CN112933219B

CN112933219B - 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN112933219B
Application number: CN202110200661.9A
Authority: CN
Inventors: 李子刚; 尹丰; 张亚萍
Original assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2021-02-23
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2041-02-23
Also published as: CN112933219A

Abstract

本发明提供了一种DNA‑多肽可逆共价偶联分子的制备方法，包括一个制备多肽的步骤；将制备的多肽用含有甲酸、乙腈和水的混合溶液溶解，然后加入溴丙炔，在多肽的甲硫氨酸位置引入带有锍盐中心的炔基；然后将DNA进行预处理，使其打开自聚形成的二硫键；在缓冲液中，将预处理的DNA和带有锍盐中心的多肽混合，形成DNA‑多肽可逆共价偶联分子。通过荧光共定位实验证实本发明的DNA‑多肽可逆共价偶联方法可用于肿瘤新抗原的递送，显著增加新抗原肽的穿膜能力和免疫激活能力。细胞增殖实验和溶血实验证明本发明构建的体系具有良好的生物安全性和广阔的肿瘤免疫治疗应用前景。

Description

一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物化学与医学免疫学方向，特别是一种多肽-DNA共价偶联分子，具体是一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其在肿瘤免疫治疗中的用途。

背景技术

肿瘤免疫疗法通过激活宿主免疫系统识别并杀死肿瘤细胞，俨然成为了肿瘤治疗的四大支柱之一(与手术、放疗、化疗并列)。然而，目前研究火热的免疫检查位点抑制剂疗法(immune checkpoint blockade，CPB)和获得性免疫细胞疗法(adoptive celltransfer，ACT)仅适用于有限的人群。肿瘤新抗原(neoantigen)的发现无疑为免疫疗法提供了新的机遇。相较于传统的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA，在正常细胞中低表达在肿瘤细胞中高表达)，新抗原由体细胞突变产生，仅在肿瘤细胞中表达，因此避开了中枢胸腺耐受，具有高度的肿瘤特异性和免疫原性。目前已被公认为肿瘤免疫治疗的理想靶标。

基于多肽的肿瘤新抗原疫苗具有良好的生物安全性、易生产等特性，而得到广泛研究。然而，它们的临床试验效果一直不理想。一方面归因于抗原肽的氨基酸组成对其等电性影响极大，致使大量可溶性多肽共存时易沉淀，并沉积在非靶标组织中，存在潜在的生物安全性问题。另一方面，面对体内复杂的蛋白酶系统和细胞膜屏障，多肽仍然存在稳定性差、穿膜能力有限等问题。因此就如何提高抗原肽的作用效果，是目前新抗原疫苗研发急需解决的难点，也是其他种类疫苗(如DNA/RNA疫苗)或药物临床应用的共性问题。

有研究指出，10-100nm的纳米粒子可模拟病原分子模式，被免疫细胞受体识别为危险信号，从而增加疫苗的摄取和提呈概率。已有研究将肿瘤新抗原包载到高密度脂蛋白纳米圆盘、DNA-RNA纳米胶囊、PC7A纳米颗粒等载体中。尽管疫苗载体的研究进展显著，但潜在的安全性、纳米粒子扩大制备等问题，仍然是疫苗开发的重要挑战。更智能化、且具有结合其他免疫疗法潜能的、生物安全性新抗原载体的开发亟待进行。在众多纳米载体中具有可编程性的DNA折纸(DNA origami)表现出其他载体无可比拟的优势，具有作为新抗原载体的巨大应用潜能。作为生物源的材料，DNA具有良好的生物兼容性、可降解性以及可忽略的免疫原性。通过合理的设计即可获得尺寸明确、空间可寻址、多肽疫苗价态可知的运载体系。此外，基于DNA严格的碱基互补配对原则，无需过多的化学修饰即可将多种佐剂分子或功能核酸，如CpG、shRNA、siRNA等纳入新抗原疫苗的配方中。

如何将多肽引入到DNA折纸递送体系中，并能保证其进入细胞后与载体解离，是新抗原递送和宿主免疫系统激活的关键。目前较为成熟的DNA-多肽共价连接方法是以双功能团交联剂(如DIBAC-maleimide、Sulfo-SMCC等)为Linker的连接。此类反应通常依赖于常见的官能团，如氨基或硫醇等。但如果目标肽中含有多个相同官能团时(如赖氨酸Lys和精氨酸Arg的氨基侧链)，共价连接的位点特异性将大打折扣。而基于点击化学(clickchemistry)的加成反应在一定程度上规避了上述情况，但多肽中非天然氨基酸的引入同时预示着合成成本的增加和安全使用窗口问题。且基于上述方式获得偶联物的再次断裂仅依赖于核酸或多肽的生物降解，这直接限制了DNA/多肽药物从载体上的释放。以二硫键为接口的交联物，可被胞内还原性物质如GSH等还原，实现药物的可逆释放。但在制备过程必可避免形成的多肽和DNA二聚物需要更繁杂的纯化操作处理，直接增加了人力和时间成本。因此综合点击化学反应的特异性和二硫键可逆断裂性质的DNA-多肽可逆共价偶联的新方式亟待开发。

本发明受启发于多肽的可逆关环策略，提出将锍盐中心驱动的炔基与巯基的加成策略应用于新抗原与核酸的可逆共价连接中。尝试结合DNA折纸纳米载体的优势，开发一种简便通用、尺寸已知、生物安全、且具有联合多种治疗途径潜能的新抗原疫苗递送载体。将CpG佐剂和新抗原同时递送到免疫细胞中，协同激活宿主免疫系统。拓展并完善新抗原疫苗的递送策略，并期望为个性化肿瘤疫苗、DNA/RNA疫苗、及其他生物活性药物的递送提供一个全新的平台。

发明内容

针对现有技术中DNA-多肽共价连接中存在的问题，本发明提供了一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途，用于解决基于点击化学反应的不可逆性以及非天然氨基酸引入导致的潜在生物安全性问题，解决基于二硫键连接的非特异性技术问题。

本发明提供了一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法，包括如下步骤：

1)一个制备多肽的步骤；

2)将制备的多肽用含有甲酸、乙腈和水的混合溶液溶解，然后加入溴丙炔，在多肽的甲硫氨酸位置引入带有锍盐中心的炔基；

3)将DNA进行预处理，使其打开自聚形成的二硫键；

4)在(NH₄)₂CO₃缓冲液中，将步骤3)预处理的DNA和步骤2)中带有锍盐中心的多肽混合，形成DNA-多肽可逆共价偶联分子。

进一步的，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2。

进一步的，所述的DNA的碱基序列为SEQ ID NO.3-7中任意一个。

本发明还提供了通过上述的方法制备得到的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

本发明还提供了一种DNA折纸纳米递送载体，含有上述的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

本发明还提供了上述的DNA折纸纳米递送载体在制备疫苗中的用途。

本发明还提供了一种疫苗，含有上述的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

本发明还提供了一种DNA折纸辅助的多肽递送体系，含有上述的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

本发明还提供了上述的DNA折纸辅助的多肽递送体系在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

上述共价偶联方式如下所示，

本发明利用凝胶电泳和液质联用等技术证实不同种类的DNA均可通过锍盐中心驱动的炔基与巯基共价偶联的方法实现DNA-多肽共价偶联物的制备，且该共价偶联物可在巯基吡啶/GSH等巯基还原剂存在的情况下被可逆还原释放出多肽分子。

本发明通过纳米粒度仪DLS等证实上述DNA-多肽可逆共价偶联分子可通过DNA严格的碱基互补配对组装到DNA四面体上，获得同时含有免疫激活辅助因子CpG(一条长度为20nt的DNA单链，被公认为目前最强的免疫佐剂)和肿瘤新抗原的纳米体系。

本发明通过荧光共定位和流式细胞技术证实由上述DNA-多肽可逆共价偶联分子构建的DNA折纸纳米递送体系具有良好的细胞膜穿膜能力，可显著提高多肽的穿膜效果。

本发明通过酶联免疫技术、MTT和细胞溶血等手段证实由上述DNA-多肽可逆共价偶联分子构建的DNA折纸纳米递送体系显著增强了抗原的免疫激活能力。且该体系具有良好的生物安全性，在肿瘤免疫治疗中表现出广阔的应用前景。

附图说明

图1为带有锍盐中心多肽的质谱鉴定图。(a)带锍盐中心多肽的制备示意图。(b)LSD1多肽的结构示意图。(c)LSD1多肽的质谱鉴定结果。(d)带有锍盐中心的LSD1多肽的质谱鉴定结果。(多肽序列信息：LSD1：FAM-GRKMHCKTKHL)

图2为DNA与多肽共价偶联的电泳验证图。(a)DNA与多肽共价偶联的示意图。(b)不同缓冲液中DNA与多肽共价偶联的电泳结果。

图3为偶联前后DNA的UV光谱扫描图。

图4为DNA与多肽在不同温度下的连接情况图。

图5为pH值对DNA与多肽共价连接的影响图。(a)40nt ssDNA与LSD1共价结合。(b)63nt ssDNA与LSD1共价结合。

图6为DNA与多肽配比对共价连接的影响图。(a)40nt ssDNA与LSD1共价连接的非变性电泳结果。(b)63nt ssDNA与LSD1共价连接的非变性电泳结果。(c)63nt ssDNA与LSD1共价连接的变性电泳结果。

图7为不同配比条件下DNA与多肽共价连接的效率对比图。

图8为反应时间对DNA与多肽共价连接的影响图。

图9为底物浓度对DNA与多肽共价连接的影响图。

图10为DNA-多肽可逆共价连接方法的普遍适用性分析图。

图11为DNA-多肽共价连接产物的LC-MS验证结果图。(a)DNA的LC-MS结果。(b)DNA-多肽共价偶联物的LC-MS结果。

图12为DNA-多肽共价偶联物被可逆还原的验证结果图。(a)DNA-多肽共价偶联物被可逆还原的示意图。(b)DNA-多肽偶联物(63nt)被2-巯基吡啶还原的电泳结果。(c)DNA-多肽偶联物(63nt)被GSH还原的电泳结果。

图13为新抗原肽OVA与ssDNA poly20A共价偶联的结果图。(a)OVA多肽与ssDNApoly20A共价偶联的示意图。(b)OVA多肽与ssDNA poly20A共价偶联的电泳验证结果。

图14为新抗原肽OVA与ssDNA poly20A共价偶联的LC-MS验证结果图。(a)带有锍盐中心的OVA多肽的结构示意图和LC-MS结果。(b)ssDNA HS-poly20A的LC-MS鉴定结果。(c)OVA-poly20A共价偶联物的LC-MS鉴定结果。

图15为新抗原肽OVA与免疫激活辅助因子CpG共同组装到DNA四面体(命名为DNeoC-NTs)上的结果图。(a)DNA四面体自组装的示意图。(b)OVA和CpG被共同组装到DNA四面体上的电泳验证结果。

图16为DNeoC-NTs纳米体系的微观表征结果图。(a)DNA四面体的粒径。(b)DNA四面体的电位。(c)与(a)对应的DNA四面体的粒径分布曲线。(d)与(b)对应的DNA四面体的电位分布曲线。

图17为DNeoC-NTs纳米体系的血清稳定性分析图。

图18为DNeoC-NTs的穿膜能力评估图。(a)DNeoC-NTs(仅OVA多肽上带有FAM标签)的结构示意图。(b)给药4h后DNeoC-NTs在RAW264.7细胞中荧光分布的定量分析结果。(c)给药4h后DNeoC-NTs在RAW264.7细胞中荧光分布的中轴值统计。

图19为DNeoC-NTs在RAW264.7细胞中的荧光分布情况图。

图20为同时带有FAM荧光标签和Cy5荧光标签的DNeoC-NTs的穿膜能力评估图。(a)DNeoC-NTs(OVA多肽上带有FAM荧光标签，DNA上带有Cy5荧光标签)的结构示意图。(b)给药4h后DNeoC-NTs上的FAM荧光在RAW264.7细胞中分布的定量分析结果。(c)给药4h后DNeoC-NTs上Cy5荧光在RAW264.7细胞中分布的定量分析结果。

图21为同时带有FAM荧光标签和Cy5荧光标签的DNeoC-NTs在RAW264.7细胞中的荧光共定位情况图。

图22为DNeoC-NTs在RAW264.7细胞中的荧光共定位情况和Pearson相关系数分析图。

图23为不同时间段DNeoC-NTs在RAW264.7细胞中的荧光共定位情况图。(a)Confocal分析胞内FAM荧光和Cy5荧光共定位的情况。(b)细胞中FAM绿色荧光(OVA多肽)、Cy5红色荧光(DNA四面体)和DAPI蓝色荧光(细胞和)的荧光分布曲线。(c)不同时间段FAM与Cy5荧光共定位的Pearson系数统计。(d)不同时间段细胞中FAM荧光分布的中轴值统计。(e)不同时间段细胞中Cy5荧光分布的中轴值统计。

图24为DNeoC-NTs刺激RAW264.7细胞分泌肿瘤相关因子TNF-α的情况图。(a)ELISA测得TNF-α的标准曲线。(b)ELISA分析RAW264.7细胞分泌肿瘤相关因子TNF-α的情况。

图25为DNeoC-NTs刺激RAW264.7细胞分泌白介素IL-6的情况图。(a)ELISA测得IL-6的标准曲线。(b)ELISA分析RAW264.7细胞分泌白介素IL-6的情况。

图26为DNeoC-NTs刺激RAW264.7细胞分泌白介素IL-12p40的情况图。(a)ELISA测得IL-12p40的标准曲线。(b)ELISA分析RAW264.7细胞分泌白介素IL-12p40的情况。

图27为MTT法分析DNeoC-NTs对RAW264.7细胞生长抑制情况图。

图28为DNeoC-NTs的溶血性评估图。

图29为本发明的原理图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1

本发明采用锍盐中心驱动的多肽炔基末端与DNA巯基末端加成的方法，将两种生物源大分子多肽和DNA通过锍盐中心共价偶联。在保证共价连接特异性的前提下，保留活性的锍盐中心，为DNA-多肽共价偶联物的可逆断裂提供可能(如图29)。首先以一段长度为11个氨基酸的多肽LSD1和一条63nt的单链DNA为模型，探究了共价连接的可行性。通过分析连接温度、时间、pH值、底物配比、底物浓度、DNA序列长度等，优化DNA-多肽共价连接的最适条件。并用LC-MS确定共价连接产物的分子量，进一步证实DNA与多肽共价偶联。随后将巯基还原剂(巯基吡啶或GSH)加入到共价连接体系中，凝胶电泳分析共价连接产物的减少量，确定DNA-多肽共价偶联物可被还原断裂，从而释放出多肽药物。

为了拓展其应用范围，本发明将该共价偶联物应用到基于肿瘤新抗原的免疫治疗中。肿瘤新抗原的本质是一段多肽分子，基于本发明提出的方法，将反应体系中的多肽替换为OVA抗原肽，将ssDNA替换为poly20A，用于与DNA四面体上的poly20T互补配对，从而将OVA多肽连接到DNA四面体上，制备出同时含有抗原肽OVA和免疫激活辅助因子CpG的DNA折纸共组装体系。利用DNA折纸的可设计性、可编程性、良好的细胞膜穿透性和生物安全性，将OVA抗原肽高效递送到细胞中，共同激活RAW264.7小鼠巨噬细胞的免疫响应，为肿瘤免疫治疗提供一种新型的抗原肽共价偶联方法和新抗原递送策略(如图29所示)。

实施例2 带锍盐中心多肽的制备及分离纯化步骤

采用传统的多肽固相合成方法获得需要的多肽。

表一本发明中涉及到的多肽序列信息

备注：βA为丙氨酸A的同分异构体，常用作间隔氨基酸。这里选用βA间隔OVA的功能肽段(SIINFEKL)和用于接溴丙炔的甲硫氨酸M。

具体操作步骤为：

(1)多肽固相合成：称取500mg Rink amide MBHA树脂于10mL接肽管中，加入二氯甲烷(DCM)，氮气鼓吹溶胀30min。加入含50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，氮气鼓吹30min，脱去树脂上的Fmoc保护基团。用DMF和DCM交替洗涤10遍树脂后，重复上述步骤二次脱Fmoc。用DMF和DCM交替洗涤10遍树脂后，将配好的氨基酸(5eq，0.4M，DMF溶剂)溶液，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(5eq，0.38M，DMF溶剂)溶液，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(10eq)混匀后加入树脂中氮气鼓吹1h。抽掉反应液，随后用DMF和DCM交替洗涤10遍树脂后，按照上述同样的操作脱掉Fmoc，随后加入下一个氨基酸，直到所有的氨基酸连接完成。

(2)多肽的剪切：用三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIPS)和水(TFA:TIPS:水(v:v:v)＝95:2.5:2.5)剪切液将多肽从树脂上切下来，氮气吹干除去剪切液，随后用冰乙醚将多肽沉淀出来，进行多肽的初步纯化，得到SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2多肽的粗产物。

(3)用含有甲酸、乙腈和水(甲酸：乙腈:水(v:v:v)＝1:49.5:49.5)的混合溶液溶解多肽结晶，并加入10eq的溴丙炔，摇床上过夜反应，在多肽的甲硫氨酸位置引入带有锍盐中心的炔基(图1a带锍盐中心多肽的制备示意图；图1b本发明中使用的LSD1多肽的结构示意图)。

(4)用C18高效液相色谱柱将反应后的样品分离纯化，并用LC-MS进行鉴定。图1d结果显示引入锍盐中心后LSD1多肽的分子量由原来的1887.2Da增加至1926.3Da，这与理论计算结果一致。(图1c LSD1多肽的质谱鉴定结果；图1d带有锍盐中心的LSD1多肽的质谱鉴定结果)。

实施例3 多肽与DNA共价连接产物的制备及分离纯化步骤

表二用于与多肽共价连接的DNA的序列信息(SEQ ID NO.3-7)

备注：HS代表5’端带有C6巯基修饰。

(1)在DNA与多肽共价连接之前，订购的DNA需预处理打开DNA自聚集形成的二硫键。具体操作步骤如下：向100μM 50μLDNA中加入200eq的TCEP，室温反应4h后，加入冰乙醇，12000rpm离心30min后去上清，除去多余的TCEP。超纯水溶解沉淀物，Nanodrop进行浓度定量分析。

(2)按照图2a所示的方案，将DNA与带有锍盐中心的多肽分别在PBS(pH7.4，培养细胞用)、(NH₄)₂CO₃(10mM，pH9.6)、Tris(10mM Tris-HCl，pH8.0)、Tris-Mg²⁺(10mMTris-HCl，5mM MgCl₂，pH8.0)、Tris-Mg²⁺-Na⁺(10mMTris-HCl，2.5mM MgCl₂，20mM NaCl，pH8.0)缓冲溶液中混合，于4℃反应4h后，PAGE凝胶电泳检测连接结果。图2b中能明显检测到DNA与多肽共价连接的产物。Nanodrop进一步分析共价连接前后DNA的UV扫描图谱(图3)，成功在494nm处(多肽上的FAM标签)检测到光谱吸收，也进一步证实了带锍盐中心的多肽可与带巯基末端的DNA共价偶联。

(3)接下来分别对连接反应的温度(4℃、室温、37℃，图4)、pH值(pH6.0-10.0，图5)、底物配比(1:0.5-1:10，图6和图7)、反应时间(2h-8h，图8)、底物浓度(5μM-50μM，图9)、DNA长度(20nt-80nt，图10)进行探究，以确定共价连接的最适条件。为了保证结果的准确性，本发明同时分析了40nt长DNA和63nt长DNA与LSD1多肽共价连接的情况：如图5a和图5b分别为40nt和63nt DNA与LSD1在不同pH条件下的连接结果；图6a和图6b分别为40nt和63ntDNA与LSD1在不同配比条件下的连接结果，图6c为63nt DNA与LSD1连接的变性胶验证结果；图8a和图8b分别为40nt和63nt DNA与LSD1反应不同时间的连接结果。通过图4-图10的条件探究确定在4℃、(NH₄)₂CO₃(10mM，pH9.6)缓冲条件下、按照DNA:多肽摩尔比为1:3，反应2h即可实现85％以上的共价连接效率。且该情况适用于不同DNA序列长度，底物浓度高达50μM的DNA样品。

(4)为了保证连接的彻底性，在后期扩大制备过程中，推荐反应体系按底物摩尔比为1:5(DNA:Peptide)、10mM(NH₄)₂CO₃溶液、4℃反应过夜后C18高效液相色谱柱对反应产物进行分离纯化。

(5)LC-MS对最终连接产物进行验证，确定DNA-多肽共价连接产物的分子量为21537.1Da(图11b)，等于DNA单链分子量(19601.8Da，图11a)与FAM-LSD1多肽分子量(1926.3Da，图1d)的加和。

实施例4 多肽与DNA共价连接产物被可逆还原

为了明确本发明制备的DNA-多肽共价偶联物可被再次还原断裂，释放出体系中的多肽，为多肽药物递送及其在肿瘤新抗原免疫治疗中的应用提供可能(图12a)。在本发明中将100eq的巯基吡啶或GSH等巯基还原剂加入到终浓度为40μM的DNA-多肽共价连接产物中，于37℃反应。分别在0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h取出3μL样品，10％PAGE凝胶电泳分析共价连接产物被还原的情况。图12b结果显示随着反应时间的延长，初始连接产物条带逐渐变暗，同时伴随DNA底物量逐渐增加。同样的，在加入GSH的实验组中也发现了类似的情况(图12c)。确定该共价偶联物可被还原断裂。

实施例5 将上述共价连接方法应用到新抗原疫苗递送体系的构建中

为了拓展该共价连接方法的应用范围，本发明中将该共价偶联方法应用到基于新抗原的肿瘤免疫治疗中。基于多肽的肿瘤新抗原疫苗具有良好的安全性、易生产等特性，而得到广泛研究。然而，它们的临床试验效果一直不理想。纳米载体是目前被公认为行之有效的疫苗递送策略。在众多纳米载体中具有可编程性的DNA折纸(DNA origami)表现出其他载体无可比拟的优势，具有作为新抗原载体的巨大应用潜能。基于此，本发明提出利用DNA-多肽可逆共价偶联的方法将新抗原多肽与DNA折纸结合，利用DNA折纸的优势，将新抗原和免疫激活辅助佐剂CpG共同递送到免疫细胞中，联合激活细胞免疫系统。

(1)按照实施案例3中的方法制备OVA抗原肽与ssDNA poly20A的共价连接产物(图13a)，PAGE凝胶电泳鉴定连接结果(图13b)。需要指出的是：ssDNApoly20很难被gelred等核酸染料染色，为了便于分析，本发明中将一条带有20nt polyT尾巴的52nt单链DNA与poly20A退火杂交互补配对后再进行电泳分析(退火条件：90℃保持5min，随后以0.1℃/s的速度降温至20℃，并保持10min)。LC-MS分析共价连接产物的分子量(7830.1Da，图14c)，证实OVA多肽(分子量：1431.74Da，图14a)被成功连接到ssDNApoly20A上(分子量6398.36Da，图14b)。

(2)将表三中用于构建DNA四面体的ssDNA按照摩尔比为1:1:1:1:1:1的配比，在缓冲液10mM Tris-HCl，5mM MgCl₂(pH8.0)的缓冲溶液中混合，保证各ssDNA的终浓度为1μM。将混合物在90℃保持10min使其高温变性打开ssDNA中的二级结构，随后在室温放置1h进行退火杂交。最后补加3eq的OVA-poly20A共价连接产物，于50℃保持10min后，室温放置1h，即可获得如果图15a所示的DNA四面体。

(3)凝胶电泳分析发现，随着OVA多肽和CpG加入DNA四面体的体系中，产物的迁移速率逐渐降低，表现为电泳条带位置的滞后(图15b)。且在加入OVA的组中成功检测到多肽特有的FAMlvse荧光，也证明了OVA抗原肽和免疫激活辅助佐剂CpG被共同组装到DNA四面体上(命名为DNeoC-NTs，图15b)。

(5)DLS对DNA折纸纳米载体的微观结构情况进行表征，检测到DNeoC-NTs的粒径约25nm(图16a,c)，电位约-10mV(图16b,d)，这与DNA四面体的理论设计相符。

表三构建DNA四面体所需DNA的序列信息(SEQ ID NO.8-15)

实施例6 DNeoC-NTs的稳定性评估

基于多肽的肿瘤新抗原疫苗的临床试验效果不佳的一个重要原因是多肽自身的稳定性有限。已经有报道指出DNA与多肽的共价偶联物可在一定程度上提高多肽的稳定性，同时多肽末端可阻碍核酸酶与DNA的相互作用，进一步提高度复合物的整体稳定性。本发明中将DNeoC-NTs(终浓度1μM)与含有10％血清的RPMI1640细胞培养基混合，于37℃孵育24h后，发现仍有50％以上DNeoC-NTs底物稳定存在(图17)，具有较高的稳定性。

实施例7 DNeoC-NTs的穿膜能力评估

采用流式细胞实验和激光共聚焦显微技术评估DNeoC-NTs的穿膜能力。分别将带FAM标签的OVA多肽、FAM-OVA-poly20A共价偶联物、混合有商业化转染试剂Lipofectamine2000的FAM-OVA-poly20A、DNeoC-NTs(以OVA浓度计，给药浓度为1μM)，给药处理RAW264.7免疫细胞4h。分别采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对各组药物的穿膜能力进行评估。对于流式细胞实验：给药处理后，用PBS将细胞清洗三遍，随后用0.25％胰酶消化3min后，收集细胞。再次用PBS清洗3次后将细胞重悬到PBS中，通过流式细胞仪测定带FAM荧光细胞的占比，评估不同药物的穿膜能力。对于共聚焦实验：将细胞提前12h种在细胞爬片上，给药处理后用PBS小心清洗爬片，随后用4％的多聚甲醛处理15min固定细胞，PBS清洗去除残留的甲醛，最后用含有DAPI的封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察DNeoC-NTs在细胞中的定位情况。图18的流式结果显示DNeoC-NTs组有具有最强的荧光偏移，证实DNA四面体显著提高了OVA多肽的细胞膜穿透性。此外，图19中的Confocal结果也显示DNeoC-NTs给药组细胞中FAM荧光量最强，进一步证实了流式检测的结果。

实施例8 DNeoC-NTs中多肽的穿膜方式分析

为了证实多肽是由DNA四面体辅助进入细胞膜的，本发明中在DNA四面体的一条链上标记红色的Cy5荧光，在OVA多肽上标记绿色FAM荧光，构建同时带有两种荧光标签的复合物(图20a)，用于纳米体系在细胞中的共定位分析。给药处理4h后，利用流式细胞技术分别通过检测FAM荧光通道和Cy5荧光通道的情况评估DNeoC-NTs的穿膜效果。图20结果显示，相较于OVA多肽或ssDNA，DNeoC-NTs组都有最好的细胞膜穿透性(图20b和图20c)。激光共聚焦显微镜观察到在RAW264.7的细胞质中同时有红色Cy5荧光和绿色FAM荧光(图21)，且其共定位Pearson系数接近0.9(最大值为1，其数值越大，预示着两种荧光的共定位程度越高，图22)，表明OVA多肽确实是在DNA四面体辅助下穿过细胞膜的。

实施例9 DNeoC-NTs在细胞中的分离过程监测

被携带进入细胞的OVA抗原与DNA四面体解离后才能被MHC复合物呈递在细胞表明，进而激活肿瘤特异性T细胞，达到肿瘤免疫治疗的目的。实施方案3中已经证实DNA-多肽共价连接产物可被还原性物质如巯基吡啶、GSH等还原，释放出多肽药物。为了评估胞内OVA抗原与DNA四面体分离的情况，带有两种荧光标签的DNA四面体在细胞中的共定位情况被分析。用DNeoC-NTs(以OVA浓度计，给药浓度为0.75μM)给药处理RAW264.7细胞4h、8h、12h和24h后，制备confocal检测用细胞爬片。图23a结果显示细胞中的绿色FAM荧光和红色Cy5荧光在细胞质中聚集，随着时间的延长，可观察到绿色FAM荧光强度逐渐减弱，表现为Pearson分布散点逐渐向x轴(FAM荧光)偏移(图23a)和荧光共定位分布曲线图中FAM荧光逐渐减弱(图23b)。进一步的，流式分析RAW264.7细胞中总体荧光变化情况，发现随着时间延长，可检测到的FAM荧光有先上升后下降的趋势(图23d)，而Cy5荧光在12h和24h时都维持在较高水平(图23e)，这与图17中稳定性的分析结果具有一致性(同样浓度的纯DNA四面体和DNeoC-NTs与10％血清中孵育24h后，DNA四面体组有更多的底物剩余量)，可确定OVA多肽在细胞内与DNA四面体解离。需要指出的是RAW264.7细胞并非体内主要的抗原提呈细胞，因此在RAW264.7细胞中并未观察到明显的细胞膜表面荧光信号变化情况，这也是实验中仅观察到FAM荧光信号降低，但Pearson共定位系数变化不大的原因(图23c)。

实施例10 DNeoC-NTs的免疫激活能力评估

采用酶联免疫ELISA试剂盒分析给药刺激后，RAW264.7细胞分泌肿瘤相关因子和白细胞介素的情况，评估DNeoC-NTs的免疫激活能力。用CpG、OVA、OVA-poly20A、DNA四面体(Th)、只带有OVA的DNA四面体(Th-OVA)、只带有CpG的DNA四面体(Th-CpG)、同时带有CpG佐剂和OVA抗原肽的DNA四面体(DNeoC-NTs，以OVA浓度计，给药浓度为1μM)分别处理细胞24h和48h后，收取细胞上清。随后1000g离心20min除去悬浮细胞，取100μL细胞上清加入酶联免疫检测板中，按照ELISA试剂盒操作说明，分析RAW264.7细胞分泌各细胞因子情况。以试剂盒中标准样品的ELISA检测结果绘制标准曲线(图24a，图25a，图26a)，计算细胞培养上清中肿瘤相关因子TNF-α(图24b)、白细胞介素IL-6(图25b)和IL-12p40(图26b)的含量。图24-26结果显示，相较于单独的OVA或CpG给药，DNeoC-NTs纳米复合物显著增加了各相关因子的分泌量，表现出潜在的肿瘤免疫治疗能力。本发明涉及的DNeoC-NTs纳米体系为肿瘤新抗原免疫疗法提供了一种新型的新抗原递送策略。

实施例11 DNeoC-NTs的安全性评估

采用MTT法从细胞水平分析DNeoC-NTs的细胞毒性。控制最大给药量为1μM(以OVA浓度计)，依次等比稀释后获得8个浓度梯度的药物。给药处理RAW264.7细胞24h后加入20μL的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)，使其终浓度为5mg/mL，37℃继续培养4h。吸出细胞上清，加入100μL DMSO溶解活细胞产生的甲赞结晶，用全功能酶标仪测定各孔的吸光值。以不加药物的细胞为对照组，通过分析细胞生长的抑制情况确定药物的细胞毒性。图27结果显示，在最大给药量时，DNeoC-NTs组的细胞仍能维持近100％的细胞存活率，且在更低的给药浓度时DNeoC-NTs有微弱的促生长作用，表明DNeoC-NTs无显著的细胞毒性。

进一步的，通过细胞溶血实验分析DNeoC-NTs的生物安全性。取新鲜的小鼠全血，1200rpm离心5min去除血清，并用PBS清晰细胞至上清无色。随后将不同浓度的DNeoC-NTs(以OVA浓度计，最大给药量为1μM)与10⁵个红细胞混合后，37℃孵育1h。随后1200rpm离心5min，取100μL上清到96孔板中，使用全功能酶标仪测定上清在570nm处的吸光值，确定DNeoC-NTs的溶血情况。图28a结果显示，离心后的细胞上清颜色与加了PBS的对照组接近。进一步测定570nm处的吸光值发现，最大DNeoC-NTs给药组中红细胞上清的吸光值与对照组接近，远低于加入TritionX-100(一种细胞膜破坏剂)的阳性对照组(图28b)。也证实了本发明构建的新抗原递送体系具有良好的生物安全性，这为后续该纳米体系在肿瘤新抗原免疫疗法中的应用提供了保障。

序列表

<110> 北京大学深圳研究生院

深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心

<120> 一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途

<130> JSP12101691

<150> 2020112870379

<151> 2020-11-17

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Lys Met His Cys Lys Thr Lys His Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctctcaac tgcctcagac 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcagactta ggaatgttcg acatgcgagg gtccaatacc 40

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caataccgac gattacagct tgctacacga ttcagactta ggaatgttcg acatgcgagg 60

gtc 63

<210> 6

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaacattcct aagtctgaaa tttatcaccc gccatagtag acgtatcacc aggcagttga 60

gatttttttt tttttttttt 80

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttttttttt tttttttttt gtctgaggca gttgagagat ctcgaacatt cc 52

<210> 9

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccatgacgt tcctgacgtt tttaagtctg aagatccatt tatcaccagc tgctgcacgc 60

catagtagac gtatcacctg tcc 83

<210> 10

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccatgacgt tcctgacgtt ttagctactt gctacacgag gatcttcaga cttaggaatg 60

ttcgagatc 69

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catgcgagga ctcggtccaa taccgtacta acgattacag atcaa 45

<210> 12

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttttttttt tttttttttt cagctggtga taaaacgtgt agcaagtagc tttgatctgt 60

aatcgactct acgggaagag c 81

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttttttttt tttttttttt atgcccatcc ggctcactac tatggcgtgc ag 52

<210> 14

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccatgacgt tcctgacgtt ttcgagtcct cgcatgactc aactgcctca gacggacagg 60

tgatacg 67

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagccggatg ggcatgctct tcccgtagag atagtacggt attggac 47

Claims

1.一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个制备多肽的步骤；

3)将DNA进行预处理，使其打开自聚形成的二硫键；

2.根据权利要求1所述的一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的一种DNA-多肽可逆共价偶联分子的制备方法，其特征在于：所述的DNA的碱基序列为SEQ ID NO.3-7中任意一个。

4.通过权利要求1所述的方法制备得到的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

5.一种DNA折纸纳米递送载体，其特征在于：含有权利要求4所述的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

6.权利要求5所述的DNA折纸纳米递送载体在制备疫苗中的用途。

7.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求4所述的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

8.一种DNA折纸辅助的多肽递送体系，其特征在于：含有权利要求4所述的DNA-多肽可逆共价偶联分子。

9.权利要求8所述的DNA折纸辅助的多肽递送体系在制备治疗肿瘤的药物中的用途。