CN111781186A

CN111781186A - 用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的sers传感器及其制备方法

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Publication number: CN111781186A
Application number: CN202010540034.5A
Authority: CN
Inventors: 宋春元; 张晶晶; 杨琰君; 汪联辉
Original assignee: Nanjing University of Posts and Telecommunications
Current assignee: Nanjing University of Posts and Telecommunications
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN111781186B

Abstract

本发明公开用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器及其制备方法，所述SERS传感器包括表面修饰有四面体DNA结构的银纳米棒阵列基片和SERS探针，所述四面体DNA结构由六条DNA单链自组装而成，所述四面体DNA结构的三条棱边上有三条DNA单链分别连接三条捕获链，用于分别特异性结合核酸和蛋白标志物。本发明的SERS传感器检测核酸和蛋白的检测限分别达到阿摩尔每升量级和亚飞克每毫升量级；可实现在血清等复杂环境中多种核酸和蛋白生物标志物的一体化检测。本发明公开的传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性好，可实现肺癌早期极低丰度的生物标志物的高灵敏检测，同时对各种肿瘤生物标志物具有良好的普适性。

Description

用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器及其制备方法。

背景技术

肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为大多数国家癌症死亡的主要病因。早期筛查癌症有助于预防和及时治疗癌症。然而，癌症的典型临床表现隐匿且是无症状的，这严重限制了早期对癌症的有效筛查。在癌症的早期阶段，血液中生物标志物的浓度极低，且研究尚未发现引起特定癌症的单一不同生物标志物。通常，多个高度相关的生物标志物(如核酸和蛋白)会同时受到调控，并且不同类型的标志物(如微小核酸miRNA和蛋白)能提示疾病的不同发展阶段。开展针对核酸及蛋白标志物的一体化检测，对于实施肺癌早期检测及发病阶段判断等具有重要意义。

表面增强拉曼散射(SERS)具有超高的检测灵敏度，甚至能够实现单分子水平的检测，长期以来一直被认为是实现痕量物质高灵敏检测的强有力分析手段。SERS提供了独特的“特征”谱图，特征峰尖锐而易于分辨，适合多种物质的联合检测，很适合开发高灵敏传感器，实现同时检测多种癌症相关的生物标志物。

然而，由于核酸和蛋白不同的生物特性和检测方法，目前还没有能够同时检测蛋白和核酸的SERS传感器。

发明内容

发明目的：目前没有公开能同时用于核酸和蛋白联合检测的SERS传感器，而针对血清中多元生物标志物(如核酸和蛋白)联合检测的方法还比较匮乏。本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器及其制备和检测方法，满足针对不同类型肺癌标志物同时高灵敏检测的需求。该传感器以银纳米棒阵列为固相基片，经表面修饰具备三条捕获臂的四面体DNA而构建得到，结合SERS探针实施检测。

本发明将检测芯片(表面修饰有四面体DNA结构的银纳米棒阵列基片)依次与待检测液体样品、SERS探针溶液混合，通过与目标生物分子结合后形成“检测芯片-目标生物分子(核酸或蛋白)-SERS探针”复合物，之后进行SERS测试，通过SERS信号强度实现对于血清中核酸或蛋白的高灵敏、特异性的传感检测。本发明同时提供了利用该SERS传感器开展血清中两种肺癌核酸标志物(miRNA-21、miRNA-486)和一种肺癌蛋白标志物(CEA)的一体化检测方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了多生物分子(多元)检测芯片界面的生物功能化问题，满足同时识别不同类型标志物的需求。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种用于肺癌早期极低丰度的生物标志物(核酸或蛋白)高灵敏检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器，所述SERS传感器包括表面修饰有四面体DNA结构的银纳米棒阵列基片和SERS探针，所述四面体DNA结构由六条DNA单链自组装而成，所述四面体DNA结构的三条棱边上有三条DNA单链分别连接三条捕获链，用于分别特异性结合核酸和肿瘤蛋白标志物。

其中，所述四面体DNA具有三维立体结构，该四面体DNA由A、B、C、D、E和F六条DNA单链自组装而成，其中A、E、F三条DNA单链均在5’端修饰巯基，A、C、E三条DNA单链分别连接三条碱基序列作为三种目标分析物的捕获链。四面体DNA通过底面的三个巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面，四面体DNA的三条棱边上有三条DNA单链分别连接三条碱基序列作为三种目标分析物的捕获链，分别用于特异性结合肿瘤两种微小核糖核酸(miRNA-21、miRNA-486)及一种蛋白(癌胚抗原，CEA)标志物。

其中，所述六条DNA单链核酸碱基序列为：

A：5’-SH-(CH₂)₆-GTC TGA GGC AGT TGA G A GAT CTC GAA CAT TCC ATC GTA CGATCA TAG ATC AAT-3’；(SEQ ID NO：1)

B：5’-TAA GTC TGA AGATCC A TTT ATC ACC AGC TGC TGC ACG CCA TAG TAG ACGT ATC ACC TGT CC-3’；(SEQ ID NO：2)

C：5’-AGC TAC TTG CTA CAC G A GGA TCT TCA GAC TTA GGA ATG TTC GAG ATCA CAT GCG AGG ACT CGG TCC AAT ACC GTA CTA A CGA TTA CAG ATC AA ATT CTA GACGTT ACT TAA CAT-3’；(SEQ ID NO：3)

D：5’-CAG CTG GTG ATA AA A CGT GTA GCA AGT AGC TTT GAT CTG TAA TCG ACTC TAC GGG AAG AGC-3’；(SEQ ID NO：4)

E：5’-SH-(CH₂)₆-ATG CCC ATC CGG CTC A CTA CTA TGG CGT GCA G CCA TAC CGCCAT TTC CAA CTA-3’；(SEQ ID NO：5)

F：5’-SH-(CH₂)₆-CGA GTC CTC GCA TG A CTC AAC TGC CTC AGA CGG ACA GGTGAT ACG A GAG CCG GAT GGG CAT GCT CTT CCC GTA GAG A TAG TAC GGT ATT GGA C-3’。(SEQ ID NO：6)

其中，所述四面体DNA的三条棱边上有三条用于结合三种目标分子的捕获链C1、C2和C3，C1为针对miRNA-21核酸片段设计的核酸碱基序列，C2为针对miRNA-486核酸片段设计的核酸碱基序列，C3为针对CEA蛋白设计的核酸碱基序列。

其中，所述核酸标志物为miRNA-21和/或miRNA-486，所述肿瘤蛋白标志物为CEA。

其中，所述三条捕获链的核酸碱基序列为：

C1：5’-CTG ATA AGC TA TT ATT GAT CTA TGA TCG TAC GAT-3’，(SEQ ID NO：7)

C2：5’-TC AGT ACA GGA TT ATG TTA AGT AAC GTC TAG AAT-3’，(SEQ ID NO：8)

C3：5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT TAG TTG GAA ATG GCG GTA TGG-3’。(SEQ IDNO：9)

其中，所述的捕获链C1、C2和C3分别为检测miRNA-21、miRNA-486和CEA设计的，所述目标分子为肺癌相关生物标志物，包括但不限于miRNA-21、miRNA-486和CEA等肺癌相关生物标志物，可根据检测目标分子的种类或数量设计捕获链的核酸碱基序列。

其中，所述SERS探针为在金纳米颗粒表面修饰有能与目标生物分子结合的特定单链DNA探针及拉曼分子。

其中，所述SERS探针分别修饰拉曼分子DTNB、4-MBA和2-MBT，所述拉曼分子为本领域常规的拉曼报告物，包括但不限于DTNB、4-MBA和2-MBT等拉曼报告物。

其中，所述SERS探针包括单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液、单链DNA探针P2功能化的AuNP溶液和单链DNA探针P3功能化的AuNP溶液；所述单链DNA探针P1、P2、P3的碱基序列为：

P1：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT TCA ACA TCA GT-3’，(SEQ ID NO：10)

P2：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT CTC GGG GCA GC-3’，(SEQ ID NO：11)

P3：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT AGG GGG TGA AGG GAT ACC C-3’。(SEQ ID NO：12)

其中，四面体DNA的A、C、E三条DNA单链分别连接三条碱基序列作为目标miRNA-21、miRNA-486和CEA的捕获链，分别用于特异性识别肿瘤两种微小核糖核酸及一种蛋白标志物。将待检测液体样品依次与检测芯片和SERS探针混合，当目标生物分子存在时会形成“检测芯片-目标生物分子(核酸或蛋白)-SERS探针”三明治结构。也即意味着，只有当待检测液体样品中存在目标核酸和蛋白时，检测芯片上的四面体DNA会特异性结合肿瘤两种微小核糖核酸(miRNA-21、miRNA-486)及一种蛋白(癌胚抗原，CEA)标志物，进而与SERS探针结合输出拉曼分子DTNB、4-MBA和2-MBT对应的拉曼信号强度；当不存在目标核酸和蛋白时，四面体DNA探针未能与miRNA-21、miRNA-486和CEA结合，因而SERS探针不会被捕获在检测芯片表面，无法采集检测芯片上SERS探针的拉曼信号。

本发明内容还包括所述的SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)检测芯片的制备：制备银纳米棒阵列并用超纯水多次冲洗；制备四面体DNA结构的银纳米棒阵列基片：将六条特殊设计的DNA单链等物质的量混合并退火处理(加热至95℃后降温至4℃)，组装形成四面体DNA，之后将等物质的量的三条捕获链与四面体DNA混合共培养1h，形成具有三条捕获臂的四面体DNA探针，即三条棱边上有三个用于结合三种目标分子的捕获端；将银纳米棒阵列和四面体DNA探针溶液共培养，四面体DNA探针通过四面体DNA上的三个巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面；依次用缓冲液和超纯水多次清洗基片，得到检测芯片；

2)SERS探针的制备：将单链DNA探针P1与AuNP溶液共培养，然后将NaCl溶液缓慢添加到混合物中，老化过夜后得到单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液，将DTNB添加到单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液中，经离心提纯后浓缩后即可制备用于miRNA-21检测的SERS探针；将DNA单链探针P2与AuNP溶液共培养，在加盐老化过夜后得到探针P2功能化的AuNP溶液，将4-MBA添加到探针P2功能化的AuNP溶液中，即可制备用于miRNA-486检测的SERS探针；将DNA单链探针P3与AuNP溶液共培养，在加盐老化过夜后得到探针P3功能化的AuNP溶液，将2-MBT添加到探针P3功能化的AuNP溶液中，即可制备用于CEA检测的SERS探针；将上述制备的三种SERS探针混合即得用于miRNA-21、miRNA-486与CEA多元检测的SERS探针。

其中，所述步骤四面体DNA的制备方法为：将六条特殊设计的DNA单链等物质的量混合并退火处理(加热至95℃后降温至4℃)，组装形成四面体DNA，之后将等物质的量的三条捕获单链与四面体DNA混合共培养1h，形成具有三条捕获臂的四面体DNA探针。

其中，所述步骤1)中的四面体DNA与银纳米棒阵列共培养的培养条件为在25-37℃，60-80％湿度环境中静置3-5小时。

其中，所述四面体DNA探针溶液浓度为50nM-150nM。

其中，所述步骤2)SERS探针的制备方法为：将50μL 10μM单链DNA探针P1与500μL2.3nM AuNP(15nm)溶液共培养4小时以上，然后在2小时内将12.5μL的2M NaCl溶液缓慢添加到混合物中4次(NaCl的最终浓度为200mM)，在25℃下老化过夜后，将5μL 10μM DTNB添加到单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液中，经离心提纯后浓缩为50μL，即可制备用于miRNA-21检测的SERS探针。制备用于miRNA-486与CEA检测的SERS探针方法如上，将DNA单链探针P2与AuNP(15nm)溶液共培养，在加盐老化过夜后，将4-MBA添加到探针P2功能化的AuNP溶液中，即可制备用于miRNA-486检测的SERS探针；将DNA单链探针P3与AuNP(15nm)溶液共培养，在加盐老化过夜后，将2-MBT添加到探针P3功能化的AuNP溶液中，即可制备用于CEA检测的SERS探针。将上述制备的三种SERS探针各取6μL混合即可制备用于miRNA-21、miRNA-486与CEA多元检测的SERS探针。

本发明内容还包括所述的用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器工作曲线的建立及检测限的检测：

1)在10％浓度的正常人血清中加入三种肿瘤标志物(两种核酸：miRNA-21、miRNA-486及一种蛋白：癌胚抗原(CEA))，配制含有不同浓度的三种目标分子的血清样品；

2)将检测芯片分别与20μL不同浓度的待检测样品溶液共培养(培养条件：25-37℃，60-80％湿度环境中静置1-3小时)；

3)将步骤2)共培养后的检测芯片多次清洗后分别与三种SERS探针的混合液共培养(培养条件：25-37℃，60-80％湿度环境中静置3-5小时)；

4)将步骤2)处理得到的检测芯片清洗多次后进行SERS测试得到SERS信号，以目标核酸或蛋白浓度的对数为横坐标，以各检测物对应的SERS探针的特征峰强度值为纵坐标做出工作曲线，根据工作曲线计算SERS传感器的检测限。

本发明中SERS传感器检测核酸的线性范围为：100aM-100pM，检测限达到阿摩尔每升量级；检测蛋白的线性范围为：0.1fg/mL-100pg/mL，检测限达到亚飞克每毫升量级。

本发明中银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体方法按文献(C.Y.Song，J.L.Abell，Y.P.He，S.H.Murph，Y.P.Cui，Y.P Zhao.Gold-modified silvernanorod arrays：growth dynamics and improved SERS properties.Journal ofMaterials Chemistry，2012，22(3)：1150-1159.)中报到的方法制备，并在其表面用PDMS膜制备4×10阵列型小孔，孔径4mm，深度1mm。

本发明还包括用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器的检测方法，所述检测方法：将检测芯片与待测样品溶液共培养，多次清洗芯片后进一步与三种SERS探针的混合液共培养，依次用缓冲液和超纯水冲洗后进行SERS测试得到SERS信号，根据SERS特征信号确定待测样品中目标肿瘤标志分子类型，对照三种目标分子各自的工作曲线计算得出待测样品中目标肿瘤标志分子的浓度。

本发明SERS传感器可以用于多生物分子(多元)检测，将待检测液体样品依次与检测芯片和SERS探针混合，当目标生物分子存在时会形成“检测芯片-目标生物分子(核酸或蛋白)-SERS探针”三明治结构，通过测试检测芯片上SERS探针的拉曼信号强度，实现对肺癌相关生物标志物(核酸或蛋白)的传感检测。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明利用表面修饰有四面体结构的DNA的银纳米棒阵列基片作为检测芯片，四面体DNA通过底面的三个巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面，在基片表面具有更优的均一性、稳定性以及优异的SERS性能。相比于常规单链DNA与分子信标类的核酸探针，四面体结构的DNA探针具有良好的结构刚性和稳定性，可实现对DNA探针自组装界面的精确调控，易于使用不同分子进行功能化以进行多元检测。此外，同时检测疾病相关的核酸标志物和蛋白标志物，十分有利于提高检测的特异性，降低“假阴性”和“假阳性”率，提高检测的可靠性；同时不同类型标志物的检测通常能够提示疾病的不同发展阶段。然而，由于核酸和蛋白分属不同类型生物分子，构建集成核酸和蛋白一体化检测的传感器因缺乏合适的探针而面临诸多难点，至今报道的基于SERS技术的蛋白和核酸一体化检测传感器还十分有限。该用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器检测核酸和蛋白的检测范围分别达到了100aM-100pM和0.1fg/mL-100pg/mL，检测限分别达到阿摩尔每升量级和亚飞克每毫升量级，可实现在血清等复杂环境中多种核酸和蛋白生物标志物的一体化检测。本发明公开的传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性好，可实现肺癌早期极低丰度的生物标志物(核酸或蛋白)的高灵敏检测，同时对各种肿瘤生物标志物具有良好的普适性。

附图说明

图1是用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器构建及工作原理图；

图2是实施例1中四面体DNA自组装，四面体DNA连接三条捕获链的凝胶电泳表征；(A)图是四面体DNA形成以及四面体DNA与三条捕获链杂交的示意图；(B)图是四面体DNA形成以及四面体DNA与三条捕获链杂交的电泳图(泳道1：A链；泳道2：B链；泳道3：A+B；泳道4：A+B+C；泳道5：A+B+C+D；泳道6：A+B+C+D+E；泳道7：A+B+C+D+E+F(四面体DNA)；泳道8：四面体DNA+C1；泳道9：四面体DNA+C1+C2；泳道10：四面体DNA+C1+C2+C3)。

图3是实施例2SERS传感器具有三条捕获臂的四面体DNA在银纳米棒阵列上组装密度的优化；图3(A)是从具有不同组装浓度四面体DNA溶液(1000nM，100nM，50nM，10nM，5nM，2.5nM)的银纳米棒阵列基片上获得检测miRNA-21、CEA和miRNA-486的SERS光谱；图3(B)中绘制了在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处SERS强度与四面体DNA组装浓度的关系。

图4是实施例3SERS传感器用于血清样品三种肿瘤标志物检测时的工作曲线及检测限；图4(A)是含有不同浓度的三种目标分子的血清样品检测所得的SERS光谱；图4(B-D)是(A)图其各谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处SERS峰强度与三种目标分子miRNA-21、CEA和miRNA-486浓度关系的工作曲线。

图5是实施例4SERS传感器用于血清样品检测的特异性表征；图5(A)是检测不同生物分子样品的SERS光谱；图5(B)是(A)图其谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处所对应的SERS峰强度。

图6是实施例5SERS传感器均一性验证；图6(A)是记录的50个随机点的平均SERS光谱；图6(B-D)是(A)图其谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处所对应的SERS峰强度。

图7是实施例6SERS传感器重现性验证；图7(A)是6组传感器检测miRNA-21、CEA和miRNA-486混合样品的SERS光谱；在图7(B-D)是(A)图其谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处所对应的SERS峰强度。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，以下实例仅是说明性的，本发明的保护内容不局限于此。

本发明所使用的DNA碱基序列片段均为人工合成得到，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1、实施例中的待检测的miRNA-21、miRNA-486的核酸碱基序列为：

miRNA-21：5’-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3’

miRNA-486：5′-UCC UGU ACU GAG CUG CCC CGA G-3′

2、实施例中特殊设计的对应于四面体DNA制备所需的六条DNA单链的核酸碱基序列为：

A：5’-SH-(CH₂)₆-GTC TGA GGC AGT TGA G A GAT CTC GAA CAT TCC ATC GTA CGATCA TAG ATC AAT-3’

B：5’-TAA GTC TGA AGA TCC A TTT ATC ACC AGC TGC TGC ACG CCA TAG TAG ACGT ATC ACC TGT CC-3’

C：5’-AGC TAC TTG CTA CAC G A GGA TCT TCA GAC TTA GGA ATG TTC GAG ATCA CAT GCG AGG ACT CGG TCC AAr ACC GTA CTA A CGA TTA CAG ATC AA ATT CTA GACGTT ACT TAA CAT-3’

D：5’-CAG CTG GTG ATA AA A CGT GTA GCA AGT AGC TTT GAT CTG TAA TCG ACTC TAC GGG AAG AGC-3’

E：5’-SH-(CH₂)₆-ATG CCC ATC CGG CTC A CTA CTA TGG CGT GCA G CCA TAC CGCCAT TTC CAA CTA-3’

F：5’-SH-(CH₂)₆-CGA GTC CTC GCA TG A CTC AAC TGC CTC AGA CGG ACA GGTGAT ACG A GAG CCG GAT GGG CAT GCT CTT CCC GTA GAG A TAG TAC GGT ATT GGA C-3’

3、四面体DNA的A、C、E三条DNA单链分别连接三条碱基序列作为三种目标分析物的捕获链，用于分别特异性识别肿瘤两种核酸(miRNA-21和miRNA-486)及一种蛋白(CEA)标志物，三条捕获链C1，C2和C3的核酸碱基序列为：

C1(miRNA-21)：5’-CTG ATA AGC TA TT ATT GAT CTA TGA TCG TAC GAT-3’

C2(miRNA-486)：5’-TC AGT ACA GGA TT ATG TTA AGT AAC GTC TAG AAT-3’

C3(CEA)：5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT TAG TTG GAA ATG GCG GTA TGG-3’

4、实施例中的用于构建SERS探针的在金纳米颗粒表面修饰有能与目标生物分子结合的特定单链DNA探针P1，P2和P3的核酸碱基序列为：

P1(miRNA-21)：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT TCA ACA TCA GT-3’

P2(miRNA-486)：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT CTC GGG GCA GC-3’

P3(CEA)：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT AGG GGG TGA AGG GAT ACC C-3’

5、针对核酸标志物检测的特异性实验对应的单碱基错配序列(SM，相对于miRNA-21)、完全错配(miRNA-375)的核酸碱基序列为：

单碱基错配序列(SM，相对于miRNA-21)：5’-UAG CUC AUC AGA CUG AUG UUGA-3’

完全错配(miRNA-375)：5’-UUU GUU CGU UCG GCU CGC GUG A-3’

6、以下实施例中银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体方法按文献(C.Y.Song，J.L.Abell，Y.P.He，S.H.Murph，Y.P.Cui，Y.P.Zhao.Gold-modified silvernanorod arrays：growth dynamics and improved SERS properties.Journal ofMaterials Chemistry，2012，22(3)：1150-1159.)中报到的方法制备，并在其表面用PDMS膜制备4×10阵列型小孔，孔径4mm，深度1mm。

实施例1 用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器的制备

1、制备银纳米棒阵列并用超纯水多次冲洗；

2、将A、B、C、D、E和F六条特殊设计的DNA单链等物质的量混合于TM缓冲液(20mMTris-HCl、50mM氯化镁，pH 8.0)中，经退火处理后，即加热至95℃后降温至4℃，组装形成四面体DNA(最终浓度为1μM)，之后将等物质的量的三条捕获链C1，C2和C3与四面体DNA混合共培养1h，形成具有三条捕获臂的四面体DNA探针。图2(A)是四面体DNA形成以及四面体DNA与三条捕获链杂交的示意图。用5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证四面体DNA的形成以及四面体DNA与三条捕获链的杂交。图2(B)为电泳胶图，相比于一条、两条、三条、四条和五条DNA单链的组合，六条DNA单链混合自组装形成的四面体DNA在泳道7中移动得最慢，验证了四面体DNA高产率的形成。此外，所形成的四面体DNA的A、C、E链分别连接三条捕获链，所形成的具有三条捕获臂的四面体DNA的条带相比四面体DNA移动得更慢(泳道8-10)。

3、将制备好的具有三条捕获臂的四面体DNA溶液(1μM)稀释至50nM。然后将20μL50nM的四面体DNA溶液滴加在银纳米棒阵列上图案化的每个小孔中，在25-37℃，60-80％湿度环境中静置3-5小时。3小时后，使用TM缓冲液冲洗干净，获得表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列检测基片。

4、将50μL 10μM DNA单链探针P1与500μL 2.3nM AuNP(15nm，购买自BritishBiocell International，Cardiff，UK)溶液在0.5×TBE缓冲液(89mM Tris、90mM硼酸、2mMEDTA，pH 8.0)中共培养4小时以上得到混合物，然后在2小时内将12.5μL的2M NaCl溶液缓慢添加到混合物中4次(NaCl的最终浓度为200mM)，在25℃下老化过夜，用0.5×TBE缓冲液离心(9000rpm，20min)清洗除去多余的DNA探针链，然后将5μL 10μM 5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)添加到探针P1功能化的AuNP溶液中，共培养3小时后使用0.5×TBE缓冲液离心(9000rpm，20min)提纯后浓缩为50uL，即可制备用于miRNA-21检测的SERS探针。制备用于miRNA-486与CEA检测的SERS探针方法如上，将DNA单链探针P2与AuNP(15nm)溶液共培养，在加盐老化过夜后，将4-巯基苯甲酸(4-MBA)添加到探针P2功能化的AuNP溶液中，即可制备用于miRNA-486检测的SERS探针；将DNA单链探针P3与AuNP(15nm)溶液共培养，在加盐老化过夜后，将2-巯基苯并噻唑(2-MBT)添加到探针P3功能化的AuNP溶液中，即可制备用于CEA检测的SERS探针。将上述制备的三种SERS探针各取6μL混合即可制备用于miRNA-21、miRNA-486与CEA多元检测的SERS探针。

SERS传感器包括表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列检测基片和用于miRNA-21、miRNA-486与CEA多元检测的SERS探针。

实施例2 SERS传感器的四面体DNA在银纳米棒阵列基片上组装浓度的选择

将20μL不同组装浓度的四面体DNA溶液(1000nM，100nM，50nM，10nM，5nM，2.5nM)滴加在银纳米棒阵列上图案化的每个小孔中，在25-37℃，60-80％湿度环境中静置3-5小时。然后将包含100pM miRNA-21、100pM miRNA-486和100pg/mL CEA的20μL目标分子混合物滴加在实施例1制备的表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列基片上共培养2小时，使用PBS缓冲液(10mM磷酸盐，100mM氯化钠，2mM氯化镁，pH 7.4)清洗干净后，将按照实施例1方法制备的三种SERS探针的混合液滴加在检测芯片上共培养3小时，随后依次用PBS缓冲液和超纯水清洗小孔，在自然风干后进行SERS测试(拉曼测试条件：扫描时间2s，激光功率1％，物镜放大倍率20x，累计次数1次，激发光波长785nm)，通过SERS检测结果确认四面体DNA在银纳米棒阵列基片上最佳组装浓度。

图3(A)是从具有不同组装浓度的四面体DNA溶液(1000nM，100nM，50nM，10nM，5nM，2.5nM)的银纳米棒阵列基片上获得检测miRNA-21、CEA和miRNA-486混合样品的SERS光谱。图3(B)中绘制了在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处的SERS强度与四面体DNA组装浓度的关系。由于四面体DNA的组装浓度太低，固定在银纳米棒阵列基片上的四面体DNA数量很少，导致捕获目标分子的能力较弱，进一步影响结合SERS探针的数量，从而导致较弱的SERS信号。当增加四面体DNA的组装浓度时，SERS信号呈现先升高后下降的趋势。由于过度拥挤，可能导致四面体DNA捕获端之间的缠绕或自组装单层的局部聚集。因此，选择银纳米棒阵列基片上四面体DNA的最佳组装浓度为50nM。

实施例3 SERS传感器用于血清样品三种肿瘤标志物检测时的工作曲线及检测限

在10％浓度的正常人血清中将两种核酸miRNA-21和miRNA-486的浓度从100aM到100pM，一种蛋白癌胚抗原(CEA)的浓度从0.1fg/mL到100pg/mL的20μL目标分子混合物滴加在实施例1制备的表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列基片上，在25-37℃，60-80％湿度环境中静置3-5小时，使用PBS缓冲液清洗干净后，将按照实施例1方法制备的三种SERS探针的混合液滴加在小孔中共培养3小时。随后，依次使用PBS缓冲液和超纯水清洗小孔。自然风干后在银纳米棒阵列基片上进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值，以目标核酸或蛋白浓度的对数为横坐标，以各检测物对应的SERS探针的特征峰强度值为纵坐标做出工作曲线，根据工作曲线计算SERS检测芯片的检测限。

图4(A)是含有不同浓度的三种目标分子的血清样品检测所得的SERS光谱，图4(B-D)是(A)图其各谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处SERS峰强度与三种目标分子miRNA-21、CEA和miRNA-486浓度关系的工作曲线。对于检测miRNA-21，得到工作曲线为I＝2300×log[C_miRNA-21]+38000(R²＝0.988)，通过计算检测限为59aM；对于检测CEA，得到工作曲线为I＝2410×log[G_CEA]+39300(R²＝0.996)，通过计算检测限为0.076fg/mL；对于检测miRNA-486，得到工作曲线为I＝2500×log[C_miRNA-486]+40000(R²＝0.990)，通过计算检测限为205aM。

实施例4 SERS传感器用于血清样品检测的特异性表征

在10％浓度的正常人血清中，将miRNA-21和miRNA-486稀释到100pM，CEA稀释到100pg/mL，将单碱基错配序列(SM，相对于miRNA-21)、完全错配(miRNA-375)稀释到1nM，NSE蛋白(购买自上海领潮生物科技有限公司，上海，中国)稀释到1ng/mL，并将没有添加任何额外生物分子的正常人血清用作空白对照。实施例1制备的表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列基片分别和上述包含不同生物分子的样品在25-37℃，60-80％湿度环境中静置1-3小时，随后用TM缓冲液(20mM Tris-HCl、50mM氯化镁，pH 8.0)清洗检测芯片，并将实施例1制备的三种SERS探针的混合液滴加在小孔中共培养3-5小时后清洗。自然风干后在银纳米棒阵列基片上进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征峰强度值。

图5(A)是检测不同生物分子样品的SERS光谱，图5(B)是(A)图其谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处所对应的SERS峰强度。对于空白样品(blank)，观察到非常弱的SERS信号。同样，在单碱基错配(SM，相对于miRNA-21)和完全错配(miRNA-375)样品中也未检测到明显的SERS信号，这表明SERS传感器具有良好的可靠性。NSE蛋白样品的检测结果还表明，该用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的检测芯片几乎没有受到蛋白的干扰。在双元检测体系中，将100pM miRNA-21与100pg/mL CEA混合样品滴加在银纳米棒阵列基片表面，检测结果可以观察到DTNB(1327cm^-1)和2-MBT(1393cm^-1)明显的SERS特征峰，在100pg/mL CEA与100pM miRNA-486混合样品中，观察到2-MBT(1393cm^-1)和4-MBA(1581cm^-1)的SERS特征峰，在100pM miRNA-21与miRNA-486混合样品中，观察到DTNB(1327cm^-1)和4-MBA(1581cm^-1)的SERS特征峰。并且在同时检测100pM miRNA-21、100pg/mL CEA和100pM miRNA-486样品时，可以检测到明显的对应于DTNB(1327cm^-1)、2-MBT(1393cm^-1)和4-MBA(1581cm^-1)处的SERS特征峰。这些结果表明，所提出的SERS传感器可准确且特异性的在血清等复杂环境中实现多种核酸和蛋白生物标志物的一体化检测。

实施例5 SERS传感器均一性验证

将实施例1制备的SERS传感器与目标分子混合物(包含1pM miRNA-21、1pM miRNA-486和1pg/mL CEA)共培养3小时后，记录实施例1制备的SERS传感器上50个随机点的SERS信号来研究表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列基片的均一性。图6(A)是记录的50个随机点的平均SERS光谱，图6(B-D)是(A)图其谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处所对应的SERS峰强度。检测结果显示对应于miRNA-21、CEA和miRNA-486检测的50个随机点的SERS峰强度的相对标准偏差(RSD)很小，分别为9.01％，8.98％和7.24％。该结果表明，提出的SERS传感器具有良好的均一性。

实施例6 SERS传感器重现性

准备6组实施例1制备的表面修饰有四面体DNA的银纳米棒阵列基片和6组SERS探针，用于检测三种目标分子混合样品(包含1pM miRNA-21、1pM miRNA-486和1pg/mL CEA)。对于每组SERS传感器，采集在不同区域的10个随机点，并获得平均SERS光谱。图7(A)是6组SERS传感器检测目标miRNA-21、CEA和miRNA-486混合样品的SERS光谱，图7(B-D)是(A)图其谱线分别在1327cm^-1、1393cm^-1和1581cm^-1处所对应的SERS峰强度。检测结果显示6组SERS传感器的SERS峰强度的相对标准偏差(RSD)很小，分别为8.21％，4.67％和2.38％，说明所提出的SERS传感器具有良好重现性。

实施例7 SERS传感器回收率

用10％浓度的正常人血清将目标分子混合样品(包含miRNA-21、miRNA-486和CEA)稀释到表1中加入的目标分子浓度，将实施例1制备的SERS传感器分别对这三组包含不同浓度miRNA-21、miRNA-486和CEA的混合样品进行SERS检测，进行回收率表征实验，从表1中可以看出样品1、2和3中目标分子的检出浓度与配制值接近，SERS检测对应的回收率在91.96％～106.7％之间，样品检出准确度高，对于同时检测复杂的血清样本中低丰度生物标志物而言，该SERS传感器具有较好的可重复性与可靠性。

表1 10％浓度的正常人血清中目标生物分子的检测回收率表征结果

序列表

<110> 南京邮电大学

<120> 用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器及其制备方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> A(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctgaggca gttgagagat ctcgaacatt ccatcgtacg atcatagatc aat 53

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> B(Artificial Sequence)

<400> 2

taagtctgaa gatccattta tcaccagctg ctgcacgcca tagtagacgt atcacctgtc 60

c 61

<210> 3

<211> 114

<212> DNA

<213> C(Artificial Sequence)

<400> 3

agctacttgc tacacgagga tcttcagact taggaatgtt cgagatcaca tgcgaggact 60

cggtccaata ccgtactaac gattacagat caaattctag acgttactta acat 114

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> D(Artificial Sequence)

<400> 4

cagctggtga taaaacgtgt agcaagtagc tttgatctgt aatcgactct acgggaagag 60

c 61

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> E(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcccatcc ggctcactac tatggcgtgc agccataccg ccatttccaa cta 53

<210> 6

<211> 93

<212> DNA

<213> F(Artificial Sequence)

<400> 6

cgagtcctcg catgactcaa ctgcctcaga cggacaggtg atacgagagc cggatgggca 60

tgctcttccc gtagagatag tacggtattg gac 93

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> C1(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgataagct attattgatc tatgatcgta cgat 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> C2(Artificial Sequence)

<400> 8

tcagtacagg attatgttaa gtaacgtcta gaat 34

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> C3(Artificial Sequence)

<400> 9

ataccagctt attcaattta gttggaaatg gcggtatgg 39

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> P1(Artificial Sequence)

<400> 10

ttttttcaac atcagt 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> P2(Artificial Sequence)

<400> 11

tttttctcgg ggcagc 16

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> P3(Artificial Sequence)

<400> 12

tttttagggg gtgaagggat accc 24

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA-21(Artificial Sequence)

<400> 13

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA-486(Artificial Sequence)

<400> 14

uccuguacug agcugccccg ag 22

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 单碱基错配序列(Artificial Sequence)

<400> 15

uagcucauca gacugauguu ga 22

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 完全错配(Artificial Sequence)

<400> 16

uuuguucguu cggcucgcgu ga 22

Claims

1.用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器，其特征在于，所述SERS传感器包括表面修饰有四面体DNA结构的银纳米棒阵列基片和SERS探针，所述四面体DNA结构由六条DNA单链自组装而成，所述四面体DNA结构的三条棱边上有三条DNA单链分别连接三条捕获链，用于分别特异性结合核酸和肿瘤蛋白标志物。

2.根据权利要求1所述的用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器，其特征在于，所述六条DNA单链核酸碱基序列为：

A：5’-SH-(CH₂)₆-GTC TGA GGC AGT TGA G A GAT CTC GAA CAT TCC ATC GTA CGA TCATAG ATC AAT-3’；

B：5’-TAA GTC TGA AGA TCC A TTT ATC ACC AGC TGC TGC ACG CCA TAGTAG A CGTATC ACC TGT CC-3’；

C：5’-AGC TAC TTG CTA CAC GA GGA TCT TCA GAC TTA GGA ATG TTC GAG ATC A CATGCG AGG ACT CGG TCC AAT ACC GTA CTA A CGA TTA CAG ATC AA ATT CTA GAC GTT ACTTAA CAT-3’；

D：5’-CAG CTG GTG ATA AA A CGT GTA GCA AGT AGC TTT GAT CTG TAA TCG A CTCTAC GGG AAG AGC-3’；

E：5’-SH-(CH₂)₆-ATG CCC ATC CGG CTC A CTA CTA TGG CGT GCA G CCA TAC CGC CATTTC CAA CTA-3’；

F：5’-SH-(CH₂)₆-CGA GTC CTC GCA TG A CTC AAC TGC CTC AGA CGG ACA GGT GATACG A GAG CCG GAT GGG CAT GCT CTT CCC GTA GAG ATAG TAC GGTATT GGA C-3’。

3.根据权利要求1所述的用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器，其特征在于，所述核酸标志物为miRNA-21和/或miRNA-486，所述肿瘤蛋白标志物为CEA。

4.根据权利要求1所述的用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器，其特征在于，所述三条捕获链的核酸碱基序列为：

C1：5’-CTG ATA AGC TA TT ATT GAT CTA TGA TCG TAC GAT-3’，

C2：5’-TC AGT ACA GGA TT ATG TTA AGT AAC GTC TAG AAT-3’，

C3：5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT TAG TTG GAA ATG GCG GTA TGG-3’。

5.根据权利要求1所述的用于肿瘤蛋白和核酸标志物一体化检测的SERS传感器，其特征在于，所述SERS传感器包括单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液、单链DNA探针P2功能化的AuNP溶液和单链DNA探针P3功能化的AuNP溶液；所述单链DNA探针P1、P2、P3的碱基序列为：

P 1：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT TCA ACA TCA GT-3’，

P2：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT CTC GGG GCA GC-3’，

P3：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT AGG GGG TGAAGG GAT ACC C-3’。

6.权利要求1～5任一项所述的SERS传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)检测芯片的制备：制备银纳米棒阵列并用超纯水多次冲洗；制备四面体DNA结构的银纳米棒阵列基片：将六条特殊设计的DNA单链等物质的量混合并退火处理，组装形成四面体DNA，之后将等物质的量的三条捕获链与四面体DNA混合共培养1h，形成具有三条捕获臂的四面体DNA探针，即三条棱边上有三个用于结合三种目标分子的捕获端；将银纳米棒阵列和四面体DNA探针溶液共培养，四面体DNA探针通过四面体DNA上的三个巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面；依次用缓冲液和超纯水多次清洗基片，得到检测芯片；

2)SERS探针的制备：将单链DNA探针P1与AuNP溶液共培养，然后将NaCl溶液缓慢添加到混合物中，老化过夜后得到单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液，将5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)添加到单链DNA探针P1功能化的AuNP溶液中，经离心提纯后浓缩后即可制备用于miRNA-21检测的SERS探针；将DNA单链探针P2与AuNP溶液共培养，在加盐老化过夜后得到探针P2功能化的AuNP溶液，将4-巯基苯甲酸添加到探针P2功能化的AuNP溶液中，即可制备用于miRNA-486检测的SERS探针；将DNA单链探针P3与AuNP溶液共培养，在加盐老化过夜后得到探针P3功能化的AuNP溶液，将2-巯基苯并噻唑添加到探针P3功能化的AuNP溶液中，即可制备用于CEA检测的SERS探针；将上述制备的三种SERS探针混合即得用于miRNA-21、miRNA-486与CEA多元检测的SERS探针。

7.根据权利要求6所述的SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的四面体DNA与银纳米棒阵列共培养的培养条件为在25-37℃，60-80％湿度环境中静置3-5小时。

8.根据权利要求7所述的SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述四面体DNA探针溶液浓度为50nM-150nM。