CN105647788A - 用于核酸检测的sers传感器及其制备和多元检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸检测的SERS传感器及其制备和多元检测方法,该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成,核酸探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面,与目标核酸分子碱基互补配对后,通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化,实现对核酸的传感检测,基片表面的裸露位点用巯基己醇封闭。所述固体SERS基片为银纳米棒阵列型基片。所述的核酸探针链3’端修饰巯基,5’端修饰染料分子,探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构,部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。该传感器检测限达到飞摩尔级(fM),可实现多种核酸标志物的联合检测。本发明公开的传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性好,在肿瘤早期诊断等领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能纳米材料和生物检测领域,具体涉及一种用于核酸检测的SERS(表面增强拉曼散射)传感器及其制备方法和多元检测方法。
背景技术
近年来研究证明miRNA的表达失控与肿瘤的发生发展密切相关,miRNA在特定组织及特定发育阶段表达,具有组织特异性和时序性,这就决定了miRNA在疾病诊断中的重要作用。然而在病变的早期这些肺癌标志物含量很低,常规临床检测技术因其灵敏度的限制,容易对标志物产生漏检;而且至今尚未发现敏感度和特异性俱佳的单一肺癌标志物;此外,肿瘤标志物检测的样本一般是血液或组织,通常成分复杂,测试结果易受干扰,影响检测可靠性。针对肿瘤早期发现这一关键性问题,迫切需要发展便捷、灵敏、价格低廉的高灵敏检测新方法,对多种肺癌标志物实行联合检测。目前已公开的用于核酸检测的表面增强拉曼散射传感器比较少,针对血清中多元核酸标志物联合检测的方法还比较匮乏。因此,开发用于核酸标志物检测,尤其是痕量肿瘤核酸标志物检测的高性能SERS传感器,用于多种肿瘤miRNA标志物的联合检测是迫切需求。
发明内容
本发明提供一种用于核酸检测的表面增强拉曼散射(SERS)传感器及其制备方法和多元检测方法。该传感器以银纳米棒阵列型SERS基片为载体,经表面修饰特定核酸探针链构建得到,本发明同时提供了利用该核酸传感器的多元检测方法。
本发明采用的技术方案为:
用于核酸检测的SERS传感器,该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成,核酸探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面,与目标核酸分子碱基互补配对后,通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化,实现对核酸的传感检测。
基片表面的裸露位点用巯基己醇封闭。
所述固体SERS基片为银纳米棒阵列型基片。
所述的核酸探针链3’端修饰巯基,5’端修饰染料分子,探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构,部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。
所述染料分子为本领域常规的标记染料,包括但不限于ROX、Cy5、FAM等染料。
所述核酸探针链的浓度优选为1uM。
核酸探针链和目标核酸分子数量相等,每个核酸探针链对应一个目标核酸分子,构成一组互补杂交双链结构。
所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法,包括如下步骤:
1)制备固体SERS基片,然后用纯水多次冲洗;
2)取核酸探针链滴于固体SERS基片与固体SERS基片共培养,然后用缓冲液冲洗干净;修饰探针链的SERS基底在缓冲液中浸泡,使DNA形态保持稳定;
3)用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点,并用缓冲液轻轻冲洗干净,制备得到核酸检测SERS传感器。
步骤2)中所述共培养条件为在25℃,80%湿度环境中静置培养3h。
步骤2)中浸泡时间为10~30min。
所述的SERS传感器检测核酸的多元检测方法,将SERS传感器与待测样品溶液共培养后,用缓冲液冲洗进行SERS测试得到SERS信号,对照工作曲线计算得出待测样品中目标核酸的浓度。
所述工作曲线是将SERS传感器分别与含有多种目标核酸的不同浓度血清样品溶液共培养,得到不同浓度样品检测的SERS信号强度,以核酸浓度为横坐标,以SERS信号强度变化量为纵坐标做出工作曲线。
所述SERS传感器与待测样品溶液共培养条件为:在37℃,杂交反应2h。
本发明传感器基于银纳米棒阵列型SERS基片制作得到,首先选择特定的检测探针链,该探针链为可以与待检测核酸分子进行碱基互补配对,具有发卡型结构且带有染料分子的核酸片段,然后将上述探针链固定在银纳米棒阵列基片表面制备得到核酸SERS传感器。将待检测核酸滴加到上述传感器并培养,通过检测染料分子的SERS信号及其强度实现对待检测核酸的定性定量检测。
本发明中银纳米棒阵列型SERS基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备,具体方法按文献(C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modifiedsilvernanorodarrays:growthdynamicsandimprovedSERSproperties.JournalofMaterialsChemistry,2012,22(3):1150-1159.)中报到的方法制备。
本发明SERS传感器可以用于单元、双元及多元检测核酸,根据探针种类来实现混合核酸的检测。
以检测肺癌核酸标志物microRNA-21、microRNA-486和microRNA-375为示例制备用于三元检测的核酸SERS传感器。
所述示例的3种检测核酸碱基序列为:
microRNA-21:5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’
microRNA-486:5'-UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG-3'
microRNA-375:5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’
所述示例的3种发卡型探针链对应的核酸片段碱基序列为:
探针链1:5’-ROX-CCGTTCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’;
探针链2:5’-Cy5-CCGTTCTACTCGGGGCAGCTCAGTACAGGATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’;
探针链3:5’-FAM-CCGTTCTATCACGCGAGCCGAACGAACAAATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’。
本发明制备用于核酸检测的SERS传感器的优选方案中,核酸探针链3’端修饰巯基,5’端修饰染料分子ROX、FAM或者Cy5,探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构,部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。探针链通过金-硫键固定于银纳米棒阵列型SERS基底的表面,基底表面的裸露位点用巯基己醇封闭。
本发明制备用于核酸检测的SERS传感器的优选方案中,发卡型核酸探针链和目标核酸(待检测)分子部分碱基互补,每个发卡型核酸探针链均对应与一个目标核酸分子互补杂交,构成一组互补杂交双链结构。互补配对后,探针链的发夹型茎环打开,5’端修饰的染料分子远离SERS基底。
本发明中制备上述用于核酸检测的SERS传感器,包括如下具体步骤(以三元检测传感器为例):
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)将探针链1(1uM)、探针链2(1uM)和探针链3(1uM)分别进行高温冷却处理,即在95℃恒温摇床中保持5min,再在4℃冰箱保持20min,用于提纯发卡型DNA链;
(3)取三种核酸探针链(1uM)各20uL分别滴于SERS基片,在25℃,80%湿度环境中孵育3h,然后用缓冲液冲洗干净;修饰探针链1、2和3的SERS基片在缓冲液中浸泡20min,使DNA探针链形态保持稳定;
(4)用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点,并用缓冲液轻轻冲洗干净,制备得到用于三元核酸检测的SERS传感器。
(5)特异性检测:分别将不同血清样(见表1)和上述三元检测核酸SERS传感器共同孵育,在37℃恒温箱杂交反应2h;分别取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试,评估核酸SERS传感器对于血清样品的特异性和灵敏度。
(6)工作曲线:用10%的人血清分散等量microRNA-21、microRNA-486和microRNA-375,配置得到浓度1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM的三种核酸的混合溶液;将核酸SERS传感器与不同浓度的待检测物溶液中,在37℃恒温杂交反应2h;取出传感器用缓冲液冲洗后进行SERS测试,检测得到ROX、Cy5和FAM的信号,作microRNA-21浓度和ROX的SERS信号强度变化量的工作曲线,作microRNA-486浓度和Cy5的SERS信号强度变化量的工作曲线,对microRNA-375浓度和相应FAM的SERS信号强度变化量的工作曲线。
(7)SERS传感器用于三元核酸检测方法:将上述传感器与待检测的血清样品溶液共培养,在37℃恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试,检测到的SERS信号强度与工作曲线对照,得出待检测样品中目标核酸的浓度。
本发明的传感器以银纳米棒阵列型SERS基片为载体,通过在银棒表面有序地组装带有染料分子的发卡型核酸探针链,制备得到用于多种肿瘤miRNA标志物联合检测的SERS传感器,并公开了该类传感器用于血清样品中多种低丰度核酸肿瘤核酸标志物的快速、联合检测方法,为拓展SERS技术在肿瘤早期检测中的广泛应用提供了技术支持。
有益效果:本发明与现有技术相比,具有以下优点:
本发明利用银纳米棒阵列型SERS基片作为检测基片,具有优异的SERS性能,探针链通过金-硫键组装到银纳米棒阵列型SERS基片表面,在基片表面分布具有更优的均一性和稳定性;设计特殊的发夹型探针链结构使得检测结构简单有效;采用的固态SERS基片作为检测基片在样品分离提纯方面优势明显(相比于离心等提纯方式),固态基底通过冲洗可实现生物分子的快速分离,无设备要求,操作简单;该传感器检测限达到飞摩尔级(fM),可实现多种核酸标志物的联合检测。本发明公开的传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性好,在肿瘤早期诊断等领域有广泛的应用前景。本发明的核酸SERS传感器具有结构简单、制备方便等优点,并且具有良好的检测灵敏度,检测限可低于1fM,可以用于检测早期肿瘤血液样本中的低丰度核酸标志物;同时对各种核酸具有良好的普适性。
附图说明
图1是多元核酸检测SERS传感器构建及工作原理图。
图2是SERS传感器在缓冲液中单元检测对应非互补、单碱基错配、互补miRNA的SERS谱图。
图3是SERS传感器在缓冲液中单元检测对应非互补、单碱基错配、互补miRNA的SERS谱图中1503cm-1处峰值统计。
图4是多元血清样品检测的特异性表征:miRNA-21传感器检测结果(ROX探针)。
图5是多元血清样品检测的特异性表征:miRNA-486传感器检测结果(Cy5探针)。
图6是多元血清样品检测的特异性表征:miRNA-375传感器检测结果(FAM探针)。
图7是SERS传感器用于血清样品三元检测时对应miRNA-21的工作曲线。
图8是SERS传感器用于血清样品三元检测时对应miRNA-486的工作曲线。
图9是SERS传感器用于血清样品三元检测时对应miRNA-375的工作曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明的内容并不限于所举的实施例。
以下实施例中银纳米棒阵列型SERS基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备,具体方法按文献C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modifiedsilvernanorodarrays:growthdynamicsandimprovedSERSproperties.JournalofMaterialsChemistry,2012,22(3):1150-1159.中报到的方法制备。
以下实施例中所述示例的3种检测核酸碱基序列为:
microRNA-21:5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’
microRNA-486:5'-UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG-3'
microRNA-375:5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’
所述示例的3种发卡型探针链对应的核酸片段碱基序列为:
探针链1:5’-ROX-CCGTTCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’;
探针链2:5’-Cy5-CCGTTCTACTCGGGGCAGCTCAGTACAGGATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’;
探针链3:5’-FAM-CCGTTCTATCACGCGAGCCGAACGAACAAATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’。
实施例1单元检测microRNA-21的SERS传感器及其制备和检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)将探针链1(1uM)先进行高温冷却处理,即在95℃恒温摇床中保持5min,再在4℃冰箱保持20min,用于提纯发卡型核酸链;
(3)取20uL探针链1(1uM)滴于SERS基片,在25℃,80%湿度环境中静置3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH7.4)冲洗干净;修饰探针链的SERS基底在缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH7.4)中浸泡20min,使DNA形态保持稳定;
(4)用1mM巯基己醇溶液浸泡10min,封闭基片表面裸露的位点,并用缓冲液轻轻冲洗干净,制备得到单元检测的核酸SERS传感器。
(5)特异性检测:分别将目标检测物microRNA-21、单碱基错配核酸、完全不互补核酸用缓冲液稀释成100pM的核酸溶液;将核酸SERS传感器置于不同核酸液溶中,在37℃恒温箱杂交反应2h;分别取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试,评估核酸SERS传感器的特异性,结果见图2。
(6)工作曲线:将检测物microRNA-21用缓冲液稀释至不同浓度100aM,1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM的核酸溶液;将核酸SERS传感器置于不同浓度的待检测物microRNA-21液溶中,在37℃恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试,对目标核酸分子浓度和相应SERS信号强度作出核酸传感器的工作曲线,并计算传感器对这种目标核酸分子的线性范围和检测下限。(拉曼测试条件:扫描时间1s,激光功率10%,物镜放大倍率5x,累计次数5次,激发光波长633nm。)
(7)SERS传感器用于单元核酸检测方法:将上述传感器置于待检测的microRNA-21溶液,在37℃恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试,检测到的SERS信号强度与工作曲线对照,计算得出待检测样品的浓度。
SERS检测结果表明,SERS传感器可有效识别肺癌标志物microRNA21,SERS特征峰信号强度与初始信号的差值在RNA浓度区间100aM~100pM呈线性关系,最低检测极限达到100aM。
实施例2microRNA-21/486/375三元血清检测的SERS传感器及其制备和检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)修饰ROX并与microRNA-21对应的DNA探针链1(1uM)、修饰Cy5并与microRNA-486对应的DNA探针链2(1uM)和修饰FAM并与microRNA-375对应的DNA探针链3(1uM)分别进行高温冷却处理,即在95℃恒温摇床中保持5min,再在4℃冰箱保持20min,用于提纯发卡型DNA链;
(3)分别取三种20uL核酸探针链(1uM)滴于SERS基片,在25℃,80%湿度环境中静置3h,然后用缓冲液冲洗干净;修饰探针链的SERS基底在缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH7.4)中浸泡20min,使DNA形态保持稳定;
(4)用1mM巯基己醇溶液浸泡10min,封闭基片表面裸露的位点,并用缓冲液轻轻冲洗干净,制备得到三元检测的核酸SERS传感器。
(5)特异性检测:分别将不同血清样(见表1)和和核酸SERS传感器共同孵育,在37℃恒温箱杂交反应2h;分别取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试,评估核酸SERS传感器对于血清样品的特异性和灵敏度,检测结果见图4-6。
表1:多元检测特异性实验设计
(6)工作曲线:取等量且相同浓度待检测物100nM的microRNA-21、microRNA-486和microRNA-375充分混合均匀,再用10%的人血清至不同浓度1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM的核酸混合溶液;将核酸SERS传感器置于不同浓度的待检测物血清液溶中,在37℃恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试分别得到ROX、Cy5和FAM的信号,对microRNA-21浓度和相应ROX的SERS信号强度变化量作出核酸传感器对应microRNA-21的工作曲线,对microRNA-486浓度和相应Cy5的SERS信号强度变化量作出核酸传感器对应microRNA-486的工作曲线,对microRNA-375浓度和相应FAM的SERS信号强度变化量作出核酸传感器对应microRNA-375的工作曲线,并计算传感器对不同目标核酸分子的线性范围和检测下限。(拉曼测试条件:ROX:扫描时间1s,激光功率10%,物镜放大倍率5x,累计次数5次,激发光波长633nm;Cy5:扫描时间0.5s,激光功率5%,物镜放大倍率5x,累计次数1次,激发光波长633nm;FAM:扫描时间1s,激光功率10%,物镜放大倍率5x,累计次数5次,激发光波长633nm。)
(7)SERS传感器用于三元核酸检测方法:将上述传感器置于待检测的血清样品溶液,在37℃恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试,分别检测到ROX、Cy5和FAM的SERS信号强度,与工作曲线对照,计算得出待检测样品的浓度。
基于上述SERS核酸传感器在人体血清样品中开展了肺癌标志物核酸miRNA-21、miRNA-486、miRNA-375混合物的灵敏检测,三种探针ROX、Cy5、FAM的结果均显示出良好的特异性(如图4-6)。且当标志核酸miRNA21、miRNA486、miRNA375浓度分别在1fM-100pM、1fM-1nM、1fM-100pM之间时,拉曼信号强度与浓度之间存在有良好的线性关系(如图7-9),工作曲线分别为:
miRNA21:△ImiRNA21=721.41Log[miRNA21]+11536.56;检测下线:0.34fM
miRNA486:△ImiRNA486=574.95Log[miRNA21]+9388.38;检测下线:0.60fM
miRNA486:△ImiRNA375=549.76Log[miRNA21]+8936.59;检测下线:0.17fM
未知待检测的血清样品测试结果见表2。
表2:
应理解上述实施例仅用于说明本发明技术方案的具体实施方式,而不用于限制本发明的范围。本发明公开的传感器及其制备技术可用于制备单元、三元及多元检测的传感器。在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等同形式的修改和替换均落于本申请权利要求所限定的保护范围。
<110>南京邮电大学
<120>用于核酸检测的SERS传感器及其制备和多元检测方法
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
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<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
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<211>22
<212>RNA
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<212>DNA
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<210>6
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
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Claims (10)
1.用于核酸检测的SERS传感器,其特征在于,该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成,核酸探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面,与目标核酸分子碱基互补配对后,通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化,实现对核酸的传感检测。
2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器,其特征在于,所述固体SERS基片为银纳米棒阵列型基片。
3.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器,其特征在于,所述的核酸探针链3’端修饰巯基,5’端修饰染料分子,探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构,部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。
4.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器,其特征在于,核酸探针链和目标核酸分子数量相等,每个核酸探针链对应一个目标核酸分子,构成一组互补杂交双链结构。
5.权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备固体SERS基片,然后用纯水多次冲洗;
2)取核酸探针链滴于固体SERS基片与固体SERS基片共培养,然后用缓冲液冲洗干净;修饰探针链的SERS基底在缓冲液中浸泡,使DNA形态保持稳定;
3)用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点,并用缓冲液轻轻冲洗干净,制备得到核酸检测SERS传感器。
6.根据权利要求5所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法,其特征在于,步骤2)中所述探针链与固体SERS基片共培养的培养条件为在25℃,80%湿度环境中静置培养3h。
7.根据权利要求5所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法,其特征在于,步骤2)中浸泡时间为10~30min。
8.一种采用权利要求1所述的SERS传感器检测核酸的多元检测方法,其特征在于,将SERS传感器与待测样品溶液共培养后,用缓冲液冲洗进行SERS测试得到SERS信号,对照工作曲线计算得出待测样品中目标核酸的浓度。
9.根据权利要求8所述的SERS传感器检测核酸的多元检测方法,其特征在于,所述工作曲线是将SERS传感器分别与含有多种目标核酸的不同浓度血清样品溶液共培养,得到不同浓度样品检测的SERS信号强度,以核酸浓度为横坐标,以SERS信号强度变化量为纵坐标做出工作曲线。
10.根据权利要求8所述的SERS传感器检测核酸的多元检测方法,其特征在于,所述SERS传感器与待测样品溶液共培养条件为:在37℃,杂交反应2h。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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