CN112941178B - 一种用于snp位点检测的检测探针、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于SNP位点检测的检测探针、检测方法及其应用。本发明所述的检测探针包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第一核酸探针，所述第一核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第一识别链，所述第一识别链为发夹结构；所述第二检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第二核酸探针，所述第二核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第二识别链，所述第二识别链为发夹结构。本发明的检测方法克服了固态纳米孔在DNA单碱基突变检测中分辨率不足的缺点，实现了固态纳米孔对SNP位点的高灵敏检测，扩展了固态纳米孔在单分子检测领域的应用。
Description
技术领域
本发明纳米孔传感器检测领域，特别涉及一种用于SNP位点检测的检测探针、检测方法及其应用。
背景技术
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因序列上单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，包括单碱基的转换、插入与缺失。SNP在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变。通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系遗传图谱来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记，有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。在过去几十年中，人们发展了电泳，荧光以及质谱，芯片等多种技术手段来分析SNP遗传图谱，但这些方法多需要荧光探针等的标记以及PCR扩增，同时需要多种酶的参与，使其检测具有制备探针成本高，速度慢以及准确性低等问题，如芯片法，假阳性可高达40％，因此现有方案远远不能满足筛选和检测人类基因组中大量SNP图谱的要求，因此，有必要继续寻找一种稳定、快速、高效、可靠而又经济的检测分析方法，实现SNP的高通量检测需求。
纳米孔传感器作为一种新兴的单分子检测工具，它简单快速，无需标记，低成本，是一种理想的生物分子高通量检测平台。纳米孔一经发现，就用来进行DNA测序，目前利用生物纳米孔孔径小，分辨率高等优势，结合蛋白酶的辅助进行DNA测序已经取得了一定的进展。但生物孔结构不稳定以及不易保存等特点限制了应用。随着微加工技术的进步，以氮化硅等材料制备的固态纳米孔应运而生。固态孔大小可控，性质稳定，选择性强，适合多种检测环境(酸碱、浓度)，极大地扩展了纳米孔的应用范围。不过，纳米孔信号检测的高灵敏度要求纳米孔与检测分子尺寸相近，要想实现单碱基的识别，还需要sub-2nm的超薄固态纳米孔，这对固态纳米孔的加工工艺以及现有纳米孔信号采集放大装置具有一定的挑战。因此本发明构建了一种选择特异性的探针，简单可靠的检测方法，用于固态纳米孔实现对SNP位点的高灵敏检测，为纳米孔解读人类基因图谱以及疾病的诊疗，药物筛选提供了理论指导和技术支持。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种用于SNP位点检测的检测探针，该检测探针用于实现固态纳米孔对SNP位点的检测，即以纳米孔传感平台为基础，利用金纳米球表面修饰DNA分子探针，通过探针捕获SNP目标分子之后是否形成纳米颗粒二聚体来区分野生型和突变型位点的存在，从而实现SNP位点的高灵敏检测。本发明还提供了SNP位点的检测方法，使用金纳米球形成的组装结构在纳米孔检测过程中会形成信噪比更高的电流信号，从而判断目标基因片段是否具有SNP位点突变，提高了检测的灵敏性和通量，打破了固态纳米孔对生物小分子检测的瓶颈。本发明还提供了该检测探针在SNP位点检测中的应用。本发明使用性质稳定，大小可控的氮化硅纳米孔传感器作为检测工具，使得本方案对各类生物分子更具有普适性，低成本，高通量等优势，扩展了固态纳米孔传感器应用范围和发展的潜力。
技术方案：本发明第一方面提供了一种用于SNP位点检测的检测探针，包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第一核酸探针，所述第一核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第一识别链，所述第一识别链为发夹结构；所述第二检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第二核酸探针，所述第二核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第二识别链，所述第二识别链为发夹结构。
本发明中的识别链选择发卡结构，可以有效的减少非特异性吸附和碱基配对的随机性，而且本发明中的发夹结构为弱的发夹结构，增加了和目标探针的特异性的同时，减少了假阳性。
所述第一识别链与SNP目标分子5’端完全互补；所述第二识别链与SNP目标分子3’端完全互补。本发明通过识别链和SNP完全互补，形成二聚体，在检测时信号变化明显，易于分辨。
所述锚定链为polyA序列。polyA序列实现了数量可控的吸附在金球表面，实现单颗粒标记。
优选地，本发明在金纳米球上连接的探针，锚定链polyA后面设计有一段5-6个碱基的柔性片段，便于识别目标分子，核酸检测探针末端为识别链，为了增加捕获概率，根据SNP的序列，识别链与SNP目标分子互补，每个识别链的长度优选为SNP目标分子序列长度的一半，即第一核酸探针和第二核酸探针的识别链用于识别目标分子一半的序列。
本发明中单个的核酸探针的结构为锚定链-柔性序列-识别链。
本发明中单个检测探针的结构为金纳米球-锚定链-柔性序列-识别链。
优选地，所述金纳米球的直径为5-10nm。
所述金纳米球的直径为5nm。本发明通过对金纳米球的直径进行筛选，选用具有最大的体表比，便于修饰标记的金纳米球。
更优选地，本发明中选用的金纳米球的直径为5nm，polyA长度为60nt，60A可以较好的实现金球单颗粒标记。
本发明第二方面提供了一种用于检测胃癌p53基因SNP位点的检测探针，所述检测探针包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第一核酸探针，所述第一核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第一识别链，所述第一识别链为发夹结构；所述第二检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第二核酸探针，所述第二核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第二识别链，所述第二识别链为发夹结构；所述第一核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SNP目标分子对照的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明第三方面提供了一种利用上述检测探针检测SNP位点的方法，包括以下步骤：
(1)检测探针的制备
(11)取核酸探针(DNA探针)溶液与金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；
(12)加入PBS缓冲溶液，培养过夜，将样品离心，得到修饰后的DNA探针的金纳米球，得到第一检测探针以及第二检测探针；
(2)将SNP目标分子与步骤(1)制备的检测探针混合，充分震荡摇匀，培养过夜；
(3)修饰探针的金颗粒组装样品即制备完成，使用纳米孔传感器对含有金球探针与SNP目标分子的混合溶液进行检测，将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动其中小分子通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的大小来区分是否形成二聚体，从而实现对目标SNP位点的检测。
优选地，步骤(11)中，核酸探针的用量与金纳米球的用量可比，摩尔比例范围为1:1-1:10。
本发明中采用的锚定链polyA为整条链吸附在金纳米球表面，可调控核酸探针(DNA链)一对一标记，实现金纳米球单颗的单标记。
优选地，步骤(11)中，所述金纳米球粒的粒径为5nm。
优选地，步骤(2)中，检测探针是远远过量，增加产率，多余的通过离心去除。
在实际检测中，可以采用SNP目标分子与检测探针的1:100比例混合或者进一步增加检测探针的用量，可增加最终二聚体的产率。
优选地，步骤(3)中，所述纳米孔传感器的孔径为40nm。
作为一种优选方案，本发明中一种利用上述检测探针检测SNP位点的方法，包括以下步骤：
(1)第一检测探针的制备
(11)取第一核酸探针溶液与平均直径为5nm的金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；第一核酸探针溶液与金纳米球的摩尔比为1:1-1:10比例范围混合；
(12)加入PBS缓冲溶液，培养过夜：将样品离心，得到第一检测探针；
(2)第二检测探针的制备
(21)取第二核酸探针溶液与平均直径为5nm的金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；第二核酸探针溶液与金纳米球的摩尔比为1:1-1:10比例范围混合；
(22)加入PBS缓冲溶液，培养过夜：将样品离心，得到第二检测探针；
(3)将SNP目标分子与制备的第一检测探针以及第二检测探针混合，充分震荡摇匀，培养过夜；所述第一检测探针以及第二检测探针等比例混合(含量相同)；所述SNP目标分子与第一检测探针或者第二检测探针的摩尔比为1:100；
(4)修饰探针的金颗粒组装样品即制备完成，使用孔径40nm的纳米孔传感器对含有金球探针与SNP目标分子的混合溶液进行检测，将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动带电纳米颗粒通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的大小来区分是否形成二聚体，从而实现对目标SNP位点的检测。
本发明第四方面提供了利用上述的检测探针检测胃癌p53基因SNP位点的方法，包括以下步骤：
(S1)检测探针的制备
(S11)取核酸探针与金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；
(S12)加入PBS缓冲溶液，培养过夜：将样品离心，得到修饰后的DNA探针的金纳米球，分别制备第一检测探针以及第二检测探针；
(S2)将SNP目标分子与步骤(S1)制备的检测探针混合，充分震荡摇匀，培养过夜；
(S3)修饰探针的金颗粒组装样品即制备完成，使用纳米孔传感器对含有金球探针与目标分子的混合溶液进行检测，将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动其中小分子通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的大小来区分是否形成二聚体，从而实现对目标SNP位点的检测。优选地，所述纳米孔为氮化硅纳米孔，孔径40nm，具有良好的信噪比。
作为一种优选方案，本发明中一种利用上述检测探针检测SNP位点的方法，包括以下步骤：
(1)第一检测探针的制备
(11)取第一核酸探针溶液与平均直径为5nm的金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；第一核酸探针溶液与金纳米球的摩尔比为1:1-1:10比例范围混合；所述第一核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(12)加入PBS缓冲溶液，培养过夜：将样品离心，得到第一检测探针；
(2)第二检测探针的制备
(21)取第二核酸探针溶液与平均直径为5nm的金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；第二核酸探针溶液与金纳米球的摩尔比为1:1-1:10比例范围混合；所述第二核酸检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(22)加入PBS缓冲溶液，培养过夜：将样品离心，得到第二检测探针；
(3)将SNP目标分子与制备的第一检测探针以及第二检测探针混合，充分震荡摇匀，培养过夜；所述第一检测探针以及第二检测探针等比例混合(含量相同)；所述SNP目标分子与第一检测探针或者第二检测探针的摩尔比为1:100；所述SNP目标分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(4)修饰探针的金颗粒组装样品即制备完成，使用孔径40nm的纳米孔传感器对含有金球探针与SNP目标分子的混合溶液进行检测，将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动其中带电颗粒通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的大小来区分是否形成二聚体，从而实现对目标SNP位点的检测。
本发明第五方面提供了上述测探针在SNP位点检测中的应用。实现SNP位点的高灵敏高通量的检测。
所述的应用可以为用于检测胃癌p53基因SNP位点突变。
有益效果：(1)本发明通过金纳米球检测探针的设计，在金纳米球上修饰的核酸探针与目标分子结合后，可诱导纳米颗粒自组装形成二聚体，通过制备两段式核酸探针能够稳定的与金纳米球结合，将DNA单碱基的突变转化为纳米颗粒的结构变化，完成对SNP位点的检测，不仅降低了检测物在固态纳米孔通道中的易位速度，同时提高了检测分辨率，有利于实现对DNA单碱基突变分子的高通量、高灵敏检测，具有十分重要的研究价值，有效地解决了固态纳米孔中小分子过孔速度快，分辨率低等问题；(2)本发明利用氮化硅纳米孔传感平台，以金纳米球为载体，在金球表面设计核酸探针，对胃癌p53基因的SNP位点的野生型和突变型目标分子进行识别，提高了p53基因的SNP位点检测灵敏度；(3)本发明将DNA单碱基突变转化为金纳米颗粒单体与二聚体的结构差异，通过纳米孔传感器进行检测，不仅放大了检测信号，而且减慢了过孔速度，检测到高信噪比的信号；(4)本发明利用氮化硅纳米孔，结合纳米颗粒的修饰组装技术，实现了大孔径的固态纳米孔传感器对小生物分子的高通量检测。
附图说明
图1为本发明所述的检测探针(金纳米球载体修饰DNA探针的结构)，以及检测探针与野生型与突变型目标分子结合过程示意图；
图2为本发明用到的5nm金纳米球TEM表征图以及修饰DNA探针的金纳米球与SNP目标分子结合后形成的二聚体TEM表征图；
图3为本发明中修饰在金纳米球上的核酸探针与野生型与突变型目标分子识别后，产物加入前后纳米孔传感器得到的离子电流信号的变化轨迹图；
图4本发明制备的检测探针分别与野生型和SNP目标分子反应后形成的复合物在纳米孔内检测的特征信号阻塞幅值的柱状统计图和散点图。
图5本发明制备的检测探针与不同浓度的SNP目标分子反应后形成的单体和二聚体的信号比例。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：检测探针的制备
步骤1：取适量第一核酸探针(SEQ ID NO.1)与粒径5nm左右的金纳米球，按照1:10比例范围(摩尔比)混合DNA溶液与金纳米球，充分震荡摇匀，于25℃、300rpm的培养箱培养过夜。
步骤2：取体积约为步骤(1)中的混合溶液10％的1mol/L的PBS缓冲溶液，使得终溶液中PBS浓度约为0.1mol/L，PBS缓冲溶液分5次，每次间隔20min加入，每次加完充分震荡摇匀，待全部加入后，于25℃、300rpm的培养箱培养过夜：
步骤3：将样品置于高速控温离心机中，条件：15000rpm、25℃，高速离心后，底部出现沉淀即修饰DAN探针的金纳米球，多余DNA浮于上清液中，去除上清液后，用浓度0.1mol/L的PBS缓冲溶液复溶，重复以上步骤3次。
按照上述的方法，制备连接有第二核酸探针如SEQ ID NO.2所示的第二检测探针。
实施例2：纳米孔传感器检测
本实施例本发明选取了p53基因中野生型和突变型DNA片段为检测对象。
步骤1：取实施例1制备的两种探针样品，按照两种探针按照1:1的比例两两混合，充分摇匀。然后按照1：100的摩尔比例分别与野生型(SEQ ID NO.3)和SNP位点突变型(SEQID NO.4)目标分子反应，充分震荡摇匀后，于25℃,300rpm的培养箱培养过夜。
步骤2：将步骤1制备的探针样品与野生型(SEQ ID NO.3)与SNP位点突变型(SEQID NO.4)的混合物，放置于控温离心机中进行提纯(25℃、12000r.p.m)，去除上层清液后将沉淀析出，用浓度0.1mol/L的PBS缓冲溶液复溶，同时4℃冰箱保存用于纳米孔检测。
步骤3：将制备好的检测探针与目标分子的复合物，用40nm的氮化硅纳米孔传感器进行观测。首先将40nm的纳米孔芯片组装在0.1mol KCl电解池溶液中，纳米孔是唯一的离子通道。然后将稀释到1fM-1nM的复合物样品加入一层腔室中，然后施加0-1000mV的不同偏置电压进行信号检测，其采样频率为100KHz，低通滤波截止频率为10KHz。通过检测到阻塞信号的大小来区分是否形成二聚体，从而实现对SNP位点的检测。
表1 DNA探针设计和目标分子的序列
| DNA | sequence |
| 第一核酸探针(SEQ ID NO.1) | 60A GCGGACTCCAACACTCCGT |
| 第二核酸探针(SEQ ID NO.2) | 60A CTGCCCATGGTGGGGGCAG |
| Wild(SEQ ID NO.3) | GAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATG |
| SNP(SEQ ID NO.4) | GAGGTTGTGAGGCACTGCCCCCACCATG |
本发明的原理图如图1所示，本发明以金纳米球为载体，首先将设计的核酸探针修饰在金纳米颗粒上，进行金球的单颗粒标记。然后加入野生型和突变型目标分子进行识别，SNP型分子与DNA探针完全互补配对，易于打开探针发夹结构，连接两个金纳米球探针从而形成稳定的二聚体。野生型目标分子与DNA探针存在碱基错配，打开发夹需要克服更高能垒，难以形成二聚体，主要以单体形式存在。
图2中的(a)图为本发明实施例1所用的金纳米颗粒，直径5nm金球，性质稳定，大小均一，在溶液中良好的分散性。图2中的(b)图为实施例1制备的第一检测探针以及第二检测探针与SNP型目标分子结合后，引起的金纳米球的二聚体形貌分析，可以看出分子识别后，SNP型目标分子能够打开发夹，与金球上的DNA探针高效率的结合，形成高质量的金球二聚体。
图3为本发明实施例2中的修饰在金纳米颗粒上核酸探针与野生型与突变型目标分子识别后，产物加入前后纳米孔传感器得到的离子电流信号的变化轨迹图，其中，图3中(a)图为未加入任何样品时的基线电流变化图，离子电流平稳，表明纳米孔具有良好的伏安特性。图3中(b)图为单独加入SNP和野生型目标探针时，纳米孔离子电流变化图，从图3的(b)图中看出由于目标DNA分子片段小，速度快，在40nm的纳米孔离子电流中，基线电流几乎不变，难以检测到信号，也说明溶液中游离的目标DNA小分子不会对金纳米颗粒组装后产物的过孔信号产生干扰；图3中(c)图为修饰为第一核酸探针和第二核酸探针的金纳米球进入纳米孔内，离子电流的变化图。从图(c)中看出基线电流上产生了一系列尖锐的阻塞信号，该信号主要为修饰了核酸探针的金纳米单体产生的阻塞电信号；图3中(d)图为修饰第一核酸探针和第二核酸探针的金纳米球和野生型目标分子混合后制备的复合物进入纳米孔内，引起的离子电流的变化图。从图3的(d)图中看出和图3中的(c)图类似；图3中的(e)图为修饰第一核酸探针和第二核酸探针的金纳米球和SNP型目标分子混合后制备的复合物进入纳米孔内，引起的离子电流的变化图；和图3中的(c)图和图3中的(d)图比，从图中看出阻塞信号的形貌发生了变化，主要为探针和SNP目标结合后，形成金纳米颗粒二聚体，该组装体进入纳米孔产生的阻塞电信号。
图4为本发明实施例2中形成金纳米探针分别与野生型和SNP型目标分子反应后形成的复合物在纳米孔内检测的特征信号阻塞幅值的柱状统计图和散点图。图4中的(a)图和图4中的(b)图分别为野生型和SNP型目标分子与探针反应后，形成的复合物在纳米孔内产生阻塞信号幅值的柱状统计图，从中可以看到，图4中的(a)图出现了一个峰值，为金纳米探针单体产生的信号。；图4中的(b)图出现了两个峰值，为金纳米探针单体和组装成的二聚体产生的信号。图4中的(c)图为图4中的(b)图中阻塞信号统计的散点分布图，进一步证实了单体和二聚体分布在不同的区域。通过实验对比，可以发现本发明设计的探针序列不仅可以捕获目标分子，而且尾端自我形成发夹结构，这种设计可以有效地阻止探针之间的非特异性结合，大大降低假阳性结果的概率。
图5本发明制备的检测探针与不同浓度的SNP目标分子反应后形成的单体和二聚体的信号比例。图5中可以看出SNP浓度从0.1pM(100fM)，10pM,1000pM(1nM)浓度变化过程中，随着浓度的提高，单体的信号比例不断下降，二聚体的比例不断提高，可以实现从fM到nM的不同SNP目标探针的检测，同时该发明将DNA单碱基突变转化为金纳米颗粒单体与二聚体的结构差异，通过纳米孔传感器进行检测，不仅放大了检测信号，而且减慢了过孔速度，检测到高信噪比的信号，同时通过该设计实现了胃癌p53基因的SNP位点的野生型和突变型目标分子高灵敏高通量识别，提高了p53基因的SNP位点检测灵敏度。
所有的测试结果表明，本发明所设计的氮化硅纳米孔传感器可以实现对SNP位点的检测，解决了氮化硅纳米孔传感器在生物小分子检测过程中的速度快，分辨率低等问题，同时以金纳米颗粒为载体，使其纳米孔的尺寸不受检测分子大小的限制，大大提高了生物小分子的检测灵敏度，因此该发明对于基因组学中SNP谱图的发展具有重要的研究价值，可以用于基因组内的与各种疾病相关的SNP位点检测，包括肿瘤相关的基因组突变以及药物敏感性等紧密相关的基因突变。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种用于SNP位点检测的检测探针、检测方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
gcggactcca acactccgt 79
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
ctgcccatgg tgggggcag 79
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatg 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggttgtga ggcactgccc ccaccatg 28
Claims (5)
1.一种不以疾病诊断为目的的SNP位点检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）检测探针的制备：
（11）取核酸探针溶液与金纳米球混合，充分震荡摇匀，培养过夜；
（12）加入PBS缓冲溶液，培养过夜，将样品离心，得到修饰DNA探针的金纳米球，从而得到第一检测探针以及第二检测探针；
（2）将SNP目标分子与步骤（1）制备的检测探针混合，充分震荡摇匀，培养过夜；
（3）修饰探针的金颗粒组装样品制备完成，使用纳米孔传感器对含有检测探针与SNP目标分子的混合溶液进行检测，将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动带电纳米颗粒通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的大小来区分是否形成二聚体，从而实现对目标SNP位点的检测；
所述检测探针包括第一检测探针以及第二检测探针；所述第一检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第一核酸探针，所述第一核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第一识别链，所述第一识别链为发夹结构；所述第二检测探针包括金纳米球以及在金纳米球表面修饰的第二核酸探针，所述第二核酸探针包括与金纳米球连接的锚定链以及用于捕获SNP目标分子的第二识别链，所述第二识别链为发夹结构；所述锚定链为polyA序列；
所述第一核酸探针的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二核酸探针的序列如SEQ IDNO.2所示，所述SNP目标分子的序列如SEQ ID NO.4所示，所述SNP目标分子的野生型序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的SNP位点检测方法，其特征在于，所述第一识别链与SNP目标分子5’端完全互补；所述第二识别链与SNP目标分子3’端完全互补。
3.根据权利要求1所述的SNP位点检测方法，其特征在于，所述金纳米球的直径为5-10nm。
4.根据权利要求1所述的SNP位点检测方法，其特征在于，所述金纳米球的直径为5 nm。
5.根据权利要求1所述的SNP位点检测方法，其特征在于，所述纳米孔为氮化硅纳米孔。
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