CN112795565B - 检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。本发明所述的检测探针包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述连接段的序列长度为5‑8nt；所述引物段的长度为15‑20nt。本发明利用端粒酶对金纳米颗粒表面标记的探针序列进行延伸，当端粒延伸后，表面覆盖不同长度DNA产物的金纳米球通过固态纳米孔进行识别，实现了固态纳米孔对端粒酶活性的实时高灵敏监测。本发明通过端粒DNA链固定在金纳米球表面，不仅有助于酶的捕获，提高端粒酶的活性反应，同时DNA‑金纳米球的复合结构在纳米孔检测中起到信号放大的功能，可以直接对端粒酶活性进行实时监测。
Description
技术领域
本发明属于固态纳米孔传感器检测领域，特别涉及一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。
背景技术
端粒是一段具有重复序列(TTAGGG)的DNA序列，通常存在于细胞染色体的末端。在细胞分裂过程中，染色体的复制会导致端粒的不断缩短。而端粒酶作为体内广泛存在的一种逆转录酶，在维持端粒长度以及细胞生长、分化过程中起到非常关键的作用。端粒酶通过在端粒的3’端不断的复制TTAGGG的重复序列达到维持端粒长度以及细胞活性的目的。2009年，ELIZABETN等发现了端粒酶以及端粒对于细胞活性的保护机制而获得了诺贝尔医学奖。此后，许多研究表明端粒酶的活性过高可能会诱导细胞的永久性存活，甚至引发癌症。但是，端粒酶活性过低又会加速细胞衰老，甚至凋亡。在正常人的体细胞中，端粒酶处于抑制的状态，研究发现在包括胃癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等大多数癌症细胞中，端粒酶的活性明显高于正常水平。因此，端粒酶活性检测在癌症的诊疗等方面具有重大的研究意义。WEINBERG等发现，对于端粒酶的抑制可能会导致细胞的死亡。不仅如此，越来越多的研究者发现端粒酶可以作为重要的靶点在癌症的诊断，治疗方面发挥作用。因此，如何准确、灵敏、快速地获得端粒酶活性成为了在临床诊断和治疗方面的一大热点。
目前应用最广最为经典的方法是基于链式聚合反应的端粒酶重复序列扩增技术(PCR-TRAPs)。该方法将端粒延伸方法和聚合酶链式反应相结合，首先需要端粒酶在端粒底物的3’端不断的复制TTAGGG的重复序列，然后用与端粒重复序列互补的反向引物进行PCR扩增，然后利用电泳分离产物。该方法具有一定的灵敏度，但依赖于PCR扩增反应，操作繁琐，同时容易受到来自细胞内的其他物质的干扰，造成检测结果不准确，因此该方法也不适用于端粒酶有关药物的筛选。所以，提供一个简单直接的端粒酶单分子检测方案，来实现端粒酶活性的高灵敏检测具有十分重要的研究意义。同时，现今的研究中很难提供一个可以表征端粒酶延伸序列的动力学过程的实时检测过程，这对于研究细胞的生长与凋亡以及癌症，肿瘤的诊疗也具有十分重要的研究价值。
纳米孔传感器作为一种单分子检测工具，具有高通量、无需标记等特征，在近几十年来得到了广泛研究。该技术最早用于DNA测序，在DNA传输过程中每个碱基通过一个纳米级通道(纳米孔)时产生不同的离子脉冲信号，可以区分不同的核苷酸。固态纳米孔通常存在于固态薄膜上，分离出含有导电电解质的两个腔室，电极浸在每个腔室里。当施加一定的偏置电压在电极上，由此产生的电场使溶液中的电解质离子定向运动穿过孔隙，形成离子电流信号。当溶液中的生物分子进入纳米孔，当孔隙被堵塞时，离子电流会产生波动，形成一系列的阻塞电流信号。当分子穿过通道，离子电流回到基线电流。通过分析阻塞信号的幅值和持续时间，可以确定目标分子的物理和化学性质。在测序中，每一个核苷酸都以不同的方式阻断通道，从而产生不同的振幅和持续时间，这些信息再转化为DNA序列信息。除DNA测序外，纳米孔的无需标记、无需放大的单分子检测技术还可以在RNA检测、蛋白质检测等各种重大疾病的生物标志物检测方面得到应用。该技术具有的无标记、高通量、低的材料需求的显著优势，并且不会受PCR所引入的扩增偏差的影响，对生物信息进行直接读取，大大简化了实验过程，减少误差，因此非常适用于体内超低水平生物靶分子的检测以及疾病有关的药物的筛选，在临床诊疗具有很大的应用潜力。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。本发明使用金纳米颗粒通过Au-S键连接端粒酶引物作为探针，通过固态纳米孔传感器研究端粒酶活性与延伸的动力学过程，实现端粒酶活性的直接检测。
技术方案：本发明所述的一种检测探针，包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述连接段的序列长度为5-8nt；所述引物段的长度为15-20nt。
优选地，所述连接段通过Au-S键连接在金纳米颗粒表面。
优选地，所述引物段序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述金纳米颗粒的直径为5-10nm。
优选地，所述金纳米颗粒的直径为5nm，选用的金纳米颗粒均一稳定，其大小尺寸在纳米孔传感器形成高信噪比的易位信号，同时相对于单一的DNA链，可以极大地降低DNA在易位过程中的速度，提高检测的灵敏度。
本发明的检测探针使用金纳米颗粒作为载体，通过Au-S键将端粒DNA序列连接到金纳米颗粒表面，DNA序列提高了金纳米颗粒的分散性和稳定性，同时纳米颗粒提供表面载体，富集了反应物，降低了DNA分子的易位速度。
所述连接段为polyT序列。
本发明还提供了上述的检测探针在制备用于检测端粒酶活性的试剂盒中的应用。
优选地，本发明提供了一种用于固态纳米孔中的可实时检测端粒酶活性的检测探针，所述检测探针包括：包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述金纳米颗粒的直径为5nm；所述探针序列的引物段序列如SEQ ID NO.1所示；或者所述探针序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针序列通过Au-S键连接在金纳米颗粒表面；在金纳米颗粒和引物序列段之间还有一段柔性片段。优选地，柔性片段的长度为5-8nt。
本发明的原理为：探针序列(包括端粒DNA链)通过Au-S键连接到金纳米颗粒表面，并在端粒酶的活性反应中，生长为不同的长度的端粒序列，包覆在金纳米颗粒表面，作为检测探针，该检测探针可以实时检测端粒酶活性。当检测探针与端粒酶经过不同时间反应后，得到金球-DNA复合产物(金球-DNA复合产物，指酶活性反应后，表面覆盖不同长度的DNA序列的金纳米球)表面标记不同长度的DNA链，会引起过孔颗粒的电荷、体积以及扩散速度等发生改变，从而起易位过程中阻塞电流信号不同，并可以基于不同的阻塞电流信号来区分DNA链长度的变化，得到端粒酶活性。
本发明还提供了上述的检测探针在纳米孔传感器检测中的应用。
本发明所述的检测探针的制备方法，包括以下步骤：
(S1)取金纳米颗粒溶液，加入TBE溶液与巯基修饰的端粒酶引物序列；
(S2)将步骤(S1)得到的产物加盐老化；
(S3)将步骤(S2)老化后的DNA修饰金纳米颗粒离心，保留沉淀，得到DNA-金球复合物探针。
优选地，步骤(S1)中，根据金纳米颗粒的体表比，在实际操作过程中，满足加入的引入序列的量高于金纳米颗粒的用量，如可以选择金纳米颗粒与引物序列的摩尔比为1:100进行反应(引物序列的用量可以高于该用量)，保证金纳米颗粒充分修饰。优选地，步骤(S1)的操作步骤为：取200uL 50nM的直径为5nm的金纳米颗粒溶液，加入50uL 5×TBE溶液与2uL 100uM的巯基修饰的端粒酶引物序列，使用震荡仪震荡均匀，放入小摇床上使用37℃，500rpm反应10h。
优选地，所述端粒酶引物序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，步骤(S2)中，加盐老化为使用3M NaCl溶液，分5次加样，每次加入10uL，样品中的NaCl终浓度为500mM，继续放到小摇床上37℃，500rpm反应10h。
优选地，步骤(S3)中，将步骤(S2)得到的样品使用天平配平，使用冷冻离心机25℃使用15000rpm离心30min，去除上清液保留沉淀，使用超纯水复溶，重复三次，放置4℃冰箱储存。
本发明所述的端粒酶活性的直接检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：取上述步骤制备的DNA-金球复合物探针，加入TRAP溶液和反应碱基dNTP将反应物混合均匀，加入端粒酶，混合均匀，在37℃条件下反应；
步骤(2)：在反应一段时间后，加入SDS溶液终止端粒酶的延伸反应，在降温后，离心去除上清液，使用超纯水溶液复溶，重复三次；
步骤(3)：将获得不同时间梯度下的端粒酶延伸的DNA-金球复合物产物(DNA-AuNPs)，使用Tris溶液复溶，然后使用直径20nm的氮化硅纳米孔传感器对其进行检测，获得不同时间梯度下的端粒酶延伸端粒DNA序列长度的检测信号，从而获得端粒酶活性。
所述的不同时间段可以根据实际需要选择，如选择时间间隔为30-60min。
优选地，所述端粒酶来自hela细胞。在具体应用时，使用端粒酶提取液对培养的hela细胞进行裂解提取其中的端粒酶，冰浴10min，使用冷冻离心机4℃,15000rpm进行离心，并分装保存在-80℃的冰箱内储存。
优选地，步骤(1)中，dNTP加入的浓度在1mM以上，底物远远过量，保证反应充分进行。
优选地，步骤(1)中，取50uL上述所制备的检测探针，加入10uL TRAP溶液，2uL100mM dNTP溶液和28uL超纯水，混合均匀，加入上述提取的端粒酶提取液10uL，混合均匀，放置到摇床上反应，反应条件为37℃，500rpm。如上文所述，本发明的检测探针在加入端粒酶反应溶液后，端粒酶对端粒DNA链进行延伸，DNA链长度的变化将会引起DNA-AuNPs复合结构体积，电荷等改变，在纳米孔通道内易位时产生差异化的电流检测信号。通过易位信号统计分析可以实现对端粒酶活性及反应动力学过程的实时监测。本发明使用氮化硅纳米孔传感器，性质稳定，大小可控，操作简单，具有单分子单颗粒的灵敏度。
本发明选用的纳米孔传感器是20nm的氮化硅纳米孔，该纳米孔通道允许单颗粒的金纳米球及其端粒延伸后的金球-DNA复合物通过，并对复合结构的变化具有较高的灵敏度。
其中上述的巯基修饰的DNA溶液、NaCl溶液和TBE溶液都是使用超纯水配制。
所制备的金纳米颗粒载体表面标记端粒DNA序列。在具体应用时，标记后的金纳米颗粒，使用hela细胞提取的端粒酶溶液对其上的端粒酶引物序列进行延伸，然后使用纳米孔传感器对端粒酶延伸后的DNA-AuNPs复合产物进行检测。
有益效果：(1)本发明以金纳米颗粒为载体，在金纳米颗粒表面标记端粒序列，在端粒酶的活性反应中，对表面的端粒进行延伸反应，得到一系列表面覆盖不同长度端粒的金纳米球-DNA复合产物。该复合产物易于被纳米孔捕获，降低纳米孔通道内的易位速度，同时放大信号，便于进行实时检测，实现端粒酶活性与端粒延伸的动力学过程的高通量、高灵敏和高分辨的表征；(2)本发明采用的金纳米颗粒，具有独特的光电特性，尺寸可控，性质稳定，同时易于对金纳米颗粒进行修饰表征；在具体应用时选用5nm的金纳米颗粒作为端粒DNA序列的载体，通过Au-S键将端粒DNA连接在金纳米颗粒上，端粒DNA链在金球表面的固定富集，不仅有利于端粒酶的活化反应，同时金球-DNA复合结构将会极大地降低DNA的易位速度，对检测信号起到放大功能，提高了固态纳米孔传感器对DNA分子检测分辨率；当DNA链的长度发生变化时，也会影响金球-DNA复合结构的易位过程，产生十分明显的易位电流检测信号，通过信号变化能够实现对端粒酶活性的实时检测；(3)本发明通过在端粒酶反应溶液中，端粒酶对金纳米颗粒表面的端粒进行延伸，延伸后的DNA-金球复合结构通过氮化硅纳米孔传感器进行检测，通过检测到的电流轨迹信号实现对端粒酶活性的检测与端粒延伸动力学过程分析，5nm的金纳米颗粒在纳米孔内具有高的信噪比，同时制备的检测探针在溶液中有效地降低DNA分子的易位速度，提高了氮化硅纳米孔传感器的分辨率；(4)本发明在金纳米颗粒表面标记端粒DNA序列，有效的减慢了DNA小分子片段在纳米通道中的迁移速率，有效的富集反应物，易于酶的活性反应，同时提高了金纳米颗粒在溶液中的分散性和稳定性，提高了检测通量，端粒酶在适宜的条件下对端粒延伸，使的金球表面包覆不同长度的端粒产物，该DNA-AuNPs复合产物在易位时引起离子电流变化，产生差异化的电流轨迹信号；(5)本发明使用了更易于保存和使用的固态纳米孔传感器作为检测工具，从而使得本发明更具有通用性和应用的广泛性，同时扩展了固态纳米孔传感器对酶活性检测的应用领域；(6)本发明提供了一种检测端粒酶活性与端粒酶延伸端粒动力学过程表征的纳米孔检测方案，通过金球-DNA复合产物表面覆盖不同长度的DNA序列而引起的过孔颗粒的电荷、体积以及扩散速度的改变，检测到易位过程中阻塞电流信号不同，并基于不同的阻塞电流信号来区分DNA链长度的变化；(7)本发明通过对纳米孔传感器的孔径进行筛选，选择20nm的氮化硅纳米孔，该纳米孔通道允许单颗粒的金纳米球及其端粒延伸后的金球-DNA复合物通过，并对复合结构的变化具有较高的灵敏度。
附图说明
图1为金纳米颗粒表面标记端粒DNA链的制备流程图与氮化硅纳米孔传感器检测DNA-金球复合结构的示意图；
图2为本发明实施例中使用的金纳米颗粒的TEM图和金纳米颗粒修饰DNA前后的紫外吸收图；
图3为本发明实施例中随时间变化端粒酶对端粒活化延伸后得到的DNA-金球复合产物的zeta电位图；
图4为在随着时间变化，端粒酶对标记在金球表面的端粒活化延伸生成的DNA-金球复合产物在氮化硅纳米孔检测到的电流轨迹信号；
图5为不同的DNA-金球复合产物在氮化硅纳米孔检测到的特征事件信号图；
图6为端粒酶活化过程中，对不同催化时间下得到的DNA-金球复合物在纳米孔内检测的特征信号的滞留时间和阻塞幅值的柱状统计图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1：检测探针的制备
步骤(1)：取200uL 50nM的直径为5nm的金纳米颗粒溶液，加入50uL 5×TBE溶液与2uL 100uM的巯基修饰的端粒酶引物序列(SH-ttttttaatccgtcgagcagagtt)，使用震荡仪震荡均匀，放入小摇床上使用37℃，500rpm反应10h。
步骤(2)：将步骤(1)得到的产物加盐老化，使用3M NaCl溶液，分5次加样，每次加入10uL，样品中的NaCl终浓度为500mM，继续放到小摇床上37℃，500rpm反应10h。
步骤(3)：将步骤(2)得到的样品使用天平配平，使用冷冻离心机25℃使用15000rpm离心30min，去除上清液保留沉淀，使用50-100uL超纯水复溶，重复三次，得到检测探针，放置4℃冰箱储存。
其中巯基修饰的DNA溶液、NaCl溶液和TBE溶液都是使用超纯水配制。
本实施例所制备的金纳米颗粒载体表面标记端粒DNA序列，标记后，使用hela细胞提取的端粒酶溶液对其上的端粒酶引物序列进行延伸。
实施例2：DNA-AuNPs复合物的制备
使用hela细胞内提取的端粒酶对金纳米颗粒表面富集的端粒进行活化延伸，其操作步骤如下：
步骤(1)：使用缓和的CHAPS裂解液(aladdin)对培养的hela细胞进行裂解并提取其中的端粒酶，根据试剂盒的操作说明，在离心得到的细胞沉淀物中，约106个细胞加入200uL细胞裂解液，震荡，裂解，将其吸出放入1.5mL离心管；将离心管冰浴，放置4℃冰箱10min，使用冷冻离心机4℃，15000rpm离心30min后取出上清液分装，放置-80℃冰箱保存。
步骤(2)：取50uL实施例1制备的检测探针溶液(约20nM)，加入10uL TRAP溶液，2uL100mM dNTP溶液和28uL超纯水，混合均匀，加入步骤(1)提取的端粒酶提取液10uL，混合均匀，放置到摇床上反应，反应条件为37℃，500rpm。
步骤(3)：在反应一段时间后，将上述步骤(2)制备的延伸后产物的溶液加入10uL1％质量比的SDS溶液终止端粒酶的延伸反应，并放置到4℃降温约30min，离心去除上清液，使用冷冻离心机25℃，15000rpm离心30min，使用超纯水溶液复溶，重复三次，得到不同反应时间段的DNA-AuNPs复合物(具体为每隔1h取反应溶液加入SDS溶液终止端粒酶的延伸反应)。
通过上述步骤，使用SDS变性剂调控反应时间，可以获得不同时间梯度下的端粒酶延伸引物序列后不同长度的DNA序列的DNA-金球复合物产物(DNA-AuNPs)，使用Tris溶液复溶上述样品，然后使用直径20nm的氮化硅纳米孔传感器对其进行检测，可以获得不同时间梯度下的端粒酶延伸端粒DNA序列长度的检测信号，对端粒酶活性和端粒酶延伸端粒序列的动力学过程表征。
实施例3：纳米孔传感器对DNA-AuNPs复合物延伸产物的检测
根据实施例2的方法，通过SDS变性剂调控，制备不同时间的端粒酶延伸端粒DNA序列，产生不同链长的DNA-金球复合物，将所得的产物使用20nm的氮化硅纳米孔传感器使用600mV的偏置电压对不同时间梯度的DNA-金球产物(DNA-AuNps)进行检测，通过端粒酶对金球表面的端粒进行延伸后，会引起DNA-金球复合物表面所携带的荷电，水合粒径发生变化，这些性质的改变能够通过高灵敏的纳米孔离子电流信号的变化，通过产生的电流阻塞信号区分不同时间梯度下的产物，实现了纳米孔传感器对端粒酶的活性与对金球表面端粒序列延伸的动力学过程的监测。
图1展示了纳米孔对端粒酶活性检测的装置示意图。该过程中，端粒负载在金纳米球表面，在端粒酶的活性催化下，端粒不断延伸，从而使其DNA-金球复合物的大小和表面荷电发生改变，该复合物进入纳米孔检测装置，产生离子电流的不同阻塞信号，从而高灵敏的检测出端粒酶对端粒延伸动力学过程。在该反应中，固定在金纳米颗粒表面的端粒DNA序列，具有局域的浓度富集，有利于酶活性反应。同时金纳米颗粒负载端粒序列进入纳米孔，增加了体积排阻效应，具有减慢速度和信号放大的功能，易于纳米孔捕获，提高了纳米孔检测的通量和灵敏度。
图2中(a)图为本发明实施例1中使用的金纳米颗粒的TEM图；(b)图为实施例1中的标记端粒DNA前后金纳米颗粒的紫外吸收图。本实施例中DNA包覆在金纳米颗粒表面，通过铀染TEM电镜看出金颗粒表面模糊边界，可以证明DNA标记成功。同时紫外吸收图也比较了DNA标记前后金纳米球的紫外吸收峰的变化。
图3为本发明实施例3中的不同时间梯度下端粒酶对DNA-金球复合结构上的端粒酶引物延伸后测试的zeta电位，在本次试验中我们对金纳米颗粒、DNA标记的金纳米颗粒(以金纳米颗粒以及实施例1制备的检测探针(Au-Primer)作为对照)，以及实施例2的样品在2、3和5h活化反应中，端粒酶对金纳米颗粒上的端粒延伸得到的DNA-金球复合结构进行检测，从图3中可以看出，其金纳米颗粒表面的zeta电位会随着标记的端粒DNA的生长逐渐增大。实验结果表明了实验方案的可行性，也说明了使用端粒酶提取液提取的端粒酶保存着良好的活性。
图4为随着时间变化，端粒酶对标记在金纳米颗粒表面的端粒进行延伸，得到的不同长度的DNA-金球复合产物在氮化硅纳米孔检测到的电流轨迹信号图。从图中阻塞信号上可以看出随时间增加，端粒酶延伸引物后的DNA-金球复合产物产生的阻塞信号的滞留时间增加，幅值变大。这种阻塞信号可以很好的说明端粒酶对端粒延伸后的DNA链长度的变化。在金球表面的端粒DNA序列进入纳米孔的捕获区，金纳米颗粒负载端粒序列降低易位速度，同时金纳米颗粒相对较大的体积与较小的荷电，所产生的阻塞信号更大，起到信号放大的功能。DNA-金球探针进入纳米孔，引起电流信号的逐步下降。随着端粒DNA序列延伸的更长，DNA-金球探针的体积越大，产生更大的阻塞信号。
图5为端粒酶进行不同反应时间的DNA探针复合产物在氮化硅纳米孔传感器中检测到的特征事件电信号图。(a)图为端粒酶1h延伸后产物通过纳米孔的阻塞信号，(b)图为端粒酶2h延伸后产物通过纳米孔的阻塞信号，(c)图为端粒酶3h延伸后产物通过纳米孔的阻塞信号；在图中观测到阻塞电流信号从尖锐形状到矩形形状的转变，很好的反映出随着端粒酶的活性催化，负载在金纳米颗粒表面的端粒DNA序列延伸引起DNA-金球探针的体积大小和表面电荷都发生改变，从而引起不同的阻塞电流信号。
图6为端粒酶对端粒延伸过程中，不同时间点得到的DNA-金球探针在纳米孔内检测到的特征事件的阻塞幅值和滞留时间的柱状统计图。通过图示数据可以看出，不同时间下DNA-金球复合产物引起的阻塞信号的滞留时间逐渐增加，同时阻塞信号的幅值也会随着反应时间的增加而增大，证明了在酶的活性下，金球表面标记的端粒DNA链发生变化，从上述信号我们可以证明通过此方案可以应用于端粒酶活性的检测和端粒酶对端粒酶延伸端粒序列的动力学过程表征。
从本发明的所有的测试结果表明，本发明所设计的端粒在金纳米颗粒表面标记延伸后形成的DNA-金球复合产物在固态纳米孔传感器中可以实现端粒酶活性的检测和端粒酶延伸端粒序列的动力学过程表征，一方面通过金纳米颗粒作为载体形成的DNA-金球复合物解决了固态纳米孔传感器在检测DNA小分子易位速度过快的局限性，同时实现了从单分子水平上通过纳米孔电信号的变化直接读取端粒酶活化反应的信息，具有高的灵敏性和特异性。此研究对于使用固态纳米孔实现对DNA小生物分子检测的领域有着十分重要的研究意义，同时实现对癌症标记物端粒酶的活性检测与端粒酶延伸端粒序列的动力学过程表征具有十分重要的临床医学意义。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatccgtcga gcagagtt 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttttaatc cgtcgagcag agtt 24
Claims (3)
1.一种用于纳米孔传感器的检测探针在端粒酶活性检测中的应用，其特征在于，所述检测探针包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；
当检测探针与端粒酶经过不同时间反应后，得到表面标记不同长度DNA链的金球-DNA复合产物，不同长度DNA链引起金球-DNA复合产物易位过程中阻塞电流信号不同，基于不同的阻塞电流信号区分DNA链长度的变化，获得不同时间梯度下的端粒酶延伸端粒DNA序列长度的检测信号，从而得到端粒酶活性；
所述连接段通过Au-S键连接在金纳米颗粒表面；
所述探针序列如SEQ ID NO.2所示；
所述金纳米颗粒的直径为5-10 nm。
2.一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测探针的制备方法包括以下步骤：
（S1）取金纳米颗粒溶液，加入TBE溶液与巯基修饰的端粒酶引物序列；
（S2）将步骤（S1）得到的产物加盐老化；
（S3）将步骤（S2）老化后的DNA修饰金纳米颗粒离心，保留沉淀，得到DNA-金球复合物探针。
3.一种端粒酶活性的直接检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：取如权利要求2所制备的DNA-金球复合物探针，加入TRAP溶液和反应碱基dNTP，混合均匀，在37℃条件下反应；
步骤（2）：在反应一段时间后，加入SDS溶液终止端粒酶的延伸反应，在降温后，离心去除上清液，使用超纯水溶液复溶，重复三次；
步骤（3）：将获得不同时间梯度下的端粒酶延伸的DNA-金球复合物产物，使用Tris溶液复溶，然后使用直径20 nm的氮化硅纳米孔传感器对其进行检测，获得不同时间梯度下的端粒酶延伸端粒DNA序列长度的检测信号，从而获得端粒酶活性。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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