CN110835646B - 用于制备测序设备的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开一般涉及用于磁珠加载的系统，方法和装置。本公开的一个示例性实施例涉及将磁珠与测序珠子混合以形成溶液。将含有两种珠子的溶液注射到具有多个微井的微芯片上。磁珠可以具有比微井更大的直径，而测序珠子可以具有更小的直径，允许它们进入并存在于微井中。位于微芯片下方的一个或多个磁体在微芯片表面上来回移动。磁珠形成一条线并跟随磁体的运动。在扫描轮次期间，测序珠子加载到相应的井中。在加载测序珠子之后可以使磁体脱离并且可以洗掉磁珠。

Description

用于制备测序设备的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月16日提交的美国临时申请62/719,081的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本申请要求于2018年8月16日提交的美国临时申请62/719,078的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本申请要求于2019年8月12日提交的美国临时申请62/885,668的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
生物学和医学研究越来越多地转向用于加强生物学研究和医学的测序。例如，生物学家和动物学家正在转向测序以研究动物的迁移、物种的进化和性状的起源。医学界正在转向测序，以研究疾病的起源、对药物的敏感性和感染的起源。但是，测序在历史上是一个昂贵的过程，因此限制了它的实践。
除了其他问题之外，在将用核酸分子修饰的珠子加载到限制区域或接收部(例如微井或凹坑)中以形成用于测序的阵列方面存在挑战。将测序珠子以有组织的、紧密堆积的方式放置在例如小微井中，可以增加每个循环的通量并降低客户成本。随着微井密度的增加或微井尺寸减小，珠子加载变得困难，导致更多开放的微井和井中的珠子数量低。太多的开放微井提供了减少的基础读数，因此测序性能差。
发明内容
在一个示例中，制备测序设备的方法包括将具有用接头部分修饰的捕获的模板核酸的珠子支持物链接到具有互补接头部分的磁珠，以形成珠子组件，并使用磁场将珠子组件加载到测序设备的井中。可以使珠子组件变性以释放磁珠，使附着于靶核酸的珠子支持物留在井中。可以扩增靶核酸以提供可用于测序靶核酸的克隆靶核酸群。
在另一示例中，一种装置包括板，该板包含用于接收具有多个井的基板的表面；条形磁体，靠近板的与该接收基板的表面相对的表面；以及用于平行于板的表面移动条形磁体的驱动机构。基板用于接收溶液，该溶液包括与珠子支持物偶联的磁珠，例如测序珠子。磁珠的直径大于多个井中的井的直径。磁体的移动有利于珠子支持物沉积到井中。
实施例通常涉及将一个或多个测序珠子加载到阵列的一个或多个相应微井中，例如，形成在微芯片上的一个或多个相应微井。在某些实施例中，在克隆扩增后，每个测序珠子可含有相同多核苷酸片段的多个拷贝。
实施例一般涉及用于珠子支持物的磁性加载的系统、方法和装置。本公开的一个示例性实施例涉及将磁珠与测序珠子混合以形成溶液。多核苷酸、寡核苷酸或捕获部分可以在测序珠子的表面上形成或附着于测序珠子的表面。测序珠子可以通过多核苷酸、寡核苷酸或捕获部分与磁珠偶联，如下所述。将含有两种珠子的溶液注射到具有多个接收部(例如微井)的阵列的表面上。任选地，磁珠可以具有比微井开口更大的直径，而测序珠子可以具有更小的直径以允许测序珠子进入并存在于微井中。位于微芯片附近的一个或多个磁体平行于微芯片表面来回移动。在一个实施例中，磁珠形成线并跟随磁体的运动。在扫描循环期间，测序珠子加载到相应的井中。在加载测序珠子后，可以将磁珠与测序珠子分离，并且可以将其洗掉。
在特定示例中，测序珠子包括配置成捕获靶多核苷酸片段的寡核苷酸探针。在一个示例中，靶多核苷酸片段可包括捕获部分，例如生物素，并且磁珠可包括互补捕获部分，例如链霉抗生物素蛋白部分，例如，下文更详细描述。在另一个示例中，寡核苷酸探针可以与捕获的靶多核苷酸互补地延伸，靶多核苷酸可以与延伸的寡核苷酸探针分离，并且与延伸的寡核苷酸的末端互补的另外的捕获探针或引物可以与扩展的寡核苷酸杂交。另外的捕获探针或引物可包括捕获部分。在另一个示例中，与寡核苷酸探针互补并具有捕获部分的捕获探针可以与测序珠子的寡核苷酸探针杂交。
在每个示例中，测序珠子和磁珠可以使用捕获部分和磁珠表面上的互补捕获部分偶联。可以在阵列上施加测序珠子和磁珠。通过移动靠近阵列表面的一个或多个磁体，磁珠被拉过表面并且测序珠子进入阵列的微井。捕获部分和互补捕获部分可以解偶联，将磁珠与测序珠子分离，并且可以从表面洗掉磁珠，将测序珠子留在微井中。例如，可以通过熔化或化学分离杂交物将测序珠子与磁珠解偶联，从与磁珠结合的互补物释放测序珠子的寡核苷酸探针。在另一个示例中，可以切断捕获部分和互补捕获部分之间的连接。
在另一个示例中，可以选择或操纵测序珠子特征直径小于微井尺寸，并且可以将磁珠的尺寸设定为大于微井尺寸，从而允许测序珠子进入并排除磁珠。可以通过使用一个或多个磁体来辅助加载过程，所述磁体的磁通量扫过微井的表面上的珠子混合物。
在一个示例中，可以在偶联磁珠之前对测序珠子进行靶多核苷酸的克隆扩增。在另一个示例中，可以在偶联磁珠之后对测序珠子进行靶多核苷酸的克隆扩增。在另一个示例中，测序珠子可以在沉积到接收部(例如微井)中之后以及在解耦磁珠之后进行靶多核苷酸的克隆扩增。
在特定示例中，加载技术可用于系统中以进行测序。例如，系统包括光学测序系统或基于离子的测序系统。测序系统可以利用掺入的核苷酸的光学检测。在另一个示例中，基于离子的测序系统是基于pH的测序系统，其利用其中设置有微井的传感器基板。例如，图1示意性地示出了用于进行基于pH的核酸测序的系统。该装置的每个电子传感器产生取决于参考电压值的输出信号。流体回路允许多种试剂被输送到反应室。
在一个示例中，一旦珠子支持物(例如，测序珠子)沉积到井中并与磁珠分离，珠子支持物可用于测序反应。例如，测序珠子可包括与靶序列互补的寡核苷酸部分。可以添加引物以与寡核苷酸部分的末端杂交，并且可以以允许检测添加的核苷酸的顺序的方式进行测序反应。在另一个示例中，测序珠子可以具有寡核苷酸部分的单拷贝，并且通过应用引物，可以复制靶序列并将其拷贝到测序珠子上的其他寡核苷酸探针，从而在整个测序珠子中产生靶序列的克隆拷贝。在另一个示例中，测序珠子具有可以捕获靶多核苷酸的寡核苷酸捕获探针，其可以跨测序珠子复制以提供靶多核苷酸的克隆拷贝。
上述加载方法特别适用于依赖于检测井中测序反应的测序系统。例如，测序系统可以检测测序反应的产物，例如H+或H3O+离子，以确定核苷酸的掺入。例如，传感器组件包括与传感器阵列相关联的井阵列。传感器阵列的传感器可以包括场效应晶体管(FET)传感器，例如离子敏感场效应晶体管(ISFET)。在一个示例中，井的深度或厚度在100nm至10微米的范围内。在另一示例中，井可以具有0.1微米至2微米范围内的特征直径。传感器组件可以形成测序系统的一部分。
附图说明
通过参考附图，可以更好地理解本公开，并且其众多特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
图1包括示例性测序系统的图示。
图2包括示例性系统的图示，该系统包括传感器阵列。
图3包括示例性传感器和相关联的井的图示。
图4包括用于制备测序设备的示例性方法的图示。
图5，图6和图7示出了用于制备珠子组件的示例性方案。
图8和图9包括示例性珠子配置的图示。
图10包括示例性磁性加载系统的示意图。
图11示意性地示出了包含磁珠的溶液以第一速度相对于磁性封装的移动。
图12示意性地示出了包含磁珠的溶液以第二速度相对于磁性封装的移动。
图13示意性地示出了包含磁珠的溶液在相反方向上相对于磁性封装的移动。
图14示出了其上装有珠子的微芯片。
图15示意性地示出了磁性加载模型。
图16，图17，图18和图19包括示例性加载设备的图示。
图20示出了示例性流通池(flowcell)。
图21示出了具有盖玻片和载玻片并沿第一方向相对于磁体移动的另一示例性流通池。
图22示出了具有盖玻片和载玻片并沿第二方向相对于磁体移动的另一示例性流通池。
图23包括当在阵列表面上移动时试剂溶液内的堆边缘的照片图示。
图24示意性地表示珠子与磁场线的对准。
图25示出了磁体放置在微芯片上方的示例实施例。
图26示出了珠堆相对于图25的磁性装置的磁体的移动。
在不同附图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。
具体实施方式
在图1中，包含射流回路102的系统100通过入口连接到至少两个试剂贮存器104,106,108,110,112、废物贮存器120，并通过将流体学节点130连接到生物传感器134的入口138以进行流体连通的流体通道132连接到生物传感器134。来自贮存器104,106,108,110,112的试剂可通过各种方法(包括压力，泵，例如注射泵，重力进料等)驱动到射流回路102，并通过控制阀114来选择。来自射流回路102的试剂可以通过接收来自控制系统118的信号的阀114被驱动到废物容器120。来自射流回路102的试剂也可以通过生物传感器134驱动到废物容器136。控制系统118包括用于阀的控制器，其通过电连接116产生用于打开和关闭的信号。
控制系统118还包括用于系统的其他部件的控制器，例如通过电连接122与其连接的洗涤溶液阀124，和参考电极128。控制系统118还可以包括用于生物传感器134的控制和数据采集功能。在一种操作模式中，射流回路102在控制系统118的程序控制下将一系列所选试剂1,2,3,4或5递送到生物传感器134，使得在所选择的试剂流之间，射流回路102被灌注且被洗涤，并洗涤生物传感器134。进入生物传感器134的流体通过出口140排出，并通过夹管阀调节器144的控制而沉积在废物容器136中。阀144与生物传感器134的传感器流体输出140流体连通。
包括限定由第一通路和第二通路形成的井并暴露传感器垫的介电层的设备特别适用于检测化学反应和副产物，例如检测响应于核苷酸掺入的氢离子的释放，在基因测序以及其他应用中是有用的。在特定实施例中，测序系统包括其中布置有传感阵列的流通池，包括与传感阵列电子通信的通信电路，并且包括与流通池流体连通的容器和流体控制。在一个示例中，图2示出了流通池200的放大剖视图，示出了流动室206的一部分。试剂流208流过井阵列202的表面，其中试剂流208流过井阵列202的井的开口端。井阵列202和传感器阵列205一起可形成集成单元，集成单元形成流通池200的下壁(或底板)。参考电极204可以流体耦合到流动室206。此外，流通池盖230封装流动室206以在限定区域内容纳试剂流208。
图3示出了井301和传感器314的放大图，如图2的210处所示。可以基于发生的反应的性质以及采用的试剂、副产物或标记技术(如果有的话)来选择井的体积、形状、纵横比(例如基板宽度与孔的深度比)和其他尺寸特征。传感器314可以是化学场效应晶体管(chemFET)，更具体地是离子敏感FET(ISFET)，具有浮栅318，浮栅318具有传感器板320，传感器板320可选地通过材料层316与井内部隔开。传感器314可响应于(并产生与之相关的输出信号)与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量。材料层316可以是陶瓷层，例如锆，铪，钽，铝或钛等的氧化物，或钛的氮化物。或者，材料层316可以由金属形成，例如钛，钨，金，银，铂，铝，铜或其组合。在一个示例中，材料层316可以具有5nm至100nm范围内的厚度，例如10nm至70nm的范围，15nm至65nm的范围，或甚至20nm至50nm的范围。
虽然材料层316被示出为延伸超出所示FET组件的边界，但是材料层316可以沿着井301的底部并且可选地沿着井301的壁延伸。传感器314可响应于(并产生与之相关的输出信号)与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量。电荷324的变化可引起chemFET的源极321和漏极322之间的电流变化。反过来，chemFET可以直接用于提供基于电流的输出信号，或间接地与附加电路一起使用以提供基于电压的输出信号。反应物、洗涤溶液和其他试剂可通过扩散机构340移入和移出井。
井301可以由壁结构限定，壁结构可以由一层或多层材料形成。在一个实例中，壁结构可以具有从井的下表面延伸到上表面的厚度，其范围为0.01微米至10微米，例如0.05微米至10微米的范围，0.1微米至10微米的范围，0.3微米至10微米的范围，或0.5微米至6微米的范围。特别地，厚度可以在0.01微米至1微米的范围内，例如0.05微米至0.5微米的范围内，或0.05微米至0.3微米的范围内。阵列202的井301可以具有特征直径，定义为横截面积(A)除以Pi的4倍的平方根(例如，sqrt(4*A/π))，不大于5微米，例如不大于3.5微米，不大于2.0微米，不大于1.6微米，不大于1.0微米，不大于0.8微米或甚至不大于0.6微米。在一个示例中，井301可以具有至少0.01微米的特征直径。在另一个示例中，井301可以定义0.05fL至10pL范围内的体积，例如0.05fL至1pL范围内的体积，0.05fL至100fL的范围，0.05fL至10fL的范围，或甚至0.1fL至5fL的范围。
在一个实施例中，在井301中进行的反应可以是分析反应，以鉴定或确定目标分析物的特征或性质。这种反应可以直接或间接地产生影响传感器板320附近的电荷量的副产物。如果这些副产物以少量产生或快速衰变或与其他成分反应，则可同时在井301中分析同一分析物的多个拷贝，以增加产生的输出信号。在一个实施例中，分析物的多个拷贝可以在沉积到井301中之前或之后附着到固相支持物312。固相支持物312可以是微粒、纳米颗粒、珠子、包含凝胶的固体或多孔等。为了简单和易于解释，固相支持物312在本文中也称为颗粒或珠子。对于核酸分析物，可以通过滚环扩增(RCA)、指数RCA等技术制备多个连接的拷贝，以产生不需要固体支持物的扩增子。
特别地，固相支持物，例如珠子支持物，可包括多核苷酸的拷贝。在图4所示的特定示例中，聚合物颗粒可用作测序技术期间多核苷酸的支持物。例如，这种亲水性颗粒可以使用荧光测序技术固定多核苷酸用于测序。在另一个示例中，亲水性颗粒可以使用离子传感技术固定多个拷贝的多核苷酸用于测序。或者，上述处理可以改善聚合物基质与传感器阵列表面的粘合。聚合物基质可以捕获分析物，例如用于测序的多核苷酸。
珠子支持物可以由有机聚合物组成，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺，以及它们的共聚物和接枝物。支持物也可以是无机的，例如玻璃、二氧化硅、可控孔径玻璃(CPG)或反相二氧化硅。支持物的构型可以是珠子、球体、颗粒、小粒、凝胶或表面的形式。支持物可以是多孔的或无孔的，并且可以具有膨胀或非膨胀特性。在一些实施例中，支持物是离子球粒子。示例珠子支持物公开于标题为“HydrophilicPolymeric Particles and Methods for Making and Using Same”的US 9,243,085，和标题为“Polymer Substrates Formed from Carboxy FunctionalAcrylamide”的US 9,868,826，其中的每一个通过引用并入本文。
在一些实施例中，固体支持物是“微粒”、“珠子”，“微珠”等，(任选但不一定是球形的)具有50微米或更小的最小横截面长度(例如，直径)，优选10微米或更小，3微米或更小，约1微米或更小，约0.5微米或更小，例如，约0.1,0.2,0.3或0.4微米或更小(例如，小于1纳米，约1-10纳米，约10-100纳米，或约100-500纳米)。在一个实例中，支持物至少为0.1微米。微粒或珠子支持物可以由各种无机或有机材料制成，包括但不限于玻璃(例如，可控孔径玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、乳胶、聚苯乙烯等。磁化可以促进扩增后微粒附着试剂(例如，多核苷酸或连接酶)的收集和浓缩，并且还可以促进额外的步骤(例如，洗涤、试剂去除等)。在某些实施例中，使用具有不同形状尺寸或颜色的微粒群。可任选地对微粒进行编码，例如用量子点编码，使得可以单独或唯一地识别每个微粒或微粒组。
磁珠(例如，来自Dynal，Oslo，Norway的Dynabeads)可具有1微米至100微米，例如2微米至100微米的尺寸。磁珠可由无机或有机材料形成，包括但不限于玻璃(例如，可控孔径玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚苯乙烯或其组合。
在一些实施例中，珠子支持物被官能化以附着第一引物群。在一些实施例中，珠子是可以装入反应室的任何尺寸。例如，一个珠子可以装配在反应室中。在一些实施例中，一个以上的珠子装配在反应室中。在一些实施例中，珠子的最小横截面长度(例如，直径)为约50微米或更小，或约10微米或更小，或约3微米或更小，约1微米或更小，约0.5微米或更小，例如，约0.1,0.2,0.3或0.4微米或更小(例如，小于1纳米，约1-10纳米，约10-100纳米，或约100-500纳米)。
通常，珠子支持物可以被处理以包括生物分子，包括核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖类、多糖、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可以结合或附着于生物分子。生物分子的末端或任何内部部分可以结合或附着于聚合物颗粒。聚合物颗粒可以使用连接化学结合或附着于生物分子。连接化学包括共价键或非共价键，包括离子键、氢键、亲和键、偶极-偶极键、范德华键和疏水键。连接化学包括结合配偶体之间的亲和力，例如在以下之间：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫反应性片段；抗体和半抗原；地高辛部分和抗地高辛抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操作员和阻遏者；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或寡核苷酸或多核苷酸及其相应的互补物。
如图4所示，多个珠子支持物404可以与多个多核苷酸402(靶标或模板多核苷酸)一起置于溶液中。可以激活或以其他方式制备多个珠子支持物404以与多核苷酸402结合。例如，珠子支持物404可包括与多个多核苷酸402的多核苷酸的一部分互补的寡核苷酸(捕获引物)。在另一个示例中，可以使用诸如生物素-链霉抗生物素蛋白结合的技术用靶多核苷酸402修饰珠子支持物404。
在一些实施例中，模板核酸分子(模板多核苷酸或靶多核苷酸)可以衍生自来自天然或非天然来源的样品。样品中的核酸分子可以源自活生物体或细胞。可以使用任何核酸分子，例如，样品可以包括覆盖来自活生物体或细胞的部分或全部基因组，mRNA或miRNA的基因组DNA。在其他实施例中，模板核酸分子可以是合成的或重组的。在一些实施例中，样品含有具有基本相同序列或具有不同序列的混合物的核酸分子。通常使用在活细胞内由活细胞产生的核酸分子进行说明性实施例。此类核酸分子通常直接从天然来源例如细胞或体液中分离，而无需任何体外扩增。因此，样品核酸分子直接用于后续步骤。在一些实施例中，样品中的核酸分子可包括两种或更多种具有不同序列的核酸分子。
所述方法可任选地包括在库制备之前，期间或之后和预接种反应之前的靶富集步骤。可以例如通过多重核酸扩增或杂交来富集靶核酸分子，包括靶基因座或目标区域。多种方法可以用于进行多重核酸扩增以产生扩增子，例如多重PCR，并且可以用于一个实施例中。在将模板核酸分子加入到预接种的反应混合物中之前，可以通过任何方法进行富集，然后进行通用扩增反应。本教导的任何实施例可包括富集至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50，55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,125,150,175,200,250,300,400,500,600,700,800,900,1,000,2,000,3,000，4,000,5,000,6,000,7,000,8,000,9,000或10,000个靶核酸分子、靶基因座或目标区域。在任何公开的实施例中，靶基因座或目标区域可以是至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，17,18,19,20,25,50,75,100,125,150,200,250,300,400,500,600,700,800,900或1,000个核苷酸长度并包括一部分或整个模板核酸分子。在其他实施例中，靶基因座或目标区域的长度可以为约1至10,000个核苷酸，例如约2至5,000个核苷酸，约2至3,000个核苷酸，或约2至2,000个核苷酸。在本教导的任何实施例中，多重核酸扩增可包括产生每种靶核酸分子，靶基因座或目标区域的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40，45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,125,150,175,200,250,300,400,500,600,700,800,900,1,000，2,000,3,000,4,000,5,000,6,000,7,000,8,000,9,000或10,000个拷贝。
在一些实施例中，在库制备和可选的富集步骤之后，可以将模板核酸分子库模板化到一个或多个支持物上。一个或多个支持物可以在两个反应中模板化，即用于产生预接种的固体支持物的接种反应，和使用一种或多种预接种支持物以进一步扩增附着的模板核酸分子的模板化反应。预接种反应通常是扩增反应，可以使用多种方法进行。例如，预接种反应可以在RPA反应、模板步行反应或PCR中进行。在RPA反应中，在引物和核苷酸存在下使用重组酶、聚合酶和可选的重组酶辅助蛋白扩增模板核酸分子。重组酶和可选的重组酶辅助蛋白可以解离双链模板核酸分子的至少一部分，以允许引物杂交，然后聚合酶可以结合以启动复制。在一些实施例中，重组酶辅助蛋白可以是单链结合蛋白(SSB)，其阻止解离的模板核酸分子的再杂交。通常，RPA反应可在等温温度下进行。在模板步行反应中，模板核酸分子在引物和核苷酸存在下使用聚合酶在反应条件下扩增，所述反应条件允许至少一部分双链模板核酸分子解离，使得引物可以杂交并且聚合酶然后结合以启动复制。在PCR中，双链模板核酸分子通过热循环解离。冷却后，引物与互补序列结合，并可用于聚合酶的复制。在本发明的任何方面中，预接种反应可以在预接种反应混合物中进行，其由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在任何公开的方面，预接种反应混合物可包括以下一些或全部：模板核酸分子群，聚合酶，一种或多种固体支持物，其具有附着的第一引物群，核苷酸和辅助因子如二价阳离子。在一些实施例中，预接种反应混合物可进一步包括第二引物和任选的扩散限制剂。在一些实施例中，模板核酸分子群包括与至少一个可与第一或第二引物杂交的衔接子序列连接的模板核酸分子。在一些实施例中，反应混合物可以形成乳液，如在乳液RPA或乳液PCR中。在通过RPA反应进行的预接种反应中，预接种反应混合物可包括重组酶和任选的重组酶辅助蛋白。本文进一步详细讨论了反应混合物的各种组分。
在接种的特定实施例中，亲水性颗粒和多核苷酸进行聚合酶链式反应(PCR)扩增或重组酶聚合酶扩增(RPA)。在一个示例中，颗粒404包括与模板多核苷酸402的一部分互补的捕获引物。模板多核苷酸可与捕获引物杂交。捕获引物可以延伸以形成珠子406，珠子406包括与其附着的靶多核苷酸。其他珠子可以保持不与靶核酸附着，并且其他模板多核苷酸可以在溶液中自由漂浮。
在一个示例中，包括靶多核苷酸的珠子支持物406可以附着到磁珠410上以形成珠子组件412。特别地，磁珠410通过双链多核苷酸键附着到珠子支持物406。在一个示例中，包含接头部分的另一探针可与珠子支持物406上的靶多核苷酸的一部分杂交。接头部分可以附着到磁珠410上的互补接头部分。在另一个示例中，用于形成附着于珠子406的靶核酸的模板多核苷酸可包括附着于磁珠410的接头部分。在另一个示例中，与附着于珠子支持物406的靶多核苷酸互补的模板多核苷酸可以从用附着于磁珠410的接头修饰的引物产生。
附着于多核苷酸的接头部分和附着于磁珠的接头部分可以互补并相互附着。在一个实例中，接头部分具有亲和力并且可以包括：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫反应性片段；抗体和半抗原；地高辛部分和抗地高辛抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操作员和阻遏者；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或寡核苷酸或多核苷酸及其相应的互补物。在特定示例中，附着于多核苷酸的接头部分包括生物素，并且附着于磁珠的接头部分包括链霉抗生物素蛋白。
珠子组件412可以施加在包括井418的测序设备的基板416上。在一个示例中，可以将磁场施加到基板416以将珠子组件412的磁珠410拉向井418。珠子支持物406进入井418。例如，磁体可以平行于基板416的表面移动，导致珠子支持物406沉积在井418中。
可以使珠子组件412变性以移除磁珠410，从而将珠子支持物406留在井418中。例如，珠子组件412的杂交的双链DNA可以使用热循环或离子溶液变性以释放磁珠410和具有附着到磁珠410的接头部分的模板多核苷酸。例如，可以用低离子含量的水溶液(例如去离子水)处理双链DNA，以使链变性和分离。在一个示例中，泡沫洗涤可用于去除磁珠。
任选地，靶多核苷酸406可以在井418中的同时被扩增，在本文中称为模板化，以提供具有多拷贝靶多核苷酸的珠子支持物414。特别地，珠子414具有单克隆的靶多核苷酸群。可以使用聚合酶链式反应(PCR)扩增、重组聚合酶扩增(RPA)或其组合进行这种扩增反应。或者，可以在将珠子支持物414沉积在井中之前进行扩增。
在一个特定实施例中，酶(例如聚合酶)存在，结合到或紧邻颗粒或珠子。在一个示例中，聚合酶存在于溶液中或井中以促进多核苷酸的复制。多种核酸聚合酶可用于本文所述的方法中。在一个示例性实施例中，聚合酶可包括其酶，片段或亚基，其可催化多核苷酸的复制。在另一个实施例中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变体聚合酶、变体聚合酶、融合或其他工程化聚合酶、化学修饰聚合酶、合成分子或其类似物、衍生物或片段。示例酶、溶液、组合物和扩增方法可以在标题为“METHODS ANDCOMPOSITIONS FORMANIPULATING NUCLEIC ACIDS”的WO2019/094,524中找到，其全部内容通过引用并入本文。
虽然珠子支持物414的多核苷酸被示为在表面上，但是多核苷酸可以在珠子支持物414内延伸。相对于水具有低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可以包括在珠子支持物414的内部和整个珠子支持物414上的多核苷酸区段，或者多核苷酸可以存在于孔隙和其他开口中。特别地，珠子支持物414可以允许酶、核苷酸、引物和用于监测反应的反应产物的扩散。每个颗粒的大量多核苷酸产生更好的信号。
在示例实施例中，珠子支持物414可以用在测序设备中。例如，测序设备416可包括井418的阵列。
在一个示例中，可以将测序引物添加到井418中，或者可以在置于井418中之前将珠子支持物414预暴露于引物。特别地，珠子支持物414可包括结合的测序引物。测序引物和多核苷酸形成核酸双链体，其包括与测序引物杂交的多核苷酸(例如，模板核酸)。核酸双链体是至少部分双链的多核苷酸。可以向井418提供酶和核苷酸以促进可检测的反应，例如核苷酸掺入。
可以通过检测核苷酸添加来进行测序。可以使用诸如荧光发射方法或离子检测方法的方法检测核苷酸添加。例如，可以将一组荧光标记的核苷酸提供给系统416并且可以迁移到井418。还可以向井418提供激发能量。当通过聚合酶捕获核苷酸并将其添加到延伸引物的末端时，核苷酸的标记可以发荧光，表明添加了哪种类型的核苷酸。
在另一个示例中，可以依次加入包括单一类型核苷酸的溶液。响应于核苷酸添加，井418的局部环境内的pH可以改变。可以通过离子敏感场效应晶体管(ISFET)检测pH的这种变化。因此，pH的变化可用于产生指示与颗粒410的多核苷酸互补的核苷酸的顺序的信号。
特别地，测序系统可以包括设置在离子传感器例如场效应晶体管(FET)的传感器垫上的井或多个井。在实施例中，系统包括加载到井中的一个或多个聚合物颗粒，其设置在离子传感器(例如，FET)的传感器垫上，或者加载到多个井中的一个或多个聚合物颗粒，其设置在离子传感器(例如，FET)的传感器垫上。在实施例中，FET可以是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括一种用作化学传感器的场效应晶体管。chemFET具有MOSFET晶体管的结构模拟，其中栅电极上的电荷通过化学过程施加。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(例如H+)改变时，通过晶体管的电流相应地改变。
在实施例中，FET可以是FET阵列。如本文所用，“阵列”是诸如传感器或井的元件的平面布置。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是在第一维度中具有一列(或行)元件并且在第二维度中具有多列(或行)的阵列。第一维度和第二维度中的列(或行)的数量可以相同或不同。FET或阵列可包括102,103,104,105,106,107或更多个FET。
在实施例中，可以在FET传感器阵列上方制造一个或多个微流体结构，以提供生物或化学反应的抑制或限制。例如，在一个实施例中，微流体结构可被配置为布置在阵列的一个或多个传感器上方的一个或多个井(或多个孔，或反应室，或反应井，因为术语在本文中可互换使用)，使得设置给定井的一个或多个传感器检测并测量给定井中的分析物存在，水平或浓度。在实施例中，FET传感器和反应井可以是1：1的对应关系。
返回到图4，在另一示例中，井阵列的井418可以可操作地连接到测量设备。例如，对于荧光发射方法，井418可以可操作地联接到光检测设备。在离子检测的情况下，井418的下表面可以设置在离子传感器例如场效应晶体管的传感器垫上。
涉及通过检测核苷酸掺入的离子副产物进行测序的一个示例系统是Ion TorrentPGMTM，ProtonTM或S5TM测序仪(Thermo Fisher Scientific)，其是基于离子的测序系统，其通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的氢离子来对核酸模板进行测序。通常，氢离子作为在通过聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸掺入的副产物释放。IonTorrent PGMTM，ProtonTM或S5TM测序仪通过检测核苷酸掺入物的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。Ion Torrent PGMTM，ProtonTM或S5TM测序仪可包括待测序的多个模板多核苷酸，每个模板以阵列形式置于各自的测序反应井内。阵列的井可以各自与至少一个离子传感器联接，该离子传感器可以检测H+离子的释放或作为核苷酸掺入的副产物产生的溶液pH的变化。离子传感器包括联接到离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，其可以感测H+离子的存在或溶液pH的变化。离子传感器可以提供指示核苷酸掺入的输出信号，其可以表示为电压变化，电压大小与相应的井或反应室中的H+离子浓度相关。不同的核苷酸类型可以连续地流入反应室中，并且可以通过聚合酶以由模板序列确定的顺序掺入延伸引物(或聚合位点)中。每个核苷酸掺入可以伴随着反应井中H+离子的释放，以及局部pH的伴随变化。H+离子的释放可以由传感器的FET记录，其产生指示核苷酸掺入发生的信号。在特定核苷酸流动期间未掺入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号的振幅也可以与掺入延伸的核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量相关，从而允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室，同时通过多个井或反应室的掺入监测可以允许仪器同时分辨许多核酸模板的序列。
可以通过各种方法进行珠子支持物的接种和通过磁珠的捕获。例如，转到图5的502处，模板多核苷酸(B'-A)可以通过附着于珠子支持物510的捕获探针(B)捕获。捕获探针(B)可以与模板多核苷酸互补地延伸。任选地，可以使得到的双链多核苷酸变性，去除模板核酸(B'-A)并使单链(B-A')附着于珠子支持物510。如504处所示，用接头部分(例如生物素)修饰的引物(A)可以与附着于珠子支持物510的核酸(B-A')的部分(A')杂交。任选地，引物(A)可以延伸以形成互补核酸(A-B')。
如506所示，可以将磁珠512引入溶液中。磁珠512可包括与附着到引物(A)的接头部分互补的接头。例如，与引物(A)附着的接头可以是生物素，磁珠512可以用链霉抗生物素蛋白涂覆。如上所述，磁珠512可用于清洁溶液并有助于将珠子支持物510和附着的核酸(B-A')沉积到测序设备的井中。如508所示，可以使双链多核苷酸变性，导致核酸(B'-A)与附着于珠子支持物510的核酸(B-A')去杂交。因此，珠子支持物510沉积到测序设备的井中并具有单链靶核酸(B-A')。或者，接头修饰的探针(A)可以不延伸以形成具有多核苷酸(B-A')长度的互补多核苷酸。可以使用聚合酶链反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其他扩增反应进行延伸反应。
在图6所示的另一示例中，在具有捕获引物的珠子支持物的存在下扩增靶多核苷酸B-A'及其补体、模板多核苷酸(A-B')。靶多核苷酸具有与联接至珠子支持物的捕获引物序列相同或基本相似的捕获部分(B)。基本相似的序列是其补体可与每个基本相似的序列杂交的序列。珠子支持物可具有捕获引物，其是靶多核苷酸的B部分的序列或与靶多核苷酸的B部分基本相似的序列，以允许靶多核苷酸的捕获部分(B)的补体与附着于珠子支持物的捕获引物杂交。任选地，靶多核苷酸可包括与靶多核苷酸的捕获部分(B)相邻的第二引物位置(P1)，并且还可包括与引物相邻的靶区域，并由补体部分(A')界定到靶多核苷酸的测序引物部分。
当在包含捕获引物的珠子支持物的存在下扩增时，与靶多核苷酸互补的模板多核苷酸可以与捕获引物(B)杂交。靶多核苷酸可保留在溶液中。该系统不能经历延伸，其中捕获引物B与模板多核苷酸互补地延伸，产生与珠子支持物结合的靶序列。
可以在游离引物(B)、珠子支持物和附着有接头部分(L)的游离修饰的测序引物(A)的存在下进行进一步的扩增。引物(B)和修饰的引物(L-A)可以干扰自由浮动的靶多核苷酸和模板多核苷酸，阻碍它们与珠子支持物相互结合。特别地，具有附着于其的接头部分的修饰的测序引物(A)可以与附着于珠子支持物的靶多核苷酸的互补部分(A')杂交。任选地，可以延伸与靶多核苷酸杂交的接头修饰的测序引物L-A，形成接头修饰的模板多核苷酸。然后与附着于珠子支持物的靶核酸杂交的这种接头修饰的模板多核苷酸可以通过磁珠捕获，并用于测序设备的磁性加载。
可以使用聚合酶链反应(PCR)扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其他扩增技术进行扩增或延伸。在特定示例中，图6中所示的方案的每个步骤都使用PCR扩增进行。
在图7所示的另一示例中，另一种方案包括靶多核苷酸(P1-A')及其互补模板多核苷酸(A-P1')。靶多核苷酸和模板多核苷酸在包含接头修饰的测序引物(L-A)和具有带捕获引物(B)序列的部分的截短的P1引物(trP1)的溶液中扩增。在一个示例中，截短的P1引物(trP1)包括P1序列的子集或序列P1的所有。在接头修饰的测序引物(LA)和截短的P1引物(trP1-B)存在下的后续扩增期间，单个物种包括接头修饰的模板多核苷酸(LA-B')，其可操作以与具有捕获引物(B)的珠子支持物杂交。因此，接头修饰的模板多核苷酸(L-A-B')与珠子上的捕获引物(B)杂交并延伸以形成附着于珠子支持物的靶多核苷酸(B-A')。
与附着靶多核苷酸的珠子杂交的接头修饰的模板多核苷酸可用于附着到磁珠上，该磁珠可用于实现珠子磁性加载到测序设备中。如上所述，接头修饰的模板多核苷酸的接头部分可以采取各种形式，例如生物素，其可以结合到附着于磁珠的接头部分，例如链霉抗生物素蛋白。可以使用PCR、RPA或其他扩增技术进行每个扩增反应。在图7所示的示例中，该方案可以使用三个循环的聚合酶链反应(PCR)来实施。这样的一系列PCR反应导致更大百分比的珠子支持物，其上附着有单个靶多核苷酸。结果，可以在测序设备中的井中产生更多的单克隆群。
在替代实例中，如图8中所示，测序珠子802可包括暴露的寡核苷酸探针804。此类寡核苷酸探针804可捕获靶多核苷酸806。多核苷酸806可包括与磁珠上的表面官能团互补的捕获部分808。任选地，寡核苷酸探针804可以延伸以形成与靶多核苷酸806互补的部分810。在另一个示例中，可以从寡核苷酸探针804和任选部分810剥离多核苷酸806，并且可以将具有捕获部分818的引物或探针816与部分810的末端杂交。在另一个示例中，包含捕获部分814的捕获引物812被配置为被寡核苷酸探针804捕获。如图9所示，磁珠922可包括与测序珠子902的捕获部分920互补的表面部分924。在将测序珠子沉积到井中之后，可以将物种(多核苷酸或引物)熔化或以其他方式从寡核苷酸探针804或部分810分离，从而将测序珠子从磁珠中释放出来。
捕获部分可以是在结合配偶体之间具有亲和力的结合配偶体之一，例如在以下之间：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫反应性片段；抗体和半抗原；地高辛部分和抗地高辛抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操作员和阻遏者；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或寡核苷酸或多核苷酸及其相应的互补物。
图10是示例性磁性加载系统的示意图。具体地，图10示出了支撑芯片表面1010和流通池1020的基板1000。磁性封装1050布置在靠近基板1000的托盘1060中。
磁性封装1050示出为具有两个磁体1052和1054。尽管图10的实施例示出了磁体1052和1054，但是所公开的原理不限于此，并且可以包括比图10中所示更多或更少的磁体。磁体1052,1054可以用惰性材料1053分离。惰性材料1053可以用作非导电绝缘体。在某些实施例中，磁体1052和1054可以布置成使得磁体1052的北极立即横跨磁体1054的南极。利用这种布置，基板1000同时暴露于磁体1052和1054的北极和南极。在其他实施例中，磁体1052和1054可以布置成使得基板1000仅暴露于磁体的北极或南极。
基板1000可包括配置成接收微芯片1010(可互换地，芯片)的任何材料。微芯片1010可以包括顶表面，该顶表面具有多个接收部，例如微井，腔，凹坑，凹坑或其他接收部，配置成接收一个或多个测序珠子。在一个实施例中，芯片1000可包括配置成接收测序珠子的微井。一个这样的示例微芯片由提供，作为Ion 541ChipTM。下面参考图14讨论示例微芯片。
流通池1020定位在微芯片1010的上表面上方，以使得能够流体连通到微芯片的表面。流体可以通过形成在芯片1010顶部的端口1022和1024连通。磁珠和测序珠子(未示出)可以与一种或多种试剂一起通过端口1022和1024传递到微芯片1010的表面。一旦将测序珠子加载到微芯片1010的表面上，可以通过端口1022和1024传送洗涤试剂以去除不需要的颗粒或试剂。
托盘1060(和磁性封装1050)可相对于基板1000移动，如箭头1062所示。虽然基板的移动和定向被示出为水平的，但是在替代示例中，基板可以垂直定向，并且移动可以是上下移动。该移动可以由致动器1070与可编程处理器或控制器1080组合来布置，该可编程处理器或控制器1080指定托盘1060的移动速度和方向。致动器1070可以包括例如由具有处理器电路和存储器电路的一个或多个的控制器1080控制的电动机或螺线管。控制器1080可以是可编程控制器。在本公开的一个实施例中，控制器1080可以被配置为从辅助源接收输入信息1082以指示托盘1062何时应该相对于基板1000(其可以是静止的)移动。信息1082还可以包括与托盘1060的移动速度有关的数据，作为加载到芯片上的粒子类型的函数。这些数据可以存储在与控制器1080相关联的一个或多个存储器电路中。
图11示意性地示出了包含磁珠的溶液以第一速度相对于磁性封装的移动。在图11中，微芯片1110的上表面暴露于试剂(或溶液)1150。试剂1150可包括磁珠以及测序珠子。磁珠可包括具有亲和力或对磁场具有反应性的任何珠子。在一个实施例中，选择磁珠尺寸以使得不允许其进入微芯片表面上形成的微井，空腔或凹穴。示例性磁珠可以是基本上球形的，具有约1μm至100μm的直径。
磁体1152和1154由惰性材料1153分开以形成磁性封装。箭头1159示出了磁性封装1150相对于微芯片1110的移动方向。试剂1150设置在微芯片1110的顶部。试剂1150可包括与测序珠子联接的一个或多个磁珠。试剂1150可以是液体，凝胶或具有触变性(texotropic)和粘度的任何材料，以在固体表面上移动。多个磁珠(未示出)可以以使得磁珠可以相对于彼此自由移动或旋转的方式设置在试剂1150中。
图12示意性地示出了包含磁珠的溶液以第二速度相对于磁性封装的移动。图12示意性地示出了相对于图12的磁体运动更快的磁体运动(如箭头1160所示)。尽管试剂1150的形状显示出相对较宽的试剂分散体1150(含有磁珠)，但试剂1156的形状表明试剂更窄且密集(包含磁珠)。图11和12还示出了当相对运动缓慢时，试剂/珠子前缘与滞后磁体的内边缘或前缘对齐。当相对运动很快时，试剂/珠子堆落在滞后磁铁的前缘之后。
图13示意性地示出了包含磁珠的溶液在相反方向上相对于磁性封装的移动。箭头1162示出了磁体的移动方向的反转。如图13所示，当磁体切换运动方向时，试剂/珠子堆保持在相同位置，直到被新的滞后磁体(1154)内边缘拾取。磁体移动的反转方向可以有助于将珠子加载到微井中或允许试剂堆在微芯片上的阵列表面上多次扫描。
在一个示例中，磁体可以在5到50次扫描(横向和后向)之间循环，例如在5到35次扫描之间或10到30次扫描之间循环。在一个示例中，每次扫描花费1分钟到5分钟，例如1分钟到3分钟。一旦珠子支持物加载到井中，珠子组件就可以变性，并且可以对表面进行泡沫洗涤以除去磁珠。
当在微芯片上实施时，将包括珠子复合物的悬浮液沉积到微芯片表面上方的流通池中。图14示出了根据本公开的一个实施例的其上载有磁珠的微芯片。更具体地，图14示出了其上定位有流通池1412的微芯片1410。流通池1412包括用于接收和丢弃试剂的端口1422和1424。微芯片1410放置在基板1410上。一个或多个磁体(未示出)放置在基板1410下方。磁体产生磁场，该磁场使得一排磁珠1450形成在微芯片1410的表面上。磁体的移动引起线1450(即磁珠)沿着微芯片1410的表面移动。随着磁珠沿着表面移动，联接到试剂中的磁珠的测序珠子进入微芯片1410的表面上的井或腔。
图15示意性地示出了磁珠加载模型。在图15中，微芯片表面1502示出为具有多个微井1510。流1520尤其包含附着于磁珠1530的测序珠子1532,1534。如图15所示，测序珠子1532和1534可具有比磁珠1530更小的直径。微井1510的大小设计成接收测序珠子1532,1534。每个微井1510可以配置成接收至少一个测序珠子1532,1534并排除磁珠1530。虽然未示出，但是每个微井1510可以联接到包括一个或多个电极的感测电路，以及配置成检测微井1510中分析物的存在的电子电路。分析物可以与测序珠子偶联，或者可以由于井内的一个或多个反应而释放。表面1550示意性地示出了具有输入和输出端口(未示出)的流通池表面。
测序珠子可具有不同的尺寸。在一个实施例中，选择测序珠子1532,1534，使得至少一个测序珠子可以进入微井。换句话说，测序珠子直径可以选择为小于微井开口。虽然示出了具有锥形侧壁的微井1510，但是所要求保护的实施例不限于此，并且微井可以具有不同的形状和形式而不背离所公开的原理。
如图所示，流1520可包括多个珠子。磁珠1530可包括磁性。在某些实施例中，除了珠子之外，流1520可以包含其他试剂。磁珠1530可包括由Thermo Fisher Scientific提供的M-270或/>M-280，其珠子直径为约2.8μm。每个磁珠1530可以具有例如链霉抗生物素蛋白，用于与生物素化的核酸，抗体或其他生物素化的配体和靶偶联。可以使用这种生物素/链霉抗生物素蛋白结合将磁珠1530附着到测序珠子1532,1534。
这种加载方法可以在具有水平或垂直配置的硬件中实现。例如，硬件可以保持基板水平地沉积珠子。在另一个例子中，硬件可以垂直地保持基板，其中基板的平面大致平行于重力。如本文所用，垂直指的是其中基板的主表面的平面更接近于与重力平行而不是垂直于重力的取向。在图16，图17，图18和图19所示的示例中，磁性加载系统1600包括板1602和沿着板1602引导磁体的磁体保持器1604。在所示的示例中，板1602固定到垂直结构1614，垂直结构1614固定到水平结构1616。磁体保持器1604可以沿着板1602上下移动磁体，以便于将珠子支持物(例如测序珠子)加载到设置在板1602的相对侧上的基板的井中。
在特定示例中，驱动机构1606可以促进磁体保持器1604沿着板1602上下移动。例如，驱动机构1606可以旋转螺纹螺钉1618以沿着螺钉1618上下驱动连接器板1610。连接器板1610连接到磁体保持器1604。可选地，连接器板1610可以与引导板1608联接。引导板1608可以沿着导轨1612滑动，从而为连接器板1610和磁性保持器1604的运动提供稳定性。
如图17所示，基板保持器1720为基板例如具有流通池的微芯片提供空间1722，以插入并保持抵靠板1602。当附接到保持器1604的磁体沿着板1602的垂直表面上下移动时，附着在溶液中的磁珠上的珠子支持物沉积到基板的井中。在一个示例中，基板是具有流通池的测序芯片，溶液设置在该流通池中。
如图18所示，板1602可任选地包括凹槽以容纳加热器1824。加热器1824可用于控制板1602的温度，并且可选地控制位于板1602的表面附近的基板的温度。或者，加热器1824可用于促进双链核酸的融化。
磁性保持器1604可包括一个或多个磁体。例如，如图19所示，磁性保持器1604可包括磁体1928和磁体1930。磁体1928或1930可以通过空气分开。或者，磁体可以通过顺磁材料或绝缘材料分开。
在一个示例中，磁体被配置成使得磁体的不同轮询抵靠板1602定位。例如，磁体1928可以被配置为具有邻近板1602定位的北极，并且磁体1930可以被配置为具有与板1602相邻的南极。或者，磁体1928的南极和磁体1930的北极可以定位在板1602附近。在另一替代方案中，每个磁体的相同极可邻近板1602定位。
该系统还可包括传感器1926，其检测磁体的位置，例如，下边界。如图19所示，当磁体处于其下部位置时，引导板1608可以干扰光学传感器1926。或者，可以使用其他传感器来确定板和相关磁体的位置。
在将珠子加载到微芯片的井中之后，可以扩增测序珠子上的多核苷酸以在测序珠子上形成单克隆多核苷酸群。可以使用例如基于离子的测序技术对多核苷酸的单克隆群体进行测序。
在模板反应中，可以产生足够数量的基本上单克隆或单克隆群以在Ion TorrentPGMTM314,316或318测序仪上产生至少100MB，200MB，300MB，400MB，500MB，750MB，1GB或2GB的AQ20测序读数。对于相关的高通量系统，可以在单个扩增反应中产生足够数量的基本单克隆或单克隆扩增子以在Ion Torrent Proton，S5或S5XL测序仪上产生至少100MB，200MB，300MB，400MB，500MB，750MB，1GB，2GB，5GB，10GB或15GB的AQ20测序读取。如本文所用，术语“AQ20”及其变体是指测量Ion Torrent PGM TM测序仪中测序精确度的特定方法。准确性可以用类似Phred的Q得分来衡量，其以对数标度测量准确度：Q10＝90％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％，Q50＝99.999％。例如，在特定的测序反应中，可以通过预测算法或通过与已知参考基因组的实际比对来计算准确度度量。可以从查看输入信号的固有属性的算法导出预测的质量得分(“Q得分”)，并且对于序列“读取”中包括的给定单个碱基是否将对准进行相当准确的估计。在一些实施例中，这种预测的质量得分可用于在下游对准之前过滤和移除较低质量的读数。在一些实施例中，可以根据以对数标度测量准确度的类似Phred的Q得分来报告准确度，使得：Q10＝90％，Q17＝98％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％，Q50＝99.999％。在一些实施例中，可以过滤从给定聚合酶反应获得的数据以仅测量测量“N”个核苷酸或更长并且具有通过特定阈值的Q得分例如Q10，Q17，Q100(在本文中称为“NQ17”得分)的聚合酶读数。例如，100Q20得分可以指示从给定反应获得的读数的数量，其长度为至少100个核苷酸并且Q得分为Q20(99％)或更高。类似地，200Q20得分可以指示长度至少为200个核苷酸并且Q得分为Q20(99％)或更高的读数的数量。
在一些实施例中，还可以使用参考基因组序列基于正确比对来计算准确度，在本文中称为“原始”准确度。这是单次通过准确度，涉及测量与单次读数相关的每个基础误差的“真实”，与共识准确度相反，其从共有序列测量错误率，该共识序列是多次读取的结果。可以根据“AQ”得分(对准质量)报告原始精度测量值。在一些实施例中，可以过滤从给定聚合酶反应获得的数据以仅测量测量“N”个核苷酸或更长并且具有通过特定阈值的AQ得分例如AQ10，AQ17，AQ100(在本文中称为“NAQ17”得分)的聚合酶读数。例如，100AQ20得分可以指示从给定聚合酶反应获得的读数的数量，其长度为至少100个核苷酸并且AQ得分为AQ20(99％)或更高。类似地，200AQ20得分可以指示长度至少为200个核苷酸并且AQ得分为AQ20(99％)或更高的读数的数量。
示例
示例1
样品装置由盖玻片形成以显示流通池内的磁珠流动。图20示出了示例性流通池。在图20中，示例流通池用盖玻片2010制成。盖玻片2010的厚度小于约0.2mm。双面胶带用于粘合盖玻片。流通池直接放置在磁体2012上。如可以在图20看到的，磁珠直接吸引到磁体2012的内边缘。
图21示出了具有盖玻片和载玻片并沿第一方向相对于磁体移动的另一示例性流通池。在图21中，流通池2010和磁体2012由载玻片2008分开。箭头2002示出了流通池2010相对于磁体2012的移动方向。观察到，一旦流通池2010和磁体2012被载玻片2008(约1mm厚)分开，磁珠堆与滞后磁体对准，如图21所示。
图22示出了具有盖玻片和载玻片并沿第二方向相对于磁体移动的另一示例性流通池。在图22中，如箭头2010所示，运动方向改变。如可以在图22看到的，微珠现在与磁体2012的后缘对准。
图23示出了珠子堆前缘的光学放大图像。具体地，图23示出了在反射白光的流通池上20×1.6x放大的珠子。芯片向下面向。如图21和22所示，用盖玻片代替流通池。磁体(未示出)放置在微芯片的背面。珠子2308示出为累积在图23的右手侧。磁体的前导前缘(未示出)示出独特的粗略轮廓。
据信磁珠与磁场对准，从而引起磁场运动方向的吸引力。图24示意性地表示磁珠与磁场线的对准。在图24中，示意性地示出了磁珠2402以与外部磁场(未示出)对准。珠子的感应磁场使它们从前到后彼此吸引。该吸引力在珠子左侧的较深色和右侧的浅色的改变中示意性地示出。珠子也并排排斥。
示例2
图25示出了磁体放置在微芯片上方的示例实施例。在图25中，磁体2510位于显微镜物镜2520附近。微芯片2530位于磁体2510下方。对于该实验，磁体2510和物镜2520保持静止，并且微芯片通过自动化台移动。
图26示出了珠堆相对于图25的磁性装置的磁体的移动。图26示出了4x 1.6x放大。这里，芯片表面2610相对于珠子堆2620示出。可以看到粗糙边缘表示微珠边缘。磁体放置在微芯片表面2610上方。移动微芯片时，磁体保持静止。白光或Cy5荧光用于获得图26的图像。
示例3
根据上述方法加载芯片。使用标准离心技术加载第二个芯片。
对于离心技术，将Ion Torrent 541芯片用100μl的100mM NaOH洗涤60秒，用200μl无核酸酶的水冲洗，用200μl异丙醇冲洗，并抽吸干燥。为了加载芯片，将预接种的ISP涡旋，用退火缓冲液(Ion PITM Hi-QTM测序200试剂盒，Ion Torrent)使其达到45μl，并通过加载端口注入处理过的芯片中。
将芯片在1424rcf下离心2分钟。1ml泡沫(980μl50％退火缓冲液与20μl10％Triton X-100组合，移入1ml空气，并通过移液管进一步混合泡沫5秒)注入芯片中并且过量被吸走。200μl60％退火缓冲液/40％异丙醇冲洗溶液注入芯片中并将芯片吸干。用200μl退火缓冲液冲洗芯片，并将芯片真空干燥。
对于磁性加载，将库(2.4B拷贝)与生物素TPCRA(1uL，100uM)在PCR管中混合。使用1x Platinum HiFi混合物将管填充至20uL。将管在热循环仪上热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。60亿个珠子加入管中。加入1x HiFi以增加体积50％(即20uL珠子+10uL铂金Hifi混合物)。将溶液在热循环仪上热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。
将1mL MyOne珠子移液至1.5mL管(1mL MyOne珠用于2个样品)中，将管置于磁体上，弃去上清液。将1mL 3％BSA的1xPBS加入到MyOne混合物中，涡旋，脉冲旋转。将混合物放在磁体上，弃去上清液。向MyOne混合物中加入1mL AB，涡旋，脉冲旋转。将混合物放在磁体上，弃去上清液。将250uL AB加入到MyOne混合物中(一个样品使用125uL 4x浓缩的MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新的1.5mL管中。
将来自PCR管的样品转移到新的1.5mL管中。将125uL 4x浓缩的MyOne加入到ISP混合物中。将混合物上下吸移3次(200uL/s)并静置10分钟。将混合物放在磁体上，取出捕获的MyOne ISP(chef速度80uL/s)，弃去上清液。加入20uL NF水，脉冲涡旋，脉冲旋转，并置于磁体上以沉淀MyOne。
用200μLNF水冲洗芯片2次。将20μlISP混合物与4.5μL10x退火缓冲液和20.5μL水(总共45μl)混合。将ISP涡旋并与10x退火缓冲液和水混合。ISP溶液涡旋并快速旋转。ISP溶液通过加载端口缓慢注入芯片。以30秒/扫描进行磁性加载40分钟。通过芯片注入200μL泡沫(1x AB中的0.2％Triton)，并提取过量的泡沫。在抽真空出口时，加入200μL1xAB，然后吸出以干燥芯片。抽真空出口时，吸出200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL1xAB。
磁性加载的芯片显示出94％的加载，而离心机加载的芯片具有90％的加载。
示例4
接种
将库(2.4B拷贝)与生物素TPCRA(1uL，100uM)在PCR管中混合。使用1x PlatinumHiFi混合物将管填充至20uL。将管在热循环仪上热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。60亿个珠子加入管中。加入1x HiFi以增加体积50％(即20uL珠子+10uL铂金Hifi混合物)。将溶液在热循环仪上热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。
将1mL MyOne珠子移液至1.5mL管(1mL MyOne珠用于2个样品)中，将管置于磁体上，弃去上清液。将1mL 3％BSA的1xPBS加入到MyOne混合物中，涡旋，脉冲旋转。将混合物放在磁体上，弃去上清液。向MyOne混合物中加入1mL AB，涡旋，脉冲旋转。将混合物放在磁体上，弃去上清液。将250uL AB加入到MyOne混合物中(一个样品使用125uL 4x浓缩的MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新的1.5mL管中。
将来自PCR管的样品转移到新的1.5mL管中。将125uL 4x浓缩的MyOne加入到ISP混合物中。将混合物上下吸移3次(200uL/s)并静置10分钟。将混合物放在磁体上，取出捕获的MyOne ISP(chef速度80uL/s)，弃去上清液。加入20uL NF水，脉冲涡旋，脉冲旋转，并置于磁体上以沉淀MyOne。
芯片准备
用200μLNF水冲洗芯片2次。
磁性ISP加载
将20μlISP混合物与4.5μL10x退火缓冲液和20.5μL水(总共45μl)混合。将ISP涡旋并与10x退火缓冲液和水混合。ISP溶液涡旋并快速旋转。ISP溶液通过加载端口缓慢注入芯片。以30秒/扫描进行磁性加载40分钟。通过芯片注入200μL泡沫(1x AB中的0.2％Triton)，并提取过量的泡沫。在抽真空出口时，加入200μL1xAB，然后吸出以干燥芯片。抽真空出口时，吸出200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL1xAB。芯片保持在1x AB，直到准备扩增芯片上的ISP。
扩增-将所有试剂保持在冰上
第一步扩增
制备具有生物素化引物A和阻断分子(中性抗生物素蛋白)的管，并在冰上温育>15分钟。溶液包括每个芯片1.1uL 100uM引物和每个芯片1uL10mg/mL NAv(在0-PEG缓冲液中再水化)。将871μL再水合缓冲液加入1x IA沉淀(pellet)中(批次LTBP0047，PN100032944)。将溶液脉冲涡旋10x，快速旋转以收集管内容物。将内容物分成两个等体积的管(在单独的管中放入900uL)。一管900μL用于第一步扩增，保存900μL的另一管用于第二步扩增。
对于每个要运行的芯片，将60μL沉淀溶液缓慢注入芯片中。从出口端口吸出移位的退火缓冲液。将芯片与沉淀溶液在室温下孵育4分钟。将177.4μL起始溶液加入到沉淀溶液的管中，脉冲涡旋10X并快速旋转。将110uL/芯片的起始溶液转移到引物和阻断剂的管中，脉冲涡旋10X并快速旋转。对于每个芯片，将约60μL活化的沉淀溶液缓慢注入芯片中。从两个端口吸出所有排出的液体。向每个端口添加25μL沉淀溶液。将芯片置于设定为40℃的热板(热循环仪)上。用移液管尖端盒盖或类似物(不是加热的热循环器盖)覆盖芯片并孵育2.5分钟。
在扩增步骤之间的短反应停止和清洁
将扩增的芯片放置在配备有真空的罩附近。在抽真空出口端口时，加入200μL0.5MEDTA pH 8(VWR E522-100ML)，然后吸出以干燥芯片。抽真空出口时，吸出200μL1xAB，然后吸出以干燥芯片。重复添加AB并将芯片保持湿润以进行第二步扩增。(两次真空抽出AB并将第三个AB留在芯片中)
第二步扩增(无阻断剂)
制备具有生物素化引物A的管并在冰上温育>15分钟。溶液包括每芯片1.1uL100uM引物。将871μL再水合缓冲液加入1x IA沉淀(pellet)中(批次LTBP0047，PN100032944)。将溶液脉冲涡旋10x，快速旋转以收集管内容物。弃去适当体积的沉淀溶液后，将6.6μL100uM生物素化的引物加入沉淀混合物中，并将其脉冲涡旋10x。
将177.4μL起始溶液加入到沉淀溶液的管中，脉冲涡旋10x并快速旋转。对于每个芯片，将约60μL活化的沉淀溶液注入预旋转的芯片中。从两个端口吸出排出的液体。向每个端口额外添加25μL沉淀溶液。将芯片置于设定为40℃的热板(热循环仪)上。用移液管尖端盒盖或类似物(不是加热的热循环器盖)覆盖芯片并孵育20分钟。
反应停止和清洁
将扩增的芯片放置在配备有真空的罩附近。在抽真空出口端口时，加入200μL0.5MEDTA pH 8，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL1xAB，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL1％SDS水溶液(Ambion PN AM9822)，然后吸出以干燥芯片。重复SDS洗涤。在抽真空出口时，加入200μL1甲酰胺。将芯片在50℃温育3分钟，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL冲洗(50％IPA/50％AB)溶液。将芯片吸干。在抽真空出口时，加入200μL退火缓冲液。芯片留在1x AB中，直到准备启动。
片上测序引物杂交和酶
将测序引物管解冻。制备最终50％/50％AB/引物混合物的底漆混合物并充分涡旋。如果测序引物管的体积为250μL，则加入250μL1XAB。将芯片吸干至干燥，然后向芯片中加入80μL引物混合物(流通池中50μL，端口中30μL)。将芯片置于热循环仪上并在50℃下孵育2分钟，在20℃下孵育5分钟。注入200μL1xAB，同时抽真空出口。用60μL退火缓冲液和6μLPSP4酶制备酶混合物。端口被清洁并抽真空以从入口端口干燥芯片。将60μL酶混合物添加至芯片并在室温下温育5分钟。吸出芯片以从入口端口干燥芯片。立即向芯片中加入100μL的1x AB。清洁端口，干燥芯片背面，将芯片加载到Proton上进行测序。
示例5
接种
将具有A和B适配物(adapter)的Ampliseq Exome库(2.4B拷贝)与5'-生物素化引物在PCR管中混合，5'-生物素化引物与A适配物，TPCRA(1uL，100uM)互补。用含有Taq DNA聚合酶高保真度，盐，镁和dNTP的1x PlatinumHiFi混合物将管填充至20uL。将管在热循环仪上热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。向管中加入离子球粒子(ISP)珠子(60亿个)，每个固定有数千个B引物。加入1x HiFi以增加体积50％(即20uL珠子+10uL铂金Hifi混合物)。将溶液在热循环仪上热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。
在替代方法中，在PCR试管中，将12亿拷贝的Ion Ampliseq Exome库(20μL100pM，标准Ion Torrent A和P1库适配物)与3μL3μM生物素-TPCRA(序列5'生物素-CCA TCT CATCCC TGC GTG TC-3')和3μL1.5μMB-trP1(trP1是Ion P1适配物的23mer片段，序列为CCTCTC TAT GGG CAG TCG GTG AT；B是ISP引物序列)引物，和9μL离子Ampliseq HiFi MasterMix 5×混合。用10μL无核酸酶水将体积填充至45μL。将该管在热循环仪上热循环，具有以下温度曲线：在98℃下2分钟，[在98℃下15秒-在58℃下2分钟]的2个循环，最终在10℃下保持。在热循环后，将60亿ISP(75μL80,000/μL)和6μL Ion Ampliseq HiFi Master Mix 5×加入管中。还添加5μL无核酸酶水以使总体积达到131μL。将溶液充分混合并将管返回热循环仪。用以下温度曲线进行第三次扩增循环：在98℃下2分钟，在56℃下5分钟，最终在10℃下保持。热循环后，加入5μL EDTA0.5M并混合以终止反应。
ISP的富集
将具有共价偶联于珠子表面的链霉抗生物素蛋白的MyOne超顺磁珠子(1mL)移液到1.5mL管(1mL MyOne珠用于2个样品)中，将管置于磁体上，弃去上清液。将1mL 3％BSA的1xPBS加入到MyOne混合物中，然后涡旋，脉冲旋转。将混合物放在磁体上，弃去上清液。将退火缓冲液(AB；1mL)加入到MyOne混合物中，涡旋并脉冲旋转。将混合物放在磁体上，弃去上清液。将AB(250uL)加入到MyOne混合物中(一个样品使用125uL 4x浓缩的MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新的1.5mL管中。
将来自PCR管的包含ISP混合的样品转移到新的1.5mL管中。将浓缩(4x)MyOne珠子(125uL)加入到ISP混合物中。将混合物上下吸移3次(200uL/s)并然后允许静置10分钟。将混合物放在磁体上，取出捕获的MyOne ISP(chef速度80uL/s)，弃去上清液。向管中加入无核酸酶(NF)水(20uL)，然后脉冲涡旋，脉冲旋转，并置于磁体上以沉淀MyOne珠子。
在富集ISP的替代方法中，将120μL的MyOne链霉抗生物素蛋白C1珠子转移到单独的管中，并将管置于磁体上以沉淀磁珠。弃去上清液，从磁体移除管。通过重悬于150μLIonor Torrent退火缓冲液中来洗涤珠子，然后在磁体上沉淀。弃去上清液，用150μL退火缓冲液再重复洗涤一次。弃去第二次洗涤的上清液后，用50μL退火缓冲液重悬浮洗过的MyOneC1珠子。将退火缓冲液中洗涤过的MyOne C1的全部内容物转移到含有库和ISP的热循环PCR管中。将移液管的体积设定为160μL，通过每次抽吸或分配运动1秒钟上下吸移三次来缓慢混合内容物。使混合物在室温下静置30分钟而不搅拌，以允许磁珠捕获库接种的ISP。然后将管放在磁体上以沉淀磁珠，弃去上清液。将Tween-20(25μL0.1％)水溶液加入到沉淀中。将混合物剧烈涡旋以从MyOne C1珠子洗脱接种的ISP。将管脉冲旋转然后返回到磁体。将含有接种的ISP的上清液(洗脱液)收集在新管中，用于下游芯片加载和扩增步骤。
芯片准备
用200μLNF水冲洗芯片2次。
将ISP磁性加载到芯片上
使用几种制备ISP/库混合物并将其加载到含有反应室微井的Ion Torrent半导体芯片上的方法。在一种方法中，将ISP/库混合物(20μl)与4.5μL10x退火缓冲液和20.5μL水(总共45μl)混合。将混合物涡旋并旋转。ISP溶液通过加载端口缓慢注入芯片。以30秒/扫描进行磁性加载40分钟。通过芯片注入在1x AB中含有0.2％Triton的泡沫(200μL)，并提取过量的泡沫。抽真空芯片的出口时，将200μL1xAB注入芯片中，然后吸出以干燥芯片。抽真空出口时，将200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)注入芯片中，然后吸出以干燥芯片。抽真空出口时，将200μL1xAB通过注入芯片中加入。芯片保持在1x AB，直到准备扩增芯片上的ISP上的核酸。
在另一种方法中，将150μL Dynabeads M-270链霉抗生物素蛋白(Thermo FisherScientific)(其为具有与其表面结合的链霉抗生物素蛋白的磁珠)转移至管中，然后将其置于磁体中以沉淀磁珠。弃去上清液，从磁体移除管。然后将以下物质加入含有M-270沉淀珠子的试管中：来自接种过程的20μLISP混合物，9μL5×退火缓冲液和16μL无核酸酶水，总共45μL。或者，将20ul ISP/库混合物与3.2uL 10x退火缓冲液3uL浓缩的M270磁珠和5.8uL水混合，总共32μl。混合该混合物以重新悬浮M-270沉淀，并通过加载端口缓慢注入芯片中。放置在芯片下方的磁体反复扫过芯片以将ISP加载到芯片微井中。以30秒/扫描进行磁性加载扫描40分钟。加载后，剧烈摇动含有5mL 1％SDS的15mL falcon管以产生致密泡沫，然后将其800μL通过芯片注入以从芯片流通池中移除磁珠。在芯片出口处的流被丢弃。然后通过芯片注入退火缓冲液(200μL)，并丢弃通过的流。芯片从芯片出口抽真空干燥。通过芯片注入冲洗液(200μL的60％退火缓冲液，40％IPA)，然后将其真空干燥。注入退火缓冲液(200μL)以填充芯片流通池，并且在芯片出口处丢弃通过的流。芯片留有退火缓冲液，直到准备在下游扩增步骤中扩增。
扩增
第一步扩增
对于每个被扩增的芯片，将1.1uL生物素化的引物A(100uM)和1uL的阻断分子(10mg/mL在缓冲液中再水化的Neutravidin)在管中合并，并在冰上温育>15分钟。
将再水化缓冲液(871μL)加入含有反应组分的1xIA沉淀(PN 100032944)中，用于从ION PGMTM TEMPLATE IA 500试剂盒进行重组酶-聚合酶扩增(例如，重组酶，聚合酶，单链结合蛋白，核苷酸，缓冲液和其他成分)。将溶液脉冲涡旋10x并快速旋转以收集管内容物。在该过程中将再水合的内容物(称为“沉淀溶液”，大约900μl)保持在冰上。
对于每个Ion Torrent芯片，将60μL再水化的IA沉淀溶液缓慢注入芯片中。从出口端口吸出移位的退火缓冲液。将芯片与再水化IA沉淀溶液在室温下孵育4分钟。
对于每个被扩增的芯片，将90uL再水化的IA沉淀溶液转移到新管中。加入预先制备的生物素化引物A和中性抗生物素蛋白阻断分子(2.1uL)并脉冲混合。将含有28mM Mg(OAc)2,10mM Tris乙酸盐和3.75％(V/V)甲基纤维素的水溶液的起始溶液(30μL)加入到再水化的IA沉淀溶液的管中，脉冲涡旋10X并快速旋转以形成约120μL总体积的活化扩增溶液。对于每个芯片，将约60μL活化的扩增溶液缓慢注入芯片中。从两个端口吸出所有排出的液体。接下来，将25μL剩余的活化扩增溶液添加到每个芯片端口。将芯片置于设定为40℃的热板(热循环仪)上。用移液管尖端盒盖或类似盖(不是加热的热循环器盖)覆盖芯片并允许孵育2.5分钟。
在扩增步骤之间的短反应停止和清洁
从热板或热循环仪中取出扩增的芯片。在对出口进行抽真空的同时，将200μL0.5MEDTA pH 8(VWR E522-100ML)注入芯片中，然后使用真空吸出芯片以干燥。在对出口进行抽真空的同时，将200μL1xAB注入芯片中，然后吸出以干燥。将AB的添加重复两次并且将芯片填充以进行第二步扩增。(AB被抽真空两次，第三次加入AB留在芯片中。)
第二步扩增(无阻断剂)
对于每个芯片，将60μL再水化的沉淀溶液缓慢注入芯片中。从出口端口吸出移位的退火缓冲液。将芯片与沉淀溶液在室温下孵育4分钟。
对于每个被准备的芯片，将90uL再水化的沉淀溶液转移到新管中。加入生物素化的引物A(100μM的1.1uL)，将管脉冲涡旋并旋转。
将起始溶液(30μL)加入到含有再水化的沉淀溶液和引物A的管中，并脉冲涡旋10x并快速旋转以产生活化的扩增溶液。将约60μL活化的扩增溶液注入芯片中。从两个端口吸出排出的液体。向每个端口额外添加25μL剩余溶液。将芯片置于设定为40℃的热板(热循环仪)上。用移液管尖端盒盖或类似盖覆盖芯片并允许孵育20分钟。
反应停止和清洁
将经过扩增反应的芯片放在装有真空的罩子附近。在抽真空出口端口时，加入200μL0.5M EDTA pH 8，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL1xAB，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL1％SDS水溶液(Ambion PN AM9822)，然后吸出以干燥芯片。重复SDS洗涤。在抽真空出口时，加入200μL1甲酰胺。将芯片在50℃温育3分钟，然后吸出以干燥芯片。在抽真空出口时，加入200μL冲洗(50％IPA/50％AB)溶液。将芯片吸干。在抽真空出口时，加入200μL退火缓冲液。芯片留在1x AB中，直到准备启动。
片上测序引物杂交和酶反应
将含有离子测序引物(100uM)的管解冻。对于每个被测序的芯片，制备40uL退火缓冲液和40uL测序引物的引物混合物并充分涡旋。将芯片吸干至干燥，然后向芯片中加入80μL引物混合物(流通池中50μL，每个端口中15μL)。将芯片置于热循环仪上并在50℃下孵育2分钟，在20℃下孵育5分钟。注入200μL1xAB，同时抽真空出口。用60μL退火缓冲液和6μL测序酶(Ion PSP4测序聚合酶)制备酶混合物。端口被清洁并抽真空以从入口端口干燥芯片。将酶混合物(60μL)添加至芯片并在室温下温育5分钟。将芯片吸干。注入AB(100μL的1x)以立即填充芯片。清洁端口，干燥芯片背面，将芯片加载到Ion Torrent Proton(Thermo FisherScientific)装置上进行库核酸的测序。
在第一实施例中，将珠子支持物加载到基板的多个反应井中的反应井中的方法(每个反应井在基板的第一表面处具有入口开口)包括将具有多个珠子复合物的悬浮液引入到基板上，所述多个珠子复合物的珠子复合物包括与珠子支持物偶联的磁珠。该方法还包括使磁性装置平行于基板的第二表面移动，第二表面与第一表面相对，磁珠被吸引到第一表面，珠子支持物进入多个反应井中的反应井。该方法还包括将磁珠与珠子支持物分离并将磁珠从基板上洗掉。
在第一实施例的示例中，磁珠的珠子直径大于多个反应井的开口，并且其中珠子支持物的珠子直径小于多个反应井的开口。
在第一实施例和以上示例的另一示例中，磁性装置包括由惰性材料分开的一对磁体。例如，该对磁体中的第一磁体具有邻近基板的第二表面设置的北极，并且该对磁体中的第二磁体具有邻近基板的第二表面设置的南极。
在第一实施例和上述实施例的另一个实施例中，珠子支持物是其上具有多核苷酸的测序珠子。例如，该方法还包括扩增多核苷酸以在测序珠子上提供多核苷酸的多个拷贝。在另一个示例中，该方法还包括对基板的反应井中的附着于珠子支持物的多核苷酸进行测序。
在第一实施例和以上示例的另外示例中，使磁性装置平行于基板的第二表面移动包括使磁性装置沿平行于基板的第二表面的不同方向移动。
在第一实施例和上述实施例的另一个实施例中，珠子支持物与多核苷酸偶联，所述多核苷酸具有设置在珠子支持物远侧的接头部分，磁珠具有互补的接头部分，当珠子支持物的接头部分与磁珠的互补接头部分连接时形成珠子复合物。在一个示例中，具有接头部分的多核苷酸与共价结合至珠子支持物的第二多核苷酸杂交，其中将磁珠与珠子支持物分离包括将多核苷酸与第二多核苷酸分离。在另一个示例中，将多核苷酸与第二多核苷酸分离包括用低离子强度水溶液洗涤。在另一个示例中，将多核苷酸与第二多核苷酸分离包括加热基板。
在第一实施例和上述实施例的另一个实施例中，该方法还包括：产生模板核酸，其包括捕获序列部分，模板部分和用接头部分修饰的引物部分；在珠子支持物上捕获模板核酸，珠子支持物具有与模板核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物，捕获引物与模板核酸的捕获序列部分杂交；将捕获的模板核酸连接到具有第二接头部分的磁珠以形成珠子复合物，第二接头部分附着到第一接头部分。例如，该方法还包括延伸与模板核酸互补的捕获引物，以形成附着于珠子支持物的序列靶核酸。在一个示例中，该方法还包括使模板核酸和序列靶核酸变性以从珠子支持物释放磁珠。例如，变性包括酶促变性。在另一个示例中，变性包括在离子溶液存在下变性。在另一个示例中，该方法还包括扩增序列靶核酸以在反应井中的珠子支持物上形成序列靶核酸群。在另一个示例中，扩增包括进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。在另一示例中，执行RPA包括执行第一时段的RPA，洗涤和执行第二时段的RPA，第一时段比第二时段短。在另一个示例中，产生包括延伸与靶核酸互补的接头修饰的引物。在另外的示例中，产生包括在具有捕获引物的珠子支持物的存在下扩增具有第一引物部分，靶部分和第二引物部分的靶核酸，接头修饰的第一引物与第一引物部分互补，第二引物具有与第二引物部分的至少一部分互补的部分，第二引物具有与该部分连接并与捕获引物互补的捕获引物部分，其中珠子支持物捕获引物延伸至包括靶核酸的序列。例如，扩增包括进行三个聚合酶链式反应(PCR)循环。
在第二实施例中，一种装置包括：垂直取向板，其具有第一主表面和与第一主表面相对的第二主表面；磁体保持器，将磁体固定在垂直取向板的第一主表面附近；驱动机构，联接到磁体保持器并且可操作地使磁体保持器和磁体平行于垂直取向板的第一主表面移动；以及基板保持器，用于接收基板并将基板保持在垂直方向上，抵靠垂直取向板的表面。
在第二实施例的示例中，基板包括多个井。
在第二实施例和以上实施例的另一个示例中，基板还包括与多个井连通的流通池。
在第二实施例和上述示例的另一示例中，磁体保持器进一步将第二磁体固定在垂直取向板的第一主表面附近。例如，磁体和第二磁体平行于磁体和第二磁体之间的空间定向。在一个示例中，该装置还包括设置在磁体和第二磁体之间的空间中的材料。在另一个示例中，磁体被配置为具有靠近垂直取向板的北极，并且第二磁体被配置为具有靠近垂直取向板的南极。在另外的示例中，该装置还包括连接器板，该连接器板连接磁体保持器和驱动机构。例如，该装置还包括引导板和导轨，该引导板联接到连接器板并配置为沿着导轨滑动。
在第二实施例和上述示例的另一示例中，驱动机构是螺旋机构。
在第二实施例和以上示例的另一示例中，该装置还包括用于感测磁体保持器的位置的传感器。
注意，并非需要以上在一般描述或示例中描述的所有活动，可能不需要特定活动的一部分，并且除了所描述的那些之外还可以执行一个或多个其他活动。此外，列出活动的顺序不一定是它们的执行顺序。
在前述说明书中，已经参考特定实施例描述了这些概念。然而，本领域普通技术人员认识到，在不脱离如下面的权利要求所阐述的本发明的范围的情况下，可以进行各种修改和改变。因此，说明书和附图应被视为说明性的而非限制性的，并且所有这些修改旨在包括在本发明的范围内。
如这里所使用的，术语“包括”，“包含”，“具有”或其任何其他变型旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括一系列特征的过程，方法，物品或装置不一定仅限于那些特征，而是可以包括未明确列出的或这种过程，方法，物品或装置固有的其他特征。此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的-或者不是指排他性的。例如，条件A或B满足以下任何一项：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，且A和B均为真(或存在)。
此外，使用“一”或“一个”来描述本文所述的元件和组件。这仅仅是为了方便并且给出对本发明范围的一般意义。该描述应该被理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非显而易见地另有所指。
上面已经针对特定实施例描述了益处，其他优点和问题的解决方案。但是，利益，优势，问题的解决方案以及可能导致任何利益，优势或解决方案发生或变得更加明显的任何特征不应被解释为任何或所有权利要求的关键，必需或基本特征。
在阅读说明书之后，本领域技术人员将理解，为了清楚起见，本文在单独的实施方案的上下文中描述了某些特征，也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或以任何子组合提供。此外，对范围中所述值的引用包括该范围内的每个值。

Claims (22)

1.将珠子支持物加载到基板的多个反应井中的反应井中的方法，每个反应井在基板的第一表面处具有入口开口，所述方法包括：
将具有多个珠子复合物的悬浮液引入到基板上，所述多个珠子复合物中的珠子复合物包括与珠子支持物偶联的磁珠；
使磁性装置平行于基板的第二表面移动，第二表面与第一表面相对，磁珠被吸引到第一表面，珠子支持物进入多个反应井中的反应井；
将磁珠与珠子支持物分离；以及
将磁珠从基板上洗掉，
其中，磁珠的珠子直径大于多个反应井的开口，并且其中珠子支持物的珠子直径小于多个反应井的开口。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，磁性装置包括由惰性材料分开的一对磁体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，该对磁体中的第一磁体具有邻近基板的第二表面设置的北极，并且该对磁体中的第二磁体具有邻近基板的第二表面设置的南极。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，珠子支持物是其上具有多核苷酸的测序珠子。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括扩增多核苷酸以在测序珠子上提供多核苷酸的多个拷贝。
6.根据权利要求4所述的方法，还包括对附着于基板的反应井中的珠子支持物的多核苷酸进行测序。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，使磁性装置平行于基板的第二表面移动包括使磁性装置沿平行于基板的第二表面的不同方向移动。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，珠子支持物与多核苷酸偶联，所述多核苷酸具有设置在珠子支持物远侧的接头部分，磁珠具有互补接头部分，当珠子支持物的接头部分与磁珠的互补接头部分连接时形成珠子复合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，具有接头部分的多核苷酸与共价结合至珠子支持物的第二多核苷酸杂交，其中将磁珠与珠子支持物分离包括将多核苷酸与第二多核苷酸分离。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，将多核苷酸与第二多核苷酸分离包括用低离子强度水溶液洗涤。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，将多核苷酸与第二多核苷酸分离包括加热基板。
12.根据权利要求1所述的方法，还包括：
产生模板核酸，其包括捕获序列部分、模板部分和用接头部分修饰的引物部分；
在珠子支持物上捕获模板核酸，珠子支持物具有与模板核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物，捕获引物与模板核酸的捕获序列部分杂交；以及
将捕获的模板核酸链接到具有第二接头部分的磁珠以形成珠子复合物，第二接头部分附着到第一接头部分。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括延伸与模板核酸互补的捕获引物，以形成附着于珠子支持物的序列靶核酸。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括使模板核酸和序列靶核酸变性以从珠子支持物释放磁珠。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，变性包括酶促变性。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，变性包括在离子溶液存在下变性。
17.根据权利要求14所述的方法，还包括扩增序列靶核酸以在反应井中的珠子支持物上形成序列靶核酸群。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，扩增包括进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，执行RPA包括执行第一时段的RPA、洗涤、执行第二时段的RPA，第一时段比第二时段短。
20.根据权利要求12所述的方法，其中，产生包括延伸与靶核酸互补的接头修饰的引物。
21.根据权利要求12所述的方法，其中，所述产生包括在具有捕获引物、与第一引物部分互补的接头修饰的第一引物和第二引物的珠子支持物存在下扩增具有第一引物部分、靶部分和第二引物部分的靶核酸，第二引物具有与第二引物部分的至少一部分互补的部分，第二引物具有与该部分连接并与捕获引物互补的捕获引物部分，其中珠子支持物捕获引物延伸成包括靶核酸的序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，扩增包括进行三个聚合酶链式反应(PCR)循环。
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