CN117083394A - 用于自动重复测序的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于对靶多核苷酸进行测序的方法，该方法包括检测与该靶多核苷酸的至少一部分互补的第一系列核苷酸掺入。该第一系列核苷酸掺入形成第一互补多核苷酸。该靶核苷酸被固定到设置在组装件的测序区中的基板。该方法还包括将该靶核苷酸所固定到的基板移动到该组装件的模板化区；当该基板设置在该组装件的该模板化区处时，移除该第一互补多核苷酸，该靶多核苷酸保持固定到该基板；在该移除后，将该靶多核苷酸所固定到的基板移动到该测序区；以及检测与该靶多核苷酸的至少一部分互补的第二系列核苷酸掺入，该第二系列核苷酸掺入形成第二互补多核苷酸。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年11月14日提交的美国临时申请号63/113,869的权益，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
一般而言，本公开涉及用于对靶多核苷酸进行测序的系统和方法。
背景技术
基因测序越来越多地被用作研究和临床环境中的工具。例如，对疾病的起源、物种的分化、微生物群系的特征的研究以及对细菌和病毒病原体二者的研究正在使用基因测序进行。在另一个示例中，基因检测越来越多地用于检测癌症、跟踪病毒感染、开具饮食处方以及修改处方集。这种研究和检测通常依赖于基因样品中的小偏差或差异的检测。因此，准确性是确定测序技术的适用性的因素。
此外，检测的可用性通常由影响成本的因素驱动，这些因素诸如设备、试剂的成本以及技术人员的手工操作时间。提高准确性的常规方法也增加了技术人员的手工操作时间以及昂贵试剂的使用。
因此，准确的、低成本的解决方案将是所期望的。
附图说明
通过参考附图，可以更好地理解本公开，并且本公开的许多特征和优点对于本领域的技术人员而言变得显而易见。
图1包括示出用于改善的基因测序的示例性方法的方框流程图。
图2包括示例性测序系统的图示。
图3包括示例性系统的图示，该系统包括传感器阵列。
图4包括示例性传感器和相关的孔的图示。
图5包括用于制备测序装置的示例性方法的图示。
图6展示了用于制备珠粒组装件的示例性示意图。
图7包括示例性测序系统的图示。
图8包括示例性仪器的图示。
图9包括仪器的示例性台板的图示。
图10和图11包括示例性传感器装置的图示。
图12、图13和图14包括示例性流体联接器的图示。
图15和图16包括传感器装置与流体联接器之间的示例性互连件的图示。
图17和图18包括与传感器装置交互的示例性机械系统的图示。
图19和图20包括与机械系统一起使用的示例性滑块机构的图示。
图21包括在流体联接器与传感器装置之间提供流体连接的示例性机械组装件的图示。
图22和图23包括示例性流体歧管的图示。
图24包括用于使用机械系统与传感器装置交互的示例性方法的方框流程图。
图25、图26、图27和图28包括示例性装载装置的图示。
图29包括示例性电子接口的图示。
图30包括服务器系统组件的示意图。
图31包括分析流水线的方框图。
图32包括生成测定定义文件的示意图。
图33包括测定定义文件打包的示例的示意图。
图34包括根据一个实施方案用于通过两个测序步骤产生的信号数据的分析流水线的方框图，该两个测序步骤使用相同的流程顺序来进行。
图35包括根据一个实施方案用于通过两个测序步骤产生的信号数据的分析流水线的方框图，该两个测序步骤使用用于对具有分子标签的扩增子进行测序的不同的流程顺序来进行。
在不同的附图中使用相同的附图标记指示类似或相同的项。
具体实施方式
在一个实施方案中，该方法包括检测以靶多核苷酸为特征的一系列核苷酸掺入。例如，可以延伸与靶多核苷酸杂交的引物，并且可以利用与合成测序相关的技术来检测一系列核苷酸掺入。靶多核苷酸可以与设置在仪器的测序区中的基板缔合。在检测一系列核苷酸掺入后，可以将与靶多核苷酸缔合的基板移动到仪器内的模板化区。例如，可以使用机械子系统将基板从测序区自动移动到模板化区。在模板化区中，可以使与延伸的引物杂交的靶多核苷酸变性，使延伸的引物被移除，留下与基板缔合的单链靶多核苷酸。在一个示例中，延伸的引物可以通过熔化，例如，通过提高杂交的靶多核苷酸周围的溶液的温度而去杂交。在另一个示例中，靶多核苷酸和延伸的引物可以利用离子强度的变化进行去杂交。在变性后，新引物可以与多核苷酸杂交，并且酶(诸如聚合酶)可以与引物/靶多核苷酸杂合体缔合。可以将基板(包括靶多核苷酸)自动移动到仪器的测序区。任选地，新引物的杂交或酶的缔合可以在模板化区中发生或者可以在将基板移动到测序区后发生。在测序区中，可以检测第二系列核苷酸掺入，例如，当使用合成测序技术使引物与靶多核苷酸互补地延伸时。
来源于核苷酸掺入检测的信号可以用于确定靶多核苷酸中的核苷酸的顺序。例如，第一组信号可以来源于第一系列核苷酸掺入的检测，并且第二组信号可以来源于第二系列核苷酸掺入的检测。在一个示例中，可以在进行碱基识别之前对相应的信号求平均值。在一个特定示例中，可以使用加权平均值。
图1包括展示出用于确定靶多核苷酸的基因序列的示例性方法10的方框流程图。方法10包括制备文库，如方框12处所展示。文库可以由DNA样品的随机片段化制备。在另一个示例中，靶向文库可以使用例如ION AmpliseqTM或ION Ampliseq HDTM来制备。通常，文库包括通过基因测序进行测试的多种多核苷酸。
可以将多核苷酸施加于基板。在一个示例中，可以将多核苷酸直接附接至基板。在另一个示例中，可以将多核苷酸拷贝到珠粒或颗粒上，然后可以将该珠粒或颗粒施加于基板。在另一个示例中，基板可以包括附接或复制有多核苷酸的聚合物基质。此类技术在本文中称为模板化，并且产生直接或间接附接至基板的多个靶多核苷酸。在一个示例中，使基板模板化可以在仪器的模板化区中发生，如方框14所展示。
根据测序技术的性质，基板可以是透明的。或者，基板可包括半导体电路，诸如用于检测离子浓度变化的离子敏感场效应晶体管或者用于检测电阻或电感的电极。此外，基板可以包括限制区，诸如开口、孔腔、孔或凹槽。限制区可以协作地耦合至传感器，诸如离子敏感场效应晶体管。
引物可以与靶多核苷酸杂交。寡核苷酸引物的至少一部分与靶多核苷酸上的引物结合区完全或部分互补。寡核苷酸引物可以包括：单链或双链多核苷酸；DNA、RNA、嵌合DNA/RNA或核酸类似物；脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或它们的类似物的聚合物；或者多种不同的包括天然存在的、合成、重组、克隆、扩增、未扩增或存档(例如，保藏)形式的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸引物的至少一部分包含与靶多核苷酸上的区域(例如，加尾引物)不具有序列同一性或互补性的序列。
此外，酶可以与杂交的引物/多核苷酸缔合。例如，聚合酶可以包括可催化核苷酸和/或核苷酸类似物的聚合的任何酶或其片段或亚基。聚合酶可以是DNA聚合酶，该DNA聚合酶可以包括细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶；DNA依赖性聚合酶；复制酶；引发酶；RNA依赖性聚合酶(包括RNA依赖性DNA聚合酶，诸如例如逆转录酶)；T3、T5、T7或SP6 RNA聚合酶；热不稳定聚合酶，或热稳定聚合酶。聚合酶可以选自低或高保真度聚合酶，该聚合酶可以包括天然存在的聚合酶以及它们的任何亚基和截短形式；突变聚合酶；变异聚合酶；重组、融合或者工程化的聚合酶；化学修饰的聚合酶；以及保留催化核苷酸聚合能力的合成分子或组装件以及它们的任何类似物、衍生物或片段。通常，聚合酶包含可进行核苷酸结合或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。在一些实施方案中，聚合酶包含或缺乏其它酶促活性，诸如例如3′至5′核酸外切酶活性或5′至3′核酸外切酶活性。在一些实施方案中，可以用单一类型的聚合酶或者聚合酶或连接酶的混合物来进行测序反应。在一些实施方案中，聚合酶可以是大肠杆菌(E.coli)大片段DNA聚合酶I(例如，克列诺(Klenow))。
模板化基板可以移动到仪器内的测序区，例如，使用机械子系统自动移动。一旦在测序区中，即可对靶多核苷酸进行测序，如方框16所示。例如，可以检测一系列核苷酸掺入。在一个示例中，与靶多核苷酸杂交的引物可以使用合成测序技术来延伸。在合成测序期间，可以在与模板多核苷酸分子或链互补的位置处将核苷酸按顺序添加至生长的多核苷酸分子或链中。向生长的互补链添加核苷酸可以使用多种方法(例如，焦磷酸测序、荧光检测和无标记电子检测)来检测，该添加可以用于鉴定靶多核苷酸的序列组成。可以重复该过程直到与模板互补的完整的或选定的序列长度得以合成。
在电子或基于带电的测序(诸如例如基于pH值的测序)中，可以通过检测作为聚合酶催化的核苷酸延伸反应的天然副产物产生的离子(例如，氢离子)来确定核苷酸掺入事件。这可以用于对样品或模板核酸进行测序，该样品或模板核酸可以是例如感兴趣的核酸序列的片段，并且可以作为克隆群体直接或间接附接至固体支持物，诸如颗粒、微粒、珠粒等。
试剂可以以预定的流速输送预定的持续时间，并且可以测量物理或化学参数，提供关于在限定的空间或反应限制区域中发生的一个或多个反应的状态的信息。预定排序可以基于循环重复模式，该模式由短的预定试剂流程排序的连续重复(例如，四种核苷酸试剂的预定序列的连续重复，该四种核苷酸试剂诸如例如，“ACTG...”)组成，可以全部或部分基于试剂流程的一些其它模式(诸如例如，Hubble等人，U.S.10,329,608或Hubbell等人，2012年10月18日公布的美国专利申请公布号2012/0264621讨论的各种试剂流排序中的任一种，这些专利全文以引用的方式并入本文)，并且也可以基于它们的一些组合。
在完成一系列核苷酸添加的检测时，可以使用机械子系统将基板移动到模板化区。如方框18所展示，与靶多核苷酸杂交的延伸的引物可以利用例如温度的升高或离子强度的变化来去杂交或变性。例如，当基板在模板化区中时，可以加热与杂交的多核苷酸和延伸的引物相关或者在杂交的多核苷酸和延伸的引物周围的溶液的温度，以使延伸的引物与靶多核苷酸去杂交，并且可以从系统中洗涤延伸的引物。在另一个示例中，可以改变靶多核苷酸周围的溶液的离子强度，使延伸的引物去杂交，然后延伸的引物可以从系统中洗出。
在一些实施方案中，变性或去杂交包括使用物理、化学或酶促反应来移除延伸产物。例如，可以使用高温(例如，在不存在甲酰胺的情况为约75℃-100℃，或在存在甲酰胺的情况为约45℃-90℃)或化学变性剂(例如，已知使双链核酸分子解离的化合物，诸如甲酰胺、尿素、DMSO、碱性条件、低盐或极低盐条件或水)使引物延伸产物从靶多核苷酸变性/解链。也可以使用核酸酶使引物延伸产物降解。在一些实施方案中，可以使用核酸降解酶来使延伸产物降解，该核酸降解酶诸如5'→3'或3'→5'核酸外切酶(例如，核酸外切酶I、核酸外切酶III或T7基因6核酸外切酶)。
如方框20所展示，新引物可以与靶多核苷酸或其互补序列杂交。引物可以与在第一次测序运行期间与靶多核苷酸杂交的引物相同。或者，可以使用不同的引物。
如方框22所展示，新的酶可以与杂交至新引物的靶多核苷酸缔合。例如，可以添加与引物/靶多核苷酸缔合的聚合酶。该酶可以是与先前测序期间使用的酶相同的种类。或者，可以使新的酶种类与靶/引物杂合体缔合。
可以利用机械子系统将基板从模板化区自动移动到测序区，并且可以通过检测随后的一系列核苷酸掺入来对靶多核苷酸进行再次测序。或者，可以在添加新引物和酶之前将基板移动到测序区。当在测序区中时，随后的一系列核苷酸掺入可以通过延伸与靶多核苷酸互补的引物，例如使用合成测序技术来检测。试剂可以以与第一次测序运行相同的流程顺序提供。在另一个示例中，可以使用不同的流程顺序。流程顺序可以选自上文所述的顺序。
当检测第一和第二系列核苷酸掺入时，来自所检测系列的数据可以用于确定靶多核苷酸的序列。例如，检测第一和第二系列核苷酸掺入可以提供可用于碱基识别的第一和第二组信号。参见例如US10,329,608B2，该专利以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，测序系统包括自动测序仪器，该自动测序仪器适于从一组样品多核苷酸中确定多核苷酸和变异识别的序列。该系统可以利用靶向测定来生成扩增子或靶多核苷酸文库，其被测序以在期望时间内提供比对的序列表和任选地变异识别。
自动测序仪器的实施方案包含用于制备靶向多核苷酸文库的制备台板。在一个示例中，将靶向多核苷酸接种到基板上，诸如聚合物或水凝胶珠粒。自动测序仪器可以进一步包括将接种的基板施加到传感器装置的装载装置，并且可以包括例如通过检测核苷酸掺入来进行合成测序反应的测序仪。自动测序仪器可以进一步包含计算装置以利用来自测序仪的数据来确定碱基识别、比对读段和变异识别。另外，该系统可以包括用户接口或网络接口以将与碱基识别、比对读段或变异识别相关联的报告传送给用户。
虽然上文的描述包括检测第一和第二系列核苷酸掺入，但是循环方法可以进行超过一次，提供可用于进行碱基识别的若干系列核苷酸掺入和相关信号组。
定义
如本文所使用的，在本文与术语“多核苷酸”可互换使用的术语“核酸”和其变体是指核苷酸的聚合物，并且包含例如脱氧核糖核酸和核糖核酸。核酸包含但不限于DNA、cDNA、RNA、嵌合RNA/DNA和核酸类似物。
如本文所使用，引物是任何单链核酸分子(例如，寡核苷酸)，一旦与互补核酸序列杂交，就可以引发或启动核酸合成。通常，这种核酸合成以依赖模板的方式发生，并且在这种核酸合成过程中核苷酸聚合到引物的至少一端。引物通常具有游离的3'羟基，然而在一些实施方案中，引物端被封端(例如，以防止从3'端延伸)或引物是融合引物，其中引物的不同部分被设计为结合到不同的配偶体。在涉及引物延伸的反应(例如，预接种扩增)中，在封端的融合引物的3'端处的封端部分可以降低引物二聚体形成的水准。在一些实施方案中，封端或未封端的引物是带尾引物，其中5'端包含与靶核酸不互补的序列，引物的其余部分与该靶核酸互补。此5'尾可以用作引物延伸的模板。在本文提供的方法的各个实施方案中，核酸分子包含第一引物结合序列和任选地第二引物结合序列。在一些实施方案中，本文所描述的反应包含分别结合正向引物结合序列和反向引物结合序列的第一引物群体和任选地第二引物群体。在一些实施方案中，第一和第二引物被称作引物对。在一些实施方案中，第一引物或第二引物是通用引物。第一引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合，并且第二引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合。因此，术语“第一”和“第二”在本文中关于引物使用时是相对术语，并且每个都可以指正向或反向引物，这取决于它们使用的上下文。
如本文所使用的，核酸扩增是指通过核苷酸聚合合成核酸的新链的过程，并且涉及以下的一个或多个循环：将双链核酸分离，例如变性或解离成单链、引物与分离的双链核酸的单链的退火，例如杂交以及杂交引物的延伸。如本文所用，术语“引物延伸”及其变体涉及用于催化核苷酸掺入核酸分子末端的任何方法。在一些实施方案中，扩增循环包含(a)双链核酸的链的部分、不完全或完全变性或解离，(b)引物与部分或完全单链核酸的杂交或退火以及(c)引物延伸以形成延伸的引物链。在一些实施方案中，扩增循环任选地包含：(a)第一引物与模板核酸链杂交，(b)引物延伸以形成第一延伸核酸链以及(c)来自模板链的延伸链部分或不完全变性。任选地，来自步骤(c)的模板链的变性部分任意与下一扩增循环中的不同引物杂交。在一些实施方案中，扩增循环中的引物延伸涉及从双链体的另一条链置换双链体核酸的一条链或从模板链置换第一条延伸链。可包括与第一延伸链的3'端杂交的第二引物。
许多核酸扩增方法是本领域已知的。一些实例包含重组酶-聚合酶扩增(RPA)、模板步行和聚合酶链式反应(PCR)扩增。在RPA反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白来扩增核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离双链模板核酸分子的至少一部分，以使得引物杂交，随后可以使聚合酶结合以开始复制。重组酶辅助蛋白的实例是防止解离的核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-strandedbinding protein；SSB)。通常，RPA反应是等温的，并且在等温温度下进行。在一些情况下，RPA反应可以在乳液内进行。在模板步移反应中，在允许双链模板核酸分子的至少一部分解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以开始复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在PCR中，通常通过热循环使双链模板核酸分子解离。冷却后，引物与互补序列结合并可以用于聚合酶的复制。在本文提供的方法的实施方案中的一些实施方案中，在反应混合物中进行预接种或模板化反应，该反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在所公开的方面中的任何方面中，反应混合物包含以下中的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种载体或表面(例如，固体载体)、核苷酸或诸如二价阳离子的辅因子。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施方案中，模板核酸分子群体包括与和第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施方案中，如在乳液RPA或乳液PCR中，反应混合物形成乳液。在涉及RPA的反应中，反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
如本文中所使用的，术语“同一性”和“相同的”和其变化形式，当关于两种或更多种核酸序列使用时，是指两种或更多种序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列类似性。在两种或更多种同源序列的情况下，序列或其子序列的同一性或同源性百分比指示相同(即，约70％同一性，优选地75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的全部单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)的百分比。当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，百分比同一性可以在指定区域上。当氨基酸水平或核苷酸水平存在至少约80％或至少约85％同一性时，序列被称为“基本上相同”。在一些情况下，当氨基酸水平或核苷酸水平存在至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性时，序列“基本上相同”。优选地，同一性存在于至少约20、25、50或100个残基长的区内或至少一个所比较的序列的整个长度上。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其补体在严格杂交条件下彼此杂交。
如本文中所使用，术语“互补”和“补体”以及其派生词指可在反平行定向中(如在杂交双螺旋中)的两个或更多个独立相应位置经历累积碱基配对的任何两个或更多个核酸序列(例如部分或全部模板核酸分子、靶序列或引物)。此类碱基配对可根据任何现有规则集合进行，例如根据沃森-克里克碱基配对规则(Watson-Crick base pairing rules)。任选地，在第一与第二核酸序列之间可存在“完全”或“总体”互补，其中在第一核酸序列中的每个核苷酸可进行与第二核酸序列上的对应的反平行位置中的核苷酸的稳定化碱基配对相互作用。“部分”互补描述一个核酸序列的至少20％但少于100％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少50％但少于100％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少70％、80％、90％、95％或98％但少于100％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补。当一个核酸序列中的至少85％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上互补”。在一些实施方案中，两个互补或基本上互补序列能够在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“不互补”描述其中一个核酸序列的少于20％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。当一个核酸序列中的少于15％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上不互补”。在一些实施方案中，两个不互补或基本上不互补序列不能在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“错配”存在于不互补的两个相对核苷酸中的序列中的任何位置。互补核苷酸包含在生理条件下，在DNA复制期间通过彼此相对的DNA聚合酶有效并入的核苷酸。
如本文所使用，术语“单克隆”和其变体，当用于提及一种或多种多核苷酸群体时，是指多核苷酸群体，其中约50％至99％或至多100％或100％的群体成员在核苷酸序列水平上具有至少80％同一性或至少85％同一性或至少90％同一性或至少95％同一性或至少99％同一性或约100％同一性或100％同一性。如本文所用，当提及一种或多种多核苷酸群体使用时，短语“基本上单克隆”和其变化形式是指一种或多种多核苷酸群体，其中一个多核苷酸分子，例如所扩增的模板多核苷酸分子是群体中单一最普遍的多核苷酸。因此，单克隆或基本上单克隆群体的所有成员不一定完全相同或彼此互补。例如，多核苷酸模板的不同部分可以被扩增或复制以产生所得的单克隆群体的成员；类似地，在原始模板的扩增期间可以发生一定数量的“误差”或不完全延伸，从而产生单个成员可在它们之间表现出序列可变性的单克隆或基本上单克隆群体。在一些实施方案中，可在核酸扩增反应期间发生低或非基本上水准的非同源多核苷酸的混合，并且因此基本上单克隆群体可含有少数的一种或多种多核苷酸(例如小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.001％的多种多样的多核苷酸)。在某些示例中，群体中的至少90％的多核苷酸与用作扩增基础的初始单一模板至少90％相同，以产生基本上单克隆群体。在某些实施方案中，模板多核苷酸的扩增产生多核苷酸群体，其中至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多核苷酸群体成员与生成群体的模板核酸共享至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，模板多核苷酸的扩增产生多核苷酸群，其中足够的大部分多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许使用高通量测序系统对扩增模板的至少一部分进行测序。
在一些实施方案中，至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的与模板化载体连接的核酸分子的成员将与模板核酸分子具有大于90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，使用任一种扩增方法产生的核酸群体的成员在高严格杂交条件下彼此进行杂交。
在一些实施方案中，包括例如用于模板化核酸的扩增方法的本文提供的扩增方法以及涉及该方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒生成基本上单克隆核酸分子群体，其包含足够少的多克隆污染物，因此它们可以在高通量测序方法中被成功测序。例如，扩增方法可以生成基本上单克隆核酸分子群体，其提供使用特定测序系统检测的信号(例如，测序信号、核苷酸掺入信号等)的产生。此类信号包含指示核苷酸聚合的任何可检测信号，包含但不限于光学或光学可检测信号、非光学信号(或可通过非光学检测技术检测的信号)、离子(例如，氢离子)浓度、pH、电信号、电压和任何此类信号的波动变化。任选地，随后可分析信号以正确地确定存在于群体的任何核酸分子内的任何一种或多种核苷酸的序列或碱基同一性。用于检测或分析此类信号的合适测序系统的实例包含但不限于包含离子传感器的系统，例如场效应晶体管(FET)，例如chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括一种用作化学传感器的场效应晶体管。chemFET的结构类似于MOSFET晶体管，其中通过化学工艺施加栅电极上的电荷。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(诸如H+)改变时，通过晶体管的电流也相应地改变。包括FET传感器的系统的非限制性示例为Ion Torrent测序系统，诸如Ion Torrent PGMTM序列系统，包括314、316和318系统；Ion Torrent ProtonTM测序系统，包括Proton I(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)；以及Ion Torrent S5TM测序系统，包括Ion S5和S5XL(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)以及Ion Torrent GenexusTM测序系统(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)。在一个实施方案中，本文详细描述了用于检测或分析信号的基于ISFET的测序系统。在一些实施方案中，基本上单克隆核酸群体允许在并入了FET传感器的系统，例如Ion Torrent测序系统上对至少5个连续核苷酸残基进行准确测序。
如本文所使用的，术语“克隆扩增”和其变体是指由此通过扩增多核苷酸产生单克隆或基本上单克隆多核苷酸群体的任何方法。在克隆扩增的一些实施方案中，扩增两种或更多种多核苷酸以产生至少两个单克隆或基本上单克隆多核苷酸群体。
如本文所使用的，术语“预接种”，在本文中也被称为“接种”，是指涉及将多核苷酸连接到表面或载体的过程。在一些实施方案中，预接种涉及将一种或多种核酸连接到表面或载体或连接到表面或载体上的一个或多个位点。预接种的表面或载体用于例如所连接的核酸的进一步操作或分析，例如核酸扩增(包括例如模板过程中的扩增)、测序或其它过程。在一些实施方案中，预接种过程生成一个或多个表面或载体，该表面或载体具有与其连接的一种或多种核酸分子。在一些实施方案中，预接种生成一个或多个表面或载体，该表面或载体具有与其连接的单个多核苷酸。具有与其连接的一种或多种核酸分子的一个或多个表面或载体可以包含在一群、多个或许多两个或更多个表面或载体中，其中一些、少数、大部分或基本上所有的表面或载体具有与其连接的一种或多种核酸分子。在一些实施方案中，连接到不同表面或载体或连接到表面或载体上不同位点的一个或多个核酸分子是不同的。在一些实施方案中，核酸分子(或基本上单克隆核酸)的多个(multiple)(或多个(aplurality of))基本上相同的拷贝连接到表面或载体上或者多个(或多个)不同的核酸连接到一个或多个在预接种过程中的表面或载体上的位点。在一些实施方案中，在预接种过程中，将有限数量的基本上相同的多核苷酸(或基本上单克隆核酸)拷贝连接到表面或载体上以生成单克隆或基本上单克隆核酸群体。在一些实施方案中，在不涉及核酸扩增的过程中，表面或载体的预接种包含核酸与表面或载体的连接，例如，通过核酸与和载体连接的互补多核苷酸的杂交。在一些实施方案中，表面或载体的预接种包含核酸扩增，例如，核酸扩增(例如，PCR)或等温扩增的一个或多个循环。例如，可以在预接种过程中使用核酸扩增以生成能够连接(例如，通过杂交)到表面或载体的核酸的一个或多个拷贝。通常，生成连接有超过一个核酸或核酸的多个拷贝的表面或载体的预接种包含核酸扩增。在如本文提供的预接种或接种过程中生成的表面或载体被称为“预接种的”或“接种的”载体。
如本文所使用的，当指在预接种或模板化方法中连接到表面或载体的核酸(或基本上相同的拷贝或基本上单克隆核酸)的数量时，“有限数量”通常是指被控制用于各种目的的不同的核酸的数量。核酸的有限拷贝数量可以是，例如，足以在表面或载体上的核酸的任何随后更大规模扩增(例如模板化)中提供拥挤效应以生成更大的基本上单克隆核酸群体，以便通过防止或减少模板在反应位点之间的迁移来防止或减少多克隆群体的形成的数量。核酸的有限拷贝数量可以是，例如，足以在表面或载体上的核酸的任何随后更大规模扩增(例如模板化)中提供拥挤效应以生成更大的基本上单克隆核酸群体，以便通过防止或减少模板在反应位点之间的迁移来防止或减少多克隆群体的形成的数量。此类有限数量的模板拷贝可以是有限的，以便使用相对较短的核酸扩增时间，例如，以防止或减少模板在反应位点之间的迁移，但生成足够数量的模板拷贝以在随后的扩增中提供拥挤效应。
如本文所用，术语“模板化”是指生成两个或更多个、或多个或一群基本上相同的多核苷酸或生成可以在核酸分析方法中用作模板的基本上单克隆的核酸群的过程，该核酸分析方法包括例如对多核苷酸的核酸测序，诸如合成测序。在模板化过程中生成的多核苷酸通常被称为核酸模板。在一些实施方案中，模板化涉及将多核苷酸模板连接到表面或载体上。在一些实施方案中，模板化涉及生成两个或更多个、或多个单独的表面或载体或表面或载体上的离散位点，每个具有与其连接的两个或更多个、或多个或一群基本上相同的多核苷酸或基本上单克隆多核苷酸群体。在一些实施方案中，模板化涉及生成一个或多个表面或载体或表面或载体上的离散位点，具有与其连接的基本上单克隆多核苷酸群体。在一些实施方案中，模板化生成一个或多个表面或载体，该一个或多个表面或载体具有至少50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或106或更多个与每个模板化表面或载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体。在一些实施方案中，模板化生成表面或载体，其具有介于约50,000与500,000个之间的与每个模板化表面或载体连接的模板核酸分子或例如介于约50,000与400,000个之间的模板核酸分子、介于约50,000与300,000个之间的模板核酸分子、介于约50,000与200,000个之间的模板核酸分子或介于约50,000与100,000个之间的与每个模板化载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体。在一些实施方案中，模板化生成一个或多个模板化表面或载体，其具有介于约100,000与400,000个之间的与每个模板化表面或载体连接的模板核酸分子、介于约100,000与300,000个之间的模板核酸分子、介于约100,000与200,000个之间的模板核酸分子或介于约150,000与300,000个之间的与每个模板化载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体。在一些实施方案中，模板从一个或多个预接种或接种的表面或载体开始进行。在此类实施方案中，模板化可以生成一个或多个模板化表面或载体，其包含至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍、至少2500倍、至少5000倍、至少10,000倍、至少25,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少250,000倍、至少5000,000倍或至少106倍或更多的存在于预接种表面或载体上模板化表面或载体上的模板核酸分子。在一些实施方案中，预接种载体上仅存在约1个或仅1个核酸分子。在一些实施方案中，至少50,000、75,000或100,000个基本上单克隆模板核酸分子或介于约25,000与1,000,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子存在于表面或载体上，例如介于约25,000与500,000个之间、介于约25,000与250,000个之间、介于约25,000与125,000个之间或介于约25,000与100,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子存在于表面或载体，例如固体表面或载体上。
在一些实施方案中，本文所提供的方法、以及用于执行该方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒包括载体，例如固体载体或半固体载体，以约束、富集、掩蔽、分离、定位、扩增或转移可用于分析方法中的核酸。固体表面或载体可以包含聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包含膜、平面表面、微量滴定板、珠粒、过滤器、测试条、滑块、盖玻片和管。固体表面或载体意指在其上合成、连接、接合或以其它方式固定寡聚物的任何固相材料。载体可任选地包含“树脂”、“相”、“表面”和「载体」。载体可包含例如有机聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。载体也可是无机的，诸如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅。载体的构形可呈例如珠粒、球体、颗粒、细粒、凝胶或表面形式。例如，表面可以是平面的、基本上平面的或非平面的以及凹、凸或它们的任何组合。载体可以是多孔、半多孔或无孔的，并且可具有溶胀或非溶胀特征。载体可塑形成包括一个或多个孔、凹陷或其它容器(container)、容器(vessel)、特征或位置。可以将一种或多种载体配置于阵列中的不同位置。载体任选地是可寻址(例如用于机械递送试剂)，或通过检测手段，包含利用激光照射扫描和共焦或偏光聚焦来寻址。可以将载体(例如珠粒)放置在另一载体内或上(例如第二载体的孔内)。珠粒材料的实例包含但不限于凝胶、水凝胶或丙烯酰胺聚合物。在一些实施方案中，载体是离子球形颗粒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)。固体载体的实例包含但不限于“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”(任选地但不一定是球形)球体、过滤器、流通池、孔、槽、通道储存器、凝胶或毛细管的内壁。在一些实施方案中，表面包含纹理(例如，蚀刻、形成空洞、孔、三维支架或凸块)。载体的大小包含但不限于载体的最小横截面长度(例如，直径)为50微米或更小、10微米或更小、3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1微米、0.2微米、0.3微米或0.4微米或更小(例如小于1纳米，约1纳米-10纳米、约10纳米-100纳米或约100纳米-500纳米)。还包含在表面或固体载体中的是磁性或顺磁性珠粒(例如，磁性或顺磁性纳米颗粒或微粒)。例如，顺磁性微粒包含与抗生蛋白链菌素连接的顺磁性珠粒(例如，来自加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DynabeadsTMM-270)。颗粒可以具有铁芯，或可以是水凝胶或琼脂糖(例如，SepharoseTM)。微粒(例如Dynabead，Dynal，挪威奥斯陆)可由各种无机或有机材料制成，该无机或有机材料包括但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、乳胶、聚苯乙烯等。磁化可促进在扩增之后微粒连接的试剂(例如多核苷酸或连接酶)聚集和浓缩，并且也可促进另外步骤(例如洗涤、试剂移除等)。珠粒表面可以被功能化以连接一个或多个、或多个或一群引物。在一些实施方案中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。例如，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施方案中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施方案中，本文所提供的方法以及用于执行该方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒包括具有与其连接的一个、两个或更多个、多个或一群寡核苷酸(例如，引物)的载体或表面。载体或表面可涂覆有用于连接核酸分子(例如第一引物或第二引物)的丙烯酰胺、羧酸或胺化合物。例如，可以将氨基修饰的核酸分子(例如引物)与涂覆有羧酸的载体连接。可将引物与涂覆在表面上的丙烯酰胺化合物连接。颗粒可涂覆有抗生物素蛋白样化合物(例如抗生蛋白链菌素)以结合生物素标记的核酸。在一些实施方案中，与载体或表面连接的寡核苷酸基本上相同或包含在所有寡核苷酸中基本上相同的引物序列。在一些实施方案中，两个或更多个不同的寡核苷酸与载体或表面连接。在一些实施方案中，表面已连接第一引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列。在一些实施方案中，表面已连接第一引物群体和第二引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列，并且第二引物群体中的第二引物共享共有第二引物序列。在一些实施方案中，已在表面上固定有第一引物群体。在其它实施方案中，已在表面上固定有第一引物群体和第二引物群体。
概述
图1的方法可以使用各种测序技术来进行。例如，该方法可以使用光学或荧光技术或者基于电子的技术来进行。具体而言，该方法可以使用基于电子的技术来进行，诸如使用晶体管来检测离子强度或pH的变化，或者使用电极和相关的电路来检测阻抗或电感的变化。
在图2中，含有流体回路102的系统100通过入口连接到至少两个试剂储存器(104，106，108，110或112)、连接到废液储存器120，并且通过将流体节点130与生物传感器134的入口138连接以实现流体连通的流体通路132连接到生物传感器134。来自储存器(104、106、108、110或112)的试剂可以通过包含压力、泵(诸如注射泵、重力进料等)多种方法被驱动到流体回路102，并且通过控制阀114来加以选择。来自流体回路102的试剂可以通过从控制系统118接收信号的阀114而被驱动到废液容器120。来自流体回路102的试剂也可以通过生物传感器134而被驱动到废液容器136。控制系统118包括用于阀114的控制器，该控制器生成用于通过电连接件116断开和闭合的信号。
控制系统118还包括用于系统的其它组件的控制器，诸如通过电连接件122连接到控制器系统的洗涤溶液阀124和参考电极128。控制系统118还可以包含用于生物传感器134的控制和数据采集功能。在一种操作模式中，流体回路102在控制系统118的经编程控制下，将一系列所选试剂1、2、3、4或5递送到生物传感器134，使得在所选试剂流之间，流体回路102得到灌注和洗涤，并且生物传感器134得到洗涤。进入生物传感器134的流体通过出口140离开并且通过对夹紧阀调节器的控制沉积在废液容器136中。阀与生物传感器134的传感器流体输出140成流体连通。
在一个实施方案中，生物传感器可以包括电介质层，该电介质层限定由第一存取件和第二存取件形成的孔并且暴露传感器垫。这种生物传感器尤其适用于检测化学反应和副产物，诸如可用于基因测序的响应于核苷酸掺入而检测氢离子的释放，以及其它应用。在特定实施方案中，测序系统包含其中设置有传感阵列的流通池，包含与传感阵列电子连通的通信电路，并且包含与流通池流体连通的容器和流体控制器。在一个示例中，图3示出流通池200的扩大的横截面图并且示出了流动室206的一部分。试剂流208流过池阵列202的表面，其中试剂流208流过池阵列202的池的开口端。孔阵列202和传感器阵列205一起可形成形成流通池200的下壁(或底板)的集成单元。参考电极204可以流动地联接到流动室206。进一步地，流通池盖230包封流动室206以将试剂流208容纳在限定区域内。
图4展示了如图3的210处所示的孔301和传感器314的扩展视图。孔的体积、形状、纵横比(诸如基板宽度与孔深度之比)和其它尺寸特征可基于所发生的反应的性质以及所采用的试剂、副产物或标记技术(如果有的话)来选择。传感器314可以是化学场效应晶体管(chemFET)，更具体来说离子敏感FET(ISFET)，其具有浮动栅极318，该浮动栅极具有任选地通过材料层316与孔内部分离的传感器板320。传感器314可响应于与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量(并且生成与该量相关的输出信号)。材料层316可为陶瓷层，诸如锆、铪、钽、铝或钛等的氧化物，或钛的氮化物。或者，材料层316可由诸如钛、钨、金、银、铂、铝、铜或它们的组合的金属形成。在一个示例中，材料层316的厚度可在5nm至100nm范围内，诸如10nm至70nm范围内，15nm至65nm范围内或甚至20nm至50nm范围内。
尽管材料层316被示出为延伸超过所示出的FET组件的界限，但材料层316可沿孔301的底部延伸以及任选地沿孔301的壁延伸。传感器314可响应于与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量(并且生成与该量相关的输出信号)。电荷324的变化可能引起chemFET中的源极321与漏极322之间的电流的变化。进而，chemFET可以直接使用以提供基于电流的输出信号，或间接与额外的电路系统一起使用以提供基于电压的输出信号。反应物、洗涤溶液和其它试剂可通过扩散机构340进入和离开孔。
孔301可由壁结构界定，该壁结构可由一个或多个材料层形成。在一个示例中，壁结构可具有从孔的下表面延伸到上表面，0.01微米至10微米范围，诸如0.05微米至10微米范围、0.1微米至10微米范围、0.3微米至10微米范围或0.5微米至6微米范围内的厚度。特别地，厚度可以在0.01微米至1微米的范围内，诸如0.05微米至0.5微米的范围内，或0.05微米至0.3微米的范围内。阵列202的孔301的特征直径可以不大于5微米，诸如不大于3.5微米、不大于2.0微米、不大于1.6微米、不大于1.0微米、不大于0.8微米或甚至不大于0.6微米，该特征直径定义为4乘以横截面积(A)除以π的平方根(例如，sqrt(4*A/π))。在一个示例中，孔301可具有至少0.01微米的特征直径。在另一个示例中，孔301可界定0.05fL至10pL范围内的体积，诸如0.05fL至1pL范围、0.05fL至100fL范围、0.05fL至10fL范围或甚至0.1fL至5fL范围内的体积。
在一个实施方案中，在孔301中进行的反应可以是用来标识或确定所关注的分析物的特性或性质的分析反应。这些反应可以直接或间接生成影响邻近传感器板320的电荷量的副产物。如果这类副产物少量产生或快速衰减或与其它成分反应，那么可同时在池301中分析相同分析物的多个副本，以便增加所产生的输出信号。在一个实施方案中，分析物的多个拷贝可以在沉积到孔301中之前或之后连接到固相载体312上。固相载体312可以是包括凝胶或类似物的微粒、纳米颗粒、珠粒、固体或多孔。为了简单和易于解释，固相载体312在本文中也称为颗粒或珠粒。对于核酸分析物，可以通过滚环扩增(RCA)、指数RCA或类似技术制备多个连接的拷贝，以产生扩增子而不需要固体载体。
特别地，诸如珠粒载体的固相载体可以包含多核苷酸的拷贝。在图5所展示的特定示例中，聚合物颗粒在测序技术期间可用作多核苷酸的载体。例如，此类亲水性颗粒可固定用于使用荧光测序技术测序的多核苷酸。在另一个示例中，亲水性颗粒可固定用于使用离子传感技术测序的多核苷酸的多个拷贝。可替代地，上文所描述的处理可提高聚合物基质与传感器阵列表面的粘合。聚合物基质可以捕获分析物，诸如用于测序的多核苷酸。
珠粒载体可包括有机聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。载体也可是无机的，诸如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅。载体的构型可以是珠粒、球、颗粒、细粒、凝胶或表面形式。载体可以是多孔的或非多孔的，并且可以具有溶胀或非溶胀特征。在一些实施方案中，载体是离子球体颗粒。在标题为“亲水性聚合物颗粒及其制备和使用方法”的US 9,243,085和标题为“由羧基官能丙烯酰胺形成的聚合物基板”的US 9,868,826中公开了珠粒载体的实例，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，固体载体是“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”等，(形状任选地但未必是球形)，其具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1微米、0.2微米、0.3微米或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1纳米至10纳米、约10纳米至100纳米或约100纳米至500纳米)。在实例中，载体为至少0.1微米。微粒或珠粒载体可由多种无机或有机材料制成，该无机或有机材料包括但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、胶乳、聚苯乙烯等。磁化可以促进扩增后微粒连接的试剂(例如多核苷酸或连接酶)的收集和浓缩，并且还可以促进附加的步骤(例如洗涤、试剂移除等)。在某些实施方案中，使用具有不同形状大小和/或颜色的微粒群体。微米颗粒可任选地例如用量子点进行编码，使得每一微粒或微米颗粒组可分别或独特地识别。
磁性珠粒(例如，来自Dynal、Oslo、Norway的Dynabeads)可具有1微米至100微米范围内的大小，该范围诸如2微米至100微米。磁性珠粒可以由无机或有机材料形成，包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚苯乙烯或它们的组合。
在一些实施方案中，珠粒载体被官能化以连接第一引物群体。在一些实施方案中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。例如，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施方案中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施方案中，珠粒的最小横截面长度(例如，直径)是约50微米或更小、或约10微米或更小、或约3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1微米、0.2微米、0.3微米或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1纳米-10纳米、约10纳米-100纳米或约100纳米-500纳米)。
一般来说，可以将珠粒载体处理成包含生物分子，包含核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可以结合或连接到生物分子上。生物分子的末端或任何内部部分可与聚合物颗粒结合或连接。使用连接化学方法，聚合物颗粒可与生物分子结合或连接。连接化学方法包含共价或非共价键，包含离子键、氢键、亲和力键、偶极-偶极键、范德华键(van der Waals bond)和疏水性键。连接化学包括结合配偶体之间的亲和力，例如：亲和素部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫学活性片段；抗体和半抗原；地高辛配基部分和抗地高辛配基抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏物；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或者寡核苷酸或多核苷酸以及它们相应的互补序列。
如图5所展示，可以将多个珠粒载体404以及多个多核苷酸402(靶多核苷酸或模板多核苷酸)置于溶液中。可以将多个珠粒载体404活化或以其它方式制备以与多核苷酸402结合。例如，珠粒载体404可以包含与多个多核苷酸402中的一多核苷酸的一部分互补的寡核苷酸(捕获引物)。在另一个示例中，使用技术，诸如生物素-抗生蛋白链菌素结合，珠粒载体404可以被修饰具有靶多核苷酸402。
在一些实施方案中，模板核酸分子(模板多核苷酸或靶多核苷酸)可以衍生自可来自天然或非天然来源的样品。样品中的核酸分子可以是来源于活生物体或细胞。可使用任何核酸分子，例如样品可以包含覆盖来自活生物体或细胞的部分或全部基因组、mRNA或miRNA的基因组DNA。在其它实施方案中，模板核酸分子可以是合成的或重组的。在一些实施方案中，样品含有具有基本上一致序列或具有不同序列的混合物的核酸分子。通常使用在活细胞内生成并且由活细胞生成的核酸分子来进行说明性实施方案。此类核酸分子通常是直接从天然来源，诸如细胞或体液分离，无需任何活体外扩增。因此，样品核酸分子直接用于后续步骤中。在一些实施方案中，样品中的核酸分子可以包含具有不同序列的两种或更多种核酸分子。
方法任选地可包括在文库制备之前、期间或之后并且在预接种反应之前的靶标富集步骤。可以例如通过多重核酸扩增或杂交来富集包含靶基因座或所关注区域的靶核酸分子。多种方法可用于进行多重核酸扩增以生成诸如多重PCR的扩增子，并且该多种方法可用于实施方案中。在将模板核酸分子加入到预接种反应混合物中之前，可以在通过任何方法富集后进行通用扩增反应。本发明教导的任一实施方案可以包含富集多个至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个靶核酸分子、靶基因座或所关注区域。在任一所公开的实施方案中，靶基因座或所关注区域可以为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1,000个核苷酸长，并且包含模板核酸分子的一部分或全部。在其它实施方案中，靶基因座或所关注区域的长度可以在约1至10,000个核苷酸之间，例如长度在约2至5,000个核苷酸之间、在约2至3,000个核苷酸之间或在约2至2,000个核苷酸之间。在本发明教导的任一实施方案中，多重核酸扩增可以包含生成至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个各靶核酸分子、靶基因座或所关注区域的拷贝。
在一些实施方案中，在文库制备和任选的富集步骤之后，可以将模板核酸分子文库模板化到一个或多个载体上。一个或多个载体可以在两个反应中模板化，即生成预接种固体载体的接种反应和使用一个或多个预接种载体进一步扩增连接的模板核酸分子的模板化反应。预接种反应通常是扩增反应，并且可使用各种方法进行。例如，预接种反应可以在RPA反应、模板步移反应或PCR中进行。在RPA反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白来扩增模板核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离至少一部分的双链模板核酸分子，以允许引物杂交，随后聚合酶可结合以启动复制。在一些实施方案中，重组酶辅助蛋白可以是防止解离的模板核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-stranded binding protein；SSB)。通常，RPA反应可在等温温度下进行。在模板步移反应中，在允许双链模板核酸分子的至少一部分解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以开始复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在PCR中，通过热循环使双链模板核酸分子解离。冷却后，引物与互补序列结合并可以用于聚合酶的复制。在本发明教导的任一个方面中，可以在预接种反应混合物中进行预接种反应，该预接种反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在任何公开的方面中，预接种反应混合物可以包含以下的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种固体载体、核苷酸以及诸如二价阳离子的辅因子。在一些实施方案中，预接种反应混合物可以进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施方案中，模板核酸分子群体包括与同第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施方案中，如在乳液RPA或乳液PCR中，反应混合物可以形成乳液。在通过RPA反应进行的预接种反应中，预接种反应混合物可以包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
在接种的特定实施方案中，使亲水性颗粒和多核苷酸经受聚合酶链式反应(PCR)扩增或重组酶聚合酶扩增(RPA)。在一个示例中，颗粒404包含与模板多核苷酸402的一部分互补的捕获引物。模板多核苷酸可以与捕获引物杂交。捕获引物可以延伸以形成包含与其连接的靶多核苷酸的珠粒406。其它珠粒可以保持不与靶核酸连接，并且其它模板多核苷酸可自由浮动于溶液中。
在一个示例中，包含靶多核苷酸的珠粒载体406可以与磁性珠粒410连接以形成珠粒组装件412。具体地，通过双链多核苷酸连接，将磁性珠粒410与珠粒载体406连接。在一个示例中，包含接头部分的另外的探针可以与珠粒载体406上的靶多核苷酸的一部分杂交。接头部分可以与磁性珠粒410上的互补接头部分连接。在另一个示例中，用于形成与珠粒406连接的靶核酸的模板多核苷酸可以包含与磁性珠粒410连接的接头部分。在另一个示例中，从修饰具有与磁性珠粒410连接的接头的引物，可以生成与和珠粒载体406连接的靶多核苷酸互补的模板多核苷酸。
连接于多核苷酸的接头部分和连接于磁性珠粒的接头部分可以彼此互补和连接。在一个示例中，接头部分具有亲和力并且可以包括：亲和素部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫学活性片段；抗体和半抗原；地高辛配基部分和抗地高辛配基抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏物；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白A；或者寡核苷酸或多核苷酸以及它们相应的互补序列。在一个特定示例中，连接于多核苷酸的接头部分包含生物素，并且与磁性珠粒连接的接头部分包含链霉抗生物素蛋白。
珠粒组装件412可以施加在包含孔418的测序装置的基板416之上。在一个示例中，可向基板416施加磁场以将珠粒组装件412的磁性珠粒410牵拉向孔418。珠粒载体406进入孔418。例如，磁体可平行于基板416的表面移动，由此使得将珠粒载体406置放于418孔中。
可以使珠粒组装件412变性，以移除磁性珠粒410，将珠粒载体406留在孔418中。例如，可使用热循环或离子性溶液使珠粒组装件412的杂交的双链DNA变性，以释放磁性珠粒410和具有与磁性珠粒410连接的接头部分的模板多核苷酸。例如，可以用低离子含量水溶液诸如去离子水处理双链DNA，以使链变性和分离。在一个示例中，泡沫洗涤可以用于移除磁性珠粒。
任选地，可以扩增靶多核苷酸406(在本文称为模板化)，同时在孔418中，提供具有靶多核苷酸的多个拷贝的珠粒载体414。具体地，珠粒414具有靶多核苷酸的单克隆群体。这种扩增反应可以使用聚合酶链式反应(PCR)扩增、重组聚合酶扩增(RPA)或它们的组合进行。可替代地，可以在将珠粒载体414沉积在孔中之前进行扩增。
在一个特定实施方案中，酶(诸如聚合酶)存在、结合于或紧密靠近于颗粒或珠粒。在一个示例中，聚合酶存在于溶液中或孔中以促进多核苷酸的复制。多种核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在示例实施方案中，聚合酶可以包含可催化多核苷酸复制的酶、其片段或亚基。在另一实施方案中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变体聚合酶、变异聚合酶、融合或其它工程聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子，或其类似物、衍生物或片段。酶、溶液、组合物和扩增方法的实例可见于WO2019/094,524，标题为“用于操纵核酸的方法和组合物”，其通过引用整体并入本文。
尽管珠粒载体414的多核苷酸示出为在表面上，但多核苷酸可延伸在珠粒载体414内。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可以包含珠粒载体414的内部上和整个中的多核苷酸区段，或多核苷酸可存在于孔和其它开口中。具体地，珠粒载体414可以允许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物扩散。每个颗粒的大量多核苷酸产生更好的信号。
在一个示例性实施方案中，珠粒载体414可以用于测序装置中。例如，测序装置416可以包含孔418的阵列。
在一个示例中，可以将测序引物添加到孔418中，或者可以在将珠粒载体414放置在孔418中之前将其预暴露于引物。具体地，珠粒载体414可以包含结合的测序引物。测序引物和多核苷酸形成包含与测序引物杂交的多核苷酸(例如模板核酸)的核酸双螺旋。核酸双螺旋是至少部分地双链多核苷酸。可以向孔418提供酶和核苷酸以促进可检测的反应，诸如核苷酸并入。
可以通过检测核苷酸添加来进行测序。可以使用诸如荧光发射法或离子检测法的方法检测核苷酸添加。例如，一组荧光标记的核苷酸可以被提供给系统416并且可以迁移到孔418。还可以向孔418提供激发能。当核苷酸被聚合酶捕获并加入到延伸引物的末端时，核苷酸的标记可以发荧光，指示加入了哪种类型的核苷酸。
在一个替代的示例中，可以依次加入包含单一类型核苷酸的溶液。响应于核苷酸添加，孔418的局部环境内的pH可改变。这种pH的变化可以通过离子敏感场效应晶体管(ISFET)检测。因此，pH改变可用于生成指示与颗粒410的多核苷酸互补的核苷酸的次序。
具体地，测序系统可以包括安置在离子传感器诸如场效应晶体管(FET)的传感器垫上的一个孔或多个孔。在各实施方案中，系统包含装载到设置在离子传感器(例如，FET)的传感器垫上的孔中的一种或多种聚合物颗粒，或装载到设置在离子传感器(例如，FET)的传感器垫上的多个孔中的一种或多种聚合物颗粒。在各实施方案中，FET可以是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括一种用作化学传感器的场效应晶体管。chemFET的结构类似于MOSFET晶体管，其中通过化学工艺施加栅电极上的电荷。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(诸如H+)改变时，通过晶体管的电流也相应地改变。
在各实施方案中，FET可以是FET阵列。如本文所使用的，“阵列”是诸如传感器或孔的元件的平面布置。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是在第一维度中具有一列(或行)元素并且在第二维度中具有多个列(或行)元素的阵列。第一维度和第二维度中的列(或行)的数量可以相同或不同。FET或阵列可以包括102、103、104、105、106、107或更多FET。
在各实施方案中，可以在FET传感器阵列上方制造一个或多个微流体结构，以提供生物或化学反应的容纳或约束。例如，在一个实施方案中，微流体结构可以被配置成设置于阵列的一个或多个传感器上方的一个或多个孔(或孔，或反应室，或反应孔，如本文中可互换地使用的术语)，使得其上设置既定孔的一个或多个传感器检测和测量既定孔中的分析物存在、水平或浓度。在各实施方案中，FET传感器和反应孔之间可存在1:1对应。
返回到图5，在另一个示例中，可以将孔阵列的孔418可操作地连接到测量装置。例如，对于荧光发射法，可将孔418可操作地联接到光检测装置。在离子性检测的情况下，孔418的下表面可安置于离子性传感器(诸如场效应晶体管)的传感器垫上。
一种涉及通过检测核苷酸并入的离子性副产物测序的实例系统是Ion TorrentPGMTM,ProtonTM、S5TM或GenexusTM测序仪(Thermo Fisher Scientific)，其是通过检测作为核苷酸并入的副产物产生的氢离子来对核酸模板进行测序的离子类测序系统。通常，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸并入的副产物释放。IonTorrent PGMTM、ProtonTM、S5TM或GenexusTM测序仪通过检测核苷酸并入的氢离子副产物来检测核苷酸并入。Ion Torrent PGMTM、ProtonTM、S5TM或GenexusTM测序仪可以包含待测序的多个模板多核苷酸，各模板设置在阵列中的各个测序反应孔内。阵列的孔各自与至少一个离子传感器联接，该离子传感器可以检测H+离子的释放或作为核苷酸并入的副产物产生的溶液pH的变化。离子传感器包括联接到离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，其可以感测H+离子的存在或溶液pH的变化。离子传感器可提供指示核苷酸并入的输出信号，其可以表示为电压变化，其大小与各自的孔或反应室中的H+离子浓度相关。不同的核苷酸类型可连续流入反应室，并且可以通过聚合酶以模板序列确定的顺序并入延伸引物(或聚合位点)中。每个核苷酸并入可以伴随着反应孔中H+离子的释放，以及局部pH的变化。H+离子的释放可由传感器的FET记录，该FET产生指示核苷酸并入发生的信号。在特定核苷酸流动期间未并入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号的振幅也可以与并入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量相关，从而准许均聚物区被解析。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室同时并入，通过多个孔或反应室监测可以允许仪器同时解析许多核酸模板的序列。
可以通过各种方法进行接种珠粒载体和磁性珠粒捕获。例如，转到图6的502处，模板多核苷酸(B'-A)可以被与珠粒载体510连接的捕获探针(B)捕获。与模板多核苷酸互补的捕获探针(B)可以延伸。任选地，可以使所得双链多核苷酸变性，由此去除模板核酸(B'-A)并且留下与珠粒载体510连接的单链(B-A')。如504处所展示的，可以使修饰具有接头部分(诸如生物素)的引物(A)与和珠粒载体510连接的核酸(B-A')的部分(A')杂交。任选地，引物(A)可以延伸，以形成互补核酸(A-B')。
如图506所展示的，可以将磁性珠粒512引入溶液中。磁性珠粒512可以包含与和引物(A)连接的接头部分互补的接头。例如，与引物(A)连接的接头可以是生物素，并且磁性珠粒512可以涂覆有抗生蛋白链菌素。如上文所描述的，磁性珠粒512可以用于清洁溶液和帮助将珠粒载体510和所连接的核酸(B-A')置放到测序装置的孔中。如508所展示的，可以使双链多核苷酸变性，使得从与珠粒载体510连接的核酸(B-A')脱杂交出核酸(B'-A)。因此，将珠粒载体510放置到测序装置的孔中，并且该珠粒载体具有单链靶核酸(B-A')。可替代地，接头修饰的探针(A)可以不延伸，以形成具有一定长度的多核苷酸(B-A')的互补多核苷酸。可使用聚合酶链式反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其它扩增反应来进行延伸反应。
仪器
图7包括示例性测序仪器系统600的图示，该示例性测序仪器系统包括与制备台板604、装载站606和测序站608通信的控制器602。制备台板604可以包括移液机器人612，移液机器人可以访问样品614、试剂和溶液616、热循环仪618和其它装置620，诸如磁力分离器或离心机。在制备台板604处制备的靶序列可以提供给诸如装载站606的模板化区。例如，制备台板604可以提供包含靶序列的接种基板，该靶序列被提供给装载站606以装载到传感器装置上。
一旦装载，包含靶序列的传感器装置可以利用滑块机构610运输到测序区，诸如测序站608。测序站608可以包含流体和电子接口以与传感器装置交互以在合成测序反应期间感测核苷酸的添加。从传感装置收集的数据可以提供给可以执行碱基识别、读段比对和变异识别的测序计算机622。
控制器602可以进一步与诸如监测器、键盘、鼠标、触摸屏或它们的任何组合等用户接口624以及其它接口通信。进一步地，控制器602可以与可以访问局域网、广域网或全球网络的网络接口通信。网络接口626可以是使用各种标准通信协议的有线接口或无线接口。进一步地，该系统可以由电源628供电。
图8包括并入三轴移液机器人的示例仪器700的图示。在一个示例中，仪器700可以是并入了样品预制备平台的测序仪。例如，仪器700可以包含上部部分702和下部部分704。上部部分可以包括用于接近样品、试剂容器和其它消耗品所放置的搁板710的门706。下部部分可以包括用于储存另外的试剂溶液和仪器700的其它部件的柜子。另外，仪器包括诸如触摸屏显示器708的用户接口。
在一个特定示例中，仪器700可以是测序仪器。在一些实施方案中，测序仪器包含顶部区段、显示屏和底部区段。在一些实施方案中，顶部区段可以包含测序仪器和消耗品的台板支撑组件，消耗品包含样品制备区段、测序芯片和试剂条管以及载体。在一些实施方案中，底部区段可以容纳用于测序的试剂瓶和废液容器。
示例性仪器搁板710在图9中展示为仪器搁板800。在一个或多个相机的视图中，台板800容纳在仪器的顶部区段中。样品制备台板可以包括被配置成用于容纳试剂条、供应物、测序芯片以及其它消耗品的多个位置。如本文所用，消耗品是由仪器使用的组件，该组件在使用时定期更换。例如，消耗品包括试剂和溶液条或容器、移液管吸头、微孔阵列和流通池以及相关传感器，以及不是仪器的永久组件的一部分的其它一次性组件。
在一个示例中，系统800包括移液机器人802，其存取各种试剂条和容器、移液管吸头、微孔阵列和其它消耗品以实施测试。进一步地，系统可以包含用于执行测试的机构804。示例性机构804包含机械输送机或滑块和流控系统。
在一个示例中，台板800包含托盘806或808，以收纳特定配置的溶液或试剂条。在测序仪器的示例中，托盘806可以用于适当配置的条中的文库和模板溶液，并且托盘808可以收纳适当配置的文库和模板试剂。
进一步地，仪器可以被配置成在搁板上的特定位置处收纳微孔阵列810和812。例如，样品可以在孔阵列中提供，诸如微孔阵列812。在另一个示例中，系统可以被配置成以不同的条配置收纳额外的试剂814。在另一个示例中，试剂溶液可以提供在阵列816中。在另外的示例中，容器阵列820可以与诸如热循环仪的仪器仪表结合提供。进一步地，系统可以包括其它仪器仪表，诸如离心机，其可以设有诸如管的消耗品。进一步地，可以提供托盘以收纳移液吸头822。
芯片和滑块机构
在一个示例中，生物传感器和流通池是传感器装置的实例。图10和图11展示了示例性传感器装置1400，诸如包括流通池的微芯片。例如，传感器装置1400包括紧固裸片1404的基板1402，该裸片具有与传感器阵列成流体连通的多个微孔。流通池1406紧固于基板底之上，从而提供裸片1404之上的体积。
在一个示例中，流通池1406包含一组流体入口1408和一组流体出口1410。具体地，流通池1406可以划分成泳道1412。每个泳道由相应流体入口1408和流体出口1410单独接达。可替代地，流通池可以包括单组流通入口并且具有单个泳道。
如所展示，传感器装置1400包含四个泳道1412。可替代地，传感器装置1400可以包含少于四个泳道或多于四个泳道。例如，传感器装置1400可以包括介于1个与10个之间的泳道，诸如介于2个与8个之间的泳道，或4至6个泳道。泳道1412可以彼此流体隔离。因此，根据运行计划的各方面，可以在单独时间、同时期或同时使用泳道1412。
传感器装置1400可以进一步包含引导结构1414，例如，形成为流通池1406的一部分，以接合流体联接器上的互补结构。此类引导结构1414帮助使流体入口1408和流体出口1410与流体联接器上的相关联端口对齐。
图12、图13和图14包含示例流体联接器1600的图示。流体联接器1600包含限定了端口组之间的流体路径的主体1614。进一步地，流体联接器1600可以包括用于接合机械组装件并且帮助相对于机械组装件定位流体联接器1600的连接器部分1612。在另一个实例中，流体联接器1600可以包括翼部1616，该翼部限定参考孔1610以接合机械组装件的导杆，进一步帮助相对于传感器装置定位流体联接器1600。
流体联接器1600的主体1614可以限定与第一组端口1604流体连通的开口1602。开口1602的尺寸可以设计成接收移液管尖端的一端并且允许将流体组合物移取到开口1602中。开口1602与一组端口1604流体连通，该端口被配置成接合传感器装置1400的入口1408(图10)。流体联接器1600可以进一步限定第二组端口1606，该第二组端口可以接合传感器装置1400的出口1410(图10)并且提供与其的流体连通。
如图14所展示，系统可以进一步包含与第二组端口1606流体连通的第三组端口1818。第三组端口1818可以与机械组装件的流体歧管接合，诸如图22和图23中所展示的流体歧管2540。任选地，流体联接器1600可以包括第四组端口1820，该第四组端口可以与流体歧管连接或者可以根据机械组装件的配置被封闭。
端口1604、1606、1818或1820可以由弹性材料形成，诸如橡胶或弹性体聚合物。在一个示例中，端口可以使用弹性材料形成为包覆模制。
返回到图12，流体联接器1600的主体1614可以进一步包含与传感器装置1400的引导特征1414(图10)互补的引导特征1608。
如图15和图16所展示，流体联接器1600可以接合传感器装置1400。流体联接器1600的主体1614可以与传感器装置1400的基板1402对齐，以允许流体联接器1600的第一组端口1604与传感器装置1400的入口1408流体连通。进一步地，第二组端口1606可以与传感器装置1400的出口1410流体连通。例如，引导结构1414和1608可以接合以将端口与入口和出口对齐。任选地，第三组端口1818可以与歧管流体连通。在另外的实例中，任选地与第二组端口1608流体连通的一组流体端口1820可以与流体歧管流体连通。
因此，流体组合物可以被移取到与第一组端口1604流体连通的开口1602中，该开口通过流通池1406的入口1408向传感器装置1400的流通池1406提供流体组合物。在处理之后，流体组合物的剩余部分可以通过第二组端口1606和第三组端口1818从传感器装置1400的出口1410吸取到流体歧管中。
图17和图18包括用于在系统内的各个站之间移动传感器装置的示例机械系统2100的图示。例如，滑块机构2102可以沿着轨道2104移动以在站2106、2108与2110之间引导传感器装置(例如，图10中的传感器装置1400)。例如，传感器装置可以在站2106处插入到滑块机构2102中。在一个示例中，传感器装置可以以竖直朝向插入，其中入口和出口指向一侧而不是向上。传感器2112可以检测传感器装置的存在并且当传感器装置存在时允许滑块机构2102移动。例如，滑块机构2102可以将传感器装置移动到站2108，在该站处，可以诸如通过上文关于图5描述的磁性装载方法将样品装在到传感器装置中。具体地，可以将流体联接器插入到由机械组装件2114提供的空间2116中，该空间可以将流体联接器压靠在传感器装置上并且使流体联接器与歧管接合。当磁性装载技术完成时，机械组装件2114可以与流体联接器分离，并且滑块2102可以将传感器装置移动到随后的站2110，诸如针对测序提供试剂和其它条件的流体站。
如图18所展示，诸如螺钉驱动器的驱动器2218可以包括螺钉2220，该螺钉接合离合器2222以移动滑块2102，并且因此移动站2106、2108与2110之间的传感器装置。例如，作为第一次测序运行的一部分，传感器装置可以移动通过站2106、2108和2110，然后回到站2108以变性和重新引发，随后移动到站2110以进行第二次测序运行。
如图19所展示，滑块2102可以定位在台2106处，其中止动柱2332在特征2354处接合滑块2102。进一步地，滑块2102可以从站2106向前移动到站2108，在该站处可以接合螺线管止动柱2334，并且滑块向后移动(如图所展示的左侧)以使螺线管止动件2334与特征2354接合。另外，滑块2102可以沿着轨道2104移动以接合图20所示的前进止动件2436，从而将滑块和传感器托座2324与站2110对齐。为了使滑块2102返回站2106，螺线管止动柱2334可以脱离接合以允许滑块2102通过。
当传感器装置在站2106处插入托座2324中时，传感器2112可以通过开口2356感测托座2324中传感器装置的存在。例如，传感器装置2112可以是光学传感器，该光学传感器通过开口2356光学地检测托座2324内传感器装置的存在。
离合器2222可以用于提供抵靠止动件2324或2334的向后力(展示为向左)和抵靠止动件2436的向前力(展示为向右)。例如，离合器系统2222包含螺母2326以接合螺钉驱动机构2218的螺钉2220。螺母2326与具有中心孔的联接器2328接合，该中心孔允许螺母2220穿过联接器2328。联接器2328使用销和弹簧系统2350与螺母2326连接。销可移动地连接到螺母，使得当销和弹簧系统2350的弹簧压缩时，销移动通过螺母2326。
联接器2328还使用销和弹簧系统2352连接到连接器板2330。当销和弹簧系统2352的弹簧被压缩时，销和弹簧系统2352的销可以被配置成移动通过连接器板2330。可替代地或另外，销和弹簧系统2352的销可以被配置成移动通过联接器2328。
连接器板2330联接到滑块2102，该滑块响应于螺钉2220的旋转来回移动。当滑块2102抵靠止动件2332或2334向后移动(如图18中左侧所展示)时，销和弹簧系统2352的弹簧可以压缩，并且销可以移动通过连接器板2330或联接器2328。因此，螺钉2220的旋转提供了向后抵靠杆2332或2334的已知力，从而提供了传感器装置在托座2324内的精确定位。在另外的实例中，随着滑块2102向前移动以接合止动件2436，滑块2102停止移动。螺钉2220的另外旋转使螺母进一步向前移动(如图18右侧所展示)。销和弹簧系统2350的弹簧压缩，并且销和弹簧系统2350的销移动通过螺母2326，从而提供滑块2102抵靠前进止动件2436的已知力。此力和定位提供了传感器装置托座2324和传感器装置在站2110处的精确定位。
图21包括用于提供传感器装置与流体联接器之间的流体联接的示例机械组装件2114的图示。当滑块就位时，为传感器装置提供空间2538。进一步地，为流体联接器提供空间2116。当被机械组装件2114接合时，流体联接器被按压与传感器装置和歧管2540流体连通。利用例如带有螺钉2544的螺钉驱动器的驱动机构2542可以利用具有螺母2546并且通过销2564和弹簧2566联接到框架2548的离合器系统向前(在图21中展示为向上)和向后(在图21中展示为向下)移动机械组装件2114的框架2548。销2564可以与螺母2546可移动地联接，使得销2564的头部2578抵靠螺母2546定位，直到歧管2540被压靠在流体联接器上。螺母2546的另外向前移动导致销2564移动通过螺母2546，从而允许弹簧2566压缩。
框架组件2548可以响应于螺母2546的移动一起前后移动。杠杆2550在紧固件2552处可旋转地联接到框架2548。当组装件处于向后位置时，与杠杆2550连接的调节螺钉2586接合止动件2584，使杠杆2550的相对侧向后(如所展示的向下)枢转。随着螺母2546向前移动，调节螺钉2586逐渐从止动件2584中脱离接合，并且杠杆2550的相对侧例如在弹簧2582的推动下向前枢转。杠杆2550的枢转使导板2556相对于同样向前移动(如所展示的向上)的框架2548向前移动。导板2556连接到导杆2558和2560，导杆与导板2556一起向前移动以接合流体联接器的参考孔。导杆2560可以进一步由接合歧管2540的一部分的引导件2562引导。随着导杆2560向前移动，它可以与传感器2576脱离接合，表明导杆2560正在接合流体联接器的参考孔。
当歧管2540以及导杆2558和2560接合流体联接器时，螺母2546可以继续向前，而框架2546保持静止。销2564可以移动通过螺母2546并且弹簧2566压缩，提供抵靠流体联接器并且抵靠与流体联接器流体连通的传感器装置的已知力。此力在传感器装置与流体联接器之间提供了期望的无泄漏流体联接。
包含传感器2572和2574的电路板2570可以连接到可移动框架2548，并且可以与框架2548一起移动。旗形件2568可以连接到螺母2546。从向后位置到歧管2540和框架2548与流体联接器连接的第二位置，旗形件2568的位置相对于位置传感器2572保持恒定。一旦歧管2540抵靠流体联接器和传感器装置定位，螺母2546就相对于框架2548向前移动。因此，旗形件2568朝着传感器2572向前移动。当传感器2572检测到旗形件2568时，可以停止螺母2546的向前驱动。因此，实现了对弹簧2566的已知压缩，并且对框架2548、歧管2540和流体联接器施加了已知力。
随着螺母2546从向前位置向后移动，旗形件2568从传感器2572脱离接合，直到其头部2578处的销2564抵靠螺母2546固定。随着螺母2546继续向后移动，框架2548和歧管2540与传感器电路板2570一起被向后拉。可调节螺钉2586接合止动件2584，将导杆2558和2560从流体联接器的参考孔中抽出。随着导杆从流体联接器中抽出，参考杆2560接合传感器2576，指示它已经从流体联接器的参考孔中抽出。传感器2574通过与框架2548连接的传感器电路板2570继续向后移动，直到传感器2574接合指示螺母2546处于最向后位置的旗形件2580。流体联接器与机械组装件2114脱离接合并且可以被移除。进一步地，滑块机构2102可以将传感器装置移动到下一站2110。
图22和图23包括与机械组装件2114一起使用的示例歧管2540的图示。歧管2540可以在前表面处包含槽2642以接收流体联接器。槽2642连同支撑结构2644和2646可以设置流体联接器的竖直位置，诸如图16中所展示的流体联接器1600。流体联接器1600的连接器部分1612可以在歧管2540之上朝着歧管的后表面延伸。歧管2540可以进一步包含与流体联接器1600的参考孔1610对齐的参考孔2650和2648。参考孔2650的大小可以设计成接收导杆2558。参考孔2648的大小可以设计成接收导杆2560和任选地接收引导件2562。
具体地，歧管2540包含用于接合流体联接器1600的第三端口1818(图14中示出)的一组流体开口2652。该一组开口2652与安置在流体歧管2540的后表面上的一组端口2654流体连通。此类端口2654可以连接到真空，以允许流体通过端口2654、开口2652、流体联接器1600的第三组端口1818和流体联接器1600的第二组端口1606被吸取。任选地，可以提供另外的一组流体开口和流动端口以与流体联接器1600的第四组流体端口1820连接。
图24包括展示了用于流体接合传感器装置的方法2800的方框流程图。例如，如框2802处所展示的，当滑块处于第一位置时，可以将传感器装置插入滑块的固持器或托座中。任选地，在允许滑块移动到第二位置之前，检测器可以确定传感器装置是否正确地定位在固持器或托座内。
如框2804处所展示的，传感器装置和滑块可以移动到第二位置。在示例系统中，第二位置可以表示样品被装载到传感器装置上的位置。例如，可以将流体联接器压靠在传感器装置的流通池上，如框2806处所展示的。流体联接器可以包括开口，该开口允许将流体组合物吸移到开口中并且通过流体联接器的与传感器装置的流通池的入口接合的端口。
例如，移液管可以吸取流体组合物的等分试样，如框2808处所展示的。等分试样可以施加到流体联接器的开口，如框2810处所展示的。等分试样可以穿过流体联接器的开口、第一组端口和传感器装置的入口并且进入传感器装置的流通池。
在一个示例中，流体组合物可以在流通池内进行处理，如框2812处所展示的。例如，可以应用磁性装载技术将样品装载到传感器装置的孔内。
如框2814处所展示的，可以从传感器装置的流通池中吸取流体组合物的剩余部分。例如，邻接到压靠流体联接器并且与流通池的出口流体连通的歧管的真空可以从流通池吸取流体组合物的剩余部分。可以重复移取流体组合物的等分试样、施加等分试样、处理流体组合物和吸取流体组合物的剩余部分的过程，例如，以施加另外的样品或清洗流通池。
一旦装载过程完成，传感器装置可以从机械组装件中释放，如框2816所展示的。例如，可以将机械组装件拉到向后位置，释放传感器装置和流体联接器，并且允许传感器装置移动到随后的站。
滑块和传感器装置可以移动到第三位置，如框2818所展示的。例如，传感器装置可以移动到系统的测序区。为了重新测序，可以将传感器装置移动到装载位置，并且可以重复过程步骤2810-2818。
磁性装载
可以使用各种方法来进行模板化。示例性实施方案包括“Systems and Methodsfor Preparing a Sequencing Device,”US 2020/0072826A1，或“Methods andCompositions for Manipulating Nucleic Acids,”US 2019/0255505A1，这两篇专利中的每篇以引用的方式并入本文。
此类装载方法可以在具有水平或竖直配置的硬件中实施。例如，硬件可以固持基板，珠粒水平地沉积在该基板上。在另一实例中，硬件可以竖直地固持基板，其中基板的平面大致平行于重力。如本文所使用的，竖直是指基板的主表面的平面更接近于平行于重力而不是垂直于重力的朝向。在图25、图26、图27和图28所展示的示例中，磁性装载系统3500包含板3502和沿着板3502引导磁体的磁体固持器3504。在所展示的实例中，板3502固定到竖直结构3514，该竖直结构固定到水平结构3516。磁体固持器3504可以沿着板3502上下移动磁体，以促进将诸如测序珠粒的珠粒载体装载到安置在板3502相对侧上的基板的孔中。
在特定实例中，驱动机构3506可以促进磁体固持器3504沿着板3502上下移动。例如，驱动机构3506可以旋转螺纹螺钉3518以沿着螺钉3518上下驱动连接器板3510。连接器板3510连接到磁体固持器3504。任选地，连接器板3510可以联接到导板3508。导板3508可以沿轨道3512滑动，为连接器板3510和磁性固持器3504的移动提供稳定性。
如图26所展示，基板固持器3620(例如，图26或图27的歧管)为基板或传感器装置提供空间3622，诸如具有流通池的微芯片，以插入并且保持抵靠板3502。随着连接到固持器3504的磁体沿着板3502的竖直表面上下移动，连接到溶液中的磁性珠粒的珠粒载体沉积到基板的孔中。在一个示例中，基板是具有流通池的测序芯片，溶液安置在流通池中。
如图27所展示，板3502可以任选地包含用于接收加热器3724的凹部。加热器3724可以用于控制板3502和任选地定位于板3502表面附近的基板的温度。可替代地，加热器3724可以用于促进双链核酸的熔解或控制扩增温度。
磁性固持器3504可以包含一个或多个磁体。例如，如图28所展示，磁性固持器3504可以包含磁体3828和磁体3830。磁体3828或3830可以被空气分开。可替代地，磁体可以由顺磁性材料或绝缘材料分开。
在一个示例中，磁体被配置成使得磁体的不同磁极抵靠板3502定位。例如，磁体3828可以被配置成具有邻近板3502定位的北极，并且磁体3830可以被配置成具有邻近板3502的南极。可替代地，磁体3828的南极和磁体3830的北极可以邻近板3502定位。在另外的替代方案中，每个磁体的相同磁极可以邻近板3502定位。
该系统可以进一步包括传感器3826，该传感器检测磁体的位置，例如，下边界。如图28所展示，当磁体处于其较低位置时，导板3508可以干扰光学传感器3826。可替代地，可以使用其它传感器来确定板和相关联磁体的位置。
在将珠粒装载到传感器装置或微芯片的孔中之后，测序珠粒上的多核苷酸可以被扩增以在测序珠粒上形成单克隆多核苷酸群体。可以使用例如基于离子的测序技术对单克隆多核苷酸群体进行测序。
图29包括用于与传感器装置接口的示例性电子接口4802的图示。例如，电子接口4802可以包含与传感器装置的电子接口交互的销。任选地，接口4802可以包含使传感器装置与电子接口4802脱离接合的机构4804。例如，当流体歧管被压靠在传感器装置上时，机构4804可以压下。示例性流体歧管包括“FLUIDICS SYSTEM FOR SEQUENTIAL DELIVERY OFREAGENTS,”美国专利号8846378或“DEVICE,SYSTEM AND METHOD FOR FLUID DELIVERY FORSEQUENCING,”PCT申请号PCT/US2020/035086的那些，这两篇专利以引用的方式并入本文。当流体歧管与传感器装置断开连接时，机构4804可以将传感器装置推离电子接口4802。任选地，该系统可以进一步包括诸如散热器4806的用于控制温度的机构。散热器4806可以包含翅片。可替代地，散热器4806可以是液冷散热器。
具体地，流控系统和电子接口用于在合成测序反应期间检测核苷酸掺入。数据被收集并且提供给测序仪器服务器系统。
测序仪软件
在一些实施方案中，核酸测序仪器可以与用于控制测序仪器的各个组件并且对来自测序仪器上的测序运行的数据输出进行处理的服务器系统接口连接。服务器系统软件可以包含web应用、数据库和分析流水线并且支持来自测序仪器的连接(例如，图6)。服务器系统软件可以提供以下主要功能和应用程序接口(API)：
1.用于用户认证、试剂跟踪、运行信息和运行跟踪/记录的API。支持的仪器可以包含测序仪器和提取仪器。
2.用于创建样品、文库、计划运行和检索计划的运行状态的LIMS(实验室信息管理系统)的API。
3.支持对样品和运行数据的管理。
4.支持测定配置和执行分析流水线以进行数据分析和报告。
5.与用于软件更新和维护的软件更新服务器的接口。
6.支持配置连接到部署在基于云的系统或本地系统中的注释和报告系统，诸如来自Thermo Fisher Scientific的Ion Reporter，并且与基于云的系统建立安全和经过认证的连接，以传输经映射或未经映射的BAM文件。
7.支持配置连接到云计算环境中的资源系统，诸如赛默飞世尔云(Thermo FisherCloud)，并且与云资源系统建立安全和经过认证的连接，以下载软件和系统内容并发送遥测数据。
图30示出了服务器系统组件的示意图。在一些实施方案中，基础软件架构可以包括web接口、远程监测代理、数据库、与仪器的API、分析流水线、分析流水线的集装箱化(例如使用Docker)、到注释和报告系统的连接(例如，来自赛默飞世尔科技公司的IonReporter)和基于云的支持和资源系统(例如赛默飞世尔云)。基于云的支持和资源系统或基于云的资源系统可以在云计算和存储系统中实施。基于云的支持和资源系统存储包含测定定义文件的内容。云计算和存储系统的服务器可以将诸如测定定义文件的内容下载到本地服务器系统。基于云的支持和资源系统可以从本地服务器系统接收遥测数据。服务器系统、本地服务器系统和用户的服务器系统在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，用户接口(UI)可以通过web应用软件实施。UI可以提供样品管理页面。样品管理UI页面允许用户将样品信息输入到系统中。样品信息包含唯一样品标识符(ID)、样品名称和样品制备试剂跟踪信息。验证逻辑内置于将样品制备步骤锁定到预定义测定工作流的样品管理流中。UI可以提供测定管理页面。测定管理UI页面允许用户查看测定并创建测定。测定将工作流锁定到过程的每个步骤的预定义参数。可以内置有验证逻辑以确保测定配置。UI可以提供运行计划和监测器页面。运行计划和监测器UI页面允许用户对运行进行计划并监测正在进行的运行。UI可以提供输出数据页面。输出数据UI页面允许用户查看分析结果以及对所生成的结果的质量控制(QC)度量评价、日志和审计跟踪。UI可以提供配置页面。配置UI页面允许用户对系统进行查看和配置。
在一些实施方案中，应用编程接口(API)可以通过Java平台提供。例如，Java平台可以包含可以用于针对基于Web的应用构建Web档案(WAR)文件的Tomcat服务器。
在Kepler工作流引擎的上下文中，用于分析流水线的各个步骤的代码模块可以被称为参与者(actor)。例如，用于分析步骤的代码模块可以由包含在参与者罐(actor jar)中的Java程序二进制代码来实施。Kepler工作流引擎将工作流的处理组件定义为“参与者”并将步骤链接起来以供算法或分析流水线的处理器执行。(https://kepler-project.org)。例如，可以使用Kepler工作流引擎来配置图49中的分析流水线的工作流。
服务器系统可以包含一个或多个数据库。例如，服务器系统可以包含用于存储样品数据、运行数据和系统/用户配置的关系数据库。关系数据库可以包含两个独立的数据库：测定开发数据库和Dx数据库。测定开发数据库可以存储用于RUO或测定开发操作模式的样品数据、运行数据和系统/用户配置。Dx数据库可以存储用于IVD或Dx操作模式的样品数据、运行数据和系统/用户配置。
服务器系统可以包含用于存储注释源数据的注释数据库AnnotationDB。例如，注释数据库可以被实施为NoSQL或非关系数据库，例如MongoDB数据库。每个注释源可以存储为具有指示源名称和版本的元信息的JSON(JavaScript对象表示法)串。每个注释源可以含有以注释ID为关键字的注释列表。服务器系统可以包含用于存储变异信息的变异组数据库VariomeDB。例如，变异组数据库可以被实施为NoSQL或非关系数据库，例如MongoDB数据库。VariomeDB可以存储特定样品的变异识别结果集合。例如，JSON格式的记录可以含有用于标识样品的元信息。
例如，AnnotationDB数据库可以存储以下注释源中的一个或多个注释源：
1.RefGene模型：hg19_refgene_63，版本63
2.RefGene功能规范转录物评分：hg19_refgeneScores_4，版本4
3.dbSNP：dbsnp_138，版本138
4.规范RefSeq转录物：hg19_refgene_63，版本63
5.5000Exomes：hg_esp6500_1，版本1
6.ClinVar：clinvar_1，版本1
7.DGV：dgv_20130723，版本20130723
8.OMIM：omim_03022014，版本03022014
可以包括其它注释源。可以包括以上注释源的其它版本。注释源可以提供公共注释信息内容或专有注释信息内容。
对于变异组数据库中的每个识别，可以查询每个注释源以查找与变异匹配的注释，并且可以将匹配注释作为键值对与变异一起存储在变异组数据库中。带注释的变异可以包含在用户的结果文件，例如带注释的VCF文件中。VCF文件是用于存储基因序列变异的制表符分隔的文本文件。在一些实施方案中，与本发明教导一起使用的注释方法可以包含在2016年1月28日公布的美国专利申请公布号2016/0026753中描述的一个或多个特征，该美国专利申请公布全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，服务器系统可以包含用于对在由测序仪器执行的测定的测序运行期间生成的测序数据进行处理的分析流水线。测序仪将测序数据文件和实验日志文件例如以原始.dat文件、产生逐块1.wells文件的已处理的.dat文件和缩略图数据的形式传输到服务器系统存储器。分析流水线访问来自存储器的数据文件并且针对运行开始数据分析。
在一些实施方案中，可以使用Docker容器和Docker镜像来打包分析流水线和操作系统特定的二进制文件。Docker是一种通过使用容器来创建、部署和运行应用的工具。容器使应用能够与其所需的所有部分，诸如文库和其它依赖项一起捆绑为一个包。这允许应用软件使用与主机系统相同的Linux核。Docker镜像文件可以与分析流水线代码所需的文库和二进制文件一起打包。Docker可以用于使应用或算法适应操作系统(OS)的新版本或不同版本，以创建与OS版本兼容的应用的Docker镜像。
在一些实施方案中，服务器系统可以包含用于将数据从测序仪器传输到分析流水线的爬虫服务(crawler service)。爬虫是一种可以使用JAVA NIO watcher API(应用编程接口)开发的基于事件的服务。NIO(非阻塞I/O)是为密集型输入/输出(I/O)操作提供功能的Java编程语言API的集合。爬虫可以监测为测序仪器配置的FTP目录，以将运行数据从测序仪器传输到分析流水线。
图31是根据一个实施方案的分析流水线的方框图。测序仪器在测定的测序运行期间生成原始数据文件(DAT或.dat文件)。信号处理可以应用于原始数据以生成诸如1.wells文件的与运行的日志信息一起传输到服务器FTP位置的文件的掺入信号测量数据。信号处理步骤可以导出对应于孔的背景信号。可以从对应孔的测得信号中减去背景信号。剩余的信号可以通过掺入信号模型拟合，以估计每个孔的每个核苷酸流处的掺入。来自以上信号处理的输出是可以存储在诸如1.wells文件的文件中的每个孔和每个流的信号测量结果。
在一些实施方案中，碱基识别步骤可以进行相位估计、归一化，并且运行求解器算法以标识最佳部分序列拟合并进行碱基识别。序列读段的碱基序列存储在未经映射的BAM文件中。碱基识别步骤可以生成读段总数、碱基总数和平均读长作为指示碱基识别质量的QC度量。碱基识别可以通过分析任何合适的信号特性(例如，信号振幅或强度)来进行。与本发明教导一起使用的信号处理和碱基识别可以包括2013年4月11日公布的美国专利申请公布号2013/0090860、2014年2月20日公布的美国专利申请公布号2014/0051584和2012年5月3日公布的美国专利申请公布号2012/0109598中描述的一个或多个特征，每个专利申请公布全文以引用的方式并入本文。
一旦序列读段的碱基序列确定，就可以向比对步骤提供序列读段，例如以为未经映射的BAM文件的形式。比对步骤将序列读段与参考基因组进行比对，以确定经比对的序列读段和相关映射质量参数。比对步骤可以生成一定百分比的可映射读段作为QC度量以指示比对质量。比对结果可以存储在经映射的BAM文件中。与本发明的教导一起使用的用于比对序列读段的方法可以包括2012年8月2日公布的美国专利申请公布号2012/0197623中描述的一个或多个特征，该专利申请公布全文以引用的方式并入本文。
BAM文件格式结构在2014年9月12日的“序列比对/地图格式规范”中进行了描述(https://github.com/samtools/hts-specs)。如本文中所描述的，“BAM文件”是指与BAM格式兼容的文件。如本文中所述，“未经比对的”BAM文件是指不含有经比对的序列读段信息和映射质量参数的BAM文件，并且“经映射的”BAM文件是指含有经比对的序列读段信息和映射质量参数的BAM文件。
在一些实施方案中，变异识别步骤可以包含检测单核苷酸多态性(SNP)、插入和缺失(InDel)、多核苷酸多态性(MNP)和复杂嵌段取代事件。在各个实施方案中，变异识别器可以被配置成将针对样品基因组识别的变异以*.vcf、*.gff或*.hdf数据文件的形式进行传送。只要所识别的变异信息可以被解析或提取以用于分析，所识别的变异信息就可以使用任何文件格式传送。与本发明教导一起使用的变异检测方法可以包括2013年12月26日公布的美国专利申请公布号2013/0345066、2014年10月2日公布的美国专利申请公布号2014/0296080和2014年2月20日公布的美国专利申请公布号2014/0052381以及2018年4月24日公布的美国专利号9,953,130中所描述的一个或多个特征，这些专利中的每篇以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，变异识别步骤可以应用于带分子标签的核酸序列数据。用于带分子标签的核酸序列数据的变异检测方法可以包括2018年11月22日公布的美国专利申请公布号2018/0336316中描述的一个或多个特征，该专利申请公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，分析流水线可以包含用于融合检测的融合分析流水线。融合检测方法可以包括2016年1月21日公布的美国专利申请公布号2016/0019340中描述的一个或多个特征，该专利申请公布以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，融合分析流水线可以应用于带分子标签的核酸序列数据。用于带分子标签的核酸序列数据的融合检测方法可以包括2019年3月21日公布的美国专利申请号公布2019/0087539中描述的一个或多个特征，该专利申请以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，分析流水线可以包含用于检测拷贝数变异的拷贝数变异分析流水线。用于检测拷贝数变异的方法可以包括2014年9月11日公布的美国专利申请公布号2014/0256571、2012年2月23日公布的美国专利申请公布号2012/0046877和2016年4月14日公布的美国专利申请公布号US2016/0103957中所描述的一个或多个特征，这些专利申请公布中的每篇以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，服务器系统软件可以支持封装的测定配置，其包含测定名称、测定类型、面板、热点文件(如果有的话)、参考名称、对照名称(如果有的话)、质量控制QC阈值、测定描述(如果有的话)、数据分析参数和值、仪器运行脚本名称和定义测定的其它配置。整套信息被称为测定定义。测定配置内容和对应的工作流可以作为测定定义文件(ADF)中的模块化软件组件传送给用户。服务器系统软件可以导入含有测定配置的测定定义文件。导入过程可以通过包含加密的Debian文件并触发安装过程的zip文件导入来启动。用户接口可以提供页面供用户选择要导入的ADF。基于云的支持和资源系统中的应用商店可以存储可供用户选择以下载到用户的本地服务器系统的支持各种测定、面板和工作流的ADF。
测定定义文件(ADF)是定义用于分子测试或测定的配置的封装文件，其包含测定名称、技术平台配置(例如，下一代测序(NGS)、芯片类型、化学成分类型)、工作流步骤(样品制备、仪器脚本、分析、报告)、分析算法、监管标记(例如，仅供科研使用(RUO)、体外诊断(IVD)、中欧体外诊断(CE-IVD)、仅内部使用(IUO)等)、靶向标志物(面板)、参考基因组版本、消耗品、对照、QC阈值、报告基因和变体。ADF提供了一种模块化方法来构建本地测序仪器的测定能力。测定软件可以由ADF与测序仪器的平台软件分开提供。
使用ADF进行测定配置的优点包含以下：
测定工作流和分析的封装
一键安装
由于Docker实施的软件的模块化结构允许与平台软件分离，因此在软件更新后无需重新验证测定配置
多层加密确保安全传送
对原始设备制造商(OEM)的测定配置的精简支持
精简的报告定制
支持区域调节要求
即插即用格式支持技术无关工作流
实现分子测试菜单的快速扩展和实验室的测定采用
在一些实施方案中，测定定义文件(ADF)可以包含用于以下步骤中的一个或多个步骤的软件代码模块：1)文库制备；2)模板化；3)测序；4)分析；5)变异解释；和6)报告生成。对于文库制备和模板化的工作流步骤，ADF可以包含用于制备文库、模板化和模板化珠富集的脚本。对于测序和分析的工作流步骤，ADF可以包含用于关于图50所描述的分析流水线的算法二进制代码和参数的Docker镜像包。对于变异解释的工作流步骤，ADF可以包含可以用于对变异进行分析和注释的注释源列表。对于报告生成的工作流步骤，ADF可以包含报告模板和镜像文件以供生成报告时使用。
ADF可以包含用于控制测序仪器上的工作流步骤的仪器脚本。例如，脚本可以包含控制移取量和机器人控制的参数。仪器脚本可以针对特定测定进行定制。
例如，对于测序和分析步骤，ADF可以包含端到端分析流水线的Docker镜像。Docker镜像可以包含用于分析流水线的每个步骤的算法的OS特定文库和二进制文件。算法二进制文件可以包括分析流水线的步骤，包括信号处理、碱基识别、比对和变异识别，诸如关于图50所描述的那些步骤。在另一个实例中，ADF Debian文件可以打包用于特定测定的某些代码模块，诸如用于信号处理、碱基识别和RNA计数的代码模块。
ADF可以包含用于试剂盒配置的脚本。这些脚本支持计算测序运行所需的消耗品。ADF中包含的配置脚本可以包含以下中的一项或多项：
条码集和芯片
文库试剂盒和消耗品，包含将样品控制配置(例如，样品在线控制)和其QC参数相关联的能力
模板试剂盒和消耗品，包含将内部对照和QC参数相关联的能力
测序试剂盒，包含将内部对照和QC参数相关联的能力
ADF可以包含一个或多个参考基因组文件。参考基因组的实例包含hg19和GRCH38。参考基因组文件可以与工作流信息一起打包在主ADF中。可替代地，参考基因组文件可以打包在作为主ADF的补充的单独的ADF中。
ADF可以包含用于融合面板和融合目标区域面板的工作流的代码模块。ADF可以包含用于分析的融合目标区域参考文件和热点文件。
ADF可以包含用户可以配置的工作流的各个点处的测定参数。可配置参数可以在用户接口中显示以供用户调整。可以在任何参与者级别处添加新参数。可配置参数可以传递到分析流水线。可配置测定参数的输入格式可以包含一个或多个单串文本、布尔值(Boolean)、多行文本、浮点、单选按钮、下拉菜单和文件上传。例如，文件上传可以使用诸如.properties和.json的文件格式。
ADF可以包含用于质量控制的QC参数和工作流中各个点处的测定性能阈值。例如，QC参数的类型包含运行QC参数、样品QC参数、内部对照QC参数和测定特定QC参数。QC参数可以由数据类型(例如，整数、浮点数)、下限、上限和默认值中的一种或多种来定义。
ADF可以包含针对给定测定选自数据库的结果呈现的指定数据选项卡列。所选择的数据选项卡列支持对结果的用户接口显示的配置以及要包含在用于测定的PDF报告中的列。ADF可以包含给定测定的结果呈现的镜像文件。ADF可以包含对PDF报告的多种语言的支持。ADF可以包含要由分析流水线针对给定测定生成的任何文件的下载文件列表。样品或运行的文件列表可以在用户接口处显示。ADF可以包含基因列表。基因列表可以用于在用户接口处和PDF报告中显示给定癌症类型的已知基因列表。
ADF可以包含用于给定测定的一组插件。ADF可以指定一组插件和其版本。如果ADF没有指定插件的版本，则安装在服务器系统上的最新版本的插件可以用于给定测定。
ADF可以包含新工作流模板以支持自定义测定创建。新工作流模板可以包含一组测定人字形步骤。可以显示步骤的参数。
ADF可以包含注释源和集的列表以支持新注释集的配置。ADF可以包含过滤器链以应用于由给定测定的分析流水线检测到的变异。ADF可以包含用于注释变异的规则集。
ADF可以被配置成支持多种不同类型的测定。实例包含但不限于肿瘤学相关测定(例如，来自赛默飞世尔科技公司的Oncomine测定)、免疫肿瘤学相关测定(例如，T细胞受体(TCR)、微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变装载(TML))、感染病相关测定(例如，微生物组)、生殖健康相关测定和外显子组相关测定。ADF也可以被配置用于定制测定。
图32是根据一个实施方案的生成测定定义文件的示意图。测定定义可以通过启动测定信息的文件复制和数据库填充以形成Debian文件的build.sh、debscripts和makedeb.sh来生成。测定定义内容可以包含测定参数、BED文件(浏览器可扩展数据文件-BED文件-定义染色体位置或区域)、面板文件、基因列表、热点文件(定义基因中通常含有变异的区域的BED或VCF文件)和含有容许试剂的种子数据(seed data)。测定定义内容可以含有测定名称、描述和支持以不同语言显示测定信息的报告消息的本地化版本。测定定义文件可以支持新分析流水线的打包。ADF可以包含可以基于测定类型执行变异识别、融合识别和CNV识别的任选的后处理脚本。ADF可以包含用于对特定分析流水线的二进制文件进行更新的任选的Docker容器镜像。Docker容器镜像可以与ADF一起打包，以确保平台更改，诸如操作系统或第三方文库不会影响测定结果或系统功能。
Debian文件可以被序列化以防止未经授权的修改。序列化的测定定义可以使用高级加密标准(AES)进行进一步加密，高级加密标准是一种对称密钥算法。含有化测定元信息的文本文件也可以使用AES和相同的加密密钥进行加密。加密测定定义文件可以与加密元信息文件一起被压缩成zip格式。其它加密格式也可以应用于序列化测定定义信息。例如，元信息可以包含以下中的一项或多项：
分析流水线版本；
参考基因组文件位置的参考基因组路径；
测定唯一名称——用于检查系统中唯一出现的测定的内部名称；
Docker镜像名称——用于启动分析和安装测定相关文件参考；
分析流水线启动所需的任何依存包名称。
图33是测定定义文件打包的示例的示意图。压缩格式的压缩化测定定义文件40可以包含序列化和加密测定定义Debian打包41、序列化和加密元信息文本文件42以及序列化和加密的任选的Docker镜像Debian打包43。服务器系统可以在安装测定定义Debian文件之前解密元信息文本文件42和测定定义序列化文件41。
服务器系统和模块化软件组件可以被配置成控制多种功能模式，包含RUO或AD模式和IVD或Dx模式。参考图1，Tomcat服务器可以被配置成包含用于RUO模式的Web档案(WAR)文件和用于IVD模式的WAR文件。服务器系统可以被配置成包含用于通过RUO测定检测的变异的RUO变异组数据库和用于通过IVD测定检测的变异的IVD变异组数据库。服务器系统可以被配置成包含用于RUO模式和IVD模式的单独的分析流水线和相关联的Kepler工作流引擎。RUO测定的RUO Docker镜像文件可以被配置为与IVD测定的IVD Docker镜像文件分开的文件。关系数据库可以被配置成具有分离数据库：用于RUO模式的测定开发(AD)数据库和用于IVD模式的Dx数据库。最初仅支持RUO模式的服务器系统可以被配置成通过软件更新支持RUO和IVD模式。
对于RUO模式测定和IVD模式测定，可以单独地生成ADF。RUO模式ADF可以包含研究中所使用的测定的测定定义。RUO模式ADF可以由第三方开发。IVD模式ADF包含符合区域诊断使用监管要求的测定定义。
测定
自动测序仪器可以适于与多种靶向测定一起使用。例示性靶向测定可以利用化学物质，诸如Ion Ampliseq、Ion Ampliseq HD以及其它化学物质。例如，自动测序仪器可以适于与测定诸如RNA-seq、Diff-Seq或S1-seq以及其它文库制备测定一起使用。其它示例测定包括Oncomine癌症测定，例如OCAv3、Oncomine焦点测定或Oncomine TCRβ-LR测定等。
该测定可以与来自拭子、血液、FFPE组织样品、cfDNA以及其它来源的核酸一起使用。核酸可以呈DNA或RNA的形式，任选地转化为CDNA。
测定可以有许多引物对，例如在10到24000的范围内。在一个示例中，引物对的数量可以在100到1000的范围，诸如100到500的范围或150到300的范围内。在另一实例中，引物对的数量在300到5000的范围，诸如400到4000的范围内。
该测定可以产生平均扩增子大小在50到500的范围，诸如50到200的范围或75到125的范围内的文库。在另一实例中，扩增子大小可以在200到500的范围内，诸如200到400或200到300。
测定可以在单个池中进行或可以利用多个池。例如，测定可以使用单个DNA池。在另一实例中，测定利用两个DNA池。在另外的实例中，测定利用两个RNA池。在特定实例中，测定利用两个DNA池和两个RNA池。
图34是根据一个实施方案用于通过两个测序步骤产生的信号数据的分析流水线的方框图，该两个测序步骤使用相同的流程顺序来进行。制备文库方框12和模板基板方框14参照图1进行描述。第一测序方框3402是参照图1描述的序列方框16的第一应用。在第一测序方框3402之后，应用第二测序制备方框3404。第二测序制备方框3404表示在将基板从测序区移动到模板化区之后应用变性方框18、重新引发方框20、重新加酶方框22并将基板从模板化区移动到测序区，如参照图1所描述。第二测序方框3406是关于图1描述的序列方框16的第二应用。第一测序方框3402和第二测序方框3406各自产生用于相应测序应用程序的原始数据文件，诸如.DAT文件。参照图31描述的信号处理步骤可以独立地应用于每个原始数据文件，以生成用于文件(诸如1.wells文件)的掺入信号测量数据。应用于每个原始数据文件的信号处理可以提供第一组信号和第二组信号，每个组包括每个孔和每个流程的信号测量。第一和第二组信号可以存储在各自的文件中，诸如各自的1.wells文件。
在方框3408处，可以将第一组的每个孔和每个流程的信号测量值与第二组的对应孔和流程的信号测量值求平均值，以生成每个孔和每个流程的平均信号测量值。在一些实施方案中，求平均值方框3408可以计算加权平均值。用于加权平均值的权重可以基于信噪比(SNR)将权重应用于信号测量值，使得具有较高SNR的信号具有较大权重。在一些实施方案中，求平均值方框3408仅应用于对于测序方框3402和3406都检测到有效文库珠粒的那些孔。例如，如果在第一测序方框3402之后而不是在第二测序方框3406之后在特定孔中检测到文库珠粒，则可以仅保留由第一测序方框3402产生的信号测量值用于碱基识别。
如参照图31所描述，可以将碱基识别应用于平均信号测量值以提供用于序列读段的碱基序列。比对步骤可以应用于序列读段，变异识别步骤可以应用于比对的序列读段，如参照图31所描述。
图35是根据一个实施方案用于通过两个测序步骤产生的信号数据的分析流水线的方框图，该两个测序步骤使用用于对具有分子标签的扩增子进行测序的不同的流程顺序来进行。核酸序列的分子标记可用于鉴定来源于相同多核苷酸分子的核酸序列读段，并基于它们的独特分子标签(UMT)序列将它们归类到家族中。用于产生带分子标签的核酸序列数据的方法可以包括2016年12月15日公布的美国专利申请公布号2016/0362748中描述的一个或多个特征，该专利申请公布以引用的方式整体并入本文。
制备文库方框12和模板基板方框14参照图1进行描述。第一测序方框3502是使用第一流程顺序参照图1描述的序列方框16的第一应用。在第一测序方框3502之后，应用第二测序制备方框3504。第二测序制备方框3504表示在将基板从测序区移动到模板化区之后应用变性方框18、重新引发方框20、重新加酶方框22并将基板从模板化区移动到测序区，如参照图1所描述。第二测序方框3506是使用不同于第一流程顺序的第二流程顺序参照图1描述的序列方框16的第二应用。
第一测序方框3502和第二测序方框3506各自产生用于相应测序应用程序的原始数据文件，诸如.DAT文件。参照图31描述的信号处理步骤可以独立地应用于每个原始数据文件，以生成用于文件(诸如1.wells文件)的掺入信号测量数据。应用于每个原始数据文件的信号处理可以提供第一组信号和第二组信号，每个组包括每个孔和每个流程的信号测量。第一和第二组信号可以存储在各自的文件中，诸如各自的1.wells文件。
如参照图31所描述，可以将碱基识别独立地应用于第一和第二组信号的信号测量值以提供用于序列读段的碱基序列。序列读段的碱基序列可以存储在第一和第二未经映射的BAM文件中。在方框3508处，可通过对具有相同UMT的读段进行分组来将第一组的序列读段与第二组的序列读段合并。UMT用于鉴定来源于相同多核苷酸分子的序列读段，并将它们归类到家族中。可确定每个序列读段家族的共有碱基序列。比对步骤可以应用于共有碱基序列，变异识别步骤可以应用于比对的共有碱基序列。用于产生共有碱基序列、带分子标签的核酸序列数据的比对和变异检测的方法可以包括2018年11月22日公布的美国专利申请公布号2018/0336316中描述的一个或多个特征，该专利申请公布以引用的方式整体并入本文。
实施例
实施例1
使用GenexusTM测序仪，基于标准文库进行重新测序。根据标准说明使用GX5TM芯片、GenexusTM联接器和GenexusTM模板化条3-GX5TM和4。根据标准方案进行第一次测序运行。在第一次测序运行之后，芯片自动返回到模板化站，通过升高芯片和芯片的流通池内的溶液的温度来进行熔化过程，并且重新引发模板序列。通过自动将芯片移动到测序站并根据标准测序方案来进行第二次测序运行。如上文所述对数据求平均值。
重新测序导致AQ20 RL增加2个碱基，原始读数准确度增加0.11％。
实施例2
使用由适用于Genexus测序仪的OncomineTM综合测定法v3 GX、OncomineTM精确测定法GX和CarrierSeqTM测定法制备的文库来重复实施例1的程序。
重新测序为来源于OncomineTM综合测定法v3 GX的文库提供至少9％的比对读段增加，为来源于OncomineTM精确测定法GX的文库提供至少6％的比对读段增加，为来源于CarrierSeqTM测定法的文库提供至少11％的比对读段增加。
在第一方面，用于对靶多核苷酸进行测序的方法包括检测与靶多核苷酸的至少一部分互补的第一系列核苷酸掺入。第一系列核苷酸掺入形成第一互补多核苷酸。该靶核苷酸被固定到设置在组装件的测序区中的基板。该方法还包括将靶核苷酸所固定到的基板移动到组装件的模板化区；当基板设置在组装件的模板化区处时，移除第一互补多核苷酸，靶多核苷酸保持固定到基板；在移除后，将靶多核苷酸所固定到的基板移动到测序区；以及检测与靶多核苷酸的至少一部分互补的第二系列核苷酸掺入，第二系列核苷酸掺入形成第二互补多核苷酸。
在第一方面的一个示例中，第二系列核苷酸掺入与第一系列核苷酸掺入至少97％相同。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，第二系列核苷酸掺入与第一系列核苷酸掺入至少99％相同。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，移除包括使用离子强度的变化进行变性以使第一互补多核苷酸和靶多核苷酸解离。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，移除包括通过升高温度熔化以使第一互补多核苷酸和靶多核苷酸解离。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，该方法还包括在移除后添加与靶多核苷酸至少部分互补的引物。例如，添加引物包括在将基板设置在模板化区中时添加引物。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，检测第一系列核苷酸掺入使用核苷酸的第一流程顺序来进行，第二系列核苷酸掺入使用核苷酸的第二流程顺序来进行。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，第一流程顺序不同于第二流程顺序。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，检测第一系列核苷酸掺入和检测第二系列核苷酸掺入产生第一组信号和第二组信号，该方法还包括使用第一组信号和第二组信号来确定一组有序的碱基识别。例如，使用第一和第二组信号包括对第一和第二组信号的对应信号求平均值。在另一个示例中，求平均值包括求加权平均值。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，基板包括传感器阵列，靶多核苷酸被固定在传感器阵列的传感器附近。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，该方法还包括当将基板设置在模板化区中时将适配器接合到基板。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，该方法还包括响应于将基板移动到测序区而使流体回路与基板接合。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，该方法还包括当将基板置于模板化区中时将靶多核苷酸固定到基板上；以及在检测第一系列核苷酸掺入之前，将基板移动到测序区。在另一个示例中，将靶多核苷酸固定到基板包括在聚合物颗粒上形成靶多核苷酸，将聚合物颗粒沉积到基板的孔中，以及将靶多核苷酸拷贝到聚合物颗粒上。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，检测包含基于pH的检测。例如，基于pH的检测包括使用在基板中形成的离子敏感场效应晶体管的检测。
在第一方面的另一个示例和上述示例中，检测包括基于荧光的检测。
需注意，并非以上在一般描述或示例中描述的所有活动都是必需的，特定活动的一部分可以不是必需的，并且除了所描述的那些之外还可以进行一种或多种另外的活动。更进一步地，列出活动的顺序不一定是执行这些活动的顺序。
在前述说明书中，已经参考具体实施方案描述了概念。然而，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可以进行各种修改和改变。因此，说明书和附图应当被认为是例示性的而不是限制性的，并且所有此类修改旨在被包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“包括(“comprises”、“comprising”、“includes”、“including”)”、“具有”(“has”、“having”)或其任何其它变型旨在涵盖非排他性的包括。例如，包括一系列特征的过程、方法、制品或装置不必仅限于那些特征，而是可包括未明确列出的或此类过程、方法、制品或装置所固有的其它特征。此外，除非另有明确的相反陈述，否则“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件A或B符合以下任一项：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)并且B为真(或存在)，并且A和B均为真(或存在)。
此外，使用“一”或“一个”来描述本文所述的元件和部件。这样做仅仅是为了方便并且给出本发明范围的一般含义。该描述应被理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非很明显另有含义。
上文已关于特定实施方案描述了益处、其它优点及问题的解决方案。然而，益处、优点、问题的解决方案以及可导致任何益处、优点或解决方案发生或变得更显著的任何特征不应被解释为任何或所有权利要求的关键的、必需的或必要的特征。
在阅读本说明书之后，本领域的技术人员将理解，为了清楚起见，本文在分开的实施方案的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以单独地或以任何子组合来提供。此外，对范围内所述值的引用包括该范围内的每个值。
Claims (20)
1.一种用于对靶多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：
检测与所述靶多核苷酸的至少一部分互补的第一系列核苷酸掺入，所述第一系列核苷酸掺入形成第一互补多核苷酸，所述靶核苷酸被固定到设置在组装件的测序区中的基板；
将所述靶核苷酸所固定到的所述基板移动到所述组装件的模板化区；
当所述基板设置在所述组装件的所述模板化区处时，移除所述第一互补多核苷酸，所述靶多核苷酸保持固定到所述基板；
在所述移除后，将所述靶多核苷酸所固定到的所述基板移动到所述测序区；以及
检测与所述靶多核苷酸的至少一部分互补的第二系列核苷酸掺入，所述第二系列核苷酸掺入形成第二互补多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二系列核苷酸掺入与所述第一系列核苷酸掺入至少97％相同。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二系列核苷酸掺入与所述第一系列核苷酸掺入至少99％相同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中移除包括使用离子强度的变化进行变性以使所述第一互补多核苷酸和所述靶多核苷酸解离。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中移除包括通过升高温度熔化以使所述第一互补多核苷酸和所述靶多核苷酸解离。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括在移除之后添加与所述靶多核苷酸至少部分互补的引物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中添加所述引物包括在将所述基板设置在所述模板化区中时添加所述引物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中检测所述第一系列核苷酸掺入使用核苷酸的第一流程顺序来进行，并且所述第二系列核苷酸掺入使用核苷酸的第二流程顺序来进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一流程顺序不同于所述第二流程顺序。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中检测所述第一系列核苷酸掺入和检测所述第二系列核苷酸掺入产生第一组信号和第二组信号，所述方法还包括使用所述第一组信号和所述第二组信号来确定一组有序的碱基识别。
11.根据权利要求10所述的方法，其中使用所述第一组信号和所述第二组信号包括对所述第一组信号和所述第二组信号的对应信号求平均值。
12.根据权利要求11所述的方法，其中求平均值包括求加权平均值。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述基板包括传感器阵列，所述靶多核苷酸被固定在所述传感器阵列的传感器附近。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，还包括当将所述基板设置在所述模板化区中时将适配器接合到所述基板。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，还包括响应于将所述基板移动到所述测序区而使流体回路与所述基板接合。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，还包括：
当所述基板处于所述模板化区中时，将所述靶多核苷酸固定到所述基板；以及
在检测所述第一系列核苷酸掺入之前，将所述基板移动到所述测序区。
17.根据权利要求16所述的方法，其中将所述靶多核苷酸固定到所述基板包括：
在聚合物颗粒上形成所述靶多核苷酸；
将聚合物颗粒沉积到所述基板的孔中；以及
将所述靶多核苷酸拷贝到所述聚合物颗粒上。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中检测包括基于pH的检测。
19.根据权利要求18所述的方法，其中基于pH的检测包括使用在所述基板中形成的离子敏感场效应晶体管的检测。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中检测包括基于荧光的检测。
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