CN108350491A - 将核酸加载到基材上 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于将核酸分配到阵列区域内的方法、组合物和系统。该方法、组合物和系统利用核酸缩合剂来增加核酸分配到阵列区域内的效率。本发明提供了用于促进核酸分配到阵列区域的各种方法。

Description

将核酸加载到基材上

相关申请的交叉引用

本专利申请是要求下述在先临时专利申请的优先权和权益的非临时实用专利申请：Lei Sun等人于2016年10月26日提交的名称为“LOADI NG NUCLEIC ACIDS ONTOSUBSTRATES”的USSN 62/413,313，Lei Sun等人于2016年9月19日提交的名称为“LOADINGNUCLEIC ACIDS ONTO SUBSTRATES”的USSN 62/396,637，以及Sassan Sheikholeslami等人于2015年11月18日提交的名称为“METHODS AND COMPOSITIO NS FOR LOADING OFPOLYMERASE COMPLEXES”的USSN 62/257,152，所述专利各自以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

背景技术

分子生物学和分子医学中的技术通常依赖于单一生物分子的分析。这些技术包括DNA和RNA测序、多态性检测、目的蛋白质检测、蛋白质-核酸复合物检测以及许多其他技术。单一分子分析涉及的高灵敏度、高流通量和低试剂成本使得这种类型的分析成为分子医学中从低成本基因组学到高灵敏度标记物分析的各种检测和分析问题的越来越有吸引力的方法。

通常用于单一分子分析方法的小观察体积通常通过将目的分子在光学限制反应/观察区域内固定或以其它方式局部化来提供，所述光学限制反应/观察区域例如极小孔的阵列如在零模式波导(ZMW)阵列中或其它纳米级孔。然而，当尝试将大反应物分子(例如大核酸模板-聚合酶复合物)加载到纳米级反应位点内之时，加载的熵垒可能是显著的。

因此期望用于增加加载效率的方法(例如增加有效加载的孔的数目、减少加载所需的样品的量、和/或减少加载所需的时间)。本文描述的发明满足了这些和其它需要，如在阅读下述后变得显而易见的。

发明内容

在一些方面，本发明提供了用于将核酸分子分配到多个阵列区域内的方法。在该方法中，提供包含多个阵列区域的表面，并且使所述表面暴露于包含核酸分子和核酸缩合剂的溶液。在一些实施例中，核酸缩合剂包含聚乙二醇聚合物。在一些实施例中，核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)和含有阳离子的盐。

缩合剂的提供可促进大核酸加载到阵列区域内。因此，在一些实施例中，核酸长度至少约10kb、长度至少约20kb、长度至少约30kb、或长度至少约40kb。在一些实施例中，核酸分子是蛋白质-核酸复合物，例如聚合酶-模板复合物或解旋酶-核酸复合物的部分。任选地，核酸分子固定在阵列区域中。在一些实施例中，阵列区域包括纳米级孔，例如零模式波导(ZMW)。在其它实施例中，阵列区域包含纳米孔。

本文对于其它实施例指出的基本上所有特征也适用于这些实施例，如相关的。

在一些方面，本发明提供了用于将核酸分子分配到多个阵列区域内的方法。在该方法中，提供包含多个阵列区域的表面，并且使所述表面暴露于包含核酸分子、聚乙二醇(PEG)和包含阳离子的盐的溶液。在一些实施例中，核酸分子是分配到阵列区域内的聚合酶-模板复合物中的模板。

各种PEG是本领域已知的并且适用于该方法中。在一类实施例中，溶液包含例如浓度为2.5-25mM或5-15mM的PEG 8000。阳离子可为例如一价阳离子或二价阳离子。在一类实施例中，溶液包含例如浓度为50至500mM或100至300mM的一价阳离子，例如Na⁺或K⁺。在一类实施例中，溶液包含例如浓度为0.05至10mM的二价阳离子，例如Sr²⁺。也可采用阳离子的组合，例如K⁺和Sr²⁺。在一类示例性实施例中，溶液包含PEG 8000和K⁺，例如5-15mM PEG 8000和100-300mM K⁺。在一类示例性实施例中，溶液包含PEG 8000、K⁺和Sr²⁺，例如5-15mM P EG8000、100-300mM K⁺和0.05-0.3mM Sr²⁺。

在一些实施例中，阵列区域包含纳米级孔，例如，零模式波导(ZMW)。在其它实施例中，阵列区域包含纳米孔。

PEG和阳离子的提供可促进大核酸加载到阵列区域内。因此，在一些实施例中，核酸(例如聚合酶-模板复合物的模板)为长度至少约10kb、长度至少约20kb、长度至少约30kb、或长度至少约40kb。PEG和阳离子的提供也可促进比不存在这些试剂的情况下可实现的更快的加载。因此，在一些实施例中，分配在约0.5-5、1-4.5、1.5-4、1-3或2-3.5小时内完成。

在其中聚合酶-模板复合物分配到阵列区域内的实施例中，聚合酶-模板复合物的模板任选与引物杂交。聚合酶-模板复合物可例如通过结合位于每个孔的底部处的部分，而固定在阵列区域中，例如在纳米级孔的底部处。

核酸可通过溶液扩散，或者它们的移动可例如通过核酸与之附着的珠得到辅助。因此，在一类实施例中，聚合酶-模板复合物与磁珠结合，阵列区域包含具有基部的纳米级孔，所述基部具有与之结合的偶联剂，并且该方法包括施加动态磁场，以使溶液中的磁珠向下移动到表面的顶部。动态磁场还促使珠跨越表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与在纳米级孔的基部上的偶联剂结合。在另一类实施例中，阵列区域包含在其基部处包含偶联剂的纳米级孔，并且聚合酶-模板复合物通过溶液扩散到纳米级孔的基部并且与偶联剂结合，由此将聚合酶-模板复合物固定在纳米级孔中。

在一类实施例中，聚合酶-模板复合物中的模板具有不同的长度，其长度中的至少一个大于10kb。在将复合物固定在纳米级孔中之后，通过其长度大于10kb的固定的模板占据的纳米级孔的百分比等于或大于初始溶液中其长度大于10kb的模板的百分比。在相关的一类实施例中，聚合酶-模板复合物中的模板具有不同的长度，其长度中的至少一个大于20kb。在将复合物固定在纳米级孔中之后，通过其长度大于20kb的固定的模板占据的纳米级孔的百分比等于或大于初始溶液中其长度大于20kb的模板的百分比。在一类实施例中，聚合酶-模板复合物中的模板包含第一模板，其长度为第二模板长度的至少20倍。在复合物固定后，固定的第一模板/固定的第二模板的比率等于或大于初始溶液中第一模板/第二模板的比率。

在一些实施例中，在核酸(例如聚合酶-模板复合物)的分配和任选固定之后，至少38％的阵列区域，例如至少50％或至少75％的区域被单一固定的核酸(例如单一固定的聚合酶模板复合物)占据。在一类示例性实施例中，将聚合酶-模板复合物分配且固定至纳米级孔，并且在固定步骤后，至少38％或至少50％的纳米级孔被单一固定的聚合酶-模板复合物占据。

核酸可为例如完全或部分双链或单链的。合适的核酸包括但不限于SMRTbells^TM(具有双链中心区域和单链发夹末端的环状核酸)、双链环状DNA分子(例如带缺口或空隙的双链环状DNA分子，例如带缺口或空隙的质粒)和线性分子(例如基因组DNA片段)。在一类示例性实施例中，将聚合酶-模板复合物分配到阵列区域，并且聚合酶-模板复合物的模板各自包含双链中心区域和两个相同的单链发夹末端区域。任选地，双链中心区域为长度至少约5kb，例如至少约10kb、至少约20kb、至少约30kb、或至少约40kb。在一类相关的示例性实施例中，聚合酶-模板复合物的模板各自包含双链中心区域和两个不同的单链发夹末端区域。在另一类示例性实施例中，将聚合酶-模板复合物分配到阵列区域，并且聚合酶-模板复合物的模板包含带缺口或空隙的双链环状DNA分子。任选地，双链环状DNA分子为长度至少约5kb，例如至少约10kb、至少约20kb、至少约30kb、或至少约40kb。在另一类示例性实施例中，将聚合酶-模板复合物分配到阵列区域，并且聚合酶-模板复合物的模板包含线性分子，例如双链分子，例如基因组DNA片段或扩增子。任选地，线性模板为长度至少约5kb，例如至少约10kb、至少约20kb、至少约30kb、或至少约40kb。

将核酸加载到阵列区域内可促进后续核酸分析，例如核酸测序，特别是单一分子核酸测序。因此，该方法任选包括例如通过确定其核酸序列来分析阵列区域中的核酸。在此类分析之前，例如通过洗涤将PEG任选地从核酸中去除。

本文对于其它实施例指出的基本上所有特征也适用于这些实施例，如相关的。

在一些方面，本发明提供了用于将聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法。在该方法中，提供了珠溶液，各个珠上具有与之结合的多种聚合酶-核酸复合物。在至少一种核酸缩合剂的存在下，使溶液暴露于基材。优选地，基材包括零模式波导的阵列。基材包含对于将聚合酶-核酸复合物与例如在零模式波导内的基材偶联选择性的偶联基团。应用场以将珠下拉到基材，由此聚合酶-核酸复合物通过偶联基团变得与基材结合。

本文描述了合适的核酸缩合剂。在一类实施例中，至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)，例如PEG 8000。在一类实施例中，至少一种核酸缩合剂包含阳离子，例如一价阳离子和/或二价阳离子。在一类优选的实施例中，至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)和阳离子(例如一价阳离子)，例如PEG 8000和K⁺，PEG 8000和Sr²⁺，或PEG 8000、K⁺和Sr²⁺。

在一些实施例中，将珠下拉到基材的场是磁场、电场或重力场。该方法可包括施加使珠跨越基材的表面移动的场。在一些实施例中，将珠下拉到基材的场和使珠跨越基材移动的场包括不同类型的场。在其它实施例中，将珠下拉到基材的场和使珠移动的场包括相同类型的场，例如磁场。在一些实施例中，使用相对于基材移动的一个或多个永磁体来施加磁场。在一些实施例中，使用一个或多个电磁体来施加磁场。

在一些实施例中，该方法包括从基材去除珠，将结合的聚合酶-核酸复合物留在基材上。在一些实施例中，基材包括零模式波导的阵列。在一些实施例中，珠具有的直径大于零模式波导的最小横截面尺寸。例如，珠的直径可为零模式波导的最小横截面尺寸的两倍或更多倍。任选地，珠的直径比零模式波导的最小横截面尺寸大2倍至10,000倍。在一类实施例中，零模式波导是圆柱形的，并且最小横截面尺寸是零模式波导的直径。在一些实施例中，在施加场之后，零模式波导的一部分具有与之附着的单一聚合酶-核酸复合物。

核酸缩合剂的提供还可促进核酸与珠附着。因此，在一类实施例中，珠溶液的提供包括在PEG和阳离子存在下，使珠暴露于聚合酶-核酸复合物。

基本上所有上述特征也适用于这些实施例，如相关的，例如关于溶液组成、核酸大小、核酸类型、纳米级孔被复合物的占据等等。

在一些方面，本发明提供了用于将活性聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法。在该方法中，提供了具有与之结合的聚合酶-核酸复合物的磁珠溶液。每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和模板核酸。在至少一种核酸缩合剂的存在下，使磁珠溶液与包含具有基部的纳米级孔阵列的基材的顶部接触，其中孔的基部具有与之结合的偶联剂。施加动态磁场以使溶液中的磁珠向下移动到基材的顶部，由此动态磁场也促使珠跨越基材的顶表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与在纳米级孔的基部上的偶联基团结合。

本文描述了合适的核酸缩合剂。在一类实施例中，至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)，例如PEG 8000。在一类实施例中，至少一种核酸缩合剂包含阳离子，例如一价阳离子和/或二价阳离子。在一类优选的实施例中，至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)和阳离子例如一价阳离子，例如PEG 8000和K⁺，PEG 8000和Sr²⁺，或PEG 8000、K⁺和Sr²⁺。

在一些实施例中，珠具有的直径大于纳米级孔的最小横截面尺寸。例如，珠的直径可为纳米级孔的最小横截面尺寸的两倍或更多倍。任选地，珠的直径比纳米级孔的最小横截面尺寸大2倍至10,000倍。在一类实施例中，纳米级孔是圆柱形的，并且最小横截面尺寸是纳米级孔的直径。在一些实施例中，在施加场之后，纳米级孔的一部分具有与之附着的单一聚合酶-核酸复合物。

在一些实施例中，聚合酶-核酸复合物经由与磁珠附着的寡核苷酸和模板核酸上的序列之间的杂交与磁珠结合。在一类实施例中，每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶、模板核酸和引物。在一些实施例中，引物包含与附着至磁珠的寡核苷酸互补的5'检索序列、以及与模板核酸互补的3'引发序列。检索序列和引发序列可通过柔性的亲水性接头例如PEG接头连接。在一些实施例中，检索序列包含聚(dA)或聚(A)，并且附着至磁珠的寡核苷酸包含聚(dT)或聚(T)。

在一些实施例中，使用一个或多个移动永磁体产生动态磁场。在一些实施例中，使用一个或多个电磁体产生动态场。在一些实施例中，在孔基部处的偶联剂包含生物素。在一些实施例中，聚合酶附着至链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白用于与偶联剂结合。

基本上所有上述特征也适用于这些实施例，如相关的，例如关于溶液组成、核酸大小、核酸类型、纳米级孔被复合物的占据等等。

在一些方面，本发明提供了用于将活性聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法。在该方法中，提供了具有与之结合的聚合酶-核酸复合物的磁珠溶液。每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和模板核酸。通过捕获寡核苷酸与模板核酸上的序列的杂交，使聚合酶-核酸复合物与珠结合，其中所述捕获寡核苷酸包含与附着至磁珠的寡核苷酸互补的检索序列、与模板核酸互补的捕获序列、以及将检索序列和捕获序列连接的柔性亲水性接头例如PEG接头。

使磁珠溶液与包含具有基部的纳米级孔阵列的基材的顶部接触，其中孔的基部具有与之结合的偶联剂。通常，珠具有的直径大于纳米级孔的最小横截面尺寸。施加动态磁场以使溶液中的磁珠向下移动到基材的顶部。动态磁场还促使珠跨越基材的顶表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与在纳米级孔的基部上的偶联剂结合。

在一些实施例中，每种聚合酶-核酸复合物还包含与模板核酸杂交的引物。在其它实施例中，捕获序列位于捕获寡核苷酸的3'末端处且充当引发序列。

基本上所有上述特征也适用于这些实施例，如相关的，例如关于溶液组成、核酸大小、核酸类型、磁体、纳米级孔被复合物的占据等等。

附图说明

图1示意性地示出了包括通过柔性接头分开的，可与寡核苷酸修饰的磁珠杂交的珠捕获尾部的引物，以及可与DNA模板杂交的测序引物。

图2A示出了包含六单元PEG间隔物的示例性柔性接头。图2B示意性地示出了使用如图1中的引物将对称SMRTbell^TM模板捕获到磁珠。在该图中未显示结合SMRTbell^TM-引物复合物的聚合酶分子。

图3显示了用于加载复合物的空ZMW相对于生产性单一加载ZMW的数目的数据，所述复合物包括11kb对称SMRTbell^TM模板和包括柔性PEG接头(P18)的引物或缺乏接头的对照引物(C2V2)。

图4显示了比较在两种不同的洗涤条件下，在固定混合物中包括或缺乏PEG的测序运行结果的图。

图5A显示了示出在对照条件下芯片的加载的不均匀性的热图。图5B显示了示出在固定混合物中具有PEG的芯片的改善的加载均匀性的热图。显示了80个总单元(bin)中的测序ZMW数目。较深的颜色一般指示更高数目的测序ZMW，而白色指示低加载。

图6示意性地示出了用于将目的分子例如聚合酶-核酸复合物设置到基材例如零模式波导阵列上的方法。

图7呈现了来自在PEG的存在下，以低皮摩尔浓度将大DNA模板扩散加载到ZMW内的数据。

图8呈现了来自在PEG的存在下，不同长度模板的混合群体扩散加载到ZMW内的数据。

示意图不一定按比例绘制。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。下述定义补充了本领域的那些定义，并且涉及当前专利申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或专利申请。尽管本文描述了优选的材料和方法，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料都可用于实践中用于测试本发明。相应地，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不预期是限制性的。

在下述说明书中，阐述了众多具体细节以提供本发明的更透彻的理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，本发明可无需这些具体细节中的一个或多个进行实践。在其它情况下，为了避免模糊本发明，没有描述本领域技术人员熟知的众所周知特征和程序。

注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个、”“一种”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一种细胞”包括细胞的混合物等等。

如本文使用的，术语“约”指示给定数量的值变化值的+/-10％，或任选值的+/-5％，或在一些实施例中，如此描述的值的+/-1％。

在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该所述范围中的任何其它所述值或中间值都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，遭受所述范围中的任何特别排除的限制。当所述范围包括一个或两个限制时，排除那些包括的限制中的任一或两个的范围也包括在本发明中。除非上下文另有明确说明，否则所述范围一般包括一个或两个限制。

术语“核酸”涵盖可单体单元的任何物理串，其对应于核苷酸串，包括核苷酸的聚合物(例如通常的DNA或RNA聚合物)、PNA(肽核酸)、经修饰的寡核苷酸(例如包含对生物RNA或DNA非通常的核苷酸的寡核苷酸，如2'-O-甲基化的寡核苷酸)等等。核酸可为例如单链或双链的。本发明的核酸一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括可具有替代主链的核酸类似物，所述替代主链包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它主链和键。核酸可具有其它修饰，例如包括杂原子、标记例如染料的附着或用官能团取代，当核酸待用作模板时，所述修饰仍然允许碱基配对和通过聚合酶的核酸识别。

“寡核苷酸”是包含两个或更多个核苷酸的聚合物。该聚合物可另外包含非核苷酸元素，如标记、猝灭剂、封闭基团等等。寡核苷酸的核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可为天然的或非天然的，并且可为未取代的、未修饰的、取代的或修饰的。核苷酸可通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键、硼烷磷酸酯键等等连接。

“千碱基”或“kb”是用于指定核酸序列长度的单位。1kb等于1000个碱基或核苷酸的序列。显而易见1kb因此也可表示双链核酸的1000个碱基对的序列。

本文定义或以其它方式表征了各种另外的术语。

具体实施方式

在其它方面中，本发明提供了用于将核酸分子(以及与那些核酸分子结合的任何分子或化合物)分配到多个阵列区域内的方法、装置、组合物和系统。将核酸加载到基材上可促进后续核酸分析，例如核酸测序，且特别是单一分子核酸测序。通过本文所述的方法可增强核酸(包括聚合酶-模板复合物)加载到阵列区域例如零模式波导(ZMW)、其它纳米级孔或纳米孔内。在一个方面，核酸缩合剂促进加载。

将DNA缩合剂引入固定反应介质可特别促进将大核酸模板加载到深而窄的纳米级孔内。不受任何特定机制的限制，DNA是具有大回转半径的分子，并且其在纳米结构例如ZMW内的固定受到DNA向纳米结构内的缓慢扩散速率阻碍。再次，不受任何特定机制的限制，缩合剂的提供可促进DNA自身压紧并且减少其在固定期间的回转半径，并且因而增加扩散和整体固定速度和效率。为了达到所需的加载程度所需的样品量也可减少。缩合剂可类似地减小回转半径并且改善其它大核酸分子例如RNA的加载。

一般而言，核酸缩合剂是当以适当浓度加入含有核酸的溶液中时，压实核酸的物质。通常，核酸缩合剂将核酸的形状从无规卷曲变为致密的圆环、球体或小球。通常，这样的压实将核酸的轮廓尺寸减少至少90％，更通常减少了至少95％、或至少99％(例如与压实圆环或球体的直径相比延长链的长度)。压实形式的直径可例如小于200nm，更通常小于150nm、小于125nm、或小于100nm。例如，具有1-100μm延伸长度的DNA可在缩合剂存在下被压实至约100nm的球体或圆环。在缩合剂的去除(或充分稀释)时，缩合是可逆的。

合适的核酸缩合剂包括例如一价阳离子(例如Na⁺、K⁺、Li⁺、Rb⁺和Cs⁺)、二价阳离子(例如Sr²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Eu²⁺、Ba²⁺和Fe²⁺)、和三价阳离子(例如Co³⁺)、多聚带正电的有机分子和聚合物(例如聚胺例如聚赖氨酸、亚精胺或精胺和其它聚阳离子)、阳离子过渡金属络合物(例如六胺钴)、阳离子表面活性剂、阳离子脂质或脂质体、醇、野生型和经改造的DNA结合蛋白(例如组蛋白和细菌组蛋白样蛋白)、纳米颗粒、拥挤剂(例如分支多糖如葡聚糖)和聚合物(特别是中性或阳离子亲水性聚合物，特别是PEG聚合物)及其组合。例如，亲水性聚合物和包含阳离子的盐的组合可用作缩合剂。

在一些实施例中，聚乙二醇(PEG，也称为聚环氧乙烷)充当缩合剂。示例性的PEG包括平均分子量为约200至约80,000，例如约200至约40,000、约200至约20,000、约600至约10,000，或约4000至约10,000的PEG。例如，PEG可具有约400、约600、约1000、约2000、约4000、约6000、约8000、约10,000、约20,000或约40,000的平均分子量。PEG可为多分散的，具有如所示的平均分子量，或者PEG可为单分散的，其中所有分子都具有相同尺寸。PEG通常是线性聚合物，但可为支化、星形或梳状PEG(或线形、支化、星形和/或梳状类型的混合物)。任选地，PEG的末端官能团是可变的。

PEG可在固定混合物中以约2-30％重量/体积(w/v)，例如约2-20％、约2-15％或约4-12％的最终浓度提供。所采用PEG的浓度通常与其分子量成反比。作为几个例子，当PEG8000(平均分子量为8000的线性PEG)以约8-14％或约8-13％w/v的最终浓度采用时，PEG20,000可以约6-10％w/v的最终浓度采用，或PEG 40,000可以约4-7％w/v的最终浓度采用。在一类实施例中，PEG 8000以约2.5-25mM(约2-20％w/v)，例如约5-15mM(约4-12％w/v)、约10-15mM(约8-12％w/v)、或大于约10.5mM的最终浓度采用。在一个示例性实施例中，PEG8000以约4-12％w/v(即约5-15mM)的最终浓度与浓度为约100mM至约300mM(例如浓度约250mM)的一价阳离子(例如K⁺、Na⁺、Li⁺、Rb⁺或Cs⁺)组合采用。在另一个示例性实施例中，PEG8000以约5-15mM的最终浓度与浓度为约0.05mM至约10mM，例如约1mM至约10mM或约0.05mM至约0.3mM(例如浓度约0.15mM)的二价阳离子(例如Sr²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Eu²⁺、Ba^{2 +}或Fe²⁺)组合采用。在另一个示例性实施例中，PEG 8000以约5-15mM的最终浓度与浓度为约100至约300mM(例如浓度约250mM)的一价阳离子(例如K⁺或Na⁺)和浓度为0.05mM至约0.3mM(例如浓度约0.15mM)的二价阳离子(例如Sr²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Eu²⁺、Sn²⁺、Ba²⁺或Fe²⁺)组合采用。

类似于PEG的各种组合物中的任一种也可用作缩合剂。合适的缩合剂因此包括PEG的衍生物、取代的PEG(例如具有悬垂侧链的PEG)和PEG的修饰形式。合适的缩合剂还包括共聚物，所述共聚物包括环氧乙烷/乙二醇亚基和/或其取代或修饰形式，例如嵌段共聚物和无规共聚物。在一些实施例中，包含这种共聚物的至少一些亚基是环氧乙烷/乙二醇亚基。在一些实施例中，包含这种共聚物的至少约50％，例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％亚基是环氧乙烷/乙二醇亚基。示例性的有用聚合物包括例如聚乙二醇-聚丙二醇共聚物和其中一些亚基带有侧链例如悬垂氨基的共聚物。参见例如Yoshikawa等人(1997)J.Am.Chem.Soc.119:6473-6477所述的PEG-A。优选的共聚物为中性或阳离子的。PEG和含PEG化合物在本文中统称为“PEG聚合物”(或“聚乙二醇聚合物”)。含PEG的化合物包括被官能团取代的PEG、具有悬垂侧链的PEG和PEG共聚物。上文对于PEG所述的尺寸和/或浓度范围也适用于其它PEG聚合物，如各种构型(线性、星形、梳状、支化等等)一样。

如本领域已知的，可提供阳离子包括一价阳离子和二价阳离子作为基本上任何方便的盐，例如乙酸钾、氯化钾、氯化钠、乙酸锶、氯化钴、氯化钙、硫酸锌等等。阳离子可在固定混合物中以约0.05mM至约1000mM，例如约0.05mM至约500mM、约50mM至约500mM、约50至约400mM、或约100至约300mM的最终浓度提供。例如，一价阳离子可在固定混合物中以约50mM至约500mM，例如约50mM至约400mM、或约100mM至约300mM的最终浓度提供。作为另一个例子，当不提供一价阳离子时，二价阳离子可在固定混合物中以约0.05至约10mM，例如约1至约10mM的最终浓度提供，或者当还提供一价阳离子时，以约0.05mM至约0.3mM的最终浓度提供。

在一类实施例中，将核酸和缩合剂施用于基材并且缩合的核酸扩散至所需位置。在一类实施例中，缩合剂作用于增加掺料溶液的密度。在这些实施例中，将较高密度的掺料溶液施加到液体覆盖的基材上并且下沉，将核酸与其携带到阵列区域。在一类实施例中，核酸附着至珠。任选地，在施加的场中珠的运动定位凝聚的核酸，用于定位到基材上。

缩合剂的包括对于加载较大的模板可为特别有益的。因此，待加载的核酸任选为长度至少5kb，例如长度至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少70kb、至少100kb、至少200kb、至少500kb、或甚至至少1000kb。核酸可为完全或部分双链的或者可为单链的。合适的核酸包括但不限于SMRTbells^TM(具有双链中心区域和单链发夹末端的环状核酸)、双链环状DNA分子(例如带缺口或空隙的双链环状DNA分子，例如带缺口或空隙的质粒)和线性分子(例如基因组DNA片段)。

缩合剂的包括可促进少量核酸的加载。因此，任选地，可将1皮摩尔或更少的核酸施加到基材，同时仍然达到所需加载程度。例如，可将100飞摩尔或更少、10飞摩尔或更少、1飞摩尔或更少、或者甚至0.1飞摩尔或更少的核酸施加到基材。类似地，任选地，可将10微克或更少的核酸施加到基材，同时仍然达到所需加载程度。例如，可将1微克或更少、100纳克或更少、50纳克或更少、10纳克或更少、5纳克或更少、或者甚至1纳克或更少的核酸施加到基材。在将核酸分配到基材上并且任选将核酸分子固定在阵列区域中或阵列区域处之后，任选地至少20％的阵列区域，例如至少30％、至少38％、至少50％或至少67％的阵列区域被核酸分子占据。在一些实施例中，在将核酸分配到基材上，并且任选将核酸分子固定在阵列区域中或阵列区域处之后，初始存在于样品中的至少约1％，例如至少约2％、至少约5％、或至少约10％的核酸占据阵列区域。

在将核酸分配到基材上，并且任选将核酸分子固定在阵列区域中或阵列区域处之后，可去除缩合剂(例如通过洗涤阵列)，允许核酸解缩合。作为另一个例子，可降低缩合剂的浓度(例如通过稀释溶液)，以允许核酸解缩合。在其中随后对核酸执行分析(例如单一分子测序)的实施例中，对于优选的缩合剂，可完全去除试剂，或者试剂(或在其中去除试剂的实施例中，任何残留试剂)不干扰分析。对于其中加载蛋白质-核酸复合物的实施例，优选的缩合剂不会有害地影响蛋白质的相关活性(例如核酸结合、酶促活性等等)。

为了便于讨论，本文所述的加载方法通常指纳米级孔阵列(例如规则或不规则阵列)。这种纳米级孔在某些例子中可为零模式波导(ZMW)，并且在进一步的例子中，那些ZMW可具有生物素化的基部和钝化侧面，其可用于本文所述的加载方法以及随后的下游应用如测序反应中。如应了解的，本文涉及纳米级孔和/或ZMW的任何讨论都适用于任何形式的反应位点，并且涵盖目的分子可加载到其内的区域的所有类型的表面、形状和构型。类似地，为了便于讨论，本文所述的加载方法通常指可用于缩合核酸的PEG和阳离子。如应了解的，本文涉及PEG和/或阳离子的任何讨论都适用于任何形式的核酸缩合剂，并且涵盖缩合核酸的所有类型的组合物，由此促进其加载到反应位点内。为了便于讨论，本文所述的加载方法通常指聚合酶-模板复合物(也称为聚合酶-核酸复合物)。如应了解的，本文涉及聚合酶-模板复合物加载的任何讨论都适用于任何形式的核酸，包括分离的核酸或核酸与其它组分的复合物的加载。

由本发明的方法产生或用于本发明的方法的组合物也是本发明的特征，如相关的试剂盒和系统一样。

珠辅助加载

美国专利号8,715,930中详述了用于将核酸加载到基材上的有用技术，所述美国专利在此以引用的方式全文并入用于所有目的。一般地，将核酸(包括例如聚合酶-核酸模板复合物)附着至珠，例如磁珠。提供场以使珠与基材接近或接触，并且任选地使珠相对于基材移动。核酸或核酸复合物例如通过基材上的偶联基团变得与基材结合。在一些实施例中，基材包括纳米级孔阵列例如零模式波导(ZMW)。在进一步的实施例中，核酸或复合物变得与孔的基部结合。

可通过本文所述的方法增强核酸，包括聚合酶-模板复合物的加载。在一个方面，将柔性接头掺入寡核苷酸内，所述寡核苷酸将模板核酸捕获至珠。在另一个方面，至少一种核酸缩合剂包括在其中珠结合的核酸与基材接触的溶液中。显而易见本文描述的各种技术可分开或者与彼此和/或美国专利号8,715,930中描述的技术组合采用。

包括柔性接头的寡核苷酸

在一个一般类别的实施例中，目的核酸(例如模板)通过与寡核苷酸杂交而捕获至珠。在示例性实施例中，寡核苷酸附着至珠并且与核酸互补。在一些实施例中，寡核苷酸直接附着至珠，而在其它实施例中，寡核苷酸间接附着至珠。例如，在一类实施例中，寡核苷酸与目的核酸和依次又附着至珠的另一个寡核苷酸互补。对于其中核酸在固定至基材上之后进行测序的应用，寡核苷酸任选充当测序引物。

一个例子提供了新型引物设计。如图1中示意性所示，引物具有三部分：A：与寡核苷酸修饰的磁珠杂交的珠捕获尾部；B：与DNA模板杂交的测序引物；和C：将A和B分开且连接的柔性接头(例如聚乙二醇(PEG)接头)，潜在地降低了两个杂交事件的空间干扰。示例性的PEG接头显示于图2A中。

如图2B中示意性所示，在DNA固定期间，含接头的引物的3'侧通常首先与模板(例如SMRTbell^TM，其具有双链中心区域和两个单链发夹末端区域)杂交，然后通过与引物的5'侧杂交(例如聚-A尾部)将引物-模板复合物捕获至磁珠(例如聚-T包被的珠)。不受任何特定机制的限制，认为如果在两个杂交序列之间不存在间隔物，则两个杂交事件均在被聚-T寡核苷酸密集覆盖的珠表面处。由于在珠表面处的空间位阻，聚A-与-聚T杂交特别视为不完全的，给出少于预期数目的A:T碱基对和较差的稳定性。这被认为潜在导致SMRTbell^TM的无效捕获以及在初始捕获后SMRTbell^TM从珠中的丧失，这依次又可损害DNA固定到纳米结构如ZMW。柔性接头的包括因此可降低模板和珠之间的空间位阻，并且例如通过提供模板和珠之间的另外距离且提供增加的柔性来增加固定效率。

在一类实施例中，柔性接头包含PEG接头。PEG间隔物是柔性亲水性的，并且不显示出与聚合酶的非特异性结合相互作用。PEG间隔物任选包括2-30个PEG单元，例如4-20个单元、6个单元(18个原子)或12个单元(36个原子)。也可采用其它柔性亲水性部分。不增加例如与聚合酶的非特异性结合相互作用的接头是优选的。非核苷酸间隔物因此是优选的，因为仅在寡核苷酸的捕获区域和引发区域之间包含另外的碱基可增加非特异性聚合酶结合和/或无法有效地缓解空间位阻。

在图2B所示的例子中，SMRTbell^TM模板是对称的(它包括双链中心区域和两个相同的单链发夹末端区域)。引物的一个拷贝因此可与每个单链末端区域结合。在其它实施例中，采用不对称SMRTbell^TM模板(包括双链中心区域和具有不同序列的两个单链发夹末端区域)。在这样的实施例中，包括柔性亲水性接头的捕获寡核苷酸可与一个末端区域杂交用于将模板捕获到珠，而分开的测序引物与另一个末端区域杂交。

显而易见用于将核酸捕获至珠的寡核苷酸可与珠直接结合或可与珠间接结合(例如通过与依次又结合珠的另一个寡核苷酸杂交，例如通过聚A-聚T杂交)。

核酸缩合剂

如上所述，将核酸缩合剂引入固定反应介质可促进特别将大核酸模板(例如大于10kb、大于15kb、大于20kb、大于30kb、大于40kb、大于50kb、大于70kb、大于100kb、大于200kb、大于500kb、或甚至大于1000kb)加载到深而窄的纳米级孔内。不受任何特定机制的限制，即使用珠用于促进加载时，DNA模板的大回转半径可阻碍其在纳米结构例如ZMW内的固定。再次，不受任何特定机制的限制，缩合剂的提供可促进DNA自身压紧并且减少其在固定期间的回转半径，并且因而增加固定速度和效率。

合适的缩合剂已在上文得到描述，并且包括一价阳离子(例如Na⁺和K⁺)、二价阳离子(例如Sr²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Eu²⁺、Ba²⁺和Fe²⁺)、三价阳离子(例如Co³⁺)、多聚带正电的有机分子(例如亚精胺、组蛋白和其它聚阳离子)、纳米颗粒和聚乙二醇(PEG)和PEG聚合物及其组合。在优选实施例中，采用PEG和至少一种阳离子的组合。示例性的PEG和阳离子已在上文得到详述，如合适的浓度范围一样。

除增加有效加载的ZMW孔的数目之外，PEG的包括也改善了DNA固定的均匀性。不受任何特定机制的限制，PEG在固定和后续洗涤步骤期间有效地防止表面干燥，并且这减少了在这种干燥事件期间的DNA损失和聚合酶失活。这也改善了总体固定性能。

显而易见各种工作流可用于实现固定混合物中核酸缩合剂的所需最终浓度。例如，为了将聚合酶-模板复合物加载到ZMW内，可形成聚合酶-模板复合物并将其附着到缺乏PEG的水溶液中的珠，然后施加到覆盖有一层等体积的另一种水溶液的ZMW芯片，所述另一种水溶液含有以两倍所需最终浓度的PEG，使得在芯片上的混合后实现PEG(和阳离子)的所需最终浓度。作为另一个例子，聚合酶-模板复合物可与珠结合，并且PEG/阳离子可在它们与ZMW芯片接触之前加入复合物中。在又一个例子中，当模板(或其它核酸)与珠结合时，存在核酸缩合剂。在核酸与珠结合期间，PEG和阳离子或另一种缩合剂的存在可改善珠的加载。为了通过模板(或如上所述的捕获引物)上的聚-dA与聚-T包被的珠的杂交来捕获SMRTbell^TM模板，结合效率一般随着DNA模板的大小增加而降低。大模板(例如大于10kb、大于15kb、大于20kb、大于30kb、大于40kb、大于50kb、大于70kb、大于100kb、大于200kb、大于500kb、或甚至大于1000kb)的捕获因此可通过在将模板固定到珠上期间，任选地加上在将珠结合的模板加载到ZMW内期间，包括PEG和至少一种阳离子(例如如上文对于加载详述的)得到增强。在PEG和阳离子的存在下，核酸也可通过非特异性结合(例如静电相互作用)而不是通过杂交捕获到珠。

分离的聚合酶-核酸复合物物理转移至基材

如美国专利号8,715,930中详述的，珠可用于将分离的聚合酶-核酸复合物直接设置到基材上。一般而言，该技术包括获得具有聚合酶-核酸复合物附着至其的珠溶液。使珠溶液与需要在其上设置复合物的基材(优选如上文详述的，在核酸缩合剂的存在下)接触或紧密接触。所使用的基材被制备为具有与聚合酶-核酸复合物结合的基团。在珠溶液与表面接触后，去除珠，留下与基材结合的聚合物-核酸复合物。在从基材去除珠之前，一般还期望诱导在珠和基材之间的运动，例如，使珠跨越基材表面移动以便增加设置的复合物的数目。在从基材去除珠之前，可能期望例如通过加入过量浓度的分子诱导珠与复合物的解离，所述分子减弱珠与复合物之间的亲和相互作用量级。例如，在具有聚-dA序列捕获到聚-T包被的珠上的模板的情况下，可加入高浓度的单链聚-A寡核苷酸，以将模板-聚合酶复合物从珠中竞争出。

图6显示了用于将聚合酶-核酸复合物直接从珠加载到基材上的本发明的一个实施例。提供了基材610。基材一般具有偶联基团，其将与聚合酶-核酸复合物上的部分反应，以将复合物结合到表面。在图6的实施例中，基材包括纳米级孔或零模式波导阵列616。基材610上的零模式波导616是穿过包覆层614的纳米级小孔，所述包覆层已设置到透明基材612上。包覆层的厚度一般为约10nm至约300nm。零模式波导可为例如直径约10nm至约300nm的圆柱形孔。这种零模式波导阵列可用于单一分子分析，例如如本文所述的单一分子测序。零模式波导可为任何合适的形状，包括圆柱体或圆锥体。形状可为通道。零模式波导的横截面形状可为圆形、三角形、正方形、矩形或椭圆形，或者横截面形状可为任意形状。为了在零模式波导内执行分析，经常期望具有与零模式波导的基部结合的固定的目的分子，但在基材的其它部分上具有很少的目的分子至基本上不具有目的分子。用于处理零模式波导的表面的方法包括用于获得与零模式波导的基部的选择性联接的方法，例如在美国专利号7,833,398、7,292,742以及于2007年3月29日提交的美国专利申请号11/731,748、于2008年3月27日提交的12/079922和于2008年3月5日提交的12/074,716中描述，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文用于所有目的。例如，在一些情况下，生物素选择性地联接到零模式波导的基部。

在基材上分配具有与之结合的目的分子，例如聚合酶-核酸复合物604的珠溶液602。复合物一般具有结合部分，其将附着到设置在基材表面上的偶联基团。例如，当基材包含生物素偶联基团时，生物素结合蛋白可与聚合酶-核酸复合物结合。生物素结合蛋白可为例如与聚合酶结合的链霉抗生物素蛋白。这些聚合酶-核酸复合物包被的珠可以任何合适的方式制备。包含珠602的溶液一般为具有将聚合酶-核酸复合物保持在一起所需的组分的水溶液。珠602可为磁珠。珠的大小取决于应用。在一些情况下，期望珠具有的直径大于零模式波导的直径。

在步骤(I)中，使珠与基材接触。这可通过例如应用使珠向下移动到基材顶部上的场来完成。当珠是磁性的时，磁场可用于将磁珠下拉。除了下拉珠之外，可能期望提供促使珠跨越基材的顶部移动的动态场。这可通过例如以促使珠移动的方式在基材下方移动永磁体来实现。一个或多个永磁体可以旋转方式移动，使得珠横扫表面。在其它情况下，提供有变化电流的一个或多个固定电磁体可用于产生动态场。一般而言，当磁场可用于移动珠时，珠被称为磁珠。

在步骤(II)中，将珠从基材表面去除。当使用磁珠时，可通过从样品侧面和上方使用磁体来执行这种去除或分离。

聚合酶-核酸复合物与珠之间的附着在该过程期间断裂，留下与表面结合的复合物，同时珠被去除。可能存在其中可发生复合物与珠附着中的破坏的几个地方。可通过设计成具有适当结合水平的构建体连接来控制在其处发生断裂的位置。各种类型的连接是可能的，并且一些类型具有比其它类型更强的结合。在本发明的一些实施例中，核酸杂交用作结合链中最弱的连接。在一些情况下，两个或多个杂交连接可发生在结合链中，并且例如通过具有更长的序列同源性区域可使一个比另一个更强。连接的强度也可通过下述来加以控制：包括经修饰的或非天然的碱基例如肽核酸(PNA)，加入错配的碱基，并且改变溶液中的条件包括离子强度和/或温度。

当聚合酶经由生物素-链霉抗生物素蛋白连接与表面结合时，提供了控制珠和复合物之间的连接中的断裂位置的一个例子，聚合酶通过在活性部位处的酶-基材相互作用与核酸结合，通过钩状寡核苷酸上的捕获序列与约10至约15个碱基对的核酸的发夹衔接子部分上的序列杂交，使核酸与钩状寡核苷酸结合，并且钩状寡核苷酸通过来自约18至约30个核苷酸的钩状寡核苷酸上的检索区域与连接至磁珠的寡核苷酸杂交来附着，例如在钩状寡核苷酸上的聚(dA)区域和在磁珠上的聚(dT)区域。对于这种类型的构建体，钩的捕获区域和核酸之间的杂交连接是在磁珠加载过程中最易于断裂的最弱环节。在这个位置处具有断裂是有利的，因为它将聚合酶-核酸复合物留在表面上而没有钩或珠的任何部分附着至其。

用聚合酶-核酸复合物包被的珠可如本文所述或以任何其它合适的方式生产。虽然本发明以珠的形式描述，但应理解，可使用具有聚合物-核酸复合物附着的其它固体表面，只要固体表面可与基材接近或接触以设置聚合酶-核酸复合物。珠一般是球形的，但可具有任何其它合适的形状，例如可使用纤维、杆、圆盘、立方体或其它成形材料。珠是有用的，因为它们可在溶液内容易地操作。用于本发明中的珠可在其外表面上功能化，用于附着聚合酶-核酸复合物。合适的珠包括在其表面上具有功能性有机分子的聚合物珠，允许这种附着。各种类型的珠是已知并且使用的，并且许多是商购可得的。珠可以纳米至毫米尺寸范围的各种尺寸范围生产。在某些情况下，珠可产生为相对单分散的，这可帮助获得一致的结果。

珠可以各种方式与基材接近或接触。力例如重力、离心力、磁力、电力或介电力或其组合可用于使珠与表面接触，并且相对于表面移动珠。在优选的方法中，使用磁珠，并且施加磁场以使珠下降到与基材接近或接触，并且使珠跨越基材移动。

磁珠已用于化学和生物化学过程中的纯化和分离，并且功能化磁珠是商购可得的。例如，NEB提供了各种磁珠，包括直链淀粉磁珠、抗MBP磁珠、几丁质磁珠、山羊抗小鼠IgG磁珠、山羊抗兔IgG磁珠、山羊抗大鼠IgG磁珠、亲水性链霉抗生物素蛋白磁珠、蛋白A磁珠、蛋白G磁珠、链霉抗生物素蛋白磁珠、SNAP-捕获磁珠、寡核苷酸(dT)磁珠；Dynal(LifeTechnologies)提供了各种功能化磁珠、包括链霉抗生物素蛋白包被的珠、与His标记结合的珠、阴离子交换、阳离子交换、疏水捕获和抗体珠。Micromod提供了用表面官能团NH2、PEG-NH2和PEG-COOH功能化的磁珠，用于蛋白质、抗体或其它分子的共价结合。TubobeadsLLC提供了具有链霉抗生物素蛋白、磺酸盐、羧酸盐或铵官能团的珠。Spherotech Inc.提供了具有各种官能团包括羧基、氨基、抗体和蛋白质的磁珠。使用功能化珠和表面聚合物合成的已知方法，可制备具有各种性质的珠，包括具有特定序列的寡核苷酸或肽的珠。

珠可包含聚合物，包括聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯、葡聚糖、交联葡聚糖、二氧化硅强化葡聚糖、淀粉(BNF-淀粉颗粒)、聚(乳酸)、聚(乙烯亚胺)或脱乙酰几丁质。珠也可由无机材料如碳、氧化铁、二氧化硅或硅制成。只要磁珠通过施加的磁场有效地移动，磁珠就可为有用的。例如，珠可为铁磁或顺磁的、或超顺磁的。

本发明的方法、组合物和装置对于执行单一分子分析特别有用。关于这点的原因在于所述方法可用于在基材上以相对稀疏的水平提供目的分子，例如聚合酶-核酸复合物。因此，该方法可用于在基材上设置目的分子，使得目的分子以这样的表面密度提供，使得目的分子是可独立地光学观察的。在一些情况下，基材包含纳米级孔阵列，例如零模式波导(ZMW)阵列。例如，基材可具有由例如熔融石英构成的透明下层，在所述透明下层上设置厚度为约10nm至约500nm的包覆层。包覆层一般是不透明层并且可为金属层。穿过包覆层的是延伸到透明基材，并且在一些情况下延伸到透明基材内的孔阵列。这些孔可具有任何合适的横截面轮廓包括圆形轮廓。当孔具有圆形轮廓时，孔的直径一般为约20nm至约500nm。延伸到透明基材的孔一般具有透明基材的一部分作为其基部，因此形成纳米级孔。为了用于本发明，将纳米级孔阵列功能化，使得结合分子附着在孔的底部处，用于结合孔内的一种或多种目的分子，例如聚合酶-核酸复合物。在一些情况下，阵列被选择性功能化，使得在孔内存在比孔外部更高密度的结合分子。功能化零模式波导基材的方法在美国专利号7,833,398、7,292,742以及于2007年3月29日提交的美国专利申请号11/731,748、于2008年3月27日提交的12/079922和于2008年3月5日提交的12/074,716中描述，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文用于所有目的。如本文其它地方所述，这些纳米级孔提供用于对非常少量的分子下至单一分子进行分析。在一些情况下，本发明的方法、装置和组合物允许在纳米级孔内设置单一目的分子。

当将目的分子例如聚合酶-核酸复合物设置到ZMW内时，在一些情况下，期望珠的直径大于ZMW的最小横截面尺寸；当ZMW具有圆形轮廓时，大于ZMW的直径。在某些情况下，珠的直径比ZMW的最小横截面尺寸大20％或更多。在一些情况下，珠的直径比ZMW的最小横截面尺寸大2倍或更多倍。在一些情况下，珠的直径比ZMW的最小横截面尺寸大2倍至10,000倍。在其它情况下，使珠的尺寸小于ZMW的尺寸可能是有用的。珠的尺寸可为例如直径约40nm至约10微米。

如本领域应理解的，珠一般不具有完美的球形形状，并且一般不是完全单分散的，而是具有尺寸和形状的分布。另外，当颗粒的外表面由在溶液中溶解或部分溶解的聚合物组成时，表面不是光滑的平坦表面，但附着至表面的基团可从聚合物链上的珠延伸到溶液内。尽管不受理论束缚，但认为在一些情况下，延伸到溶液内的这些聚合物链可将聚合物-核酸复合物从珠提供到纳米级孔内，所述珠太大而无法适合于孔。这种性质可用于促进ZMW的加载。在一些情况下，在珠上的官能团和用于连接钩状分子或直接连接到目的分子如聚合酶-核酸复合物的基团之间在珠表面上提供间隔物或接头分子。通过改变间隔物或接头的长度，可提供珠表面和目的分子之间或多或少的到达。间隔物或接头可为任何合适的分子结构。它可由聚合物例如多肽、聚(乙烯醇)、聚乙二醇或多糖制成。接头一般使用在溶液中溶解的聚合物制备，珠设置在所述溶液中发生。当目的分子是酶时，这一般是极性溶液，例如含水环境，对于使用极性或亲水性接头或间隔物。

在一些方面，本发明提供了用于将活性聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法，所述方法包括：提供具有与之结合的聚合酶-核酸复合物的磁珠溶液，每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和模板核酸；在至少一种核酸缩合剂的存在下，使磁珠溶液与包含具有基部的纳米级孔阵列的基材的顶部接触，其中所述孔的基部具有与之结合的偶联剂；并且从基材下方施加动态磁场，以使溶液中的磁珠向下移动到基材的顶部，由此动态磁场促使珠跨越基材的顶表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与纳米级孔的基部上的偶联基团结合。在某些情况下，磁场从基材上方或邻近基材施加。例如，可使用场聚焦，其允许从上方施加磁场，仍获得其中场梯度在基材下方最高的场，趋于将磁珠拉下。

基材上用于偶联至目的分子例如聚合酶-核酸复合物的偶联基团或结合分子，可为任何合适的偶联基团或结合分子。偶联可通过形成共价键或通过非共价相互作用来完成。一般期望与基材的偶联导致相对于例如聚合酶-核酸复合物和捕获分子之间以及捕获分子和珠之间的其它连接的强结合。本领域已知许多类型的结合对。在一些情况下，使用生物素和生物素结合蛋白如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白之间的相互作用。在一些情况下，使用例如在地高辛配基和抗地高辛配基之间的抗体-抗原相互作用。形成共价键的反应，例如Spy、SNAP或Click化学，可用于将聚合酶-核酸复合物与基材结合。寡核苷酸杂交也可用于附着。当使用这种杂交时，连接被设计为使得与表面结合的寡核苷酸更强，例如，具有比表面和珠之间的其它连接更高的Tm。

聚合酶-核酸复合物与基材的结合一般通过与聚合酶形成键来进行。一般用于将复合物附着至基材的结合对的一个成员直接或间接连接至聚合酶。在一些情况下，在生产聚合酶时包括生物素化序列，并且蛋白质在复合物形成之前被生物素化并且附着至链霉抗生物素蛋白。然后聚合酶-链霉抗生物素蛋白准备用于与基材结合，所述基材通过在其表面上具有生物素基团而制备。在其它实施例中，与聚合酶复合的核酸模板附着至基材。参见例如下文的参考文献。

当目的分子包含聚合酶-核酸复合物时，用于与珠设置的溶液一般是水溶液。如上所述控制溶液的组分和条件，以便使聚合酶-核酸复合物保持完整。例如，控制一价离子和二价离子的适当水平、核苷酸浓度、pH和温度。一般还期望聚合酶在设置期间不继续执行核酸合成，并且可添加锶和钙以便抑制或减少聚合。如上所述包括缩合剂以促进固定。

一般存在与珠附着的目的多个分子。例如，可存在附着至珠的数十至数百万或更多分子。在一些情况下，珠或珠的子集将各自仅具有附着的一个目的分子。

当珠用于将目的分子选择性地递送至基材时，可通过向珠施加力来使珠与基材接触，所述力可涉及将珠置于施加这种力的场中。用于结合目的分子的有效方法一般涉及施加迫使珠向下到基材的表面的场和使磁珠跨越基材的表面移动的场两者。这两种场可为不同的场，或可为相同场的两个组件。场可为例如重力、离心力、磁性、电力或介电的。

本发明的优选实施例利用磁场来下拉颗粒并且使颗粒跨越基材的表面移动，或与基材接触或与基材接近。可使用一个或多个永磁体或使用一个或多个电磁体来施加磁场。这些方法各自具有其益处和缺点，并且各自可用于进行本发明。在一些情况下，一个、两个、三个、四个或更多个永磁体被保持在基材下方，并且相对于基材连续移动。以这种方式，珠被拉下到基材并且跨越基材的表面移动。一个或多个磁体的移动可为提供珠的合适移动的任何模式。珠可在基材的平面内四处移动，或者可这样移动，使得它们也可从基材移开和移回基材。一个或多个磁体在基材下面的圆形移动已发现实施简单并且提供必要的移动。在一些情况下，磁体可保持固定并且基材相对于磁体移动。在某些情况下，基材和磁体两者均移动。

磁性运动模式的选择还将取决于珠与之接触或移动到其附近的基材的尺寸和形状。例如，磁体可制备为跟踪更宽的圆形，以确保珠与较大表面的外部区域接触。在一些实施例中，使用在基材下彼此相邻地保持的两个磁体，一个磁体具有其北极面朝上，并且另一个具有其北极面朝下。这对磁体被附着到机构，所述机构使该对在基材下面旋转。该对磁体在基材下方的基材平面内以约10至约120rpm旋转。在一些情况下，使用1rpm至600rpm、3rpm至120rpm、或6rpm至20rpm的旋转速率。珠跨越基材移动通常约5至约20分钟，但在一些情况下约1分钟至约2小时。商业上容易获得各种永磁体。例如，Dura Magnetics Inc.在其网站(www(dot)duramag(dot)com/magnet-material(dot)html)上具有各种磁体包括具有各种磁场强度的磁体可获得。可选择永磁体的类型和形状以易于实施且优化加载。例如，可采用纽扣式磁体、条形磁体或片状磁体。

一个或多个电磁体也可用于移动颗粒用于设置。例如，一个或多个电磁体可安装在基材下方，并且可改变电磁体的电流以便改变磁场的强度。通过将多个电磁体以图案放置，并且控制对每个电磁体的电流，可在基材上方产生移动的磁场，所述磁场可使磁性颗粒向下，且使颗粒跨越基材的表面移动。电磁体的使用具有以下优点：用于移动珠的系统可构造成不具有移动零件。流经电磁体的电流在电磁体处产生热。使用这种方法时，应该考虑这种热生成。在某些情况下，当使用电磁体时，提供散热、绝缘和/或主动冷却来控制温度。

可改变磁场强度、磁体数目、移动速度、与基材的距离和设置时间，以获得所需结果。即使对于非常小的磁珠，显微镜也可用于观察被磁场实时移动的珠云团的行为。这些观察也可用于设定关于设置的适当参数。

重力场可用于相对较大的珠。然而，随着珠变得更小，重力将珠从溶液中向下移动的能力变得有限。在某些情况下，芯片可缓慢旋转，同时珠跨越表面的顶部移动。旋转允许珠相对于芯片表面移动。在一些情况下，芯片在旋转时倾斜，以促进珠跨越表面的移动。也可施加离心力场来使珠下降，并且还使珠跨越基材的表面移动。例如，基材可被安装在离心机内，使得基材与离心力矢量成角度，并且基材可被旋转以使得珠跨越表面四处移动。

电场可用于移动颗粒，其中颗粒具有它们将在电场中移动的特性。例如，具有净电荷的颗粒或由具有被相反电荷的抗衡离子围绕的净电荷的聚合物制成的颗粒将在电场中移动。与上文关于磁场的描述一样，动态电场可用于将颗粒移动到基材并且使颗粒跨越基材的表面移动。通常电极将放置与溶液接触。然后将适当的电压根据时间施加到电极以产生电场。根据本发明，使用介电场梯度和交流电也可使颗粒移动。声场(超声处理)可用于相对于表面移动珠。也可利用例如通过产生漩涡的流体动力。

也可使用场的组合。例如，磁体可用于拉下珠，并且另一种力例如超声处理可用于移动它们，或者离心可用于拉下珠，并且分开的力用于移动它们。

本发明的一个目的是对基材提供目的分子例如聚合酶-核酸复合物，用于单一分子分析。对于单一分子分析，一般期望单一目的分子以密度和图案与基材结合，使得来自一个分子的光信号可与来自其它分子和溶液的信号区别检测。即，分子被这样设置，以便可个别地光学分辨。已用于此目的一种方法是从稀释的溶液中设置目的分子，使得平均起来，可接受数目的单一分子可个别地光学分辨。如果浓度太高，则表面上的密度将是这样的，使得少数(如果有的话)单一分子也是可分辨的。如果浓度太低，则这也可导致极少的单一分子。本发明的方法、装置和组合物提供了用于在基材上获得高水平的光学可分辨的单一分子的替代方法。

如上所述，用于单一分子分析的优选基材是零模式波导(ZMW)阵列。此处，光学分析仅在表面上的ZMW内进行。本发明提供了用于将单一分子加载到ZMW阵列内的有用方法。与用于单一分子分析的其它基材一样，将目的分子加载到ZMW上以获得可接受数目的单一分子已通常用稀释法进行，其中将以不同稀释水平的溶液施加到表面以获得最佳加载。本发明的方法提供了用于控制其中将目的分子加载到ZMW内的方式的工具。其它合适的基材包括例如纳米孔阵列。

当通过溶液扩散将聚合酶-核酸复合物文库设置到基材例如ZMW基材上时，可存在设置的相对大数目的较小片段而不是较大片段。通过用珠设置，特别是在缩合剂的存在下，可存在设置的聚合酶-核酸复合物通过尺寸均匀得多的分配，允许较大尺寸的片段在单一分子分析中的更佳表示。在一些情况下，珠加载还允许较大尺寸片段超过较小尺寸片段的优先加载。

因为ZMW是具有限定尺寸的孔，所以珠的尺寸、形状和延伸(到达)可用于控制其中设置目的分子的方式。例如，在一些情况下，使用具有的尺寸小于ZMW的特征尺寸的珠，使得珠适合于ZMW，并且具有这样的到达，使得仅来自珠的目的分子适合于将设置的ZMW。在某些情况下，使用比ZMW直径小但大于ZMW直径一半的珠。以这种方式，只有一个珠设置到ZMW内，防止第二个珠的设置，确保每个ZMW仅接收来自一个珠的目的分子。例如，对于具有200nm直径的ZMW的ZMW阵列，使用具有约100nm至约190nm的直径的珠。控制加载水平的另一种方式是通过控制珠的表面上目的分子的密度。例如，通过使用稀疏功能化的珠，仅设置小数目的分子。

用于将复合物附着到磁珠并且加载到ZMW芯片上的示例性过程

产生具有多个双链片段的文库，各种片段具有来自原始DNA样品的一部分的序列。多个双链片段可例如通过剪切或使用限制性酶来产生。例如，可控制尺寸分布，以得到相对长的片段-例如10kb或更大，或相对小的片段-例如200-300个碱基。将发夹衔接子连接到双链片段的末端上，以产生具有中心双链部分和在末端处的单链发夹环的环形模板分子(参见来自Pacific的SMRTbells^TM)。发夹衔接子用具有3'-多聚(A)区域的引物引发。引物与发夹衔接子部分杂交，使得引物的互补区域与发夹衔接子杂交，而多聚(A)部分保持未杂交和单链。使引发的SMRTbell^TM模板的溶液在其中形成聚合酶-核酸复合物的条件下暴露于phi-29聚合酶。该步骤一般用过量的聚合酶进行。

将具有附着的聚(T)DNA(例如Dynal珠)的磁珠溶液加入管中(任选如本文详述的在缩合剂的存在下)。用磁体将珠带到管的一侧，并且用缓冲液冲洗，例如一次使用高盐，并且一次使用与用于测序的缓冲液类似的缓冲液或使用包括缩合剂的缓冲液。然后以适当的稀释水平(例如20pM)将聚合酶-核酸复合物加入珠中，并且使珠重悬浮于该溶液内。珠与溶液接触以允许引物的聚(A)尾部与珠上的聚(T)基团杂交。复合物与珠的附着水平可通过荧光测定法来确定。

然后用缓冲液或盐溶液洗涤附着有聚合酶-核酸复合物的磁珠一至三次。洗涤步骤去除未附着的复杂物、不需要的组分和未复合的酶。在最后一步中，将具有复合物的磁珠分散到测序反应混合物或其它缓冲液内。该溶液可贮存用于例如在4℃下使用，或者可如本文详述的在缩合剂的存在下直接分配到基材上。该溶液可被分配到在芯片下方具有一个或多个永磁体的ZMW芯片上，并且磁体相对于芯片移动以使珠跨越表面移动。在某些情况下，不需要磁体，并且重力可用于将复合物加载到芯片上。对芯片的暴露可为例如15分钟至约6小时。较短的时间可提供较高的流通量，而较长的时间允许加载较低浓度的模板，这在最小量的样品可用时可能是有用的。然后可去除珠和任选的缩合剂，留下在基材上固定的聚合酶-核酸复合物。

扩散加载

在其它实施例中，核酸通过加载溶液的扩散达到所需加载速度和程度。通过提供核酸缩合剂可增强核酸，特别是大核酸的扩散加载。不受任何特定机制的限制，对于大核酸分子，大回转半径通常导致通过扩散的无法接受的缓慢和无效加载，但缩合剂的提供可降低回转半径，并且因而使扩散和总体固定速度和效率增加到有用的水平。输入核酸的量和/或浓度也可降低。

合适的缩合剂已在上文得到描述，并且包括一价阳离子(例如Na⁺和K⁺)、二价阳离子(例如Sr²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Eu²⁺、Ba²⁺和Fe²⁺)、三价阳离子(例如Co³⁺)、多聚带正电的有机分子(例如亚精胺、组蛋白和其它聚阳离子)、纳米颗粒和聚乙二醇(PEG)和PEG聚合物及其组合。在优选实施例中，PEG和至少一种阳离子的组合用于使核酸缩合。示例性的PEG和阳离子已在上文得到详述，如合适的浓度范围一样。

在一类实施例中，制备包含待加载的核酸(例如聚合酶-模板复合物)、PEG和阳离子的溶液。然后将该溶液施加到所需基材的表面。核酸通过溶液扩散到阵列区域。显而易见各种工作流可用于实现固定混合物中核酸缩合剂的所需最终浓度。因此，在另一类实施例中，将缺乏PEG的水溶液中待加载的核酸(例如聚合酶-模板复合物)施加到基材表面，所述基材表面覆盖有一层等体积的另一种水溶液，所述另一种水溶液含有以两倍所需最终浓度的PEG，使得在表面上的混合后实现PEG(和阳离子)的所需最终浓度。核酸通过溶液扩散到阵列区域。核酸通过溶液扩散到阵列区域。

如对于上文实施例详述的，用于设置的溶液一般是水溶液。当待设置聚合酶-核酸复合物时，如上所述控制溶液的组分和条件，以便使聚合酶-核酸复合物保持完整。例如，控制一价离子和二价离子的适当水平、核苷酸浓度、pH和温度。一般还期望聚合酶在设置期间不继续执行核酸合成，并且可添加锶和钙以便抑制或减少聚合。

本文描述了合适的基材并且包括反应区域阵列，例如纳米级孔例如ZMW阵列或纳米孔阵列。阵列可为规则或不规则的。如上文详述的，本发明的一个目的是对基材提供目的分子例如聚合酶-核酸复合物，用于单一分子分析。对于单一分子分析，一般期望单一目的分子以密度和图案与基材结合，使得来自一个分子的光信号可与来自其它分子和溶液的信号区别检测。即，分子被这样设置，以便可个别地光学分辨。如上所述，用于单一分子分析的优选基材是零模式波导(ZMW)阵列。此处，光学分析在表面上的ZMW内进行。

关于本文描述的其它实施例，核酸任选地固定或结合至阵列区域中的基材。例如，核酸可固定在纳米级孔(例如ZMW)的基部处，或者在纳米孔内、纳米孔上或纳米孔附近。例如，可在孔的基部处提供偶联剂(例如化学交联剂或结合部分)。核酸或与核酸结合的分子(例如聚合酶或引物)与偶联剂的结合因此将核酸固定在孔中。用于固定的合适技术是本领域众所周知的；参见例如本文其它地方提到的参考文献以及美国专利申请公开2008/0032301和2014/0094375。在一类实施例中，聚合酶包含生物素标记，并且聚合酶-模板复合物通过生物素标记与生物素结合蛋白(例如链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、traptavidin等等)的结合得到固定，所述生物素结合蛋白依次又结合纳米级孔的基部，例如生物素化的基部。在另一类实施例中，聚合酶例如通过与固定的反应性官能团的反应或通过带有SpyTag的聚合酶与固定的SpyCatcher肽的反应共价连接至附着至孔的基部的部分(关于SpyTag/SpyCatcher系统的讨论，参见例如，Fairhead等人(2014)J.Am.Chem.Soc.136:12355-12363)。在其它实施例中，模板核酸或引物被生物素化，并且与表面上的生物素结合蛋白结合或与表面化学交联。

关于上述实施例，例如，聚合酶可具有与之连接的结合对的成员，所述成员可结合与基材附着的结合对的另一成员。本领域已知许多类型的结合对。在一些情况下，使用生物素和生物素结合蛋白如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白之间的相互作用。在一些情况下，使用例如在地高辛配基和抗地高辛配基之间的抗体-抗原相互作用。形成共价键的反应，例如Spy、SNAP或Click化学，可用于将聚合酶-核酸复合物与基材结合。寡核苷酸杂交也可用于附着。

通常，聚合酶直接附着至基材。在其它实施例中，将与聚合酶复合的核酸模板附着至基材。例如在美国专利号8,481,264中提供了模板固定的某些实施例，所述美国专利以引用的方式并入本文。本领域技术人员将了解，存在经由接头部分共价或非共价固定核酸和蛋白质或将它们栓系至固定部分的许多方式。这些方法是固相合成和微阵列领域众所周知的(Beier等人，Nucleic Acids Res.27:1970-1-977(1999))。用于将核酸或聚合酶附着至固体支持物的非限制性示例性结合部分尤其包括链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素连接、氨基甲酸酯键、酯键、酰胺、硫酯、(N)-功能化硫脲、功能化马来酰亚胺、氨基、二硫化物、酰胺和腙键。特异性结合一种或多种反应组分的抗体也可用作结合部分。另外，可使用本领域已知的方法将甲硅烷基部分附着至核酸或聚合酶以及基材例如玻璃。

缩合剂的包括对于扩散加载较大的模板可为特别有益的。因此，待加载的核酸任选为长度至少5kb长，例如长度至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少70kb、至少100kb、至少200kb、至少500kb或甚至至少1000kb。核酸可为完全或部分双链的或者可为单链的。合适的核酸包括但不限于SMRTbells^TM(具有双链中心区域和单链发夹末端的环状核酸)、双链环状DNA分子(例如带缺口或空隙的双链环状DNA分子，例如带缺口或空隙的质粒)和线性分子(例如基因组DNA片段)。如下文更详细描述的，大核酸的缩合可导致排除足够体积的缩合分子，以不利于第二核酸在相同阵列区域或纳米级孔中的固定。纳米级孔(例如ZMW)任选具有50nm-400nm或50nm-300nm的临界尺寸，例如孔的顶部开口的直径或孔的基部的直径。

在不存在核酸缩合剂的情况下，将核酸的混合群体加载到纳米级孔内趋于有利于加载较小的核酸，所述较小的核酸(不限于任何特定机制)具有比大核酸更小的回转半径，并且因此可更容易地接近尺寸受限的反应区域。核酸缩合剂的添加可消除加载中的这种尺寸偏差，并且在一些情况下，甚至可有利于大核酸的加载。例如，核酸缩合剂的包括可导致大核酸(例如长度大于5kb、大于10kb、大于20kb、大于30kb、大于40kb、大于50kb、大于70kb、大于100kb、大于200kb、大于500kb、或甚至大于1000kb的核酸)与较小核酸(例如1或2kb)的加载和固定一样有效。例如，与该长度的核酸在起始样品中表现的频率相比，给定长度(例如5kb、10kb、20kb、30kb、40kb、50kb等)的核酸可在固定群体中以相同频率-或者甚至更大频率–表现。频率可评价为例如纳米级孔由该长度的分子占据的百分比，或者具有指定长度的初始样品中的分子百分比。还可评价不同尺寸模板的比率。

在其中加载聚合酶-模板复合物的一类示例性实施例中，聚合酶-模板复合物中的模板具有不同的长度。长度中的至少一个大于10kb。将样品加载和固定在纳米级孔中之后，由其长度大于10kb的固定模板占据的纳米级孔的百分比等于或大于初始溶液中其长度大于10kb的模板的百分比。任选地，初始溶液还包括其长度小于10kb(例如小于5kb、小于2kb、或小于1kb)的至少一种核酸；在加载和固定后，由其长度小于10kb的固定模板占据的纳米级孔的百分比等于或小于初始溶液中其长度小于10kb的模板的百分比。在相关的一类实施例中，聚合酶-模板复合物中的模板具有不同的长度，其长度中的至少一个大于20kb。将样品加载和固定在纳米级孔中之后，由其长度大于20kb的固定模板占据的纳米级孔的百分比等于或大于初始溶液中其长度大于20kb的模板的百分比。任选地，初始溶液还包括其长度小于20kb(例如小于10kb、小于5kb、小于2kb、或小于1kb)的至少一种核酸；在加载和固定后，由其长度小于20kb的固定模板占据的纳米级孔的百分比等于或小于初始溶液中其长度小于20kb的模板的百分比。作为一个具体例子，如果长度大于20kb的核酸构成75％的起始样品，则在将样品加载和固定在纳米级孔中之后，至少75％的被占据的孔被长度大于20kb的核酸占据。

在其中加载聚合酶-模板复合物的一类示例性实施例中，聚合酶-模板复合物中的模板包含第一模板，其长度至少为第二模板长度的20倍(例如至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、或至少100倍)。在样品加载和固定之后，固定的第一模板/固定的第二模板的比率等于或大于初始溶液中第一模板/第二模板的比率。例如，当起始样品中存在1fmole20kb模板和1fmole 1kb模板时，在样品加载和固定在纳米级孔中之后，被固定的20kb模板占据的孔与被固定的1kb模板占据的孔的比率为至少1:1(例如1.5:1、2:1或3:1或更多)。显而易见通常的样品可包括许多不同长度的大量核酸；上文的例子仅提出了选择的两个代表性长度，以评价不同长度的相对加载效率。

关于上述实施例，除增加有效加载的ZMW孔的数目之外，PEG的包括也改善了DNA固定的均匀性。不受任何特定机制的限制，PEG在固定和后续洗涤步骤期间有效地防止表面干燥，并且这减少了在这种干燥事件期间的DNA损失和聚合酶失活。这也改善了总体固定性能。

密度加载

与不包括缩合剂的通常扩散加载方法相比，另一个一般类别的实施例提供了导致核酸的改善加载的方法。在这类实施例中，缩合剂作用于增加掺料溶液的密度。在这些实施例中，将较高密度的掺料溶液施加到液体覆盖的基材上并且下沉，将核酸与其携带到阵列区域。关于另外的细节，参见通过Sassan Sheikholeslami等人于2015年11月18日提交的美国专利申请62/257,152，以及通过Sassan Sheikholeslami等人随之同日提交并且名称为“Methods and Compositions for Loading of Polymerase Complexe s”的美国专利申请__/______(代理人案号067191-5102-US)，所述专利各自在此以引用的方式全文并入用于所有目的。

本发明提供了用于将核酸分子(以及与那些核酸分子结合的任何分子或化合物)分配到多个阵列区域内的方法、装置、组合物和系统。一般而言，与不存在缩合剂的情况下的通常扩散加载方法相比，所述方法、装置、组合物和系统导致改善的核酸加载。注意，尽管为了便于讨论，下述节段的大部分讨论是根据聚合酶组合物，但应了解，任何其它分子(包括其它酶或其它蛋白质、分子或核酸)可用于本发明的方法、装置、组合物和系统中。因此，例如，可使用对于聚合酶组合物描述的技术来加载分离的核酸。如本节段中使用的“聚合酶组合物”意欲涵盖这样的组合物，所述组合物包含核酸模板和聚合酶，以及任何相关的分子，包括例如引物、dNTP和任何其它添加剂。在某些例子中，聚合酶组合物包含其中聚合酶附着至核酸模板的聚合酶复合物，在一些例子中，所述核酸模板还进一步与引物杂交。

与不存在缩合剂的情况下的通常扩散方法相比，本文描述的方法和系统改善了在其下核酸模板和任何相关分子加载到表面上的反应区域的速率。通常的扩散加载方法依赖扩散(和重力)将分子加载到表面，而无需使用如本文所述的具有密度差的溶液。像这样，通常的扩散加载方法一般需要较高浓度的输入样品，以在给定的时间量内将组合物加载到表面。相比之下，所述方法和系统具有改善的加载效率，使得需要较小的输入浓度以在相同的给定时间量内将组合物加载到表面。

一般而言，该方法利用浸浴表面的溶液与含有聚合酶组合物的溶液之间的密度差来增加将这些聚合酶组合物加载到表面的效率。增加加载效率意欲增加在其下组合物到达表面的速度和/或减少在给定时帧内占据表面所需的输入浓度的量。

例如，表面在标准缓冲液中覆盖。在某些非限制性例子中，该表面还包括多个阵列区域。含有聚合酶组合物的溶液(在本文中也称为“掺料”溶液)包括核酸缩合剂，并且具有比标准缓冲液更高的密度，并且当将更高密度的掺料溶液加入标准缓冲液中时，更高密度的溶液行进穿过该缓冲液，以覆盖该表面以及该表面上的任何阵列区域–因此，该掺料溶液中的聚合酶组合物也被携带到表面并且加载到阵列区域内。密度差允许掺料溶液以有效的方式将聚合酶组合物携带到表面。与在不存在缩合剂的情况下依赖通常的扩散控制方法的方法相比，这种高密度加载导致酶组合物的加载速度增加。

在进一步的例子中，掺料溶液包括添加剂，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)或另一种PEG聚合物。如上文详述的，PEG是优选的添加剂，因为它可作用于增加掺料溶液的密度且充当核酸缩合剂。其它大的中性或阳离子聚合物如葡聚糖和蔗聚糖也可用于增加掺料溶液的密度和充当核酸缩合剂。其它示例性添加剂包括氨基葡聚糖、糊精、簇糊精、蔗糖、DMSO、甘油和支链淀粉。

在进一步的例子中，可能期望加载已富集其中聚合酶与核酸模板复合的复合物的聚合酶组合物，并且该核酸模板进一步与引物杂交。因此，通过包括其中从掺料溶液中去除不适合加载的分子的步骤，掺料溶液任选地富集这种聚合酶复合物。例如，在其中期望加载聚合酶复合物的情况下，清洁步骤去除“游离”聚合酶和引物-即并非聚合酶-核酸复合物的部分的聚合酶和引物。在某些例子中，该清洁步骤使用能够结合非复合分子的颗粒完成。此类方法在其中使用高浓度引物和聚合酶以使复合物形成偏差的情况下特别有用。例如在美国专利申请62/257,152中描述了用于使掺料溶液富集聚合酶复合物的技术。

在进一步的例子中，核酸和任何相关分子(例如聚合酶)被加载到表面上，其中表面包括多个阵列区域。这些阵列区域在再进一步的例子中可包括纳米孔。这种纳米孔在进一步的例子中可包括但不限于零模式波导(ZMW)。在其它例子中，阵列区域可包括纳米孔。

如上文讨论并且在本文中更详细地描述的，在一些例子中，本文公开的组合物包括各自与单一模板核酸分子复合的聚合酶分子。单一模板核酸分子可包含DNA、RNA、非天然核苷酸或其组合。模板核酸可为单链和/或双链的。在一些例子中，模板核酸是具有第一末端和第二末端的双链。在进一步的例子中，第一发夹寡核苷酸在第一末端处连接模板核酸的每条链，并且第二发夹寡核苷酸连接在第二末端处连接模板核酸的每条链。在一些例子中，第一发夹寡核苷酸和第二发夹寡核苷酸是相同的(在本文中也描述为对称模板)，并且在其它例子中，第一发夹寡核苷酸和第二发夹寡核苷酸不相同(在本文中也描述为不对称模板)。

通常，如本文所述分配到基材上的聚合酶-模板复合物随后被固定或结合到基材。例如，聚合酶可具有与之连接的结合对的成员，所述成员可结合与基材附着的结合对的另一成员。在一些情况下，结合对包括生物素和结合生物素的蛋白质，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。本领域已知许多类型的结合对。在一些情况下，使用生物素和生物素结合蛋白如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白之间的相互作用。在一些情况下，使用例如在地高辛配基和抗地高辛配基之间的抗体-抗原相互作用。形成共价键的反应，例如Spy、SNAP或Click化学，可用于将聚合酶-核酸复合物与基材结合。寡核苷酸杂交也可用于附着。

通常，聚合酶直接附着至基材。在其它实施例中，与聚合酶复合的核酸模板附着至基材。例如在美国专利号8,481,264中提供了模板固定的某些实施例，所述美国专利以引用的方式并入本文。本领域技术人员将了解，存在经由接头部分共价或非共价固定核酸和蛋白质或将它们栓系至固定部分的许多方式。这些方法是固相合成和微阵列领域众所周知的(Beier等人，Nucleic Acids Res.27:1970-1-977(1999))。用于将核酸或聚合酶附着至固体支持物的非限制性示例性结合部分尤其包括链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素连接、氨基甲酸酯键、酯键、酰胺、硫酯、(N)-功能化硫脲、功能化马来酰亚胺、氨基、二硫化物、酰胺和腙键。特异性结合一种或多种反应组分的抗体也可用作结合部分。另外，可使用本领域已知的方法将甲硅烷基部分附着至核酸以及直接附着至基材例如玻璃。

本文所述的方法和系统提供了超过用于将分子加载到表面上的常规方法和系统的几个优点。例如，对于给定的时间量，本文描述的方法和系统允许较小量的输入分子(例如核酸或聚合酶-模板复合物)用于相同的加载速度。在一些例子中，与不使用具有密度差和缩合剂的溶液的基于扩散加载的方法和系统相比，本文所述的方法和系统导致聚合物组合物快约2X至约100X的加载。

本文描述的方法和系统的进一步优点是需要聚合物组合物的较小输入浓度，以达到与不使用密度差和缩合剂的通常扩散加载方法下相同的速度和加载水平。本文所述方法的又一个进一步优点在于，一般而言，由于在样品有机会均匀覆盖整个表面之前的样品蒸发(不受机制限制)，不使用本文所述的溶液差异将样品直接施加至表面可导致斑片状不均匀加载。这对于反应例如测序反应中一般使用的表面尤其如此，所述反应一般可具有约20–150mm²的表面积。

在一些实施例中，根据本文所述的任何方法对其加载聚合酶组合物的表面具有圆形几何形状或矩形几何形状。这样的表面还可包含约120,000至约2,000,000ZMW。在其中表面具有圆形几何形状的实施例中，表面一般而言可包含约100,000、150,000、200,000或250,000个ZMW。在其中表面具有矩形几何形状的实施例中，表面可包括约750,000、1,000,000或1,500,000或更多个ZMW。在进一步的实施例中，表面包含约0.5-20、1-19、2-18、3-17、4-16、5-15、6-14、7-13、8-12或9-11百万个ZMW。在其它实施例中，这样的表面可包括纳米孔，并且本文所述的任何加载方法同样适用于将任何类型或长度的核酸递送至包含纳米孔的表面。

一般而言，与不使用具有核酸缩合和密度差的溶液的基于扩散加载的方法和系统相比，本文所述的加载方法导致聚合物组合物快约2X至约100X的加载。在某些实施例中，与不使用具有核酸缩合和密度差或其他溶液差异的溶液的基于扩散加载的方法和系统相比，加载方法导致聚合物组合物快约5-90X、10-80X、15-70X、20-60X、25-50X或30-40X的加载。

如所述，该方法利用掺料溶液和覆盖表面的溶液之间的密度差，以增加组合物加载到表面的效率。在具体实施例中，表面在标准缓冲液中覆盖。在某些非限制性例子中，该表面还包括多个阵列区域，其依次又可包含纳米孔(纳米级孔)。这些纳米孔可包括但不限于ZMW。含有聚合酶组合物的掺料溶液具有比标准缓冲液更高的密度，使得当将更高密度的掺料溶液加入缓冲液中时，更高密度的溶液行进穿过该缓冲液，以覆盖该表面以及该表面上的任何阵列区域。因此，该掺料溶液中的聚合酶组合物也被携带到表面并且加载到该表面上的任何阵列区域中。密度差允许掺料溶液以有效的方式将聚合酶组合物携带到表面。与在不存在核酸缩合/密度增加组分的情况下依赖通常的扩散控制方法的方法相比，这种高密度加载导致聚合酶组合物的加载速度增加。

与本领域已知和本文所述的使用添加剂覆盖表面的标准缓冲液相比，可提高掺料溶液的密度。在优选实施例中，PEG作用于增加掺料溶液的密度且使核酸缩合。PEG可以按体积计(v/v)约1-20％的浓度，例如按体积计约2-18％、5-15％、8-10％或3-10％的浓度包括在掺料溶液中。在一些实施例中，PEG和至少一种阳离子的组合用于使核酸缩合。上文已详细描述了合适的PEG(和其它PEG聚合物)和示例性阳离子，与具有合适的浓度范围一样。在其它实施例中，除核酸缩合剂(例如可采用PEG、聚阳离子或另一种缩合剂和密度修饰添加剂的组合)之外，还可提供密度增强添加剂。示例性的密度修饰添加剂包括中性和亲水性多糖、高度支化的高质量多糖、葡聚糖、氨基葡聚糖、糊精、簇糊精、蔗聚糖、蔗糖、PEG、DMS O、甘油和支链淀粉。在一些实施例中，掺料溶液包含排除缓冲液的体积。应了解，添加剂可以用于增加溶液密度的任何浓度包括在溶液中。这些添加剂可以按体积计(v/v)约1-20％的浓度包括。在进一步的实施例中，这些添加剂以按体积计约2-18％、5-15％、8-10％或3-10％的浓度包括。

如本文讨论的，与不使用掺料溶液通过扩散分配相比，使用掺料溶液(在本文中也称为“分配”聚合酶组合物)的聚合酶组合物的加载快约2-50倍发生。在进一步的实施例中，与不使用掺料溶液通过扩散分配相比，用掺料溶液的分配以快约5-45、10-40、15-35、20-30倍的速率发生。在再进一步的实施例中，与不使用掺料溶液通过扩散分配相比，用掺料溶液的分配快至少2、5、10、20、50、75、100、150或200倍发生。

在进一步的实施例中，掺料溶液具有的体积低于浸浴聚合物组合物要分配到其上的表面的缓冲液的体积。在一些实施例中，掺料溶液具有的体积为缓冲液体积的约1％至约20％。在进一步的实施例中，掺料溶液具有的体积为缓冲液体积的约1-30％、5-15％、10-25％或15-20％。在又进一步的实施例中，掺料溶液具有的体积为缓冲液体积的约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在再进一步的实施例中，掺料溶液的体积/缓冲液的体积之比为约1:5、1:7、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:30、1:40或1:50。

在进一步的实施例中，增加盐浓度还可增强如本文所述的密度加载。在某些实施例中，盐包括但不限于乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、氯化钾或一般用于缓冲溶液中的任何其它盐。在再进一步的实施例中，高密度加载方法利用包含约100-600、150-550、200-500、250-450或300-400mM盐的掺料溶液。

在一些实施例中，并且根据上述中的任何，如本文所述的高密度加载方法包括提供包含纳米孔阵列的表面。这些纳米孔在进一步的实施例中可包括ZMW。具有纳米孔的表面还包含标准缓冲溶液，包括例如在测序反应中使用并且是本领域已知的任何标准缓冲液。在某些实施例中，标准缓冲液包括钾盐并且具有在7–9的范围内的pH。在一些实施例中，缓冲液可包括Tris乙酸盐或Tris-HCl作为示例性实施例。将具有比标准缓冲液那种更高的密度并且含有核酸(例如附着至与引物进一步杂交的核酸模板的聚合酶的复合物)的掺料溶液施加至标准缓冲液。掺料溶液的较高密度促使其行进穿过标准缓冲液到纳米孔，并且与当加载溶液和标准缓冲液之间不存在密度差时可见的相比，核酸或聚合酶复合物以更快的速率加载到纳米孔内。

掺料溶液的密度可具有高于标准缓冲液那种的任何密度。在一些非限制性实施例中，掺料溶液的密度比标准缓冲液的密度高0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0X。在进一步的实施例中，掺料溶液比标准缓冲液的密度高约0.5–3X、0.6–2.5X、0.8–2.0X、1.0–1.5X。在再进一步的实施例中，掺料溶液的密度(也称为比重)比标准缓冲液的密度高约2–20％。在又进一步的实施例中，掺料溶液的密度比标准缓冲液的密度高约1.5–30、2–28、3–26、4–24、5–22、6–20、7–18、8–16、9–14、10–12％。在再进一步的实施例中，掺料溶液的密度为约1-5、1.1-1.5、1.2-2.0、1.3-2.5、1.4-3.0、1.5-3.5、1.6-4.0、1.7-4.5、1.8-5、1.9-5.5、2.0-6.0g/cm³。

在一些实施例中，在本文所述的任何方法中并且根据上述中的任何，将分子分配到表面在约0.5至约5小时内完成。在再进一步的实施例中，分配在约1-4.5、1.5-4、1-3或2-3.5小时内完成。

在又进一步的实施例中，输入样品(包括输入核酸模板、聚合酶分子和引物中的任何一种或组合)的量在比不使用高密度掺料溶液可见更少的时间内产生相同量的加载。换言之，对于相同的给定时间量，与使用不利用不同密度的溶液的扩散控制方法时相比，当使用本文描述的高密度溶液方法时，需要更少的输入样品来将相同数目的分子加载到表面。

在再进一步的实施例中，在使用本文所述的方法加载到表面的分子中有核酸模板，一般作为与聚合酶分子的复合物的部分。此类核酸模板可包括本领域已知和本文所述的任何核酸分子。在一些实施例中，模板具有约50至600个核苷酸的长度。在另一个实施例中，核酸为长度300至600或200至20000个核苷酸。在又一个实施例中，核酸模板为长度10-100、50-100、50-300、100-200、200-300、50-400、100-400、200-400、400-500、400-600、500-600、50-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、700-900、700-800、800-1000、900-1000、1500-2000、1750-2000、50-2000、100-25000、200-24000、300-23000、400-22000、500-21000、600-20000、700-19000、800-18000、900-17000、1000-16000、1100-15000、1200-14000、1300-13000、1400-12000、1500-11000、1600-10000、1700-9000、1800-8000、1900-7000、2000-6000、2100-5000、2200-4000、2300-3000、10000-30000、12000-28000、14000-26000、16000-24000、18000-22000或19000-20000个核苷酸。任选地，核酸模板为长度至少5kb，例如长度至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少70kb、至少100kb、至少200kb、至少500kb、或甚至至少1000kb。在进一步的实施例中，核酸模板是聚合酶-模板复合物的部分。在又进一步的实施例中，核酸模板本身进一步与引物杂交。

在进一步的实施例中并且根据上文中的任何，掺料溶液具有比它置于其内的缓冲剂更大的粘度。如本文使用的，“粘度”指动态粘度，即流体对剪切流动的阻力。SI中的粘度单位是Poiseuille(PI)[1PI＝1Pa*s]或Poise(P)[1P＝0.100kg/ms]。一般而言，掺料溶液的粘度不超过水粘度的10X。在某些实施例中，掺料溶液的粘度不超过水粘度的8X、6X、4X或2X。(水具有大约1厘泊(cP)的粘度。)在进一步的实施例中，掺料溶液的粘度和密度之间的平衡是这样的，使得掺料溶液(及其所含分子)的加载效率增加超过在粘度和密度之间没有这种平衡的溶液的那种。在进一步的实施例中，掺料溶液的粘度为约1.5-10、2-9、2.5-8、3-7、3.5-6、4-5cP。在再进一步的实施例中，掺料溶液的密度为约1-5、1.1-1.5、1.2-2.0、1.3-2.5、1.4-3.0、1.5-3.5、1.6-4.0、1.7-4.5、1.8-5、1.9-5.5、2.0-6.0g/cm³，并且粘度为约2-12、3-11,4-10、5-9、6-8cP。

加载一个核酸/阵列区域

执行单一分子分析的一个困难发生在用目的分子(例如模板或其它分析物和/或酶)加载单一分子分析装置的反应/观察区域。将两个或多个目的分子加载到ZMW或其它小型观察体积内趋于使从双重(或超过双重)加载区域观察到的任何信号分析复杂化。这是因为可能同时从ZMW或其它观察体积观察到两(或更多)组信号，意味着在可使用来自观察区域的数据之前来自ZMW的信号必须解卷积。来自双重(+)加载的ZMW的数据可通过各种数据分析方法来识别。来自错误加载的ZMW或其它相关观察体积的数据可弃去，例如，当它无法解卷积时；通常，解卷积算法能够从通过双重(+)加载的ZMW产生的总数据的一部分中回收有用的数据。

为了减少阵列的相关反应/观察体积中的多重分子加载事件的发生率，本领域通常使阵列由目的分析分子基本上“加载不足”。当所有观察体积的少于20％被加载时，分子随机分配到阵列内导致一个或几个分子加载到大多数反应/观察体积内。当所有观察体积的约64％被加载时，单一分子占据的最高可能百分比为36.8％。这种类型的加载被称为“泊松限制”分析物加载，意味着少而足够的分子加入阵列中，使得分析物在阵列内的泊松式随机统计分布导致在多数情况下一个或几个分析物/观察体积。在ZMW背景下，已对于一系列ZMW直径(例如70-100nm)获得大约36％的单一分子占据的现有技术产率。参见Foquet等人(2008)“Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-moleculedetection”Journal of Appli ed Physics 103,034301。对于这种加载程度，通常的ZMW阵列中约37％的ZMW未被加载(例如没有分析物分子)。

更高的加载密度将允许同时分析阵列中更多的分析物分子，增加了此类系统的流通量，同时降低了分析成本。用于实现高加载密度的各种技术例如在USPN 8,906,831和于2016年3月23日提交的美国专利申请15/078,915中描述，所述专利各自以引用的方式全文并入本文。这种技术可通过包括如本文所述的核酸缩合剂得到促进。

此外，不受任何特定机制的限制，大核酸(例如大于8kb、大于10kb、大于15kb、大于20kb、大于30kb、大于40kb、大于50kb、大于70kb、大于100kb、大于200kb、大于500kb、或甚至大于1000kb)的缩合可导致缩合分子，所述缩合分子排除足够体积，以不利于第二核酸在相同的反应区或纳米级孔中的固定。因此，在一些实施例中，在分配核酸(例如聚合酶-模板复合物)之后，至少38％的纳米级孔(或其它阵列区域)，例如至少50％或至少75％的孔或区域被单一固定的核酸(例如单一固定的聚合酶-模板复合物)占据。如上所述，加载可为珠辅助的、通过扩散或通过密度掺料。可通过调整溶液条件来调节缩合的程度，所述溶液条件例如PEG的类型、PEG的浓度和/或一价离子和二价离子的浓度，并且从而影响被核酸排除的体积的程度。纳米级孔(例如ZMW)任选具有50nm-400nm或50nm-300nm的临界尺寸，例如孔的顶部开口的直径或孔的基部的直径。

例如，通过将一个或多个颗粒附着到核酸(包括例如依次又与核酸结合的另一个分子如聚合酶分子)，可实现另外的尺寸排阻效应。附着任选是共价的(例如通过用可切割连接改造的偶联分子，以允许固定后颗粒与模板的解离)或非共价的(例如通过杂交，例如模板上的聚A与聚-dT包被的珠，或通过非特异性离子相互作用)。用于与核酸附着的合适颗粒包括但不限于磁珠或非磁性珠或者任何尺寸的颗粒，生物分子如蛋白质、DNA或寡聚物，复合物及其聚集物。通常，合适颗粒的整体尺寸比底部ZMW直径或顶部直径(或比另一个阵列区域的临界尺寸)略微更小或略微更大。合适颗粒的几个具体例子是磁性或非磁性dT珠(例如50至300nm)、用dT或另一种寡核苷酸或羧基功能化的聚合物颗粒(例如 珠)、对于DNA具有亲和力的组蛋白或其它碱性蛋白质、具有DNA结合基团的改造的自组装多面体蛋白质壳、以及用DNA结合基团功能化的病毒(空心)衣壳。颗粒可仅为了其尺寸排除益处而使用，或者颗粒(例如珠)可用于帮助如上所述的加载(例如在重力或磁场的影响下)，加上提供尺寸排除益处。

当偶联剂提供用于例如在纳米级孔的基部处的核酸固定时，控制表面上偶联剂的密度或数目可帮助达到所需的占据。例如，可调节表面上偶联剂的密度或数目，使得足够的试剂可用于容易地结合第一核酸以遇到纳米级孔的基部，但使得孔被第一核酸的占据足以阻止在该孔中的偶联剂被其它核酸的可及性。在一个实施例中，在纳米级孔的基部处存在一个偶联剂。在一些实施例中，偶联剂的密度或数目将是在纳米级孔的表面上偶联剂的最大可能密度或数目的一部分。

模板及其它核酸

除非另有说明，否则本公开内容中描述的本发明的实践可采用在领域技术内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。这样的常规技术包括核酸合成、分离和/或操作、聚合物阵列合成、杂交、连接、噬菌体展示以及使用标记的杂交检测。通过参考本文的例子可得到合适技术的具体说明。然而，当然也可使用其它等价的常规程序。这些常规技术和描述可在标准实验室手册中找到，例如Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第3版)，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,2000,Current Protocolsin Molecular Biology,F.M.Ausubel等人，编辑，Current Protocols,a joint venturebetween Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.，(补充到2016年)，Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)，Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cells:A Laboratory Manual,PCR Primer:A Laboratory Manual和Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman,New York,Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London,Nelson和Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry第3版，W.H.Freeman Pu b.,NewYork,N.Y.和Berg等人(2002)Biochemistry，第5版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，所有所述参考文献都以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

本发明实践中采用的核酸可为完全或部分双链的或者可为单链的。合适的核酸包括但不限于SMRTbells^TM(具有双链中心区域和单链发夹末端的环状核酸)、双链环状DNA分子(例如带缺口或空隙的双链环状DNA分子，例如带缺口或空隙的质粒)和线性分子(例如基因组DNA片段)。

核酸包括模板核酸可使用本领域众所周知的技术从基本上任何所需样品制备。关于环状模板包括例如简单环状和SMRTbells^TM(具有双链中心区域和单链发夹末端的环状核酸)的进一步讨论，参见例如USPN 8,236,499“Methods and Compositions for NucleicAcid Sample Preparation”，USPN 8,153,375“Compositions and Methods for NucleicAcid Sequencing”，以及Travers等人(2010)Nucl.Acids Res.38(15):e159，所述参考文献以引用的方式全文并入本文用于所有目的)。如所述，这些方法对于加载大模板分子可能特别有用。因此，在一些实施例中，核酸模板是长度至少5000、10000、15000、20000、25000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、120,000、130,000、140,000、150,000、200,000、500,000或1,000,000个核苷酸。

本文所述的任何方法和复合物都可包括模板核酸分子，通常作为本文所述的聚合酶复合物的部分。一般而言，模板核酸是关于其互补序列在聚合酶反应中合成(或可合成)的分子。应了解，模板序列可具有任何长度或结构。在一些情况下，模板核酸是线性的；在一些情况下，模板核酸是环状的。模板核酸可为DNA、RNA和/或非天然RNA或DNA类似物。适合于通过聚合酶复制的任何模板核酸都可用于本文所述的方法和系统中。

在一些实施例中，用于本发明的方法和组合物中的模板核酸包含从样品获得的核酸。样品可包含任何数目的事物，包括但不限于体液(包括但不限于血液、尿、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液)以及实际上任何生物的细胞，其中哺乳动物样品是优选的，并且人样品是特别优选的；环境样品(包括但不限于空气、农业、水和土壤样品)；生物战剂样品；研究样品(例如在核酸的情况下，样品可为扩增反应的产物，包括靶和信号扩增两者，如PCR扩增反应；纯化的样品，如纯化的基因组DNA、RNA制剂，原始样品(细菌、病毒、基因组DNA等)；如本领域技术人员应了解的，实际上可对样品进行任何实验操作。

在进一步的实施例中，从样品获得核酸分子并将其片段化用于(或在使用之前)在本发明的方法中作为模板核酸。片段可为单链或双链的，并且可根据本领域已知的和本文描述的任何方法进一步修饰。模板核酸可通过使用本领域已知的任何方法将源核酸(例如基因组DNA)片段化来生成。在一个实施例中，在基因组DNA的裂解和提取期间的剪切力生成在期望范围内的片段。本公开内容还涵盖利用限制性内切核酸酶的片段化方法。

如应了解的，可通过片段化从源核酸如基因组DNA生成模板核酸，以产生特定大小的片段。靶核酸可为例如长度约10至约50,000个核苷酸、或长度约10至约20,000个核苷酸。在一个实施例中，片段为长度50至600个核苷酸。在另一个实施例中，片段为长度300至600或200至2000个核苷酸。在又一个实施例中，片段为长度10-100、50-100、50-300、100-200、200-300、50-400、100-400、200-400、400-500、400-600、500-600、50-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、700-900、700-800、800-1000、900-1000、1500-2000、1750-2000和50-2000个核苷酸。在进一步的实施例中，片段为长度至少5000、10000、15000、20000、25000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、120,000、130,000、140,000或150,000个核苷酸。在又进一步的实施例中，核酸模板为长度10-100、50-100、50-300、100-200、200-300、50-400、100-400、200-400、400-500、400-600、500-600、50-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、700-900、700-800、800-1000、900-1000、1500-2000、1750-2000、50-2000、100-25000、200-24000、300-23000、400-22000、500-21000、600-20000、700-19000、800-18000、900-17000、1000-16000、1100-15000、1200-14000、1300-13000、1400-12000、1500-11000、1600-10000、1700-9000、1800-8000、1900-7000、2000-6000、2100-5000、2200-4000、2300-3000、5000-20000、10000-30000、12000-28000、14000-26000、16000-24000、18000-22000、19000-20000个核苷酸。在又进一步的实施例中，核酸模板为长度至少5000、10000、15000、20000、25000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、120,000、130,000、140,000、150,000、200,000、500,000或1,000,000个核苷酸。在进一步的实施例中，核酸是聚合酶-模板复合物的部分。在又进一步的实施例中，核酸模板本身进一步与引物杂交。

在一些情况下，模板序列可为线性单链或双链核酸序列。在另外其它实施例中，模板可作为环状或功能性环状构建体来提供，所述构建体允许相同核酸序列通过合成复合物的冗余加工。这样的环状构建体的使用已例如在于2008年7月25日提交的美国专利号7,315,019和美国专利申请号12/220674中得到描述，并且替代的功能环状构建体也在美国专利申请公开号20090298075中得到描述，所述专利各自的全部公开内容以引用的方式全文并入本文用于所有目的，并且特别是用于涉及模板核酸构建体的所有教导。简言之，此类替代构建体包括具有中心双链部分的模板序列，所述中心双链部分在每个末端处通过合适的连接寡核苷酸(例如发夹环区段(SMRTbells^TM))连接。这样的结构不仅提供了重复复制单一分子(且因此测序该分子)的能力，而且通过复制双链部分的有义部分和反义部分提供了另外的冗余。在测序应用的背景下，这种冗余测序提供了在序列准确性方面的极大优点。

在进一步的方面，用于本发明组合物中的模板核酸包括：具有第一末端和第二末端的双链核酸区段；在第一末端处连接单一模板核酸的每条链的第一发夹寡核苷酸；和在第二末端处连接单一模板核酸的每条链的第二发夹寡核苷酸。在一些实施例中，第一发夹和第二发夹寡核苷酸是相同的。在其它实施例中，第一发夹寡核苷酸和第二发夹寡核苷酸不相同–换言之，尽管是替代的环状构建体，模板核酸仍然是不对称的。在进一步的实施例中，第一发夹寡核苷酸包括引物结合位点，而第二发夹寡核苷酸包括捕获衔接子(或反之亦然)。捕获衔接子一般具有可用于对于所选择的发夹富集群体的序列-例如，在一些实施例中，捕获衔接子包含聚A序列，从而允许使用珠或利用聚T序列的柱层析的捕获。在一些实施例中，捕获衔接子包含至少一个甲氧基残基。在进一步的实施例中，捕获衔接子与附着至珠的寡核苷酸互补，所述珠在进一步的实施例中可为可用于富集含有捕获衔接子的模板核酸群体的磁珠。在其中模板群体包括具有不同衔接子的模板或其中每个模板在每个末端处包含不同衔接子的一些实施例中，可使用含有与不同衔接子互补的寡核苷酸的不同珠。因此，对于具有两个不同衔接子的模板，可使用两个不同的珠。对于含有多种不同衔接子的群体，可使用针对那些衔接子的伴随数目的不同类型的珠。在其它实施例中，相同珠可含有与模板群体中的不同衔接子互补的不同寡核苷酸，使得相同珠可捕获不同衔接子(及其结合的模板)。

在再进一步的实施例中，第一发夹或第二发夹包含自引发的衔接子序列，其中引物是衔接子的部分。在这样的实施例中，不需要另外的寡核苷酸引物以允许聚合酶分子开始复制模板。

在其它实施例中，核酸模板仅含有在一个末端或另一个末端处的单个发夹。

用于本文所述方法和组合物中的聚合酶一般需要引物。尽管在大多数情况下使用寡核苷酸引物，但在某些情况下，蛋白质如末端蛋白可充当引物。寡核苷酸引物一般与模板核酸的一部分互补。引物可包含天然存在的RNA或DNA寡核苷酸。引物也可为合成的类似物。如上所述，引物可具有替代的主链。引物还可具有其它修饰，例如包括杂原子、标记例如染料的附着或用官能团取代，所述修饰仍然允许碱基配对和通过酶的识别。引物可选择更紧密结合的引物序列，例如富含GC的序列，以及采用在其结构内包括非天然核苷酸或核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA))的引物，其可证实与模板更高的亲和力配对。还可选择引物以通过使用长度、核苷酸含量和/或上文讨论的任何修饰来影响聚合酶反应的动力学。

在其它实施例中，采用自引发模板。例如，如上所述，可采用包括自引发衔接子序列的SMRTbell^TM。作为另一个例子，可采用包括至少一个带缺口或空隙的双链模板(例如带缺口或空隙的双链质粒)。

聚合酶

本公开内容的许多方法和组合物利用聚合酶(在本文中也称为“聚合酶”)。任何合适的聚合酶都可用于本文公开的系统和方法中。合适的聚合酶包括DNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)、以及RNA依赖性RNA聚合酶。在某些实施例中，用于本发明的方法和组合物中的聚合酶是链置换聚合酶。

如本文进一步详细公开的，用于本文公开的方法中的聚合酶可包括改善酶的某些特征的修饰，所述特征包括持续合成能力、对光损伤的抗性和对固定的帮助性。在某些方面，本文公开的方法和系统中使用的聚合酶包括接头、基序(例如生物素连接酶识别序列)或聚合酶(以及它们与之复合的任何其它分子，如模板核酸)通过其可固定在表面上的结构域。

基于各种系统发生关系，DNA聚合酶有时分类成六个主要组，例如大肠杆菌(E.coli)Pol I(A类)、大肠杆菌Pol II(B类)、大肠杆菌Pol III(C类)、广古生菌(Euryarchaeotic)Pol II(D类)、人Polβ(X类)、以及大肠杆菌UmuC/DinB和真核生物RAD30/着色性干皮病变体(Y类)。关于最近的命名法的综述，参见例如Burgers等人(2001)“Eukaryotic DNA polymerases:proposal for a revised nomenclature”J BiolChem.276(47):43487-90。关于聚合酶的综述，参见例如Hübscher等人(2002)“EukaryoticDNA Polymerases”Annual Review of Biochemistry第71卷：133-163；Alba(2001)“Protein Family Review:Replicative DNA Polymerases”Genome Biology 2(1):reviews 3002.1-3002.4；和Steitz(1999)“DNA polymerases:structural diversity andcommon mechanisms”J Biol Chem 274:17395-17398。已确定了许多聚合酶的基本作用机制。事实上数百种聚合酶的序列是可公开获得的，并且这些聚合酶中的许多的晶体结构已得到确定，或者可基于与同源聚合酶的分辨晶体结构的相似性推断。例如，Φ29(待根据本发明修饰的优选类型的亲本酶)的晶体结构是可获得的。

除野生型聚合酶之外，可使用由不同来源的镶嵌体(mosaic)制成的嵌合聚合酶。例如，通过考虑来自超过一种亲本聚合酶的序列制备的Φ29聚合酶可用作突变的起点，以产生本文所述方法中使用的聚合酶。例如，使用聚合酶之间的相似性区域以定义嵌合体中使用的共有序列的考虑，或使用其中多个Φ29相关聚合酶经由可用的基因改组技术随机或半随机改组的基因改组技术，可产生嵌合体(例如经由“家族基因改组”；参见Crameri等人(1998)“DNA shuffling of a family of genes from diverse species a cceleratesdirected evolution”Nature 391:288–291；Clackson等人(1991)“Making antibodyfragments using phage display libraries”Nature 352:624-628；Gibbs等人(2001)“Degenerate oligonucleotide gene shuffling(D OGS):a method for enhancing thefrequency of recombination with fam ily shuffling”Gene 271:13-20；以及Hiraga和Arnold(2003)“General me thod for sequence-independent site-directedchimeragenesis:J.Mol.Biol.330:287-296)。在该方法中，可预先确定重组点，使得基因片段以正确次序组装。然而，可随机形成组合，例如嵌合体。例如，使用Clarkson等人所述的方法，可生成五种基因嵌合体，例如包含Phi29聚合酶、PZA聚合酶、M2聚合酶、B103聚合酶和GA-1聚合酶的区段。改善支化分数、增加封闭复合物的稳定性、或改变反应速率常数的适当突变可引入嵌合体内。

可用的DNA聚合酶也已以各种方式中的任一种进行修饰，例如以降低或消除外切核酸酶活性(许多天然DNA聚合酶具有干扰例如测序应用的校对外切核酸酶功能)，以通过制备蛋白酶消化的酶片段如Klenow片段重组体等来简化生产。如所述，聚合酶也已进行修饰，以赋予聚合酶-DNA-核苷酸复合物中标记核苷酸的特异性、持续合成能力以及改善的保留时间(例如通过Hanzel等人的WO 2007/076057Polymerases For Nucleotide AnalogueIncorporation，以及通过Rank等人的WO 2008/051530Polymerase Enzymes And ReagentsFor Enhanced Nucleic Acid Sequencing)，以改变支化部分和易位(例如名称为“Engineering Polymerases And Reaction Conditions For Modified IncorporationProperties”的美国公开号20100075332)，以增加光稳定性(例如名称为“EnzymesResistant to Photodamage”的美国公开号20100093555)，并且以改善表面固定的酶活性(例如通过Hanzel等人的WO 2007/075987Active Surface Coupled Polymerases，以及通过Hanzel等人的WO 2007/076057Protein Engineering Strategies To OptimizeActivity Of Surface Attached Proteins)。在一些情况下，聚合酶进行修饰以便更有效地掺入所需的核苷酸类似物，例如，在其多磷酸酯链中具有四个或更多个磷酸酯的类似物。突变为更容易接受具有这种性质的核苷酸类似物的酶例如在下述中描述：上文描述的专利申请以及US 20120034602-Recombinant Polymerases for Improved Single MoleculeSequencing；US 20100093555-Enzymes Resistant to Photodamage；US 20110189659-Generation of Modified Polymerases for Improved Accuracy in Single MoleculeSequencing；US 20100112645-Generation of Modified Polymerases for ImprovedAccuracy in Single Molecule Sequencing；US 2008/0108082-Polymerase enzymes andreagents for enhanced nucleic acid sequencing；和US 20110059505-Polymerasesfor Nucleotide Analogue Incorporation，所述专利以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

适合于修饰的许多聚合酶是可用的，例如用于测序、标记和扩增技术。例如，人DNA聚合酶β可从R&D系统获得。DNA聚合酶I可得自Epicenter、GE Health Care、Invitrogen、New England Biolabs、Promega、Roche Applied Science、Sigma Aldrich以及许多其他公司。DNA聚合酶I的Klenow片段可以重组体和蛋白酶消化的形式两者得自例如Ambion、Chimerx、eEnzyme LLC、GE Health Care、Invitrogen、New England Biolabs、Promega、Roche Applied Science、Sigma Aldrich以及许多其他公司。Φ29NA聚合酶可得自例如Epicentre。聚A聚合酶、逆转录酶、测序酶、SP6DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和各种热稳定DNA聚合酶(Taq、热启动、钛Taq等)可得自各种这些和其它来源。最近的商业DNA聚合酶包括可得自New England Biolabs的Phusion^TM High-Fidelity DNA聚合酶；可得自Promega的Flexi DNA聚合酶；可得自Epicentre Biotechnologies的RepliPHI^TMΦ29 DNA聚合酶；可得自Stratagene的PfuUltra^TM Hotstart DNA聚合酶；可得自Novagen的KOD HiFi DNA聚合酶；以及其它许多聚合酶。Biocompare(dot)com提供了许多不同的商购可得的聚合酶的比较。

其为用于突变以改善所需性质(例如用于单一分子测序的优选底物的DNA聚合酶，包括例如Taq聚合酶、外切核酸酶缺陷型Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶1、Klenow片段、逆转录酶、Φ29相关聚合酶包括野生型Φ29聚合酶和这些聚合酶的衍生物，如外切核酸酶缺陷形式、T7DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、RB69聚合酶等。

在一个方面，用于本文所述的方法和组合物中的聚合酶是经修饰的Φ29型DNA聚合酶。例如，经修饰的重组DNA聚合酶可与野生型或外切核酸酶缺陷的Φ29DNA聚合酶同源，例如如美国专利号5,001,050、5,198,543或5,576,204中所述。可替代地，经修饰的重组DNA聚合酶可与其它Φ29型DNA聚合酶例如B103、GA-1、PZA、Φ15、BS32、M2Y、Nf、G1、Cp-1、PRD1、PZE、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17、Φ21等等同源。关于命名法，还参见Meijer等人(2001)“Φ29Family of Phages”Microbiology and Molecular Biology Reviews,65(2):261-287。合适的聚合酶在例如美国专利申请公开2007-0196846、2008-0108082、2010-0075332、2010-0093555、2010-0112645、2011-0189659、2012-0034602、2013-0217007、2014-0094374和2014-0094375中描述，所述专利各自以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

在进一步的实施例中，本文所述方法中使用的聚合酶包括RNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶。合适的逆转录酶包括HIV-1、M-MLV、AMV和端粒逆转录酶。逆转录酶还允许RNA底物如信使RNA、转移RNA、非编码RNA、核糖体RNA、微小RNA或催化性RNA的直接测序。

许多天然DNA聚合酶具有校对外切核酸酶功能，其在利用掺入事件的实时观察作为鉴定序列信息的方法(例如单一分子测序应用)的过程中可产生基本数据分析问题。即使当外切核酸酶活性在单一分子测序中不引入这些问题时，外切核酸酶活性的降低也是期望的，因为它可增加准确度(在某些情况下以读取长度为代价)。

相应地，用于上述技术中的聚合酶任选包括相对于亲本聚合酶降低或消除内源性外切核酸酶活性的一个或多个突变(例如取代、插入和/或缺失)。例如，相对于野生型Φ29DNA聚合酶，位置N62、D12、E14、T15、H61、D66、D169、K143、Y148和H149中的一个或多个任选突变，以降低重组Φ29聚合酶中的外切核酸酶活性。可降低重组Φ29聚合酶中外切核酸酶活性的示例性突变包括例如N62D、N62H、D12A、T15I、E14I、E14A、D66A、K143D、D145A和D169A取代，以及在C末端处外源特征(例如聚组氨酸标记)的添加。关于野生型Φ29聚合酶的序列，参见例如美国专利申请公开2014/0094375，其以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

应用：测序

本发明的方法、装置和组合物可特别用于对于单一分子测序方法，并且特别是通过实时掺入的单一分子测序，因为本公开内容的方法和组合物提供了有效建立由核酸(包括例如聚合酶组合物)占据的反应区的高密度阵列的方式。如上文讨论的，与在不存在缩合剂的情况下依赖扩散的通常加载方法中一般需要的相比，将核酸加载到阵列内更快速并且以更低浓度的输入样品完成。这些方法因此减少了建立用于在方法例如测序方法中的阵列所需的时间和资源。在具体实施例中，该方法导致加载反应区域阵列，使得单一核酸(或与核酸模板和任选的引物复合的单一聚合酶)占据多个反应区域，因此允许来自那些反应区域的单一分子测序。另外，如上文详述的，本发明的某些实施例提供了实现高密度单一分子加载的方式，其允许单一分子分析更有效且以更大速度进行，因为基材表面上存在更少的“不可用”区域用于测序反应(即，没有加载聚合酶组合物或加载多重聚合酶组合物的区域，其不提供信息(对于空白区域)或提供必须解卷积以解释多重加载分子的测序信息)。

序列分析可在核酸分配到阵列区域(以及它们在其中的任选固定)之后执行。如本文实施例所述，在确定核酸的序列之前，通常去除(例如通过用合适的缓冲液洗涤)缩合剂。

在一些方面，本发明包括分析模板核酸序列的方法。在这样的方面，序列分析通常在鉴定模板核酸的核苷酸序列中采用模板依赖性合成。采用模板依赖性合成的核酸序列分析鉴定了个别碱基或碱基群，因为它们在模板介导的合成反应例如引物延伸反应期间添加，其中碱基的身份需要与模板序列互补，在合成过程中引物序列与所述模板序列杂交。其它此类过程包括连接驱动过程，其中寡核苷酸或多核苷酸与潜在的模板序列复合，以便鉴定该序列中的核苷酸序列。通常，此类方法使用核酸聚合酶(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等等)或其它酶(例如在连接驱动过程的情况下)例如连接酶来酶促介导。

使用模板依赖性合成的序列分析可包括许多不同的过程。例如，在利用通过合成方法的序列的实施例中，当它们加入生长中的引物延伸产物时，个别核苷酸或核苷酸类似物被迭代地鉴定。

对于依赖监测将核苷酸掺入由复合物合成的生长中的新生链中的测序过程，通过这些步骤的反应进程可具有重要意义。特别地，对于某些“实时”核苷酸掺入监测方法，基于核苷酸在其最终掺入引物延伸产物内期间掺入且保留在合成复合物内的时间量，掺入事件的可检测性得到改善。例如，在某些示例性过程中，合成复合物中核苷酸的存在借助于对合成复合物的集中观察，或通过使用交互式标记技术来检测，当核苷酸在合成复合物内时，所述交互式标记技术产生特征性信号。参见例如Levene等人，Science299:682-686,January2003，以及Eid,J.等人，Science,323(5910),133-138(2009)，所述参考文献的全部公开内容以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

在进一步的方面，本发明的方法包括来自本领域已知的任何单一分子测序方法的步骤。参见例如Rigler等人，DNA-Sequencing at the Single Molecule Level,Journalof Biotechnology,86(3):161(2001)；Goodwin,P.M.等人，Application of SingleMolecule Detection to DNA Sequencing.Nucleosides&Nucleotides,16(5-6):543-550(1997)；Howorka,S.等人，Sequence-Specific Detection of Individual DNA Strandsusing Engineered Nanopores,Nature Biotechnology,19(7):636-639(2001)；Meller,A.等人，Rapid Nanopore Discrimination Between Single Polynucleotide Molecules,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,97(3):1079-1084(2000)；Driscoll,R.J.等人，Atomic-Scale Imaging of DNAUsing Scanning Tunneling Microscopy.Nature,346(6281):294-296(1990)。

在进一步的实施例中，本领域已知的单一分子测序的方法包括检测各个核苷酸，因为它们被掺入引物模板内，即通过合成的测序。在DNA聚合酶已形成完整的互补链后，此类方法通常利用外切核酸酶序贯释放各个荧光标记的碱基作为第二步。参见Goodwin等人，"Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing,"Nucleos.Nucleot.16:543-550(1997)。

一般而言，对于利用本发明组合物的测序方法，在支持物的分开的不连续区域内提供各个聚合酶组合物。例如，在一些情况下，可在各个约束结构包括纳米级结构例如纳米级孔内提供各个复合物。在进一步的例子中，零模式波导核心或上文在逐步测序节段中讨论的任何反应区域充当利用本发明组合物的测序方法的反应区域。用于固定其中的各个复合物的波导和方法的例子在例如公开的国际专利申请号WO 2007/123763中描述，所述专利的全部公开内容以引用的方式全文并入本文用于所有目的，并且特别用于将各个复合物提供到各个约束结构内相关的所有教导。在一些情况下，核酸(例如聚合酶/模板复合物)可提供在允许电子单一分子测序的结构或区域上或其附近。这种结构可包括纳米级电子结构，例如电极、电容器或场效应换能器(nanoFET)。NanoFET包括具有碳纳米管栅极的那些。这种结构及其用于单一分子测序的用途例如在美国专利申请公开号2015/0065353中描述，所述专利以引用的方式全文并入本文用于所有目的，并且特别用于与用于单一分子测序中结构相关的所有教导。

通过聚合酶掺入标记的核苷酸类似物可特别用于各种不同的核酸分析，包括DNA聚合的实时监测。标记本身可掺入，或者更优选地，可在类似物掺入期间释放。例如，可通过监测在通过聚合酶掺入类似物期间的标记释放来实时监测类似物掺入。掺入的类似物的一部分可与天然核苷酸相同，或者可包括与天然核苷酸不同的类似物的特征。

一般而言，标记掺入或释放可用于指示生长中的核酸链的存在和组成，例如，提供模板复制/扩增和/或模板序列的证据。来自掺入的信号传导可为检测标记基团的结果，所述标记基团例如在固相测定中从掺入的类似物中释放，或者可在掺入反应时出现。例如，在其中结合标记被淬灭且自由标记未被淬灭的FRET标记的情况下，标记基团从掺入的类似物中的释放可产生荧光信号。可替代地，可用接近活性位点的FRET对的一个成员标记该酶，并且掺入带有另一个成员的类似物允许掺入后的能量转移。例如，在核酸测序应用中使用酶结合的FRET组分在美国专利申请公开号2003/0044781中得到描述，所述专利以引用的方式并入本文。

在目的反应的一个例子中，可在极小的观察体积内分离聚合酶反应，其有效地导致各个聚合酶分子的观察。因此，掺入事件提供了容易与未掺入的核苷酸类似物区分的掺入的核苷酸类似物的观察。在一个优选方面，通过将聚合酶固定在光学约束例如零模式波导(ZMW)内来提供这样的小观察体积。关于ZMW及其在单一分子分析特别是核酸测序中的应用的描述，参见例如美国专利申请公开号2003/0044781和美国专利号6,917,726，所述专利各自以引用的方式全文并入本文用于所有目的。还参见Levene等人(2003)“Zero-modewaveguides for single-molecule analysis at high concentrations”Science 299:682-686,Eid等人(2009)“Real-time DNA sequencing from single polymerasemolecules”Science 323:133-138，以及美国专利号7,056,676、7,056,661、7,052,847和7,033,764，所述参考文献的全部公开内容以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

一般而言，聚合酶在一个或多个核苷酸和/或一个或多个核苷酸类似物的存在下与模板链复合。例如，在某些实施例中，存在标记的类似物，代表与四种天然核苷酸A、T、G和C各自的类似化合物，例如在分开的聚合酶反应如经典的桑格测序中，或复合在一起例如在单一反应如多路测序方法中。当模板链中的特定碱基在聚合反应期间被聚合酶遇到时，它与可用的类似物复合，所述类似物与这种核苷酸互补，并且将该类似物掺入新生且生长中的核酸链内。在一个方面，掺入可导致例如在聚磷酸盐类似物中的标记释放，在类似物中的α和β磷原子之间切割，并且因而释放标记基团(或其一部分)。借助于在复合物中类似物以及因此标记的更久存在，或者借助于将标记基团释放到周围介质内来检测掺入事件。当对于每种类型的类似物例如A、T、G或C使用不同的标记基团时，鉴定掺入的类似物的标记允许鉴定该类似物，并且因而确定在那时加工的模板链中的互补核苷酸。顺序反应和监测允许实时监测聚合反应和确定模板核酸的序列。如上所述，在特别优选的方面，提供固定在光学约束内的聚合酶/模板复合物，所述光学约束允许观察各个复合物，例如零模式波导。关于实时监测掺入磷酸盐标记的类似物的单一分子测序的另外信息，参见例如Eid等人(2009)“Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules”Science 323:133-138。

在第一示例性技术中，提供了固定在观察区域内的包括聚合酶、模板序列和互补引物序列的核酸合成复合物，所述观察区域允许包括复合物的小体积的照射和观察，而无周围体积的过度照射。通过仅照射和观察紧在复合物周围的体积，可容易地鉴定在该合成期间掺入的荧光标记的核苷酸，因为这样的核苷酸被聚合酶保留在该观察体积内的时间比简单地随机扩散进出该体积的那些核苷酸更长时期。特别地，当核苷酸被聚合酶掺入DNA内时，它保留在观察体积内延长时间段，并且在继续照射时产生延长的荧光信号。通过比较，随机扩散且未掺入的核苷酸保留在观察体积内短得多的时间段，并且因此仅产生瞬态信号，由于其极短的持续时间，所述瞬态信号中的许多未被检测到。

在特别优选的示例性系统中，通过使用被称为零模式波导(ZMW)的光学受限小孔阵列来提供受限照明体积。参见例如美国专利号6,917,726，所述专利以引用的方式全文并入本文用于所有目的。对于测序应用，通常提供固定在ZMW底部的DNA聚合酶，尽管复合物的另一组分(例如引物或模板)任选固定在ZMW的底部上以定位复合物。参见例如Korlach等人(2008)PNAS U.S.A.105(4):1176-1181和美国专利申请公开2008-0032301，所述参考文献各自以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

在操作中，荧光标记的核苷酸(例如对应于A、C、G和T的类似物)带有在末端磷酸盐部分上的一个或多个荧光染料基团，所述末端磷酸盐部分在引入时从核苷酸切割。因此，合成的核酸不带有荧光标记的积累，因为标记的聚磷酸盐基团在掺入相关核苷酸后从复合物扩散开，这些标记也不干扰掺入事件。参见例如Korlach等人(2008)Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids 27:1072-1083。

在第二示例性技术中，固定的复合物和待掺入的核苷酸各自提供有相互作用的标记组分。一旦掺入，携带标记组分的核苷酸就足够接近携带(或复杂的近端)标记组分的复合物，使得这些组分产生特征性信号事件。例如，聚合酶可提供有荧光团，所述荧光团对适当的受体荧光团提供荧光共振能量转移(FRET)。这些受体荧光团在待掺入的核苷酸上提供，其中每种类型的核苷酸带有不同的受体荧光团，例如其提供不同的荧光信号。在掺入时，供体和受体足够靠近在一起以生成能量传递信号。通过在不同类型的核苷酸上提供不同的受体标记，当掺入发生时，获得用于掺入每种类型的核苷酸的基于特征性FRET的荧光信号。

在相关方面，核苷酸类似物可包括两个相互作用的荧光团，其作为供体/猝灭剂对起作用，其中一个成员存在于核碱基或核苷酸的其它保留部分上，而另一个成员存在于磷酸基或掺入后释放的核苷酸的其它部分，例如末端磷酸基。在掺入之前，供体和猝灭剂在相同的类似物上足够接近，以提供特征性信号猝灭。在掺入和切割末端磷酸基(例如带有供体荧光团)后，去除猝灭，并且可观察到所得到的供体的特征性荧光信号。

在利用前述过程中，当掺入反应发生得太快时，则它可导致结合事件无法检测到，即事件速度超过监测系统的检测速度。掺入的核苷酸的错过检测可导致序列测定中错误率的增加，如实际序列中的遗漏一样。为了减轻由于短反应或产物释放时间的错过脉冲的可能性，在一个方面，本发明可导致在掺入循环期间的反应和/或产物释放时间增加。类似地，非常短的脉冲间距离偶尔可促使脉冲合并。如美国专利申请公开2009-0286245和2010-0112645中所述，采用具有降低的反应速率的聚合酶(例如显示出降低的速率和/或两个慢速动力学的聚合酶)的优点是较长的可检测结合事件的频率增加。该优点还可看作较长的可检测脉冲与较短的不可检测脉冲的比率增加，其中脉冲代表结合事件。

例如使用上述基材和本发明组合物的测序过程一般在荧光光学系统的背景下利用，所述荧光光学系统能够照射基材上的各种复合物，并且获得、检测和分开记录来自这些复合物的荧光信号。这样的系统通常采用一个或多个照明源，其对于使用的标记提供适当波长的激发光。光学串(optical train)引导在反应区域处的激发光，并且收集发射的荧光信号且将它们引导至合适的一个或多个检测器。光学串的另外部件可提供例如来自不同荧光标记的光谱不同信号的分开，以及这些分开的信号引导到单个检测器的不同部分或不同检测器。其它部件可提供光学信号的空间过滤，将激发光和或发射光聚焦到基材且引导到基材。示例性系统也在Lundquist等人，公开的美国专利申请号2007-0036511，OpticsLetters，第33卷，Issue 9，第1026-1028页中描述，所述参考文献的全部公开内容以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

荧光反射光学串可用于本发明系统的应用中。关于这种系统的优点的讨论，参见例如于2007年2月9日提交的美国专利申请号11/704,689、于2006年7月7日提交的11/483,413、以及于2007年2月9日提交的11/704,733，所述专利的全部公开内容以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

在本文所述的核酸测序方法的背景下，应了解，信号源各自表示测序反应，并且特别是聚合酶介导的模板依赖性引物延伸反应，其中在优选方面中，每个碱基掺入事件导致待掺入的四种差异标记的核苷酸之一的延长时间照射(或定位)，以便产生携带可区分的光谱轮廓或颜色的可识别脉冲(峰)。

在进一步的实施例中，本发明的方法和组合物用于利用纳米孔的测序方法中。在示例性实施例中，将单一核酸加载到多个纳米孔各自中。在某些实施例中，核酸附着至纳米孔附近。如应了解的，解旋酶和/或外切核酸酶以及聚合酶可用于纳米孔测序。这些酶与核酸的复合物可如本文详述的加载到纳米孔，并且复合物的核酸或酶组分可附着到纳米孔或接近纳米孔。纳米孔测序的方法是本领域已知的，并且公开于例如美国公开申请号2013/0327644和2014/0051068中，所述申请在此以引用的方式并入用于所有目的，并且特别是用于与纳米孔测序有关的所有教导、书面描述、附图和图例。

本文描述的方法还可包括计算机实现的过程，和/或指导这些过程的并入计算机可读介质上的软件，如下文更详细地阐述的。像这样，由上述反应和光学系统生成的信号数据被输入或以其它方式被接收到计算机或其它数据处理器内，并且经历下文阐述的各个处理步骤或组件中的一个或多个。一旦执行了这些过程，所得到的计算机实现过程的输出可以有形或可观察的格式产生，例如打印在用户可读的报告中，展示在计算机显示器上，或者它可存储在一个或多个数据库中用于随后的评估、加工、报告等等，或者它可由计算机保留或传输到不同的计算机用于配置后续反应或数据处理。

用于进行本发明的过程的计算机范围可从运行Intel Pentium或DuoCore处理器的PC或类型计算机到运行UNIX、LINUX、 或其它系统的工作站、实验室设备或高速服务器。本发明的逻辑处理可通过下述执行：完全通过执行软件和/或固件逻辑指令的通用逻辑处理器(例如CPU)；或完全通过并入实验室或诊断系统或照相机系统的专用逻辑处理电路(例如ASIC)，所述系统可能还包括软件或固件元件；或通过通用和专用逻辑电路的组合。信号数据的数据格式可包含任何方便的格式，包括基于数字图像的数据格式，例如JPEG、GIF、BMP、TIFF或其它方便的格式，同时可采用基于视频的格式，例如avi、mpeg、mov、rmv或其它视频格式。本发明的软件过程一般可以各种编程语言进行编程，所述编程语言包括例如Matlab、C、C++、C#、NET、Visual Basic、Python、JAVA、CGI等等。

在一些情况下，本发明的组合物、方法和系统可用作集成测序系统的部分，例如如US 20120014837-Illumination of Integrated Analytical Systems、US 20120021525-Optics Collection and Detection System and Method、US 20120019828-IntegratedAnalytical System and Method、61/660776filed 06/17/2012-Arrays of IntegratedAnalytical Devices and Methods for Production、以及US 20120085894-Substratesand Optical Systems and Methods of Use Thereof中描述的，所述专利以引用的方式全文并入本文用于所有目的。

在某些实施例中，本文所述的测序组合物将全部或部分以试剂盒形式提供，使得能够进行本文所述的过程。这样的试剂盒通常包含反应复合物的一种或多种组分，例如聚合酶和引物序列。如本文所述的方法中，这样的试剂盒通常还包括用于加载聚合酶和/或模板的缓冲液和试剂。试剂盒还任选包括用于根据本文所述的那些方法进行测序应用的其它组分。特别地，这样的试剂盒可包括用于观察如本文所述的各个反应复合物的ZMW阵列基材。

在进一步的示例性实施例中，本公开内容的试剂盒包括(单独或与上述试剂盒组分组合)用于在本文描述的加载方法中的组分。这样的组分可包括以任何组合的下述中的一种或多种：一种或多种核酸缩合剂(例如在制备的溶液中)、用于覆盖表面的标准缓冲液、高密度加载溶液、聚合酶、核酸模板、引物序列、用于清洁高密度加载溶液的颗粒、用于加载核酸的磁珠或其它颗粒、以及本文所述的与将聚合酶组合物加载到表面和/或进行测序反应相关的任何其它组合物。

除上文阐述的各种组分之外，试剂盒通常还包括用于以本文所述的量和/或比率组合各种组分的说明，以进行如本文中也描述或提及的所需过程，例如用于通过掺入反应和/或加载方法执行序列。

基材和表面

在本发明的方法中使用的基材是本领域已知且在本文中讨论的，并且如应了解的，本文讨论的任何基材都可以任何组合用于本文讨论的任何实施例。

在示例性实施例中，本发明的方法利用包括以阵列形式排列在惰性基材材料上的一个或多个反应区域(在本文中也称为“阵列区域”)的基材，所述基材在本文中也称为“固体支持物”或“表面”，其允许在限定的空间中的反应物(例如在测序反应中)组合。阵列可为规则的或不规则的，例如无规的。基材和阵列区域也可允许例如测序反应事件的检测。如上所述，核酸或聚合酶复合物可设置在反应区域中，使得各个核酸(或聚合酶反应)可独立地在光学上观察。反应区域可为基材材料上的局限性区域，其促进例如在核酸测序反应中反应物的相互作用。在某些实施例中，反应区域可为纳米级孔(在本文中也被称为纳米孔)，并且在进一步的实施例中纳米孔是ZMW。纳米级孔通常具有在纳米范围内即小于1微米的尺寸。在一些实施例中，纳米级孔具有小于1000、900、800、700、600或500nm，例如小于400、350、300、250或200nm的横截面直径。在一些实施例中，纳米级孔具有小于1000、900、800、700、600或500nm，例如小于400、350、300、250或200nm的深度。如本文讨论的，由本发明考虑的测序反应在一些实施例中可对众多个别核酸样品串联发生，特别是同时测序例如来源于基因组和染色体DNA的众多核酸样品。本发明的仪器因此可包括具有足够数目的阵列区域/反应区域的阵列，以进行如此众多的个别测序反应。在一个实施例中，阵列包含至少1,000个反应区域。在另一个实施例中，阵列包含大于400,000个反应区域，优选400,000至20,000,000个反应区域。在一个更优选的实施例中，阵列包含1,000,000至16,000,000个反应区域，例如1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000或5,000,000个反应区域。

阵列上的反应区域可采取在基材材料中具有宽度和深度的空腔或孔的形式，反应物可设置在所述空腔或孔内。一种或多种反应物通常在反应区域与基材材料结合，并且反应物的剩余部分在介质中，所述介质促进反应并且流过或接触反应区域。当形成为空腔或孔时，室优选具有足够的尺寸和次序，以允许(i)将必要的反应物引入室内，(ii)在室内发生反应，和(iii)抑制室之间的反应物混合。孔或空腔的形状优选为圆形或圆柱形，但可为多侧面的以便接近圆形或圆柱形形状。在另一个实施例中，孔或空腔的形状基本上是六边形的。该空腔可具有光滑的壁表面。在一个另外的实施例中，空腔可具有至少一个不规则的壁表面。空腔可具有例如平面底部或凹入底部。

在一些情况下，反应区域可采取纳米孔的形式。这样的反应区域包括纳米孔阵列是本领域已知的，并且例如在美国公开申请号2013/0327644和2014/0051068中描述，所述申请在此以引用的方式并入本文用于所有目的，且特别是用于与纳米孔阵列相关的所有教导。

任何材料都可用作固体支持物材料，只要表面允许核酸或聚合酶酶复合物的稳定附着以及核苷酸掺入的任选检测。固体支持物材料可为平面的或者可为空化的，例如在光纤的空化末端或微孔微蚀刻、模制或以其它方式微加工成的平面表面内，例如使用微机电系统构造中常用的技术。参见例如Rai-Choudhury,HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY,MICROMACHINING,AND MICROFABRICATION,VOLUME 1:MICROLITH OGRAPHY,Volume PM39,SPIEPress(1997)；Madou,CRC Press(1997),Aoki,Biotech.Histochem.67:98-9(1992)；Kane等人，Biomaterials.20:2363-76(1999)；Deng等人，Anal.Chem.72:3176-80(2000)；Zhu等人，Nat.Genet.26:283-9(2000)。在一些实施例中，固体支持物是光学透明的，例如玻璃。

合适的基材包括具有纳米级孔或零模式波导阵列的芯片。示例性的基材包括在基于二氧化硅的层上具有金属或金属氧化物层的基材，其中纳米级孔穿过金属或金属层设置到或进入基于二氧化硅的层内。这种基材例如在美国专利申请号10/259,268、14/187,198、14/107,730、13/920,037，以及美国专利号8,994,946、8,906,670、8,993,307、8,802,600、7,907,800和7,302,146中描述，所述专利以引用的方式全文并入本文用于所有目的，并且特别是用于与基材相关的所有教导。

实例

应理解，本文描述的例子和实施例仅用于示出的目的，并且根据其的各种修改或改变将由本领域技术人员建议，并且被包括在本专利申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。相应地，提供下述实施例以示出而不是限制本发明。

实例1：捕获引物中的柔性接头改善模板加载

产生如图1示意性示出的捕获引物，其包括分开且连接珠捕获聚A尾巴和与DNA模板互补的引发区域的六单元PEG间隔物(图2A)。还产生缺乏PEG间隔物的等价对照引物。对称的11kb SMRTbell^TM模板(包括双链中心区域和两个相同的单链发夹末端区域)与DNA聚合酶和引物复合，与聚-T包被的磁珠结合，并且使用动态磁场加载到ZMW内，如上文和美国专利号8,715,930中所述。

包括六单元PEG间隔物(18个原子，P18)的捕获引物在测序实验中显示出改善的DNA固定。如图3所示，与缺乏任何间隔物的捕获引物(C2V2)和11kb对称的SMRTbell^TM模板一起采用时相比，当采用包括P18间隔区的捕获引物时，有效单一加载的ZMW的数目更大。P18间隔区的包括增加了加载有单个聚合酶-模板复合物的ZMW的数目，并且得到的测序数据超过两倍，从19％到43％。

实例2：核酸缩合剂促进磁珠加载

如图4和表1所示，在核酸-聚合酶复合物的固定期间PEG的包括极大增加了有效加载的ZMW的数目。SMRTbell模板用与聚合酶复合的P18引物(上文描述)退火，并且根据对于MagBeads(Pacific Biosciences of California)公开的方案捕获至磁珠，除了在样品添加之前使用MagBead结合缓冲液洗涤珠，并且在样品添加之后用MagBead洗涤缓冲液洗涤两次，随后重悬浮于MagBead结合缓冲液中之外。根据公开的方案，在Sequel^TM系统(PacificBiosciences of California)上执行测序，具有下述改变：用含有PEG 8000(以所需最终浓度的两倍)和乙酸钾的稀释缓冲液替换稀释缓冲液。简言之，将含有PEG的稀释缓冲液加入ZMW芯片中。然后将具有附着的DNA聚合酶复合物的磁珠悬浮液加入芯片中；在这个点时，芯片上的混合物含有250mM乙酸钾和8％w/v PEG 8000。混合通过机器臂在芯片上执行，并且将芯片移动至磁珠加载站用于固定。

图4中所示的图包括采用两种不同洗涤条件(标准和温和)的测序运行(120分钟移动)的结果。对于两种类型的洗涤，将PEG包括在固定混合物中极大增加了加载的ZMW的数目。对于该实验，每个芯片加载10fmol的19kb对称SMRTbell^TM模板，所述模板与十倍过量的引物和聚合酶复合，具有120分钟加载时间。

在另一个实验中，每个芯片加载7.5、15或30fmol的15kb大肠杆菌SMRTbell^TM文库。如表1中可见，在15fmole样品输入时观察到15kb文库的39％加载。在固定混合物中包括PEG再次极大增加了加载的ZMW的数目。在等价投入量(30fmole)下，与缺乏PEG的对照相比，对于PEG条件观察到加载中大于20倍的增加。

表1.用PEG和经修饰的接头-引物加载15kb大肠杆菌文库。

除增加有效加载的ZMW孔的数目之外，PEG的包括也改善了DNA固定的均匀性。不受任何特定机制的限制，PEG在固定和后续洗涤步骤期间有效地防止表面干燥，并且这减少了在这种干燥事件期间的DNA损失和聚合酶失活。这也改善了总体固定性能。参见图5A和5B中呈现的数据；注意对照芯片中心的加载不足区域(图5A)。使用PEG，芯片的中心部分被均匀地加载(图5B)。

实例3：核酸缩合剂改善模板与珠的结合

在PEG的存在或不存在下，测量具有不同大小插入片段的SMRTbells^TM的珠结合效率。BWB指示MagBead洗涤缓冲液；BWB-PEG是包括12.5mM PEG 8000、400mM乙酸钾和0.05mM乙酸锶的可比较的缓冲液。

表2.珠结合效率(珠上回收的DNA％)

	48kλ	30k大肠杆菌	19k	15k大肠杆菌
					BWB	45％	69％	62％	79％
BWB-PEG	>98％**	>98％	>98％	>98％

**串珠后溶液中的DNA太少而无法通过Qubit^TM荧光测定法准确测量。

如表2中可见的，所有大小的DNA几乎全都被捕获在具有PEG存在的缓冲液中的珠上，而在不存在PEG的情况下的DNA回收较低，并且看起来与插入片段大小相关联(其中较大的尺寸一般减少回收)。

实例4：核酸缩合剂促进大模板的扩散加载

如图7所示，在聚合酶-模板复合物的固定期间包括核酸缩合剂促进将大DNA模板以低皮摩尔浓度加载到ZMW内。模板是SMRTbells^TM，包括19kb的质粒插入片段或48kb的λ插入片段。通过将模板之一与经修饰的Φ29聚合酶和P18引物(如本文所述)一起温育，然后清洁柱以去除过量的引物和/或游离聚合酶，来形成复合物。Sequel^TM芯片(Pacific Biosciences of California)任选用150μl乙醇洗涤三次，用150μl固定缓冲液洗涤四至五次，并且用在由Tris，pH 8缓冲的溶液中的100μl 10mM PEG 8000、250mM乙酸钾和0.15mM乙酸锶洗涤两次。将聚合酶-模板样品稀释到150μl最终体积的10mM PEG 8000、250mM乙酸钾和0.15mM乙酸锶内，充分混合，分配到ZMW芯片上，再次在芯片上混合，并且在湿度室中温育两小时。然后轻轻洗涤芯片并且在Sequel^TM系统(Pacific Biosciences of California)上执行测序。关于测序产率的数据(映射的读数，表示获得芯片上一百万个所示模板的测序数据的ZMW数目)显示于图7中。为了比较，在不存在缩合剂的情况下以相同浓度的相同大小模板的扩散加载导致可忽略不计的产率或不导致测序产率。

实例5：核酸缩合剂改善大模板的加载超过小模板的加载

如图8所示，在不同长度模板的混合群体的固定期间包含核酸缩合剂改善了较大模板的加载。聚合酶-模板复合物由不同大小的四种不同模板形成：250bp、2kb、19kb和48kb。将等摩尔量的四种模板混合，然后加入等体积的浓缩PEG溶液中。每种模板的最终浓度在由Tris，pH 8缓冲的150μl 10mM PEG 8000、250mM乙酸钾和0.15mM乙酸锶中为0.5pM(0.075fmol)。将Sequel^TM芯片(Pacific Biosciences of California)用PEG溶液洗涤，然后与混合样品一起温育一小时。关于测序产率的数据(映射读数，表示得到关于所示模板的测序数据的ZMW数目)显示于图8中。较大的19和48kb模板的加载有利地超过较小的250bp和2kb模板。

实例6：用于扩散加载的双股环状模板的制备

使用一种或多种适当的商购可得的内切核酸酶，将一个或多个随机或特异性切口位点或空隙位点引入双链环状DNA上(包括在大环状DNA例如质粒上)。当将多重缺口或空隙位点引入单一DNA分子上之时，它们之间的距离优选大于后续测序反应的预期读数长度，以确保测序不过早终止。接下来使模板和聚合酶在缓冲液中一起温育，以允许聚合酶与缺口或空隙位点结合。在一个例子中，模板和聚合酶以接近1:1的比率或在轻微模板过量(例如1.5:1)下混合，使得至多一个聚合酶分子可与带缺口或空隙的DNA环结合。在另一个例子中，聚合酶相对于模板处于高度过量(例如2:1、3:1或10:1)，并且剩余的游离的未结合的聚合酶通过清除程序去除，所述清除程序可涉及例如柱过滤、透析、磁珠或其组合。

然后将该模板-聚合酶复合物的溶液在PEG缓冲液(如上所述)中的ZMW芯片上温育，使得压实的模板-聚合酶复合物可加载到ZMW内且在底部表面处结合。在一个例子中，模板-聚合酶复合物的加载经由扩散发生。在另一个例子中，首先将模板-聚合酶复合物捕获到磁珠上，例如通过在PEG和阳离子的存在下珠表面上的核酸缩合，然后使珠结合的核酸-聚合酶复合物如上所述与基材接触。

在固定步骤结束时，PEG缓冲液被洗掉并且模板可解缩合。使用标准SMRT^TM测序方案(Pacific Biosciences of California)起始DNA延伸。

尽管前述发明已略微详细描述用于清楚和理解的目的，但对于本领域技术人员明确的是，根据本公开内容的阅读，可做出形式和细节中的各种改变，而不背离本发明的真正范围。例如，上文描述的所有技术和仪器都可以各种组合使用。本专利申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文件以引用的方式全文并入用于所有目的，其程度如同每个个别出版物、专利、专利申请和/或其它文件个别指出以引用的方式并入用于所有目的。

Claims (73)

1.一种用于将核酸分子分配到多个阵列区域内的方法，所述方法包括：

提供包括所述多个阵列区域的表面；和

使所述表面暴露于包含所述核酸分子和核酸缩合剂的溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸缩合剂包含聚乙二醇聚合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中使所述表面暴露于包含所述核酸分子和核酸缩合剂的溶液包括使所述表面暴露于包含所述核酸分子、聚乙二醇(PEG)和包含阳离子的盐的溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子包含蛋白质-核酸复合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述阵列区域包含纳米级孔或纳米孔。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子为长度至少10kb。

7.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括将所述核酸分子固定在所述阵列区域中。

8.一种用于将聚合酶-模板复合物分配到多个阵列区域内的方法，所述方法包括：

提供包括所述多个阵列区域的表面；和

使所述表面暴露于包含聚合酶-模板复合物、聚乙二醇(PEG)和包含阳离子的盐的溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含PEG 8000。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含2.5-25mM PEG 8000。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含5-15mM PEG 8000。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含一价阳离子。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含以50至500mM的一价阳离子。

14.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含以100至300mM的一价阳离子。

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含二价阳离子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶液包含以0.05至10mM的二价阳离子。

17.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含PEG 8000和K⁺。

18.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含PEG 8000、K⁺和Sr²⁺。

19.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含5-15mM PEG 8000和100-300mM K⁺。

20.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液包含5-15mM PEG 8000、100-300mM K⁺和0.05-0.3mM Sr²⁺。

21.根据权利要求8所述的方法，其中所述阵列区域包含纳米级孔。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述纳米级孔包括零模式波导(ZMW)。

23.根据权利要求8所述的方法，其中所述分配在约1-3小时内完成。

24.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板为长度至少约10kb。

25.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板为长度至少约20kb。

26.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板为长度至少约30kb。

27.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板为长度至少约40kb。

28.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板与引物杂交。

29.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括将所述聚合酶-模板复合物固定在所述阵列区域中。

30.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物与磁珠结合；其中所述阵列区域包含具有基部的纳米级孔，其中所述孔的基部具有与之结合的偶联剂；所述方法包括施加动态磁场以使溶液中的磁珠向下移动到所述表面的顶部，由此所述动态磁场也促使珠跨越所述表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与在纳米级孔的基部上的偶联剂结合。

31.根据权利要求8所述的方法，其中所述阵列区域包含纳米级孔，所述纳米级孔在其基部处包含偶联剂，其中所述聚合酶-模板复合物通过所述溶液扩散到所述纳米级孔的基部，并且与所述偶联剂结合，由此将所述聚合酶-模板复合物固定在所述纳米级孔中。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物中的模板具有不同的长度，其长度中的至少一个大于10kb；其中通过其长度大于10kb的固定的模板占据的纳米级孔的百分比等于或大于初始溶液中其长度大于10kb的模板的百分比。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物中的模板具有不同的长度，其长度中的至少一个大于20kb；其中通过其长度大于20kb的固定的模板占据的纳米级孔的百分比等于或大于初始溶液中其长度大于20kb的模板的百分比。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物中的模板包含第一模板，其长度为第二模板长度的至少20倍，其中固定的第一模板/固定的第二模板的比率等于或大于初始溶液中第一模板/第二模板的比率。

35.根据权利要求8所述的方法，所述方法包括将所述聚合酶-模板复合物固定在所述阵列区域中，其中所述阵列区域包含纳米级孔，其中在所述固定步骤之后，至少38％的所述纳米级孔被单一固定的聚合酶-模板复合物占据。

36.根据权利要求35所述的方法，其中至少50％的所述纳米级孔被单一固定的聚合酶-模板复合物占据。

37.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板各自包含双链中心区域和两个相同的单链发夹末端区域。

38.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合酶-模板复合物的模板包含带缺口或空隙的双链环状DNA分子。

39.一种用于将聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法，所述方法包括：

提供珠溶液，各个珠具有与之结合的多个聚合酶-核酸复合物；

在至少一种核酸缩合剂的存在下使所述溶液暴露于基材，其中所述基材包含零模式波导阵列，并且其中所述珠具有的直径大于所述零模式波导的最小横截面尺寸，所述基材包含用于将所述聚合酶-核酸复合物偶联至在所述零模式波导内的基材的偶联基团；和

施加场将珠下拉到所述基材，由此聚合酶-核酸复合物变得通过所述偶联基团与所述基材结合。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含PEG 8000。

42.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含一价阳离子。

43.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)和一价阳离子。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含PEG 8000和K⁺。

45.根据权利要求39所述的方法，所述方法还包括施加使所述珠跨越所述基材的所述表面移动的场。

46.根据权利要求45所述的方法，其中将所述珠下拉到所述基材的所述场和使所述珠跨越所述表面移动的所述场包括不同类型的场。

47.根据权利要求45所述的方法，其中将所述珠下拉到所述基材的所述场和使所述珠跨越所述表面移动的所述场包括相同类型的场。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述场包含磁场。

49.根据权利要求48所述的方法，其中使用相对于所述基材移动的一个或多个永磁体来施加所述磁场。

50.根据权利要求48所述的方法，其中使用一个或多个电磁体来施加所述磁场。

51.根据权利要求39所述的方法，其中所述场是磁场、电场或重力场。

52.根据权利要求39所述的方法，所述方法还包括从所述基材去除所述珠，将所述结合的聚合酶-核酸复合物留在所述基材上。

53.根据权利要求39所述的方法，其中所述零模式波导的一部分具有与之附着的单一聚合酶-核酸复合物。

54.根据权利要求39所述的方法，其中所述珠的直径比所述零模式波导的最小横截面尺寸大2倍或更多倍。

55.根据权利要求39所述的方法，其中所述珠的直径比所述零模式波导的最小横截面尺寸大2倍至10,000倍。

56.根据权利要求39所述的方法，其中所述零模式波导是圆柱形的，并且所述最小横截面尺寸是所述零模式波导的直径。

57.根据权利要求39所述的方法，其中提供所述珠溶液包括在PEG和阳离子的存在下使珠暴露于聚合酶-核酸复合物。

58.一种用于将聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法，所述方法包括：

提供具有与之结合的聚合酶-核酸复合物的磁珠溶液，每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和模板核酸；

在至少一种核酸缩合剂的存在下，使磁珠溶液与包含具有基部的纳米级孔阵列的基材的顶部接触，其中所述孔的基部具有与之结合的偶联剂，其中所述珠具有的直径大于所述纳米级孔的最小横截面尺寸；和

施加动态磁场以将溶液中的磁珠向下移动到基材的顶部，由此所述动态磁场也促使所述珠跨越所述基材的顶表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与在纳米级孔的基部上的偶联剂结合。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇(PEG)。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含PEG 8000。

61.根据权利要求58所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含一价阳离子。

62.根据权利要求58所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含聚乙二醇和一价阳离子。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述至少一种核酸缩合剂包含PEG 8000和K⁺。

64.根据权利要求58所述的方法，其中每种聚合酶-核酸复合物包含所述聚合酶、所述模板核酸和引物。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述引物包含i)与寡核苷酸互补的5'检索序列，所述寡核苷酸附着至所述磁珠，和ii)与所述模板核酸互补的3'引发序列。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述检索序列和引发序列通过柔性亲水性接头连接。

67.根据权利要求65所述的方法，其中所述检索序列和引发序列通过PEG接头连接。

68.根据权利要求65所述的方法，其中所述检索序列包含聚(dA)或聚(A)，并且附着至所述磁珠的所述寡核苷酸包含聚(dT)或聚(T)。

69.根据权利要求58所述的方法，其中所述纳米级孔是圆柱形的，并且所述最小横截面尺寸是所述纳米级孔的直径。

70.一种用于将聚合酶-核酸复合物加载到基材上的方法，所述方法包括：

提供具有与之结合的聚合酶-核酸复合物的磁珠溶液，每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和模板核酸，其中所述聚合酶-核酸复合物通过捕获寡核苷酸与所述模板核酸上的序列杂交与所述珠结合，其中所述捕获寡核苷酸包含i)与附着至所述磁珠的寡核苷酸互补的检索序列，ii)与所述模板核酸互补的捕获序列，和iii)将所述检索序列和所述捕获序列连接的柔性亲水性接头；

使所述磁珠溶液与包含具有基部的纳米级孔阵列的基材的顶部接触，其中所述孔的基部具有与之结合的偶联剂，其中所述珠具有的直径大于所述纳米级孔的最小横截面尺寸；和

施加动态磁场以将溶液中的磁珠向下移动到基材的顶部，由此所述动态磁场也促使所述珠跨越所述基材的顶表面移动，由此一些聚合酶-核酸复合物变得与在纳米级孔的基部上的偶联剂结合。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述检索序列和所述捕获序列通过PEG接头连接。

72.根据权利要求70所述的方法，其中每种聚合酶-核酸复合物还包含与所述模板核酸杂交的引物。

73.根据权利要求70所述的方法，其中所述捕获序列位于所述捕获寡核苷酸的3'末端处并且充当引发序列。