CN110231392B - 基于dna四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测方法 - Google Patents

基于dna四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法及其使用的DNA四面体。本发明所述的方法包括：制备具有三维空间结构的DNA四面体：所述DNA四面体由四片核酸瓦片杂交合成，所述核酸瓦片由第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸杂交合成；DNA四面体与待测蛋白质分子连接；采用固态纳米孔检测平台进行检测；本发明克服了单分子蛋白质在应用纳米孔传感器检测时过孔速度过快的缺陷，增加检测信号的电流变化幅值，克服检测过程中蛋白质团聚的发生，样品消耗量小，检测的灵敏度高。

Description

基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测方法
技术领域
本发明属于固态纳米孔单分子检测方法及其使用的载体，具体涉及一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法及DNA四面体。
背景技术
在过去的二十几年里，纳米孔传感技术由于其较高的灵敏度及其功能的多样性已经受到了越来越广泛的关注。纳米孔传感器的检测原理来源于库尔特计数器。纳米孔传感器采用电阻脉冲传感作为检测方案，通常为在生物膜或人工合成的绝缘薄膜上存在纳米尺度的孔或通道，该绝缘薄膜将电解质溶液流体池隔离成两个独立的离子池，即顺式腔(Cis)与反式腔(Trans)并保证薄膜上的纳米尺度孔为唯一的离子通道。两个Ag/AgCl 电极分别插入薄膜两侧的离子池中，当一个稳定的偏置电压施加在两侧后，一个跨膜的稳定离子电流将会产生。当向腔室加入携带电荷的分析物分子后，由于静电力作用，该分子会穿过薄膜上的纳米孔通道或与孔壁作用，此时会出现瞬时的电流阻塞现象，根据检测分析的电流阻塞幅值与易位时间，能够得到分析物分子的物理化学性质(尺寸、形状、携带电荷量等)。根据其组成材料的不同，纳米孔传感器大体上分为两大类：生物纳米孔与固态纳米孔。生物纳米孔又可以称其为跨膜通道蛋白质，通常将其组装在磷脂双分子层基底上使用。目前应用比较广泛的通道蛋白大体上包括：α-溶血素蛋白(α-HL)、耻垢分枝杆菌蛋白(MspA)、气单胞菌溶素蛋白(AeL)、噬菌体phi29蛋白(Phi29)。由于其原子级精度的结构重复性以及分子尺度的孔径尺寸，生物纳米孔通常被用作对金属离子、小分子、DNA链、小蛋白质与多肽链以及与基因测序相关的核苷酸序列识别等相关检测。
尽管生物纳米孔具有诸多优点，但是由于其孔与膜的稳定性较差，对工作条件如pH 值，温度，溶液离子浓度都有较高的要求，同时通道蛋白所插入的磷脂双分子层结构稳定差，使得生物纳米孔的应用受到了极大的限制。采用固态纳米孔对单分子蛋白质检测主要依靠对蛋白质分子的过孔易位行为的检测，但由于蛋白质分子过孔速度过快的特点，易位信号的采集及电流变化幅值很低，同时，蛋白质分子很容易发生团聚，因此，在采用常规固态纳米孔对其进行传感检测时，很难保证为单个蛋白质分子易位，使得应用固态纳米孔对蛋白质的研究面临着很大的挑战。因此，提出一种具有信号放大，增加易位事件检测率的固态纳米孔单分子传感方法很有必要，以克服当前单分子蛋白质纳米孔传感的不足。
发明内容
发明目的：本发明提供一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法。本发明的另一目的是提供了用于固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大的载体复合物。
技术方案：本发明所述的一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，包括以下步骤：
(1)制备具有三维空间结构的DNA四面体：所述DNA四面体由四片核酸瓦片杂交合成；所述核酸瓦片由第一单链核酸、第二单链核酸及第三单链核酸杂交合成；所述第一单链核酸序列由78个碱基组成，所述第一单链核酸序列如SEQ ID NO：1，所述第二单链核酸序列由42个碱基组成，所述第二单链核酸序列如SEQ ID NO：2，所述第三单链核酸序列由31个碱基组成，所述第三单链核酸序列的5’末端修饰有一个羧基基团，所述第三单链核酸序列如SEQ ID NO：3；
(2)DNA四面体与待测蛋白质分子连接：将步骤(1)中制备的DNA四面体与 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入所述待测蛋白质分子，形成DNA四面体与蛋白质复合物；
(3)采用固态纳米孔检测平台进行检测：将步骤(2)中所得的DNA四面体与蛋白质复合物溶液加入到固态纳米孔检测平台进行检测。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：步骤(1)中，将所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸溶解于Tris-镁盐缓冲液(TM Buffer)中进行杂交，所述第一单链核酸、第二单链核酸及第三单链核酸的摩尔浓度比为1:3:3。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：所述核酸瓦片杂交的方法为：先将所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸混合后放于95℃处理10min，之后于55℃放置1h，放于室温48h。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：所述第一单链核酸的浓度为70nM，所述第二单链核酸的浓度为210 nM，所述第三单链核酸的浓度为210nM。
上述三种单链核酸溶液在具体应用时，总体积优选为100μl。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：步骤(2)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述 N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:3。
上述DNA四面体与蛋白质连接的具体步骤可为：将DNA四面体加入400μl MES 缓冲液，至终体积为500μl，加入4mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 6mg的N-羟基琥珀酰亚胺，25℃放置15min，加入500μl的所述待测蛋白质分子，所述待测蛋白质分子浓度为500ng/ml，25℃放置3h。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：步骤(3)中，所述采用固态纳米孔检测平台进行检测，包括将所述 DNA四面体与蛋白质复合物溶液加入到固态纳米孔检测平台的检测池的一侧流道内，将一对Ag/AgCl电极分别浸入所述检测池流道内的电解质溶液中，施加300～900mV 的跨膜电压，采集电流阻断信号。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：所述固态纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用特氟龙检测池，检测池上具有直径为1mm流体通道，将带有纳米尺度孔洞的固态纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到检测池的流道内，形成固态纳米孔检测平台。
作为本发明所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法的一个优选方案：所述固态纳米孔芯片为直径为40nm的氮化硅纳米孔芯片，将所述氮化硅纳米孔芯片用体积比为3:1的H2SO4溶液与H2O2的混合溶液处理，80℃浸泡30 min，清洗，氮气吹干。
本发明中所述的用于固态纳米孔单分子蛋白质检测信号的DNA四面体，所述DNA四面体由四片核酸瓦片杂交合成，形成四面体结构；所述核酸瓦片由第一单链核酸、第二单链核酸及第三单链核酸杂交合成；所述第一单链核酸序列由78个碱基组成，所述第一单链核酸序列如SEQ ID NO：1，所述第二单链核酸序列由42个碱基组成，所述第二单链核酸序列如SEQ ID NO：2，所述第三单链核酸序列由31个碱基组成，所述第三单链核酸序列的5’末端修饰有一个羧基基团，所述第三单链核酸序列如SEQ ID NO：3。
作为本发明所述的用于固态纳米孔单分子蛋白质检测信号的DNA四面体的一个优选方案：所述第一单链核酸、第二单链核酸及第三单链核酸的摩尔浓度比为1:3:3。
本发明制备的DNA四面体由于羧基基团，可作为载体，与待检测的蛋白质连接，形成DNA四面体与蛋白质复合物，克服检测过程中蛋白质团聚的发生，且DNA四面体与蛋白质复合物能够使得单分子蛋白质易位事件的电流变化幅值增大1.3倍。
有益效果：本发明基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，操作简单高效，无需标记，克服了单分子蛋白质在应用纳米孔传感器检测时过孔速度过快的缺陷，增加检测信号的电流变化幅值，克服检测过程中蛋白质团聚的发生，样品消耗量小，检测的灵敏度高。本发明能准确、实时实现对单分子蛋白质的检测，对生命科学研究中的单分子检测具有重要的指导意义。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的DNA四面体的透射电镜表征图；
图2为本发明实施例2制备的DNA四面体结合蛋白质复合物示意图；
图3为本发明基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测原理图；
图4为本发明实施例2制备的DNA四面体结合蛋白质复合物与未结合DNA四面体的蛋白质在500mV电压时电流变化分布图；
图5为本发明实施例2制备的DNA四面体结合蛋白质复合物与未结合DNA四面体的蛋白质在700mV电压时电流变化分布图；
图6为本发明实施例2制备的DNA四面体结合蛋白质复合物与未结合DNA四面体的蛋白质在900mV电压时电流变化分布图；
图7为对照1DNA四面体的透射电镜表征图。
具体实施方式
实施例1：DNA四面体的制备：
本发明采用序列L，M，S三条ssDNA DNA四面体(序列L见表1中的SEQ ID NO： 1，序列M见表1中的SEQ ID NO：2，序列S见表1中的SEQ ID NO：3)
制备的DNA四面体，该DNA四面体具有三维空间结构的DNA四面体纳米结构。
具体制备方法为：
(1)将序列L，M，S三条ssDNA分别溶解在1×TE Buffer(10mM Tris，1mM EDTA， pH8.0)中。按照要求体积加入缓冲液，使终浓度分别都为100μM(室温)；
(2)取浓度为100μM的L链10μl溶解在90μl 1×TE缓冲液中，L链的浓度为 10μM作为母液保存；再取10μl加入缓冲液稀释至1μM；
取浓度为100μM的M链10μl溶解在90μl 1×TE缓冲液中，M链的浓度为10μM 作为母液保存；再取10μl加入缓冲液稀释至1μM；
取浓度为100μM的S链10μl溶解在90μl 1×TE缓冲液中，S链的浓度为10μM 作为母液保存；再取10μl加入缓冲液稀释至1μM；
(3)取上述浓度为1μM的L链7μl，M链21μl，S链21μl溶解在51μl TM缓冲液中。最终浓度为L链：70nM，M链：210nM，S链：210nM，体积为100μl；
(4)将上述样品混合液放在PCR仪设置温度95℃10min。取出放在水浴锅中 55℃1h，取出放在室温(～25℃)48h，得DNA四面体，所得的DNA四面体的透射电镜图见图1，然后在4℃中保存。
表1 本发明中采用的ssDNA序列
Figure BDA0002155519220000051
实施例2：DNA四面体与蛋白质复合物的制备：
(1)将实施例1制备的DNA四面体溶液溶解在400μl MES缓冲液中(pH 5.5)(激活DNA四面体上修饰的羧基基团)至终体积为500μl；(2)配制蛋白质溶液：将辣根过氧化物酶(HRP)干粉状样品溶解在PBS缓冲液中(pH 7.5)至终体积为500μl，浓度为500ng/ml，4℃中保存，待用。
(3)DNA四面体与蛋白质分子连接：
取4mg EDC加入到上述500μl溶液中，再取6mg NHS加入到上述溶液中，将上述混合物体系放置在25℃，15min；
将500μl辣根过氧化物酶溶液加入到处理后的溶液中，将其混合25℃3h。DNA 四面体结构会与辣根过氧化物酶结合，取出后在4℃中保存，待用。
制备所得DNA四面体与蛋白质复合物，该结构见图2所示，图2DNA四面体301 通过羧基与蛋白质302连接后，解决了蛋白质分子容易团聚的缺点，可以保证固态纳米孔对蛋白质检测时，保证单个蛋白质分子易位。
实施例3：固态纳米孔检测平台进行检测
(1)搭建固态纳米孔检测平台
①取直径为40nm的氮化硅(Si3N4)纳米孔芯片，将其用新配置的食人鱼溶液(VH2SO4：VH2O2＝3：1)处理，浸泡在其中80℃，30min。然后用超纯水清洗3次，并用氮气吹干；
②将处理后的芯片安装在检测池中，将电解质溶液0.1M KCl溶液加入到检测池的流道内，确保纳米孔为唯一的电解质连通通道，从而形成固态纳米孔检测平台。
利用固态纳米孔检测平台进行单分子蛋白质检测的原理图见图3。
(2)采用固态纳米孔检测平台进行检测：
①将氮化硅纳米孔检测平台放置在双层法拉第笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统；
②将实施例2配制好的辣根过氧化物酶溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于辣根过氧化物酶在pH 7.5条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保蛋白质分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
③清洗氮化硅纳米孔芯片，并重新安装至流体池中，并放置在双层法拉第笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统；
④将配制好的辣根过氧化物酶与DNA四面体结合的复合物溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于该复合物显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
电流阻断信号分析：
对采集到的单分子易位信号的阻断电流进行解析。对于电流阻断幅值：辣根过氧化物酶与DNA四面体结合的复合物的幅值约为辣根过氧化物酶分子的1.3倍。进一步对不同电压下的电流变化进行测试：
图4为500mV电压电流变化分布图，从图4中可看出：
HRP过孔：电流变化为76.38pA；
DNA四面体+HRP过孔：电流变化为97.06pA；
图5为700mV电压电流变化分布图，从图5中可看出：
HRP过孔：电流变化为86.06pA；
DNA四面体+HRP过孔：电流变化为125.47pA；
图6为900mV电压电流变化分布图，从图6中可看出：
HRP过孔：电流变化为235.09pA；
DNA四面体+HRP过孔：电流变化为260.10pA；
从以上数据中可知：绑定有DNA四面体的HRP蛋白质过孔检测电流变化幅值是 HRP蛋白质过孔检测的1.3倍。
对照1：不同核酸单链配比对本发明的影响
取浓度为100μM的L链10μl溶解在90μl 1×TE缓冲液中，L的浓度为10μM作为母液保存。再取10μl加入缓冲液稀释至1μM；
取浓度为100μM的M链10μl溶解在90μl 1×TE缓冲液中，M的浓度为10μM作为母液保存。再取10μl加入缓冲液稀释至1μM；
取浓度为100μM的S链10μl溶解在90μl 1×TE缓冲液中，S的浓度为10μM作为母液保存。再取10μl加入缓冲液稀释至1μM；
取上述浓度为1μM的L 21μl，M 21μl，S 21μl溶解在37μl TM缓冲液中。最终浓度为L：210nM，M：210nM，S：210nM,体积为100μl；(摩尔浓度比为1:1:1)；
将上述样品混合液放在PCR仪设置温度95℃10min。取出放在水浴锅中55℃1 h，取出放在室温(～25℃)48h。然后在4℃中保存。
将合成的DNA四面体用透射电镜进行表征，表征图如图7。从图7中可见使用该摩尔浓度比合成的DNA四面体的均一性较差。
序列表
<110> 东南大学
<120> 基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法及DNA四面体
<150> 2018112653859
<151> 2018-10-29
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcaccatc gtaggtttaa cttgccaggc accatcgtag gtttaacttg ccaggcacca 60
tcgtaggttt aacttgcc 78
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagcaacctg cctggcaagc ctacgatgga cacggtaacg cc 42
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttaatttt ttaccgtgtg gttgctaggc g 31

Claims (6)

1.一种基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备具有三维空间结构的DNA四面体，所述DNA四面体由四片核酸瓦片杂交合成：将第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸溶解于Tris-镁盐缓冲液中进行杂交；所述第一单链核酸的浓度为70 nM，所述第二单链核酸的浓度为210 nM，所述第三单链核酸的浓度为210 nM；所述核酸瓦片由第一单链核酸、第二单链核酸及第三单链核酸杂交合成；所述第一单链核酸序列由78个碱基组成，所述第一单链核酸序列是SEQ ID NO：1，所述第二单链核酸序列由42个碱基组成，所述第二单链核酸序列是SEQ ID NO：2，所述第三单链核酸序列由31个碱基组成，所述第三单链核酸序列的5’末端修饰有一个羧基基团，所述第三单链核酸序列是SEQ ID NO：3；
（2）DNA四面体与待测蛋白质分子连接：将步骤（1）中制备的DNA四面体与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入所述待测蛋白质分子，形成DNA四面体与蛋白质复合物；
（3）采用固态纳米孔检测平台进行检测：将步骤（2）中所得的DNA四面体与蛋白质复合物溶液加入到固态纳米孔检测平台进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，其特征在于，所述核酸瓦片杂交的方法为：先将所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸混合后放于95 ℃处理10 min，之后于55 ℃放置1 h，放于室温48 h。
3.根据权利要求1所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，其特征在于，步骤（2）中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:3。
4.根据权利要求1所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，其特征在于，步骤（3）中，所述采用固态纳米孔检测平台进行检测，包括将所述DNA四面体与蛋白质复合物溶液加入到固态纳米孔检测平台的检测池的一侧流道内，将一对Ag/AgCl电极分别浸入所述检测池流道内的电解质溶液中，施加300～900mV的跨膜电压，采集电流阻断信号。
5.根据权利要求1所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，其特征在于，所述固态纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用特氟龙检测池，检测池上具有直径为1 mm流体通道，将带有纳米尺度孔洞的固态纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到检测池的流道内，形成固态纳米孔检测平台。
6.根据权利要求5所述的基于DNA四面体的固态纳米孔单分子蛋白质检测信号放大方法，其特征在于，所述固态纳米孔芯片为直径为40 nm的氮化硅纳米孔芯片，将所述氮化硅纳米孔芯片用体积比为3:1的H2SO4溶液与H2O2的混合溶液处理，80 ℃浸泡30 min，清洗，氮气吹干。
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