CN111088154A - 一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法 - Google Patents
一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种石墨烯纳米孔测序仪,包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台;所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上,所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上,所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内;所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体;所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通,所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。本发明的石墨烯纳米孔测序仪能实现纳米孔精确寻址及单DNA分子可控过孔,用于降低DNA分子的过孔速度和抑制纳米孔中的DNA位移热运动,为实现单碱基测序提供新方法。
Description
技术领域
本发明涉及单分子控制领域及分子检测领域,具体涉及一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法。
背景技术
目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的MinION,GridION和PromethION三款不同类型测序仪器。ONT测序的特点是单分子测序,测序读长长,测序速度快,测序数据实时监控,机器便携等。2018年自然杂志上发表了许多里程碑式的纳米孔测序文章:直接RNA测序文章、首个纳米孔人类基因组测序文章,展示迄今为止使用单一测序技术完成的最完整的基因组。然而,以上实验大部分是使用ONT公司MinION检测得到的实验结果,而ONT公司仪器使用的都是生物纳米孔技术。生物纳米孔具有寿命短、抗化学、机械性能差等缺点。而固态纳米孔相对生物纳米孔在成本、使用寿命、机械性能等方面具有十分巨大的优势。然而,目前尚无课题组使用固态纳米孔完成测序工作。
固态纳米孔测序面临的挑战主要有:一、时间分辨率,在电场的作用下,DNA过孔速度太快难以采集足够的有效数据点;二、空间分辨率,相邻碱基距离仅为0.34nm,要实现单碱基分辨率纳米孔厚度必需小于0.34nm,并且需要确保仅有单条DNA链通过纳米孔,防止其他DNA链对碱基数据信息采集的干扰,与此同时,需要帮助单条DNA链在其链长范围内找到纳米孔位置,使DNA链能够顺利穿过纳米孔,实现碱基信号采集。
发明内容
为了解决上述现有的固态纳米孔测序在时间分辨率以及空间分辨率所面临的难题,本发明提供了一种石墨烯纳米孔测序仪及其测序方法,实现纳米孔精确寻址及单DNA分子可控过孔,用于降低DNA分子的过孔速度和抑制纳米孔中的DNA位移热运动,为实现单碱基测序提供新方法。
为解决上述技术问题,本发明提供以下技术方案:
一种石墨烯纳米孔测序仪,包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台;所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上,所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上,所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内;所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体;所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通,所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。
进一步的,所述探针纳米运动平台的纵向闭环行程大于25μm,其闭环分辨率小于0.3nm;所述三维纳米运动平台的三维方向闭环行程X/Y/Z均大于10μm,其闭环分辨率小于5nm,控制效果更好,控制精度更高。
进一步的,所述AFM探针包括基体、金修饰层、金表面以及隔离层;所述金修饰层通过薄膜沉积技术包覆在所述基体的外侧表面,所述隔离层通过薄膜沉积技术包覆在所述金修饰层的外侧表面,所述金表面通过微纳加工制造技术刻蚀在所述AFM探针的尖端处并刻穿所述隔离层,所述金表面与所述DNA四面体相连,能够更好地进行测序。
进一步的,所述DNA四面体的棱长为10bp~50bp,即3.4nm~17nm,DNA四面体用于捕获单条DNA链,这样的设计能够更好地进行测序。
进一步的,所述金修饰层的厚度为30~100nm;所述隔离层的厚度为10~50nm;所述金表面的直径大于所述DNA四面体的棱长,能够更好地进行测序。
进一步的,所述纳米孔芯片的材料为石墨烯或氮化硼或二硫化钼,所述纳米孔的直径小于5nm,测序更加精确。
进一步的,所述疏水液池的材料为特氟龙,稳定性高。
进一步的,所述磁珠为链霉亲和素磁珠,能够更好地进行测序。
一种基于上述石墨烯纳米孔测序仪的纳米孔测序方法,包括以下步骤:
S1、将处理好且未修饰的DNA四面体的AFM探针装夹在探针纳米运动平台上;
S2、扫描实验区域精确定位纳米孔后固定AFM探针位置;
S3、注入修饰溶液,使AFM探针的针尖依次组装与捕获DNA四面体和待测DNA,探针下行使DNA四面体上修饰链过孔,通过阻塞电流确定DNA四面体是否成功修饰,修饰成功后再绑定待测DNA;
S4、在纳米孔芯片上下方注入测试液,并在纳米孔芯片下方布置链霉亲和素磁珠;
S5、在纳米孔两侧施加电压驱动AFM探针尖端表面待测DNA穿过纳米孔,并被下方磁珠表面链霉亲和素所捕获,在电场力的作用下,将待测DNA拉直;
S6、通过控制探针纳米运动平台,实现AFM探针垂直向下移动,实现DNA测序。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、纳米孔位置实现精确定位,本发明中可利用原子力显微镜原理对纳米孔位置进行精确寻址,保证了DNA通过纳米孔的前提条件;
2、单分子限位亚纳米操控与测序分辨率高,单个DNA四面体、磁珠、单链DNA分子和AFM探针的可控精确组装,解决了传统纳米孔测序遇到的时间分辨率低的问题,同时,采用高精密速度控制的纳米定位技术实现DNA在纳米孔内运动的主动控制,控制了单碱基穿过纳米孔的速率,提高纳米孔测序遇到的信号的精确度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据附图获得其他的附图。
图1为本发明一种石墨烯纳米孔测序仪的结构示意图;
图2为本发明中的AFM探针结构示意图;
图3为本发明一种石墨烯纳米孔测序方法原理示意图;
图4为本发明一种石墨烯纳米孔测序方法步骤流程图;
图5为本发明一种石墨烯纳米孔测序方法步骤示意图。
图中:
1 探针纳米运动平台
2 AFM探针
20 探针基体
21 金修饰层
210 金表面
22 隔离层
23 DNA四面体
3 纳米孔芯片
30 纳米孔
4 疏水液池
5 三维纳米运动平台
6 待测DNA
7 磁珠
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例包括:
实施例一:
如图1-3所示,一种石墨烯纳米孔测序仪,包括探针纳米运动平台1、AFM探针2、纳米孔芯片3、疏水液池4以及三维纳米运动平台5;AFM探针2装夹在探针纳米运动平台1上,疏水液池4固定在三维纳米运动平台5上,纳米孔芯片3安装在疏水液池4内;AFM探针2的针尖设置有DNA四面体23;纳米孔芯片3上刻蚀有固态纳米孔30且疏水液池4内部的溶液通过纳米孔30连通,纳米孔30下方的溶液内设置有若干颗磁珠7。
在本实施例中,探针纳米运动平台1的纵向闭环行程大于25μm,其闭环分辨率小于0.3nm;三维纳米运动平台5的三维方向闭环行程X/Y/Z均大于10μm,其闭环分辨率小于5nm,控制效果更好,控制精度更高。
如图2所示,AFM探针2包括基体20、金修饰层21、金表面210以及隔离层22;金修饰层21通过薄膜沉积技术包覆在基体20的外侧表面,隔离层22通过薄膜沉积技术包覆在金修饰层21的外侧表面,金表面210通过微纳加工制造技术刻蚀在AFM探针2的尖端处并刻穿隔离层22,金表面210与DNA四面体23相连,能够更好地进行测序。
在本实施例中,AFM探针2的具体制作方法如下:首先,提供一根AFM探针2的基体20;然后,利用薄膜沉积技术在其探针尖端一面沉积金修饰层21;接着,再次利用薄膜沉积技术在镀金探针表面沉积隔离层22;随后,利用微纳加工制造技术切割探针尖端隔离层22,直至露出足够范围的金表面210;最后DNA四面体23与AFM探针2的金表面210自组装,探针基体20是硅探针或氮化硅探针,针尖形状是四面体形或圆锥形。
在本实施例中,金修饰层21的薄膜沉积方法为原子层沉积、磁控溅射、电子束蒸发或其他薄膜制造方法中的一种,厚度为30~100nm,制作质量更好。
在本实施例中,隔离层22的薄膜沉积方法为原子层沉积、化学气相沉积、溅射沉积、氧化、电镀或其他薄膜制造方法中的一种,隔离层22材料为氧化铝、氧化钛、氮化硅或其他不与巯基偶联的材料中的一种,厚度为10~50nm,制作质量更好。
在本实施例中,金表面210的直径大于DNA四面体23的棱长,能够更好地进行测序。
在本实施例中,微纳加工制造技术为聚焦离子束、高能电子束、激光或其他加工制造方法中的一种,刻蚀面积半径为2~20nm,刻蚀深度为10~100nm,要求刻穿隔离层22且保留金修饰层21。
在本实施例中,DNA四面体23棱长为10bp~50bp,即3.4nm~17nm;其中,DNA四面体23三顶点修饰有巯基,余下一顶点修饰官能团或DNA引物链,利用余下一顶点修饰物实现特异性目标的精确捕获。
在本实施例中,纳米孔芯片3的材料为石墨烯或氮化硼或二硫化钼,纳米孔30的直径小于5nm,测序更加精确。
在本实施例中,疏水液池4的材料为特氟龙,稳定性高。
在本实施例中,磁珠7为链霉亲和素磁珠7,能够更好地进行测序。
如图4-5所示,一种基于上述石墨烯纳米孔30测序仪的纳米孔30测序方法,包括以下步骤:
S1、将处理好且未修饰的DNA四面体23的AFM探针2装夹在探针纳米运动平台1上;
S2、扫描实验区域精确定位纳米孔30后固定AFM探针2位置;
S3、注入修饰溶液,使AFM探针2的针尖依次组装与捕获DNA四面体23和待测DNA6,探针下行使DNA四面体23上修饰链过孔,通过阻塞电流确定DNA四面体23是否成功修饰,修饰成功后再绑定待测DNA6;
S4、在纳米孔芯片3上下方注入测试液,并在纳米孔芯片3下方布置链霉亲和素磁珠7;
S5、在纳米孔30两侧施加电压驱动AFM探针2尖端表面待测DNA6穿过纳米孔30,并被下方磁珠7表面链霉亲和素所捕获,在电场力的作用下,将待测DNA6拉直;
S6、通过控制探针纳米运动平台1,实现AFM探针2垂直向下移动,实现DNA测序。
实施例二:
一种石墨烯纳米孔30测序仪,基本结构与实施例一相似,其不同点在于:
在本实施例中,AFM探针2选择氮化硅探针,针尖形状为四面体形。
在本实施例中,金修饰层21的薄膜沉积方法选择为原子层沉积,金修饰层21厚度为50nm。
在本实施例中,隔离层22的薄膜沉积方法为原子层沉积,隔离层22材料选择为氧化铝,厚度为20nm。
在本实施例中,微纳加工制造技术选择为聚焦离子束,聚焦离子束离子源选择为镓离子,刻蚀半径为10nm,刻蚀深度为25nm。
在本实施例中,DNA四面体23的棱长为17bp,约5.8nm,DNA四面体23与AFM探针2的金表面210自组装具体方法如下:将制备好的镀金探针依次用甲苯、丙酮、V(氯仿):V(乙醇)=1:1的溶液浸泡5min,再超声清洗5min,挥发干燥;用食人鱼溶液V(H2O2):V(H2SO4)=1:3溶液浸泡5min,超声清洗2min,然后用去离子水超声清洗2次,每次10min,N2吹干备用,取一定体积的DNA四面体23(1μM)滴加到表面清洗干净的金表面210,盖紧针尖冒,常温过夜自组装。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,包括探针纳米运动平台、AFM探针、纳米孔芯片、疏水液池以及三维纳米运动平台;所述AFM探针装夹在所述探针纳米运动平台上,所述疏水液池固定在所述三维纳米运动平台上,所述纳米孔芯片安装在所述疏水液池内;所述AFM探针的针尖设置有DNA四面体;所述纳米孔芯片上刻蚀有固态纳米孔且所述疏水液池内部的溶液通过所述纳米孔连通,所述纳米孔下方的溶液内设置有若干颗磁珠。
2.根据权利要求1所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述探针纳米运动平台的纵向闭环行程大于25μm,其闭环分辨率小于0.3nm;所述三维纳米运动平台的三维方向闭环行程X/Y/Z均大于10μm,其闭环分辨率小于5nm。
3.根据权利要求2所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述AFM探针包括基体、金修饰层、金表面以及隔离层;所述金修饰层通过薄膜沉积技术包覆在所述基体的外侧表面,所述隔离层通过薄膜沉积技术包覆在所述金修饰层的外侧表面,所述金表面通过微纳加工制造技术刻蚀在所述AFM探针的尖端处并刻穿所述隔离层,所述金表面与所述DNA四面体相连。
4.根据权利要求3所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述DNA四面体的棱长为10bp~50bp,即3.4nm~17nm。
5.根据权利要求4所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述金修饰层的厚度为30~100nm;所述隔离层的厚度为10~50nm;所述金表面的直径大于所述DNA四面体的棱长。
6.根据权利要求5所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述纳米孔芯片的材料为石墨烯或氮化硼或二硫化钼,所述纳米孔的直径小于5nm。
7.根据权利要求6所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述疏水液池的材料为特氟龙。
8.根据权利要求7所述的石墨烯纳米孔测序仪,其特征在于,所述磁珠为链霉亲和素磁珠。
9.一种基于权利要求8所述的石墨烯纳米孔测序仪的纳米孔测序方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将处理好且未修饰的DNA四面体的AFM探针装夹在探针纳米运动平台上;
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S6、通过控制探针纳米运动平台,实现AFM探针垂直向下移动,实现DNA测序。
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PB01 | Publication | ||
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