CN103820313A - 一种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行dna测序传感器及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测DNA碱基序列的纳米孔DNA测序传感器及检测方法，其中三通道并行DNA测序传感器，包括堵塞离子电流信号检测系统，原子力显微镜探测系统，隧穿电流信号检测系统和纳米孔单分子传感器。本发明采用化学修饰的方法在原子力显微镜探针上键合待测单链DNA，通过对原子力显微镜探针的操控，可以有效地控制DNA在纳米孔内的运动方向和速度，而且可以同时检测DNA过孔时产生的堵塞离子电流，隧穿电流和AFM探针的牵引力的变化，实现三通道并行检测和信号并行分析，相比传统纳米孔单分子传感器而言大大提高了识别DNA碱基的能力，避免了有效信号的流失；本发明可以精确的用于对DNA碱基序列过孔电信号和力信号的检测，对实现低成本高通量的DNA测序这一目标意义重大。

Description

一种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器及检测方法

技术领域

本发明涉及到一种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器及测序检测方法。

背景技术

纳米孔单分子传感器，其工作原理基于库特计数器，因其原理和制备工艺简单，被科学研究者们一致认为在不久的将来将被广泛应用于生物医学、生命科学和技术科学等领域。然而DNA碱基序列精准测序发展到现在一直受到膜片钳放大器扫描频率的制约，目前膜片钳的采样频率还尚未突破4兆赫兹，现有的采样频率还远远达不到精确测序的要求。因此研究者们采用了一系列的办法来降低DNA的过孔速度，（Meller A, Nivon L, Brandin E, et al. Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules. P Natl Acad Sci USA, 2000, 97(3): 1079-1084）文献提出降低体系温度来降低DNA的过孔速度，（Fologea D, Uplinger J, Thomas B, et al. Slowing DNA translocation in a solid-state nanopore. Nano Lett, 2005, 5(9): 1734-1737）文献提出增加溶液粘度，降低外加电压和温度可以降低DNA的过孔速度，然而这些方法只能很有限的降低DNA的过孔速度，距离实现DNA测序的目标甚远；（de Zoysa RSS, Jayawardhana DA, Zhao QT, et al. Slowing DNA translocation through nanopores using a solution containing organic salts. J Phys Chem B, 2009, 113(40): 13332-13336）文献提出采用有机盐溶液要比无机盐溶液更有效的降低DNA的过孔速度，然而有机盐溶液相对无机盐溶液适用范围窄，将限制DNA测序的应用；（Manrao EA, Derrington IM, Laszlo AH, et al. Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant mspa nanopore and phi29 DNA polymerase. Nat Biotechnol, 2012, 30(4): 349-U174）文献提出采用聚合酶对DNA聚合的作用来控制DNA的迁移速度，虽然可以使得单碱基的迁移速率达到毫秒级，但是聚合酶存在的条件复杂，违背了低成本简单高速测序的初衷；（Lu B, Hoogerheide DP, Zhao Q, et al. Pressure-controlled motion of single polymers through solid-state nanopores. Nano Lett, 2013, 13(7): 3048-3052）文献提出采用外载对流体加压，使得DNA在穿过纳米孔的时候除了受电场力外还受到额外的压力，他们的这一方法可以通过调节电场方向使得作用于DNA上的总作用力降低到电场力减去压力的差值，从而达到降低DNA过孔速度的目的，然而他们控制压力的方法繁琐复杂，且降低速率的程度依然有限；（Keyser UF, Koeleman BN, Van Dorp S, et al. Direct force measurements on DNA in a solid-state nanopore. Nat Phys, 2006, 2(7): 473-477）文献指出通过光镊对DNA进行操纵以达到控制DNA过孔速度的目的，可是目前光镊操作技术尚不成熟，严重制约了DNA测序技术的应用。此外目前基于纳米孔单分子传感器的纳米孔DNA测序传感器都是通过采集DNA过孔时候的堵塞电流信号或隧穿电流信号来辨别DNA碱基的，信号单一，包含的碱基信息有限。因此一种同时具备控制DNA过孔速度和实现多元化信号检测两种特征的DNA测序传感器很有必要被提出，以弥补目前测序传感器的不足。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明要解决的是现有的纳米孔DNA测序传感器发展过程中DNA过孔速度太快的问题和现有传感器信号检测渠道过于单一使得不能对DNA碱基序列精准测序等问题。

（二）技术方案

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器，其特征是：包括堵塞离子电流信号检测系统，原子力显微镜探测系统，隧穿电流信号检测系统和纳米孔单分子传感器，所述的堵塞离子电流信号检测系统包括电源I，电流表I和两个Ag/AgCl电极；所述的原子力显微镜探测系统包括激光发射器，信号反馈处理器和原子力显微镜探针；所述的隧穿电流检测系统包括电源II，电流表II和两个纳米Au或Pt电极；所述的纳米孔单分子传感器包括含有纳米孔的纳米薄膜和基底；所述的原子力显微镜探针位于所述纳米薄膜的上方；在所述纳米薄膜的上方和下方还分别设置一个所述Ag/AgCl电极；所述两个纳米Au或Pt电极分别位于所述纳米薄膜上纳米孔的两侧。

一种基于三通道并行DNA测序传感器的检测方法，步骤如下：

步骤一、采用化学修饰的方法在原子力显微镜探针上键合待测单链DNA分子；化学修饰的方法具体是：

a、采用磁控溅射在原子力显微镜探针表面镀上一层Au薄膜；

b、配制所要修饰的DNA溶液10-100 μM；

c、将镀有Au薄膜的AFM探针浸泡到步骤b中所配制的DNA溶液中，静置12-24小时；

d、然后在步骤c的溶液中加入3-5 ml的0.1%-0.2%的 SDS和0.1-0.2 M的磷酸钠，其中磷酸钠的PH=7.4；

e、在室温条件下静置5-7天；

f、在静置后的溶液中加入3-5 ml的0.8-1 M氯化钠6-8次，每次加入之间的时间间隔为3-4小时；

步骤二、通过操控原子力显微镜探针拉着DNA接近纳米孔并从纳米孔中穿过；

步骤三、当DNA进入纳米孔中后，通过操控原子力显微镜的探针，沿着纳米孔轴线方向慢慢移动DNA直至DNA完全移出纳米孔，并同时开始检测DNA移动过程中的堵塞离子电流信号，隧穿电流信号和牵引DNA运动的力信号；

步骤四、重复步骤三二或三次；

步骤五、完成上述步骤后，通过比对分析本传感器所得的三通道并行检测数据，寻找碱基与信号之间的对应规律，完成测序。

本发明是一种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行检测DNA测序传感器，该传感器由堵塞离子电流信号检测系统，原子力显微镜探测系统，隧穿电流信号检测系统和纳米孔单分子传感器组成。

上述方案中，采用化学修饰的方法在原子力显微镜探针上键合待测单链DNA。然后通过控制原子力显微镜探针来操纵DNA的过孔迁移速度和方向，以满足基本的信号检测带宽需求。然后可以同时检测DNA过孔时产生的堵塞离子电流，隧穿电流及牵引DNA过孔的力信号，实现三通道并行检测。

（三）有益效果

将基于力信号检测的原子力显微镜探测系统结合基于电流信号检测的纳米孔单分子传感器应用于DNA测序技术上，实现多元化信号的检测。

探测过程中事先通过化学修饰的方法在原子力显微镜探针上键合待测的单链DNA，通过对原子力显微镜探针的操控达到控制DNA在纳米孔内运动方向和迁移速度的目的，甚至可以控制DNA在孔内来回运动，进行反复测序。

本发明基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器，在维持了纳米孔单分子传感器固有特点的同时，其特征在于此传感器可以同时检测DNA过孔时候的堵塞离子电流信号，隧穿电流信号，DNA过孔的牵引力信号，实现三通道并行检测，大大提高了识别DNA碱基的能力，避免了有效信号的流失，降低了DNA测序检测的误差。

基于上述基本原理，本发明提供的这种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器可以实现对DNA过孔速度和方向的有效控制，而且可以三通道并行检测DNA过孔时产生的堵塞离子电流，隧穿电流及牵引DNA过孔的力信号，使得信号包含DNA碱基的信息多元化，提高了纳米孔DNA测序传感器的检测灵敏度，对实现DNA测序碱基精确辨识意义重大。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明的结构示意图。

图中：1.电源I，2.电流表I，3.Ag/AgCl电极，4.激光发射器，5.信号处理器，6原子力显微镜探针，7.电源II，8.电流表II，9.纳米Au（Pt）电极，10.带有纳米孔的纳米薄膜，11.基底。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参考附图，对本发明进一步详细说明。

如图1所示，本发明提供的这种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器由堵塞离子电流信号检测系统，原子力显微镜探测系统，隧穿电流信号检测系统和纳米孔单分子传感器组成。其中堵塞离子电流信号检测系统由电源I1，电流表I2，Ag/AgCl电极3组成；原子力显微镜探测系统由激光发射器4，信号处理器5，原子力显微镜探针6组成；隧穿电流信号检测系统由电源II7，电流表II8，纳米Au或Pt电极9组成；纳米孔单分子传感器由带有纳米孔的纳米薄膜10，基底11组成。本发明提供的这种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器具体布局参见图1所示。

本发明的工作过程如下：

（1）按照图1布局搭建好堵塞离子电流信号检测系统，原子力显微镜探测系统，隧穿电流信号检测系统和纳米孔单分子传感器；

（2）采用如下化学修饰的方法在原子力显微镜探针上键合待测单链DNA分子；

1．  采用磁控溅射在原子力显微镜探针表面镀上一层Au薄膜；

2．  配制所要修饰的DNA（事先将DNA修饰上“-SH”官能团）溶液10-100 μM；

3．  将镀有Au薄膜的AFM探针浸泡到步骤2中所配制的DNA溶液中，静置12-24小时；

然后在步骤3的溶液中加入3-5 ml的0.1%-0.2%的十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1 -0.2 M的磷酸钠（PH=7.4）；

4．  在室温条件下静置7天；

5．  在上述溶液中加入适量的0.8-1 M氯化钠6-8次，每次加入之间的时间间隔约为3-4小时。

（3）然后通过操控原子力显微镜探针拉着DNA接近纳米孔，并通过下述方法确认DNA是否进入纳米孔中；

确认DNA是否进入纳米孔的方法：因DNA分子在溶液中带负电，在外加堵塞离子电流信号检测系统的电源I施加的电压下DNA会拉直并穿过纳米孔，通过下述步骤来确认DNA是否顺利进入了纳米孔中；

1.      打开堵塞离子电流信号检测系统，此时离子电流为开孔离子电流，无堵塞现象（具体表现为离子电流值在一稳定值附近波动）；

2.      操控原子力显微镜探针拉着DNA逐渐靠近纳米孔；

3.      当发现开孔离子电流堵塞后（具体表现为离子电流下降到某个稳定值附近震荡），待堵塞稳定之后慢慢操控原子力显微镜探针拉着DNA运动出并逐渐远离纳米孔，若此过程中离子电流又回升到开孔离子电流值附近波动表示原子力显微镜探针找孔成功，并能顺利操控DNA入孔和出孔。

（4）按照步骤3确认DNA进入纳米孔中后，通过操控原子力显微镜的探针，沿着纳米孔轴线方向慢慢移动DNA直至DNA完全移出纳米孔，并同时开始检测DNA移动过程中的堵塞离子电流信号，隧穿电流信号和牵引DNA运动的力信号；

（5）重复步骤（4）二或三次；

（6）完成上述步骤后，通过比对分析本传感器所得的三通道并行检测数据，寻找碱基与信号之间的对应规律，完成测序。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细。

说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于纳米孔和原子力显微镜的三通道并行DNA测序传感器，其特征是：包括堵塞离子电流信号检测系统，原子力显微镜探测系统，隧穿电流信号检测系统和纳米孔单分子传感器，所述的堵塞离子电流信号检测系统包括电源I（1），电流表I（2）和两个Ag/AgCl电极（3）；所述的原子力显微镜探测系统包括激光发射器（4），信号反馈处理器（5）和原子力显微镜探针（6）；所述的隧穿电流检测系统包括电源II（7），电流表II（8）和两个纳米Au或Pt电极（9）；所述的纳米孔单分子传感器包括含有纳米孔的纳米薄膜（10）和基底（11）；所述的原子力显微镜探针（6）位于所述纳米薄膜（10）的上方；在所述纳米薄膜（10）的上方和下方还分别设置一个所述Ag/AgCl电极（3）；所述两个纳米Au或Pt电极（9）分别位于所述纳米薄膜（10）上纳米孔的两侧。

2.一种基于权利要求1所述三通道并行DNA测序传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一、采用化学修饰的方法在原子力显微镜探针上键合待测单链DNA分子；化学修饰的方法具体是：

a、采用磁控溅射在原子力显微镜探针表面镀上一层Au薄膜；

b、配制所要修饰的DNA溶液10-100 μM；

c、将镀有Au薄膜的AFM探针浸泡到步骤b中所配制的DNA溶液中，静置12-24小时；

d、然后在步骤c的溶液中加入3-5 ml的0.1%-0.2%的SDS和0.1-0.2 M的磷酸钠，其中磷酸钠的PH=7.4；

e、在室温条件下静置5-7天；

f、在静置后的溶液中加入3-5 ml的0.8-1 M氯化钠6-8次，每次加入之间的时间间隔为3-4小时；

步骤二、通过操控原子力显微镜探针拉着DNA接近纳米孔并从纳米孔中穿过；

步骤三、当DNA进入纳米孔中后，通过操控原子力显微镜的探针，沿着纳米孔轴线方向慢慢移动DNA直至DNA完全移出纳米孔，并同时开始检测DNA移动过程中的堵塞离子电流信号，隧穿电流信号和牵引DNA运动的力信号；

步骤四、重复步骤三二或三次；

步骤五、完成上述步骤后，通过比对分析本传感器所得的三通道并行检测数据，寻找碱基与信号之间的对应规律，完成测序。

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