CN106596645A - 单分子操纵的石墨烯纳米孔dna测序仪 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，包括纳米操纵系统、纳米孔测序系统、数据采集分析系统和中央控制系统，纳米操纵系统，将探针移动至纳米孔处并将DNA分子送入纳米孔中；纳米孔测序系统，实现单个碱基的识别；数据采集分析系统对纳米孔芯片中的离子电流信息进行数据采集，并进行实时地数据处理和分析，测量出长链DNA的序列；中央控制系统：通过反馈控制系统电路对各个系统进行实时控制，确保各个系统在亚微秒的同步时间下进行协同工作。本发明将纳米孔测序的基本原理与单分子纳米操纵技术有机结合，具备超长读写长度，可以进行单分子DNA实时控制，能够实现单碱基识别的超高分辨率，满足DNA测序的技术要求。

Description

单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪

技术领域

本发明涉及DNA测序领域，具体涉及一种利用单分子操纵系统结合石墨烯纳米测序技术对DNA碱基序列进行高效、廉价、精准的检测，并能灵活的扩展到RNA、多肽和蛋白质的结构单元及空间构像检测的设备。

背景技术

DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)序列是生命的蓝图，蕴含着整个生物体的遗传信息。快速准确地解读这些遗传信息对生命科学的进步和生物环境的发展具有重要的意义。然而生物体的基因多样性高、容量巨大，要正确解读生物体的遗传信息就需要快速、精准的DNA序列探测技术。开发一台快速、长读长、低成本的DNA测序仪是实现精准化生命科学研究和生物医药发展创新的必由之路，方可真正实现DNA测序广泛的应用价值。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，该设备具有成本低廉，操作便捷，结果准确等特点，并适用于RNA、多肽、蛋白质等多类物质的检测。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，包括纳米操纵系统101、纳米孔测序系统102、数据采集分析系统103和中央控制系统104，纳米操纵系统101，对单个DNA分子进行实时操纵，将DNA分子移动至纳米孔处并将DNA分子送入纳米孔中；纳米孔测序系统102，对四种不同的碱基进行区分，实现单个碱基的识别；数据采集分析系统103，利用低噪音电流放大器，对纳米孔芯片中的离子电流信息进行数据采集，并进行实时地数据处理和分析，获得离子电流信号和碱基序列之间的对应关系，从而测量出长链DNA的序列；中央控制系统104，通过反馈控制系统电路对纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统进行实时控制，确保纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统在亚微秒的同步时间下进行协同工作。

进一步，所述纳米操纵系统包括微位移平台203、探针201、探针夹持器和电源207；所述探针设置于探针夹持器上；所述纳米孔测序系统包括石墨烯纳米孔芯片205和装载石墨烯纳米孔芯片的反应池204，所述反应池设置于微位移平台上，所述电源的正极、负极分别通过电极206向石墨烯纳米孔芯片施加电压。

进一步，所述纳米操纵系统还包括激光发射器和光电探测器，激光发射器发出激光照射在探针上，所述光电探测器检测来自于探针的反射光。

进一步，所述探针为单探针或多探针。

进一步，所述纳米操纵系统还包括电流表208，所述电流表连接于电源与电极之间。

由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益技术效果：

本发明将纳米孔测序的基本原理与单分子纳米操纵技术有机结合，具备超长读写长度，可以进行单分子DNA实时控制，能够实现单碱基识别的超高分辨率，满足DNA测序的技术要求。通过纳米操纵系统准确控制DNA分子的位置和过孔速度，提高电流信号的信噪比达到单碱基探测灵敏度；将石墨烯薄膜创造性地添加在测序系统中，利用单层石墨烯薄膜的几何属性有效地实现单碱基识别；对超长DNA分子进行线性化处理，避免DNA分子堵塞纳米孔从而实现设备对超长链DNA分子的读取能力；本发明无需对待测DNA分子进行标记或放大，可以实时读取DNA分子通过纳米孔时的离子电流信号从而实现对碱基序列无损直观的检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示为本发明实施例提供的DNA测序方法总体技术路线图；

图2显示为本发明实施例提供的DNA测序方法中的场效应晶体管进行碱基测试电流变化示意图；

图3为样品池的俯视图；

其中，201为探针，202为待测DNA，203为微位移平台，204为样品池，205为加载在样品池内的石墨烯纳米孔芯片，206为电极，207为电源，208为电流表，209为检测到的电流信号，214光学显微镜。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

图1为本仪器的DNA测序方法总体技术路线图，一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，包括纳米操纵系统101、纳米孔测序系统102、数据采集分析系统103和中央控制系统104。

其中纳米操纵系统101包括：闭环精度高于0.2nm的三轴微位移平台203、探针夹持器(图中未视出)，激光发射器(图中未视出)，四象限光电探测器(图中未视出)和分辨大于1um的光学显微镜214。在单分子操纵的纳米孔DNA测序仪中，核心的部件是具有纳米精度操纵系统，它可以有效解决目前DNA在没有控制情况下，通过纳米孔速度过快的问题。在控制器作用下，能够对于单个DNA分子进行实时操纵，操纵精度为0.3纳米，运动速度为0.3纳米/1毫秒，是目前市场上测量仪器的1000倍。纳米操纵系统上可以配置单探针或者双探针。采用单探针技术时，可以在光学显微镜的配合下将探针移动至纳米孔周围，通过给带负电的DNA分子施加电压驱导其进入纳米孔。采用双探针技术时，先使用没有修饰DNA分子的探针在石墨烯纳米孔芯片芯片表面做拓扑图扫描，精确确定纳米孔位置；后将修饰有DNA分子的探针移动至纳米孔处并将DNA分子送入纳米孔中。利用纳米操纵系统可反复多次精确控制单个DNA分子通过或离开纳米孔。通过压电技术控制的微位移平台最大行程为350微米(可以测量的DNA长度1百万个碱基)，通常选择DNA的测量长度为10K个碱基，是目前主流测量仪器的10倍到100倍。

纳米孔测序系统102包括：直径小于2nm的石墨烯纳米孔芯片205和装载石墨烯纳米孔芯片的反应池204。选用石墨烯纳米孔芯片作为测序的核心部件，对四种不同的碱基进行区分，实现单个碱基的识别。单层石墨烯的厚度和单个碱基的大小相当，因此在石墨烯上形成的纳米孔具有超高的空间分辨率，可以达到0.35纳米，能够有效地识别单个碱基。石墨烯纳米孔的大小可以设定在1nm左右，这样的尺寸和单链DNA的直径接近，可以很好地控制单个碱基在纳米孔内造成的阻塞电流变化，从而提高识别单个碱基的灵敏度。

数据采集分析系统103：最高采样率高于200KHZ，RMS电流噪音在pA级别。主要是针对纳米测量系统获得低噪音电流进行采集，技术路线是：在法拉第电磁屏蔽罩内，尽可能地消除外界的电磁和震动等噪音，提高信号噪音比，利用低噪音电流放大器，获取石墨烯纳米孔芯片中的离子电流信息进行数据采集，并进行实时地数据处理和分析，给出离子电流信号和碱基序列之间的对应关系，从而测量处长链DNA的序列。

中央控制系统104：通过反馈控制系统电路对于纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统进行实时控制，确保纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统能够在亚微秒的同步时间下进行协同工作，根据数据分析的结果，可以通过反馈控制对各个模块进行统一地控制，反复地对待测单个DNA分子进行测量，确保测量的精度。

图2为纳米孔测序系统：本发明采用化学修饰的方法将待测DNA202固定在操纵探针201上，所用的石墨烯纳米孔芯片205放置在特制的样品池206中。在光学显微镜214的配合下将探针移动到距离纳米孔2um的范围内；再通过扫描探针快速成像，将操纵探针移动到距离纳米孔100nm范围内，通过电极206对DNA分子加电压将其导入纳米孔。在单探针操纵系统上则单独利用施加电压的方式驱使DNA接近纳米孔。通过中央控制系统，使DNA在外电场和探针拉力作用下以一定速度通过纳米孔，同时数据采集系统208开始采集并且记录待测DNA序列产生的电流信号信息209。四类碱基会对开孔电流造成不同的阻塞作用210-213，通过记录各个碱基对应的阻塞作用检测出该DNA分子的碱基序列。当一次测序结束后，由中央采集系统发出指令停止测序或者从新开始测序。

以上步骤可在10min内完成，单次测序(6kbp)在600ms内完成，1min内实现30次循环次序，100min内完成3000次循环测序。当通过纳米孔时，就会出现相应的电流信号，通过分析过孔离子电流的变化情况来有效地对DNA碱基序列进行识别，从而实现廉价、快速、准确的DNA测序。

在本发明中，探针可以是氮化硅探针、硅探针、碳纳米管探针、或在商用探针基础上修饰的探针及自行制备的各种材质的探针。

在本发明中，将待测DNA202固定在操纵探针上除了化学非共价键修饰，还包括物理修饰、生物素修饰等修饰方法。

在本发明中，在本发明中，纳米孔包括固体材料上制备的固态纳米孔或生物纳米孔等；固态纳米孔的材质包括不同厚度的石墨烯，氮化硅，二氧化硅、氮化硼，二硫化钼等。

固态纳米孔包括在不同材质基片上直接制备的尺度在纳米范围内的小孔，也包括在所制备的纳米孔表面或者内部进行化学修饰、物理修饰及生物修饰后加工出来的固态纳米孔。

生物纳米孔包括α-hemolysin(αHL)，MspA，phi29等，不仅限于的生物纳米孔，也包括利用化学物质进行共价键修饰、非共价键修饰及其他物理生物方式修饰后的生物纳米孔。

在本发明中，控制系统、纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统可以是模块化的，也是高度集成的。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，其特征在于：包括纳米操纵系统(101)、纳米孔测序系统(102)、数据采集分析系统(103)和中央控制系统(104)，

纳米操纵系统(101)，对单个DNA分子进行实时操纵，将DNA分子移动至纳米孔处并将DNA分子送入纳米孔中；

纳米孔测序系统(102)，对四种不同的碱基进行区分，实现单个碱基的识别；

数据采集分析系统(103)，利用低噪音电流放大器，对纳米孔芯片中的离子电流信息进行数据采集，并进行实时地数据处理和分析，获得离子电流信号和碱基序列之间的对应关系，从而测量出长链DNA的序列；

中央控制系统(104)，通过反馈控制系统电路对纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统进行实时控制，确保纳米操纵系统、纳米孔测序系统和数据采集分析系统在亚微秒的同步时间下进行协同工作。

2.根据权利要求1所述的一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，其特征在于：所述纳米操纵系统包括微位移平台(203)、探针(201)、探针夹持器和电源(207)；所述探针设置于探针夹持器上；所述纳米孔测序系统包括石墨烯纳米孔芯片(205)和装载石墨烯纳米孔芯片的反应池(204)，所述反应池设置于微位移平台上，所述电源的正极、负极分别通过电极(206)向石墨烯纳米孔芯片施加电压。

3.根据权利要求2所述的一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，其特征在于：所述纳米操纵系统还包括激光发射器和光电探测器，激光发射器发出激光照射在探针上，所述光电探测器检测来自于探针的反射光。

4.根据权利要求1所述的一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，其特征在于：所述探针为单探针或多探针。

5.根据权利要求2所述的一种单分子操纵的石墨烯纳米孔DNA测序仪，其特征在于：所述纳米操纵系统还包括电流表(208)，所述电流表连接于电源与电极之间。