CN108490046A - 一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器及利用其快速定量检测atp的方法 - Google Patents

一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器及利用其快速定量检测atp的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器及利用其快速定量检测ATP的方法，其主要是在超微电极表面电沉积了一层由Au纳米颗粒堆积的纳米花，形成了Au纳米花超微电极，再将双链DNA(dsDNA)组装在Au纳米花超微电极表面，在定量检测ATP时，将该电化学传感器进行后处理，使电极表面的活性位点被封闭，再将组装dsDNA的Au纳米花电极在ATP溶液中培育完成杂交反应，使电极表面的活性位点释放，利用方波伏安法即可快速定量测定出ATP；能够快速、准确地实现对性质不稳定物质的快速测定，而且检测结果精确、反应灵敏，克服了常规检测方法耗时长、检测结果误差大的问题。

Description

一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器及利用其快速 定量检测ATP的方法
技术领域
本发明属于ATP检测技术领域，特别涉及一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器及基于该电化学传感器快速定量检测ATP的方法。
背景技术
ATP(三磷酸腺苷)是一种不稳定的高能化合物，由一分子腺嘌呤，一分子核糖和三分子磷酸基团组成，水解时能释放大量的能量，是生物体内最直接的能量来源。ATP作为生物体内化学能的主要载体，是生物生物体内重要的底物，在细胞代谢的调节和整合中起着重要的作用。由于其在生物中无处不在，它也用作细胞存活和细胞损伤的指示剂。因ATP在细胞中的水平还与许多疾病有关，例如心血管疾病、心肌疾病和帕金森疾病等，且由于ATP是一种高能磷酸化合物，在细胞中，它能与ADP快速的发生相互转化实现贮能和放能，从而保证细胞各项生命活动的能量供应生，故而在生物体内ATP的含量是时刻不停的在发生变化的，处于动态平衡之中(Wat.ScL Tech.Vol.36.No.10.pp.109-1IS.1997.)，具有不稳定性，因此，实现快速而又准确的定量检测生物体内及生物细胞中的ATP，对于生化研究和临床诊断都有着至关重要的意义。
目前检测ATP的方法多种多样，如生物发光法，高效液相色谱法，电泳法，化学发光法及同位素示踪法等，虽然这些方法都能实现ATP的检测，但各自都存在一定的缺陷，如成本较高，灵敏度的检测有限，选择性不高，耗时较长等。且由于ATP作为生物体内的直接能源，在细胞中含量很少，但是转化十分迅速，从而使细胞中的ATP总是处于一种动态平衡之中，故建立一种快速准确的ATP检测方法有着难以估量的应用价值。
近年来，核酸适配体的出现使得其在分析应用领域成为一种很有前景的分析工具。核酸适配体通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，且其自身具有稳定性好、易获得、制备合成相对简单、易功能化修饰语标记等优点，因此被广泛用于生物传感器领域。且把核酸适配体应用于探针，开发的基于核酸适配体构型变化的电化学传感器(又称，E-AB传感器)，与电化学检测方法的结合，使之具备便携化、操作简单、成本低等优点。
目前，虽然利用基于ATP核酸适配体的生物传感器来检测ATP的研究已有见报道(J.AM.CHEM.SOC.2007,129,1042-1043.)，但利用常规大电极与ATP核酸适配体组装制得的生物传感器，在用于ATP检测时需要与ATP进行长达数小时的杂交，而鉴于ATP自身性质的不稳定性，对于常规的需要与ATP杂交数小时的ATP检测方法，准确性较低。
发明内容
为了克服现有ATP检测方法所存在的不足，本发明提供了一种能够快速、精确检测非稳定ATP且灵敏度高、成本相对较低的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器。
同时本发明提供了一种利用上述用于快速检测非稳定物质的电化学传感器快速定量检测ATP的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，该电化学传感器由以下步骤制得：
(1)将浓度均为1μmol/L的anti-ATP适配体与其互补链混合置于含有1mmol/L的三(2-羧乙基)膦和1mol/L的NaClO4的磷酸缓冲溶液中，加热至70℃～90℃，缓慢冷却至室温，得到dsDNA；
(2)将Pt圆盘超微电极用超纯水超声清洗，以该Pt圆盘超微电极为工作电极，放入含有质量浓度为1.5％HCl与浓度为1.2mg/mL HAuCl4及0.1mol/L NaCl的混合液中，用循环伏安扫描法在Pt圆盘超微电极上电沉积Au，得到Au纳米花超微电极；
(3)将步骤(2)的Au纳米花超微电极放入0.5mol/L的H2SO4中，利用循环伏安扫描法进行电化学清理，直至扫描的峰电流稳定，之后再用超纯水反复清洗后，完成Au纳米花超微电极的预处理；
(4)将步骤(3)预处理好的Au纳米花超微电极置于步骤(1)的dsDNA中，反应10h～16h后，使dsDNA组装至Au纳米花超微电极上，得到用于快速检测非稳定物质的电化学传感器。
进一步限定，步骤(1)和步骤(4)中的磷酸缓冲溶液的pH均为7.4。
进一步限定，所述步骤(1)的anti-ATP适配体的序列为：
5’-ferrocene-C6-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTT-C6-SH-3’；
互补链的序列为：
5'-ACCTTCC TCCGC AATAC TCCCC CAGGT-3'。
进一步限定，所述步骤(2)中的Pt圆盘超微电极的制备方法为：截取一段Pt微米线置于石英玻璃管中，将石英玻璃管的一端用环氧树脂胶封住，将放有Pt微米线的石英玻璃管放入P-2000激光拉制仪中，使Pt微米线处于激光加热中心，向石英玻璃管中抽入真空，在抽真空状态下，通过激光加热，以每加热45s冷却15s的加热方式，重复7-8次，使得Pt微米线被紧封于石英玻璃管中；重复进行第二次激光加热，使得被紧封于石英管玻璃中的Pt线与石英管玻璃同时被拉成两节；将拉制好的紧封于石英玻璃管里的Pt微米线的一端用导电银胶与0.2mm钨丝沾粘上，并用环氧树脂将石英管口封住，将拉制的尖端打磨，使得Pt尖端暴露，得到Pt圆盘超微电极。
进一步限定，所述步骤(2)的循环伏安扫描法的扫描范围从0.4V至-0.5V，扫描速度为20mV/s，两电极体系为vs.Ag/AgCl；
所述步骤(3)的循环伏安扫描法的扫描范围从0V至1.5V，扫描速度为30mV/s，两电极体系为vs.Ag/AgCl。
进一步限定，所述Au纳米花超微电极的尺寸不超过25μm。
一种利用上述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器进行ATP快速定量检测的方法，具体是：将上述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器置于含有0.1mol/L的2-巯基乙醇和1mol/L NaClO4的磷酸缓冲溶液中后处理8min～12min，使电极表面的活性位点被封闭；之后在36℃～38℃条件下，将该用于快速检测非稳定物质的电化学传感器放入待检ATP溶液中培育8min～12min，利用方波伏安法测定，实现ATP的定量检测。
进一步限定，所述ATP溶液是将ATP溶于含有50mmol/L NaClO4和1mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、pH＝8.0的缓冲溶液中。
进一步限定，所述ATP溶液浓度的检测范围为1.0×10-9～1.0×10-6mol/L。
本发明提供了一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器主要是在超微电极表面电沉积了一层由Au纳米颗粒堆积的纳米花，形成了Au纳米花超微电极，再将双链DNA(dsDNA)组装在Au纳米花超微电极表面，在定量检测ATP时，将该电化学传感器进行后处理，使电极表面的活性位点被封闭，再将组装dsDNA的Au纳米花超微电极在ATP溶液中培育完成杂交反应，使电极表面的活性位点释放，利用方波伏安法即可快速定量测定出ATP；与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的电化学传感器是在超微电极表面电沉积了一层由Au纳米颗粒堆积的纳米花，形成了Au纳米花超微电极，以一端带有二茂铁的anti-ATP适配体与其互补链结合形成的dsDNA作为载体，固定于Au纳米花超微电极基底上，使传感器的生物兼容性及导电性得到极大的提高，极大的加速分子的扩散，缩短了分子间的杂交时间，从而实现对性质不稳定物质的快速测定。
(2)本发明的ATP快速定量检测方法所用电化学传感器具有ATP适配体探针，能够与ATP的高特异性结合特性，能够高灵敏地实现ATP的含量检测。
(3)本发明的ATP快速定量检测方法所选用的ATP适配体探针与Au纳米花超微电极结合检测ATP，能够在较短时间(10min左右)检测出ATP浓度，而且检测结果精确、反应灵敏，克服了常规检测方法耗时长、检测结果误差大的问题。
(4)本发明所述方法测定涉及仪器少，成本低，操作简单。
附图说明
图1为ATP浓度与测定信号的关系。
图2为ATP浓度与测定信号的线性关系。
图3为超微电极临界尺寸25μm处，尺寸相同而形貌不同的Au纳米花与Au圆盘超微电极，在相同浓度梯度的ATP溶液中培育相同时间(10min)后，浓度-电流强度对比图。
图4为同等条件下沉积的不同尺寸的Au纳米花超微电极，在10min培育条件下ATP与探针杂交效果测定的对比图。
具体实施方式
现结合附图和实验对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施情形。
实施例1
本发明快速定量检测ATP的方法由以下步骤实现：
(1)将浓度均为1μmol/L的anti-ATP适配体与其互补链混合置于含有1mmol/L的三(2-羧乙基)膦(简称TCEP，98+％，购置于Sigma公司)和1mol/L的NaClO4，pH为7.4的磷酸缓冲溶液中，加热至80℃，缓慢冷却至室温，得到dsDNA；
anti-ATP适配体与其互补链由上海生工生物工程股份有限公司合成，
anti-ATP适配体的序列为：
5’-ferrocene-C6-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTT-C6-SH-3’；
互补链的序列为：
5'-ACCTTCC TCCGC AATAC TCCCC CAGGT-3'。
(2)将Pt圆盘超微电极用超纯水超声清洗5min，以该Pt圆盘超微电极为工作电极，放入含有质量浓度为1.5％HCl与浓度为1.2mg/mL HAuCl4(99.995％，购置于Sigma公司)及0.1mol/L NaCl的混合液中，用循环伏安扫描法在Pt圆盘超微电极上电沉积Au，扫描范围从0.4V至-0.5V，扫描速度为20mV/s，两电极体系为vs.Ag/AgCl，得到Au纳米花超微电极；
其中，Pt圆盘超微电极是根据张波等人(Y.Li,D.Bergman and B.Zhang,Anal.Chem.,2009,81,5496–5502.)公开的制作Pt圆盘超微电极的方法，具体为：
第一步，截取一段Pt微米线(d＝25μm,L＝2.5cm,99.95％)放入一根石英玻璃管(L＝7.5cm，o.d.＝1.0mm,i.d.＝0.30mm)的正中间，再将石英玻璃管的一端用环氧树脂胶封住，接着将放有Pt微米线的石英玻璃管放入P-2000激光拉制仪中，使Pt微米线处于激光加热中心，且石英玻璃管未封口一端抽入真空；
第二步，在抽真空状态下，设置P-2000激光拉制仪在一定参数(温度参数＝829，火焰间距参数＝2，速度参数＝60，延迟参数＝140，拉力参数＝225)，通过激光加热，以每加热45s冷却15s的加热方式，重复7-8次，使得Pt微米线被紧封于石英玻璃管中；
第三步，重新设置P-2000激光拉制仪的参数(温度参数＝876，火焰间距参数＝2，速度参数＝60，延迟参数＝100，拉力参数＝229)，再通过激光加热，使得被紧封于石英管玻璃中的Pt线与石英管玻璃同时被拉成两节；
第四步，将上述拉制好的紧封于石英玻璃管里的Pt微米线的一端用导电银胶与0.2mm钨丝沾粘上，并用环氧树脂将石英管口封住，避免松动，最后将拉制的尖端打磨，使得Pt尖端暴露，制得Pt圆盘超微电极。
(3)将步骤(2)的Au纳米花超微电极放入0.5mol/L的H2SO4中，利用循环伏安扫描法进行电化学清理，扫描范围从0V至1.5V，扫描速度为30mV/s，两电极体系为vs.Ag/AgCl，直至扫描的峰电流稳定，之后再将电极用超纯水反复清洗后，完成Au纳米花超微电极的预处理；
(4)将步骤(3)预处理好的Au纳米花超微电极置于步骤(1)的dsDNA中，反应10h～16h后，通过Au—S键的结合方式，使dsDNA组装至Au纳米花超微电极上，得到用于快速检测非稳定物质的电化学传感器(简称电化学传感器)。
为了使检测更快速，控制电化学传感器的Au纳米花超微电极尺寸小于25μm。
(5)将上述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器(即组装了dsDNA的Au纳米花超微电极)置于含有0.1mol/L的2-巯基乙醇和1mol/L NaClO4，pH为7.4的磷酸缓冲溶液中后处理8min～12min，使电极表面的活性位点被封闭；
(6)将步骤(5)中后处理的电化学传感器在36℃～38℃条件下，放入ATP溶液中培育8min～12min，利用方波伏安法测定，即可完成非稳定ATP的快速定量检测。
ATP溶液是将ATP溶解于含有50mmol/L NaClO4的1mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、pH＝8.0的缓冲溶液中。
为了验证本发明的技术效果，现以下述实验为例进行验证。
1、电化学传感器与ATP浓度的线性关系
选取浓度为0n mol/L、10n mol/L、100n mol/L、1μmol/L、10μmol/L的ATP溶液，分别与电化学传感器杂交反应10min，观察电化学信号随ATP浓度变化，结果如图1和2所示。
由图1和2可知，本发明的电化学传感器与ATP杂交，只需～10min便可测得ATP浓度在1.0×10-9～1.0×10-6mol/L范围内电化学信号随ATP浓度的增加线性增强，也同时表明Au纳米花超微电极可用于对ATP的快速定量测定。
2、电极表面形貌对快速测定ATP灵敏度的影响
将相同尺寸的Au圆盘超微电极与Au纳米花超微电极同时在相同条件下组装dsDNA后，制作成电化学传感器，作为对比电化学传感器；将其与本发明的电化学传感器在相同条件下，分别放入相同浓度梯度的ATP中培育10min后，在相同条件下检测电化学信号，结果如图3所示。
由图3可知，对比电化学传感器和本发明的电化学传感器的两种电极上均检测到的电信号都随ATP浓度的增加而成线性增强，但在相同条件下，对比电化学传感器的Au圆盘超微电极较本发明的电化学传感器的Au纳米花超微电极上检测到的电信号强度随ATP浓度增加而增强的趋势变缓很多，因此，实验证明用Au纳米花超微电极作为传感器基底，较Au圆盘超微电极可实现高灵敏度的对ATP的测定。
3、电极尺寸大小对快速测定ATP的电化学信号的信噪比的影响
在相同条件下，以电化学沉积Au纳米颗粒于Pt超微电极上的方式，通过改变沉积圈数，制得不同尺寸的Au纳米花超微电极。将不同尺寸的Au纳米花超微电极，首先作相同的电化学处理，并在相同的条件下组装dsDNA，制作成不同尺寸的电化学传感器，接着再将这些不同尺寸的Au纳米花电化学传感器，在相同条件下与10nM ATP溶液中培育10min后，测得不同尺寸的Au纳米花电化学传感器对应的信噪比，如图4所示。
从图中，可以明显看出，随Au纳米花超微电极尺寸大小的增加，得到的信噪比值逐渐降低，在超微电极的临界值(约25μm)处，信噪比值也出现明显的拐点。说明当Au纳米花超微电极尺寸达到一定值后，大约10min时间已不足以使Au纳米花传感器与ATP完成杂交反应。而对于Au纳米花超微电极(即尺寸小于25μm的电极)，可实现对ATP的快速定量测定，且Au纳米花超微电极的尺寸越小，其得到的信噪比越高，因此，当Au纳米花超微电极的尺寸小到一定值时，可实现对ATP更加快速的定量测定。

Claims (9)

1.一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，其特征在于该电化学传感器由以下步骤制得：
(1)将浓度均为1μmol/L的anti-ATP适配体与其互补链混合置于含有1mmol/L的三(2-羧乙基)膦和1mol/L的NaClO4的磷酸缓冲溶液中，加热至70～90℃，缓慢冷却至室温，得到dsDNA；
(2)将Pt圆盘超微电极用超纯水超声清洗，以该Pt圆盘超微电极为工作电极，放入含有质量浓度为1.5％HCl与浓度为1.2mg/mL HAuCl4及0.1mol/L NaCl的混合液中，用循环伏安扫描法在Pt圆盘超微电极上电沉积Au，得到Au纳米花超微电极；
(3)将步骤(2)的Au纳米花超微电极放入0.5mol/L的H2SO4中，利用循环伏安扫描法进行电化学清理，直至扫描的峰电流稳定，之后再用超纯水反复清洗后，完成Au纳米花超微电极的预处理；
(4)将步骤(3)预处理好的Au纳米花超微电极置于步骤(1)的dsDNA中，反应10h～16h后，使dsDNA组装至Au纳米花超微电极上，得到用于快速检测非稳定物质的电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，其特征在于：步骤(1)和步骤(4)中的磷酸缓冲溶液的pH均为7.4。
3.根据权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，其特征在于所述步骤(1)的anti-ATP适配体的序列为：
5’-ferrocene-C6-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTT-C6-SH-3’；
互补链的序列为：
5'-ACCTTCC TCCGC AATAC TCCCC CAGGT-3'。
4.根据权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，其特征在于所述步骤(2)中的Pt圆盘超微电极的制备方法为：截取一段Pt微米线置于石英玻璃管中，将石英玻璃管的一端用环氧树脂胶封住，将放有Pt微米线的石英玻璃管放入P-2000激光拉制仪中，使Pt微米线处于激光加热中心，向石英玻璃管中抽入真空，在抽真空状态下，通过激光加热，以每加热45s冷却15s的加热方式，重复7-8次，使得Pt微米线被紧封于石英玻璃管中；重复进行第二次激光加热，使得被紧封于石英管玻璃中的Pt线与石英管玻璃同时被拉成两节；将拉制好的紧封于石英玻璃管里的Pt微米线的一端用导电银胶与0.2mm钨丝沾粘上，并用环氧树脂将石英管口封住，将拉制的尖端打磨，使得Pt尖端暴露，得到Pt圆盘超微电极。
5.根据权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，其特征在于所述步骤(2)的循环伏安扫描法的扫描范围从0.4V至-0.5V，扫描速度为20mV/s，两电极体系为vs.Ag/AgCl；
所述步骤(3)的循环伏安扫描法的扫描范围从0V至1.5V，扫描速度为30mV/s，两电极体系为vs.Ag/AgCl。
6.根据权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器，其特征在于：所述Au纳米花超微电极的尺寸不超过25μm。
7.一种利用权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器进行ATP快速定量检测的方法，具体是：将权利要求1所述的用于快速检测非稳定物质的电化学传感器置于含有0.1mol/L的2-巯基乙醇和1mol/L NaClO4的磷酸缓冲溶液中后处理8min～12min，使电极表面的活性位点被封闭；之后在36℃～38℃条件下，将该用于快速检测非稳定物质的电化学传感器放入待检ATP溶液中培育8min～12min，利用方波伏安法测定，实现ATP的定量检测。
8.根据权利要求7所述的ATP快速定量检测方法，其特征在于所述ATP溶液是溶于含有50mmol/L NaClO4和1mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、pH＝8.0的缓冲溶液。
9.根据权利要求8所述的ATP快速定量检测方法，其特征在于：所述ATP溶液浓度的检测范围为1.0×10-9～1.0×10-6mol/L。
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