CN104561274B - 一种检测待测液中microRNA含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测待测液中microRNA含量的方法，包括：步骤一、将第一条单链DNA分子修饰于电化学装置的工作电极表面；步骤二、加入样品，样品中的目标microRNA与第一条单链DNA部分互补配对，形成双链结构，步骤三、加入标记有电信号分子的第二条单链DNA，其与microRNA存在部分互补配对的序列，从而形成DNA/microRNA/DNA的杂交结构；步骤四、通过DNA连接酶将第一条DNA与第二条DNA连接成一条单链DNA，通过加热变性，将microRNA从电极表面去除，以有效降低背景信号；步骤五，通过检测DNA末端的电信号分子，可判断样品中是否含有目标microRNA及其相应的浓度。

Description

一种检测待测液中microRNA含量的方法
技术领域
本发明涉及电化学检测领域，特别涉及一种用于检测待测液中microRNA含量的电化学方法。
背景技术
microRNA是一类机体内源性表达的单链小分子RNA，其长度约为18～25个核苷酸，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框。成熟的microRNA通过与mRNA互补结合，在转录后水平抑制靶基因的表达。microRNA普遍存在于真核细胞中，而且数量可观，约占整个基因组基因总数2％左右，microRNA具有高度保守性，时序性和组织特异性。microRNA已被发现在时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等多种生理过程中起着重要的作用，同时包括癌症在内的多种疾病发生过程中也伴随着microRNA的表达量变化。根据国内外的相关研究，某些microRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。有研究发现癌症患者血循环中能检测到具有高度稳定性的肿瘤特异性microRNA。在临床工作中，血清样本比较容易获得，且创伤性小，因此microRNA已经被考虑作为一种新的标志物用于疾病的诊断。
目前检测microRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵分析和实时定量PCR等，但这些方法都需要大型、复杂、昂贵的设备支持，有的甚至更需要大量的人工操作，且动态范围小，检测成本高，不适合常规的分析检测，因此需要发展一种方便简单、成本低廉、检测灵敏精准的方法。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种既简单又灵敏的检测microRNA含量的电化学方法。该方法通过三电极系统中电信号的变化可以直接判断出待测样品中是否存在待检测的microRNA，此法操作简单，抗干扰能力强，能快速、灵敏地实现对目标microRNA的定性和定量检测。
本发明采用如下技术方案：
一种检测待测液中microRNA含量的方法，包括以下步骤：
步骤1)将待测的microRNA的序列分为两个部分，针对所述两个部分分别设计出两条单链DNA分子，所述两条单链DNA分子能够分别与所述microRNA中的两个部分互补配对，其中，第一条单链DNA分子的一端修饰于用于电化学检测的工作电极上，第二条单链DNA分子的一端修饰有电信号分子；
步骤2)将所述工作电极浸入待测液中，使第一条单链DNA分子与microRNA互补配对，形成DNA-microRNA杂交体；
步骤3)将所述工作电极浸入含第二条单链DNA分子的溶液中，使第二条单链DNA分子与microRNA互补配对，形成DNA-microRNA-DNA杂交体；
步骤4)将所述工作电极浸入含DNA连接酶的溶液中，使所述第一条单链DNA分子和第二条单链DNA分子连接为一条完整的末端含所述电信号分子的新单链DNA分子；随后通过加热，除去所述工作电极表面的microRNA；
步骤5)检测所述工作电极中电信号分子的电化学响应值；
步骤6)配制含不同浓度的microRNA标准液，按步骤1)～5)的操作测得不同浓度的microRNA标准液所对应的电化学响应值，并绘制标准曲线图；
步骤7)将步骤5)得到的电化学响应值与标准曲线图比对，从而得出待测液中microRNA的含量。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA的方法，所述第一条单链DNA分子是含有12～30个碱基的脱氧核糖核酸序列。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述第一条单链DNA分子的5’端修饰有磷酸基团。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述第二条单链DNA分子是含有12～30个碱基的脱氧核糖核酸序列。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述第二条单链DNA分子5’端修饰有电信号分子。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述第一条单链DNA分子的3’端修饰有巯基基团或氨基基团。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述工作电极为金电极。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述电信号分子为亚甲基蓝、二茂铁或具有电化学性质的纳米颗粒中的任意一种。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述银纳米颗粒的粒径为4～30nm。
优选的是，所述的检测待测液中microRNA含量的方法，所述具有电化学性质的纳米颗粒为银纳米颗粒。
本发明的有益效果是：本案通过设计两条单链DNA分子与目标microRNA进行连接，随后通过加热变性，将目标microRNA游离，既保持了该方法对目标microRNA的特异性，又可显著降低电化学检测时的背景信号；首次将具有固态转换性能的银纳米颗粒应用于microRNA的电化学检测上，借助电信号分子特有的电化学性质，有效提高了本方法对microRNA含量检测的灵敏度和精确度。
附图说明
图1是本发明提及的microRNA的电化学检测方法的流程示意图。
图2是应用本发明的microRNA电化学检测方法对样品检测过程中的交流阻抗谱测试图。
图3是应用本发明的电化学检测方法检测不同浓度microRNA所得到的伏安图及标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案提出一种检测待测液中microRNA含量的方法，具体包括以下步骤：
步骤1)将待测的目标microRNA的序列分为两个部分，针对两个部分分别设计出两条单链DNA分子，两条单链DNA分子能够分别与microRNA中的两个部分进行碱基互补配对，其中，第一条单链DNA分子的一端修饰于用于电化学检测的工作电极上，第二条单链DNA分子的一端修饰有电信号分子；
步骤2)将工作电极浸入待测液中，使第一条单链DNA分子与microRNA互补配对，形成DNA-microRNA杂交体(如图1所示)；
步骤3)将工作电极浸入含第二条单链DNA分子的溶液中，使第二条单链DNA分子与microRNA互补配对，形成DNA-microRNA-DNA杂交体(如图1所示)；
步骤4)将工作电极浸入含DNA连接酶的溶液中，使第一条单链DNA分子和第二条单链DNA分子连接为一条完整的末端含电信号分子的新单链DNA分子；随后通过加热变性，使microRNA游离于母液中，达到除去工作电极表面的microRNA的目的；
步骤5)检测工作电极中电信号分子的电化学响应值；检测的电化学方法不受限制，可选自循环伏安法、线性扫描伏安法、差分脉冲伏安法或交流阻抗法中的一个；
步骤6)配制含不同浓度的microRNA标准液，按上述步骤1)～5)的操作测得不同浓度的microRNA标准液所对应的电化学响应值，并绘制标准曲线图；
步骤7)将步骤5)得到的电化学响应值与标准曲线图比对，从而得出待测液中microRNA的含量。
其中，工作电极优选为金电极。第一条单链DNA分子优选是含有12～30个碱基的脱氧核糖核酸序列，碱基数量过多或过少，都将影响碱基互补配对的速率和效率；更优选的是，第一条单链DNA分子的5’端修饰有磷酸基团，第一条单链DNA分子的3’端修饰有巯基基团或氨基基团，巯基或氨基上的孤对电子可与金属电极形成配位共价键，从而第一条单链DNA分子的3’端可修饰于工作电极上。第二条单链DNA分子优选是含有12～30个碱基的脱氧核糖核酸序列，更优选的是，第二条单链DNA分子5’端修饰有电信号分子，电信号分子优选是亚甲基蓝、二茂铁或具有电化学性质的纳米颗粒中的任意一种，更优选的是银纳米颗粒AgNPs(Ag nanoparticles)，银纳米颗粒具有优异的电化学性能，在扫描电压下，银纳米颗粒游离出Ag+，与Cl-离子反应，生成AgCl，银纳米颗粒的电信号响应值与microRNA的浓度呈线性，但银纳米颗粒的粒径应被限制，其优选为4～30nm，若小于4nm或大于30nm，则银纳米颗粒的电信号响应值与microRNA的浓度将偏离线性，其线性拟合指数R2将至少降低8％。
实施例1
待测液中的目标microRNA序列为：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。
因此设计：
第一条单链DNA分子的序列为：5’-P-CTGATAAGCTATTTT-SH-3’；
第二条单链DNA分子的序列为：5’-NH2-TTTTTCAACATCAGT-3’。
其中，需要说明的是，目标microRNA序列中下划线部分与第二条单链DNA分子的序列中下划线部分互补配对，目标microRNA序列中斜体部分与第一条单链DNA分子的序列中斜体部分互补配对。两条单链DNA分子的合成方法不受限制，属常规技术，可使用ABI3900型号的DNA合成仪按设计进行任意序列的合成。
将合成好的第一条单链DNA分子修饰于金电极表面，具体方法是将第一段单链DNA分子溶于含有10mM Tris-HCl、10mM TCEP、1mM EDTA、0.1M NaCl的混合液中，控制第一段单链DNA分子的最终浓度为1μM；随后将金电极浸泡入上述混合液中，放置8小时，然后用去离子水将金电极冲洗干净，再浸泡入浓度为1mM的巯基己醇中半小时，通过DNA末端的巯基与金之间的共价反应将其固定于电极表面。
将合成好的第二条单链DNA分子的5’端修饰有银纳米颗粒，其中，银纳米颗粒的合成方法如下：配置100mL含浓度为0.25mM的硝酸银和0.25mM的柠檬酸三钠的混合溶液，并与3mL浓度为10mM硼氢化钠溶液混合，剧烈搅拌30分钟，然后静置过夜，12000g离心30分钟，去除杂质，得到表面覆盖有分散作用的柠檬酸三钠的银纳米颗粒。将该银纳米颗粒加入到含有第二条单链DNA分子的溶液中，混合搅拌1小时，使Ag充分与氨基上的孤对电子发生共价反应，随后12000g离心30分钟，重悬，得到5’端修饰有银纳米颗粒的第二条单链DNA分子。
将修饰有第一条单链DNA分子的金电极浸泡在待测液中，孵育1h，待测液中的microRNA与第一条单链DNA分子互补配对，形成DNA-microRNA杂交体。
随后，再将上述电极浸泡在含修饰有银纳米颗粒的第二条DNA分子的溶液中孵育1h，形成DNA-microRNA-DNA杂交体。
随后，再将上述电极浸泡在含有5unit/mL T4DNA连接酶的溶液中(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，pH＝7.5)，22℃孵育1小时；在DNA-microRNA-DNA杂交体中，第一条DNA的5’端磷酸基团与第二条DNA的3’端羟基在连接酶的作用下反应，最终形成一条末端修饰银纳米颗粒的单链DNA。
随后，继续将上述电极浸泡入95℃的Tris-HCl缓冲液中5min；通过变性反应将microRNA游离出电极表面；
测定和记录金电极的线性扫描伏安图，在金电极中银纳米颗粒的量与待测液中microRNA的量呈正相关，因此可以通过伏安图上的信号推算出待测液中microRNA的含量。具体的实验数据参见图2和图3。
在图2中，(a)为修饰有第一条单链DNA分子的金电极的交流阻抗谱；(b)为修饰有DNA-microRNA-DNA杂交体的金电极的交流阻抗谱，阻抗明显增大，其中杂交体中未修饰银纳米颗粒；(c)为将(b)的电极经过变性，microRNA离开金电极后的交流阻抗谱，阻抗减小；(d)为在(c)的金电极上再修饰上银纳米颗粒的金电极交流阻抗谱，由于其优良的导电性能，阻抗进一步减小。图2说明本方法在原理上的正确性，(d)中电极为实施本案测试方法的最优电极。交流阻抗的测试参数如下：初始电平：0.231V；高频：100000Hz；低频：0.1Hz；振幅：0.005V。
图3为采用上述实施例的方法得到的线性扫描伏安图，以及以该伏安图的峰值与lg([microRNA]/M)值(M表示mol/L)所做的线性曲线，该线性曲线说明了microRNA的浓度越高，伏安图的峰值越大，两者的关系呈线性正相关。线性扫描伏安法的测试参数如下：扫速：100mV/s。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (3)

1.一种检测待测液中microRNA含量的方法，包括以下步骤：
步骤1)将待测的microRNA的序列分为两个部分，针对所述两个部分分别设计出两条单链DNA分子，所述两条单链DNA分子能够分别与所述microRNA中的两个部分互补配对，其中，第一条单链DNA分子的一端修饰于用于电化学检测的工作电极上，第二条单链DNA分子的一端修饰有电信号分子；
步骤2)将所述工作电极浸入待测液中，使第一条单链DNA分子与microRNA互补配对，形成DNA-microRNA杂交体；
步骤3)将所述工作电极浸入含第二条单链DNA分子的溶液中，使第二条单链DNA分子与microRNA互补配对，形成DNA-microRNA-DNA杂交体；
步骤4)将所述工作电极浸入含DNA连接酶的溶液中，使所述第一条单链DNA分子和第二条单链DNA分子连接为一条完整的末端含所述电信号分子的新单链DNA分子；随后通过加热，除去所述工作电极表面的microRNA；
步骤5)检测所述工作电极中电信号分子的电化学响应值；
步骤6)配制含不同浓度的microRNA标准液，按步骤1)～5)的操作测得不同浓度的microRNA标准液所对应的电化学响应值，并绘制标准曲线图；
步骤7)将步骤5)得到的电化学响应值与标准曲线图比对，从而得出待测液中microRNA的含量；
所述第一条单链DNA分子是含有12～30个碱基的脱氧核糖核酸序列；
所述第一条单链DNA分子的5’端修饰有磷酸基团；
所述第二条单链DNA分子是含有12～30个碱基的脱氧核糖核酸序列；
所述第二条单链DNA分子5’端修饰有电信号分子；
所述第一条单链DNA分子的3’端修饰有巯基基团或氨基基团；
所述电信号分子为银纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的检测待测液中microRNA含量的方法，其特征在于，所述工作电极为金电极。
3.根据权利要求1所述的检测待测液中microRNA含量的方法，其特征在于，所述银纳米颗粒的粒径为4～30nm。
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