CN107290406B - 用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法 - Google Patents

用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，所述的磁球纳米复合物包含以下组分：磁球纳米金复合物、发夹DNA探针、二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金、与发夹DNA探针环状部分互补的miRNA。所述用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，包含以下步骤：首先制备磁球纳米金复合物，然后将两种发夹DNA探针在磁球纳米金复合物表面固定，最后是miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定。本发明提供的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物具有制备简单、电化学响应强、检测灵敏度高等优点。

Description

用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复 合物及其制备方法
技术领域
本发明属于电化学传感技术领域，具体涉及一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一种包含17～25个核苷酸的内源性的、非编码的单链RNA，它在基因表达调控过程中发挥着非常重要的作用。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基，pri-miRNA在细胞核内经Drosha酶的作用形成具有发夹结构的pre-miRNA，其长度大约为70～90个碱基，pre-miRNA被转运到细胞质经Dicer酶酶切后，成为长约17～25个核苷酸的成熟miRNA。miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，其表达水平的高低可为癌症的临床诊断及药物开发提供重要的依据。
目前，miRNA定性和定量的检测技术主要有：Northern blotting印迹法、聚合酶链式反应(PCR)、微阵列芯片(microarray)、滚环扩增等，这些方法都是通过碱基互补配对原理进行杂交，然后结合分离、标记以及荧光、电化学等方法对miRNA进行分析检测。其中，Northern blotting印迹法是一种半定量的检测方法，步骤繁琐且耗时、灵敏度不高。PCR技术能够对miRNA进行高灵敏、高特异性的定量检测，但该方法步骤繁琐，需要对miRNA进行预处理。Microarray法虽然在短时间内能快速、高通量地检测大量miRNA序列，但其成本高，无法区分碱基相差很小的同族miRNA序列。“CN 105950711A”公开了一种二茂铁标记的磁性纳米复合物，但是该复合物只能检测一种miRNA序列。单一基因可由多种miRNA共同调节，因此有必要发展一种同时检测多种miRNA的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法。该纳米复合物可用于检测两种miRNA序列，具有制备简单、电化学响应强、检测灵敏度高等优点。
本发明提供了一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，包含以下组分：
a)磁球纳米金复合物；
b)两种发夹DNA探针；
c)二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金；
d)与发夹DNA探针环状部分互补的miRNA。
所述的磁球纳米金复合物磁球半径为100nm～3μm，优选2.5μm～2.8μm。
所述的发夹DNA探针，环状部分为17～25个碱基，茎部为5～10个碱基。
所述的二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金为末端标记了二茂铁的DNA修饰的纳米金和末端标记了亚甲基蓝的DNA修饰的纳米金。
所述标记二茂铁或亚甲基蓝的DNA片段中包含5～20个A碱基序列和其它非A碱基序列。
本发明用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，包含以下步骤：
(1)磁球纳米金复合物的制备
将直径为30～50nm氨基化的金纳米粒子与磁球混合震荡，磁性分离，除去上清液，向磁球中加入H2O2和HAuCl4的混合溶液，震荡后除去上清液,制得磁球纳米金复合物；
(2)在磁球纳米金复合物表面固定两种发夹DNA探针
在磁球纳米金复合物中加入两种发夹DNA探针，常温震荡，磁分离；采用巯基己醇封闭，磁分离；加入质量百分数为1％的牛血清白蛋白溶液封闭，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物，备用；
(3)二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的制备
将末端修饰二茂铁或亚甲基蓝的DNA分别与羟基化的纳米金粒子(粒径为10～20nm)混合震荡，加入含NaCl的PBS静置，离心后分散在PBS中，制得二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金；
(4)miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定
将步骤(2)得到的两种发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入两种miRNA序列，室温震荡，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡，超纯水清洗，磁分离得到本发明二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物。
所述步骤(1)中将6～10mL，直径为30～50nm氨基化的金纳米粒子与150～250μL磁球混合震荡15～25min，磁性分离，除去上清液，向磁球中加入2.2～6.6mM H2O2和1～3.1mMHAuCl4的混合溶液2～6mL，震荡10～15h，除去上清液，制得磁球纳米金复合物。
所述步骤(2)中将磁球纳米金复合物中加入浓度分别为0.5～2μM的两种发夹DNA探针的混合液50～200μL，常温震荡3～6h，磁分离，采用50～100μL浓度为0.1～0.6mM的巯基己醇封闭0.5～1h，磁分离；加入50～100μL质量百分数为1％的牛血清白蛋白溶液封闭0.5～1h，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物，备用。
所述步骤(3)中将100～260μL，4～10μM末端修饰二茂铁或亚甲基蓝的DNA分别与500～1200μL，10～20nM羟基化的纳米金粒子(粒径为10～20nm)混合震荡12～18h，加入250～750μL含0.05～0.2M NaCl的PBS(10～100mM)静置35～45h，离心后分散在250～1000μL，10～100mM的PBS中，制得1.3～2.5μM二茂铁修饰的纳米金和1.3～2.5μM亚甲基蓝修饰的纳米金。
所述步骤(4)中将在步骤(2)得到的两种发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入80～200μL浓度分别为1pM～1μM的两种miRNA序列，室温震荡1～2h，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入30～80μL，1.3～2.5μM二茂铁修饰的纳米金和30～80μL，1.3～2.5μM亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡1～2h，超纯水清洗，磁分离得到本发明二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物。
由于本发明在于磁球纳米金表面固定两种发夹DNA探针，miRNA与发夹探针的环状部分杂交导致发夹探针打开，通过发夹探针的茎部序列与辅助探针的杂交，表面修饰二茂铁、亚甲基蓝的纳米金随后连接到磁球纳米金表面。通过检测二茂铁与亚甲基蓝的电化学信号，实现了同时检测两种miRNA的目标。
本发明的技术方案相比于现有技术，有如下优点：
1)易于磁性分离，制备简单；
2)具有双重电化学信号以及双重信号放大功能，可实现两种不同序列的miRNA的快速、灵敏检测，电化学响应强；
3)本发明对两种miRNA序列的最低检测浓度可达到1fM，检测灵敏度高。
附图说明
图1为二茂铁修饰的纳米金示意图。
图2为亚甲基蓝修饰的纳米金示意图。
图3为二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步描述，而并非限制本发明。
实施例1
用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法1
(1)磁球纳米金复合物的制备
将8mL，直径为30～50nm氨基化的金纳米粒子与200μL磁球混合震荡15min，磁性分离，除去上清液，向磁球中加入4.4mM H2O2和2.1mM HAuCl4的混合溶液4mL，震荡12h，除去上清液，制得磁球纳米金复合物；
(2)在磁球纳米金复合物表面固定两种发夹DNA探针
磁球纳米金复合物中加入浓度分别为1μM的两种发夹DNA探针的混合液100μL，常温震荡3h，磁分离，采用50μL浓度为0.1mM的巯基己醇封闭0.5h，磁分离，加入50μL质量百分数为1％的牛血清白蛋白溶液封闭1h，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物，备用；
(3)二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的制备
260μL，10μM末端修饰二茂铁或亚甲基蓝的DNA分别与1000μL，13nM羟基化的纳米金粒子(粒径为10～20nm)混合震荡16h，加入500μL含0.1M NaCl的PBS(10mM)静置40h，离心后分散在500μL，10mM的PBS中，制得1.95μM二茂铁修饰的纳米金和1.95μM亚甲基蓝修饰的纳米金，图1为二茂铁修饰的纳米金示意图，图2为亚甲基蓝修饰的纳米金示意图；
(4)miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定
在步骤(2)得到的发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入100μL浓度分别为1pM的两种miRNA序列，室温震荡1h，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入30μL，1.95μM二茂铁修饰的纳米金和30μL，1.95μM亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡1h，超纯水清洗，磁分离得到本发明二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，图3为二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物示意图。
实施例2
用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法2
(1)磁球纳米金复合物的制备
将6mL,直径为30～50nm氨基化的金纳米粒子与150μL磁球混合震荡20min，磁性分离，除去上清液，向磁球中加入2.2mM H2O2和1mM HAuCl4的混合溶液2mL，震荡10h，除去上清液,制得磁球纳米金复合物；
(2)在磁球纳米金复合物表面固定两种发夹DNA探针
磁球纳米金复合物中加入浓度分别为0.5μM的两种发夹DNA探针的混合液50μL，常温震荡4h，磁分离，采用75μL浓度为0.4mM的巯基己醇封闭0.5h，磁分离，加入75μL质量百分数为1％的牛血清白蛋白溶液封闭0.5h，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物，备用；
(3)二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的制备
100μL,4μM末端修饰二茂铁或亚甲基蓝的DNA分别与500μL,10nM羟基化的纳米金粒子(粒径为10～20nm)混合震荡12h，加入250μL含0.05M NaCl的PBS(10mM)静置35h，离心后分散在250μL，10mM的PBS中，制得1.3μM二茂铁修饰的纳米金和1.3μM亚甲基蓝修饰的纳米金；
(4)miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定
在步骤(2)得到的发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入80μL浓度分别为1pM的两种miRNA序列，室温震荡1h，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入50μL，1.3μM二茂铁修饰的纳米金和50μL，1.3μM亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡1h，超纯水清洗，磁分离得到本发明二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物。
实施例3
用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法3
(1)磁球纳米金复合物的制备
将10mL,直径为30～50nm氨基化的金纳米粒子与250μL磁球混合震荡25min，磁性分离，除去上清液，向磁球中加入6.6mM H2O2和3.1mM HAuCl4的混合溶液6mL，震荡15h，除去上清液,制得磁球纳米金复合物；
(2)在磁球纳米金复合物表面固定两种发夹DNA探针
磁球纳米金复合物中加入浓度分别为2μM的两种发夹DNA探针的混合液200μL，常温震荡6h，磁分离，采用100μL浓度为0.6mM的巯基己醇封闭1h，磁分离，加入100μL质量百分数为1％的牛血清白蛋白溶液封闭1h，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物，备用；
(3)二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的制备
260μL,10μM末端修饰二茂铁或亚甲基蓝的DNA分别与1200μL,20nM羟基化的纳米金粒子(粒径为10～20nm)混合震荡18h，加入750μL含0.2M NaCl的PBS(100mM)静置45h，离心后分散在1000μL，100mM的PBS中，制得2.5μM二茂铁修饰的纳米金和2.5μM亚甲基蓝修饰的纳米金；
(4)miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定
在步骤(2)得到的发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入200μL浓度分别为1μM的两种miRNA序列，室温震荡2h，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入80μL，2.5μM二茂铁修饰的纳米金和80μL，2.5μM亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡2h，超纯水清洗，磁分离得到本发明二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物。

Claims (9)

1.一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，包含以下组分：
a）磁球纳米金复合物；
b）两种发夹DNA探针；
c）二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金；
d）与发夹DNA探针环状部分互补的miRNA；
所述的二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金为末端标记了二茂铁的DNA修饰
的纳米金和末端标记了亚甲基蓝的DNA修饰的纳米金；
所述的标记二茂铁或亚甲基蓝的DNA片段包含5~20个腺嘌呤（A）碱基序列和其它非A碱基序列。
2.根据权利要求 1所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，其特征在于，所述的磁球纳米金复合物磁球半径为100 nm~3μm。
3.根据权利要求 2所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，其特征在于，所述的磁球纳米金复合物磁球半径为2.5 μm~2.8 μm。
4.根据权利要求 1所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，其特征在于，所述的发夹DNA探针，其环状部分为17~25个碱基，茎部为5~10个碱基。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）磁球纳米金复合物的制备
将直径为30~50 nm氨基化的金纳米粒子与磁球混合震荡，磁性分离，除去上清液，向吸附金纳米粒子的磁球中加入H2O2和HAuCl4的混合溶液，震荡后除去上清液, 制得磁球纳米金复合物；
（2）在磁球纳米金复合物表面固定两种发夹DNA探针
在磁球纳米金复合物中加入两种发夹DNA探针，常温震荡，磁分离；采用巯基己醇封闭，磁分离；加入质量百分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物，备用；
（3）二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的制备
将末端修饰二茂铁和亚甲基蓝的DNA分别与羟基化的纳米金粒子混合震荡，羟基化的纳米金粒子的粒径为10~20 nm，加入含NaCl的PBS静置，离心后分散在PBS中，制得二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金；
（4）miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定
将步骤（2）得到的两种发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入两种miRNA序列，室温震荡，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡，超纯水清洗，磁分离得到二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物。
6.根据权利要求 5所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中将6~10 mL，直径为30~50 nm氨基化的金纳米粒子与150~250 μL磁球混合震荡15~25 min，磁性分离，除去上清液，向吸附金纳米粒子的磁球中加入2.2~6.6 mM H2O2和1~3.1 mM HAuCl4的混合溶液2 ~6 mL，震荡10~15 h，除去上清液，制得磁球纳米金复合物。
7.根据权利要求 5所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中将磁球纳米金复合物中加入浓度分别为0.5~2 μM的两种发夹DNA探针的混合液50~200 μL，常温震荡3~6 h，磁分离；采用50~100 μL浓度为0.1~0.6 mM的巯基己醇封闭0.5~1 h，磁分离；加入50~100 μL质量百分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭0.5~1 h，磁分离，得到发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物。
8.根据权利要求 5所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中将100~260 μL, 4~10 μM末端修饰二茂铁和亚甲基蓝的DNA分别与500~1200 μL, 10 ~20 nM羟基化的纳米金粒子混合震荡12~18 h，加入250~ 750 μL含0.05~0.2 M NaCl的PBS静置35~45 h，PBS的浓度为10~100 mM，离心后分散在250~1000 μL，10~100 mM的PBS中，制得1.3~2.5 μM二茂铁修饰的纳米金和1.3~2.5 μM亚甲基蓝修饰的纳米金。
9.根据权利要求 5所述的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中将步骤（2）得到的两种发夹DNA探针修饰的磁球纳米金复合物中加入80~200 μL浓度分别为1 pM~1 μM的两种miRNA序列，室温震荡1~2h，通过磁分离除去未反应的miRNA，分别加入30~80 μL，1.3~2.5 μM二茂铁修饰的纳米金和30~80 μL，1.3~2.5 μM亚甲基蓝修饰的纳米金，震荡1~2 h，超纯水清洗，磁分离得到二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物。
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