CN111218496B - 一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用 - Google Patents

一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111218496B
CN111218496B CN202010048588.3A CN202010048588A CN111218496B CN 111218496 B CN111218496 B CN 111218496B CN 202010048588 A CN202010048588 A CN 202010048588A CN 111218496 B CN111218496 B CN 111218496B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
solution
magnetic
concentration
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010048588.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111218496A (zh
Inventor
王建秀
胡雨晴
卢汉文
高娟
衣馨瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN202010048588.3A priority Critical patent/CN111218496B/zh
Publication of CN111218496A publication Critical patent/CN111218496A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111218496B publication Critical patent/CN111218496B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

本发明公开了一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用，本发明将易于分离富集的磁球、比表面积大的纳米金和DNA步行者相结合，磁球能降低干扰物的非特异性吸附，纳米金能增大DNA序列的负载量，DNA步行者在酶的作用下可逐步切割信号分子导致电化学信号的变化。相比传统的电化学检测方法，该方法避免了在电极表面修饰DNA序列以及用封闭剂降低非特异性吸附等繁琐步骤，且具有极高的灵敏度，对靶点miRNA‑182的最低检测浓度可达1fM。本发明的检测方法测定范围宽，为0.001‑2pM，正常血清样品中miRNA‑182的含量约为0.2‑1pM，胶质瘤患者中约为1‑2pM，本发明的方法对正常血清样品以及胶质瘤患者血清样品中miRNA‑182的测定具有可行性。

Description

一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其 产品与应用
技术领域
本发明属于生物材料及电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物细胞中的RNA调控因子，通常具有21个碱基左右的长度，在调控发育过程中发挥重要作用。研究发现，miRNA的异常表达与多种癌症相关，例如miRNA-182与胶质瘤有着密切的关系，这也使miRNA成为癌症诊断的新的生物学标志物，给人类疾病的治疗提供一种新的临床信息。但是由于其在细胞中的含量低、尺寸小和易降解等特点，定量检测细胞内的miRNA是非常困难的。
miRNA的传统检测方法有：Northern印迹法、实时聚合酶链反应(PCR)和miRNA的基因芯片检测等。其中，Northern印迹法被认为是miRNA检测的黄金标准方法，但是由于它操作繁琐，费时费力，灵敏度相对较低并且样品需要量大(10μg样品)等缺点使得它不适用于常规的临床诊断；PCR和基因芯片检测法存在效率低、耗时、经济性低、设备昂贵和操作复杂的缺点，限制了它们的生物和生物医学应用，因此，开发新的miRNA的检测策略是具有重要意义的。采用电化学传感器测量miRNA，主要是通过结合有DNA探针的纳米粒子材料对miRNA进行检测，其方法简单，成本低，因而得以飞速的发展，但缺点是检测限较高，因而研发DNA探针修饰的纳米粒子材料用于检测低浓度的miRNA有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高，选择性好，检测浓度低的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用。
本发明这种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)DNA修饰的纳米金：将氯金酸溶液与水混合后加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，继续加热反应，得到含金纳米粒子溶液；向含金纳米粒子溶液中加入一端修饰巯基、一端修饰生物素基团的DNA连接探针进行反应，反应完毕后，加入氯化钠老化，离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金；
(2)强导电性磁性纳米复合物的制备：将步骤(1)中DNA修饰的纳米金溶液加入到亲和素修饰的磁球溶液中进行反应，磁性分离除去未反应的纳米金，得到磁球-纳米金复合物；在磁球-纳米金复合物中加入氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，震荡，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物；
(3)混合探针溶液的制备：DNA步行者探针的一端和保护探针在水浴中杂交，得到DNA步行者探针和保护探针的杂交双链；接着将杂交双链与二茂铁修饰的信号探针进行混合，然后加入TCEP进行还原反应，还原二硫键，得到混合探针溶液；
(4)DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备：将步骤(3)中的混合探针溶液加入到步骤(2)中强导电性的磁性纳米复合物中进行反应，反应完毕后，磁性分离除去未反应的DNA链，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
所述步骤(1)中，氯金酸的浓度为0.005～0.015g/mL，氯金酸溶液与水的体积比为1:(80～100)，柠檬酸钠的浓度为0.01～0.03g/mL，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:(1～3)；加热反应时间为10～30min；DNA连接探针浓度为5～15mM，DNA连接探针与纳米金溶液的体积比为1:(15～25)，反应时间为6～12h；所述的DNA连接探针为SH-T30-Biotin，如序列1所示。
所述步骤(2)中，所述磁球的粒径为0.5～1.5μm，磁球溶液浓度为9～11mg/mL，DNA修饰的纳米金的浓度为10～15nM，DNA修饰的纳米金与磁球的体积比为35～45:1，反应时间为2～5h；氯金酸溶液的浓度为0.005～0.015g/mL，柠檬酸钠溶液浓度为0.005～0.015g/mL，磁球-纳米金复合物溶液、氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:(7～9):(7～9)，震荡时间为0.5～1.5h。
所述步骤(3)中，DNA步行者探针的序列为SH-T40-GGT AGA ACT CAC ACT CCT CAGC(序列2所示)，保护探针的序列为TG AGG AGT GTG AGT TCT ACC ATT GCC AAA(序列3所示)，信号探针序列为SH-T10-GCTGAGGTT-Fc(序列4所示)；DNA步行者探针浓度为5～15μM，保护探针的浓度为5～15μM，步行者探针与保护探针的体积比为1:1；水浴杂交温度为90～100℃，杂交时间为4～6min；杂交双链与信号探针的摩尔比为1:15～25；TCEP浓度为5～15mM，与信号探针的体积比为1:(2～3)；还原反应时间为0.5～1.5h。
所述步骤(4)中，强导电性的磁性纳米复合物溶液的浓度为9～11mg/mL，混合探针溶液与强导电性的磁性纳米复合物溶液的体积比为(40～50):10，反应时间为6～12h。
根据所述的制备方法制备得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物在检测miRNA中的应用。
所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物在检测血清中miRNA-182中的应用。
采用DNA步行者偶联的磁性纳米复合物检测血清中miRNA-182的方法，包括以下步骤：
A、配置不同浓度的miRNA-182溶液，然后将不同浓度的溶液分别与DNA步行者偶联的磁性纳米复合物进行反应，反应完毕后，磁性分离和洗涤，然后用PBS重溶，加入Nb.BbvCI内切酶，进行切割反应，随后进行磁性分离和洗涤，得到不同浓度miRNA-182溶液处理的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物；
B、将金电极打磨抛光后，用处理后的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物进行修饰，得到工作电极；然后采用微分脉冲伏安法，以三电极体系，高氯酸钾溶液为支持电解质，进行测试，并绘制二茂铁氧化峰电流与对应miRNA-182浓度的标准曲线；
C、将血清样品按照步骤A中的处理方法与DNA步行者偶联的磁性纳米复合物进行反应和酶切，然后将处理后的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物按照步骤B的方法进行测试，将测得的数据代入标准曲线方程，即得血清样本中miRNA-182的浓度。
所述步骤A中，miRNA-182溶液的浓度为0.001pM，0.04pM，0.08pM，0.4pM，0.8pM，1.2pM，1.5pM，1.8pM，2pM；DNA步行者偶联的磁性纳米复合物溶液的浓度为5mg/mL；miRNA-182溶液与磁性纳米复合物溶液的体积比为(4～6):2，反应时间为0.3～1h，Nb.BbvCI内切酶的浓度为10U/mL，内切酶与磁性纳米复合物溶液的体积比为1:(1～3)；切割反应时间为25～35min；所述步骤B中，高氯酸钾溶液的浓度为100mM，微分脉冲伏安法的参数为：扫速为0.1V/s，扫描范围为-0.1-0.8V，脉冲宽度为50ms，脉冲振幅为50mV。
本发明的原理：本发明原理如图1所示，两端分别修饰巯基和生物素的DNA链使纳米金和亲和素修饰的磁球相连，其中，巯基与纳米金通过Au-S键结合，而亲和素和生物素间具有特异性的相互作用；用柠檬酸钠还原氯金酸使磁球表面进一步生长纳米金，从而增强磁球的导电性；将DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及信号探针通过Au-S键固定到磁性纳米复合物表面；加入miRNA-182目标序列使其和保护探针杂交，解旋后的DNA步行者探针与信号探针杂交形成Nb.BbvCI内切酶识别的位点，在内切酶作用下，信号探针中带有二茂铁基团的序列被切除，电化学信号降低，峰电流与miRNA-182的浓度成反比关系(如图2)；通过绘制氧化峰电流与miRNA-182浓度的标准曲线来确定血清样品中miRNA-182的浓度(如图3)。本发明提出了将DNA步行者与磁性纳米复合物相结合并应用于电化学检测，与传统电化学方法相比，提高了分析选择性和灵敏度。
本发明的有益效果：1)本发明将易于分离富集的磁球、比表面积大的纳米金和DNA步行者相结合，磁球能降低干扰物的非特异性吸附，纳米金能增大DNA序列的负载量，DNA步行者在酶的作用下可逐步切割信号分子导致电化学信号的变化。相比传统的电化学检测方法，该方法避免了在电极表面修饰DNA序列以及用封闭剂降低非特异性吸附等繁琐步骤，且具有极高的灵敏度，对靶点miRNA-182的最低检测浓度可达1fM。2)本发明的检测方法测定范围宽，为0.001-2pM，正常血清样品中miRNA-182的含量约为0.2-1pM，胶质瘤患者中约为1-2pM，本发明的方法对正常血清样品以及胶质瘤患者血清样品中miRNA-182的测定具有可行性。3)本发明的检测方法将“磁球表面偶联纳米金”-“DNA自组装”-“DNA步行者信号放大”-“磁性富集”等多个步骤相结合对miRNA-182浓度进行分析，该方法操作简单、选择性好、灵敏度高、且检测范围宽。4)本发明的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物具有如下特性：易于磁性分离、导电性好、便于表面修饰、可实现多重信号放大。因此，该复合物在电化学分析方面具有一定的应用潜力。
附图说明
图1本发明的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备和检测原理图；
图2实施例2中采用微分脉冲伏安法的检测结果图。
图3实施例2中的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例中DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备，其制备流程图如图1所示：包括以下步骤，
(1)纳米金的制备：1mL质量浓度为0.01g/mL的氯金酸和99mL二次水混匀，边搅拌边加热至溶液沸腾，然后加入2mL质量浓度为0.02g/mL的柠檬酸钠，继续加热15min，冷却至室温，得到含纳米金的溶液。
(2)DNA在纳米金表面的固定：50μL浓度为10mM的一端修饰巯基，另一端修饰生物素基团的DNA(SH-T30-Biotin)加入到1mL步骤(1)所制得的纳米金溶液中，反应过夜，随后每隔2h加入浓度为3M的氯化钠溶液，一共加5次，继续反应12h，用高速离心机离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金。
(3)磁球上偶联纳米金以及金生长：将步骤(2)中2mL DNA修饰的纳米金(13nM)加入到50μL浓度为10mg/mL，亲和素修饰的平均粒径为1μm的磁球中反应3.5h，磁性分离除去未反应的DNA修饰的纳米金，得到磁球-纳米金复合物，然后加入400μL浓度为0.01g/mL氯金酸和400μL浓度为0.01g/mL柠檬酸钠还原剂，震荡反应1h，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物。(亲和素修饰的磁球购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，粒径约为1μm，浓度为10mg/mL。)
(4)DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及信号探针在磁性纳米复合物上的固定：200μL浓度为10μM的DNA步行者探针和200μL浓度为10μM的保护探针(序列分别为SH-T40-GGT AGA ACT CAC ACT CCT CAGC和TGA GGA GTG TGA GTT CTA CCA TT GCC AAA)在95℃水浴中反应5min，冷却至室温，得到DNA步行者探针与保护探针的杂交双链。20μL浓度为10mM TCEP加入到10μL浓度为10μM DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及200μL浓度为10μM的信号探针(序列为SH-T10-GCTGAGGTT-Fc)的混合溶液(二者摩尔比为1:20)中反应1h。反应结束后将230μL混合液加入到步骤(3)得到的50μL浓度为10mg/L的强导电性磁性纳米复合物中反应过夜，磁性分离，除去未反应的杂交双链和信号探针，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
实施例2
DNA步行者偶联的磁性纳米复合物对miRNA-182的检测
(1)DNA步行者偶联的磁性纳米复合物与miRNA-182的反应以及酶切割：50μL浓度为0.001pM，0.04pM，0.08pM，0.4pM，0.8pM，1.2pM，1.5pM，1.8pM，2pM的miRNA-182溶液分别加入至20μL浓度为5mg/mL的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物中反应0.3～1h，磁性分离和洗涤。用相同体积的PBS重溶，加入10μL,10U/mL的Nb.BbvCI内切酶，切割反应时间为30min，随后进行磁性分离和洗涤，得到多份待测的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
(2)磁性金电极的预处理：将磁性金电极用粒径为0.05μm的三氧化二铝在抛光布上打磨5～10min，用二次水、无水乙醇分别超声清洗1～2min，氮气吹干。
(3)已知浓度的miRNA-182的分析：在室温条件下，采用三电极体系，其中，(1)中磁性纳米复合物修饰的磁性金电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝为辅助电极，100mM高氯酸钾溶液为支持电解质，扫速为0.1V/s，扫描范围为-0.1-0.8V。记录不同miRNA-182浓度时二茂铁的氧化峰电流，得到的结果图如图2所示，可以看出，miRNA-182的浓度与氧化峰电流值成反比，根据上述结果绘制标准曲线，其结果如图3所示。
(4)血清样品中miRNA-182的测定：将血清样品加入至20μL，浓度为5mg/mL的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物中反应0.3～1h。磁性分离和洗涤，用相同体积的PBS重溶，加入浓度为10U/mL的Nb.BbvCI内切酶，切割反应时间为30min，进一步磁性分离和洗涤，得到与血清样品中miRNA-182反应后的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。将上述磁性纳米复合物收集到磁性金电极表面进行微分脉冲伏安测定，通过测得的氧化峰电流，从标准曲线上得出血清样品中miRNA-182的浓度，测出该血清样品中miRNA-182的浓度为1.57pM。
实施例3
本实施例中DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备，其制备流程图如图1所示：包括以下步骤，
(1)纳米金的制备：1mL质量浓度为0.005g/mL的氯金酸和80mL二次水混匀，边搅拌边加热至溶液沸腾，然后加入1mL质量浓度为0.01g/mL的柠檬酸钠，继续加热10min，冷却至室温，得到含纳米金的溶液。
(2)DNA在纳米金表面的固定：50μL浓度为15mM的一端修饰巯基，另一端修饰生物素基团的DNA(SH-T30-Biotin)加入到1.25mL步骤(1)所制得的纳米金溶液中，反应6h，随后每隔2h加入浓度为3M的氯化钠溶液，一共加5次，继续反应12h，用高速离心机离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金。
(3)磁球上偶联纳米金以及金生长：将步骤(2)中2mL DNA修饰的纳米金(10nM)加入到57μL浓度为9mg/mL，亲和素修饰的平均粒径为1μm的磁球中反应2h，磁性分离除去未反应的DNA修饰的纳米金，得到磁球-纳米金复合物，然后加入400μL浓度为0.005g/mL氯金酸和400μL浓度为0.005g/mL柠檬酸钠还原剂，震荡反应0.5h，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物。(亲和素修饰的磁球购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，粒径约为1μm，浓度为10mg/mL。)
(4)DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及信号探针在磁性纳米复合物上的固定：200μL浓度为5μM的DNA步行者探针和200μL浓度为5μM的保护探针(序列分别为SH-T40-GGT AGA ACT CAC ACT CCT CAGC和TGA GGA GTG TGA GTT CTA CCA TT GCC AAA)在90℃水浴中反应4min，冷却至室温，得到DNA步行者探针与保护探针的杂交双链。20μL浓度为5mM的TCEP加入到10μL浓度为10μM DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及200μL浓度为10μM的信号探针(序列为SH-T10-GCTGAGGTT-Fc)的混合溶液(二者摩尔比为1:20)中反应0.5h。反应结束后将230μL混合液加入到步骤(3)得到的50μL浓度为10mg/L的强导电性磁性纳米复合物中反应过夜，磁性分离，除去未反应的杂交双链和信号探针，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
实施例4
本实施例中DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备，包括以下步骤，
(1)纳米金的制备：1mL质量浓度为0.015g/mL的氯金酸和100mL二次水混匀，边搅拌边加热至溶液沸腾，然后加入3mL质量浓度为0.03g/mL的柠檬酸钠，继续加热30min，冷却至室温，得到含纳米金的溶液。
(2)DNA在纳米金表面的固定：50μL浓度为15mM的一端修饰巯基，另一端修饰生物素基团的DNA(SH-T30-Biotin)加入到0.75mL步骤(1)所制得的纳米金溶液中，反应12h，随后每隔2h加入浓度为3M的氯化钠溶液，一共加5次，继续反应12h，用高速离心机离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金。
(3)磁球上偶联纳米金以及金生长：将步骤(2)中2.25mL DNA修饰的纳米金(15nM)加入到50μL浓度为11mg/mL，亲和素修饰的平均粒径为1μm的磁球中反应5h，磁性分离除去未反应的DNA修饰的纳米金，得到磁球-纳米金复合物，然后加入450μL浓度为0.015g/mL的氯金酸和450μL浓度为0.015g/mL的柠檬酸钠还原剂，震荡反应1.5h，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物。(亲和素修饰的磁球购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，粒径约为1μm，浓度为10mg/mL。)
(4)DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及信号探针在磁性纳米复合物上的固定：200μL浓度为15μM的DNA步行者探针和200μL浓度为15μM的保护探针(序列分别为SH-T40-GGT AGA ACT CAC ACT CCT CAGC和TGA GGA GTG TGA GTT CTA CCA TT GCC AAA)在95℃水浴中反应6min，冷却至室温，得到DNA步行者探针与保护探针的杂交双链。20μL浓度为10mM的TCEP加入到10μL浓度为10μM DNA步行者探针与保护探针的杂交双链以及200μL浓度为10μM的信号探针(序列为SH-T10-GCTGAGGTT-Fc)的混合溶液(二者摩尔比为1:20)中反应1h。反应结束后将230μL混合液加入到步骤(3)得到的50μL浓度为10mg/L的强导电性磁性纳米复合物中反应过夜，磁性分离，除去未反应的杂交双链和信号探针，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
本发明的工艺选择将带负电荷的纳米金通过DNA链连接到粒径约为1μm、同样带负电的磁球表面，在磁球表面通过进一步生长纳米金形成强导电性的磁性纳米复合物。通过Au-S键，在磁性纳米复合物表面固定已用保护探针封闭酶切位点的DNA步行者探针，此时的DNA步行者探针被锁定不能发挥其功效。当序列完全匹配的miRNA与保护探针通过末端介导的链置换反应形成双螺旋结构时，DNA步行者探针被释放出来，与表面固定的二茂铁标记的信号探针杂交形成内切酶识别位点，在内切酶作用下二茂铁标记的信号探针被切除，导致DNA步行者探针再次被释放出来。释放出来的DNA步行者探针与另一个信号探针再次杂交形成酶切位点，在内切酶的作用下再次被切除，如此循环往复直到几乎所有二茂铁标记的信号探针被切除。将上述复合物收集到磁性金电极表面进行电化学测定。基于复合物对电化学信号的多重放大以及酶切前后二茂铁信号的变化，可实现含量极低的miRNA序列的检测。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ggtagaactc acactcctca 60
gc 62
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tgaggagtgt gagttctacc attgccaaa 29
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
tttttttttt gctgaggtt 19

Claims (10)

1.一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）DNA修饰的纳米金：将氯金酸溶液与水混合后加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，继续加热反应，得到含金纳米粒子溶液；向含金纳米粒子溶液中加入一端修饰巯基、一端修饰生物素基团的DNA连接探针进行反应，反应完毕后，加入氯化钠老化，离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金；
（2）强导电性磁性纳米复合物的制备：将步骤（1）中DNA修饰的纳米金溶液加入到亲和素修饰的磁球溶液中进行反应，磁性分离除去未反应的纳米金，得到磁球-纳米金复合物；在磁球-纳米金复合物中加入氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，震荡，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物；
（3）混合探针溶液的制备：DNA步行者探针的一端和保护探针在水浴中杂交，得到DNA步行者探针和保护探针的杂交双链；接着将杂交双链与二茂铁修饰的信号探针进行混合，然后加入TCEP进行还原反应，还原二硫键，得到混合探针溶液；
（4）DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备：将步骤（3）中的混合探针溶液加入到步骤（2）中强导电性的磁性纳米复合物中进行反应，反应完毕后，磁性分离除去未反应的DNA链，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
2.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，氯金酸的浓度为0.005~0.015 g/mL，氯金酸溶液与水的体积比为1:(80~100)，柠檬酸钠的浓度为0.01~0.03 g/mL，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:(1~3)；加热反应时间为10~30 min；DNA连接探针浓度为5~15 mM，DNA连接探针与纳米金溶液的体积比为1:(15~25)，反应时间为6~12 h；所述的DNA连接探针为SH-T30-Biotin，如序列1所示。
3.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述磁球的粒径为0.5~1.5 μm，磁球溶液浓度为9~11mg/mL，DNA修饰的纳米金的浓度为10~15 nM，DNA修饰的纳米金与磁球的体积比为35~45:1，反应时间为2~5h；氯金酸溶液的浓度为0.005~0.015 g/mL，柠檬酸钠溶液浓度为0.005~0.015 g/mL，磁球-纳米金复合物溶液、氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:(7~9):(7~9)，震荡时间为0.5~1.5 h。
4.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，DNA步行者探针的序列为SH-T40-GGT AGA ACT CAC ACT CCT CAGC，如序列2所示，保护探针的序列为TG AGG AGT GTG AGT TCT ACC ATT GCC AAA，如序列3所示，信号探针序列为SH-T10-GCTGAGGTT-Fc，如序列4所示；DNA步行者探针浓度为5~15 μM，保护探针的浓度为5~15 μM，步行者探针与保护探针的体积比为1:1；水浴杂交温度为90~100 ℃，杂交时间为4~6 min；杂交双链与信号探针的摩尔比为1:15~25；TCEP的浓度为5~15mM，与信号探针的体积比为1:(2~3)；还原反应时间为0.5~1.5 h。
5.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，强导电性的磁性纳米复合物溶液的浓度为9~11 mg/mL，混合探针溶液与强导电性的磁性纳米复合物溶液的体积比为(40~50):10，反应时间为6~12 h。
6.一种根据权利要求1~5任意一项所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法制备得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。
7.一种根据权利要求6所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物在检测miRNA中的应用。
8.根据权利要求7所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物在检测血清中miRNA-182中的应用。
9.一种采用权利要求8所述DNA步行者偶联的磁性纳米复合物检测血清中miRNA-182的方法，包括以下步骤：
A、配置不同浓度的miRNA-182溶液，然后将不同浓度的溶液分别与DNA步行者偶联的磁性纳米复合物进行反应，反应完毕后，磁性分离和洗涤，然后用PBS重溶，加入Nb.BbvCI内切酶，进行切割反应，随后进行磁性分离和洗涤，得到不同浓度miRNA-182溶液处理的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物；
B、将金电极打磨抛光后，用处理后的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物进行修饰，得到工作电极；然后采用微分脉冲伏安法，以三电极体系，高氯酸钾溶液为支持电解质，进行测试，并绘制二茂铁氧化峰电流与对应miRNA-182浓度的标准曲线；
C、将血清样品按照步骤A中的处理方法与DNA步行者偶联的磁性纳米复合物进行反应和酶切，然后将处理后的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物按照步骤B的方法进行测试，将测得的数据代入标准曲线方程，即得血清样本中miRNA-182的浓度。
10.根据权利要求9所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物检测血清中miRNA-182的方法，其特征在于，所述步骤A中，miRNA-182溶液的浓度为0.001 pM，0.04 pM，0.08 pM，0.4pM，0.8 pM，1.2 pM，1.5 pM，1.8 pM，2 pM； DNA步行者偶联的磁性纳米复合物溶液的浓度为5 mg/mL；miRNA-182溶液与磁性纳米复合物溶液的体积比为(4~6):2，反应时间为0.3-1h，Nb.BbvCI内切酶的浓度为10 U/mL，内切酶与磁性纳米复合物溶液的体积比为1: (1~3)；切割反应时间为25~35 min；所述步骤B中，高氯酸钾溶液的浓度为100 mM，微分脉冲伏安法的参数为：扫速为0.1 V/s，扫描范围为-0.1-0.8 V，脉冲宽度为50 ms，脉冲振幅为50 mV。
CN202010048588.3A 2020-01-16 2020-01-16 一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用 Active CN111218496B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010048588.3A CN111218496B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010048588.3A CN111218496B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111218496A CN111218496A (zh) 2020-06-02
CN111218496B true CN111218496B (zh) 2023-06-27

Family

ID=70810623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010048588.3A Active CN111218496B (zh) 2020-01-16 2020-01-16 一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111218496B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006137716A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Kyoung Sik Seo Nanoparticle marker, diagnostic methods using the same and diagnostic kit and apparatus using the same
CN101182580A (zh) * 2007-11-19 2008-05-21 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于磁珠和纳米金探针的基因或基因突变的测定方法
CN105821132A (zh) * 2016-04-29 2016-08-03 江南大学 一种基于核酸外切酶和核酸探针的电化学检测特定单链dna浓度的方法
CN107290406A (zh) * 2017-06-20 2017-10-24 中南大学 用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法
WO2018010681A1 (zh) * 2016-07-14 2018-01-18 青岛大学 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器
CN109097445A (zh) * 2018-07-18 2018-12-28 桂林理工大学 一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法
CN109295169A (zh) * 2018-10-20 2019-02-01 桂林理工大学 一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用
CN110592188A (zh) * 2019-05-20 2019-12-20 重庆医科大学 一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101967517B (zh) * 2010-03-19 2012-11-07 黄乐群 一种无需借助pcr的基因检测方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006137716A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Kyoung Sik Seo Nanoparticle marker, diagnostic methods using the same and diagnostic kit and apparatus using the same
CN101182580A (zh) * 2007-11-19 2008-05-21 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于磁珠和纳米金探针的基因或基因突变的测定方法
CN105821132A (zh) * 2016-04-29 2016-08-03 江南大学 一种基于核酸外切酶和核酸探针的电化学检测特定单链dna浓度的方法
WO2018010681A1 (zh) * 2016-07-14 2018-01-18 青岛大学 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器
CN107290406A (zh) * 2017-06-20 2017-10-24 中南大学 用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法
CN109097445A (zh) * 2018-07-18 2018-12-28 桂林理工大学 一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法
CN109295169A (zh) * 2018-10-20 2019-02-01 桂林理工大学 一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用
CN110592188A (zh) * 2019-05-20 2019-12-20 重庆医科大学 一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测;汪毅等;《分析化学》;20100815(第08期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111218496A (zh) 2020-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11099150B1 (en) Method for preparing ratiometric electrochemical miR3123 aptasensor based on metal-organic framework composite
Chen et al. A novel non-invasive detection method for the FGFR3 gene mutation in maternal plasma for a fetal achondroplasia diagnosis based on signal amplification by hemin-MOFs/PtNPs
CN109470691B (zh) 一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针、制备方法、试剂盒及其应用
Zhou et al. Dual-amplified strategy for ultrasensitive electrochemical biosensor based on click chemistry-mediated enzyme-assisted target recycling and functionalized fullerene nanoparticles in the detection of microRNA-141
Yu et al. Combining padlock exponential rolling circle amplification with CoFe2O4 magnetic nanoparticles for microRNA detection by nanoelectrocatalysis without a substrate
Ye et al. Ultrasensitive electrochemical DNA sensor for virulence invA gene of Salmonella using silver nanoclusters as signal probe
Chen et al. An ultrasensitive electrochemical DNA biosensor based on a copper oxide nanowires/single-walled carbon nanotubes nanocomposite
CN105784796B (zh) 一种基于金/二硫化钼/石墨烯纳米复合材料的适体传感器对溶菌酶的灵敏测定方法
CN102899418A (zh) 一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法
CN108344783A (zh) 一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用
Xu et al. Porous magnetic pseudo-carbon paste electrode electrochemical biosensor for DNA detection
Hu et al. Ferrocene-labeled and purification-free electrochemical biosensor based on ligase chain reaction for ultrasensitive single nucleotide polymorphism detection
CN109706225A (zh) 基于滚环扩增介导的钯纳米颗粒对microRNA的电化学检测方法
Yang et al. A stepwise recognition strategy for the detection of telomerase activity via direct electrochemical analysis of metal–organic frameworks
CN112710710A (zh) 基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法
Cheng et al. Hairpin probes based click polymerization for label-free electrochemical detection of human T-lymphotropic virus types II
CN105567808B (zh) 滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用
CN113624823B (zh) 基于四面体纳米结构dna的信号探针、其制备方法和用途
CN109540995B (zh) 检测转基因成分dna的方法及其使用的电化学传感器
Hamidi-Asl et al. A bimetallic nanocomposite modified genosensor for recognition and determination of thalassemia gene
CN111218496B (zh) 一种基于dna步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用
CN103114139A (zh) 一种基于连接酶反应的多特异位点dna甲基化电化学检测方法
Fan et al. An electrochemical DNA sensor based on an integrated and automated DNA walker
CN109596689A (zh) 双信号超级三明治电化学传感器检测基因甲基化的方法
Ma et al. Stable nitronyl nitroxide monoradical MATMP as novel monomer of reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization for ultrasensitive DNA detection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Jianxiu

Inventor after: Hu Yuqing

Inventor after: Lu Hanwen

Inventor after: Gao Juan

Inventor after: Yixinyao

Inventor before: Wang Jianxiu

Inventor before: Lu Hanwen

Inventor before: Gao Juan

Inventor before: Yixinyao

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant