CN112710710A - 基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法 - Google Patents

基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，采用水热法制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子，ATP和T4 PNK存在时，滚环扩增反应引物链S1的5′端磷酸化，修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面；加入环形模板S2，核酸链S2与Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面引物链S1杂交形成环形混合物；Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面发生RCA反应；加入二茂铁标记的核酸链S3，Fc‑S3与RCA反应产物杂交，被修饰到磁性纳米粒子表面，增强电化学响应信号；通过GME的磁性富集和电化学响应信号，实现对T4 PNK活性的高灵敏和定量测定。

Description

基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激 酶活性的方法
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。
背景技术
T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是一种由噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，具有5'激酶活性，可催化核酸5'羟基末端进行磷酸化，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
磁性纳米粒子同时具有纳米材料性质和磁学特性。四氧化三铁Fe3O4磁性纳米粒子具有超顺磁性、比表面积大、优异的吸附性能、低毒性及表面原子配位不足等特点，常作为一些复合材料的载体或磁核用于富集分离过程。纳米二氧化钛TiO2是一种新型无机半导体材料，具有比表面积大、生物相容性好、吸附能力强、导电性好、化学惰性强和制造成本低等特性，在磷酸化蛋白选择性富集和光催化活性方面表现出广阔应用前景。采用磁性Fe3O4为核，负载TiO2纳米壳层材料，制备得到的Fe3O4@TiO2核壳纳米复合材料，不仅可以保持TiO2纳米材料的高催化活性，并且可以维持磁性核材料的强磁性，实现对磷酸化蛋白/多肽的高选择性和特异性富集和分析。滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)反应作为一种简单高效的恒温核酸扩增技术，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。该技术不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，其产物在组装体搭建和多功能材料的制备方面有着广泛的应用。
测定T4 PNK活性的方法主要是放射性同位素32P、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、耗时耗力且操作复杂、需要高素质人员、易产生放射性污染等缺点。近年来，发展了一些新的T4 PNK活性的检测方法，例如电化学方法、石英晶体微天平技术、化学发光法、荧光法、单分子荧光成像技术等。虽然此类方法灵敏度较高，但是操作过程繁琐，成本较高，其应用受到一定程度的限制。
目前，缺乏一种实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种灵敏度高选择性好的测定T4多核苷酸激酶活性的电化学生物传感方法。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，包括如下步骤：(1)设计寡核苷酸序列；
(2)制备Fe3O4磁性纳米粒子；
(3)制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：
(4)制备二茂铁标记的核酸链S3，即为Fc-S3；
(5)构建电化学生物传感器：在ATP和T4 PNK存在下，滚环扩增反应引物链S1的5′端磷酸化后与TiO2特异性反应，连接到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面；加入环形模板S2，在T4 DNA连接酶存在下，核酸链S2与Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面引物链S1杂交形成环形混合物；在phi29 DNA聚合酶和dNTP存在下，Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面发生RCA反应，加入二茂铁标记的核酸链S3，Fc-S3与RCA反应产物杂交，被修饰到磁性纳米粒子表面；
(6)测定T4多核苷酸激酶活性：
以磁性金电极GME为工作电极，通过GME的磁性富集和电化学响应信号增强，实现对T4 PNK活性的定量测定。
进一步地，在步骤(1)中，所述的引物链S1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的核酸链S3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
在步骤(2)中，水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3溶解于乙二醇，加入NaAc和聚乙二醇，搅拌溶液30分钟，然后转移至聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应8小时后冷却至室温，用乙醇洗涤数次，磁力分离，室温下干燥，制得Fe3O4磁性纳米粒子；
在步骤(3)中，制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：将冰醋酸和钛酸丁酯溶于乙醇中，加入Fe3O4纳米粒子，超声分散15min，再加入聚乙二醇和尿素，搅拌1小时，然后将混合物转移到反应容器中，180℃下反应8小时，过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次，80℃干燥12小时，制得Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子；
在步骤(4)中，制备二茂铁标记的核酸链S3：将二茂铁甲酸溶于PBS缓冲溶液，加入EDC和NHS，37℃下反应15min，加入β-巯基乙醇；将上述混合液与核酸链S3等体积混合，37℃培养2h，制得Fc-S3；
在步骤(5)中，构建电化学生物传感器：在Tris-HCl缓冲溶液(含引物链S1和ATP)中加入不同浓度的T4 PNK，37℃培育2h；加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；加入S2连接酶缓冲溶液，含T4 DNA连接酶，37℃培育1h；加入RCA反应溶液，含phi29 DNA聚合酶和dNTP，37℃培育1h；加入Fc-S3，37℃培育30min；将上述反应混合液滴涂于处理好的GME表面，制得T4PNK电化学生物传感器；
在步骤(6)中，测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线。
进一步地，在步骤(5)中，在Tris-HCl缓冲溶液，含引物链S1和ATP，中加入不同浓度的T4 PNK，37℃培育2h；加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；加入S2连接酶缓冲溶液，含T4 DNA连接酶，37℃培育1h；加入RCA反应溶液，含phi29 DNA聚合酶和dNTP，37℃下培育1h；加入Fc-S3，37℃培育30min；将上述反应混合液滴涂于处理好的GME表面，制得T4 PNK电化学生物传感器；
在步骤(6)中，使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对T4PNK的活性进行定量测定。
更进一步地，在步骤(1)中，所述的引物链S1的长度为24个碱基，核酸链S2的长度为54个碱基；核酸链S3的长度为29个碱基；Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子的直径为400nm；引物链S1的浓度为1μM。
进一步地，在步骤(5)中，ATP的浓度为2mM，T4PNK的浓度为0.00001-20U/mL；所述的Fe3O4@TiO2的用量和浓度分别为5μL和5mg/mL；所述的核酸链S2的浓度为1μM；所述的引物链S1磷酸化反应的时间为2h；所述的引物链S1修饰到Fe3O4@TiO2表面的时间为2h；所述的引物链S1和核酸链S2杂交的时间为1h；所述的RCA反应的时间为1h。
进一步地，在步骤(5)中，所述的Fc-S3的浓度为10μM，所述的Fc-S3杂交的时间为1h；所述的反应温度和杂交温度为37℃。
更进一步地，在步骤(6)中，所述的信号放大技术是Fe3O4@TiO2和RCA双重信号放大；所述的工作电极为直径为3mm的磁性金电极；所述的RCA反应产物是通过磁性富集在电极表面；所述的T4 PNK活性测定技术为微分脉冲伏安法。
进一步地，在步骤(6)中，所述的生物信号放大技术为滚环扩增反应。
在步骤(6)中，电化学信号放大技术是基于Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和滚环扩增双重信号放大技术。磁性金电极通过磁性富集滚环扩增产物和电化学信号增强。
有益效果：本发明操作简单、成本低、非放射性、灵敏度高，选择性好。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明提供了一种电化学技术检测T4多聚核苷酸激酶活性；
(2)本发明利用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和滚环扩增双重信号放大技术提高测定T4 PNK活性的灵敏度；
(3)本发明利用磁性金电极通过磁性富集实现电化学信号增强；以磁性金电极(GME)为工作电极，通过GME的磁性富集和电化学响应信号，实现对T4 PNK活性的高灵敏和定量测定。
(4)本发明设计了特定序列的DNA，提高了检测T4PNK活性的选择性和特异性；
(5)本发明制备的电化学生物传感器可用于T4 PNK抑制剂EDTA、Na2HPO4和(NH4)2SO4的检测。
附图说明
图1为使用本发明的磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的制备技术和检测原理示意图。
图2为使用本发明技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的标准曲线图，横坐标是T4PNK的活度，单位是U/mL，纵坐标是DPV响应峰电流，单位是μA。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明基于Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和生物信号双重信号放大技术检测T4PNK活性的方法原理如图1所示。首先制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子，ATP和T4 PNK存在下，滚环扩增反应引物链S1的5′端磷酸化，磷酸化的引物链S1通过与TiO2特异性反应，修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面。加入环形模板S2，在T4 DNA连接酶存在下，S2与Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面引物链S1杂交形成环形混合物。在phi29 DNA聚合酶和dNTP存在下，Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面发生RCA反应。加入二茂铁标记的核酸链S3(Fc-S3)，Fc-S3与RCA反应产物杂交，被修饰到磁性纳米粒子表面，增强电化学响应信号。以磁性金电极(GME)为工作电极，通过GME的磁性富集和电化学响应信号，实现对T4 PNK活性的定量测定。
实施例2
寡核苷酸序列设计
本发明所设计的寡核苷酸序列由中国上海Sangon生物工程有限公司合成，并通过HPLC纯化检验，冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下：
S1：5′-TTTTTTCACAGAGGATAGGACATGA-3′；
S2：5′-PO4-CTCAGCTGTGAACAACTAGAAGATAACTGTGAAGATCGCTTATCATGTCCTATC-3′；
S3：5′-NH2-TTTTTTTTAAGATAACTGTGATTTTTTTT-NH2-3′；
将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中，-18℃保存备用。
实施例3
Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子制备
称取0.615g FeCl3·6H2O溶解于20mL乙二醇中，加入1.8g NaAc和0.5g聚乙二醇，搅拌溶液后，转移至100mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压反应釜中，200℃下反应8小时，冷却至室温，用乙醇洗涤数次，磁力分离，室温下风干，得到Fe3O4磁性纳米粒子。取9.6mL冰醋酸和6.8mL钛酸丁酯溶于60mL乙醇中，加入0.4g Fe3O4磁性纳米粒子，超声分散15min，加入2.4g聚乙二醇和3.6g尿素，电动搅拌1小时，然后将混合物转移至反应容器中在180℃结晶8小时。冷却至室温后，过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次，并在80℃下干燥12小时，得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子。
实施例4
二茂铁标记核酸链(Fc-S3)的制备
二茂铁标记核酸链(Fc-S3)采用EDC/NHS交联法制备，称取2.9mg二茂铁甲酸置于2.5mL 10mM PBS缓冲溶液(pH 8.0，0.5M NaCl)，超声溶解，加入1.0mg EDC和2.8mg NHS，37℃下反应15min，再加入3.5μLβ-巯基乙醇；最后将上述混合液与核酸链S3等体积混合，37℃培养2h，得到Fc-S3。
实施例5
电化学生物传感器的制备
磁性金电极(GME)用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉打磨抛光，先后用超纯水、无水乙醇、超纯水超声洗涤；将GME放入piranha溶液中浸泡30min，超纯水洗涤；在0.5M H2SO4溶液中采用循环伏安扫描30圈活化电极，电位范围-0.2～1.6V，扫速50mV/s，N2气吹干备用。
在20μL 66mMTris-HCl缓冲溶液(含1μM S1，2mM ATP，6.6mM MgCl2)中加入不同浓度的T4 PNK，37℃培育2h；加入5μL 5mg/mL Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；加入20μL 1μM S2连接酶缓冲溶液(66mM pH 7.4Tris-HCl，含5U/mLT4 DNA连接酶)，37℃培育1h；加入20μL RCA反应溶液(8U/mL phi29 DNA聚合酶，0.5mMdNTP，0.2mg/mL BSA)，37℃下培育1h；加入20μL 10μM Fc-S3，37℃培育30min；取10μL上述反应混合液滴涂于处理好的GME表面，得到T4 PNK电化学生物传感器。
实施例6
T4PNK活性的测定
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，磁性金电极为工作电极。采用微分脉冲伏安法测定T4 PNK活性，以10mM pH7.4Tris-HCl为缓冲液，电位范围为-0.9～-0.7V，电位增幅为50mV，脉冲周期为20ms。微分脉冲曲线响应峰电流大小与T4 PNK浓度的标准曲线如图2所示，峰电流与T4 PNK浓度在0.00001-20U/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.9988，线性方程为ipc(μA)＝0.19logc+0.94，检出限为0.000003U/mL。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有更宽的线性范围和更低的检出限，采用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和滚环扩增双重信号放大技术可实现T4 PNK活性的定量和灵敏测定。
实施例7
T4 PNK活性抑制剂的测定
将不同浓度的抑制剂EDTA、Na2HPO4和(NH4)2SO4与T4 PNK缓冲液混合，实验方法相同，随着抑制剂浓度加大，T4 PNK的相对活性明显降低。当加入三种抑制剂浓度分别为11mM、13mM和13mM时，T4 PNK的相对活性降低了50％，表明该方法可用于T4PNK抑制剂的检测分析。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 碱基
<120> 基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法
<130> 2020
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(核酸链S1)
<400> 1
ttttttcaca gaggatagga catga 25
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(核酸链S2)
<400> 2
ctcagctgtg aacaactaga agataactgt gaagatcgct tatcatgtcc tatc 54
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(核酸链S3)
<400> 3
ttttttttaa gataactgtg atttttttt 29

Claims (9)

1.基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计寡核苷酸序列；
(2)制备Fe3O4磁性纳米粒子；
(3)制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：
(4)制备二茂铁标记的核酸链S3(Fc-S3)；
(5)构建电化学生物传感器：在ATP和T4 PNK存在下，滚环扩增反应引物链S1的5′端磷酸化后与TiO2特异性反应，连接到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面；加入环形模板S2，在T4DNA连接酶存在下，核酸链S2与Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面引物链S1杂交形成环形混合物；在phi29 DNA聚合酶和dNTP存在下，Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面发生RCA反应，加入二茂铁标记的核酸链S3(Fc-S3)，Fc-S3与RCA反应产物杂交，被修饰到磁性纳米粒子表面；
(6)测定T4多核苷酸激酶活性：
以磁性金电极(GME)为工作电极，通过GME的磁性富集和电化学响应信号增强，实现对T4 PNK活性的定量测定。
2.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的引物链S1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的核酸链S3具有SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列；
在步骤(2)中，水热法制备制备Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3溶解于乙二醇，加入NaAc和聚乙二醇，搅拌溶液30分钟，然后转移至聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应8小时后冷却至室温，用乙醇洗涤数次，磁力分离，室温下干燥，制得Fe3O4磁性纳米粒子；
在步骤(3)中，制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：将冰醋酸和钛酸丁酯溶于乙醇中，加入Fe3O4纳米粒子，超声分散15min，再加入聚乙二醇和尿素，搅拌1小时，然后将混合物转移到反应容器中，180℃下反应8小时，过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次，80℃干燥12小时，制得Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子；
在步骤(4)中，制备二茂铁标记的核酸链S3(Fc-S3)：将二茂铁甲酸溶于PBS缓冲溶液，加入EDC和NHS，37℃下反应15min，加入β-巯基乙醇；将上述混合液与核酸链S3等体积混合，37℃培养2h，制得Fc-S3；
在步骤(5)中，构建电化学生物传感器：在Tris-HCl缓冲溶液(含引物链S1和ATP)中加入不同浓度的T4 PNK，37℃培育2h；加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；加入S2连接酶缓冲溶液(含T4 DNA连接酶)，37℃培育1h；加入RCA反应溶液，含phi29 DNA聚合酶和dNTP，37℃培育1h；加入Fc-S3，37℃培育30min；将上述反应混合液滴涂于处理好的GME表面，制得T4PNK电化学生物传感器；
在步骤(6)中，测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线。
3.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(5)中，
在Tris-HCl缓冲溶液中加入不同浓度的T4 PNK，37℃培育2h；加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；加入S2连接酶缓冲溶液(含T4 DNA连接酶)，37℃培育1h；加入RCA反应溶液(含phi29 DNA聚合酶和dNTP)，37℃下培育1h；加入Fc-S3，37℃培育30min；将上述反应混合液滴涂于处理好的GME表面，制得T4 PNK电化学生物传感器；
在步骤(6)中，使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对T4 PNK的活性进行定量测定。
4.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的引物链S1的长度为24个碱基，核酸链S2的长度为54个碱基；核酸链S3的长度为29个碱基；Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子的直径为400nm；引物链S1的浓度为1μM。
5.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(5)中，ATP的浓度为2mM，T4PNK的浓度为0.00001-20U/mL；所述的Fe3O4@TiO2的用量和浓度分别为5μL和5mg/mL；所述的核酸链S2的浓度为1μM；所述的引物链S1磷酸化反应的时间为2h；所述的引物链S1修饰到Fe3O4@TiO2表面的时间为2h；所述的引物链S1和核酸链S2杂交的时间为1h；所述的RCA反应的时间为1h。
6.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述的Fc-S3的浓度为10μM，所述的Fc-S3杂交的时间为1h；所述的反应温度和杂交温度为37℃。
7.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述的信号放大技术是Fe3O4@TiO2和RCA双重信号放大；所述的工作电极为直径为3mm的磁性金电极。
8.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述的RCA反应产物是通过磁性富集在电极表面；所述的T4 PNK活性测定技术为微分脉冲伏安法。
9.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述的生物信号放大技术为滚环扩增反应。
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