CN114894862A - 一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法 - Google Patents

一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，包括如下步骤：以磷酸盐柱[5]芳烃PP5作为主体，亚甲基蓝MB作为客体分子，利用二氧化钛TiO2的介导作用，构建了一种电化学生物传感器用于T4PNK活性检测；设计的DNA底物链通过形成金‑硫键固定在金电极表面，当存在ATP和T4PNK时，DNA底物链末端‑OH被磷酸化‑PO4，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；产生的电化学信号与T4PNK浓度成正比，实现对T4PNK的高灵敏度和高选择性测定。

Description

一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电 化学分析方法
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。
背景技术
T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是从感染了噬菌体T4中分离得到，简称T4激酶，具有5'激酶活性，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
柱芳烃(pillararene)是一类结构新颖的芳香族大环化合物，具有刚性的柱状结构，是继冠醚、环糊精、杯芳烃、葫芦脲之后的第五代经典大环宿主分子，由于其特殊的化学结构以及优良的主体和客体化学性质受到超分子研究者的关注。柱芳烃具备易于修饰、刚性空腔大小可调、热稳定性高、配体作用专一、结构刚性强、高度对称等特点，与客体分子表现出独特的主体和客体识别和络合性能。柱芳烃独特的空腔结构和易于修饰合成，良好的主体和客体性能和生物兼容性，在生物医用材料、药物包载、靶向传递和可控释放等方面具有应用潜力。磷酸盐柱[5]芳烃是一种水溶性柱芳烃，具有亲水的边缘和疏水的刚性空腔，能容纳多种客体分子。亚甲基蓝(methyleneblue)是一种吩噻嗪盐，水溶液呈碱性，广泛应用于化学指示剂、染料、生物染色剂和药物等方面。亚甲基蓝可作为客体分子，与磷酸盐柱[5]芳烃主体络合，进入磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成包合物，产生电化学信号，构建高灵敏的电化学传感器。
测定T4 PNK活性的方法主要有放射性同位素32P、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、耗时耗力且操作复杂、需要高素质人员、易产生放射性污染等缺点。近年来，发展了一些新的T4 PNK活性的检测方法，例如比色分析法、荧光分析法、电化学分析法、化学发光法及荧光成像分析技术等。虽然此类方法灵敏度较高，但是操作过程繁琐，成本较高，其应用受到一定程度的限制。
目前，缺乏一种实现对T4 PNK活性的高灵敏度、高选择性、快速和定量检测的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种灵敏度高选择性好的测定T4多核苷酸激酶活性的电化学生物传感方法。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4-二(2-羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；
(3)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；
(4)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；
(5)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为(NH4)2SO4和NaH2PO4；
(6)实际样品测定：所述的实际样品为HeLa细胞。
进一步地，在步骤(2)中，磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5-6h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6-7h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为70-80h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为0.5-1h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
进一步地，在步骤(3)中，在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后电极在DNA反应缓冲液中，37℃下磷酸化反应1h，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mL TiO2纳米粒子溶液，室温下反应时间为30min，继续滴涂5μL 0.1mM磷酸盐柱[5]芳烃溶液，室温下反应时间为1h，PBS缓冲液冲洗；最后在电极表面滴涂5μL 0.4mM亚甲基蓝溶液，PBS缓冲液冲洗，制得T4PNK电化学传感器。
更进一步地，在步骤(1)中，所述的DNA底物链的长度为21个碱基，5′端标记羟基，3′端标记巯基；在步骤(3)中，所述的TiO2纳米粒子的直径为30-50nm。
进一步地，在步骤(3)中，所述的DNA反应缓冲液为含1mMATP和不同浓度T4 PNK；所述的主体为磷酸盐柱[5]芳烃，客体为亚甲基蓝，介导为二氧化钛纳米粒子。
进一步地，在步骤(3)中，所述的磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用形成主体和客体包合物，亚甲基蓝客体处于磷酸盐柱[5]芳烃主体的空腔中，包合物形成的驱动力主要为疏水作用。
更进一步地，在步骤(3)中，DNA底物链溶液的用量和浓度分别为5μL和1μM；DNA底物链的孵育温度和时间分别为30℃和2h；MCH溶液的浓度为1mM，孵育时间为15min；DNA反应缓冲液中ATP的浓度为1mM，T4 PNK的浓度为0.0002至5U/mL，磷酸化反应的温度和时间分别为37℃和1h；TiO2纳米粒子溶液的用量和浓度分别为5μL和1mg/mL，反应温度和时间分别为室温和30min；磷酸盐柱[5]芳烃溶液的用量和浓度分别为5μL和0.1mM，反应温度和时间分别为室温和1h；亚甲基蓝溶液的用量和浓度分别为5μL和0.4mM。
进一步地，在步骤(4)中，测定T4多核苷酸激酶活性：采用三电极系统，以修饰金电极为工作电极，通过磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝主体和客体识别作用，使用电化学工作站测量电化学响应信号，实现电化学响应信号增强和对T4PNK活性的定量测定。
进一步地，在步骤(5)中，测定T4多核苷酸激酶抑制剂：以修饰金电极为工作电极，在DNA磷酸化反应缓冲液中加入不同浓度的抑制剂，测定抑制剂的半最大抑制值为IC50。
更进一步地，在步骤(6)中，实际样品测定：选择HeLa细胞为实际样品，采用标准加入法，在HeLa细胞提取液中加入不同浓度T4 PNK，测定回收率和相对标准偏差。
有益效果：本发明操作简单、成本低、非放射性、T4 PNK活性的高灵敏度、高选择性、快速和定量检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明提供了一种电化学技术检测T4多聚核苷酸激酶活性；本发明利用磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用提高了测定T4 PNK的选择性；
(2)本发明利用磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用产生放大的电化学响应信号提高了测定T4 PNK活性的灵敏度；
(3)本发明制备的电化学生物传感器可用于T4 PNK抑制剂(NH4)2SO4和NaH2PO4的检测，本发明制备的电化学生物传感器可用于实际样品HeLa细胞中T4 PNK活性的测定。
附图说明
图1为使用本发明的磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主客识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的制备技术和检测原理示意图。
图2为使用本发明的磷酸盐柱[5]芳烃的合成路线图。
图3为使用本发明技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的工作曲线图，横坐标是T4PNK的浓度，单位是U/mL，纵坐标是DPV响应峰电流，单位是μA。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的DNA底物链的长度为21个碱基，5′端标记羟基，3′端标记巯基；
(2)采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为7h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为80h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为75h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为1h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为70h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
(3)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后电极在DNA反应缓冲液中，37℃下磷酸化反应1h，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mL TiO2纳米粒子溶液，室温下反应时间为30min，继续滴涂5μL 0.1mM磷酸盐柱[5]芳烃溶液，室温下反应时间为1h，PBS缓冲液冲洗；最后在电极表面滴涂5μL0.4mM亚甲基蓝溶液，PBS缓冲液冲洗，制得T4 PNK电化学传感器。所述的TiO2纳米粒子的直径为50nm。
所述的DNA反应缓冲液为含1mMATP和不同浓度T4 PNK；所述的主体为磷酸盐柱[5]芳烃，客体为亚甲基蓝，介导为二氧化钛纳米粒子。所述的磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用形成主体和客体包合物，亚甲基蓝客体处于磷酸盐柱[5]芳烃主体的空腔中，包合物形成的驱动力主要为疏水作用。
DNA底物链溶液的用量和浓度分别为5μL和1μM；DNA底物链的孵育温度和时间分别为30℃和2h；MCH溶液的浓度为1mM，孵育时间为15min；DNA反应缓冲液中ATP的浓度为1mM，T4 PNK的浓度为0.0002至5U/mL，磷酸化反应的温度和时间分别为37℃和1h；TiO2纳米粒子溶液的用量和浓度分别为5μL和1mg/mL，反应温度和时间分别为室温和30min；磷酸盐柱[5]芳烃溶液的用量和浓度分别为5μL和0.1mM，反应温度和时间分别为室温和1h；亚甲基蓝溶液的用量和浓度分别为5μL和0.4mM。
(4)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；测定T4多核苷酸激酶活性：采用三电极系统，以修饰金电极为工作电极，通过磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝主体和客体识别作用，使用电化学工作站测量电化学响应信号，实现电化学响应信号增强和对T4 PNK活性的定量测定。
(5)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为(NH4)2SO4和NaH2PO4；测定T4多核苷酸激酶抑制剂：以修饰金电极为工作电极，在DNA磷酸化反应缓冲液中加入不同浓度的抑制剂，测定抑制剂的半最大抑制值为IC50。
(6)实际样品测定：所述的实际样品为HeLa细胞。实际样品测定：选择HeLa细胞为实际样品，采用标准加入法，在HeLa细胞提取液中加入不同浓度T4 PNK，测定回收率和相对标准偏差。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
(2)采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5.5h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为70h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为70h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为0.8h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
(3)所述的TiO2纳米粒子的直径为30nm。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
(2)采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为6h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6.5h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为76h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为80h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为0.5h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为76h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
(3)所述的TiO2纳米粒子的直径为40nm。
试验例1
本发明基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4 PNK活性的方法原理如图1所示。首先DNA寡核苷酸3'端通过形成金-硫键固定在金电极上，利用MCH封闭电极表面。在ATP和T4 PNK的存在下，DNA寡核苷酸5'端-OH被磷酸化-PO4。以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大，产生的电化学信号与T4 PNK浓度成正比，实现对T4 PNK的定量检测。
试验例2
DNA寡核苷酸序列设计
本发明所设计的DNA寡核苷酸序列由中国大连Takara生物技术有限公司合成，并通过HPLC纯化检验，冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下：
5′-HO-GTG CTG GTC GTG CTG TAG TAG-SH-3′；
将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中，-18℃保存备用。
试验例3
磷酸盐柱[5]芳烃的合成
磷酸盐柱[5]芳烃采用艾伯佐夫(Arbuzov)反应和麦肯纳(McKenna)反应合成，合成过程如图2所示。称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇(体积比为1:1)溶液洗涤，得到化合物2。称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷，体积比为1:1)，得到化合物3。称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为72h，减压浓缩，柱层析纯化(甲醇/乙酸乙酯，体积比为1:2)，得到化合物4。称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为72h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌30min，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5。称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为72h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
试验例4
电化学生物传感器的制备
金电极(直径3mm)先在piranha溶液中浸泡10分钟，超纯水冲洗，之后依次用粒径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声清洗；在0.5M H2SO4溶液中采用循环伏安扫描30圈活化电极，电位范围-0.2～1.6V，扫速0.1V/s，N2气吹干备用。
预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后将电极在DNA反应缓冲液(含1mMATP和不同浓度T4 PNK)中，37℃下磷酸化反应1h，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mL TiO2纳米粒子溶液，室温下反应时间为30min，继续滴涂5μL 0.1mM磷酸盐柱[5]芳烃溶液，室温下反应时间为1h，PBS缓冲液冲洗；最后在电极表面滴涂5μL 0.4mM亚甲基蓝溶液，PBS缓冲液冲洗，得到T4PNK电化学传感器。
试验例5
T4 PNK活性的测定
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，金电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。采用微分脉冲伏安法测定T4 PNK活性，以100mM PBS(pH7.4)为缓冲液，电位范围为-0.5～-0.1V，电位增幅为50mV，脉冲周期为20ms。微分脉冲曲线响应峰电流与T4 PNK浓度的关系曲线及工作曲线如图3所示，峰电流与T4 PNK浓度在0.0002-5U/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.9922，线性方程为ipc(μA)＝0.26logc+1.29，检出限为0.0001U/mL。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有更宽的线性范围和更低的检出限，采用磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用构建的电化学传感器可实现对T4 PNK活性的定量和灵敏测定。
试验例6
T4 PNK活性抑制剂的测定
将不同浓度的抑制剂(NH4)2SO4和NaH2PO4和与T4 PNK缓冲液混合，实验方法相同，随着抑制剂浓度加大，T4 PNK的相对活性明显降低。当加入两种抑制剂浓度分别为7.73mM和10.35mM时，T4 PNK的相对活性降低了50％，表明该方法可用于T4PNK抑制剂的检测分析。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南民族大学
<120> 一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA底物链)
<400> 1
gtgctggtcg tgctgtagta g 21

Claims (10)

1.一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4-二(2-羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；
(3)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；
(4)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；
(5)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为(NH4)2SO4和NaH2PO4；
(6)实际样品测定：所述的实际样品为HeLa细胞。
2.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(2)中，磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5-6h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6-7h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为70-80h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为0.5-1h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
3.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后电极在DNA反应缓冲液中，37℃下磷酸化反应1h，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mLTiO2纳米粒子溶液，室温下反应时间为30min，继续滴涂5μL 0.1mM磷酸盐柱[5]芳烃溶液，室温下反应时间为1h，PBS缓冲液冲洗；最后在电极表面滴涂5μL 0.4mM亚甲基蓝溶液，PBS缓冲液冲洗，制得T4 PNK电化学传感器。
4.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的DNA底物链的长度为21个碱基，5′端标记羟基，3′端标记巯基；在步骤(3)中，所述的TiO2纳米粒子的直径为40nm。
5.根据权利要求3所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的DNA反应缓冲液为含1mMATP和不同浓度T4 PNK；所述的主体为磷酸盐柱[5]芳烃，客体为亚甲基蓝，介导为二氧化钛纳米粒子。
6.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用形成主体和客体包合物，亚甲基蓝客体处于磷酸盐柱[5]芳烃主体的空腔中，包合物形成的驱动力主要为疏水作用。
7.根据权利要求4所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，DNA底物链溶液的用量和浓度分别为5μL和1μM；DNA底物链的孵育温度和时间分别为30℃和2h；MCH溶液的浓度为1mM，孵育时间为15min；DNA反应缓冲液中ATP的浓度为1mM，T4 PNK的浓度为0.0002至5U/mL，磷酸化反应的温度和时间分别为37℃和1h；TiO2纳米粒子溶液的用量和浓度分别为5μL和1mg/mL，反应温度和时间分别为室温和30min；磷酸盐柱[5]芳烃溶液的用量和浓度分别为5μL和0.1mM，反应温度和时间分别为室温和1h；亚甲基蓝溶液的用量和浓度分别为5μL和0.4mM。
8.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(4)中，测定T4多核苷酸激酶活性：采用三电极系统，以修饰金电极为工作电极，通过磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝主体和客体识别作用，使用电化学工作站测量电化学响应信号，实现电化学响应信号增强和对T4 PNK活性的定量测定。
9.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(5)中，测定T4多核苷酸激酶抑制剂：以修饰金电极为工作电极，在DNA磷酸化反应缓冲液中加入不同浓度的抑制剂，测定抑制剂的半最大抑制值为IC50。
10.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(6)中，实际样品测定：选择HeLa细胞为实际样品，采用标准加入法，在HeLa细胞提取液中加入不同浓度T4 PNK，测定回收率和相对标准偏差。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110487867A (zh) * 2019-07-10 2019-11-22 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法
CN112014446A (zh) * 2020-08-28 2020-12-01 武汉大学 一种基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器、其制备方法及检测方法
CN112697858A (zh) * 2020-12-08 2021-04-23 云南民族大学 基于磁性纳米材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
CN112710710A (zh) * 2020-12-08 2021-04-27 云南民族大学 基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110487867A (zh) * 2019-07-10 2019-11-22 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法
CN112014446A (zh) * 2020-08-28 2020-12-01 武汉大学 一种基于末端标记策略检测基因甲基化水平的电化学传感器、其制备方法及检测方法
CN112697858A (zh) * 2020-12-08 2021-04-23 云南民族大学 基于磁性纳米材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
CN112710710A (zh) * 2020-12-08 2021-04-27 云南民族大学 基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANGFENG WANG等: "Detection of T4 polynucleotide kinase activity with immobilization of TiO2 nanotubes and amplification of Au nanoparticles", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 43, pages 125 - 130 *
刘在琼 等: "基于磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝主客体识别作用构建T4多聚核苷酸激酶电化学传感器", 第十五届全国化学传感器学术会议 论文摘要集, pages 322 - 323 *
杨云汉 等: "亚甲基蓝/水溶性磷酸盐柱[5]芳烃对百草枯的竞争性荧光传感", 有机化学, vol. 40, pages 1680 - 1688 *

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