CN110029150A - 用于检测微小rna的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法 - Google Patents
用于检测微小rna的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测微小RNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法，采用1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将核酸与二氧化硅微球进行偶联；采用1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将金属螯合剂与核酸进行偶联；利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒，分别配置氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，在常温下将其混合进行反应制备底物金纳米颗粒；基于序列特异性杂交的微小RNA可视化及定量方法。提供固定分离探针与目标形成夹心结构传感器。并利用上述传感器建立了一种全新的检测miRNA的方法。
Description
技术领域
本发明公开了一种用于检测微小RNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的方法，属于生物纳米材料领域。
背景技术
近年来，微小RNA(miRNA)已成为癌症早期诊断的潜在肿瘤标志物。已知miRNA中的50％与多种人类肿瘤有关，这些miRNA的异常表达，与肿瘤的发生和发展有密切的关系。由于目前我国癌症患者的数量增长非常迅速，因此，对癌症的科学预防、早期诊断，及时治疗以及术后监测，已成为具有重要意义的研究课题与方向。很多生物学研究已经证实，实现对癌症的早期诊断，可以有效提高癌症的存活率，通过对miRNA的灵敏检测可以对肿瘤的发生、发展、转移以及预后起到重要的作用。传统检测方法主要包括Northern印迹法，逆转录酶PCR(RT-PCR)和微阵列。这些方法为RNA的检测提供了基本的思路和可能。然而，这些方法存在着的一些局限性阻碍了miRNA检测的灵敏度和稳定性的提升。基于纳米材料并偶联各种酶和小分子的探针已被广泛应用于各种miRNA检测，易于操作的修饰方法和显著的信号放大效率使这种方法受到科学家们的青睐，但偶联生物酶的催化也存在着催化不稳定，易于变性等不足之处。
因此，我们采用化学小分子金属螯合剂来改进基于传统生物酶的检测方法的缺陷，以纳米粒子为载体并偶联寡核苷酸探针，用于miRNA的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的纳米颗粒检测miRNA的方法。
在发明中，我们采用基于纳米材料的检测方法作为基本方法，利用金属螯合剂对金离子的螯合作用进一步改善纳米探针的灵敏度和稳定性。常见的金属螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)，氨基三乙酸(又称次氮基三乙酸NTA)，二亚乙基三胺五乙酸等。在我们的方法中，我们将与目标序列的一半互补的核酸通过羧基氨基活化偶联的方法连接到金属螯合剂上作为等离子体信号调节探针(probe B)，再用同样的方法将另一半与目标序列特异性互补的核酸标记的二氧化硅微球(SiO2MPs)作为固定分离探针(probe A)。当溶液中存在目标miRNA时，大量带有金属螯合剂的probe B通过夹心结构固定在SiO2MPs上。由于组装上的夹心生物传感器携带了大量的金属螯合剂，向溶液中加入HAuCl4和柠檬酸钠后，传感器表面的金属螯合剂可以螯合Au3+以调节AuNPs的产生从而达到定性和定量地检测miRNA浓度的目的。
本发明提供如下技术方案：
用于检测微小RNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法，包括如下步骤：
1)核酸偶联二氧化硅微球探针的制备：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将核酸与二氧化硅微球进行偶联；
2)核酸偶联金属螯合剂探针的制备：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将金属螯合剂与核酸进行偶联；
3)常温下金纳米颗粒的制备：利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒，分别配置氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，在常温下将其混合进行反应制备底物金纳米颗粒；
4)基于序列特异性杂交的微小RNA可视化及定量方法。
本发明制备核酸偶联二氧化硅纳米粒子探针probe A的方法包括以下步骤：
(1)为了制备寡核苷酸与二氧化硅微球粒子结合探针，首先将一段3’端羧基修饰并与目标核酸的一半互补的核酸序列溶解在磷酸盐缓冲液缓冲液中；
(2)对3’端羧基修饰的并与目标核酸一半互补的核酸序列进行羧基活化，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺以摩尔比为1:1～1：4的比例加入离心管中，再将该核酸序列加入活化15～20min；
(3)加入带有氨基修饰的二氧化硅微球，室温下孵育过夜后6000～8000rpm离心5～8min，获得的沉淀物物再悬浮于缓冲液中，将得到的探针在保存在4℃～25℃。
本发明制备核酸偶联金属螯合剂探针probe B包括以下步骤：
(1)为了制备寡核苷酸与金属螯合剂结合探针，首先将一段5’端氨基修饰，与目标核酸的另一半互补的核酸序列溶解在0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液缓冲液中。
(2)对金属螯合剂进行氨基活化，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺以摩尔比为1:1～1:4的比例加入离心管中，再加入金属螯合剂活化15～20min；
(3)在离心管中加入与金属螯合剂摩尔比为1:500～1500的前述5’端氨基修饰核酸序列在室温下孵育3～6小时，最后将得到的探针在保存在4℃～25℃。
本发明常温下制备金纳米颗粒的方法具体操作如下：
利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒,氯金酸和柠檬酸钠按照摩尔比为1:1.3～1:2.7混合进行反应制备底物金纳米颗粒。
本发明金属螯合剂螯合金离子以调节金纳米颗粒生成的方法具体操作如下：
利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒,金属螯合剂与氯金酸溶液按摩尔比为1:4～5:1混合进行反应，柠檬酸钠按照氯金酸和柠檬酸钠按照摩尔比为1:1.3～1:2.7加入相应的量，制备底物金纳米颗粒。
本发明微小RNA-21的可视化以及定量的检测方法操作步骤如下：
将寡核苷酸二氧化硅微球粒子结合探针probe A、寡核苷酸金属螯合剂结合探针probeB以及不同浓度的微小RNA-21分别混合，在20～30℃孵育1～3h后6000～8000rpm离心5～8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应10～15min观察颜色变化,并利用多功能酶标仪检测对比不同溶液在550nm处的吸光度值。
本发明的方法用于人尿液中微小RNA-21的检测。
本发明用于人尿液中微小RNA-21的检测的方法具体如下：
采用加标回收的方法进行尿液中微小RNA-21的检测；通过向尿液中中加入配制好的微小RNA-21溶液以获得一系列不同浓度梯度的尿液微小RNA-21样本；在已制备好的基于金属螯合剂标记寡核苷酸探针体系中等体积加入待检尿液样本，置于金属浴中，20～30℃孵育1～3h后6000～8000rpm离心5～8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应10～15min观察颜色变化,并利用多功能酶标仪检测对比不同溶液在550nm处的吸光度值。
本发明用金属螯合剂标记与目标序列部分互补的核酸(probe B)作为等离子体信号调节探针，另一段与目标序列互补的核酸标记的二氧化硅微球(SiO2MPs)作为固定分离探针(probe A)。当溶液中存在目标序列miRNA时，大量金属螯合剂标记的核酸探针通过夹心结构固定在SiO2MPs上。由于组装上的夹心生物传感器携带了大量的金属螯合剂金属螯合剂，向溶液中加入HAuCl4和柠檬酸钠后，传感器表面的金属螯合剂可以螯合Au3+以调节AuNPs的产生从而达到定性和定量地检测miRNA浓度的目的。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种金属螯合剂标记核酸作为等离子体信号调节探针和另一段与目标序列互补的核酸标记的SiO2MPs作为固定分离探针与目标形成夹心结构传感器。并利用上述传感器建立了一种全新的检测miRNA的方法，取得了一系列优异的技术效果：
1)灵敏：相比其它方法，本方法将金属螯合剂出色的螯合性质与纳米材料良好的信号放大的特点结合，使检测灵敏度提高到10-15mol/L。
2)特异：反应的特异性由两段与目标互补的探针决定，相对比探针与目标直接杂交的方式增加了特异性。
3)成本低廉：探针无需复杂修饰，可视化检测无需使用大型仪器。
4)探针稳定：相对比偶联生物酶放大的方法，金属螯合剂性质稳定不易失活。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明中小分子螯合剂以乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)为例。示例待检miRNA为miRNA-21，它在大多数癌细胞中的表达水平异常升高，其中包括乳腺癌、子宫颈癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、大肠癌、胶质瘤和胆管癌等，是肿瘤诊断重要的分子生物学标志物。
附图说明
图1本发明结构过程图；
图2不同浓度HAuCl4(0.5,1.2,1.5,2,3,3.5mM，100μL)下金纳米颗粒的颜色变化；
图3不同浓度EDTA·2Na(0.05,0.01,0.1,0.5,0.8,1,5,10mM,20μL)条件下金纳米颗粒的颜色变化；
图4不同浓度miRNA-21的550nm处的吸光值A550和空白对照溶液A0(不含待测物)的差值(ΔA550)与A0的比值(ΔA550/ΔA0)对应的溶液颜色照片；
图5本发明的工作曲线；
图6特异性实验；
图7使用标准加入法检测不同人的尿液样品；
图8本发明的探针稳定性实验。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明以便于本领域技术人员理解本发明，但并不以任何形式限制本发明。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,可以做出改进和润饰,这些改进和润饰在本发明的保护范围之内。
本发明所用核酸具体序列与修饰详情见序列表。
主要仪器和试剂：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(阿拉丁，上海)。柠檬酸钠、氯金酸(HAuCl4·3H2O)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)(Sigma，上海)。磷酸盐缓冲液(PBS，PH＝7.2～7.4)购自AKZ生物技术公司(中国天津)。氨基改性的二氧化硅粒子(SiO2NPs-NH2)(倍思乐色谱技术开发中心，天津)。96孔聚苯乙烯微孔板(Costar，美国)。
1.一种基于金属螯合剂标记寡核苷酸探针的微小RNA检测方法，如图1所示，步骤如下：
1)核酸偶联二氧化硅微球探针的制备：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将核酸与二氧化硅微球进行偶联；
2)核酸偶联金属螯合剂探针的制备：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将金属螯合剂与核酸进行偶联；
3)常温下金纳米颗粒的制备：利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒，分别配置氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，将其混合进行反应制备底物金纳米颗粒；
4)基于序列特异性杂交的微小RNA可视化及定量方法。
2、制备核酸偶联二氧化硅微米粒子探针probe A，步骤如下：
首先将一段3端羧基修饰的核酸捕获探针序列(DNAⅠ，与目标核酸一半互补)溶解在0.01～0.05mol/L PBS缓冲液中至终浓度为10-8～10-7M；对核酸捕获探针序列进行羧基活化，将10-8～10-7M的DNAⅠ,摩尔比为1:1～1:4的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入离心管中，活化10～15min；加入0.5～1.5mg/mL的1μm二氧化硅微球(SiO2MPs)，室温下1～3h后6000～8000rpm离心5～8min，获得的沉淀物(probe A)再悬浮于0.01～0.05mol/L PBS缓冲液中，将得到的探针在保存在4～25℃。
3、制备核酸偶联金属螯合剂探针probe B，步骤如下：
首先将3端氨基修饰核酸捕获探针序列Ⅱ(DNAⅡ，与目标核酸另一半互补)溶解在0.01～0.05mol/L PBS缓冲液中至终浓度为10-8～10-7M；对金属螯合剂进行氨基活化，将1～10mM金属螯合剂、摩尔比为1:1～1：4的EDC以及NHS加入离心管中，活化10～15min；在离心管中加入10-8～10-7M DNAⅡ在室温下孵育过夜，将得到的探针(probe B)保存在4～25℃。
4、一种常温下制备金纳米颗粒的方法，步骤如下：
利用氯金酸(HAuCl4)溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒，配置HAuCl4溶液和柠檬酸钠溶液，使其摩尔比为1:1～1:4，室温下将其混合进行反应制备底物金纳米颗粒。
5、金属螯合剂螯合金离子以调节金纳米颗粒生成的方法具体操作如下：
利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒,金属螯合剂与氯金酸溶液按摩尔比为1:4～5:1混合进行反应，柠檬酸钠按照氯金酸和柠檬酸钠按照摩尔比为1:1.3～1:2.7加入相应的量，制备底物金纳米颗粒。
6、一种miRNA的可视化以及定量的检测方法：
将probe A探针、probe B探针以及不同浓度的miRNA分别混合，在室温孵育1～3h后6000～8000rpm离心5～8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入HAuCl4溶液在室温下继续反应10～15min观察颜色变化,并利用多功能酶标仪检测对比不同溶液在550nm处的吸光度值。
7、用于人尿液中微小RNA-21的检测的方法具体如下：
采用加标回收的方法进行尿液中微小RNA-21的检测；通过向尿液中中加入配制好的微小RNA-21溶液以获得一系列不同浓度梯度的尿液微小RNA-21样本；在已制备好的基于金属螯合剂标记寡核苷酸探针体系中等体积加入待检尿液样本，置于金属浴中，20～30℃孵育1～3h后6000～8000rpm离心5～8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应10～15min观察颜色变化,并利用多功能酶标仪检测对比不同溶液在550nm处的吸光度值。
实施例1：
(1)将摩尔比为1:8的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液加入在200μL体系中混合。室温下，反应15～30min。
(2)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图2所示，摩尔比为1:8的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液反应后溶液呈无色，吸光度约为0，此时远未达吸光度最大值。
实施例2：
(1)将摩尔比为1:3.3的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液加入在200μL体系中混合。室温下，反应15～30min。
(2)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
(3)结果：如图2所示，摩尔比为1:3.3的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液反应后溶液呈淡灰色，吸光度为1.131，此时远未达吸光度最大值。
实施例3：
(1)将摩尔比为1:2.7的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液加入在200μL体系中混合。室温下，反应15～30min。
(2)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图2所示，摩尔比为1:2.7的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液反应后溶液呈淡紫色，吸光度为1.986，此时远未达吸光度最大值。
实施例4：
(1)将摩尔比为1:2.2的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液加入在200μL体系中混合。室温下，反应15～30min。
(2)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图2所示，摩尔比为1:2.2的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液反应后溶液呈酒红色，吸光度为2.457，此时颜色已经与实施例1、2、3呈现出明显区分，但尚未达吸光度最大值。
实施例5：
(1)将摩尔比为1:2的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液加入在200μL体系中混合。室温下，反应15～30min。
(2)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图2所示，摩尔比为1:2.2的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液反应后溶液呈酒红色，吸光度为2.457，此时颜色与实施例1、2、3呈现出明显区分，达到吸光度最大值。随着HAuCl4溶液浓度的增大，金纳米颗粒的颜色逐渐由无色变为酒红色，当浓度达到2mM时酒红色最明显，此时得到了分散最为均匀的AuNPs,同时吸光度值达到最大，浓度超过2mM时溶液颜色变浅，在1.5～3mM浓度范围内即HAuCl4溶液与柠檬酸三钠摩尔比为1:1.3～1:2.7时都可生成金纳米颗粒。
实施例6：
(1)将摩尔比为1:1.3的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液加入在200μL体系中混合。室温下，反应15～30min。
(2)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图2所示，摩尔比为1:2.2的HAuCl4溶液与柠檬酸三钠溶液反应后溶液呈浅酒红色，吸光度为2.105，此时颜色与实施例1、2、3呈现出明显区分，但吸光度值对比实施例5反而有所降低，证明实施例5中的吸光度值最高。
实施例7：
(1)将摩尔比为1:200的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为1:200时，EDTA·2Na浓度为0.01mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为0.125，EDTA·2Na未表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例8：
(1)将摩尔比为1:40的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为1:40时，EDTA·2Na浓度为0.05mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为0.103，EDTA·2Na未表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例9：
(1)将摩尔比为1:20的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为1:20时，EDTA·2Na浓度为0.1mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为0.528，EDTA·2Na开始表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用，但不明显。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例10：
(1)将摩尔比为1:4的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为1:4时，EDTA·2Na浓度为0.5mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为1.452，EDTA·2Na表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用，吸光度差值变化明显。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例11：
(1)将摩尔比为1:2.5的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为1:2.5时，EDTA·2Na浓度为0.8mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为2.127，EDTA·2Na表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用，吸光度差值变化明显。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例12：
(1)将摩尔比为1:2的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为1:2时，EDTA·2Na浓度为1mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为2.127，EDTA·2Na表现出对HAuCl4中Au3 +的螯合作用，吸光度差值变化明显。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例13：
(1)将摩尔比为2.5:1的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为2.5:1时，EDTA·2Na浓度为5mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为2.127，EDTA·2Na表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用，吸光度差值变化明显。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例14：
(1)将摩尔比为5:1的EDTA·2Na与HAuCl4溶液加入至100μL体系中。
(2)加入100μL 4mM柠檬酸三钠溶液。室温下，反应20～30min。
(3)观察颜色变化,利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图3所示，EDTA·2Na与HAuCl4溶液摩尔比为5:1时，EDTA·2Na浓度为10mM，溶液与不加EDTA·2Na的对照组吸光度差值ΔA550为2.236，EDTA·2Na表现出对HAuCl4中Au3+的螯合作用，吸光度差值变化明显。实验发现在EDTA·2Na浓度在0.5～10mM的范围内，即与HAuCl4溶液摩尔比为1:4～5:1时，化学小分子EDTA·2Na能表现出对底物HAuCl4的螯合作用，实现对底物金纳米颗粒的合成与自组装显色的控制，底物HAuCl4溶液中被螯合的Au3+增加，生成的纳米金颗粒减少，从而吸光度值减小。
实施例15：
(1)制备核酸偶联二氧化硅纳米粒子探针probe A，步骤如下：
首先将一段核酸序列DNAⅠ(序列如SEQ ID No.6羧基修饰的DNAⅠ探针COOH-tttttttttttcaacatcagt所示)溶解在0.01mol/L PBS缓冲液中至终浓度为10-8M；对DNAⅠ进行羧基活化，将10μL DNAⅠ,EDC以及NHS加入离心管中，活化15min；加入300μL 0.5M的SiO2MPs，室温下孵育过夜后6000rpm离心8min，获得的沉淀物物再悬浮于300μL PBS缓冲液中，将得到的探针在保存在4℃下。
(2)制备核酸偶联乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)探针probe B，步骤如下：
方法：首先将DNAⅡ(序列如SEQ ID No.7DNA氨基修饰的DNAⅡ探针ctgataagctatttttttttt-NH2所示)溶解在0.01M PBS缓冲液中至终浓度为10-8M；对DNAⅡ进行氨基活化，将EDTA·2Na(1mM,30μL)、0.92mg EDC以及NHS加入离心管中，在室温下放置15min；在离心管中加入10μL DNAⅡ在室温下孵育过夜，最后将得到的探针在保存在4℃下。
(3)可视化以及定量检测miRNA：
方法：将40μL probe A探针、5μL probe B探针以及5μL不同浓度的miRNA-21(序列如SEQ ID No.1RNA miR-21UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A所示)分别混合，在室温孵育3h后6000rpm离心8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应15min观察颜色变化,并利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：为了探究该方法对miRNA-21的最小检测灵敏度，通过配置不同浓度的本检测方法对miRNA-21最小浓度为10-15M的样本仍有检测能力，可检测微量的样本，可通过对不同浓度的样本检测产物溶液的在550nm处的吸光值和空白对照溶液(不含待测物)的差值(ΔA550)与和空白对照溶液(不含待测物)的差值A0与A0的比值(ΔA550/ΔA0)作图，见图4。根据ΔA550与目标物浓度建立线性关系，见图5。
实施例16：
(1)将40μL probe A探针、5μL probe B探针以及5μL 1×10-14M miRNA(miR-21、miR-141、miR-143、Let-7d或阴性对照NC miRNA，序列如：
SEQ2RNA miR-141UAA CAC UGU CUG GUA AAG AUG G、
SEQ3RNA miR-200b UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG、
SEQ4RNA Let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU或
SEQ5RNA nc RNA UUG UAC UAC ACA AAA GUA CUG所示分别混合，在室温孵育3h后6000rpm离心8min；
(2)弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应15min观察颜色变化,并利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：图6显示了本方法miRNA-141，miRNA-122，miRNA-200b，let-7d和错配miRNA存在的情况下对miRNA-21的区分能力。如图所示，只有miRNA-21存在时，550nm波长处才会产生显著的紫外吸收值得变化，而其他miRNA存在时紫外吸收值无明显变化。
实施例17：
(1)将10μL不同浓度的待测miRNA 1×10-13M,8×10-14M,5×10-14M,1×10-14M,8×10-15M,5×10-15M and 1×10-15M加入到90μL不同人的尿液中制成检测样品。
(2)将40μL probe A探针、5μL probe B探针以及5μL上述检测样品分别混合，在室温孵育3h后6000rpm离心8min。
(1)弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应15min观察颜色变化,并利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：图7显示本方法所测得数值与加入的目标浓度数值基本一致。
实施例18：
(1)在不同的天数(0,5,10,20,30天)将40μL probe A探针、5μL probe B探针以及5μL 1×10-14M miR-21分别混合，在室温孵育3h后6000rpm离心8min。
(2)弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应15min观察颜色变化,并利用紫外分光光度计扫描溶液在400～600nm之间的波谱并使用酶标仪读出不同溶液在550nm处的吸光度值。
结果：如图8所示，ΔA550在30天内无显著变化，证明本发明中的探针具有优良的稳定性。
本发明公开和提出的用于检测miRNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序列表
<110> 天津大学
<120> 用于检测微小RNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 5
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ncrnauugua cuacacaaaa guacug 26
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttttttt tcaacatcag t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgataagct attttttttt t 21
Claims (8)
1.用于检测微小RNA的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)核酸偶联二氧化硅微球探针的制备：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将核酸与二氧化硅微球进行偶联；
2)核酸偶联金属螯合剂探针的制备：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化偶联羧基氨基的方法，将金属螯合剂与核酸进行偶联；
3)常温下金纳米颗粒的制备：利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒，分别配置氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，在常温下将其混合进行反应制备底物金纳米颗粒；
4)基于序列特异性杂交的微小RNA可视化及定量方法。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：制备核酸偶联二氧化硅纳米粒子探针probeA的方法包括以下步骤：
(1)为了制备寡核苷酸与二氧化硅微球粒子结合探针，首先将一段3’端羧基修饰并与目标核酸的一半互补的核酸序列溶解在磷酸盐缓冲液缓冲液中；
(2)对3’端羧基修饰的并与目标核酸一半互补的核酸序列进行羧基活化，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺以摩尔比为1:1～1：4的比例加入离心管中，再将该核酸序列加入活化15～20min；
(3)加入带有氨基修饰的二氧化硅微球，室温下孵育过夜后6000～8000rpm离心5～8min，获得的沉淀物物再悬浮于缓冲液中，将得到的探针在保存在4℃～25℃。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：制备核酸偶联金属螯合剂探针probe B包括以下步骤：
(1)为了制备寡核苷酸与金属螯合剂结合探针，首先将一段5’端氨基修饰，与目标核酸的另一半互补的核酸序列溶解在0.01～0.05mol/L磷酸盐缓冲液缓冲液中。
(2)对金属螯合剂进行氨基活化，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺以摩尔比为1:1～1:4的比例加入离心管中，再加入金属螯合剂活化15～20min；
(3)在离心管中加入与金属螯合剂摩尔比为1:500～1500的前述5’端氨基修饰核酸序列在室温下孵育3～6小时，最后将得到的探针在保存在4℃～25℃。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：常温下制备金纳米颗粒的方法具体操作如下：
利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒,氯金酸和柠檬酸钠按照摩尔比为1:1.3～1:2.7混合进行反应制备底物金纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：金属螯合剂螯合金离子以调节金纳米颗粒生成的方法具体操作如下：
利用氯金酸溶液及柠檬酸钠溶液制备金纳米颗粒,金属螯合剂与氯金酸溶液按摩尔比为1:4～5:1混合进行反应，柠檬酸钠按照氯金酸和柠檬酸钠按照摩尔比为1:1.3～1:2.7加入相应的量，制备底物金纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述方法，微小RNA的可视化以及定量的检测方法操作步骤如下：
将寡核苷酸二氧化硅微球粒子结合探针probe A、寡核苷酸金属螯合剂结合探针probeB以及不同浓度的微小RNA-21分别混合，在20～30℃孵育1～3h后6000～8000rpm离心5～8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应10～15min观察颜色变化,并利用多功能酶标仪检测对比不同溶液在550nm处的吸光度值。
7.权利要求1的方法用于人尿液中微小RNA-21的检测。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：用于人尿液中微小RNA-21的检测的方法具体如下：
采用加标回收的方法进行尿液中微小RNA-21的检测；通过向尿液中中加入配制好的微小RNA-21溶液以获得一系列不同浓度梯度的尿液微小RNA-21样本；在已制备好的基于金属螯合剂标记寡核苷酸探针体系中等体积加入待检尿液样本，置于金属浴中，20～30℃孵育1～3h后6000～8000rpm离心5～8min。弃去上清，将沉淀溶于柠檬酸钠中，之后加入氯金酸溶液在室温下继续反应10～15min观察颜色变化,并利用多功能酶标仪检测对比不同溶液在550nm处的吸光度值。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113186254A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-30 | 中国地质大学（武汉） | 用于ctDNA检测的生物传感器及其制备方法 |
| CN114470204A (zh) * | 2022-02-10 | 2022-05-13 | 西安交通大学 | 一种实现多模态治疗的智能金纳米粒子的制备方法与应用 |
| CN114592042A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-06-07 | 之江实验室 | 一种微rna检测方法及试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105158221A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-12-16 | 天津医科大学 | 一种用于检测微核糖核酸的荧光传感器的制备方法及应用 |
| CN109486914A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-19 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种核酸可视化检测方法 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105158221A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-12-16 | 天津医科大学 | 一种用于检测微核糖核酸的荧光传感器的制备方法及应用 |
| CN109486914A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-19 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种核酸可视化检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIAFANG PIAO等: "Enzyme-free colorimetric detection of MicroRNA-21 using metal chelator as label for signal generation and amplification.", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113186254A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-30 | 中国地质大学（武汉） | 用于ctDNA检测的生物传感器及其制备方法 |
| CN113186254B (zh) * | 2021-03-17 | 2022-06-24 | 中国地质大学（武汉） | 用于ctDNA检测的生物传感器及其制备方法 |
| CN114470204A (zh) * | 2022-02-10 | 2022-05-13 | 西安交通大学 | 一种实现多模态治疗的智能金纳米粒子的制备方法与应用 |
| CN114470204B (zh) * | 2022-02-10 | 2022-11-04 | 西安交通大学 | 一种实现多模态治疗的智能金纳米粒子的制备方法与应用 |
| CN114592042A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-06-07 | 之江实验室 | 一种微rna检测方法及试剂盒 |
| CN114592042B (zh) * | 2022-04-21 | 2022-11-11 | 之江实验室 | 一种微rna检测方法及试剂盒 |
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