CN109266783B - 一种分子信标-g四链体光学传感器及其在检测sv40病毒中的应用 - Google Patents

一种分子信标-g四链体光学传感器及其在检测sv40病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分子信标‑G四链体光学传感器及其在检测SV40病毒中的应用。该传感器包括分子信标，所述分子信标呈发夹结构，其包括G‑四链体序列、能与目标双链DNA特异性结合的环状区，以及能阻止G‑四链体结构形成的茎状区；分子信标的序列为：5'‑CCCTACCCTTTTTTCTTCTCTTTCC(T)6GGGTAGGGCGGGTTGGG‑3'。本发明可以根据荧光强度的变化来实现SV40病毒特异性目标双螺旋DNA的定量检测，在SV40病毒的检测中发挥重要作用，其最大线性检测范围为5～300 nmol/L，检出限为3 nmol/L，相关系数为0.992，同时具有良好的选择性，应用前景广阔。

Description

一种分子信标-G四链体光学传感器及其在检测SV40病毒中的 应用
技术领域
本发明属于生物化学分析技术领域。更具体地，涉及一种分子信标-G四链体光学传感器及其在检测SV40病毒中的应用。
背景技术
猿猴空泡病毒40(Simian Virus 40，SV40)属于乳多空病毒科(Papovaviruidae)，多瘤病毒是DNA肿瘤病毒中的一员，可以诱导细胞异常增值或导致肿瘤。SV40是Sweet和Hileman在1960年发现分离的猴肾细胞病毒，在人体内寄生，它由结构蛋白(VP1，VP2，VP3)和两种抗原(LT和st)共同构成。据报道，大量人群因使用被SV40污染的猴肾细胞培养脊髓灰质炎疫苗而感染SV40病毒。此外它还可以通过血液和粪口途径在人群中传播，感染的数量以每年1.2％的速度递增，对人类健康产生了威胁。国外学者利用PCR方法检测了SV40基因在人体各类肿瘤中的分布情况，结果显示，SV40基因在人间皮细胞瘤、室管膜瘤、胶质细胞瘤、骨瘤及骨肉瘤、淋巴中的携带率分别为83％、75％、47％、33％和13％，说明SV40与人体肿瘤关系紧密。因此，提高生物制品的病毒检测能力既能够保证疫苗等生物制品的安全，又可以避免或减少由于SV40感染引发肿瘤的情况。
目前，国外临床已经有应用RQ-PCR方法检测临床样本中SV40感染的检测，以及分析猴源性生物制品(如脊髓灰质炎减毒活疫苗)的SV40污染情况。PCR技术由于其快速、安全且具有较高敏感性和特异性等优点被广泛应用。我国药典中对于SV40的检测提供了PCR的检测方法，但在实际工作中发现存在扩增效果不佳的情况，极有可能出现漏检，而且PCR检测在整个检测过程中，对操作人员、精密实验仪器和整体实验室设施的要求都有较高的技术要求，不适合基层大规模筛选检测。而传统的分离培养检测技术培养时间较长，操作过程相对复杂，要在无菌条件下操作，并对操作者的相关专业知识和操作技术要求都比较高，限制了这种方法在临床以及非实验室环境的应用。免疫荧光检测则是灵敏度不够稳定，需要进一步改进与完善。
综上所述，为了实现生物制品的批量检测，分析SV40病毒的感染状况，迫切需要发展方便快捷、高灵敏度、高特异性和适宜于临床筛查的诊断方法以及研制相应的检测试剂来满足SV40病毒的检测需要，这对于控制SV40传播和人民用药安全具有深远意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种特异性和灵敏度高、选择性好、检测速度快的分子信标-G四链体光学传感器。该分子信标-G四链体光学传感器通过连续监测荧光信号强弱的变化，来即时测定待测样品中SV40病毒目标双螺旋DNA特异性产物的含量，为SV40病毒快速检测产品的开发提供了一定的理论指导，对SV40病毒的临床监控具有重要意义。
本发明的目的是提供一种分子信标-G四链体光学传感器。
本发明的第二个目的是提供上述分子信标-G四链体光学传感器在检测SV40病毒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测SV40病毒的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种分子信标-G四链体光学传感器，包括分子信标，所述分子信标呈发夹结构，其包括能与荧光染料结合发出荧光的G-四链体序列、能与目标双链DNA特异性结合的环状区，以及能阻止G-四链体结构形成的茎状区；
所述分子信标的序列为5'-CCCTACCCTTTTTTCTTCTCTTTCC(T)6GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'。
其中，所述分子信标的序列中，基因片段5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'为G-四链体序列部分，能与荧光染料结合发出荧光；基因片段5'-TTTTTTCTTCTCTTTCC-3'为17个同聚嘧啶序列，是分子信标的环状区，能特异性识别目标双链DNA形成三螺旋DNA，再连上6个T作为隔离序列；基因片段5'-CCCTACCC-3'为分子信标的茎状区，在分子信标与目标双链DNA杂交形成三螺旋DNA前，能阻止G-四链体结构的形成。
发卡结构的茎状区封闭了部分G-四链体的结构，因此在形成发卡结构的时候，分子信标中的G-四链体无法形成，也无法发出荧光。只有当目标链与分子信标中的环状部分杂交，将分子信标打开，G-四链体被释放，此时才能与荧光染料结合，发出荧光。隔离序列的设计可以减少三螺旋DNA对G-四链体结构形成的空间位阻。
本发明根据SV40病毒大T抗原基因上的一段同聚嘌呤-同聚嘧啶双螺旋DNA，进行大量的分析比对和科学验证，设计出了一条兼具高特异性和高灵敏度的多功能分子信标。该分子信标的环状区能够特异性识别目标双螺旋DNA，形成三螺旋DNA，从而打开分子信标，形成G四链体，再与荧光染料结合，在激发波长的照射下，产生荧光信号，从而可通过连续监测荧光信号强弱的变化，来即时测定待测样品中SV40病毒目标双螺旋DNA特异性产物的含量，实现对SV40病毒的定量分析。
优选地，所述分子信标-G四链体光学传感器还包括精胺、钾离子或银离子中的一种或多种。
当目标双链DNA将分子信标打开之后，G-四链体DNA序列就会裸露出来，在K+存在下，可以形成立体的G-四链体结构，再与荧光染料结合发出荧光。
在正常情况下，目标双链与分子信标杂交形成三螺旋DNA需要在弱酸性的条件下进行，而在中性或者碱性的条件下，无法或者只有很少的三螺旋DNA形成。然而，在人体的环境中，大部分的病毒、DNA或者酶均是在中性条件下存在，因此，本发明在中性缓冲溶液中加入银离子，可以在中性条件下形成稳定的三螺旋DNA结构，从而使得本发明的分子信标-G四链体光学传感器能够在中性条件下发挥良好的检测作用。
优选地，所述精胺的浓度为0.1～1.2mmol/L。
更优选地，所述精胺的浓度为0.3～0.7mmol/L。
最优选地，所述精胺的浓度为0.5mmol/L。
优选地，所述钾离子的浓度为0.1～150mmol/L。
更优选地，所述钾离子的浓度为100～150mmol/L。
最优选地，所述钾离子的浓度为150mmol/L。
优选地，所述银离子的浓度为0.05～0.5μmol/L。
更优选地，所述银离子的浓度为0.2～0.5μmol/L。
最优选地，所述银离子的浓度为0.3μmol/L。
本发明中，所述浓度均是指物质在反应体系中的终浓度。
优选地，所述分子信标发夹结构互补碱基数为5～10。
更优选地，所述分子信标发夹结构互补碱基数为8。
优选地，所述荧光染料为N-甲基卟啉二丙酸IX(N-methylmesoporphyrin IX，NMM)、3,6-二甲基-2-(4-二甲基氨基苯)-苯噻唑阳离子。
相应地，上述分子信标-G四链体光学传感器在检测SV40病毒中的应用，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用是指在检测SV40病毒特异性双螺旋DNA中的应用。
所述SV40病毒特异性双螺旋DNA为5'-CCTTTCTCTTCTTTTTT-3'；5'-AAAAAAGAAGAGAAAGG-3'。
本发明还提供一种使用上述分子信标-G四链体光学传感器进行检测SV40病毒的方法，包括以下步骤：
S1.向含有分子信标的缓冲溶液中加入特异性双螺旋DNA或待测样品，混匀后20～30℃恒温反应；
S2.加入荧光染料，混匀后室温孵育；测定待测样品的荧光强度，得到待测样品中SV40病毒特异性双链DNA的浓度。
优选地，步骤S1中还加入有精胺、钾离子或银离子中的一种或多种。
优选地，所述钾离子为硝酸钾或醋酸钾。
优选地，所述银离子为硝酸银。
优选地，步骤S1的反应时间为60～90min。
优选地，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
所述缓冲溶液的浓度优选为10～30mmol/L，更优选为20mmol/L。
所述缓冲溶液的pH值优选为6～8，更优选为7.4。
优选地，步骤S2的孵育时间为10～20min。
优选地，步骤S2于室温进行荧光检测。
优选地，所述室温为20～28℃。
优选地，激发波长为399nm，发射波长扫描范围为：580～650nm。
优选地，狭缝宽度均为5nm。
本发明SV40病毒特异性目标双螺旋DNA的检测浓度和荧光信号值在5～300nmol/L浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为I＝2.138C+38.79(C：nmol/L，I为荧光信号值)，检出限为3nmol/L(3σ/slope)，相关系数为0.992。而且，实验结果表明，在相同浓度下，错配序列的荧光信号值远低于完全互补序列的荧光信号，说明本方法具有良好的选择性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的分子信标-G四链体光学传感器可以根据荧光强度的变化来实现SV40病毒特异性目标双螺旋DNA的定量检测，在SV40病毒的检测中发挥重要作用，其最大线性检测范围为5～300nmol/L，线性方程为I＝2.138C+38.79，检出限为3nmol/L，相关系数为0.992，同时具有良好的选择性。
2、本发明建立了猴空泡病毒定量检测方法，利用此检测方法可以对组织样品及相关生物制品进行批量检测。
3、本发明不仅能够评价猴空泡病毒感染状况，并且三螺旋DNA的存在可作为探究肿瘤发生原理的有力工具，为研究人类疾病新疗法指明了方向和提供了思路，同时也为猴空泡病毒的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。
附图说明
图1为本发明分子信标-G四链体光学传感器的检测原理图。
图2为精胺浓度对ΔI的影响(将ΔI定义为荧光强度的差值。ΔI的定义式为ΔI＝Itarget-Iblank；Itarget表示存在目标链的荧光信号，Iblank表示没有加入目标链的荧光信号)。
图3为Ag+浓度对ΔI的影响。
图4为K+浓度对ΔI的影响。
图5为互补碱基数对ΔI的影响。
图6为荧光信号值随目标双链DNA浓度变化的荧光光谱曲线。
图7为荧光信号值随目标双链DNA浓度变化的工作曲线。
图8为本发明的方法选择性分析。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例中使用序列如下：
Figure BDA0001746148080000051
Figure BDA0001746148080000061
目标双链DNA(Oligo-1·Oligo-2，target dsDNA)为SV40病毒大T抗原基因上的一段同聚嘌呤-同聚嘧啶双螺旋序列称为gp6，编号为4424-4440，由17个碱基构成。
MB probe为多功能分子信标，包括能与NMM结合发出荧光的G-四链体序列部分；以及17个同聚嘧啶序列的环状区，能特异性识别目标双链DNA形成三螺旋DNA，再连上6个T作为隔离序列；还有茎状区，其在分子信标与目标双链杂交前，能阻止G-四链体结构的形成。
M-1(Oligo-3·Oligo-4)，M-2(Oligo-5·Oligo-6)为目标链的单碱基错配序列。
M-3(Oligo-7·Oligo-8)，M-4(Oligo-9·Oligo-10)为目标链的双碱基错配序列。
实施例1SV40病毒的检测
(1)在250μL 2μmol/L分子信标的PBS(20mM，pH7.4)的缓冲溶液中，分别加入50μL的一系列不同浓度的目标双螺旋DNA(Oligo-1和Oligo-2)或待测样品、50μL 5mmol/L的精氨、50μL 3μmol/L的银离子和50μL 1mol/L的钾离子，在25℃的条件下，保持1.5小时；
(2)加入50μL 40μM NMM于上述溶液中，并在25℃下孵育15分钟；即精氨、银离子和钾离子在反应体系中的终浓度分别为0.5mmol/L、0.3μmol/L、100mmol/L；
然后，将混合液转移至微量石英样品池(3mm×10mm×47mm)测量波长614nm处的荧光发射；其中，荧光光谱测量参数设置：激发波长399nm，狭缝宽度均为5nm，发射波长扫描范围580～650nm。
实验原理图如图1所示。本发明的原理是：寡聚脱氧核糖核苷酸5'-CCCTACCCTTTTTTCTTCTCTTTCC(T)6GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'(MB probe)作为多功能分子信标。没有加入目标双链DNA时，分子信标由于本身的发夹结构，使分子信标中的G-四链体序列被包裹在茎状区，起到屏蔽作用；当加入目标双链DNA：5'-CCTTTCTCTTCTTTTTT-3'·5'-AAAAAAGAAGAGAAAGG-3'(Oligo-1·Oligo-2，target dsDNA)后，通过Hoogsteen氢键特异性识别，打开多功能分子信标，形成了G-四链体结构，加入荧光底物(NMM)，从而可以根据荧光强度的变化来实现目标双链DNA序列的定量检测。
本发明荧光光谱图和工作曲线分别如图6和图7所示。SV40病毒双螺旋DNA序列的浓度和荧光信号值在5～300nmol/L浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为I＝2.138C+38.79(C：nmol/L，I为荧光信号值)，检出限为3nmol/L(3σ/slope)，相关系数为0.992。
通过观察对比荧光光谱曲线和工作曲线，可以很清晰地表明，当SV40病毒双螺旋DNA序列浓度在5～300nmol/L浓度范围内时，荧光信号值随着目标链DNA浓度的增加而增加，并且呈现出良好的线性关系，从而说明了本发明的传感器对SV40病毒的检测具有灵敏度高、特异性好、选择性好的优点。
实施例2SV40病毒的检测
(1)在250μL 2μmol/L分子信标的PBS(20mM，pH7.4)的缓冲溶液中，分别加入50μL的一系列不同浓度的目标双螺旋DNA(Oligo-1和Oligo-2)或待测样品，在25℃的条件下，保持1.5小时；
(2)加入50μL 40μM NMM于上述溶液中，并在25℃下孵育15分钟；然后，将混合液转移至微量石英样品池(3mm×10mm×47mm)测量波长614nm处的荧光发射；其中，荧光光谱测量参数设置：激发波长399nm，狭缝宽度均为5nm，发射波长扫描范围580～650nm。
本实施例的传感器对SV40病毒的检测具有灵敏度高、特异性好、选择性好的优点。当SV40病毒双螺旋DNA序列浓度在5～300nmol/L浓度范围内时，荧光信号值随着目标链DNA浓度的增加而增加，并且呈现出良好的线性关系。
实施例3荧光强度随精胺浓度的变化
1、方法
在实施例1的基础上，以反应体系的精胺浓度为单因素变量，以ΔI为指标(将ΔI定义为荧光强度的差值，ΔI的定义式为ΔI＝Itarget-Iblank，Itarget表示存在目标链的荧光信号，Iblank表示没有加入目标链的荧光信号)，考察不同精胺浓度对SV40病毒特异性目标双螺旋DNA序列检测效果的影响。
2、结果
实验结果如图2所示，精胺浓度的变化显著影响检测荧光强度的强弱，当精胺浓度在0.1～0.5mmol/L范围内，吸光度值随精胺浓度增加而增加；在0.5mmol/L之后，峰值吸收随浓度增加有所下降。从图2中可以看出，精胺浓度为0.1～1.2mmol/L时，检测效果较好；精胺的浓度为0.3～0.7mmol/L时，检测效果更好；精胺的浓度为0.5mmol/L时，检测效果最好。
实施例4荧光强度随Ag+浓度的变化
1、方法
在实施例1的基础上，以反应体系的Ag+浓度为单因素变量，以ΔI为指标，考察不同Ag+浓度对SV40病毒特异性目标双螺旋DNA序列检测效果的影响。
2、结果
实验结果如图3所示，在中性或弱碱性的条件下，Ag+浓度对三链DNA稳定性具有重要的影响，当Ag+浓度在0.05～0.3μmol/L范围内，吸光度值随Ag+浓度增加而增加；在0.3μmol/L之后，峰值吸收随浓度增加有所下降。由图3可知，当银离子的浓度为0.05～0.5μmol/L时，检测效果较好；当银离子的浓度为0.2～0.5μmol/L时，检测效果更好；当银离子的浓度为0.3μmol/L时，检测效果最好。
实施例5荧光强度随K+浓度的变化
1、方法
在实施例1的基础上，以反应体系的K+浓度为单因素变量，以ΔI为指标，考察不同K+浓度对SV40病毒特异性目标双螺旋DNA序列检测效果的影响。
2、结果
实验结果如图4所示，K+的加入，可以明显提高三链DNA的稳定性，当钾离子的浓度为0.1～150mmol/L时，检测效果较好；当K+浓度为100～150mmol/L时，荧光强度更强，检测效果更好；当K+浓度为150mmol/L时，检测效果最好。
实施例6荧光强度随分子信标发卡结构互补碱基数的变化
1、方法
在实施例1的基础上，从研究反应体系分子信标发卡结构互补碱基数对ΔI的影响出发，考察了互补碱基数在5～10范围内，荧光信号随互补碱基数的变化情况。
2、结果
实验结果如图5所示，分子信标发卡结构影响荧光信号，当互补碱基数在5～8范围内，吸光度值随发卡结构互补碱基数增加而增加。在8个互补碱基数之后，峰值吸收随互补碱基数增加有所下降。因此，选择8作为最佳互补碱基数。
实施例7检测方法的选择性
1、方法
为了验证本发明的传感器及其检测方法的选择性，在实施例1的基础上，选择相同浓度的单碱基错配序列M-1(Oligo-3·Oligo-4)、M-2(Oligo-5·Oligo-6)和双碱基错配序列M-3(Oligo-7·Oligo-8)、M-4(Oligo-9·Oligo-10)代替完全互补的序列(TargetdsDNA)加入到反应体系中进行杂交反应。
2、结果
如图8所示，错配序列的荧光信号值远远低于完全互补序列的荧光信号，完全互补序列的荧光信号值为单碱基错配序列和双碱基错配序列的荧光信号值的6.3倍、4.0倍和12.9倍、14.8倍，从而表明本发明的分子信标-G四链体光学传感器及其应用于SV40病毒特异性目标双螺旋DNA序列的检测方法具有良好的选择性。
实施例8
分别以SV40病毒和以下与SV40病毒基因组结构极为相似的JC病毒(JCV)、BK病毒(BKV)和猴嗜淋巴多型瘤病毒(LPV)作为待测样本；采用本发明的传感器对上述待测样本进行检测，其检测结果如表1所示，与其他不同类型的病毒相比，只有在SV40病毒待测样本，检测结果才成阳性。结果说明，本发明用于对SV40病毒进行荧光检测的分子信标-G四链体光学传感器的特异性良好，反应体系特异性良好。
表1检测结果
病毒类型 SV40 JCV BKV LPV
检测结果 (+) (-) (-) (-)
注：(+)代表检出SV40病毒，(-)代表未检测到SV40病毒。
另外，实验发现，同等条件下，本检测方法与SV40的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、全病毒ELISA法和PCR相比，灵敏度较高，特异性更强，与其它猴源性DNA病毒没有交叉反应，检测准确性得到了很大的提高，便于标准化操作，适用于临床筛查。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东海洋大学
<120> 一种分子信标-G四链体光学传感器及其在检测SV40病毒中的应用
<140> 2018108436252
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<213> 分子信标(MB probe)
<400> 12
ccctaccctt ttttcttctc tttccttttt tgggtagggc gggttggg 48

Claims (3)

1.一种用于检测SV40病毒的分子信标-G四链体光学传感器，其特征在于，包括分子信标，还包括精胺、钾离子和银离子；所述分子信标呈发夹结构，其包括能与荧光染料结合发出荧光的G-四链体序列、能与目标双链DNA特异性结合的环状区，以及能阻止G-四链体结构形成的茎状区；所述分子信标的序列为5'-CCCTACCCTTTTTTCTTCTCTTTCCTTTTTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3'；所述精胺的浓度为0.3～0.7 mmol/L，所述钾离子的浓度为100～150 mmol/L，所述银离子的浓度为0.2～0.5 μmol/L；所述分子信标发夹结构的互补碱基数为8。
2.权利要求1所述的分子信标-G四链体光学传感器在制备检测SV40病毒的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指在制备检测SV40病毒特异性双链DNA的产品中的应用。
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