CN113322348A - 一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏新型冠状病毒2019‑nCoV核酸检测试剂盒及使用方法，包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标基因引物对及探针组，本发明以新型冠状病毒（2019‑nCoV）ORF1ab和N基因为靶区域，设计特异性引物及探针，通过检测荧光信号的变化，对样本中的新型冠状病毒2019‑nCoV核酸进行定性检测，由于ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端用荧光基团FAM修饰后成为单色双靶检测体系，并使用高于常规的大体积体系进行扩增，在对新型冠状病毒2019‑nCoV核酸检测时，检测灵敏度高，灵敏度高可达可以到50copies/mL，而且以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P,RNP）基因作为内标靶基因，对核酸提取和检测过程进行监控，避免了假阴、假阳性的产生，因此在市场推广前景广阔。

Description

一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用 方法
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，特别是一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法。
背景技术
2019-nCoV主要传播途径为经呼吸道飞沫传播，以呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏传染，亦可通过接触传播。感染新冠病毒后潜伏期在3-7天，一般不超过14天，临床表现以发热乏力、干咳为主，鼻塞流涕等上呼吸道症状少见，约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者进展为急性呼吸窘迫综合征、休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。
冠状病毒为单链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinac)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ4个属，已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的冠状病毒(HCoV-229E和HCoV-NL63)和β属的冠状病毒(HCoV-HKU1、HCoV-OC43、MERS-CoV和SARS-CoV)，2019-nCoV为β属的新型冠状病毒。
2019-nCoV具有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径60-140nm。病毒基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒全基因组通常含有7个开放阅读框，每相邻两基因之间存在间隔序列，5’端为非编码区帽子结构，3’端为多聚腺苷酸非编码区；从5’端起约占据全基因组的三分之二的ORF1(包含ORF1a和1b)也称为复制酶基因，负责编码16个以上与病毒复制相关的非结构蛋白；靠近3’端的4个开放阅读框，依次编码S蛋白(spikeprotein)、E蛋白(envelope protein)、M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleoprotein)。冠状病毒S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组可用作诊断抗原。
各研究机构及生物公司都致力于相关核酸检测试剂盒的开发和生产，经过半年多的使用发现，目前市场上的2019-nCoV核酸检测试剂盒，患者在早期感染阶段存在漏检情况。“根据天津疾控中心1月30日公布的新增确诊案例情况显示，天津疾控第28例患者，男，55岁，与本单位多名新型冠状病毒感染的肺炎患者为密切接触者。1月19日出现发热，1月25日就诊于市第四中心医院，两次核酸检测阴性，予以居家隔离。1月27日再次发热，1月28日核酸检测阴性，1月30日第四次检测为阳性”。上述案例的出现说明一部分早期感染的患者在体液中病毒载量低，虽然用现有的检测试剂盒多次检测结果为阴性，但是仍然是病毒感染者且具有感染性。而这类患者的漏检很可能造成周围人群进一步的感染，不利于病毒传播的控制。申请号为202010160474.8的中国发明专利，公开了一种新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒，采用N基因特异引物和Taqman探针，结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对2019-nCoV N基因的检测。申请号为202010160162.7的中国发明专利，公开了一种新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒用ORF1ab基因特异引物和Taqman探针，结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对2019-nCoV ORF1ab基因的检测。但上述方法分别对不同靶基因进行检测，而且现有方法的检测体系小，模板加样量小，检测灵敏度不足，因此仍然存在漏检的问题。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中国存在的问题，提供一种灵敏度高、检出率高的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标基因引物对及探针组；
所述ORF1ab基因引物对包含SEQ ID NO.1-2所示的ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物；所述ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物的浓度分别为0.1-1.5μmol/L；
所述N基因引物对包含SEQ ID NO.4-5所示的N基因上游引物、N基因下游引物；所述N基因上游引物、N基因下游引物的浓度分别为0.1-1.5μmol/L；
所述内标基因引物对包含SEQ ID NO.7-8所示的内标基因上游引物、内标基因下游引物；所述内标基因上游引物、内标基因下游引物的浓度分别为0.10-1.5μmol/L；
所述探针组包括SEQ ID NO.3所示的ORF1ab基因探针、SEQ ID NO.6所示的N基因探针和SEQ ID NO.9所示的内标基因探针；所述ORF1ab基因探针的浓度为0.01-1μmol/L；所述N基因探针的浓度为0.01-1μmol/L；所述内标基因探针的浓度为0.01-1μmol/L；
所述ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端用同一种荧光基团修饰；所述内标探针为与ORF1ab基因探针、N基因探针无交叉的人基因组特异性探针，所述内标基因探针的5’端用荧光基团ROX修饰。
进一步地，所述ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端用荧光基团FAM、HEX、VIC、Cy3、Cy5中的一种修饰。
进一步地，还包含dNTP混合物、DNA聚合酶、逆转录酶、RT-PCR缓冲液。
进一步地，所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，包括PCR反应液A和PCR反应液B；
所述PCR反应液A包含ORF1ab基因引物对、ORF1ab基因探针、N基因引物对、N基因探针、内标基因引物对、内标基因探针、dNTP混合物和RT-PCR缓冲液；
所述PCR反应液B包含DNA聚合酶、逆转录酶。
进一步地，还包括阳性对照，所述阳性对照为含ORF1ab和N基因的假病毒以及人A549或其它人源细胞培养液混合物。
进一步地，还包括阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶水。
优选地，所述ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物的浓度均为0.4μmol/L，ORF1ab基因探针的浓度为0.12μmol/L。
优选地，所述N基因上游引物、N基因下游引物的浓度均为0.4μmol/L，N基因探针的浓度为0.12μmol/L。
优选地，所述内标基因上游引物、内标基因下游引物的浓度均为0.16μmol/L，内标基因探针的浓度为0.08μmol/L。
另外本发明还提供了一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒使用方法，包括以下步骤：
1)配置50ul-60μL反应体系：PCR反应液A和PCR反应液B的混合液15-25μL，35μL模板RNA；
2)混匀后放入放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测；
3)设定如下循环体系后开始扩增：50℃20min，95℃3min，95℃15s，54℃3min，25℃1min共45个循环，扩增结束后判读结果。
与现有技术相比，本发明以新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab和N基因为靶区域，设计特异性引物及探针，通过检测荧光信号的变化，对样本中的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸进行定性检测，由于ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端用荧光基团FAM修饰后成为单色双靶检测体系，在对新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测时，检测灵敏度高可达可以到50copies/mL，同时检出率高，而且以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P(RNase P，RNP)基因作为内标靶基因，对核酸提取和检测过程进行监控，避免了假阴、假阳性的产生，因此在市场推广前景广阔。
附图说明
图1是比较本方法与A公司检测试剂的Ct值。
图2是比较本方法与B公司检测试剂的Ct值。
图3为检测限结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
本实施例的一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，包括PCR反应液A(920μL×1管)和PCR反应液B(290μL×1管)；
所述PCR反应液A(920μL×1管)包含ORF1ab基因引物对、ORF1ab基因探针、N基因引物对、N基因探针、内标基因引物对、内标基因探针、dNTP混合物和RT-PCR缓冲液；其中，ORF1ab基因引物对、ORF1ab基因探针、N基因引物对、N基因探针、内标基因引物对、内标基因探针由人工合成，其核苷酸序列参见核苷酸序列表SEQ ID NO.1-9。ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端可以均优选FAM荧光基团修饰；所述内标探针为与ORF1ab基因探针、N基因探针无交叉的人基因组特异性探针，所述内标基因探针的5’端用荧光基团ROX或不同于靶标标记的其他荧光基团修饰。ORF1ab基因引物的上、下游引物浓度均为0.4μmol/L，ORF1ab基因探针的浓度为0.12μmol/L，所述内标引物的上、下游引物浓度均为0.16μmol/L，ORF1ab基因探针的浓度为0.08μmol/L。
所述PCR反应液B(290μL×1管)包含DNA聚合酶、逆转录酶；
阳性对照(100μL×1管)：含ORF1ab和N基因的假病毒以及人A549细胞培养液混合物；
阴性对照(400μL×1管)：无核酸酶水。具体如下表1所示。
表1
Figure BDA0002995795650000061
本实施例中，选用新型冠状病毒(2019-nCoV)基因组中特异基因编码区为扩增靶区域，设计特异性引物，引物序列和其它物种无交叉反应，长度在25bp左右，引物间无明显二聚体形成，然后由生工生物工程股份有限公司进行合成。合成的引物和探针经纯化和检验，合格后使用，同时提供质控检测结果。
DNA聚合酶、逆转录酶由珠海宝锐生物科技有限公司提供，无色透明液体，-20℃保存。
本实施的试剂盒由新型冠状病毒(2019-nCoV)病毒特异性引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶为主要原料，经配液、分装、贴签、组装制得。
其中，阳性对照(P1～P6)的制备过程为：
5份新型冠状病毒(2019-nCoV)样本(灭活)；1份混合样本由10个咽拭子混合物+新冠病毒培养物(灭活)制成，由军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所提供。
5份经数字PCR标定的新型冠状病毒(2019-nCoV)病毒样本，根据其病毒滴度用生理盐水分别稀释至5.0×105copies/mL、2.0×105copies/mL、1.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、1.0×104copies/mL；和一份10个咽拭子混合物加新冠病毒培养物(灭活)的混合样本(新型冠状病毒终浓度1.0×103copies/mL)；分装成200μL/管，依次标记为P1～P6，-80℃以下保存，见下表2。
表2
Figure BDA0002995795650000071
阴性对照(N1～N10)的制备过程为：
10种可引起呼吸道感染、肺炎相似症状的病原微生物：N1人冠状病毒hCoV-HKU1病毒培养物(灭活)、N2人冠状病毒hCoV-OC43病毒培养物(灭活)、N3人冠状病毒hCoV-NL63病毒培养物(灭活)、N4人冠状病毒hCoV-229E病毒培养物(灭活)、N5人冠状病毒hCoV-SARS假病毒、N6人冠状病毒hCoV-MERS假病毒；N7甲型流感病毒(灭活)、N8副流感病毒(灭活)、N9呼吸道合胞病毒(灭活)、N10腺病毒(灭活)，由广州邦德盛生物技术有限公司和军事科学院军事医学研究院提供。提取核酸，用数字PCR定量，分别稀释至1.0×105copies/mL，依次标记为N1～N10。分装成200μL/管，-80℃及以下保存。
使用本实施例的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒进行新型冠状病毒核酸检测，具体过程如下：
一、核酸提取(在样本处理区进行)
所采用的样本类型为：口咽拭子或鼻咽拭子，然后选择合适的磁珠法或离心柱法核酸提取试剂盒提取样本总核酸，按照相应试剂盒说明书操作。
注意：阴性对照与待测样本同步处理，阳性对照不必提取，可直接加样。完成样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-70℃，一周内完成检测。
二、PCR试剂准备(在试剂准备区进行)
1.按下列组成配制PCR反应液(n为反应管数)。
PCR反应液A为19μL×n，PCR反应液B为6μL×n；
注意：使用前确保反应液充分融解，反应液在使用前需离心，以确保所有液体集中在底部。
测试数N＝n+2，其中n表示待检测样本数量，另2份为阴性对照、阳性对照。应根据实验室情况，适当考虑混合液分装过程中的损耗。反应液A和反应液B不能提前预混，需要现用现加，否则再次使用时会影响扩增效率。
2.将PCR反应液A和PCR反应液B振荡混匀，3000rpm离心数秒。25μL/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区。
三、加样(在样本处理区进行)
用带滤芯的吸头分别取阴性对照、已处理好的样本、阳性对照各35μL加到装有反应体系的PCR反应管中。盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区。
注意：加样顺序为阴性对照、样本核酸、阳性对照，防止待测样本与试剂盒对照样本间产生交叉污染。
四、PCR扩增检测(在扩增检测区进行)
1.将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。
2.循环参数设定：
Figure BDA0002995795650000091
3.仪器检测通道选择：FAM为新型冠状病毒(2019-nCoV)基因扩增信号，ROX为内标基因扩增信号。
3.1ABI 7500Real Time PCR System和ABI Quant Studio5
1)选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：None)检测新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab和N基因；
2)选择ROX通道(Reporter：ROX，Quencher：None)检测内标基因；
3)反应体积(Sample Volume)为60μL。
3.2上海宏石SLAN-96P
1)选择FAM通道检测新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab和N基因；
2)选择ROX通道检测内标基因；
3)反应体积(Sample Volume)为60μL。
五、结果分析
1.FAM、ROX通道的结果需单独选择相应的荧光通道进行分析。如分析FAM通道结果时，建议只选取FAM通道；分析ROX通道结果时，建议只选取ROX通道。
2.阈值设定
以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。
3.基线设定
ABI7500和ABI Quant Studio5：基线起点设为3，终点设为15。上海宏石SLAN-96P：基线起点设为6，终点设为12。Bio-Rad CFX96可手动调整基线位置，使基线高度与阴性对照高度持平。
4.记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。
六、质控标准
1.阴性对照：FAM通道(新型冠状病毒)结果为阴性，无Ct值。
2.阳性对照：FAM通道(新型冠状病毒)结果为阳性，且Ct值≤40，ROX通道(内标)为阳性，且Ct值≤40。
3.以上两项需在一次实验中同时满足；否则，本次实验无效，实验应重新进行。
【阳性判断值或参考区间】
在阳性对照和阴性对照均正常的情况下进行结果分析：FAM通道为新型冠状病毒(2019-nCoV)基因扩增信号，ROX通道为内标RNP基因扩增信号。结果如下：Ct≤40为阳性(+)；40＜Ct≤45为灰度区(±)；Ct无数值时为阴性(－)。
Figure BDA0002995795650000101
Figure BDA0002995795650000111
为了验证的本发明的可行性，使用本实施例的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒进行以下几个方面的性能研究：最低检出限、重复性、特异性、准确度等。
最低检出限：取阳性样本稀释为以下浓度(1.0×103copies/mL，5.0×102copies/mL，2.0×102copies/mL，1.0×102copies/mL，5.0×101copies/mL)备用。使用上海宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR检测仪进行荧光PCR扩增，操作严格按照试剂盒说明书进行。PCR循环条件：50℃20min；95℃3min；(95℃15s，54℃30s)扩增45个循环，于每个循环的退火温度下收集并记录荧光；25℃10s。每样本重复检测20次。核酸提取浓度为50copies/mL时样本检出率为大于等于95％。最终确定本试剂盒对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测限为50copies/mL，如图3所示。
精密性：使用连续三批生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)检测同一份样本(1×104copies/mL)，检测方法为由两名试验人员，连续进行10天试验检测，检测结果CV值小于5％，显示试剂盒重复性(精密性)良好。
分析特异性：对以下病原微生物进行检测，包括人冠状病毒hCoV-HKU1(灭活)、人冠状病毒hCoV-OC43(灭活)、人冠状病毒hCoV-NL63(灭活)、人冠状病毒hCoV-229E(灭活)、人冠状病毒hCoV-SARS(灭活)、人冠状病毒hCoV-MERS(灭活)、甲型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、乙型肝炎病毒，浓度为1.0×105copies/mL，结果为阴性，实验结果表明本试剂盒与以上病原体无交叉反应。
抗干扰性：本试剂盒对添加人血液及鼻咽分泌物的样本和作为对照的常规样本进行检测，结果均为阳性，且灰度值无明显差异，表明待测样本中可能存在的人血液和鼻咽分泌物等内源性物质对本试剂盒的检测结果无干扰。本试剂盒对含有缓解鼻塞和咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和过敏症状等治疗药物苯福林、倍氯美松、地塞米松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、盐酸组胺、α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、莫匹罗星、妥布霉素的新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性样本检测结果均为阳性，说明上述常见的外源性治疗药物对本试剂盒无干扰作用。
准确度：用本试剂盒检测阳性参考品和阴性参考品，P1～P6的阳性符合率为6/6(+/+)，N1～N10阴性符合率为10/10(-/-)。
另外，为了进一步验证本发明的技术效果，设定以下对比实例进行验证。
1.“单色双靶”检测灵敏度高于“双色双靶”
在ORF1ab和N基因引物探针序列、扩增体系相同的条件下，将ORF1ab基因的探针标记FAM荧光，N基因的探针标记HEX荧光，配制“双色双靶”检测体系；将ORF1ab基因和N基因的探针都标记FAM荧光，配制“单色双靶”检测体系，将配制好的“单色双靶”和“双色双靶”体系同时对50copies/mL的新冠病毒模板进行检测，每组实验重复16次，单色双靶体系阳性判断方法为：当检测结果中FAM通道有明显的扩增曲线且Ct值≤40，则样本判断为阳性。双色双靶体系阳性判断方法为：当检测结果中FAM和HEX通道同时有明显的扩增曲线且Ct值≤40，则样本判断为阳性。“单色双靶”检出率为100％(16/16)，“双色双靶”检出率为56.25％(9/16)，见下表3，由此可见，“单色双靶”检测灵敏度高于“双色双靶”。
表3
Figure BDA0002995795650000131
注：“—”无扩增曲线，未检测到Ct值
2.临床样本检测结果表明本试剂盒可提高确诊病例的核酸检出率
使用本方法与A公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)平行检测28例某医院临床确诊新型冠状病毒感染住院收治病人恢复期的样本(样本信息见表4)。A公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)双靶标为阳性的样本1个，检出率为3.57％，单或双靶标阳性样本4个，检测率为14.28％；本方法检测出阳性样本7个，检出率为25.00％，见表4。结果表明：本方法SARS-CoV-2核酸阳性检出率高于A公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)检测试剂的2倍以上(见表5)。
表4
Figure BDA0002995795650000141
Figure BDA0002995795650000151
表5
Figure BDA0002995795650000152
注：“—”无扩增曲线，未检测到Ct值
3.本试剂盒检测低拷贝核酸样本的灵敏度高于代表性的商品化试剂A公司和B公司生产的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒。
使用本方法与B公司生产的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)平行检测不同浓度的灭活病毒RNA(900copies/mL、180copies/mL、90copies/mL)，结果显示：与商品化试剂比较，本方法检测Ct值更低，差异具有统计学意义(P<0.0001)(图2)。以上结果表明：本方法检测效果优于B公司生产的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)检测试剂。
图1是比较本方法与B公司检测试剂的Ct值。与B公司检测试剂比较，****P<0.0001。
本方法与A公司生产的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)检测试剂平行检测不同浓度的灭活病毒RNA(900copies/mL、180copies/mL、90copies/mL)，结果显示：与A公司生产的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)检测试剂中检测效果相对较好的N基因检测结果比较，本方法检测Ct值更低，差异具有统计学意义(P<0.0001)(图1)。以上结果表明：本方法的检测效果优于A公司生产的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光探针法)检测试剂。统计检测结果阳性率，检测浓度为900、180、90copies/mL的样本，本研究检测试剂阳性率分别为100％、100％、100％也高于A公司检测试剂的100％，87.5％、75％(表5)。
由此也可看出，在双靶同时阳性才判读为阳性的前提下，对于低拷贝(低于100copies/mL)核酸样本，“双色双靶”策略有漏检风险，且大量单靶阳性的样本需要复检，一定程度上造成人力、财力资源浪费。
图2是比较本方法与A公司检测试剂的Ct值。与A公司检测试剂比较，其比较结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002995795650000161
Figure BDA0002995795650000171
注：“—”无扩增曲线，未检测到Ct值
4.FAM标记荧光效率和稳定性高于其他染料
核酸检测过程中，也有采用双重引物、单荧光标记双探针方式进行实时荧光PCR检测，与本试剂盒验证的结论一致。此外，实时荧光PCR检测结果的准确性除受检测试剂影响外，还受检测仪器的影响。荧光激发是实时荧光PCR仪的关键环节，不同品牌的荧光激发系统有所差异，如果试剂与仪器的匹配性不好，将直接影响检测效果。目前FAM荧光基团的激发光源、检测光源及滤波器是最成熟的商品化设备之一，其荧光基团的合成标记也是最稳定和经济的。仅进行FAM荧光检测，可以提高检测试剂和仪器的匹配度；仅标记FAM荧光基团，可以提高试剂的鲁棒性且降低成本。基于以上原理，本试剂盒针对ORF1ab和N基因设计两套引物、探针，且探针5’端均标记FAM荧光基团，提高了检测试剂的仪器适用性，降低了成本。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法
<130> 2021.3.26
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
agaagagcaa gaagaagatt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
caattgtttg aatagtagtt gtc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
gttggtcaac aagacggcag tga 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
tttgctgaat aagcatattg acgc 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
ctgtttcttc tgtctctgcg g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
aaggctgatg aaactcaagc c 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
gtctcagatc catctcactg caat 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
tggaaaaact gcaacaacat cat 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 9
agcaacttct tcaagggccc ggct 24

Claims (10)

1.一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标基因引物对及探针组；
所述ORF1ab基因引物对包含SEQ ID NO.1-2所示的ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物；所述ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物的浓度分别为0.1-1.5μmol/L；
所述N基因引物对包含SEQ ID NO.4-5所示的N基因上游引物、N基因下游引物；所述N基因上游引物、N基因下游引物的浓度分别为0.1-1.5μmol/L；
所述内标基因引物对包含SEQ ID NO.7-8所示的内标基因上游引物、内标基因下游引物；所述内标基因上游引物、内标基因下游引物的浓度分别为0.10-1.5μmol/L；
所述探针组包括SEQ ID NO.3所示的ORF1ab基因探针、SEQ ID NO.6所示的N基因探针和SEQ ID NO.9所示的内标基因探针；所述ORF1ab基因探针的浓度为0.01-1μmol/L；所述N基因探针的浓度为0.01-1μmol/L；所述内标基因探针的浓度为0.01-1μmol/L；
所述ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端用同一种荧光基团修饰；所述内标探针为与ORF1ab基因探针、N基因探针无交叉的人基因组特异性探针，所述内标基因探针的5’端用荧光基团ROX修饰。
2.根据权利要求1所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，所述ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端均用荧光基团FAM、HEX、VIC、Cy3、Cy5中的一种修饰。
3.根据权利要求1所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，还包含dNTP混合物、DNA聚合酶、逆转录酶、RT-PCR缓冲液。
4.根据权利要求1所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液A和PCR反应液B；
所述PCR反应液A包含ORF1ab基因引物对、ORF1ab基因探针、N基因引物对、N基因探针、内标基因引物对、内标基因探针、dNTP混合物和RT-PCR缓冲液；
所述PCR反应液B包含DNA聚合酶、逆转录酶。
5.根据权利要求4所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照为含ORF1ab和N基因的假病毒以及人A549或其它人源细胞培养液混合物。
6.根据权利要求4所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶水。
7.根据权利要求1所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于：所述ORF1ab基因上游引物、ORF1ab基因下游引物的浓度均为0.4μmol/L，ORF1ab基因探针的浓度为0.12μmol/L。
8.根据权利要求1所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于：所述N基因上游引物、N基因下游引物的浓度均为0.4μmol/L，N基因探针的浓度为0.12μmol/L。
9.根据权利要求1所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于：所述内标基因上游引物、内标基因下游引物的浓度均为0.16μmol/L，内标基因探针的浓度为0.08μmol/L。
10.一种如权利要求3所述的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）配置60µL反应体系：PCR反应液A和PCR反应液B的混合液25µL，35µL模板RNA；
2）混匀后放入放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测；
3）设定如下循环体系后开始扩增：50℃ 20min，95℃ 3min，95℃ 15s，54℃ 3min，25℃1min共45个循环，扩增结束后判读结果。
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