CN111690772A - 一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用，新冠病毒核酸检测试剂盒包括分别根据新冠病毒核酸ORF1ab基因、N基因、E基因序列合成引物和探针、根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板，一步法将缓冲反应体系进行逆转录反应合成模板cDNA，再进行反复热循环，获得PCR产物并降解其探针释放荧光素A，ACE2基因则降解其探针释放荧光素B。内内引物引导的PCR产物以超过2倍的速度增加，可以从根本上解决特异性扩增的效率，并能够鉴别出由于取材误差导致的假阴性结果，从而提高检测结果的准确性。

Description

一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术中的RNA体外扩增技术领域，尤其涉及一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用。
背景技术
现有的新冠病毒核酸体外扩增检测技术及其试剂盒基本上都是基于RT-QPCR技术平台，该技术首先将RNA逆转录合成模板cDNA，再将耐热DNA聚合酶、特异引物探针、dNTPs底物、模板cDNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温、低温、中温的热循环，以使模板DNA变性、引物与模板复性、引物延伸反复进行热循环和荧光检测，而达到靶DNA片段在体外呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)。临床实践表明，这种方法出现了较多的假阴性结果，分析原因可能存在以下几个方面：
1、常规的荧光定量PCR灵敏度局限，由于模板数量较少，需要更多的循环数才能达到检测，而由于经常遇到引物二聚体和其它非特异性扩增的产生，而一旦产生非特异性模板，由于其与特异性扩增的效率相当，并竟争底物与酶，使特异性扩增受到抑制，特异性扩增效率降低。尤其在扩增粗提的临床标本时，常导致临床基因诊断的假阳性和假阴性结果的产生。
2、用于提高PCR扩增特异性的方法已有热启动法、固体石蜡膜法、抗体-酶法、双链引物法等。这些方法虽然都能在一定程度上提高PCR扩增的特异性与其扩增效率，但与常规PCR相比都只是略有改进，而没有本质的变化，特异性扩增效率都不会超过2n倍。
普通巢式PCR(nest PCR)是一种特异性很高的PCR，其本质是在一段待扩增的靶序列中设计外侧、内侧两对引物。先用外侧引物进行扩增，完成后再取扩增产物作模板用内侧引物扩增，即要进行两次连续的PCR反应，这种方法操作较复杂，费时较长，而其每一次的PCR中，扩增的效率也不会超过2n倍，同时由于第二次扩增要用外侧引物扩增的PCR产物做模板，很容易造成PCR产物污染，导致扩增的假阳性。
另外，由于新冠病毒主要干扰深部肺泡上皮细胞，在病毒滴度较低时，因为取材技术和方法不规范，没能够取到病毒或含有病毒的细胞，也可以产生假阴性结果，从而降低了检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用，采用了一种操作简单、特异性高、特异性扩增效率超过2n倍的DNA体外扩增技术即巢式共扩增聚合酶链反应(nest coamplification polymerase chain reaction，NCA-PCR)和增加ACE2内参照基因检测的多重PCR扩增技术，可以从根本上解决特异性扩增的效率，并能够鉴别出由于取材误差导致的假阴性结果，从而提高了检测结果的准确性。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种新冠病毒核酸检测试剂盒，包括引物探针混合物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板，所述引物探针混合物包括根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的第一外侧引物和一对特异的内侧引物以及TaqMan探针P5、根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物和一对特异的第二内侧引物以及TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物和一对特异的第三内侧引物以及TaqMan探针P15、根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM，所述一对特异的第一外侧引物包括外侧上游引物P1和外侧下游引物P2；所述一对特异的第一内侧引物包括内侧上游引物P3和内侧下游引物P4；所述一对特异的第二外侧引物包括外侧上游引物P6和外侧下游引物P7；所述一对特异的第二内侧引物包括内侧上游引物P8和内侧下游引物P9；所述一对特异的第三外侧引物包括外侧上游引物P11和外侧下游引物P12；所述一对特异的第三内侧引物包括内侧上游引物P13和内侧下游引物P14；所述内对照引物包括上游引物ACE2F和下游引物ACE2R；
所述外侧上游引物P1的引物序列为ACAACTTGTGCTAAT；
所述外侧下游引物P2的引物序列为CATCAGCTGACTGAAG；
所述内侧上游引物P3的引物序列为AAAACCCTGTGGGTTTTACACTT；
所述内侧下游引物P4的引物序列为AAAAGGGTTCGCGGAGTTGAT；
所述TaqMan探针P5的引物序列为FAM-CCTTTCCACATACCGCAGAC-TAMARA；
所述外侧上游引物P6的引物序列为CAGTTCAAGAAATTCAACT；
所述外侧下游引物P7的引物序列为CAGTTTGGCCTTGTTGT；
所述内侧上游引物P8的引物序列为AAAAGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；
所述内侧下游引物P9的引物序列为AAAACATTTTGCTCTCAAGCTGGT；
所述TaqMan探针P10的引物序列为FAM-CTTGCTTTGCTGCTGCTTGAC-TAMARA；
所述外侧上游引物P11的引物序列为GTTAATAGCGTACTTCTTT；
所述外侧下游引物P12的引物序列为CAAGACTCACGTTAACAAT；
所述内侧上游引物P13的引物序列为AAAACTTGCTTTCGTGGTATTCTTG；
所述内侧下游引物P14的引物序列为AAAAGCAGCAGTACGCACACAAT；
所述TaqMan探针P15的引物序列为FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTC-TAMARA；
所述上游引物ACE2F的引物序列为GGACTCTGCCATTTACTTAC；
所述下游引物ACE2R的引物序列为CCAACTATCTCTCGCTTCAT；
所述TaqMan探针ACE2TM的引物序列为ROX-CATCCACCTCCACTTCTCTAAC–TAMARA。
其中，所述外侧上游引物P1、P6、P11、所述外侧下游引物P2、P7、P12、所述内侧上游引物P3、P8、P13、所述内侧下游引物P4、P9、P14、所述TaqMan探针P5、P10、P15、所述上游引物ACE2F、所述下游引物ACE2R和所述TaqMan探针ACE2TM的终浓度均为0.2-0.4umol/L。
其中，所述逆转录酶的终浓度为1-3U/50ul，所述耐热DNA聚合酶的终浓度为1-3U/50ul，所述dNTPs的终浓度为0.2-0.5mmol/L，所述镁离子的终浓度为1.5-3.5mmol/L，所述PCR缓冲液的终浓度为1-1.5XPCR。
其中，1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、PH值为8.3浓度为10mmol/L的Tris.HCl、0.01％明胶。
第二方面，本发明提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒的制备方法，包括：
根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物和TaqMan探针P5；根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物和一对特异的第二内侧引物以及TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物和一对特异的第三内侧引物以及TaqMan探针P15；
根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM；
将一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物、TaqMan探针P5、一对特异的第二外侧引物、一对特异的第二内侧引物、TaqMan探针P10、一对特异的第三外侧引物、一对特异的第三内侧引物、TaqMan探针P15、一对特异的内对照引物、TaqMan探针ACE2TM等摩尔混合成引物探针混合物；
将所述引物探针混合物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板混合成缓冲反应体系；
将所述缓冲反应体系进行逆转录反应、反复热循环反应，得到新冠病毒核酸检测试剂盒。
在一实施方式中，将所述缓冲反应体系进行逆转录反应、反复热循环反应，得到新冠病毒核酸检测试剂盒，具体包括：
将所述缓冲反应体系在荧光定量PCR仪上42℃逆转录5分钟，96℃下变性5分钟；
在96℃20秒、50℃10秒、60℃30秒的温度下进行反复热循环反应40次。
第三方面，本发明提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒的应用，包括：
根据新冠病毒核酸检测试剂盒中内标基因扩增的结果，判断新冠病毒核酸检测的样品是否合格、有效；
若有Ct值，则得出阳性结果；
若无Ct值，则根据阴性对照进行判断；
若内标基因检测结果为阴性，病毒核酸检测为阴性，则得到采样不合格的检测结果；
若内标基因检测结果为阳性，病毒核酸检测为阴性，则得出阴性结果。
本发明的一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用，通过根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的外侧引物和一对特殊的巢式引物和TaqMan探针，以及人ACE2 mRNA特异的内对照引物和其特异的TaqMan探针ACE2TM，然后将各引物、探针等摩尔混合成引物混合物探针混合物，最后将逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水以及待测RNA等混合成新冠病毒核酸反应体系，在荧光定量热循环仪上首先进行逆转录反应合成模板cDNA,再进行高温、低温、中温的反复热循环，使内外侧引物同时引导新链合成，获得分别由内内、外外、内外侧引物界定的PCR产物并降解其探针释放荧光素A,ACE2基因则降解其探针释放荧光素B。由于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定的PCR产物都可以作为内内引物附加的模板，使内内引物引导的PCR产物以超过2倍的速度增加，经过n个循环，其理论值为初始模板量的1/4(n2+3n)2n倍。比常规荧光定量PCR技术更高特异性、更高扩增效率的且能够降低假阴性结果，从而提高检测结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒的制备方法的流程示意图；
图2是本发明的新冠病毒核酸检测试剂盒的应用流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
第一方面，本发明提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒，包括引物探针混合物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板，所述引物探针混合物包括根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物、TaqMan探针P5、根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物和一对特异的第二内侧引物以及TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物和一对特异的第三内侧引物以及TaqMan探针P15、根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM，所述一对特异的第一外侧引物包括外侧上游引物P1和外侧下游引物P2；所述一对特异的第一内侧引物包括内侧上游引物P3和内侧下游引物P4；所述一对特异的第二外侧引物包括外侧上游引物P6和外侧下游引物P7；所述一对特异的第二内侧引物包括内侧上游引物P8和内侧下游引物P9；所述一对特异的第三外侧引物包括外侧上游引物P11和外侧下游引物P12；所述一对特异的第三内侧引物包括内侧上游引物P13和内侧下游引物P14；所述内对照引物包括上游引物ACE2F和下游引物ACE2R；
所述外侧上游引物P1的引物序列为5’-ACAACTTGTGCTAAT-3’(SEQ ID NO：1)；
所述外侧下游引物P2的引物序列为5’-CATCAGCTGACTGAAG-3’(SEQ ID NO：2)；
所述内侧上游引物P3的引物序列为5’-AAAACCCTGTGGGTTTTACACTT-3’(SEQ IDNO：3)；
所述内侧下游引物P4的引物序列为5’-AAAAGGGTTCGCGGAGTTGAT-3’(SEQ ID NO：4)；
所述TaqMan探针P5的引物序列为5’FAM-CCTTTCCACATACCGCAGAC-TAMARA-3’(SEQID NO：5)；
所述上游引物ACE2F的引物序列为5’-GGACTCTGCCATTTACTTAC-3’(SEQ ID NO：6)；
所述下游引物ACE2R的引物序列为5’-CCAACTATCTCTCGCTTCAT-3’(SEQ ID NO：7)；
所述TaqMan探针ACE2TM的引物序列为5’ROX-CATCCACCTCCACTTCTCTAAC–TAMARA-3’(SEQ ID NO：8)；
所述外侧上游引物P6的引物序列为CAGTTCAAGAAATTCAACT；(SEQ ID NO：9)；
所述外侧下游引物P7的引物序列为CAGTTTGGCCTTGTTGT；(SEQ ID NO：10)；
所述内侧上游引物P8的引物序列为AAAAGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；(SEQ ID NO：11)；
所述内侧下游引物P9的引物序列为AAAACATTTTGCTCTCAAGCTGGT；(SEQ ID NO：12)；
所述TaqMan探针P10的引物序列为FAM-CTTGCTTTGCTGCTGCTTGAC-TAMARA；(SEQ IDNO：13)；
所述外侧上游引物P11的引物序列为GTTAATAGCGTACTTCTTT；(SEQ ID NO：14)；
所述外侧下游引物P12的引物序列为CAAGACTCACGTTAACAAT；(SEQ ID NO：15)；
所述内侧上游引物P13的引物序列为AAAACTTGCTTTCGTGGTATTCTTG；(SEQ ID NO：16)；
所述内侧下游引物P14的引物序列为AAAAGCAGCAGTACGCACACAAT；(SEQ ID NO：17)；
所述TaqMan探针P15的引物序列为FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTC-TAMARA。(SEQID NO：18)；
所述ORF1ab基因为开放读码框1ab，一对特异的内侧引物为巢式引物，所述TaqMan探针P5为荧光报告基团A，所述ORF1ab基因、所述N基因、所述E基因均为荧光报告基团A，检测可增强荧光报告基团A信号，提高阳性检测灵敏度，所述TaqMan探针ACE2TM为荧光报告基团B，其荧光通道有别于荧光报告基团A。所述外侧上游引物P1、P6、P11、所述外侧下游引物P2、P7、P12、所述内侧上游引物P3、P8、P13、所述内侧下游引物P4、P9、P14、所述TaqMan探针P5、P10、P15、所述上游引物ACE2F、所述下游引物ACE2R和所述TaqMan探针ACE2TM的终浓度均为0.2-0.4umol/L。所述逆转录酶的终浓度为1-3U/50ul，所述耐热DNA聚合酶的终浓度为1-3U/50ul，所述dNTPs的终浓度为0.2-0.5mmol/L，所述镁离子的终浓度为1.5-3.5mmol/L，所述PCR缓冲液的终浓度为1-1.5XPCR。其中，1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、PH值为8.3浓度为10mmol/L的Tris.HCl、0.01％明胶。
具体的，首先根据新冠病毒核酸ORF1ab基因、N基因和E基因序列合成三对特异的外侧引物和三对特殊的巢式引物和TaqMan探针(荧光报告基团A)，以及采用了新冠病毒基因所攻击的下呼吸道靶细胞ACE2受体蛋白的mRNA作为内标，根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和其特异的TaqMan探针(采用荧光报告基团B,其荧光通道有别于荧光报告基团A)，然后将各引物、探针等摩尔混合成引物混合物探针混合物，最后将逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水以及待测RNA等混合成新冠病毒核酸缓冲反应体系，在荧光定量热循环仪上首先进行逆转录反应合成模板cDNA，再进行高温、低温、中温的反复热循环，使内外侧引物同时引导新链合成，获得分别由内内、外外、内外侧引物界定的PCR产物并降解其探针释放荧光素A，ACE2基因则降解其探针释放荧光素B。由于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定的PCR产物都可以作为内内引物附加的模板，使内内引物引导的PCR产物以超过2倍的速度增加，经过n个循环，其理论值为初始模板量的1/4(n2+3n)2n倍。另外，由于增加了ACE2内参照基因检测，能够根据其扩增曲线的状况判断是否取到了待检测的标本材料。
所用扩增缓冲反应体系是由引物、探针、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下：特异的引物及探针每条0.2-0.4umol/L、逆转录酶1-3U/50ul、Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、dNTPs底物0.2-0.5mmol/L、模板DNA若干、Mg++1.5-3.5mmol/L、缓冲液1-1.5XPCR；其中1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、10mmol/L Tris.HCl PH8.3、0.01％明胶。
该RT-NCA-QPCR由于每一循环中合成的由外外、内外侧引物界定的PCR产物都可以作为内内引物附加的模板，使内内引物引导的PCR产物以超过2倍的速度增加，经过n个循环，其理论值为初始模板量的1/4(n2+3n)2n倍。与常规巢式PCR方法相比，具有以下优点：1、操作简便快速，只做一次PCR即可达到巢式扩增的提高特异性的效果；2、扩增前不进行PCR产物操作，减少可能出现的PCR产物污染；3、自动化程度高，人工成本低，还可以高通量检测，每次可以检测90个以上标本；4、需要的检测样本材料微量,每个反应最低仅需要待检靶DNA 2-5个拷贝，便于取材。
第二方面，请参阅图1，图1是本发明实施例提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒的制备方法的流程示意图，具体的，所述新冠病毒核酸检测试剂盒的制备方法可以包括以下步骤：
S101、根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物和TaqMan探针P5；根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物和一对特异的第二内侧引物以及TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物和一对特异的第三内侧引物以及TaqMan探针P15；
S102、根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM；
S103、将一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物、TaqMan探针P5、一对特异的第二外侧引物、一对特异的第二内侧引物、TaqMan探针P10、一对特异的第三外侧引物、一对特异的第三内侧引物、TaqMan探针P15、一对特异的内对照引物、TaqMan探针ACE2TM等摩尔混合成引物探针混合物；
S104、将所述引物探针混合物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板混合成缓冲反应体系；
S105、将所述缓冲反应体系进行逆转录反应、反复热循环反应，得到新冠病毒核酸检测试剂盒。
本发明实施例中，将所述缓冲反应体系在荧光定量PCR仪上42℃逆转录5分钟，96℃下变性5分钟；
在96℃20秒、50℃10秒、60℃30秒的温度下进行反复热循环反应40次。
实施例1，用病毒RNA提取试剂盒提取痰液样本RNA，作为待扩增模板；设计引物探针：根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的外侧引物、一对特异的内侧引物和TaqMan探针P5，根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物、一对特异的第二内侧引物和TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物、一对特异的第三内侧引物和TaqMan探针P15，根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM；逆转录NCA-QPCR反应：RT-NCA-PCR:混合50ul反应体系，内含内、外侧引物(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、ACE2F、ACE2R、ACE2TM)各10pmol，模板RNA 1-5ng，1X PCR缓冲液，RNA聚合酶1u，Taq DNA聚合酶2u，Mg++终浓度2mmol/L，然后在荧光定量PCR仪上42℃逆转录5分钟，96℃下变性5分钟，然后按96℃20秒，50℃10秒，60℃30秒并检测FAM和ROX荧光，热循环40次。只用P3P4P5所做qPCR作为普通荧光定量PCR的对照试验。结果：在12个只用内侧引物所做普通荧光定量PCR检测为阳性的RNA标本中，采用RT-NCA-PCR检测为扩增均为阳性；经统计学分析NCA-qPCR反应的Ct值显著小于对应的只用内侧引物所做qPCR的Ct值，说明了NCA-qPCR的扩增效率显著高于普通qPCR的扩增效率，即NCA-qPCR灵敏度更高。
实施例2，用常规的的酚氯仿抽提法提取外周血DNA，作为待扩增模板；设计引物探针：根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的外侧引物、一对特异的内侧引物和TaqMan探针P5，根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物、一对特异的第二内侧引物和TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物、一对特异的第三内侧引物和TaqMan探针P15，根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM；逆转录NCA-QPCR反应：RT-NCA-PCR:混合50ul反应体系，内含内、外侧引物(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、ACE2F、ACE2R、ACE2TM)各10pmol，模板RNA 1-5ng，1X PCR缓冲液，RNA聚合酶1u，Taq DNA聚合酶2u，Mg++终浓度2mmol/L，然后在荧光定量PCR仪上42℃逆转录5分钟，96℃下变性5分钟，然后按96℃20秒，50℃10秒，60℃30秒并检测FAM和ROX荧光，热循环40次。只用P3P4P5所做qPCR作为普通荧光定量PCR的对照试验。结果：在20个普通荧光定量PCR检测为阴性的RNA标本中，采用RT-NCA-PCR检测为扩增阴性的标本19个，阳性结果1个，该病例经过验证确认为新冠病毒感染阳性，说明了我们发明的NCA-qPCR可以降低假阴性结果。
第三方面，请参阅图2，本发明提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒的应用，包括：
根据新冠病毒核酸检测试剂盒中内标基因扩增的结果，判断新冠病毒核酸检测的样品是否合格、有效；
若FAM通道有Ct值，则得出阳性结果；
若FAM通道无Ct值，则根据阴性对照进行判断；
若内标基因检测结果为阴性，病毒核酸检测为阴性，则得到采样不合格的检测结果；
若内标基因检测结果为阳性，病毒核酸检测为阴性，则得出阴性结果。
具体的，扩增检测结果的判断：1.扩增阴阳性的判断：有Ct值就是扩增阳性，没有Ct值就是扩增阴性。2.阴性对照应为扩增阴性，无Ct值，如阴性对照为扩增阳性，则为PCR产物污染，结果不可信，需重做实验。3.如果阳性对照为阴性，PCR扩增失败，结果不可信，需要重新进行实验。4.样品为阴性：样品的ROX荧光曲线有Ct值，且FAM荧光的扩增曲线无Ct值。5.样品为阳性：FAM荧光扩增曲线有Ct值。6.不良样品：FAM和ROX荧光放大曲线均无Ct值。根据上述NCA-PCR原理，将上述引物和其他RT-qPCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以系列稀释度的标准DNA模板组装成NCA-PCR试剂盒。
本发明采用一步法逆转录多重荧光定量PCR核酸体外检测技术在同一个检测反应体系中首先通过逆转录反应合成cDNA，在通过多重荧光定量PCR同时检测新冠病毒特异的核酸和人特异的mRNA序列，即在新冠病毒模板RNA存在时，通过逆转录酶转录为cDNA，然后再通过高、中、低温反复热循环，在双引物的作用下可以实现病毒特异性核酸序列高效率的扩增；从而判断待测标本中是否含有新冠病毒特异的核酸序列；在材料中含有人下呼吸道细胞(新冠病毒的靶细胞)时，其ACE2受体蛋白的mRNA通过逆转录酶转录为cDNA，然后再通过高、中、低温反复热循环，在其特异性引物的作用下可以实现ACE2基因的特异性扩增；
另外，除使用病毒核酸ORF1ab作为靶标外，还可以将病毒核酸的N基因、E基因等片段作为待测序列，使用与ORF1ab相同或不同的荧光探针作为荧光指示剂，分别起到更高灵敏度或高特异性的检测目标；
使用样本类型包括肺泡灌洗液、鼻咽拭子、咽拭子、痰液、泪液、唾液、鼻涕、尿液、粪便、胸腹水、汗液等各种来自人体的样本或从疑似患者所处环境使用适当采样方式采集的环境样本；
采用FAM和ROX的荧光探针分别标记待测新冠病毒核酸区域序列和内标基因从而实现一孔多重RT-PCR的检验结果；
采用了一种操作简单、特异性高、特异性扩增效率超过2n倍的DNA体外扩增技术即巢式共扩增聚合酶链反应(nest coamplification polymerase chain reaction，NCA-PCR)和增加ACE2内参照基因检测的多重PCR扩增技术，可以从根本上解决特异性扩增的效率，并能够鉴别出由于取材误差导致的假阴性结果。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种新冠病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，
包括引物探针混合物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板，所述引物探针混合物包括根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的第一外侧引物和一对特异的第一内侧引物以及TaqMan探针P5、根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物和一对特异的第二内侧引物以及TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物和一对特异的第三内侧引物以及TaqMan探针P15、根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM，所述一对特异的第一外侧引物包括外侧上游引物P1和外侧下游引物P2；所述一对特异的第一内侧引物包括内侧上游引物P3和内侧下游引物P4；所述一对特异的第二外侧引物包括外侧上游引物P6和外侧下游引物P7；所述一对特异的第二内侧引物包括内侧上游引物P8和内侧下游引物P9；所述一对特异的第三外侧引物包括外侧上游引物P11和外侧下游引物P12；所述一对特异的第三内侧引物包括内侧上游引物P13和内侧下游引物P14；所述内对照引物包括上游引物ACE2F和下游引物ACE2R；
所述外侧上游引物P1的引物序列为ACAACTTGTGCTAAT；
所述外侧下游引物P2的引物序列为CATCAGCTGACTGAAG；
所述内侧上游引物P3的引物序列为AAAACCCTGTGGGTTTTACACTT；
所述内侧下游引物P4的引物序列为AAAAGGGTTCGCGGAGTTGAT；
所述TaqMan探针P5的引物序列为FAM-CCTTTCCACATACCGCAGAC-TAMARA；
所述外侧上游引物P6的引物序列为CAGTTCAAGAAATTCAACT；
所述外侧下游引物P7的引物序列为CAGTTTGGCCTTGTTGT；
所述内侧上游引物P8的引物序列为AAAAGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；
所述内侧下游引物P9的引物序列为AAAACATTTTGCTCTCAAGCTGGT；
所述TaqMan探针P10的引物序列为FAM-CTTGCTTTGCTGCTGCTTGAC-TAMARA；
所述外侧上游引物P11的引物序列为GTTAATAGCGTACTTCTTT；
所述外侧下游引物P12的引物序列为CAAGACTCACGTTAACAAT；
所述内侧上游引物P13的引物序列为AAAACTTGCTTTCGTGGTATTCTTG；
所述内侧下游引物P14的引物序列为AAAAGCAGCAGTACGCACACAAT；
所述TaqMan探针P15的引物序列为FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTC-TAMARA；
所述上游引物ACE2F的引物序列为GGACTCTGCCATTTACTTAC；
所述下游引物ACE2R的引物序列为CCAACTATCTCTCGCTTCAT；
所述TaqMan探针ACE2TM的引物序列为ROX-CATCCACCTCCACTTCTCTAAC–TAMARA。
2.如权利要求1所述的新冠病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，
所述外侧上游引物P1、P6、P11、所述外侧下游引物P2、P7、P12、所述内侧上游引物P3、P8、P13、所述内侧下游引物P4、P9、P14、所述TaqMan探针P5、P10、P15、所述上游引物ACE2F、所述下游引物ACE2R和所述TaqMan探针ACE2TM的终浓度均为0.2-0.4umol/L。
3.如权利要求2所述的新冠病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，
所述逆转录酶的终浓度为1-3U/50ul，所述耐热DNA聚合酶的终浓度为1-3U/50ul，所述dNTPs的终浓度为0.2-0.5mmol/L，所述镁离子的终浓度为1.5-3.5mmol/L，所述PCR缓冲液的终浓度为1-1.5XPCR。
4.如权利要求3所述的新冠病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，
1XPCR缓冲液包括50mmol/L KCl、PH值为8.3浓度为10mmol/L的Tris.HCl、0.01％明胶。
5.一种新冠病毒核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
根据新冠病毒核酸ORF1ab基因序列合成一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物和TaqMan探针P5；根据新冠病毒核酸N基因序列合成一对特异的第二外侧引物和一对特异的第二内侧引物以及TaqMan探针P10、根据新冠病毒核酸E基因序列合成一对特异的第三外侧引物和一对特异的第三内侧引物以及TaqMan探针P15；
根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM；
将一对特异的第一外侧引物、一对特异的第一内侧引物、TaqMan探针P5、一对特异的第二外侧引物、一对特异的第二内侧引物、TaqMan探针P10、一对特异的第三外侧引物、一对特异的第三内侧引物、TaqMan探针P15、一对特异的内对照引物、TaqMan探针ACE2TM等摩尔混合成引物探针混合物；
将所述引物探针混合物、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板混合成缓冲反应体系；
将所述缓冲反应体系进行逆转录反应、反复热循环反应，得到新冠病毒核酸检测试剂盒。
6.如权利要求5所述的新冠病毒核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将所述缓冲反应体系进行逆转录反应、反复热循环反应，得到新冠病毒核酸检测试剂盒，具体包括：
将所述缓冲反应体系在荧光定量PCR仪上42℃逆转录5分钟，96℃下变性5分钟；
在96℃20秒、50℃10秒、60℃30秒的温度下进行反复热循环反应40次。
7.一种新冠病毒核酸检测试剂盒的应用，其特征在于，包括：
根据新冠病毒核酸检测试剂盒中内标基因扩增的结果，判断新冠病毒核酸检测的样品是否合格、有效；
若有Ct值，则得出阳性结果；
若无Ct值，则根据阴性对照进行判断；
若内标基因检测结果为阴性，病毒核酸检测为阴性，则得到采样不合格的检测结果；
若内标基因检测结果为阳性，病毒核酸检测为阴性，则得出阴性结果。
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