CN111187858A - 新型冠状病毒检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒。所述试剂盒包括qRT‑PCR反应液、qRT‑PCR酶液、内标、阴性质控品和阳性质控品；所述内标为含有内参检测基因片段的RNA假病毒；所述阳性质控品为含有目的检测基因片段的RNA假病毒；所述qRT‑PCR反应液中包括序列为SEQ ID NO:1～8的四组上下游引物和序列为SEQ ID NO:9～12四条探针；该试剂盒可同时检测三段目标基因片段，因此可有效避免漏检，并且试剂盒的内标和阳性质控品均使用假病毒，可有效提高试剂盒制备的安全性，并且还能进一步保证试剂盒检测准确性；此外，本试剂盒灵敏度高、稳定性好。

Description

新型冠状病毒检测试剂盒

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，本发明提供了一种用于检测临床样本中 新型冠状病毒(2019-nCoV)的荧光RT-PCR检测试剂盒；可用于新型冠状 病毒的临床早期定性诊断。

背景技术

冠状病毒是自然界广泛存在的一个大型病毒家族，因其形态在电镜下观 察似王冠而得名，主要引起呼吸系统疾病。2020年2月11日，世界卫生组 织(WHO)宣布，将把从2019年12月开始出现的新型冠状病毒肺炎，正式 命名为“COVID-19”，全称CoronavirusDisease 2019。感染新型冠状病毒后， 患者初始症状多为发热、乏力、干咳，并逐渐出现重症表现，部分严重病例 可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒性休克，甚至死亡。该病暂时没有特效治 疗方法。

2020年1月30日，WHO宣布将2019-nCoV疫情列为“国际关注公共卫 生突发事件”(Public Health Emergency of International Concern，PHEIC)，至 2020年2月4日，全球总共有24个国家累计报告新型冠状病毒确诊病例 20502例。该病毒主要通过飞沫传播，接触沾染有含病毒飞沫的物品和材料 也可被感染。继美国报道新冠状肺炎病人粪便中可检出2019-nCoV核酸，武 汉和深圳也发现类似情况，提示了该病毒通过粪-口途径消化道感染的可能 性，人群对2019-nCoV普遍易感，儿童也可感染。潜伏期或/和无症状2019- nCoV感染者是新冠肺炎的主要传染源。

2019-nCoV的形态结构为圆形或椭圆形，常为多形性，直径在60～140nm， 基因组为单正链RNA，有包膜，包膜上有蘑菇状蛋白刺突使病毒体形如王冠 状。2020年1月24日，中国疾病预防控制中心公布了2019-nCoV电镜照片 (参见图1)。

实时荧光PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR 产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增 产物进行实时动态监测及自动分析结果，具有实时、准确、特异、快速、简 便、廉价等特点，是一种先进的分子检测技术。

目前的新型冠状病毒检测试剂盒，因研发周期短、样本收集不规范等问 题，普遍存在检测假阴性高，容易漏检的问题；并且检测试剂盒的安全性也 是亟需解决的另一个问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新型冠状病毒(2019-nCoV)的荧 光RT-PCR检测试剂盒；该试剂盒是针对三个目标基因片段进行的同时检测， 避免漏检的同时，检测灵明度高；并且本试剂盒还使用假病毒作为内标和阳 性对照，可以有效保证试剂盒检测的准确性，其高试剂盒制备研发过程中的 安全性能；此外本发明试剂盒的稳定性也较好。

在一方面，本发明一种冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括qRT-PCR 反应液、qRT-PCR酶液、内标、阴性质控品和阳性质控品；

所述内标为含有内参检测基因片段的RNA假病毒；所述阳性质控品为 含有目的检测基因片段的RNA假病毒；

所述qRT-PCR反应液中包括序列为SEQ ID NO:1～8的引物和序列为 SEQ ID NO:9～12探针。

在一些实施方式中，所述目的检测基因片段为从2019-nCoV病毒的 ORF1ab基因、N基因和E基因中各选取150～400bp的基因片段组合而成。

在一些具体实施方式中，所述目标检测基因片段中，

检测所述2019-nCoV病毒的ORF1ab基因的引物序列为SEQ ID NO:1～2， 探针序列为SEQ ID NO:9；

检测所述2019-nCoV病毒的N基因的引物序列为SEQ ID NO:3～4，探 针序列为SEQID NO:10；

检测所述2019-nCoV病毒的E基因的引物序列为SEQ ID NO:5～6，探 针序列为SEQID NO:11。

在一些具体实施方式中，检测所述内参检测基因片段的引物序列为SEQ ID NO:7～8，探针序列为SEQ ID NO:12。

在一些实施方式中，所述qRT-PCR酶液包括Taq酶和UDG酶。

在一些实施方式中，所述试剂盒的检测样本包括呼吸道分泌物样本和血 浆样本。

在一些具体实施方式中所述呼吸道分泌物样本选自咽拭子、鼻拭子、鼻 咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液等中的一种或多种。

在一些具体实施方式中，所述内参检测基因片段为250～400bp。

在一些实施方式中，本发明中使用的检测用探针可为预先用标记物志 标记的寡核苷酸，或者是可为非标记的寡核苷酸。从检测灵敏度的观点来 看，优选使用标记的寡核苷酸。

在另一方面，本发明提供了一种冠状病毒的检测方法，所述方法包括以 下步骤：

步骤A、核酸提取

首先，样本预处理，使用0.1％DTT常温液化呼吸道分泌物样本；

其次，对血液样本或预处理的呼吸道分泌物样本使用专利号为 CN107254463B公开的RNA提取试剂盒进行核酸RNA的提取；

步骤B、RT-PCR扩增

第一步，通过逆转录酶作用，将RNA逆转录成cDNA；

第二步，在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA为模版进行PCR 扩增。

在一些实施方式中，所述检测方法同时还需要对内标进行步骤A和步骤 B的平行操作。

本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒的有益效果在于：

首先，本发明是针对新型冠状病毒2019-nCoV中ORF1ab基因、N基因 和E基因这三段基因进行的核酸检测。检测对象和检测用引物和探针经过优 化筛选后，意外得到即使进行多重荧光的核酸检测，在本发明的特有引物和 探针的作用下，仍然能准确检测出目标核酸序列，极大程度避免了漏检的可 能性，提高了检测的灵敏度；

其次，本发明还使用假病毒作为试剂盒的内标，该假病毒的应用贯穿了 试剂盒的整个操作过程如核酸提取和RT-PCR扩增，因此，可保证了试剂盒 的准确性，避免了操作流程的失误导致的假阴性，进一步提高了检出率。

此外，该试剂盒检测的阳性质控品中的假病毒插入了2019-nCoV中 ORF1ab基因、N基因和E基因三段基因相关的检测序列，可以保证三段基 因之间的浓度比例一致、阳性对照的检测结果基本一致性；进一步简化了试 剂盒的制备，有效提高试剂盒质控的同时还进一步增加额试剂盒的稳定性。

综上，本发明的新型冠状病毒检测试剂盒可实现核酸提取和RT-PCR扩 增全自动化操作，一管同时检测三段目标序列，操作简单的同时还能避免漏 检，试剂盒的检测准确性高、灵敏度和稳定性好；并且本发明试剂盒的制备 过程简单且安全。

附图说明

图1为2019-nCoV的电镜示意图；

图2为临床阳性样本检测结果示意图(扩增曲线示意图)；其中，图a为FAM 通道、图b为VIC通道、图c为ROX通道、图d为VIC通道；从图中可以 看出，四组通道的Ct≤35；均检出为阳性临床样本。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和 各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方 式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领 域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学 术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾， 本说明书优先。

在本说明书中，所述“检测”仅指判断样本中是否存在靶物质——019- nCoV病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因。

在本说明书中，“核酸”是指RNA或DNA。“核酸”、“基因片段”、“基因 序列”可相互替换。核酸只要可核酸扩增，就不特别限定，可一部分或全部是 核苷酸衍生物。

在本说明书中，“目标核酸”是有兴趣对象的序列(以下也称为“检测序 列”)。“目标核酸”和“目的检测基因片段”可相互替换。目标核酸不仅是核酸 样品中所含的核酸，也含扩增核酸样品中的DNA或RNA的扩增产物(扩增 子)或，从核酸样品中的RNA由逆转录反应合成的cDNA等。目标核酸通常 是生物来源或病毒来源的。

术语“引物”和“探针”指寡核苷酸的功能。引物典型地在与靶杂交后通过 聚合酶或连接来延伸，而探针可以通过与靶杂交或通过杂交后基于聚合酶的 延伸来发挥作用。杂交的寡核苷酸如果用于捕获或检测靶序列则可以作为探 针起作用，而如果该寡核苷酸用作扩增引物中的靶结合序列，则其可以作为 引物起作用。因此，可以理解，本文公开的用于扩增、检测的任何靶结合序 列都可以用作杂交探针或用作引物中的靶结合序列以进行检测或扩增，并任 选地与专门序列连接。术语“上下游引物”为上游引物和下游引物。术语“上游 引物”和“下游引物”是相对概念，上游引物通常是位于整个扩增片段的5’端 的引物，一般亦叫正向引物或有义链引物；下游引物与整个扩增片段的3’端 末端相同或相似，一般亦称为反向引物或反义链引物。

本发明中，作为标记物质，可例示荧光物质、酶、半抗原等。在本说明 书中，预先标记化的检测用探针也称为“标记化检测用探针”。作为标记物质 使用荧光物质时，作为信号可检测到荧光。作为荧光物质，可举出荧光素、 若丹明、德克萨斯红、四甲基若丹明、羧基若丹明、藻红蛋白、6-FAM(商标)、 Cy(注册商标)3、Cy(注册商标)5、Alexa Fluor(注册商标)的系列等。作为标记 物质使用酶时，使之与所述酶的底物反应，通过生成发生发光等的信号的反 应产物，可检测到信号。作为标记物质使用半抗原时，经特异性地结合于所 述半抗原的物质使酶或荧光物质结合于检测用探针。由此，可检测到荧光或 发光等的信号。再者，作为特异性地结合于半抗原的物质，可举出抗半抗原 抗体。另外，作为半抗原使用生物素时可使用亲和素类(亲和素、链霉亲和素 等)。

本发明优选使用荧光基团比如FAM、CY5、ROX、VIC等作为标记物质； 标记物质标记在探针的一端；探针的另一端优选标记有淬灭基团比如BHQ 等。

本发明中，内标为含有内参检测基因片段的RNA假病毒，用于临床质 控核酸提取和PCR扩增，排除操作过程的误差。

本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如，试纸、含有各种测试所需 试剂的测试盒、微流体芯片等，可以按照本领域技术人员已知的标准步骤来 制造试剂盒。

本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂和/或 用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。

实施例中采用实时荧光PCR检测试剂盒为例对本发明的试剂盒进行说 明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于实时荧光PCR检测试剂盒。

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，实施例中未注 明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器 未注明生产厂商的，为可以通过商购获得的常规产品。

以下实验材料具体如下：

表1

原料名称	供应商
		dATP、dUTP、dCTP、dGTP	罗氏诊断产品(上海)有限公司
引物、探针	上海百力格生物技术有限公司
		TI HotStart Taq	四川迈克生物新材料技术有限公司
TM-MLVRTase	四川迈克生物新材料技术有限公司
		尿嘧啶糖基化酶(UDG)	罗氏诊断产品(上海)有限公司
CoV-2019假病毒颗粒	四川迈克生物新材料技术有限公司
		IC09假病毒颗粒	四川迈克生物新材料技术有限公司

实施例1

一种冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括qRT-PCR反应液、qRT-PCR 酶液、内标、阴性质控品和阳性质控品；

所述qRT-PCR反应液：引物、探针、dNTP、Mg2+、PBS缓冲液；

所述qRT-PCR酶液：Taq酶、UDG酶；

所述内标：含有内参检测基因片段的RNA假病毒；

所述阴性质控品：DEPC-处理水；

所述阳性质控品：含有目的检测基因片段的RNA假病毒；

本试剂盒引物探针如下所示：

检测所述2019-nCoV病毒的ORF1ab基因的引物序列为SEQ ID NO:1～2， 探针序列为SEQ ID NO:9；

检测所述2019-nCoV病毒的N基因的引物序列为SEQ ID NO:3～4，探 针序列为SEQID NO:10；

检测所述2019-nCoV病毒的E基因的引物序列为SEQ ID NO:5～6，探 针序列为SEQID NO:11。

检测所述内参检测基因片段的引物序列为SEQ ID NO:7～8，探针序列为 SEQ IDNO:12。

本实施例中各探针上均标记有不同的标记物；FAM通道检测ORF1ab基 因，ROX通道检测E基因，Cy5通道检测N基因，VIC通道检测内标。

实施例2

冠状病毒检测试剂盒的检测方法

试剂准备

取试剂盒中核酸提取或纯化试剂的各组分，室温放置，待其温度平衡 之室温后，混匀后瞬时离心备用。

按照下表配制qRT-PCR混合液：

表2

	qRT-PCR反应液	qRT-PCR酶液	测试数
				qRT-PCR混合液	18μL	2μL	N＝n+2

其中，测试数N＝n+2，其中，n表示待测样本数量，另2份为阴性质 控品、阳性质控品。应根据实验室情况，适当考虑混合液分装过程中的算 好。

将上述准备好的试剂转移至样本处理区

样本处理

使用4倍0.1％DTT常温液化半小时提取新鲜采集的呼吸道样本后或直 接采集血浆样本，应保证RNA质量和满足实验需要的RNA数量，提取的 RNA样品立即检测或于-70℃以下保存；同时取相应体积的阳性质控品和阴 性质控品进行核酸提取；提取使用专利号为CN107254463B公开的RNA提 取试剂盒进行核酸RNA的提取。样本中加入适量内标进行样本的提取。

在已加入qRT-PCR混合液的PCR反应管/板上分别加入处理好的阴、阳 性质控品及待测样本核酸各20μL，终体积为40μL。盖紧管盖或封膜，瞬间 低速离心后置荧光定量PCR仪。

RT-PCR扩增

按照以下参数进行扩增：

表3

质量控制

同一次实验需同时满足以下条件，否则该次实验无效，需重新进行。

阴性质控品：VIC通道Ct≤35，其余通道未检出；

阳性质控品：扩增曲线呈S型，VIC通道Ct≤35，其余Ct≤32。

可疑：扩增曲线呈S型，且38＜Ct值≤45，需复检；复检结果若一致， 判定结果为该基因核酸检测阳性。

阳性结果判定标准：

同一份样本中2019-nCoV的ORF1ab和N基因(和/或E基因)检测同 时为阳性；

同一患者不同的两份样本中2019-nCoV的ORF1ab或N或E基因检测 为阳性。

实施例3

使用实施例2的检测方法对内标和阳性质控品进行了验证。

将四川新材料的IC09假病毒颗粒(内标)使用假病毒稀释液稀释10倍， 使用迈克生物的2019-nCoV核酸检测试剂进行多次扩增验证，各通道Ct值 如下表所示：

表4

将四川新材料的CoV-2019假病毒颗粒(阳性质控品)，使用假病毒稀释 液10倍梯度稀释，使用迈克生物的核酸提取或纯化试剂盒和2019-nCoV核 酸检测试剂进行扩增验证，检测结果为阳性，结果如下表：

表5

样本中，3L～9L表示依次表示10³稀释、10⁴稀释、10⁵稀释10⁶稀 释、10⁷稀释、10⁸稀释、10⁹稀释；

由此可见，本实施例的内标检测中，VIC通道Ct值小于35，其他通道 均无Ct值，符合要求。阳性质控品也符合要求。在使用本发明内标和阳性质 控品进行检测试剂盒的质控时，可以有效保证检测试剂盒的准确性和灵敏度。

实施例4引物和探针的设计

在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)网站查询2019-nCoV(Genbank： MN908947.3)序列，参考世界卫生组织、国家卫生健康委提供的指南，选 择开放读码框1ab(open readingframe 1ab，ORF1ab)、核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)、E蛋白(E protein，E)作为靶向区域，分别对 每个基因设计不同的引物探针，组合成引物探针组合。

以公开的引物作为对照(表8的对照组)进行如实施例2所示的检 测，利用DEPC-处理水对2019-nCoV核酸进行10倍梯度稀释，以含有不 同引物探针组合的扩增体系检测相应梯度样本，以扩增曲线形态、Ct值作 为筛选判定指标。

检测结果如表6所示，Ct值方面，ORF靶标检测，四重扩增体系中Ct 值与单重扩增检测相比，提前；E基因靶标检测，四重扩增体系中Ct值与 单重扩增检测相比，Ct值无明显差异；N基因靶标检测，四重扩增体系中 Ct值与单重扩增检测相比，Ct值无明显差异。

表6

扩增曲线荧光增幅方面，ORF靶标检测，单重扩增体系中，扩增曲线 呈标准“S”型形态，四重扩增体系中，曲线形态不呈“S”型形态，且低浓度 核酸扩增曲线，荧光增幅太低，影响阴阳性判断；E基因靶标检测，单重 扩增体系和四重扩增体系的扩增曲线均呈“S”型形态；N基因靶标检测，单 重扩增体系中，扩增曲线呈标准“S”型形态，四重扩增体系的扩增曲线不呈 “S”型形态。

结合Ct值和扩增曲线的结果，ORF和N基因这两个靶标检测的引物 探针在四重扩增体系中效果不是很好，需对这两个靶标重新设计引物。

为了进一步优化试剂盒，本发明进行了引物及探针的优化，具体探针 和引物如下表所示

表7(5’→3’)

优化方案如下：

表8

优化设计引物探针组合，利用DEPC-处理水对2019-nCoV核酸进行10 倍梯度稀释，以含有不同引物探针组合的扩增体系检测相应梯度样本，以 扩增曲线形态、Ct值作为筛选判定指标。

扩增结果如下表所述

表9 FAM(ORF检测靶标引物优化)

组别

①

②

③

④

⑤

⑥

⑨

2019-nCoV-3L

16.68

16.68

16.82

16.65

18.29

18.20

18.14

2019-nCoV-4L

20.16

20.21

20.27

20.38

22.28

21.85

21.73

2019-nCoV-5L

23.59

23.48

23.50

23.68

25.63

25.44

25.68

2019-nCoV-9L

35.51

33.94

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

2019-nCoV-9L

34.91

35.02

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

2019-nCoV-1/4 9L

43.43

37.25

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

2019-nCoV-1/4 9L

NoCt

39.54

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

H<sub>2</sub>O

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

表10 Cy5通道(N基因靶标引物优化)

从表9和表10可以看出，Ct值方面，组合①和组合②明显优于其他 组(③④⑤⑥⑨)，低浓度样本检测Ct值来看，组合②优于组合①，但是 阴性样本Cy5通道出现假阳性；组合⑦和组合⑧的结果优于组合⑨，低浓 度样本检测Ct值来看，组合⑧优于组合⑦

扩增曲线方面，Fam通道，组合①、②、③、④扩增曲线均呈“S”型形 态；组合⑤、⑥、⑨扩增曲线不呈“S”型形态；Cy5通道，组合⑦、⑧、⑨ 扩增曲线呈“S”型形态，但组合⑧荧光增幅均高于组合⑦和⑨。

综上，结合Ct值和扩增曲线的结果，ORF靶标检测的引物探针选择组 合①；N基因靶标检测的引物探针选择组合⑧，确定最终2019-nCoV检测 体系的引物探针组合为SEQ IDNO:1～12时，该试剂盒的检测灵敏度最好。

实施例5本发明试剂盒的特异性

特异性参考品C1-C5为上海百力格公司提供的目的DNA片段，样本 信息见下表。

表11

检测结果如表12所示，

表12

本试剂盒检测企业特异性参考品C1～C5，结果均为阴性，即与人冠状病 毒HCoV-229E、HCoV-OC43、CoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV阳 性样本未见交叉反应。

实施例6试剂盒精密度参考品检测

采用本试剂盒检测企业精密度参考品，结果如下：

2019-nCoV精密性参考品检测结果

表13

综上可以看出，本发明检测企业精密度参考品时，CV均小于5％。

实施例7本试剂盒的灵敏度

根据假病毒定值结果，使用假病毒稀释液将其分别稀释至 2×10³copies/mL、1×10³copies/mL、5×10²copies/mL，-10℃～-30℃条件下保存， 具体如下表所示。

表14

检测结果如下：

表15

检测结果均呈阳性，由此可见，本发明试剂盒的灵敏度可达5×10² copies/mL。

实施例8临床样本的检测

从四川省疾控中心及四川省医院分别收集50例阳性样本和110例阴性 样本(包括咽拭子、肺部灌洗液、血浆等)；阳性检测结果为100％阳性，具 体如图2所示；阴性检测结果为100％阴性。

综上所述，本发明试剂盒可同时检测三段目标基因片段，因此可有效避 免漏检，并且试剂盒的内标和阳性质控品均使用假病毒，可有效提高试剂盒 制备的安全性，并且还能进一步保证试剂盒检测准确性；此外，本试剂盒灵 敏度高、稳定性好。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质， 因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方 式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附 的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在 本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在 所附的权利要求中。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省医学科学院(四川省人民医院)

迈克生物股份有限公司

<120> 新型冠状病毒检测试剂盒

<130> MB2020

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

atgtgtggcg gttcactata tg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

ccgtgacagc ttgacaaatg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

cttgaataca ccaaaagatc acatt 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

ctctgctccc ttctgcgtag 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

gcgatcattg taggtgtgct aac 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

aacctcatcc taaggctttt g 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

caggtggaac ctcatcagga gatgc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

acttcctcaa ggaacaacat tgcca 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

agaacgctcc acctcctgct gc 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

atgtgtggcg gttcactata tgt 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

ccgtgacagc ttgacaaatg t 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

gcctctgctc ccttctgc 18

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

caratgttaa asacactatt agcata 26

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

cacattggca cccgcaatc 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

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Claims (8)

1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括qRT-PCR反应液、qRT-PCR酶液、内标、阴性质控品和阳性质控品；

所述内标为含有内参检测基因片段的RNA假病毒；所述阳性质控品为含有目的检测基因片段的RNA假病毒；

所述qRT-PCR反应液中包括序列为SEQ ID NO:1～8的引物和序列为SEQ ID NO:9～12探针。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述目的检测基因片段为从2019-nCoV病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因中各选取150～400bp的基因片段组合而成。

3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：

检测所述2019-nCoV病毒的ORF1ab基因的引物序列为SEQ ID NO:1～2，探针序列为SEQID NO:9；

检测所述2019-nCoV病毒的N基因的引物序列为SEQ ID NO:3～4，探针序列为SEQ IDNO:10；

检测所述2019-nCoV病毒的E基因的引物序列为SEQ ID NO:5～6，探针序列为SEQ IDNO:11。

4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：检测所述内参检测基因片段的引物序列为SEQ ID NO:7～8，探针序列为SEQ ID NO:12。

5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述qRT-PCR酶液包括Taq酶和UDG酶。

6.根据权利要求1所述的冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测样本包括呼吸道分泌物样本和血浆样本。

7.根据权利要求6所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述呼吸道分泌物样本选自咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：内参检测基因片段的长度为250～400bp。

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