CN111560477B - 一种covid-19质控品及其应用 - Google Patents

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
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Abstract

本发明提供了一种COVID‑19质控品，所述COVID‑19质控品包括人源细胞系的RNA与COVID‑19病毒基因序列RNA，经干燥工艺制得可常温保存的RNA干粉，性能稳定，无需低温保存或干冰运输。所述COVID‑19质控品病毒拷贝数可精确定量，病毒基因(E、N、ORF1a)的拷贝数均>1000，可对COVID‑19检测试剂的灵敏性、特异性、可重复性、可复制性、检测限等进行有效评估，有效减少临床检测假阴性的发生。

Description

一种COVID-19质控品及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种COVID-19质控品及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)是一种最新发现的冠状病毒，可引起人新型冠状病毒性肺炎，以发热、乏力、干咳为主要表现，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。
新型冠状病毒属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多行性，直径60-140nm，其遗传物质是单条正义RNA链，接近3万个碱基的长度。新型冠状病毒与严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)同属于同一家族，目前最接近的是蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)，有85％以上的同源性。新型冠状病毒除RNA核心外，由蛋白质外壳包裹，表面突出的是刺突蛋白(SProtein)，它是侵染宿主细胞关键。研究发现它跟SARS病毒一样，与人体细胞的ACE2受体作用从而入侵细胞，但它与ACE2的亲和力是SARS病毒的10～20倍，这很可能是新型冠状病毒高度传染性的原因。
目前，最常用的COVID-19快速检测技术主要是两大类，一类是核酸RNA的检测(CN202010239896.4)，主要包括逆转录定量PCR法(qRT-PCR)和测序法(mNGS)；另一类是抗原抗体的检测。从早期确诊的角度看，核酸RNA检测是最优选择：一方面是因为此时患者尚处于疾病的早期阶段，尽早检测对于疫情防控具有重要作用；另一方面是核酸检测可以定量检测病毒的拷贝数，进而动态监测病毒感染的程度和治疗的效果，因此核酸RNA检测也被认为是新冠病毒检测的金标准。理论上，核酸检测是最早能够确诊新型冠状病毒感染的方法，但由于样本收集、保存、运输不当或是检测试剂、检测条件存在问题等原因，临床检测易出现假阴性结果，如何保证核酸检测结果的及时性和准确性对新型冠状病毒疫情防控具有非常重大的意义，也是新型冠状病毒疫情防控的难题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是，提高COVID-19核酸RNA检测的准确性，减少临床检测假阴性的发生。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种针对常用的qRT-PCR为检测方法的COVID-19质控品，其制备方法包括以下步骤：
a.对COVID-19病毒基因组序列进行分析，得到质控品的病毒基因组成，按照一定的组合方式通过化学合成得到质控品病毒基因序列；
b.将步骤a中得到的病毒基因序列克隆至pUC57质粒载体上；
c.以质粒为模板，进行扩增纯化，得到病毒基因序列转录模板；
d.通过体外转录，得到病毒基因序列RNA，确定其拷贝数及浓度；
e.将人源细胞系的RNA与病毒基因序列RNA按照一定的浓度混合，确定其拷贝数及浓度；
f.将混合后的RNA溶液通过干燥工艺得到可常温保存的RNA干粉。
具体地，步骤a中所述的质控品的病毒基因组成为COVID-19病毒的ORF1a基因、ORF1b基因、M基因、S基因、N基因、E基因中的一种或多种组合。
优选地，步骤a中所述的质控品的病毒基因组成为COVID-19病毒的ORF1a基因、N基因和E基因。
进一步优选地，步骤a中所述的质控品的基因组成为COVID-19病毒的ORF1a基因SEQ ID NO：1所示序列、N基因SEQ ID NO：2所示序列和E基因SEQ ID NO：3所示序列。
具体地，步骤a中所述的病毒基因片段组合方式为串联，串联顺序为ORF1a基因SEQID NO：1序列、N基因SEQ ID NO：2序列、E基因SEQ ID NO：3序列任意排列组合。
优选地，步骤a中所述的病毒基因片段组合方式为ORF1a基因SEQ ID NO：1序列-E基因SEQ ID NO：3序列-N基因SEQ ID NO：2序列串联。
具体地，步骤e中所述的人源细胞系为HEK293细胞，所述人源细胞系的RNA在混合后的RNA溶液中的终浓度为0.1-100ng/μL。
具体地，步骤f中所述的RNA干粉的病毒基因(E、N、ORF1a)拷贝数均>1000。
另一方面，本发明还提供了所述COVID-19质控品在临床检测新型冠状病毒的应用，所述质控品特异性、重复性较好，可用于对COVID-19检测试剂进行有效的质量评估，有效减少检测假阴性的发生。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供了一种针对常用的qRT-PCR核酸检测方法的COVID-19质控品，所述质控品病毒拷贝数精确定量，病毒基因(E、N、ORF1a)的拷贝数均>1000，其可以对COVID-19检测试剂的检测灵敏性、特异性、可重复性、可复制性、检测限等进行有效评估，可有效减少检测假阴性的发生，且易保存，成本低。
附图说明
图1为数字PCR检测病毒E基因的1D散点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1COVID-19质控品病毒基因序列RNA的制备
按照如下步骤进行COVID-19质控品病毒基因序列RNA的制备：
1.通过化学合成的方式，按照ORF1a基因SEQ ID NO：1序列-E基因SEQ ID NO：3序列-N基因SEQ ID NO：2序列的顺序，合成病毒基因序列，并在基因序列的5’端增加T7启动子的序列。
2.将所得的病毒基因序列克隆至pUC57载体上，挑选阳性克隆进行测序，选择测序正确的菌体进行扩大培养，提取质粒。
3.以质粒为模板，选取载体上的M13-F和M13-R引物进行PCR扩增及纯化得到DNA模板。
4.体外转录：以步骤3中的纯化DNA为模板，以T7启动子进行RNA的转录，具体如下(以mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription Kit，Invitrogen，货号：AM1345和MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit，Invitrogen，货号：AM1908为例)：
a.从冰箱中取出各试剂，解冻，漩涡震荡后简短离心，按下表1配制反应体系；
表1
体外转录 体系
T7 2×NTP/ARCA 10μL
10×T7 reaction buffer 2μL
DNA纯化产物 0.2μg
T7 Enzyme Mix 2μL
Nuclease-free water 补加至20μL
b.震荡混匀，37℃孵育2h后向体系中加入1μL TURBO DNase，震荡混匀后，37℃孵育15min，消化掉DNA模板；
c.将转录后的RNA样品转移至1.5mL离心管，向其中加入350uL Binding SolutionConcentrate，使用移液器轻柔吹打混匀；
d.加入100μL无水乙醇，使用移液器轻柔吹打混匀；
e.组装纯化柱，将RNA溶液转移至纯化柱中，12000g离心30s，弃掉流穿液；
f.向纯化柱中加入500μL Wash Solution，12000g离心30s，弃掉流穿液；
g.重复步骤f一次；
h.将纯化柱在12000g的条件下离心30s，以去掉残留的液体；
i.提前10min将无酶水加热至95℃，将纯化柱取出，放到一个新的收集管中，取50μL预热的无酶水加到纯化柱中，12000g离心1min；
j.再次向纯化柱中加入50μL预热的无酶水，12000g离心1min；
k.使用QubitTM RNA BR Assay Kit(Invitrogen，货号：Q10210)试剂盒测定转录的RNA的浓度，并使用Tape Station 4150的RNA芯片对RNA的完整性和片段大小进行确认。
5.体外转录RNA的拷贝数确定：
将体外转录的病毒RNA进行适当稀释，稀释后的病毒RNA在QX200数字PCR平台(BIORAD One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂)上进行拷贝数确认。用于检测病毒基因的引物与探针序列如下表2所示：
表2
引物探针名称 序列(5’-3’)
E-forward ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
N-forward GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
ORF1a-forward CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
E-reverse ATATTGCAGCAGTACGCACACA
N-reverse CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
ORF1a-reverse ACGATTGTGCATCAGCTGA
E-probe ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG
N-probe TTGCTGCTGCTTGACAGATT
ORF1a-probe CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG
数字PCR检测E基因的1D散点图如图1所示，N基因和ORF1a基因的散点图类似，不再赘述，表明针对每个基因的引物探针能够很好的检测基因的拷贝数。
实施例2COVID-19质控品的制备
1.采用TRIzol@Plus RNA Purification Kit试剂盒(Invitrogen，货号12183555)进行人源RNA的提取操作，步骤如下：
a.收集单层Hek293细胞，将培养基尽量去除干净，直接加入1mL TRIzol试剂混匀(1-10cm2培养皿表面加1mL TRIzol)；
b.室温放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全解离，将裂解液转移至无菌无酶的1.5mL离心管中；
c.每1mL TRIzol裂解液添加0.2mL氯仿，剧烈混匀15s，高速离心15min；
d.离心后，混合物分离为红色下层(酚-氯仿相)、中间相和上层无色水相，转移含有RNA的上层无色水相约500-550μL到新的离心管中，避免吸入中间相物质；
e.加入等体积70％乙醇，涡旋混匀。上下颠倒离心管，使加入乙醇后的可见沉淀消散；
f.RNA结合上柱，洗涤，洗脱；
g.使用QubitTM RNA BR Assay Kit(Invitrogen，货号：Q10210)试剂盒对提取的人源RNA进行浓度测定，测定3个重复，取平均值。
2.人源RNA和病毒RNA混合
根据病毒RNA的拷贝数浓度和人源RNA的浓度，将人源RNA和病毒RNA混合，使病毒RNA拷贝数终浓度>100拷贝/μL，人源RNA终浓度为20ng/μL。
实施例3COVID-19质控品的干粉制备
1.取10μL实施例2中制备的质控品溶液加入到20μL RNA保存剂中，充分混匀。
2.将混匀的RNA溶液开盖置于吉艾姆真空浓缩仪CV200中，设置浓缩时间为1小时，开启浓缩。
3.浓缩程序结束后，RNA溶液应已完全干燥，盖上管盖。
4.将样品管和一袋干燥剂装在铝箔袋中，加热密封以保持干燥。
实验例1COVID-19质控品的病毒基因拷贝数确定
1.取3支实施例3制得的COVID-19质控品的干粉，分别加入20μL无酶水，复溶10分钟。
2.各取6μL复溶后的RNA溶液，使用QubitTM RNA BR Assay Kit试剂盒检测RNA浓度，每支测定3个重复，取平均值计算每管干粉的RNA总量，详见下表3。
表3
3.各取1μL复溶后的RNA溶液，使用BIORAD One-Step RT-ddPCR Advanced Kitfor Probes试剂在QX200数字PCR仪上进行一步法RT-ddPCR，对复溶后的RNA溶液进行精确定量，每支各取3个重复，取平均值，如详见下表4。
表4
检测结果表明，每管样品COVID-19病毒三个基因(E、N、ORF1a)的拷贝数均>1000，准确性及重复性较好，可用于对COVID-19检测试剂进行有效的质量评估，减少检测假阴性的发生。
实验例2质控品适用性检测
选取新型冠状病毒核酸检测试剂盒(圣湘生物)，新型冠状病毒核酸检测试剂盒(华大基因)，新型冠状病毒核酸检测试剂盒(透景生命)，新型冠状病毒核酸检测试剂盒(之江生物)，对质控品进行检测，结果均为阳性，表明该质控品的适用性较好。
实验例3质控品稳定性检测
在室温保存1天、7天、14天、28天后各取一支实施例3制得的COVID-19质控品的干粉，分别加入20μL无酶水，复溶10分钟。使用BIORAD One-Step RT-ddPCR Advanced Kitfor Probes试剂在QX200数字PCR仪上进行一步法RT-ddPCR，对复溶后的RNA溶液进行精确定量，检测病毒基因拷贝数，详见下表5。
表5
病毒基因 室温保存1天 室温保存7天 室温保存14天 室温保存28天
E 1253 1175 1196 1128
N 1363 1253 1239 1218
ORF1a 1299 1340 1332 1267
由表5可知，该质控品在室温长时间保存后，COVID-19病毒三个基因(E、N、ORF1a)的拷贝数仍>1000，具有良好的稳定性，满足长期存放的需要，可保证质控结果的准确性。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 菁良基因科技（深圳）有限公司
<120> 一种COVID-19质控品及其应用
<130> 20200522
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1501
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
aaccaagtca tcgtcaacaa cctagacaaa tcagctggtt ttccatttaa taaatggggt 60
aaggctagac tttattatga ttcaatgagt tatgaggatc aagatgcact tttcgcatat 120
acaaaacgta atgtcatccc tactataact caaatgaatc ttaagtatgc cattagtgca 180
aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc tctatctgta gtactatgac caatagacag 240
tttcatcaaa aattattgaa atcaatagcc gccactagag gagctactgt agtaattgga 300
acaagcaaat tctatggtgg ttggcacaac atgttaaaaa ctgtttatag tgatgtagaa 360
aaccctcacc ttatgggttg ggattatcct aaatgtgata gagccatgcc taacatgctt 420
agaattatgg cctcacttgt tcttgctcgc aaacatacaa cgtgttgtag cttgtcacac 480
cgtttctata gattagctaa tgagtgtgct caagtattga gtgaaatggt catgtgtggc 540
ggttcactat atgttaaacc aggtggaacc tcatcaggag atgccacaac tgcttatgct 600
aatagtgttt ttaacatttg tcaagctgtc acggccaatg ttaatgcact tttatctact 660
gatggtaaca aaattgccga taagtatgtc cgcaatttac aacacagact ttatgagtgt 720
ctctatagaa atagagatgt tgacacagac tttgtgaatg agttttacgc atatttgcgt 780
aaacatttct caatgatgat actctctgac gatgctgttg tgtgtttcaa tagcacttat 840
gcatctcaag gtctagtggc tagcataaag aactttaagt cagttcttta ttatcaaaac 900
aatgttttta tgtctgaagc aaaatgttgg actgagactg accttactaa aggacctcat 960
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ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

Claims (4)

1.一种COVID-19参考品，其特征在于，所述的COVID-19参考品包括人源细胞系RNA与COVID-19病毒基因序列RNA；所述的病毒基因序列的组合方式为ORF1a基因SEQ ID NO：1序列-E基因SEQ ID NO：3序列-N基因SEQ ID NO：2序列串联；所述的COVID-19参考品通过以下方法制备：
a.对COVID-19病毒基因组序列进行分析，得到参考品的病毒基因组成，按照所述组合方式通过化学合成得到参考品病毒基因序列；
b.将步骤a中得到的病毒基因序列克隆至pUC57质粒载体上；
c.以质粒为模板，进行扩增纯化，得到病毒基因序列转录模板；
d.通过体外转录，得到病毒基因序列RNA，确定其拷贝数和浓度；
e.将人源细胞系的RNA与病毒基因序列RNA混合，使病毒基因序列RNA拷贝数终浓度>100拷贝/μL，人源细胞系的RNA终浓度为20ng/μL；
f.将混合后的RNA溶液通过干燥工艺得到可常温保存的RNA干粉。
2.根据权利要求1所述的COVID-19参考品，其特征在于，步骤e中所述的人源细胞系为HEK293。
3.根据权利要求1所述的COVID-19参考品，其特征在于，步骤f中所述RNA干粉的病毒基因E、N、ORF1a的拷贝数均>1000。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的COVID-19参考品，其特征在于，所述的COVID-19参考品应用于COVID-19核酸检测中。
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