CN112662812B

CN112662812B - 新型冠状病毒质控品、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN112662812B
Application number: CN202110031468.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋黎; 杨正林; 李霖; 宋天歌; 刘祥琴; 李科成; 任芝霖
Original assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: CN112662812A

Abstract

本发明涉及一种质控品，包括：第一假病毒，其含有如SEQ ID NO:1所示的核酸片段；第二假病毒，其含有如SEQ ID NO:2所示的核酸片段；和第三假病毒，其含有如SEQ ID NO:3所示的核酸片段。该质控品用于评价多种SARS‑CoV‑2核酸检测试剂盒。本发明还涉及核酸组合物、核酸构建体的组合物、制备质控品的方法、试剂盒及用途。

Description

新型冠状病毒质控品、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒的核酸检测领域，具体涉及核酸检测的质控品。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属冠状病毒，有包膜，由RNA核酸和蛋白质组成，RNA链约含29000个碱基，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。SARS-CoV-2与急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)属同一家族，目前与其最接近的是蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)，有85％以上的同源性。SARS-CoV-2 基因组含有12个蛋白编码区或开放读码框(ORF)；其中ORF1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因(RdRp)所在区域，编码RNA聚合酶、负责病毒核酸复制；S区所编码的棘突蛋白与病毒感染能力相关，可与细胞表面血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme2， ACE2)受体结合从而进入宿主细胞；E区编码囊膜蛋白，负责病毒包膜及病毒颗粒的形成； M区编码膜蛋白；N区编码核衣壳蛋白。有研究发现SARS-CoV-2和SARS病毒入侵细胞方式相同，但其与ACE2的亲和力是SARS病毒的10～20倍，这很可能是新型冠状病毒高度传染性的原因。

SARS-CoV-2所引起的肺炎称为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。新冠肺炎主要传染源是病毒感染的患者和无症状携带者，主要通过飞沫和直接接触方式传播，其次也可能通过气溶胶传播，其感染人体后的潜伏期中位数为3d，最长可达24d，该病毒传染性强，潜伏期也具有传染性，人群普遍易感。感染患者以发热、干咳、乏力为主要表现，少数伴有鼻塞、咽痛和腹泻等症状。重型、危重型患者可能出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征，甚至多器官功能衰竭等，老年人及有慢性基础疾病者预后较差。

由于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)传染性强，潜伏期长，波及范围广，并且临床症状不典型，临床诊断和疫情防控困难巨大。快速准确的检测SARS-CoV-2对疾病的确诊和排查以及疫情的防控至关重要。目前实验室主要诊断方法分为病毒核酸检测、病毒基因测序以及血清学抗原抗体反应，其中SARS-CoV-2核酸检测为病毒检测的“金标准”。截至2020年3月27日，在国家药监局应急批准的23个新型冠状病毒检测产品中，新冠病毒核酸检测试剂占15个。SARS-CoV-2核酸检测包括逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)、等温核酸扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)技术、环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列/及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associatedprotein，CRISPR/Cas)基因核酸检测技术、基因芯片技术、基因测序等。其中，实时荧光RT-PCR为官方推荐的检测方法。

实时荧光RT-PCR检测核酸的方法具有灵敏度高、特异性强、检测周期短、可批量化和成本低的优点。RT-PCR基本原理即根据欲检测的病毒特定保守核酸序列设计对应的高特异性引物以扩增该特定保守核酸序列，同时设计可以结合该扩增区段内部区域的Taq-man探针，探针会在扩增的过程中与扩增片段特异性结合并产生荧光信号，检测荧光达到阈值时的 Ct值，从而判断样本中是否含有SARS-CoV-2。

由于SARS-CoV-2存在一定的变异率，为了防止病毒变异从而导致检测阳性率下降，假阴性率升高，中国疾病预防控制中心(CDC)与世界卫生组织(WHO)均推荐检测靶序列在高度保守的ORF1ab基因、N基因、E基因中选取。尽管CDC与WHO有这样的推荐，由于目前尚无法规对检测扩增片段做统一要求，不同生产厂商的试剂盒所的检测扩增片段遍布于上述基因的不同位置。同时，每种核酸检测试剂盒中所配备的质控品也都只含有对应扩增片段的假病毒；换句话说，每种试剂盒中的质控品仅能实现对所属试剂盒的质量控制。也就是说，目前仍缺乏可用于不同试剂、不同扩增片段的通用质控品，这为不同SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的比对、性能验证及实验室间质量评价等诸多工作带来了巨大难度。

因此，在SARS-CoV-2核酸检测领域，存在着在经批准的不同试剂盒中通用的质控品的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明人对SARS-CoV-2核酸检测的靶区域与假病毒构建技术进行了研究，通过大量优化从ORF1ab基因(以Genbank登录号：NC_045512.2为例，下同；位置：266..21555)、N基因(Genbank登录号：NC_045512.2，位置：28274..29533)和E基因(Genbank登录号：NC_045512.2，位置：26245..26472)，即从总长度为22778(21290+1260+228)nt 的共3个基因中选择了一些核酸片段，并将这些分组组合以形成用于构建假病毒的多核苷酸组合物，随后包装成假病毒颗粒，从而完成了本发明。

在第一方面，本发明提供了一种质控品，包括：

第一假病毒，其含有如SEQ ID NO:1所示的核酸片段；

第二假病毒，其含有如SEQ ID NO:2所示的核酸片段；和

第三假病毒，其含有如SEQ ID NO:3所示的核酸片段。

通过提供上述三个假病毒的混合物，本发明能够对众多经批准的SARS-CoV-2核酸检测试剂的灵敏性、特异性、可重复性、可复制性、检测限等进行有效评估，同时能够用于使用这些试剂盒的实验室间质量评价和实验室内质量控制，有效减少临床检测假阴性的发生。对于临床快速准确的检测新型冠状病毒具有重要意义。

需要说明的是，虽然下文具体实施方式部分中所证实了本发明的组合物用作十二种经批准的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的质控品的效果，但本发明的组合物的实际应用范围并不限于这十二种试剂盒，在使用其他试剂盒(包括那些申请日时尚未研发或批准的试剂盒)时，本领域技术例如能够按照具体实施方式中的所记载的方法来验证本发明的组合物的应用范围是否能到其他SARS-CoV-2核酸检测试剂盒。

本发明的另一方面优势在于：使靶序列覆盖范围与假病毒构建技术达到最佳平衡，在实现质控品效果的同时最大化了应用范围。值得说明的是，由于受限于假病毒构建过程自身的技术瓶颈，所引入的靶序列的长度不能过长，通常在1000nt左右。而CDC与WHO所推荐检测的靶序列(ORF1ab基因、N基因、E基因)覆盖了长度为22778nt的极大范围。这就需要在尽可能引入的较短序列片段的基础上适用尽可能多的试剂盒，同时还要将假病毒种类限制在合理范围之内。

非特殊说明，本发明中的用语“第一”、“第二”和“第三”等仅用于区分多个相似的要素，而不意在表示要素之间重要性或次序等方面的任何差异。

具体地，本发明的假病毒可以溶液的形式存在，所述溶液例如为假病毒制备后，其所处于的溶液。

在优选的实施方式中，第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒的体积比为：2.98.-3.64: 1.56-1.90:4.46-5.46。

按照上述体积比配制假病毒的混合物在用作SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的质控品的情况下能够进一步提高评价效果的准确性。

在第二方面，本发明提供了一种核酸组合物，包括：

如SEQ ID NO:1所示的序列、如SEQ ID NO:2所示的序列，和如SEQ ID NO:3所示的序列。

在本发明第二方面的一个变型中，提供了一种核酸组合物，包括：如SEQ ID NO:4所示的序列、如SEQ ID NO:5所示的序列，和如SEQ ID NO:6所示的序列。

在本发明第二方面的另一个变型中，提供了一种核酸组合物，包括：与SEQ ID NO:4 所示序列互补的序列、与SEQ ID NO:5所示序列互补的序列，和与SEQ ID NO:6所示序列互补的序列。

在本发明的第三方面，提供了核酸构建体的组合物，包括：

第一构建体，其含有如SEQ ID NO:4所示的序列；

第二构建体，其含有如SEQ ID NO:5所示的序列；和

第三构建体，其含有如SEQ ID NO:6所示的序列。

在本发明的第三方面的一个变型中，提供了核酸构建体的组合物，包括：

第一构建体，其含有与SEQ ID NO:4所示序列互补的序列；

第二构建体，其含有与SEQ ID NO:5所示序列互补的序列；和

第三构建体，其含有与SEQ ID NO:6所示序列互补的序列。

在示例性的实施方式中，所述构建体为PETduet-1载体。

在第四方面，本发明提供了一种制备SARS-CoV-2检测试剂盒的质控品的方法，包括：

获取如SEQ ID NO:4所示的序列；

使用所获取的序列构建重组表达载体，随后鉴定阳性的重组质粒；

使用所鉴定重组质粒构建表达菌株；

使用所述表达菌株的菌液进行假病毒的包装；

得到含有如SEQ ID NO:1所示的核酸片段的第一假病毒；

用如SEQ ID NO:5所示的序列和如SEQ ID NO:6所示的序列，分别重复上述步骤，依次得到含有如SEQ ID NO:2所示的核酸片段的第二假病毒和含有如SEQ ID NO:3所示的核酸片段的第三假病毒；以及

将所述第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒混合，得到所述质控品。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括对假病毒进行纯化的步骤。

在优选的实施方式中，第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒以2.98.-3.64:1.56-1.90: 4.46-5.46的体积比进行混合。

在第五方面，本发明提供了一种SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括质控品，并且其中，所述质控品包括：

第一假病毒，其含有如SEQ ID NO:1所示的核酸片段；

第二假病毒，其含有如SEQ ID NO:2所示的核酸片段；和

第三假病毒，其含有如SEQ ID NO:3所示的核酸片段。

在第六方面，本发明提供了核酸组合物在制备用于SARS-CoV-2核酸检测的质控品中用途，其中，所述核酸组合物包括如SEQ ID NO:1所示的序列、如SEQ ID NO:2所示的序列，和如SEQ ID NO:3所示的序列。

在本发明第六方面的一个变型中，提供了核酸组合物在制备用于SARS-CoV-2核酸检测的质控品中用途，其中，所述核酸组合物包括如SEQ ID NO:4所示的序列、如SEQ IDNO: 5所示的序列，和如SEQ ID NO:6所示的序列。

在本发明第六方面的另一个变型中，提供了核酸组合物在制备用于SARS-CoV-2核酸检测的质控品中用途，其中，所述核酸组合物包括与SEQ ID NO:4所示序列互补的序列、与 SEQ ID NO:5所示序列互补的序列，和与SEQ ID NO:6所示序列互补的序列。

在第七方面，本发明提供了质控品在用于评价SARS-CoV-2核酸检测试剂盒中的用途，其中，所述质控品包括：

第一假病毒，其含有如SEQ ID NO:1所示的核酸片段；

第二假病毒，其含有如SEQ ID NO:2所示的核酸片段；和

第三假病毒，其含有如SEQ ID NO:3所示的核酸片段。

附图说明

图1为扩增后目的基因的电泳检测结果；

图2为提取质粒进行PCR后的电泳检测结果；

图3示出了含SEQ ID NO:4所示片段的假病毒的纯度检测结果；

图4示出了含SEQ ID NO:5所示片段的假病毒的纯度检测结果；

图5示出了含SEQ ID NO:6所示片段的假病毒的纯度检测结果；

图6示出了以优化后的假病毒浓度进行检测的结果；

图7示出了使用上海之江生物科技股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图8示出了使用上海捷诺生物科技有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图9示出了使用华大生物科技(武汉)有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图10示出了使用中山大学达安基因股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图11示出了使用圣湘生物科技股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图12示出了使用上海伯杰医疗科技有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图13示出了使用北京卓诚惠生生物科技股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图14示出了使用迈克生物科技股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图15示出了使用武汉明德生物科技股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图16示出了使用上海复星长征医学科学有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图17示出了使用江苏硕世生物科技股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线；

图18示出了使用杭州优思达生物技术有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒对本发明的质控品进行检测时的扩增曲线。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1新型冠状病毒检测试剂盒的通用质控品的制备

1、引物设计

根据天根EasyGeno引物设计工具进行引物设计，具体如下表1所示：

表1

2、目的基因获取

利用引物1cov-allF1/1cov-allR1、2cov-allF1/2cov-allR1、ncov-N F1/ncov-NR1以pUC57 -MS2质粒为模板进行扩增获取MS2基因片段，利用引物1cov-allF2/1cov-allR2、2cov-allF2 /2cov-allR2、ncov-N F2/ncov-N R2分别以先前构建的pUC57-ORF+E基因质粒和pUC57-N 基因质粒为模板进行扩增获取相应的nCoV-2019片段，琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒对目的条带进行回收。

PCR反应体系如下表2所示。

表2

试剂	用量(μL/反应)
		PrimerSTAR Max Premix(2×)	20
上游引物	1
		下游引物	1
模板	1
		H₂O	17

PCR反应程序如下表3所示。

表3

3、表达载体线性化

利用限制性内切酶BamH I和HindIII对PETduet-1载体1载体进行双酶切处理，对线性化的载体进行胶回收处理。

反应体系如下表4所示。

表4

组分	用量(1反应)
		BamH I	1
HindIII	1
		Buffer	5
载体	10(总量1ug)
		灭菌超纯水	33

将反应管盖好，瞬时离心后置于PCR仪37℃反应1h。

4、重组表达载体构建

利用天根EASygeno无缝重组克隆试剂盒对上述MS2、插入片段和线性化PETduet-1载体进行重组连接，得到重组表达载体，并转化至DH5α感受态细胞。

EASygeno反应体系及条件如下表5所示。

表5

组份	用量(μL)
		PETduet-1载体	3
MS2	1
		nCoV-2019	1
2*EasyGeno Assembly Mix	5

注：C1000 Touch中50℃反应30min

将上述反应体系转化至DH5α感受态细胞：感受态细胞置于冰上溶解，取10μL反应产物混入感受态细胞，42℃热激90s，将热激后产物涂布至氨苄培养基平板，37℃培养过夜。

挑取阳性单菌落至含有氨苄的1ml LB培养基中，37℃180rpm培养4h，取1μL菌液进行PCR扩增，电泳检测，对上述阳性单克隆进行扩大培养并提取质粒。

5、表达菌株构建

1)利用上述鉴定为阳性的重组质粒转化至BL21(DE3)plys S感受态细胞：感受态细胞置于冰上溶解，取10μL反应产物混入感受态细胞，42℃热激90s，将热激后产物涂布至氨苄培养基平板，37℃培养过夜。挑取阳性单菌落至含有氨苄的1ml LB培养基中，37℃180rpm 培养4h，取1μL菌液进行PCR扩增，电泳检测。

2)提取质粒，将质粒送至生工进行测序，将测序结果与合成序列进行比对，观察其是否与标准序列一致。

6、病毒颗粒包装、纯化

1)扩大培养：将上述鉴定为阳性的菌液，吸取1mL菌液接种于装有100mL LB培养基(含有氨苄青霉素(50mg/mL)和氯霉素(34mg/mL)的锥形瓶中，接种后锥形瓶置37℃度恒温摇床，转速180rpm，培养2-4h。

2)菌液OD600检测：在培养的2-4h内，期间用紫外分光光度计检测菌液OD600至0.8-1.0 之间。培养2h后检测第一次OD600，根据检测结果预估第二次检测时间。当菌液OD600在 0.8-1.0之间时，吸取2mL菌液于EP管中，做好标记，置2～8℃冰箱备用。

诱导表达：向锥形瓶内剩余菌液内加入0.476mL IPTG(50mg/mL)，置37℃度恒温摇床，转速180rpm，培养16-18h过夜培养。

3)向两管中分别加入20mM PBS缓冲液20mL，将菌体沉淀涡旋混匀，4℃6000rpm离心10min，弃去上清。

4)向两管中分别加入20mM PBS缓冲液10mL，将菌体沉淀涡旋混匀后两管合为一管。

将盛有菌液的离心管置于冰上，利用超声波破碎机获取假病毒颗粒。超声条件：300W超声2s，间歇9.9s，总时长20min。超声结束，将溶液4℃6000rpm离心10min，收集上清，4～8℃保存备用。

5)向上述收集的上清中加入终浓度为1M的氯化钠，待其完全溶解后加入等体积的三氯甲烷上下颠倒混匀；4℃6000rpm离心30min，轻轻吸取上清液体(注意不要吸到白色物质及下层液体)。

6)加入终浓度为10％的PEG8000，充分摇匀使其溶解，冰浴1-2h，期间轻微摇晃几次(隔20min轻微晃动一次，不要剧烈晃动，离心管壁上黏附有部分白色沉淀)；4℃6000rpm离心10min，弃去上清并观察到离心管底部白色沉淀。

7)加入20mM PBS缓冲液8～10mL，充分震荡混匀，重悬管底沉淀。加入200μL DNaseI，1mL MgCl₂溶液，涡旋混匀后置37℃恒温摇床震荡过夜消化16-18h(注意：管口加封口膜，外套自封袋)。

8)次日加入等体积的三氯甲烷上下颠倒混匀；4℃6000rpm离心30min，轻轻吸取上清液体(千万不要吸到白色物质及下层液体)。

加入200μL DNase I，1mL MgCl₂溶液，涡旋混匀后置37℃恒温摇床震荡过夜消化16-18h。意：管口加封口膜，外套自封袋)。

次日加入等体积的三氯甲烷上下颠倒混匀；4℃6000rpm离心30min，轻轻吸取上清液体，即为假病毒颗粒原液，可作为新型冠状病毒检测试剂盒的通用质控品。-10～-25℃条件保存备用。

实验例2质控品制备结果验证

1、利用不同引物对扩增相应目的基因，其中MS2片段在1700bp附近、ORF片段在1100bp 附近、ORF+E片段在1100bp附近、N片段在1200bp附近有单一条带，符合预期大小，结果如图1所示。

2、利用重组克隆技术将MS2和相应目的片段连接并克隆至PETduet-1表达载体，转化至DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒后进行PCR，结果如图2所示。同时，对提取质粒进行测序鉴定，测序结果表明所提取的质粒的序列分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和SEQID NO:3所示序列一致。

实施例3假病毒颗粒的纯度检测

利用核酸RNA提取试剂盒对假病毒颗粒进行核酸提取，以新型冠状病毒2019-nCoVRNA体系和DNA体系(即不含逆转录酶)对同一管核酸进行检测，观察假病毒颗粒浓度和 DNA残留量。结果如图3-5所示。

图3示出了含SEQ ID NO:4所示片段的假病毒颗粒的纯度检测结果，其中Ct_DNA＝18.47， Ct_RNA＝7.88，△Ct＝10.59，残留量为RNA的1/1541；图4示出了含SEQ ID NO:5所示片段的假病毒颗粒的纯度检测结果，其中，Ct_DNA＝17.17，Ct_RNA＝8.19，△Ct＝8.98，残留量为RNA 的1/292；图5示出了含SEQ ID NO:6所示片段的假病毒颗粒的纯度检测结果，其中，Ct_DNA＝18.63，Ct_RNA＝8.30，△Ct＝10.33，残留量为RNA的1/1287。

实施例4假病毒的浓度优化

将含SEQ ID NO:4的假病毒颗粒、含SEQ ID NO:5的假病毒颗粒和含SEQ ID NO:6的假病毒按3.31:1.73:4.96的比例混合，配制成质控品，使用实施例1中的相应引物进行RT-PCR检测，结果如图6所示。

如图6所示，含不同片段的假病毒同时间达到阈值时的Ct值，且曲线基本重合。

实施例5假病毒混合物用作部分经批准的SARS-CoV-2检测试剂盒的质控品

使用实施例4中经混合的假病毒作为质控品，分别用下表6中的试剂盒检测其扩增曲线。

表6

使用上表6中所示仪器，按照试剂盒生产商的说明，检测本发明的质控品的扩增曲线，结果依次如图7-图18所示。

由图7-图18可知，本发明所制备的含三种不同假病毒的混合物至少可用作上述十二种SARS-CoV-2检测试剂盒的质控品。

序列表

<110> 四川省人民医院

<120> 新型冠状病毒质控品、其制备方法及用途

<130> 2013295

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1164

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gucagcuuau gugucaaccu auacuguuac uagaucaggc auuagugucu gauguuggug 60

auagugcgga aguugcaguu aaaauguuug augcuuacgu uaaugcaaca ucagcuugug 120

uuuuggcugc ugaauguaca auuuuuaaag augcuucugg uaagccagua ccauauuguu 180

augauaccaa uguacuagaa gguucuguug cuuaugaaag uuuacgcccu gacacacguu 240

augugcucau ggauggcucu auuauucaau uuccuaacac cuaccuugaa gguucuguua 300

gagugguaac aacuuuugau ucugaguacu guaggcacgg cacuugugaa agaucagaag 360

cugguguuug uguaucuacu agugguagau ggguacuuaa caaugauuau uacagaucuu 420

uaccaagacu auaacacaua uaaaaauacg ugugauggua caacauuuac uuaugcauca 480

gcauuguggg aaauccaaca gguuguagau gcagauagua aaauuguuca acuuagugaa 540

auuaguaugg acaauucacc uaauuuagca uggccucuua uuguaacagc uuuaagggcc 600

aauucugcug ucaaauuaca gaauaaugag cuuaguccug uugcacuacg acagaugucu 660

ugugcugccg guacuacaca aacugcuugc acugaugaca augcguuagc uuacuacaac 720

acaacaaagg gagguagguu uguacuccua caacuugugc uaaugacccu guggguuuua 780

cacuuaaaaa cacagucugu accgucugcg guauguggaa agguuauggc uguaguugug 840

aucaacuccg cgaacccaug cuucagucag cugaugcaca aucguuuuua aacggguuug 900

cgguguaagu gcagcccguc uuacaccgug cggugaaaug gucaugugug gcgguucacu 960

auauguuaaa ccagguggaa ccucaucagg agaugccaca acugcuuaug cuaauagugu 1020

uuuuaacauu ugucaagcug ucacggccaa uguuaagugc ugguucugau aaaggaguug 1080

caccagguac agcuguuuua agacaguggu ugccuacggg uacgcugcuu gucgauucag 1140

aucuuaauga cuuugucucu gaug 1164

<210> 2

<211> 1040

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacauuucuc aaugaugaua cucucugacg augcuguugu guguuucaau agcacuuaug 60

caucucaagg ucuaguggcu agcauaaaga acuuuaaguc aguucuuuau uaucaaaaca 120

auguuuuuau ucuucaaccu gaagaagagc aagaagaaga uugguuagau gaugauaguc 180

aacaaacugu uggucaacaa gacggcagug aggacaauca gacaacuacu auucaaacaa 240

uuguugaggu ucaauuaugu acucauucgu uucggaagag acagguacgu uaauaguuaa 300

uagcguacuu cuuuuucuug cuuucguggu auucuugcua guuacacuag ccauccuuac 360

ugcgcuucga uugugugcgu acugcugcaa uauuguuaac gugagucuug uaaaaccuuc 420

uuuuuacguu uacucucgug uuaaaaaucu gaauucuucu agaguuccug aucuucuggu 480

cuaaacgaac uaaauauuau auuaguuuug auuggcuuga agagaaguuu aaggaaggug 540

uagaguuucu uagagacggu ugggaaauug uuaaauuuau cucaaccugu gcuugugaaa 600

uugucggugg acaaauuguc accugugcaa aggaaauuaa ggagaguguu cagacauucu 660

uuaagcuugu aaauaaauuu uuggcuuugu gugcugacuc uaucauuauu gguggagcua 720

aacuuaaagc cuugaauuua ggugaaacau uugucacgca cucaaaggga uuguacagaa 780

aguguguuaa auccagagaa gaaacuggcc uacucaugcc ucuaaaagcc ccaaaagaaa 840

uuaucuucuu agagggagaa acacuuccca cagaaguguu aacagaggaa guugucuuga 900

aaacugguga uuuacaacca uuagaacaac cuacuaguga agcuguugaa gcuccauugg 960

uugguacacc aguuuguauu aacgggcuua uguugcucga aaucaaagac acagaaaagu 1020

acugugcccu ugcaccuaau 1040

<210> 3

<211> 1260

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

augucugaua auggacccca aaaucagcga aaugcacccc gcauuacguu ugguggaccc 60

ucagauucaa cuggcaguaa ccagaaugga gaacgcagug gggcgcgauc aaaacaacgu 120

cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180

aaggaagacc uuaaauuccc ucgaggacaa ggcguuccaa uuaacaccaa uagcagucca 240

gaugaccaaa uuggcuacua ccgaagagcu accagacgaa uucguggugg ugacgguaaa 300

augaaagauc ucaguccaag augguauuuc uacuaccuag gaacugggcc agaagcugga 360

cuucccuaug gugcuaacaa agacggcauc auauggguug caacugaggg agccuugaau 420

acaccaaaag aucacauugg cacccgcaau ccugcuaaca augcugcaau cgugcuacaa 480

cuuccucaag gaacaacauu gccaaaaggc uucuacgcag aagggagcag aggcggcagu 540

caagccucuu cucguuccuc aucacguagu cgcaacaguu caagaaauuc aacuccaggc 600

agcaguaggg gaacuucucc ugcuagaaug gcuggcaaug gcggugaugc ugcucuugcu 660

uugcugcugc uugacagauu gaaccagcuu gagagcaaaa ugucugguaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaacugucac uaagaaaucu gcugcugagg cuucuaagaa gccucggcaa 780

aaacguacug ccacuaaagc auacaaugua acacaagcuu ucggcagacg ugguccagaa 840

caaacccaag gaaauuuugg ggaccaggaa cuaaucagac aaggaacuga uuacaaacau 900

uggccgcaaa uugcacaauu ugcccccagc gcuucagcgu ucuucggaau gucgcgcauu 960

ggcauggaag ucacaccuuc gggaacgugg uugaccuaca caggugccau caaauuggau 1020

gacaaagauc caaauuucaa agaucaaguc auuuugcuga auaagcauau ugacgcauac 1080

aaaacauucc caccaacaga gccuaaaaag gacaaaaaga agaaggcuga ugaaacucaa 1140

gccuuaccgc agagacagaa gaaacagcaa acugugacuc uucuuccugc ugcagauuug 1200

gaugauuucu ccaaacaauu gcaacaaucc augagcagug cugacucaac ucaggccuaa 1260

<210> 4

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcagcttat gtgtcaacct atactgttac tagatcaggc attagtgtct gatgttggtg 60

atagtgcgga agttgcagtt aaaatgtttg atgcttacgt taatgcaaca tcagcttgtg 120

ttttggctgc tgaatgtaca atttttaaag atgcttctgg taagccagta ccatattgtt 180

atgataccaa tgtactagaa ggttctgttg cttatgaaag tttacgccct gacacacgtt 240

atgtgctcat ggatggctct attattcaat ttcctaacac ctaccttgaa ggttctgtta 300

gagtggtaac aacttttgat tctgagtact gtaggcacgg cacttgtgaa agatcagaag 360

ctggtgtttg tgtatctact agtggtagat gggtacttaa caatgattat tacagatctt 420

taccaagact ataacacata taaaaatacg tgtgatggta caacatttac ttatgcatca 480

gcattgtggg aaatccaaca ggttgtagat gcagatagta aaattgttca acttagtgaa 540

attagtatgg acaattcacc taatttagca tggcctctta ttgtaacagc tttaagggcc 600

aattctgctg tcaaattaca gaataatgag cttagtcctg ttgcactacg acagatgtct 660

tgtgctgccg gtactacaca aactgcttgc actgatgaca atgcgttagc ttactacaac 720

acaacaaagg gaggtaggtt tgtactccta caacttgtgc taatgaccct gtgggtttta 780

cacttaaaaa cacagtctgt accgtctgcg gtatgtggaa aggttatggc tgtagttgtg 840

atcaactccg cgaacccatg cttcagtcag ctgatgcaca atcgttttta aacgggtttg 900

cggtgtaagt gcagcccgtc ttacaccgtg cggtgaaatg gtcatgtgtg gcggttcact 960

atatgttaaa ccaggtggaa cctcatcagg agatgccaca actgcttatg ctaatagtgt 1020

ttttaacatt tgtcaagctg tcacggccaa tgttaagtgc tggttctgat aaaggagttg 1080

caccaggtac agctgtttta agacagtggt tgcctacggg tacgctgctt gtcgattcag 1140

atcttaatga ctttgtctct gatg 1164

<210> 5

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacatttctc aatgatgata ctctctgacg atgctgttgt gtgtttcaat agcacttatg 60

catctcaagg tctagtggct agcataaaga actttaagtc agttctttat tatcaaaaca 120

atgtttttat tcttcaacct gaagaagagc aagaagaaga ttggttagat gatgatagtc 180

aacaaactgt tggtcaacaa gacggcagtg aggacaatca gacaactact attcaaacaa 240

ttgttgaggt tcaattatgt actcattcgt ttcggaagag acaggtacgt taatagttaa 300

tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gttacactag ccatccttac 360

tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtcttg taaaaccttc 420

tttttacgtt tactctcgtg ttaaaaatct gaattcttct agagttcctg atcttctggt 480

ctaaacgaac taaatattat attagttttg attggcttga agagaagttt aaggaaggtg 540

tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat ctcaacctgt gcttgtgaaa 600

ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa ggagagtgtt cagacattct 660

ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc tatcattatt ggtggagcta 720

aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca ctcaaaggga ttgtacagaa 780

agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc tctaaaagcc ccaaaagaaa 840

ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt aacagaggaa gttgtcttga 900

aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga agctgttgaa gctccattgg 960

ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga aatcaaagac acagaaaagt 1020

actgtgccct tgcacctaat 1040

<210> 6

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcaccaca gccaggatcc cattcctagg aggtttgacc tg 42

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacacataag ctgacgaact tctttgttgt cttcgac 37

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acaacaaaga agttcgtcag cttatgtgtc aacctat 37

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cattatgcgg ccgcaagctt catcagagac aaagtcatta ag 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catcaccaca gccaggatcc cattcctagg aggtttgacc tg 42

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcattgagaa atgttgaact tctttgttgt cttcgac 37

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acaacaaaga agttcaacat ttctcaatga tgatact 37

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cattatgcgg ccgcaagctt attaggtgca agggcacagt ac 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccatggctga tatcggatcc cattcctcgg aggtttgccc tg 42

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tccattatca gacatgaact tctttgttgt cttcgac 37

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acaacaaaga agttcatgtc tgataatgga ccccaaa 37

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tcgagtgcgg ccgcaagctt ttaggcctga gttgagtcag ca 42

Claims

1.一种质控品，包括：

第一假病毒，其含有如SEQ ID NO: 1所示的核酸片段；

第二假病毒，其含有如SEQ ID NO: 2所示的核酸片段；和

第三假病毒，其含有如SEQ ID NO: 3所示的核酸片段。

2.权利要求1所述的质控品，其中，所述第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒的体积比为：2.98.-3.64 : 1.56-1.90 : 4.46-5.46。

3.一种制备SARS-CoV-2检测试剂盒的质控品的方法，包括：

获取如SEQ ID NO: 4所示的序列；

使用所鉴定重组质粒构建表达菌株；

使用所述表达菌株的菌液进行假病毒的包装；

得到含有如SEQ ID NO: 1所示的核酸片段的第一假病毒；

用如SEQ ID NO: 5所示的序列和如SEQ ID NO: 6所示的序列，分别重复上述步骤，依次得到含有如SEQ ID NO: 2所示的核酸片段的第二假病毒和含有如SEQ ID NO: 3所示的核酸片段的第三假病毒；以及

4.权利要求3所述的方法，其中，所述第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒以2.98.-3.64 : 1.56-1.90 : 4.46-5.46的体积比进行混合。

5.一种SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括质控品，并且其中，所述质控品包括：

第一假病毒，其含有如SEQ ID NO: 1所示的核酸片段；

第二假病毒，其含有如SEQ ID NO: 2所示的核酸片段；和

第三假病毒，其含有如SEQ ID NO: 3所示的核酸片段。

6.权利要求5所述的试剂盒，其中，所述第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒的体积比为：2.98.-3.64 : 1.56-1.90 : 4.46-5.46。

7.质控品在制备用于评价SARS-CoV-2核酸检测试剂盒中的用途，其中，所述质控品包括：

第一假病毒，其含有如SEQ ID NO: 1所示的核酸片段；

第二假病毒，其含有如SEQ ID NO: 2所示的核酸片段；和

第三假病毒，其含有如SEQ ID NO: 3所示的核酸片段。

8.根据权利要求7所述用途，其中，所述第一假病毒、第二假病毒和第三假病毒的体积比为：2.98.-3.64 : 1.56-1.90 : 4.46-5.46。