CN113564130B

CN113564130B - 柯萨奇病毒a10型毒株及其应用

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Publication number: CN113564130B
Application number: CN202111108939.6A
Authority: CN
Inventors: 张改梅; 李国顺; 朱凤才; 樊欢; 嵇红; 赵丽丽; 谢学超; 马廷涛; 陈磊; 肖海峰; 顾美荣; 刘建凯
Original assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113564130A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了柯萨奇病毒A10型毒株及其应用。本发明的柯萨奇病毒A10型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该毒株交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强，为建立稳定的感染动物模型提供了攻击毒株，并可作为柯萨奇病毒A10型免疫血清的中和抗体效价测定的检测毒株，为柯萨奇病毒A10型相关单/多价疫苗研发提供了技术支持。

Description

柯萨奇病毒A10型毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A10型毒株及其应用。

背景技术

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），多发生于5岁以下儿童，表现口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前缺乏有效治疗药物对症治疗。

近年来，随着EV-A71疫苗的推广，CV-A6和CV-A10导致的发病率逐年上升，近几年的流行病学调查中，柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10, CV-A10)在零星病例或手足口病暴发中的检出率逐渐升高。近几年的流行病学调查表明CV-A10已成为近年来手足口病流行的主要病原之一，这对手足口病的预防和控制提出了挑战。

已上市的EV-A71疫苗对CV-A10无交叉保护作用。中和抗体检测是开展CV-A10流行病学调查和疫苗免疫原性评价的关键指标之一。中和抗体效价检测的准确性与使用的检测毒株密切相关。在2008-2012年主要是亚基因型C1局限于少数地区流行，但2010年以后C2逐渐取代C1成为主要的亚基因型（Ji T, Guo Y, Huang W, Shi Y, Xu Y, Tong W, Yao W,Tan Z, Zeng H, Ma J, Zhao H, Han T, Zhang Y, Yan D, Yang Q, Zhu S, Zhang Y,Xu W. The emerging sub-genotype C2 of CoxsackievirusA10 Associated with Hand,Foot and Mouth Disease extensively circulating in mainland of China. Sci Rep.2018 Sep 6;8(1):13357.）。建立符合目前疾病流行特征的基因型标准检测毒株，固定检测用毒株代次，提高疫苗中和抗体检测的准确性、重复性，对保障疫苗临床前和临床试验的免疫原性评价具有重要意义。目前，国内外尚未有柯萨奇病毒A10型标准检测毒株，亟需企业自行筛选并建立标准检测毒株。

此外，Li Shuxuan等发表了关于CV-A10疫苗和抗体评价的乳鼠模型（Li Shuxuan,Zhao Huan, Yang Lisheng, et al. A neonatal mouse model of coxsackievirus A10infection for anti-viral evaluation[J]. Antiviral Research. 2017,144:247-255.）。CV-A10感染1日龄的BalB/c（近交系）、C57BL/6（近交系）、KM（远交系）、ICR（远交系）四种不同品系乳鼠，通过腹腔注射，每只100μl，每只乳鼠约注射10⁵TCID₅₀，观察20天。7天内100%死亡。近交系BalB/c遗传背景清晰，且遗传更稳定，故而以1日龄BalB/c乳鼠作为动物模型，腹腔注射100μl，观察20天，LD₅₀为5.78TCID₅₀/只。由于小鼠对临床分离获得的毒株易感性普遍较差，只有个别临床分离病毒能够使小鼠感染，多数均为鼠适应突变病毒株。因此在目前国内外尚未有柯萨奇病毒A10型相关检测标准毒株和用于疫苗保护性评价用攻击毒株的情况下，更加有必要提供一种新的柯萨奇病毒A10型毒株，以满足现有技术发展的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一株交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强的柯萨奇病毒A10型毒株及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种柯萨奇病毒A10型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在所述柯萨奇病毒A10型毒株基因组中，以上所述的P1结构蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

具体地，本发明提供的柯萨奇病毒A10型毒株含有P1结构蛋白以及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；其中，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-10所示。

本发明提供的柯萨奇病毒A10型毒株的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO.4-10所示的非结构蛋白。

优选地，所述柯萨奇病毒A10型毒株的基因组中，P1结构蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ IDNO.11-17所示。

以上所述的结构蛋白和非结构蛋白的编码基因在所述柯萨奇病毒A10型毒株的基因组上的排列顺序为VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。VP1、VP2、VP3和VP4组成结构蛋白P1。

本发明提供由如SEQ ID NO.2所示的基因以及如SEQ ID NO.11-17所示的基因顺次连接组成的重组核酸分子。

进一步优选地，所述柯萨奇病毒A10型毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示。所述SEQ ID NO.3中的1-746bp为5’UTR的核酸序列，747-953bp为VP4的核酸序列，954-1718bp为VP2的核酸序列，1719-2438bp为VP3的核酸序列，2439-3332bp为VP1的核酸序列，3333-3782bp为2A的核酸序列，3783-4079bp为2B的核酸序列，4080-5066bp为2C的核酸序列，5067-5324bp为3A的核酸序列，5325-5390bp为3B的核酸序列，5391-5939bp为3C的核酸序列，5940-7325bp为3D的核酸序列，7326-7328bp为终止密码子，7329-7407bp为3’UTR的核酸序列。

具体地，本发明提供柯萨奇病毒A10型毒株R06030451，该毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCC No.19533。

柯萨奇病毒A10型毒株R06030451的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO.4-10所示的非结构蛋白，其基因组序列如SEQ ID NO.3所示，亚型为C2型。

本发明提供的上述柯萨奇病毒A10型毒株具有较强的毒力，在基因型内和基因型间具有较好的交叉中和能力，免疫原性好，能够以RD等细胞作为基质细胞进行快速繁殖。

进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒A10型相关的生物材料，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白；

（2）编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白的核酸分子；

（3）序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示的核酸分子；

（4）含有（2）或（3）中所述核酸分子的表达盒；

（5）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组载体；

（6）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组微生物；

（7）含有（2）或（3）中所述核酸分子的细胞系；

（8）检测（2）或（3）中所述核酸分子的引物或探针。

以上（2）或（3）中所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。

以上（4）中所述的表达盒为在（2）或（3）中所述的核酸分子的上游、下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。

以上（5）中所述的重组载体为携带（2）或（3）中所述的核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。

以上（6）中所述的重组微生物可为细菌或病毒。

以上（7）中所述的细胞系为动物细胞系，所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于RD、Vero、MRC-5等其他细胞。

以上（8）中所述的引物、探针为能够与（2）或（3）中所述核酸分子结合并进行PCR扩增的寡核苷酸。

本发明还提供所述柯萨奇病毒A10型毒株的病毒样颗粒，其含有P1结构蛋白以及选自非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D中的任意一种或多种；所述P1结构蛋白具有如SEQID NO.1所示的序列，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D分别具有如SEQ ID NO.4-10所示的序列。

以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述结构蛋白、非结构蛋白的编码基因。

本发明还提供含有以上所述的柯萨奇病毒A10型毒株、生物材料或病毒样颗粒的免疫原性组合物。

所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒A10型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒A10型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

进一步地，本发明提供柯萨奇病毒A10型毒株或所述的生物材料或所述病毒样颗粒的如下任意一种应用：

（1）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（2）在柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；

（3）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（5）在预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物的筛选或药效评价中的应用；

（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；

（7）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；

（8）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的疫苗中的应用；

（9）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物中的应用；

（10）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗体中的应用；

（11）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗血清中的应用。

以上（1）中，所述应用具体为作为疫苗免疫原性评价的标准检测毒株。

以上（3）中，所述应用具体为作为用于疫苗保护性评价的攻击毒株。

以上（4）中，所述动物模型优选为鼠模型。

以上（1）-（11）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒A10型毒株。

以上（5）和（8）-（11）中，所述柯萨奇病毒引起疾病优选为手足口病。

本发明提供一种抗体或抗血清，其为以所述柯萨奇病毒A10型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原制备得到。

本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，该方法包括：以所述柯萨奇病毒A10型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原免疫动物，经分离获得抗柯萨奇病毒A10型的抗体或抗血清。

本发明提供一种产品，其含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：

（1）上述柯萨奇病毒A10型毒株；

（2）上述生物材料；

（3）上述病毒样颗粒；

（4）上述柯萨奇病毒A10型毒株的抗体或抗血清。

以上所述的产品优选为用于柯萨奇病毒A10型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒A10型感染动物模型构建的产品，或者为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染的产品。

所述产品可为试剂、试剂盒、疫苗或药物。

作为本发明的一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A10型疫苗免疫原性或保护性评价的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A10型感染动物模型构建的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于预防柯萨奇病毒A10型感染的疫苗，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株。

本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。

优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒A10型毒株被灭活。所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒A10型毒株在细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活、纯化后获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于治疗柯萨奇病毒A10型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株的抗体或抗血清。

本发明还提供以上所述的产品在柯萨奇病毒A10型疫苗的免疫原性评价或保护性评价、制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用。

本发明还提供以上所述的产品在诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染中的应用。

本发明的有益效果至少在于：

本发明通过病毒分离、筛选、蚀斑纯化和动物攻毒实验，筛选到的毒株同时具备了交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强的属性。该毒株的强毒力为建立稳定的感染动物模型提供了攻击毒株。

该毒株在基因型内和型间交叉性良好，可作为柯萨奇病毒A10型免疫血清的中和抗体效价测定的检测毒株，为柯萨奇病毒A10型相关单/多价疫苗研发提供支持。

该毒株免疫原性好、滴度高，腹腔注射10²CCID₅₀病毒液可使1日龄乳鼠6天内100%死亡。表明该毒株是一株强毒力的毒株。对小鼠具有高致病和致死能力的强毒株对于构建CV-A10小鼠模型至关重要。

附图说明

图1为本发明实施例1中毒株的型内交叉中和研究结果。

图2为本发明实施例5中攻击毒株筛选-存活曲线。

图3为本发明实施例5中LD₅₀确定-存活曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

本发明的基本研究方法为：

（1）对已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A10型阳性的咽肛试子样本，在RD细胞上进行分离，并经过3次传代适应性培养，对收获的病毒液进行初步的鉴定，主要包括病毒滴定、抗原含量测定、分子生物学鉴定（病毒确定，核酸序列测定分析亚型）、免疫原性试验、及交叉中和能力的研究、基因组测序等，初步获得合适的中和抗体检测毒株和攻击毒株（初筛毒株）。

（2）初筛毒株分别进行3次蚀斑纯化，在RD细胞上进行3次传代适应性培养（P4代），对收获的病毒液进行检定，病毒液检定主要包括病毒滴定。根据病毒检定结果结合病毒病变进程、病变融合度，建立原始种子，并进行相关评价研究和传代稳定性研究。评价研究主要包括病毒滴定、免疫原性研究、致病性研究及交叉中和能力的研究等。传代稳定性研究主要是将病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定、基因测序检测（基因组测序分析）。根据以上研究结果选择交叉保护范围广、遗传稳定性好、滴度高的毒株一株作为中和抗体检测毒株；遗传稳定性好、致病性强的毒株一株作为疫苗保护性评价的攻击毒株。

（3）中和抗体检测候选毒株确立后，对其进行病毒滴定。然后对其进行滴度标定及专属性评价。确定该检测毒株的标示滴度，从而确定中和试验时检测滴度株的稀释倍数。专属性评价旨在验证该检测毒株只对CV-A10型免疫血清有特异性中和能力，而对其他肠道病毒如EV-A71、CV-A6及CV-A16免疫血清无交叉反应。从而证明该毒株适用于柯萨奇病毒A10型免疫血清的中和抗体效价的检测。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 柯萨奇病毒A10型毒株的初步筛选

临床样本的处理：

在生物安全柜中将每一份样品（已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A10型阳性的咽肛试子样本）取0.25 ml加入离心管中。加入2.5μl青链霉素溶液，混匀，4 ℃放置过夜。2000 rpm 离心20 min，上清存于2~8℃以备接种。

病毒分离培养：

取准备好的长至80-90%密度的健康无污染的RD细胞，弃去细胞培养液。将处理好的样品0.2ml/孔接种于6孔板内，每一份样品接种1孔，同时加入0.2 ml/孔病毒培养液，置35℃ 5%CO₂培养箱中吸附1h。之后每孔补加3.5ml病毒培养液，置35℃ 5%CO₂培养箱中静置培养。设置2孔生长状态良好且未接种标本的细胞作为细胞对照。

病毒收获及适应性传代培养：

每天观察并记录接种后细胞特征性肠道病毒致细胞病变效应（CPE）情况。如果出现CPE且CPE程度达+++以上时，冻融一次，收获细胞培养物，用0.2μm针头滤器过滤，0.2ml/支分装病毒液，于-60℃冰箱保存，取病毒液继续传代三次，每代冻融一次，2000 rpm 4℃离心10 min，上清分装，于-60℃冰箱保存，做好标记和记录。如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传三代，继续观察。

病毒鉴定：

对获得的病毒分离阳性株的第3代病毒液进行病毒鉴定试验，主要包括病毒滴定、分子生物学鉴定（病毒鉴定及病毒基因型分型）及免疫原性试验、交叉中和能力的研究、基因组测序等。

病毒滴定：

（1）检测方法：将经三次传代的病毒液用无血清的培养液在离心管中10倍梯度稀释，从10^-1~10^-8。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μl RD细胞悬液（1.5×10⁵个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加稀释液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃，5% CO₂培养箱中静置培养，第7天判断结果。每个样品进行3次重复。

（2）病毒滴度计算：按Behrens-Karber公式计算LgCCID₅₀。

LgCCID₅₀ = L-d (S-0.5)，其中：

L = 实验中使用的病毒的最低稀释度的对数值；

d = 稀释梯度的对数值；

S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。

具体参见中华人民共和国卫生部．手足口病预防控制指南(2009版)．[EB/OL]．(2009-06-04) http://www.gov.cn/gzdt/2009-06/04/content_1332078.htm。

分子生物学鉴定：

采用RT-PCR法鉴定CV-A10病毒，将CV-A10阳性的病毒株进行VP1核酸序列测定，并根据VP1核苷酸序列进行CV-A10基因型分型。

RT-PCR法鉴定CV-A10病毒：

提取病毒核酸，应用EV组肠道病毒核酸检测通用引物及CV-A10核酸检测引物进行CV-A10病毒鉴定。

（1）扩增引物设计如下：

A、人肠道病毒核酸检测通用引物序列（产物长度400-500bp）

59F: 5’-CYTTGTGCGCCTGTTTT-3’（SEQ ID NO.18）；

588R: 5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’（SEQ ID NO.19）；

153F: 5’-CAAGYACTTCTGTMWCCCC-3’（SEQ ID NO.20）；

541R: 5’-CCCAAAGTAGTCGGTTCC-3’（SEQ ID NO.21）。

以上引物中，Y代表C/T，M代表A/C，W代表A/T。

B、CV-A10 核酸检测引物序列（产物长度 1kb）

CA10-VP1- WHF: 5’- GGTATCAAACCAATTACGTGGTCC -3’（SEQ ID NO.22）；

CA10-VP1- WHR: 5’-AACAAGCAGGTCTCGAGAAC-3’（SEQ ID NO.23）。

（2）病毒核酸提取：

按照说明书中顺序和用量向96孔板添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸；将提取好的核酸分装至EP管中，标记样品信息和日期，保存至-60℃冰箱。

（3）PCR扩增：

1）HEV- 5’UTR通用引物PCR扩增

a. 第一轮PCR扩增：

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表1），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表2）。

表1 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增反应体系

表2 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增程序

b. 第二轮PCR扩增：

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表3），然后加入0.4μl第一轮PCR扩增产物为模板，放入PCR仪运行程序（见表4）。

表3 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增反应体系

表4 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增程序

2）CV-A10 VP1特异性引物PCR扩增

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表5），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表6）。

表5 VP1特异性引物PCR扩增反应体系

表6 VP1特异性引物PCR扩增程序

3）用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

4）结果判断

HEV-5’UTR通用引物扩增阳性样本应能观察到大小为400bp的目的条带，VP1特异性引物扩增阳性样本应能观察到大小为1kb的目的条带。标本的实验室诊断结果根据表7进行判断。其中，HEV（－）代表HEV- 5’UTR通用引物未扩增出目的条带，HEV（＋）代表HEV- 5’UTR通用引物扩增出目的条带；CV-A10（－）代表CV-A10 VP1特异性引物未扩增出目的条带，CV-A10（＋）代表CV-A10 VP1特异性引物扩增出目的条带。

表7

CV-A10基因型分型：

将鉴定为CV-A10阳性的病毒株进行VP1核酸序列扩增及序列测定，根据VP1核酸序列进行CV-A10基因型分型。结果显示均为C2型。

免疫原性研究：

挑选滴度高的毒株，应用NIH小鼠进行免疫原性分析。

将20株第三代病毒液制备成相同病毒滴度（7.0LgCCID₅₀/ml），免疫NIH小鼠（SPF级，18-22g，雌性），各毒株组10只，分别编号。按照0、14天两针免疫程序，分别腹腔注射灭活病毒500 μl/只，同时设置培养基对照组，分别于一免、二免后14天采血，分离血清。采用微量细胞病变法测定血清抗特异性中和抗体效价，分析阳转率及中和抗体水平。

中和抗体效价测定步骤：将待测血清按1:8稀释，经56 ℃灭活30 min，加至96孔板中，0.05ml/孔，作2倍系列稀释后，分别与100CCID₅₀的CV-A10病毒悬液于37℃中和1~3h；加入1.5×10⁵个/ml的RD细胞悬液，0.1ml/孔，置35±0.5℃，5% CO₂培养箱中培养7d。将能抑制50%细胞病变的最高稀释度定为CV-A10抗体的中和效价，并以稀释倍数的倒数表示。每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32~320 CCID₅₀/孔时试验判为成立。以中和效价≥8判为CV-A10中和抗体阳性，阴性样品的几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）均按4计算。

试验结果显示，一免阳转率即可达到80%以上，二免阳转率均可达到100%，一免中和抗体效价在1:19~1:273之间，二免中和抗体效价在1:247~1:7476之间，其中，R603的中和抗体效价可达1:7476，表明为优势毒株。

交叉中和能力研究：

将毒株与毒株免疫血清进行交叉中和能力研究，以毒株对全部待测血清的中和抗体效价倍数差反映交叉中和能力。倍数差低代表该毒株具有较均一的交叉中和检测能力，筛选中和抗体GMT高且倍数差较低的毒株，作为检测候选毒株。

a. 型内交叉中和研究：

挑选上述筛选到的免疫原性和滴度基因序列综合评价较好的属同一基因亚型的8株初筛毒株（R603、R210、R629、R601、R579、R620、R624、R617）进行型内交叉中和研究（以8株毒株和对应的8份免疫血清进行交叉中和反应），免疫血清为2次免疫小鼠14天后采集的血清（具体步骤参见上述血清抗特异性中和抗体效价的测定）。以毒株对全部血清的中和抗体效价GMT和倍数差（MAX/MIN）反映交叉中和能力。结果见图1和表8，编号为R603的初筛毒株检测各免疫血清的中和抗体效价GMT为1:2111，倍数差为8。

表8

b. 型间交叉中和研究：

以包括1株A基因型（Kowalik, Genbank no: AY421767）、17株C2基因型株（2014-2019年中国大陆分离获得的毒株）在内的18个CV-A10毒株进行型间交叉中和研究（委托中国食品药品检定研究院进行，毒株及其对应的免疫血清均来自中国食品药品检定研究院），将全部毒株以1 ml分别在0、2 w免疫大鼠，3 w采血分离血清，将全部血清分别与18株CV-A10病毒株进行交叉中和检测。本试验中上述型内交叉中和的5个毒株（R603/R210/R629/R601/R579）参与其中，结果显示，5个毒株检测血清中和抗体效价GMT的倍数差均在384~2304之间，其中R603倍数差为384。表明该毒株对现有的柯萨奇病毒A和C基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。

实施例2 蚀斑纯化

将初筛毒株的病毒稀释液接种进行第一次蚀斑纯化。

（1）细胞准备：取已长成单层的RD细胞经洗涤、消化后接种于6孔细胞培养板中，7×10⁵个细胞/孔，补加细胞培养液（RD细胞）至 4 ml，置5% CO₂培养箱中37±1℃静置培养48小时至长成致密单层。弃去原培养液，用无血清的维持液（MEM培养液）清洗细胞表面，洗去残留的牛血清与死细胞。

（2）病毒准备：将病毒液进行适当倍数的稀释。

（3）病毒吸附：将稀释好的病毒液进行接种，0.4ml/孔，同时设置病毒液对照和细胞对照，置 5% CO₂培养箱中35℃吸附1~2小时，期间每隔15~20min轻轻晃动细胞板数次，使其接触整个细胞表面。

（4）覆盖与培养：吸附完毕后，弃去病毒液，病毒对照和细胞对照，加入病毒维持液3ml/孔。其余各孔沿壁缓慢加入琼脂糖和病毒维持液混合物，每孔3ml，室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层，把加入琼脂糖的培养板倒置于5% CO₂培养箱内37±1℃培养，细胞对照和液体病毒对照培养板正置培养，每天观察并记录，蚀斑情况（形态、大小及数量）及病毒对照病变情况。

（5）蚀斑培养：将单个蚀斑，用200μl带滤芯的枪头挑取至含有100μl病毒维持液的1.5ml EP管中，反复吹打混匀，接种至细胞已长至单层的6孔细胞培养板中，置5% CO₂培养箱中37±1℃培养，每天观察CPE。待细胞出现CPE达75%时，收集上清液，于-60℃冰箱中保存。此时病毒代次为P2代。

（6）鉴定及分析：将P2代病毒进行病毒滴度检测。

（7）选择滴度较高的毒株进行第二次和第三次蚀斑纯化，操作同上。

实施例3 检测候选毒株的确定

将经三次蚀斑纯化的毒株扩增至第5代建立原始种子，并对其进行相关检定研究以及传代稳定性研究，根据传代稳定性研究结果选择交叉保护范围广、遗传稳定性好、滴度高的毒株作为检测候选毒株。如未特别说明，检测方法同实施例1。

原始种子毒株的检定研究主要包括免疫原性、病毒滴定、基因组测序分析、交叉中和能力研究。

传代稳定性研究主要是将原始种子病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定、基因组序列分析。

毒株检定研究结果显示编号为R06030451的毒株的免疫原性良好（一免后血清阳转率即可达到100%，二免后血清阳转率为100%，二免后中和抗体效价GMT值为1:1691），滴度为8.04LgCCID₅₀/ml，基因组序列与初筛毒株R603一致。型内交叉中和研究结果（见表9）显示该毒株检测免疫血清中和抗体的GMT值为1:913（1:431~1:913），倍数差为8，表明该毒株具有较好的交叉中和检测能力。其中，毒株R06170333、R06030151、R06010343、R02100543为将实施例1中的初筛毒株R617、R603、R601、R210进行多次蚀斑纯化获得的原始种子。

表9 型内交叉中和能力研究结果

型间交叉中和结果显示，编号为R06030451的毒株的血清对全部毒株的中和抗体效价倍数差最小，与实施例1中检测的初筛毒株R603毒株相当，表明编号为R06030451的毒株对现有的柯萨奇病毒A、C基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。

传代稳定性研究表明编号为R06030451的毒株连续传15代，滴度趋势稳定（7.92~8.58 LgCCID₅₀/ml之间），基因组序列一致。表明该毒株遗传稳定性好。

上述编号为R06030451的毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCC No.19533。

R06030451毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示，P1蛋白的编码基因序列如SEQID NO.2所示，P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-10所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ ID NO.11-17所示。

实施例4 检测毒株滴度标定和专属性评价

由3名实验员，分别独立进行9次滴度测定，结果表明滴度均值为7.903LgCCID₅₀/ml（95%CI：7.868-7.937），符合正态分布。专属性研究表明与同为肠道病毒的柯萨奇病毒A16血清（毒株保藏编号为CGMCC No.19534，该毒株名称为R00880662，该毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A16型）、肠道病毒71型血清和柯萨奇病毒A6血清（毒株保藏编号为CGMCC No.19532，该毒株名称为R01170631，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型）均无交叉中和现象，研究方法参见实施例1中的型内交叉中和研究方法。

实施例5 致病性研究

根据实施例1中的免疫原性结果，选择最优的2个毒株进行致病性初步研究，根据结果挑选致病性最强的毒株进行LD₅₀研究。

初步研究将取冻存的2个毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液稀释至10⁵CCID₅₀/0.05ml，分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个毒株1窝（5-10只），另设含2%FBS的病毒维持液为对照组。记录实际小鼠数量。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况。结果显示同样的攻毒剂量，编号R06030451的毒株攻毒后第3天使乳鼠100%死亡，另外一个毒株R06010343攻毒后第6天使乳鼠100%死亡，见图2。表明编号R06030451的毒株具有更强的毒力。因此选择该毒株作为攻击毒株，进行LD₅₀研究。

取冻存的R06030451毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液做10倍系列稀释，至10³、10²、10¹、10⁰、10^-1CCID₅₀/0.05ml五个浓度。将每个稀释度病毒液分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个稀释度1窝（5-10只），另设含2%FBS的病毒维持液为对照组。第四天观察对照组有无非特异性死亡，并记录实际小鼠数量。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况，按照Reed-Muench法计算病毒的累计死亡率和LD₅₀值。

对照组21天存活率100%，试验成立。结果显示10² CCID₅₀/只攻毒组的乳鼠6天全部死亡，而10 CCID₅₀/只攻毒组的乳鼠13天全部死亡，而1 CCID₅₀/只攻毒组的死亡率为33.3%。按Reed-muench法计算，以稀释度为标准，LD₅₀为2.5×10^-7；以滴度为标准，LD₅₀为8.47CCID₅₀/ml，存活曲线见图3。表明该毒株为致病力强的毒株，可以用于柯萨奇病毒A10相关疫苗保护性评价。

实施例6 灭活疫苗的制备

取实施例3建立的柯萨奇病毒A10型毒株R06030451原始种子，在Vero细胞上进行适应性传代，传5代，收获病毒液，按实施例2进行3次蚀斑纯化后，继续传4代，经鉴定合格的病毒液收获。采用细胞工厂或者生物反应器在Vero细胞上进行扩大培养，按MOI=0.0005接种病毒，待病变达75%以上收获病毒液。将收获的病毒液经离心或过滤后，采用甲醛1:4000灭活3天（或者β-丙内酯1:4000于5±3℃灭活1天），37℃水解2小时。将灭活液进行超滤浓缩、层析纯化，纯化液经除菌过滤后获得疫苗原液（灭活也可在病毒纯化后进行）。

将上述疫苗原液与氢氧化铝佐剂按适宜比例吸附后，制备成灭活疫苗。疫苗蛋白浓度为20μg/ml，铝浓度0.8mg/ml。

实施例7 灭活疫苗的免疫原性

将实施例6中配制的灭活疫苗进行小鼠免疫试验。其中，小鼠的免疫方法如下：将NIH小鼠（SPF级，18-22g，雌性）随机分成2组，每组小鼠10只，按0、14天的免疫程序进行腹腔免疫，0.5ml/只，于第14、28天进行采血，同时将病毒维持液作为对照组。采集的血清进行中和抗体检测，具体方法见实施例1。结果显示，1免后14天，疫苗组血清效价100%阳转，中和抗体水平GTMs 可达1:641；二免后14天，中和抗体水平GTMs 可达1:3447；对照组阳转率为0%，GTMs＜1：8，表明使用柯萨奇病毒A10型毒株R06030451制备的灭活疫苗具有很好的免疫效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 柯萨奇病毒A10型毒株及其应用

<130> KHP211120539.4YS

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Arg Glu Leu

50 55 60

Ser Gly Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Lys Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg

245 250 255

Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro

260 265 270

Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro

275 280 285

Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile

290 295 300

Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln

305 310 315 320

Ala Val Ser Gln Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln

325 330 335

Phe Leu Thr Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe

340 345 350

Thr Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu

355 360 365

Glu Leu Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu

370 375 380

Ala Thr Gly Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys

385 390 395 400

Ala Asp Glu Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly

405 410 415

Pro Trp Gln Ser Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln

420 425 430

Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met

435 440 445

Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln

450 455 460

Pro Ala Asn Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp

465 470 475 480

Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn

485 490 495

Thr His Phe Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr

500 505 510

Ala Gly Val Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro

515 520 525

Glu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp

530 535 540

Asn Phe Thr Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln

545 550 555 560

Ala Val Leu Gln Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu

565 570 575

Gly Asn Thr Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Val Thr Asn Val Glu Ser

580 585 590

Ala Ala Asn Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val

595 600 605

Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp

610 615 620

Glu Asn Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu

625 630 635 640

Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val

645 650 655

Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp

660 665 670

Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met

675 680 685

Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr

690 695 700

Glu Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro

705 710 715 720

Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr

725 730 735

Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln

740 745 750

Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr

755 760 765

Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr

770 775 780

Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val

785 790 795 800

Val Ser Arg Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met

805 810 815

Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln

820 825 830

Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Val Thr

835 840 845

Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggagctc aagtctcgac gcaaaaatcc ggcagtcatg agactggtaa tgtagccact 60

ggaggatcta caataaactt cactaacatc aactattata aagattctta cgccgcgtca 120

gctacccggc aagacttcac acaagatccg aagaaattca cacaaccagt gttagactct 180

attagagaac tatcaggccc tttgaactct ccttctgtgg aagcttgtgg ttatagtgat 240

agggtcgccc agctcactgt tgggaactcc tccattacta cccaagaggc tgctaatatc 300

gtattagctt atggagagtg gcctgagtac tgccctgaca cagacgcaac tgccgtggat 360

aaaccaactc gcccggacgt gtctgtcaac aggttctaca ctttggactc caaaatgtgg 420

caagaaaatt cgactggttg gtattggaag ttccctgacg tgctgaacaa aacgggtgtg 480

ttcggacaga atgcccaatt tcattacttg taccggtcgg gtttctgctt gcatgtacag 540

tgtaatgcta gtaagtttca ccagggggcc cttcttgtgg ctgtgatacc agaatttgtg 600

atcgctggca gagggtctaa cacaaaacca aataaagcgc cccacccagg gtttaccaca 660

actttccctg gcaccaccgg tgctacattc catgacccat acgttctgga ttccggggta 720

ccattgagtc aggctctaat atacccccat cagtggatca atctccgcac taacaactgt 780

gcaactgtta tagttccata catcaatgct gttccgtttg actcagccat caaccatagc 840

aattttgggc taatagtgat accagttagc ccgctgaagt attcgtccgg ggcaactact 900

gcaatcccaa tcactatcac tatagccccc ctgaattcag agtttggagg actgcgacaa 960

gccgtcagtc aaggcatccc agctgagctc aggcccggga ctaatcagtt cctgaccaca 1020

gatgatgaca ctgcagcgcc catcctccca ggattcaccc ccacacccac aattcacata 1080

ccaggggaag tacactcttt gctggagttg tgtagggtgg agactatttt ggaagtgaac 1140

aacaccacag aagcaacagg attaacaagg ctcttaatac cagtgtcctc gcagaacaaa 1200

gccgatgagt tgtgtgctgc gtttatggtt gatccaggcc gaattggacc ttggcaatct 1260

actttagttg gacagatttg ccggtattac acacaatggt ccgggtcttt gaaggtgacc 1320

tttatgttca caggatcttt tatggcaaca ggcaagatgc tggtggccta ctccccgccc 1380

ggaagcgctc aaccagccaa cagagaaacc gccatgctgg gcacgcacgt catctgggac 1440

tttgggctac aatcgtcagt ctctttggtg ataccgtgga tcagtaacac tcacttccgt 1500

actgccaaga caggtgggaa ttacgattac tatacggcgg gtgtagtgac cttatggtat 1560

cagaccaatt acgtggtccc gccagaaacc cctggagagg catatattat tgcaatgggg 1620

gcggcacaag acaacttcac tttgaagatc tgcaaggata ctgatgaagt gacacaacaa 1680

gctgtgttgc aaggtgaccc tgtggaggat ataattcatg acgctctggg aaacacagcg 1740

cgtagagcta ttagcagtgt tacaaatgtt gaatccgcgg ccaacaccac tcccagttca 1800

caccgactag agactggacg cgtaccagcg ctacaggctg cagagacggg tgccacttct 1860

aatgccacag atgagaacat gattgagacc cgttgtgtgg ttaacagaaa tggggtgttg 1920

gaaaccacta tcaaccactt cttctcccgc tctggattag tgggagtggt taacctcaca 1980

gatgggggga cggacaccac tgggtatgct acatgggaca tagacattat gggttttgtc 2040

caactccgca gaaaatgcga gatgttcaca tacatgaggt tcaacgcaga attcacattt 2100

gtcacaacga cagagaatgg agaggctcgt ccgtacatgc tacaatatat gtatgtgccc 2160

cctggcgccc ccaaaccgac gggaagggat gcctttcaat ggcaaacagc aactaaccca 2220

tcagtcttcg tcaaactcac tgaccctcct gcacaagtct cagttccttt catgtcacca 2280

gctagcgcat atcagtggtt ctatgatggt taccccactt tcggccagca cccggagacc 2340

tcaaacacaa catacggatt gtgcccaaac aatatgatgg gcacatttgc agtgagagtt 2400

gttagtagag aggcaagtca actaaaacta cagactagag tgtacatgaa gcttaagcat 2460

gtgagggcct gggtcccaag accgatcagg tctcagccat acctgctcaa aaacttcccc 2520

aattacgaca gtagcaaggt taccaacagt gcacgggacc gttccagtat caagcaagct 2580

aatatg 2586

<210> 3

<211> 7407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaaaccagc ctgtgggttg tacccaccca cagggcccac tgggcgctag cactccgatt 60

ctgcggaatc tttgtgcgcc tgttttataa ccctcccccg aaacttgcaa cttagaagtt 120

atgtacgtta ctgatcaaca gcaggcgtgg cataccagcc atgtcttgat caagcacttc 180

tgtaaccccg gaccgagtat caatagactg ctcacgtggt cgaaagagaa aacgttcgtt 240

atccggctaa ctacttcgag aaacctagta gcaccactga aactgcggag tgtttcgctc 300

agcacttccc ccgtgtagat caggtcgatg agtcactgct taccccacgg gtgaccgtgg 360

cagtggctgc gttggcggcc tgcctatggg gcaacccata ggacgctcta aagtggacat 420

ggtgtgaaga gtctattgag ctagttagta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct 480

aactgcggag cgcatgcccc caaaccagag ggtggtgcgt cgtaacgggt aactctgcag 540

cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt cttttattct cataatggct gcttatggtg 600

acaattgagg aattgttacc atatagctat tggattggcc atccggtgtg caacagagct 660

attatctacc tgtttgttgg atacattcca ttgacaccta aatccttcaa tacattgcac 720

tatatcctaa cgttgaacgc aagaaaatgg gagctcaagt ctcgacgcaa aaatccggca 780

gtcatgagac tggtaatgta gccactggag gatctacaat aaacttcact aacatcaact 840

attataaaga ttcttacgcc gcgtcagcta cccggcaaga cttcacacaa gatccgaaga 900

aattcacaca accagtgtta gactctatta gagaactatc aggccctttg aactctcctt 960

ctgtggaagc ttgtggttat agtgataggg tcgcccagct cactgttggg aactcctcca 1020

ttactaccca agaggctgct aatatcgtat tagcttatgg agagtggcct gagtactgcc 1080

ctgacacaga cgcaactgcc gtggataaac caactcgccc ggacgtgtct gtcaacaggt 1140

tctacacttt ggactccaaa atgtggcaag aaaattcgac tggttggtat tggaagttcc 1200

ctgacgtgct gaacaaaacg ggtgtgttcg gacagaatgc ccaatttcat tacttgtacc 1260

ggtcgggttt ctgcttgcat gtacagtgta atgctagtaa gtttcaccag ggggcccttc 1320

ttgtggctgt gataccagaa tttgtgatcg ctggcagagg gtctaacaca aaaccaaata 1380

aagcgcccca cccagggttt accacaactt tccctggcac caccggtgct acattccatg 1440

acccatacgt tctggattcc ggggtaccat tgagtcaggc tctaatatac ccccatcagt 1500

ggatcaatct ccgcactaac aactgtgcaa ctgttatagt tccatacatc aatgctgttc 1560

cgtttgactc agccatcaac catagcaatt ttgggctaat agtgatacca gttagcccgc 1620

tgaagtattc gtccggggca actactgcaa tcccaatcac tatcactata gcccccctga 1680

attcagagtt tggaggactg cgacaagccg tcagtcaagg catcccagct gagctcaggc 1740

ccgggactaa tcagttcctg accacagatg atgacactgc agcgcccatc ctcccaggat 1800

tcacccccac acccacaatt cacataccag gggaagtaca ctctttgctg gagttgtgta 1860

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caggccgaat tggaccttgg caatctactt tagttggaca gatttgccgg tattacacac 2040

aatggtccgg gtctttgaag gtgaccttta tgttcacagg atcttttatg gcaacaggca 2100

agatgctggt ggcctactcc ccgcccggaa gcgctcaacc agccaacaga gaaaccgcca 2160

tgctgggcac gcacgtcatc tgggactttg ggctacaatc gtcagtctct ttggtgatac 2220

cgtggatcag taacactcac ttccgtactg ccaagacagg tgggaattac gattactata 2280

cggcgggtgt agtgacctta tggtatcaga ccaattacgt ggtcccgcca gaaacccctg 2340

gagaggcata tattattgca atgggggcgg cacaagacaa cttcactttg aagatctgca 2400

aggatactga tgaagtgaca caacaagctg tgttgcaagg tgaccctgtg gaggatataa 2460

ttcatgacgc tctgggaaac acagcgcgta gagctattag cagtgttaca aatgttgaat 2520

ccgcggccaa caccactccc agttcacacc gactagagac tggacgcgta ccagcgctac 2580

aggctgcaga gacgggtgcc acttctaatg ccacagatga gaacatgatt gagacccgtt 2640

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ttcaatggca aacagcaact aacccatcag tcttcgtcaa actcactgac cctcctgcac 3000

aagtctcagt tcctttcatg tcaccagcta gcgcatatca gtggttctat gatggttacc 3060

ccactttcgg ccagcacccg gagacctcaa acacaacata cggattgtgc ccaaacaata 3120

tgatgggcac atttgcagtg agagttgtta gtagagaggc aagtcaacta aaactacaga 3180

ctagagtgta catgaagctt aagcatgtga gggcctgggt cccaagaccg atcaggtctc 3240

agccatacct gctcaaaaac ttccccaatt acgacagtag caaggttacc aacagtgcac 3300

gggaccgttc cagtatcaag caagctaata tgggtaaatt tgggcaacaa tctggcgcca 3360

tctacgttgg taactacaga gtggtcaata ggcacctggc cacccacaat gactgggcca 3420

acctggtgtg ggaagacagt tctcgagacc tgcttgtttc gtctaccacc gcccagggtt 3480

gcgatacgat tgcccgttgt gagtgtcaga caggggtgta ctattgtaac tcaaggagga 3540

aacattaccc agtcagtttc tctaaaccta gcctcgtctt cgtagaggcc agtgagtatt 3600

accctgctag atatcaatct cacctaatgc tcgctgcagg ccactctgaa cctggggatt 3660

gcgggggtat attgaggtgt cagcatggtg tggttggcat agtgtccact ggaggcaacg 3720

gtcttgtcgg ttttgctaac gtgagggacc tcttatggtt ggatgaagaa gccatggaac 3780

agggagtatc tgactatatc aagggactcg gcgacgcctt tggtactggc tttactgatg 3840

cagtgtctag ggaagtggag gccctgaaaa attacctgat tggttccgag ggagcggtgg 3900

agaagatcct gaagaacttg gtgaaactca tatcagctct ggtcatagtt atcagaagtg 3960

actacgacat ggtcaccctt accgcaactc tagctctgat tgggtgtcac gggagcccat 4020

gggcgtggat caaagcaaag acggcgtcca tcttaggtat tcctatggca cagaagcaga 4080

gtgcatcttg gcttaagaag ttcagtgata tggcgaacgc tgcaaaggga ttagagtgga 4140

tctccaacaa aatcagcaaa tttattgatt ggctcaagga aaagatcatt ccagccgcaa 4200

aggaaaaagt cgagtttctt aataacctca agcaactgcc cttgatggaa aaccaaattg 4260

ctaacttaga acagtccgct gcttcacaag aagaccttga agtcatgttt ggtaatgtgt 4320

catacctagc acacttttgt cgcaagttcc agccactcta tgcaactgaa gcgaagagag 4380

tgtacgcctt agagaagaga atgaataatt acatgcagtt caagagcaaa caccgtattg 4440

aacctgtatg tttgattatc aggggctcac caggaactgg caagtcactt gccacaggta 4500

taatagcaag agccattgct gacaaatatc actctagtgt gtactccctt ccaccagacc 4560

cagatcactt tgatggatac aagcaacaag tggtgacagt catggatgat ctgtgccaaa 4620

acccagatgg caaagatatg tcattgtttt gtcaaatggt atccactgtc gattttatac 4680

ccccaatggc ttcactggaa gaaaaaggtg tatccttcac atctaaattt gttattgctt 4740

caactaatgc tagcaacatc attgtcccca cggtctcaga ctctgacgct atccgtagga 4800

gatttttcat ggattgtgat atcgaagtga ctgactctta taagacagac ttaggccgct 4860

tagatgcagg tagggccgca aagctctgct cagagaataa cactgccaat ttcaagaggt 4920

gcagcccgct agtgtgcggt aaagccatcc aactgagaga taggaagtcc aaagtcaggt 4980

atagcgtaga cactgtggta tcagaattag ttagggagta tagcaacagg tctgctatag 5040

ggaacactat agaagcttta ttccaagggc ctcctaaatt caggcctgta agaattagtc 5100

ttgatgagaa acccgctcca gatgccatta gtgacctgct tgctagtgtt gatagtgaag 5160

aggtgcggca gtactgcaga gatcaaggat ggataatacc tgaaacgcca accaacgtgg 5220

agcggcatct caatagggca gtactagtga tgcaatccat cgctactgta gtcgcagttg 5280

tgtcccttgt ttatgttatc tacaagctat ttgctggttt ccaaggcgca tattctggag 5340

cgcccaggca agctctcaag aaacctgtgt tgaggacagc cactgttcaa gggcccagct 5400

tagattttgc cctgtccctc ctacgacgta acgtcaggca ggtgcaaacc gaccaagggc 5460

actttaccat gcttggggta cgtgaccacc ttgctatctt acctcgtcac tcgcaaccag 5520

ggaagaccat ctgggttgaa cacaagttgg tcaatgtgct tgatgctgtt gagctagtgg 5580

atgaacaagg tgttaatttg gagctcacac tagtaaccct agataccaat gagaagttta 5640

gagatgtcac caagttcatt ccagagaata tcagtggagt cagtgatgcc acattaataa 5700

tcaacactga acacatgcca tcaatgtttg tcccggtagg agatgttgtt caatatgggt 5760

tcctaaatct tagtggtaaa ccaacccaca ggaccatgat gtacaatttc cctacaaagg 5820

ctggacagtg tggaggcgtg gtaacatctg tcggtaaaat cattggcatc cacattggag 5880

gcaacgggcg tcaagggttt tgcgctggcc tgaagaggag ttactttgca agtgagcaag 5940

gtgaaatcca atgggtgaaa cctaacaagg agaccggcag attaaatatc aatggtccaa 6000

cacgcaccaa gttagagccc agtgtgttcc atgatctgtt tgagggcaac aaggagccag 6060

cagtcctaac aagcaaggat cccagattag aggttgactt tgagcaggct ctcttctcca 6120

agtatgtggg taatgtcctc cacgaacctg atgaatatgt gaagcaggca gccctccact 6180

acgcaaatca gctcaagcaa ctggatataa acaccaataa gatgagcatg gaggaagcgt 6240

gctatggcac agagaacctg gaagcaattg acctccatac tagcgcgggg tacccataca 6300

gtgctttggg cataaagaag agggacatac tagatcctac cactaaggac ataacaaaaa 6360

tgaagtttta catggataag tatggcttgg atttacctta ctccacctac gttaaagatg 6420

aacttaggcc tctggacaag atcaagaaag ggaagtcccg cttaatagaa gctagcagcc 6480

tgaatgattc agtgtacctc agaatgactt ttggccacct gtatgaagca ttccatgcaa 6540

acccagggac tgtgaccgga tcagcagttg ggtgcaatcc ggatgtgttc tggagtaaac 6600

tcccaatcct actcccaggc tcgctatttg cctttgacta ttcaggctat gatgctagtc 6660

ttagccccgt ctggtttagg gctttggaga tggtcttacg ggacatcggc tattcagagg 6720

aagcagtgtc actcatagaa ggaataaatc acacccatca tgtgtatcgg aataaaacat 6780

attgtgttct tggcgggatg ccgtcaggat gttctggtac ttccattttc aactcgatga 6840

tcaacaacat catcattagg acgcttttaa tcaaaacctt taaagggata gatctggacg 6900

agttgaatat ggtggcctat ggagatgatg tgctggctag ttatcctttc cctattgatt 6960

gtcttgagtt agctaagact ggcaaggagt atgggctgac catgacacct gcggacaaat 7020

caccttgctt caatgaagtg acgtgggaaa atgccacctt tctgaagaga gggtttctac 7080

cagatcatca attcccattc ttgattcatc ccacaatgcc catgaaagaa attcacgaat 7140

ctatacgctg gactaaagat gcgtgcaata cccaagacca tgtgcgctct ctgtgtttat 7200

tagcttggca caatggtaag gatgaatatg aaaaatttgt gagcacaatt agatcagtcc 7260

cagttgggag agcattggca attccgaatt ttgagaattt gagaagaaat tggctcgaac 7320

tattttagat ttacagttga aagctggacc ccgccagaaa tctggtcgtg ttaatgactg 7380

gtgggggtaa atttgttata cccagag 7407

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Lys Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg

1 5 10 15

Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val

20 25 30

Trp Glu Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln

35 40 45

Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Glu Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr

50 55 60

Cys Asn Ser Arg Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Ser

65 70 75 80

Leu Val Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser

85 90 95

His Leu Met Leu Ala Ala Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly

100 105 110

Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly

115 120 125

Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asn Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp

130 135 140

Glu Glu Ala Met Glu Gln

145 150

<210> 5

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Thr Gly

1 5 10 15

Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Leu

20 25 30

Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Val Lys

35 40 45

Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val

50 55 60

Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp

65 70 75 80

Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Met Ala

85 90 95

Gln Lys Gln

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Ser Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys

1 5 10 15

Gly Leu Glu Trp Ile Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Lys Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn

35 40 45

Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Met Glu Asn Gln Ile Ala Asn Leu Glu

50 55 60

Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Met Phe Gly Asn Val

65 70 75 80

Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Phe Gln Pro Leu Tyr Ala Thr

85 90 95

Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn Tyr Met

100 105 110

Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg

115 120 125

Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg

130 135 140

Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp

145 150 155 160

Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp

165 170 175

Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln

180 185 190

Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu

195 200 205

Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala

210 215 220

Ser Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg

225 230 235 240

Arg Phe Phe Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr

245 250 255

Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu

260 265 270

Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys

275 280 285

Ala Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp

290 295 300

Thr Val Val Ser Glu Leu Val Arg Glu Tyr Ser Asn Arg Ser Ala Ile

305 310 315 320

Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln

325

<210> 7

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Pro Pro Lys Phe Arg Pro Val Arg Ile Ser Leu Asp Glu Lys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Asp Ala Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu

20 25 30

Val Arg Gln Tyr Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro

35 40 45

Thr Asn Val Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Val Met Gln Ser

50 55 60

Ile Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Leu Phe Ala Gly Phe Gln

85

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Arg Gln Ala Leu Lys Lys Pro Val Leu

1 5 10 15

Arg Thr Ala Thr Val Gln

20

<210> 9

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Val Arg

1 5 10 15

Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp

20 25 30

His Leu Ala Ile Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp

35 40 45

Val Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp

50 55 60

Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Arg Asp Val Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Gly

85 90 95

Val Ser Asp Ala Thr Leu Ile Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met

100 105 110

Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser

115 120 125

Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala

130 135 140

Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly Ile

145 150 155 160

His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg

165 170 175

Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln

180

<210> 10

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn

1 5 10 15

Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp

20 25 30

Leu Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu Thr Ser Lys Asp Pro

35 40 45

Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly

50 55 60

Asn Val Leu His Glu Pro Asp Glu Tyr Val Lys Gln Ala Ala Leu His

65 70 75 80

Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asp Ile Asn Thr Asn Lys Met Ser

85 90 95

Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu

100 105 110

His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg

115 120 125

Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Lys Asp Ile Thr Lys Met Lys Phe Tyr

130 135 140

Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp

145 150 155 160

Glu Leu Arg Pro Leu Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile

165 170 175

Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly

180 185 190

His Leu Tyr Glu Ala Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser

195 200 205

Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu

210 215 220

Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser

225 230 235 240

Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Met Val Leu Arg Asp Ile

245 250 255

Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr

260 265 270

His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro

275 280 285

Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile

290 295 300

Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp

305 310 315 320

Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro

325 330 335

Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu Ala Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly

340 345 350

Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Thr

355 360 365

Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp His Gln

370 375 380

Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu

385 390 395 400

Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Cys Asn Thr Gln Asp His Val Arg

405 410 415

Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Asp Glu Tyr Glu Lys

420 425 430

Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val Pro Val Gly Arg Ala Leu Ala Ile

435 440 445

Pro Asn Phe Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe

450 455 460

<210> 11

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtaaatttg ggcaacaatc tggcgccatc tacgttggta actacagagt ggtcaatagg 60

cacctggcca cccacaatga ctgggccaac ctggtgtggg aagacagttc tcgagacctg 120

cttgtttcgt ctaccaccgc ccagggttgc gatacgattg cccgttgtga gtgtcagaca 180

ggggtgtact attgtaactc aaggaggaaa cattacccag tcagtttctc taaacctagc 240

ctcgtcttcg tagaggccag tgagtattac cctgctagat atcaatctca cctaatgctc 300

gctgcaggcc actctgaacc tggggattgc gggggtatat tgaggtgtca gcatggtgtg 360

gttggcatag tgtccactgg aggcaacggt cttgtcggtt ttgctaacgt gagggacctc 420

ttatggttgg atgaagaagc catggaacag 450

<210> 12

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggagtatctg actatatcaa gggactcggc gacgcctttg gtactggctt tactgatgca 60

gtgtctaggg aagtggaggc cctgaaaaat tacctgattg gttccgaggg agcggtggag 120

aagatcctga agaacttggt gaaactcata tcagctctgg tcatagttat cagaagtgac 180

tacgacatgg tcacccttac cgcaactcta gctctgattg ggtgtcacgg gagcccatgg 240

gcgtggatca aagcaaagac ggcgtccatc ttaggtattc ctatggcaca gaagcag 297

<210> 13

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agtgcatctt ggcttaagaa gttcagtgat atggcgaacg ctgcaaaggg attagagtgg 60

atctccaaca aaatcagcaa atttattgat tggctcaagg aaaagatcat tccagccgca 120

aaggaaaaag tcgagtttct taataacctc aagcaactgc ccttgatgga aaaccaaatt 180

gctaacttag aacagtccgc tgcttcacaa gaagaccttg aagtcatgtt tggtaatgtg 240

tcatacctag cacacttttg tcgcaagttc cagccactct atgcaactga agcgaagaga 300

gtgtacgcct tagagaagag aatgaataat tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 360

gaacctgtat gtttgattat caggggctca ccaggaactg gcaagtcact tgccacaggt 420

ataatagcaa gagccattgc tgacaaatat cactctagtg tgtactccct tccaccagac 480

ccagatcact ttgatggata caagcaacaa gtggtgacag tcatggatga tctgtgccaa 540

aacccagatg gcaaagatat gtcattgttt tgtcaaatgg tatccactgt cgattttata 600

cccccaatgg cttcactgga agaaaaaggt gtatccttca catctaaatt tgttattgct 660

tcaactaatg ctagcaacat cattgtcccc acggtctcag actctgacgc tatccgtagg 720

agatttttca tggattgtga tatcgaagtg actgactctt ataagacaga cttaggccgc 780

ttagatgcag gtagggccgc aaagctctgc tcagagaata acactgccaa tttcaagagg 840

tgcagcccgc tagtgtgcgg taaagccatc caactgagag ataggaagtc caaagtcagg 900

tatagcgtag acactgtggt atcagaatta gttagggagt atagcaacag gtctgctata 960

gggaacacta tagaagcttt attccaa 987

<210> 14

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggcctccta aattcaggcc tgtaagaatt agtcttgatg agaaacccgc tccagatgcc 60

attagtgacc tgcttgctag tgttgatagt gaagaggtgc ggcagtactg cagagatcaa 120

ggatggataa tacctgaaac gccaaccaac gtggagcggc atctcaatag ggcagtacta 180

gtgatgcaat ccatcgctac tgtagtcgca gttgtgtccc ttgtttatgt tatctacaag 240

ctatttgctg gtttccaa 258

<210> 15

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggcgcatatt ctggagcgcc caggcaagct ctcaagaaac ctgtgttgag gacagccact 60

gttcaa 66

<210> 16

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gggcccagct tagattttgc cctgtccctc ctacgacgta acgtcaggca ggtgcaaacc 60

gaccaagggc actttaccat gcttggggta cgtgaccacc ttgctatctt acctcgtcac 120

tcgcaaccag ggaagaccat ctgggttgaa cacaagttgg tcaatgtgct tgatgctgtt 180

gagctagtgg atgaacaagg tgttaatttg gagctcacac tagtaaccct agataccaat 240

gagaagttta gagatgtcac caagttcatt ccagagaata tcagtggagt cagtgatgcc 300

acattaataa tcaacactga acacatgcca tcaatgtttg tcccggtagg agatgttgtt 360

caatatgggt tcctaaatct tagtggtaaa ccaacccaca ggaccatgat gtacaatttc 420

cctacaaagg ctggacagtg tggaggcgtg gtaacatctg tcggtaaaat cattggcatc 480

cacattggag gcaacgggcg tcaagggttt tgcgctggcc tgaagaggag ttactttgca 540

agtgagcaa 549

<210> 17

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtgaaatcc aatgggtgaa acctaacaag gagaccggca gattaaatat caatggtcca 60

acacgcacca agttagagcc cagtgtgttc catgatctgt ttgagggcaa caaggagcca 120

gcagtcctaa caagcaagga tcccagatta gaggttgact ttgagcaggc tctcttctcc 180

aagtatgtgg gtaatgtcct ccacgaacct gatgaatatg tgaagcaggc agccctccac 240

tacgcaaatc agctcaagca actggatata aacaccaata agatgagcat ggaggaagcg 300

tgctatggca cagagaacct ggaagcaatt gacctccata ctagcgcggg gtacccatac 360

agtgctttgg gcataaagaa gagggacata ctagatccta ccactaagga cataacaaaa 420

atgaagtttt acatggataa gtatggcttg gatttacctt actccaccta cgttaaagat 480

gaacttaggc ctctggacaa gatcaagaaa gggaagtccc gcttaataga agctagcagc 540

ctgaatgatt cagtgtacct cagaatgact tttggccacc tgtatgaagc attccatgca 600

aacccaggga ctgtgaccgg atcagcagtt gggtgcaatc cggatgtgtt ctggagtaaa 660

ctcccaatcc tactcccagg ctcgctattt gcctttgact attcaggcta tgatgctagt 720

cttagccccg tctggtttag ggctttggag atggtcttac gggacatcgg ctattcagag 780

gaagcagtgt cactcataga aggaataaat cacacccatc atgtgtatcg gaataaaaca 840

tattgtgttc ttggcgggat gccgtcagga tgttctggta cttccatttt caactcgatg 900

atcaacaaca tcatcattag gacgctttta atcaaaacct ttaaagggat agatctggac 960

gagttgaata tggtggccta tggagatgat gtgctggcta gttatccttt ccctattgat 1020

tgtcttgagt tagctaagac tggcaaggag tatgggctga ccatgacacc tgcggacaaa 1080

tcaccttgct tcaatgaagt gacgtgggaa aatgccacct ttctgaagag agggtttcta 1140

ccagatcatc aattcccatt cttgattcat cccacaatgc ccatgaaaga aattcacgaa 1200

tctatacgct ggactaaaga tgcgtgcaat acccaagacc atgtgcgctc tctgtgttta 1260

ttagcttggc acaatggtaa ggatgaatat gaaaaatttg tgagcacaat tagatcagtc 1320

ccagttggga gagcattggc aattccgaat tttgagaatt tgagaagaaa ttggctcgaa 1380

ctattt 1386

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cyttgtgcgc ctgtttt 17

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

attgtcacca taagcagcc 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caagyacttc tgtmwcccc 19

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cccaaagtag tcggttcc 18

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggtatcaaac caattacgtg gtcc 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aacaagcagg tctcgagaac 20

Claims

1.柯萨奇病毒A10型毒株，其特征在于，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19533。

2.权利要求1所述的柯萨奇病毒A10型毒株的如下任意一种应用：

（1）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（2）在柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；

（3）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；

（7）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；

3.一种抗体或抗血清，其特征在于，以权利要求1所述的柯萨奇病毒A10型毒株为免疫原制备得到。

4.一种产品，其特征在于，其含有以下（1）-（2）中的任意一种或多种的组合：

（1）权利要求1所述的柯萨奇病毒A10型毒株；

（2）权利要求3所述的抗体或抗血清。