CN113564131B - 柯萨奇病毒a6型毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A6型毒株及其应用。本发明提供一株柯萨奇病毒A6型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该毒株在基因型内和基因型间均具有较强的交叉中和能力，毒力较强，对小鼠具有高致病和致死能力，且具有较好的免疫原性，较高的滴度和稳定性。该毒株可用于柯萨奇病毒A6型疫苗的免疫原性评价或保护性评价，提高疫苗免疫原性评价的准确性和重复性，还可用于制备柯萨奇病毒感染动物模型，具有较好的应用前景。

Description

柯萨奇病毒A6型毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A6型毒株及其应用。

背景技术

柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6，CV-A6）是人肠道病毒的一种，能够导致手足口病。早期，肠道病毒71（Enterovirus71, EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16, CV-A16）占主要流行地位，且绝大多数的重症及死亡病例与EV-A71相关。但近年来，随着EV-A71疫苗的推广，CV-A6和CV-A10导致的发病率逐年上升。在近几年的流行病学调查中，CV-A6已经成为引起手足口病的主要病原体之一。中和抗体检测是开展CV-A6流行病学调查和疫苗免疫原性评价的关键指标之一。中和抗体效价检测的准确性与使用的检测毒株密切相关。目前世界范围内的CV-A6流行株均属于D型，分为D1、D2和D3，D3亚型又可细分为D3a和D3b型（Song Y, Zhang Y, Ji T, Gu X, Yang Q, Zhu S, Xu W, XuY, Shi Y, Huang X, Li Q, Deng H, Wang X, Yan D, Yu W, Wang S, Yu D, Xu W.Persistent circulation of Coxsackievirus A6 of genotype D3 in mainland ofChina between 2008 and 2015. Sci Rep. 2017 Jul 14;7(1):5491.），建立符合疾病流行特征的基因型标准检测毒株，固定检测用毒株代次，提高疫苗中和抗体检测的准确性和重复性，对于保障疫苗临床前和临床试验的免疫原性评价具有重要意义。目前，尚未有柯萨奇病毒A6型的标准检测毒株，也未有用于疫苗保护性评价的攻击毒株。

另外，由于小鼠对临床分离获得的毒株易感性普遍较差，只有个别临床分离病毒能够使小鼠感染，多数均为鼠适应突变病毒株。Yang Lisheng等（Yang Lisheng, MaoQunying, Li Shuxuan, et al. A neonatal mouse model for the evaluation ofantibodies and vaccines against coxsackievirus A6[J]. Antiviral Research.2016,134:50-57.）发表了关于CV-A6疫苗和抗体评价的乳鼠模型。CV-A6感染1、3、7、14、和21日龄BalB/c乳鼠，通过腹腔注射，每只乳鼠约注射10⁵TCID₅₀，观察20天。结果显示只有1日龄乳鼠4天内100%死亡，3日龄甚至更大日龄乳鼠均无临床症状。故而以1日龄BalB/c乳鼠作为动物模型，腹腔注射100μl，观察20天，LD₅₀为1.33*10³TCID₅₀/只。因此，筛选可用于柯萨奇病毒A6型感染动物模型构建的毒株具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种柯萨奇病毒A6型毒株。

本发明的第二目的是提供与该柯萨奇病毒A6型毒株相关的生物材料。

本发明的第三目的是提供含有该柯萨奇病毒A6型毒株或其生物材料的产品。

本发明的第四目的是提供上述毒株、生物材料、产品的用途。

具体地，本发明提供以下技术方案：

首先，本发明提供一种柯萨奇病毒A6型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在所述柯萨奇病毒A6型毒株基因组中，以上所述的P1结构蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

具体地，本发明提供的柯萨奇病毒A6型毒株含有P1结构蛋白以及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；其中，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 4、5、6、7、8、9和10所示。

本发明提供的柯萨奇病毒A6型毒株的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO. 4、5、6、7、8、9和10所示的非结构蛋白。

本发明提供序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白与序列如SEQ ID NO.4、5、6、7、8、9和10所示的非结构蛋白组成的融合蛋白。

优选地，所述柯萨奇病毒A6型毒株的基因组中，P1结构蛋白的编码基因序列如SEQID NO.2所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ ID NO. 11、12、13、14、15、16和17所示。

以上所述的结构蛋白和非结构蛋白的编码基因在所述柯萨奇病毒A6型毒株的基因组上的排列顺序为（5’-3’）：P1结构蛋白编码基因、2A蛋白编码基因、2B蛋白编码基因、2C蛋白编码基因、3A蛋白编码基因、3B蛋白编码基因、3C蛋白编码基因、3D蛋白编码基因。

本发明提供由如SEQ ID NO.2所示的基因以及如SEQ ID NO. 11、12、13、14、15、16和17所示的基因顺次连接组成的重组核酸分子。

以上所述的柯萨奇病毒A6型毒株的基因组序列还包括5’-UTR序列和3’-UTR序列，5’-UTR序列如SEQ ID NO.18所示，3’-UTR序列如SEQ ID NO.19所示。

进一步优选地，所述柯萨奇病毒A6型毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示。

具体地，本发明提供柯萨奇病毒A6型毒株R01170631，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型，保藏编号为CGMCC No.19532。

柯萨奇病毒A6型毒株R01170631的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO. 4、5、6、7、8、9和10所示的非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，其基因组序列如SEQ ID NO.3所示，亚型为D3a型。

本发明提供的上述柯萨奇病毒A6型毒株具有较强的毒力，在基因型内和基因型间具有较好的交叉中和能力，免疫原性好，能够以RD等细胞作为基质细胞进行快速繁殖。

进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒A6型相关的生物材料，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白；

（2）编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白的核酸分子；

（3）序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示的核酸分子；

（4）含有（2）或（3）中所述核酸分子的表达盒；

（5）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组载体；

（6）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组微生物；

（7）含有（2）或（3）中所述核酸分子的细胞系；

（8）检测（2）或（3）中所述核酸分子的引物或探针。

以上（2）或（3）中所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。

以上（4）中所述的表达盒为在（2）或（3）中所述的核酸分子的上游、下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。

以上（5）中所述的重组载体为携带（2）或（3）中所述的核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。

以上（6）中所述的微生物可为细菌或病毒。

以上（7）中所述的细胞系为动物细胞系，所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于RD、Vero、MRC-5细胞等。

以上（8）中所述的引物、探针为能够与（2）或（3）中所述核酸分子结合并进行PCR扩增的寡核苷酸。

本发明还提供所述柯萨奇病毒A6型毒株的病毒样颗粒（VLPs），其含有选自P1结构蛋白、非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D中的任意一种或多种；所述P1结构蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的序列，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D分别具有如SEQ ID NO.4、5、6、7、8、9和10所示的序列。

以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述结构蛋白、非结构蛋白的编码基因。

本发明还提供含有以上所述的柯萨奇病毒A6型毒株、生物材料或病毒样颗粒的免疫原性组合物。

所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒A6型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒A6型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

进一步地，本发明提供柯萨奇病毒A6型毒株或所述的生物材料或所述病毒样颗粒的如下任意一种应用：

（1）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（2）在柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；

（3）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（5）在预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物的筛选或药效评价中的应用；

（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；

（7）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；

（8）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的疫苗中的应用；

（9）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物中的应用；

（10）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗体中的应用；

（11）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗血清中的应用。

以上（1）中，所述应用具体为作为疫苗免疫原性评价的标准检测毒株。

以上（3）中，所述应用具体为作为用于疫苗保护性评价的攻击毒株。

以上（4）中，所述动物模型优选为鼠模型。

以上（1）-（11）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒A6型毒株。

以上（5）和（8）-（11）中，所述柯萨奇病毒引起疾病优选为手足口病。

本发明提供一种抗体或抗血清，其为以所述柯萨奇病毒A6型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原制备得到。

本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，该方法包括：以所述柯萨奇病毒A6型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原免疫动物，经分离获得抗柯萨奇病毒A6型的抗体或抗血清。

本发明提供一种产品，其含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：

（1）所述柯萨奇病毒A6型毒株；

（2）所述生物材料；

（3）所述病毒样颗粒；

（4）所述柯萨奇病毒A6型毒株的抗体或抗血清。

以上所述的产品优选为用于柯萨奇病毒A6型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒A6型感染动物模型构建的产品，或者为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染的产品。

所述产品可为试剂、试剂盒、疫苗或药物。

作为本发明的一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A6型疫苗免疫原性或保护性评价的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A6型毒株。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A6型感染动物模型构建的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A6型毒株。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于预防柯萨奇病毒A6型感染的疫苗，其含有所述柯萨奇病毒A6型毒株。

本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。

优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒A6型毒株被灭活。所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒A6型毒株在细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活、纯化后获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。

作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于治疗柯萨奇病毒A6型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒A6型毒株的抗体或抗血清。

本发明还提供以上所述的产品在柯萨奇病毒A6型疫苗的免疫原性评价或保护性评价、制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用。

本发明还提供以上所述的产品在诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一株在柯萨奇病毒A6型的D3基因型内和不同基因型间均具有较强的交叉中和能力、毒力较强（腹腔注射100CCID₅₀/0.05ml病毒液可使1日龄乳鼠6天内100%死亡）、对小鼠具有高致病和致死能力、且具有较好的免疫原性、较高的滴度和稳定性的柯萨奇病毒A6型毒株。该毒株可用于柯萨奇病毒A6型疫苗的免疫原性评价或保护性评价，提高疫苗免疫原性评价的准确性和重复性，还可用于制备柯萨奇病毒感染动物模型以及用于柯萨奇病毒A6型疫苗、抗体、抗血清的制备，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中型内交叉中和能力的检测结果。

图2为本发明实施例5中攻击毒株筛选的存活曲线。

图3为本发明实施例5中LD₅₀确定的存活曲线。

具体实施方式

本发明中，柯萨奇病毒A6型毒株的筛选和性能检测过程大致概括如下：

（1）对已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A6型阳性的咽肛试子样本，在RD细胞上进行分离，并经过3次传代适应性培养，对收获的病毒液进行初步的鉴定，主要包括病毒滴定、分子生物学鉴定（病毒确定，核酸序列测定分析亚型）、免疫原性试验、以及交叉中和能力检测、基因组测序等，初步获得合适的中和抗体检测毒株和攻击毒株（初筛毒株）。

（2）初筛毒株分别进行3次蚀斑纯化，在RD细胞上进行3次传代适应性培养（P4代），对收获的病毒液进行检定，病毒液检定主要包括病毒滴定。根据病毒检定结果结合病毒病变进程、病变融合度，建立原始种子，并进行相关评价研究和传代稳定性研究。评价研究主要包括病毒滴定、免疫原性研究、致病性研究及交叉中和能力的研究等。传代稳定性研究主要是将病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中的第5、10、15代病毒液进行病毒滴定、基因测序检测（基因组测序分析）。根据以上研究结果选择交叉保护范围广、免疫原性好、遗传稳定性好的毒株一株作为中和抗体检测毒株；遗传稳定性好、致病性强的毒株一株作为疫苗保护性评价的攻击毒株。

（3）中和抗体检测候选毒株确立后，对其进行病毒滴定。然后对其进行滴度标定及专属性评价。确定该检测毒株的标示滴度，从而确定中和试验时检测滴度株的稀释倍数。专属性评价旨在验证该检测毒株只对CV-A6型免疫血清有特异性中和能力，而对其他肠道病毒如EV-A71、CV-A10及CV-A16免疫血清无交叉反应。从而证明该毒株适用于柯萨奇病毒A6型免疫血清的中和抗体效价的检测。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中，柯萨奇病毒A10型毒株R06030451已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCC No.19533。

柯萨奇病毒A16型毒株R00880662已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A16型，保藏编号为CGMCCNo.19534。

实施例1 柯萨奇病毒A6型毒株的初步筛选

（一）临床样本的处理

在生物安全柜中将每一份样品取0.25 ml加入离心管中。加入2.5μl青链霉素溶液，混匀，4 ℃放置过夜。2000 rpm 离心20 min，上清存于2~8℃以备接种。

（二）病毒分离培养

取长至80-90%密度的健康无污染的RD细胞，弃去细胞培养液。 将处理好的样品0.2ml/孔接种于6孔板内，每一份样品接种1孔，同时加入0.2 ml/孔病毒培养液，置于35℃、5%CO₂培养箱中吸附1h。之后每孔补加3.5ml病毒培养液，置于35℃、5%CO₂培养箱中静置培养。设置2孔生长状态良好且未接种标本的细胞作为细胞对照。

（三）病毒收获及适应性传代培养

每天观察并记录接种后细胞特征性肠道病毒致细胞病变效应（CPE）情况。如果出现CPE且CPE程度达+++以上时，冻融一次，收获细胞培养物，用0.2μm针头滤器过滤，0.2ml/支分装病毒液，于-60℃冰箱保存，取病毒液继续传代三次，每代冻融一次，2000 rpm、4℃离心10 min，上清分装，于-60℃冰箱保存，做好标记和记录。如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取阳性分离物传三代，继续观察。

（四）病毒鉴定

对获得的病毒分离阳性株的第3代病毒液进行病毒鉴定试验，主要包括病毒滴定、分子生物学鉴定（病毒鉴定及病毒基因型分型）及免疫原性试验、交叉中和能力的研究、基因组测序等。

1、病毒滴定

（1）检测方法：将经三次传代的病毒液用无血清的培养液在离心管中10倍梯度稀释，从10^-1~10^-8。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μl RD细胞悬液（1.5×10⁵个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加稀释液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃，5%CO₂培养箱中静置培养，第7天判断结果。每个样品进行3次重复。

（2）病毒滴度计算：按Behrens-Karber公式计算LgCCID₅₀。

Lg CCID₅₀ = L-d (S-0.5)，其中：

L = 实验中使用的病毒的最低稀释度的对数值；

d = 稀释梯度的对数值；

S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。

具体参见中华人民共和国卫生部．手足口病预防控制指南(2009版)．[EB/OL]．(2009-06-04) http://www.gov.cn/gzdt/2009-06/04/content_1332078.htm。

2、分子生物学鉴定

采用RT-PCR法鉴定CV-A6病毒，将CV-A6阳性的病毒株进行VP1核酸序列测定，并根据VP1核苷酸序列进行CV-A6基因型分型，具体如下：

（1）RT-PCR法鉴定CV-A6病毒

提取病毒核酸，应用EV组肠道病毒核酸检测通用引物及CV-A6核酸检测引物进行CV-A6病毒鉴定。

使用的扩增引物如下：

A、人肠道病毒核酸检测通用引物序列（产物长度400-500bp）

59F（SEQ ID NO.20）: 5’-CYTTGTGCGCCTGTTTT-3’；

588R（SEQ ID NO.21）: 5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’；

153F（SEQ ID NO.22）: 5’-CAAGYACTTCTGTMWCCCC-3’；

541R（SEQ ID NO.23）: 5’-CCCAAAGTAGTCGGTTCC-3’。

B、CV-A6 核酸检测引物序列（产物长度 1kb）

CA6-VP1-FI（SEQ ID NO.24）: 5’-CCCCCACTGAGGCTAACAT-3’；

CA6-VP1-RI（SEQ ID NO.25）: 5’-CTCGTGAGCTACTTTCCC-3’。

以上引物中，Y代表C/T，M代表A/C，W代表A/T。

病毒核酸提取方法如下：

按照说明书中的加入顺序和用量向96 孔板添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸；将提取好的核酸分装至 EP 管中，标记样品信息和日期，保存至-60℃冰箱。

PCR扩增方法如下：

① HEV- 5’UTR通用引物PCR扩增

第一轮PCR扩增：

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表1），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表2）。

表1 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增反应体系

表2 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增程序

第二轮PCR扩增：

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表3），然后加入0.4μl第一轮PCR扩增产物为模板，放入PCR仪运行程序（见表4）。

表3 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增反应体系

表4 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增程序

② CV-A6 VP1特异性引物PCR扩增

配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表5），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表6）。

表5 VP1特异性引物PCR扩增反应体系

表6 VP1特异性引物PCR扩增程序

③用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

④结果判断

HEV-5’UTR通用引物扩增阳性样本应能观察到大小为400bp的目的条带，VP1特异性引物扩增阳性样本应能观察到大小为1kb的目的条带。标本的实验室诊断结果根据表7进行判断。其中，HEV（－）代表HEV- 5’UTR通用引物未扩增出目的条带，HEV（＋）代表HEV- 5’UTR通用引物扩增出目的条带；CV-A6（－）代表CV-A6 VP1特异性引物未扩增出目的条带，CV-A6（＋）代表CV-A6 VP1特异性引物扩增出目的条带。

表7 实验室诊断结果判断

（2）CV-A6基因型分型

将鉴定为CV-A6阳性的病毒株，根据VP1核酸序列进行CV-A6基因型分型。结果显示均为D3a型。

3、免疫原性研究

挑选滴度高的毒株，应用NIH小鼠进行免疫原性分析。

将15株第三代毒株的病毒液制备成相同病毒滴度（6.0 LgCCID₅₀/ml），免疫NIH小鼠（SPF级，18-22g，雌性），各毒株组10只，分别编号。按照 0 、14天两针免疫程序，分别腹腔注射灭活病毒500 μl/只，同时设置培养基对照组，分别于一免、二免后 14天采血，分离血清。采用微量细胞病变法测定血清抗特异性中和抗体效价，分析阳转率及中和抗体水平。

中和抗体效价测定步骤：将待测血清按1:8稀释，经56 ℃灭活30 min，加至96孔板中，0.05ml/孔，作2倍系列稀释后，分别与100CCID₅₀的CV-A6病毒悬液于37℃中和1~3h；加入1.5×10⁵个/ml的RD细胞悬液，0.1ml/孔，置35±0.5℃，5%CO2培养箱中培养7d。将能抑制50%细胞病变的最高稀释度定为CV-A6抗体的中和效价，并以稀释倍数的倒数表示。每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32~320 CCID₅₀/孔时试验判为成立。以中和效价≥8判为CV-A6 中和抗体阳性，阴性样品的几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）均按4计算。

试验结果显示：一免阳转率即可达到100%，一免中和抗体效价在1:66~1:1674之间，二免中和抗体效价在1:1879~1:10572之间，其中编号为R117的毒株的中和抗体效价可达1：10572，表明R117毒株为优势毒株。

4、交叉中和能力研究

将毒株与毒株免疫血清进行交叉中和能力研究，以毒株对全部待检血清的中和抗体效价倍数差（毒株对全部待检血清的最大中和抗体效价MAX和最小中和抗体效价MIN的比值）反映交叉中和能力。倍数差低代表该毒株具有较均一的交叉中和检测能力，筛选中和抗体GMT高且倍数差较低的毒株，作为检测候选毒株。

（1）型内交叉中和研究

挑选免疫原性好的6株D3a型初筛毒株（R260、R276、R117、R267、R275、R262）与各毒株分别免疫获得的6份免疫血清进行型内交叉中和研究，免疫血清为2次免疫小鼠14天后采集的血清。以毒株对全部待检血清的中和抗体效价GMT和倍数差（MAX/MIN）反映交叉中和能力。结果如图1所示，结果显示，编号为R117的初筛毒株检测各免疫血清的中和抗体效价GMT为1:1690，倍数差为3.0。中和抗体效价测定的具体步骤参见上述血清抗特异性中和抗体效价的测定方法。

（2）型间交叉中和研究

对上述（1）中测试的免疫原性好的6株D3a型初筛毒株进行型间交叉中和能力检测，具体如下：取包括1株A基因型（Gdula，Genbank：AY421764，原型株）、1株D1 (CA6-2007-00141，Genbank ：KR706309）、14株D3基因型株（2014-2019年中国大陆临床患者分离获得的毒株）在内的16个CV-A6毒株，将全部待检血清分别与16株CV-A6病毒株进行交叉中和检测（交叉中和检测委托中国食品药品检定研究院进行，毒株及其对应免疫血清均来自中国食品药品检定研究院并用于测试），免疫血清为各毒株分别进行2次免疫，于二免14天后采集的小鼠血清。以血清对全部毒株的中和抗体效价倍数差反映交叉中和能力。

结果显示，6份毒株检测血清中和抗体效价GMT的倍数差均值在1.87~6.88之间，其中R117毒株的倍数差最小，仅为1.87，表明R117毒株对现有的柯萨奇病毒A、D基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。

实施例2蚀斑纯化

将实施例1交叉中和能力研究的6株免疫原性好的初筛毒株的病毒稀释液接种于6孔细胞培养板中进行纯化，具体方法如下：

（1）细胞准备：取已长成单层的RD细胞经洗涤、消化后接种于6孔细胞培养板中，7×10⁵个细胞/孔，置于5%CO₂ 培养箱中37±1℃静置培养至长成致密单层。弃去原培养液，清洗细胞表面，洗去残留的牛血清与死细胞。

（2）病毒准备：将病毒液进行适当倍数的稀释。

（3）病毒吸附：将稀释好的病毒液进行接种，0.4ml/孔，同时设置病毒液对照和细胞对照， 置于5%CO₂ 培养箱中35℃吸附1~2小时，期间每隔15~20min轻轻晃动细胞板数次，使其接触整个细胞表面。

（4）覆盖与培养：吸附完毕后，弃去病毒液，病毒对照和细胞对照孔，加入病毒维持液3ml/孔。其余各孔沿壁缓慢加入琼脂糖和病毒维持液混合物，每孔3ml，室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层，把加入琼脂糖的培养板倒置于5% CO2培养箱内37±1℃培养，每天观察并记录，蚀斑情况（形态、大小及数量）及病毒对照病变情况。

（5）蚀斑培养：将单个蚀斑，用200μl带滤芯的枪头挑取至含有100μl病毒维持液的1.5ml EP管中，反复吹打混匀，接种至细胞已长至单层的6孔细胞培养板中，置5%CO2培养箱中37±1℃培养，每天观察CPE。待细胞出现CPE达75%时，收集上清液，于-60℃冰箱中保存。此时病毒代次为P2代。

（6）鉴定及分析：将P2代病毒进行病毒滴度检测。

（7）选择滴度较高的毒株进行第二次和第三次蚀斑纯化，操作同上。

实施例3检测候选毒株的确定

将经三次蚀斑纯化的毒株扩增至第5代建立原始种子，并对其进行相关检定研究以及传代稳定性研究（检测方法同实施例1），根据传代稳定性研究结果选择交叉保护范围广、遗传稳定性好、滴度高的毒株作为检测候选毒株。

原始种子毒株的检定研究主要包括免疫原性、病毒滴定、基因组测序分析、交叉中和能力研究。

传代稳定性研究主要是将原始种子病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定、基因组序列分析。

毒株检定研究结果显示，编号为R01170631的毒株（对应的初筛毒株为R117）的免疫原性良好（一免后血清阳转率即可达到90%以上，二免后血清阳转率为100%，二免后中和抗体效价GMT值为1:8039），滴度为6.94LgCCID₅₀/ml，R01170631的基因组序列与其对应的初筛毒株R117一致。型内交叉中和研究结果显示，编号为R01170631的毒株检测免疫血清中和抗体的GMT值为1:2767（1: 602~1: 2767），且倍数差为2（表8）。

表8 型内交叉中和结果汇总

表8中的毒株R01170631、R02620332、R02750122、R02760144、R02760155为将实施例1的初筛毒株R117、R262、R275、R276进行多次蚀斑纯化获得的原始种子，其中，R01170631为初筛毒株R117的原始种子。

型间交叉中和结果显示，编号为R01170631的毒株的血清对全部毒株的中和抗体效价倍数差最小，与实施例1中检测的初筛毒株R117毒株相当，表明编号为R01170631的毒株对现有的柯萨奇病毒A、D基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。

传代稳定性研究表明编号为R01170631的毒株连续传15代，滴度趋势稳定（6.94~8.12LgCCID₅₀/ml之间），基因组序列一致，表明该毒株的遗传稳定性较高。

上述编号为R01170631的毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型，保藏编号为CGMCC No.19532。R01170631毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示，其中，P1蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO.2所示，P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4、5、6、7、8、9和10所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ ID NO. 11、12、13、14、15、16和17所示。

实施例4 检测毒株滴度标定和专属性评价

由3名实验员，分别独立进行9次滴度测定，结果表明，滴度均值为7.852LgCCID₅₀/ml（95%CI：7.808-7.895），符合正态分布。

专属性研究方法参见实施例1中的型内交叉中和能力检测方法，结果表明，编号为R01170631的毒株与同为肠道病毒的柯萨奇病毒A16型毒株R00880662血清（保藏编号为CGMCC No.19534）、肠道病毒71型血清和柯萨奇病毒A10型毒株R06030451血清（保藏编号为CGMCC No.19533）均无交叉中和现象。

实施例5致病性研究

根据实施例1中的免疫原性检测结果，选择2个毒株进行致病性初步研究，根据结果挑选致病性最强的毒株进行LD₅₀研究。

初步研究将取冻存的毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液稀释至10⁵CCID₅₀/0.05ml，分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个毒株1窝（5-10只），并记录实际小鼠数量，以含2%FBS的病毒维持液（MEM培养液）为对照组。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况。结果显示，同样的攻毒剂量，编号R01170631的毒株攻毒后第3天使乳鼠100%死亡，另外1个毒株（R02620332）于攻毒后第5天使乳鼠100%死亡，见图2。结果表明，编号R01170631的毒株具有更强的毒力。因此选择该毒株作为攻击毒株，进行LD₅₀研究。

取冻存的毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液做10倍系列稀释，至10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2 CCID₅₀/0.05ml五个浓度。将每个稀释度病毒液分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个稀释度1窝（5-10只），并记录实际小鼠数量，以含2%FBS的病毒维持液为对照组，第四天观察对照组有无非特异性死亡。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况，按照Reed-Muench法计算病毒的累计死亡率和LD₅₀值。

结果显示，对照组21天存活率100%，试验成立；10² CCID₅₀/只攻毒组的乳鼠6天全部死亡，而10 CCID₅₀/只攻毒组的的乳鼠9天全部死亡，而1 CCID₅₀/只攻毒组的死亡率为16.7%。按Reed-muench法计算，以稀释度为标准，LD₅₀为1.4×10^-7；以滴度为标准，LD₅₀为0.64CCID₅₀/ml，存活曲线见图3。以上结果表明编号R01170631的毒株为致病力强的毒株，可以用于柯萨奇病毒A6相关疫苗保护性评价。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 柯萨奇病毒A6型毒株及其应用

<130> KHP211120533.8YS

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 870

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Glu Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Lys

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Arg Gln Asp Phe Ala Gln

35 40 45

Asp Pro Ala Lys Phe Thr Arg Pro Val Leu Asp Thr Ile Arg Glu Val

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Gln Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Ser Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Met His Ile Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Ala Ile Pro Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Pro Ala Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Gly Gln Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro

210 215 220

Gly Lys Asn Gly Gln Glu Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Pro Leu Ser Gln Ala Leu Val Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu

245 250 255

Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu

260 265 270

Pro Phe Asp Ser Ala Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Val Val Ile

275 280 285

Pro Ile Ser Pro Leu Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro

290 295 300

Ile Thr Leu Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg

305 310 315 320

Gln Ala Ile Lys Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn

325 330 335

Gln Phe Leu Thr Thr Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly

340 345 350

Phe Glu Pro Thr Pro Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu

355 360 365

Leu Asp Leu Cys Gln Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Gly Val Ser Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn

385 390 395 400

Asn Val Asp Gln Leu Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn

405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala

450 455 460

Gln Pro Ala Thr Arg Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Phe Arg Ala Val Lys Ile Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr

500 505 510

Ala Thr Gly Ile Val Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro

515 520 525

Pro Asp Thr Pro Thr Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln

530 535 540

Lys Asn Phe Thr Leu Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Gln Gln

545 550 555 560

Thr Ala Glu Tyr Gln Asn Asp Pro Ile Thr Asn Ala Val Glu Ser Ala

565 570 575

Val Ser Ala Leu Ala Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn

580 585 590

Thr Val Ala Ser Thr His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu

595 600 605

Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu

610 615 620

Ile Glu Thr Arg Cys Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser

625 630 635 640

Val Glu His Phe Tyr Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val

645 650 655

Lys Asp Ser Gly Thr Ser Leu Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp

660 665 670

Val Met Gly Phe Val Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr

675 680 685

Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asn Ser

690 695 700

Thr Thr Pro Gly Met Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala

705 710 715 720

Pro Lys Pro Asp Ser Arg Lys Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn

725 730 735

Pro Ser Val Phe Ala Lys Leu Ser Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val

740 745 750

Pro Phe Met Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr

755 760 765

Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln

770 775 780

Cys Pro Asn Asn Met Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu

785 790 795 800

Ser Thr Thr Gly Lys Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys

805 810 815

His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser Gln Ala Tyr Met

820 825 830

Val Lys Asn Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Thr Asn Thr Ala Ala

835 840 845

Asp Arg Ala Ser Ile Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala

850 855 860

Asn Pro Gln Arg Thr Ser

865 870

<210> 2

<211> 2610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcgccc aagtttcaac agaaaaatct gggtcgcatg agacaaagaa tgtagcgacc 60

gaagggtcta ctatcaattt caccaacatc aattactata aggattccta cgcagcgtca 120

gctagtagac aggactttgc acaagatccc gcaaagttca cacgccctgt cttggatacc 180

atcagagagg ttgcagcccc gctgcaatcc ccttctgttg aggcgtgcgg ttatagtgac 240

cgggttgcac agttaactgt gggtaactca accattacta cccaagaagc agccaacatt 300

gtattgagtt acggagagtg gccagaatat tgtccctcca cggatgctac agctgtggac 360

aaacctactc gccctgatgt gtcagtgaat aggttctaca cactgtcaac taagagttgg 420

aagacagaat ctactggctg gtactggaaa ttccctgatg tgctaaatga cacaggagtg 480

tttggtcaaa acgcccaatt ccactacttg taccgctcgg gtttctgcat gcacattcag 540

tgcaatgcaa gcaagttcca tcagggggcc ctcttagtgg ctgcaatccc cgaatttgtg 600

gtcgctgcaa gcagccctgc cacaaagccc aatggacaag ggttgtaccc agatttcgct 660

cacactaacc caggtaaaaa tggtcaagag tttagagatc cttatgtctt ggatgctggt 720

gttcccctaa gccaagcact ggtttacccc catcaatgga tcaatctacg aactaacaac 780

tgcgcgacca ttattatgcc atatgtcaat gcgcttccat ttgattcagc gcttaaccac 840

tcaaattttg gattggttgt gatccctatc agccccttga aatattgtaa tggagctacc 900

acagaggtgc cgatcacact aactattgcc ccacttaact cggagtttag cggcctccga 960

caagcgataa aacaagggtt tcccacagag ctcaagcctg gtaccaatca atttctcaca 1020

actgatgacg ggacgtcccc accaatacta cccggttttg aaccaactcc attgatacac 1080

attcctggtg agttcacctc tttgttagac ttgtgtcaaa tagaaaccat actagaagtc 1140

aacaatacca ctggcaccac tggagtcagt agattactaa tccccgttcg agcacaaaac 1200

aatgtggacc agttgtgcgc atcattccag gtagaccctg ggcgcaatgg cccgtggcaa 1260

tccacaatgg tcggtcagat ctgcaggtat tacactcagt ggtcaggttc ccttaaggta 1320

acctttatgt tcacaggttc ttttatggct acagggaaaa tgctgatagc ctacacgcca 1380

cctggtagtg ctcagcccgc tacaagggaa gcagcaatgc ttgggactca tatagtgtgg 1440

gattttggtt tgcaatcatc ggttaccctg gttatacctt ggattagtaa cacccatttc 1500

agagcagtta agatcggagg ggtatacgac tattacgcaa ccgggatcgt caccatttgg 1560

taccaaacca actttgtagt gccaccagac acccccactg aggctaacat tatagctctt 1620

ggagcagcac agaaaaactt taccctaaag ttgtgtaagg acactgacga gattcagcaa 1680

acagcagagt accaaaatga tcccattaca aatgcagtgg aaagcgctgt gagtgcgctt 1740

gctgacacca caatatcccg ggtgaccgcg gccaacactg tagctagcac ccactccctg 1800

ggaacagggc gtgtaccagc attgcaagcc gcagaaacgg gagcaagctc taatgctagt 1860

gatgagaacc ttattgagac ccgctgtgtg atgaatcgaa acggggttaa tgaggcgagt 1920

gtggaacatt tctactctcg tgcagggctg gtaggagttg tggaggtgaa ggactcgggc 1980

actagcctgg atgggtatac agtttggccc atagatgtga tgggcttcgt gcaacagcgg 2040

cgcaagctag agctgtcaac atatatgcgc tttgatgccg agttcacttt tgtgtccaac 2100

cttaataaca gcacgacgcc cggaatgctg ctgcagtata tgtatgtgcc accaggggcc 2160

cctaagccag atagcaggaa gtcatatcaa tggcagactg ctaccaaccc atcggtattc 2220

gcaaaattga gtgatccacc cccccaggta tctgtcccgt tcatgtcgcc agcaacagct 2280

taccagtggt tttatgatgg ttaccctaca tttggcgaac acaagcaagc taccaatttg 2340

caatatgggc agtgtccgaa taacatgatg ggccattttg ccatccgaac agtcagtgaa 2400

tctaccaccg ggaaaaacgt ccacgttcgg gtgtacatga gaattaagca cgtgagagct 2460

tgggtaccta gaccccttcg atcccaagct tatatggtca aaaactaccc gacatacagc 2520

caaacaataa caaacactgc agctgaccgt gcaagcataa ccactacgga ttatgaaggc 2580

ggggtaccag caaacccaca aaggacatct 2610

<210> 3

<211> 7434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaaaacagc ctgtgggttg tacccaccca cagggcccac tgggcgctag cacactgatt 60

ctatggaatc tttgtgcgcc tgttttataa cccctttccc aaaactgtaa tttagaagaa 120

tattacacta ccgatcaata gtgggcatgg cgcgccagcc atgtctagat caagcacttc 180

tgtctccccg gattgagtat caatagactg ctagcgcggt tgaaggagaa aacgtccgtt 240

acccggctaa ctacttcgag aaacttagta gtaccattga agctgcagag cgtttcgctc 300

agcactcccc cagtgtagat caggtcgatg agtcactgca ctccccacgg gcgaccgtgg 360

cagtggctgc gttggcggcc tgcctatggg gcaacccata ggacgctcta aagtggacat 420

ggtgcgaaga gtctattgag ctagttagta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatccc 480

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cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttattc ttatactggc tgcttatggt 600

gacaattgag agattgttac catatagcta ttggattggc catccagtga caaacagagc 660

tttgatatac ttgttcgtgg gtttcgttcc actcaccagt cgtacagttt atactctaaa 720

gtacattctg actttgaaca atagaaaatg ggcgcccaag tttcaacaga aaaatctggg 780

tcgcatgaga caaagaatgt agcgaccgaa gggtctacta tcaatttcac caacatcaat 840

tactataagg attcctacgc agcgtcagct agtagacagg actttgcaca agatcccgca 900

aagttcacac gccctgtctt ggataccatc agagaggttg cagccccgct gcaatcccct 960

tctgttgagg cgtgcggtta tagtgaccgg gttgcacagt taactgtggg taactcaacc 1020

attactaccc aagaagcagc caacattgta ttgagttacg gagagtggcc agaatattgt 1080

ccctccacgg atgctacagc tgtggacaaa cctactcgcc ctgatgtgtc agtgaatagg 1140

ttctacacac tgtcaactaa gagttggaag acagaatcta ctggctggta ctggaaattc 1200

cctgatgtgc taaatgacac aggagtgttt ggtcaaaacg cccaattcca ctacttgtac 1260

cgctcgggtt tctgcatgca cattcagtgc aatgcaagca agttccatca gggggccctc 1320

ttagtggctg caatccccga atttgtggtc gctgcaagca gccctgccac aaagcccaat 1380

ggacaagggt tgtacccaga tttcgctcac actaacccag gtaaaaatgg tcaagagttt 1440

agagatcctt atgtcttgga tgctggtgtt cccctaagcc aagcactggt ttacccccat 1500

caatggatca atctacgaac taacaactgc gcgaccatta ttatgccata tgtcaatgcg 1560

cttccatttg attcagcgct taaccactca aattttggat tggttgtgat ccctatcagc 1620

cccttgaaat attgtaatgg agctaccaca gaggtgccga tcacactaac tattgcccca 1680

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aagcctggta ccaatcaatt tctcacaact gatgacggga cgtccccacc aatactaccc 1800

ggttttgaac caactccatt gatacacatt cctggtgagt tcacctcttt gttagacttg 1860

tgtcaaatag aaaccatact agaagtcaac aataccactg gcaccactgg agtcagtaga 1920

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gaccctgggc gcaatggccc gtggcaatcc acaatggtcg gtcagatctg caggtattac 2040

actcagtggt caggttccct taaggtaacc tttatgttca caggttcttt tatggctaca 2100

gggaaaatgc tgatagccta cacgccacct ggtagtgctc agcccgctac aagggaagca 2160

gcaatgcttg ggactcatat agtgtgggat tttggtttgc aatcatcggt taccctggtt 2220

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tacgcaaccg ggatcgtcac catttggtac caaaccaact ttgtagtgcc accagacacc 2340

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gcagtggaaa gcgctgtgag tgcgcttgct gacaccacaa tatcccgggt gaccgcggcc 2520

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gaaacgggag caagctctaa tgctagtgat gagaacctta ttgagacccg ctgtgtgatg 2640

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cagtatatgt atgtgccacc aggggcccct aagccagata gcaggaagtc atatcaatgg 2940

cagactgcta ccaacccatc ggtattcgca aaattgagtg atccaccccc ccaggtatct 3000

gtcccgttca tgtcgccagc aacagcttac cagtggtttt atgatggtta ccctacattt 3060

ggcgaacaca agcaagctac caatttgcaa tatgggcagt gtccgaataa catgatgggc 3120

cattttgcca tccgaacagt cagtgaatct accaccggga aaaacgtcca cgttcgggtg 3180

tacatgagaa ttaagcacgt gagagcttgg gtacctagac cccttcgatc ccaagcttat 3240

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agcataacca ctacggatta tgaaggcggg gtaccagcaa acccacaaag gacatctggt 3360

aagtttggtc aacaatccgg ggctatctat gtaggtaact tcagagtggt aaaccgacat 3420

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gtgtcctcca ccactgctca gggatgtgat accattgccc gatgtgattg tcaaacagga 3540

gtgtattact gcaactctaa aaggaaacac tacccggtca gtttttctaa gcccggcctc 3600

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aagggacatt ctgaacccgg ggactgcggt ggcattctta ggtgccaaca tggcgtgatt 3720

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tggttggatg aagaagctat ggaacagggt gtgtcagatt acatcaaagg gctcggtgac 3840

gcatttggaa ctggcttcac tgatgcagtg gctagggagg tggaggctct taagaattac 3900

cttataggat ctgaaggggc tgttgaaaag atcttgaaga atttaattaa gctgatctca 3960

gcattagtca tagtgatcag gagtgattat gacatggtaa ctctcacagc gaccttggca 4020

ctcatagggt gccatggcag cccctgggcg tggatcaagg ctaagacagc atccatttta 4080

ggcatcccta tcgcccagaa gcagagtgcg tcatggctca agaagtttaa cgacatggcc 4140

aatgccgcca agggatttga gtggatttcc aataagatca gcaaattcat tgattggctt 4200

aaagagaaaa ttataccagc agctagagag aaggttgaat ttttgaacaa cctaaaacaa 4260

ctgccattgt tggagaacca aatctcaaac ctggagcaat ccgctgcttc gcaagaagac 4320

cttgaggcaa tgtttgggaa cgtatcgtat ctcgctcact tctgccgcaa ataccaacca 4380

ctttatgcta cagaagccaa aagagtttat gctttggaaa agaggatgaa caattacatg 4440

cagttcaaga gcaaacaccg tattgaacct gtatgtctta tcatcagagg ctccccaggt 4500

actggaaagt ccttggcaac tggtataatc gctcgagcaa tagctgacaa ataccactct 4560

agtgtgtact cacttccacc agatccagac cactttgatg gatacaaaca gcaagtggtc 4620

acagttatgg acgatctatg ccaaaaccct gatggcaagg atatgtcact cttttgccag 4680

atggtatcca ccgtagattt tatcccacca atggcttctt tggaagagaa aggagtttca 4740

ttcacatcta aatttgttat tgcatccact aatgctagca acatcatagt gccaacagtg 4800

tctgattctg acgctattcg ccgcaggttc tacatggact gcgacatcga ggtgacggac 4860

tcatataaaa cagacttggg taggttagat gctggaagag ctgccaaatt atgctctgaa 4920

aataacacag caaacttcaa acgctgcagc ccgctagtgt gcgggaaggc tatccagtta 4980

agagatagga agtccaaagt tagatacagt gtggatacag tggtttcaga gctcataagg 5040

gaatacagta acaggtctgc cgttggaaac acaattgaag cgttgttcca ggggccaccc 5100

aagtttagac ctattagaat tagtcttgag gaggcgccag caccagatgt tattagtgat 5160

cttcttgcca gtgtggatag tgaagaggtg cgccaatact gtagagacca aggttggatc 5220

ataccagaaa ctcctaccaa cgttgagcga catttaagta gggctgtgct aatcatgcaa 5280

tccattgcta cggtcgttgc agtagtctca ctggtgtatg ttatctacaa gctttttgct 5340

ggatttcagg gtgcgtattc tggcgctcct aagcaagtgc tcaagaaacc tatcctccgc 5400

acggcaacag tgcaaggacc tagccttgat tttgccctat ctctactgag aaggaacatc 5460

agacaggttc agacagatca agggcacttc actatgctgg gcgttaggga tcgcttagca 5520

gttctcccgc gccattcgca gcctggaaaa acaatctggg tggaacacaa actcgtgaac 5580

atcctggatg ctgtcgagtt ggtggacgag caaggggtca acctagagct cactctaatc 5640

actcttgata ccaatgagaa attcagagat atcaccaagt tcattccaga aaacattagt 5700

gctgctagtg acgccaccct agtgattaac acagaacaca tgccctcaat gtttgtgcct 5760

gtgggagatg tcgtacaata cggtttcctg aatctcagtg gaaagcccac ccatcgcacc 5820

atgatgtaca atttccctac taaggcagga cagtgtggag gagtggtgac atcagttggc 5880

aaagtcattg gaattcacat agggggcaat ggcaggcaag gtttctgtgc gggacttaag 5940

agaagctact ttgccagtga gcaaggagag atccaatggg taaaacctaa caaagaaact 6000

gggagactca acatcaacgg gccaactcgc accaagctcg aacctagtgt gttccatgat 6060

atctttgagg gcaacaagga accagcagtc ttacacagca aagaccctcg cctcgaggta 6120

gattttgagc aagcattgtt ctccaagtat gtaggaaaca ctatacatga gcctgatgaa 6180

tatatcaagg aggcagccct acattatgca aatcagttga agcagctaaa catagatact 6240

tctcaaatga gcatggaaga ggcttgctac ggcacagata accttgaagc tatagacctt 6300

cacactagtg caggctaccc ctacagcgcc ttgggaatca agaagaggga tatcttagac 6360

cccaccacca gggatgtgag taagatgaag ttctacatgg acaagtatgg tcttgacctc 6420

ccttactcta cttatgttaa ggatgagcta cgctcaatag ataagatcaa gaaagggaaa 6480

tcccgcttaa ttgaagctag cagtttgaat gactcagttt acctcagaat ggccttcgga 6540

catctctatg aaactttcca tgcaaaccct gggactgtga ctggttcggc tgtgggatgt 6600

aacccagatg tgttctggag caaattgcca atcctgctcc ccggttccct ctttgctttt 6660

gactactcgg gctatgatgc tagtctcagc ccagtttggt ttagagcatt ggagctagtc 6720

cttagagaga taggctacgg taacgaggca atctcactca tcgaagggat caatcataca 6780

caccatgtat atcgcaacaa aacttattgc gtacttggtg ggatgccatc aggctgttca 6840

ggaacatcca ttttcaactc aatgattaac aacatcatta tcagatcatt gcttatcaaa 6900

acatttaagg gtattgacct ggatgaactc aacatggttg cttatgggga cgatgtactt 6960

gctagctacc cttttcctat tgactgctca gagctagcaa gaacaggcaa ggagtatggt 7020

ttaaccatga cccccgcaga taagtctcct tgcttcaacg aagttaattg ggaaaatgca 7080

acctttctta agagaggttt cttgcctgat gaacaatttc catttttgat tcatcccacc 7140

atgccaatga aggagattca cgaatccatc cggtggacta aggacgcacg taatactcaa 7200

gatcacgtgc gatccttgtg tctattggca tggcacaacg gcaaacaaga atatgaaaaa 7260

tttgtaagta caattagatc tgtcccaata ggaaaggcac tggctattcc aaattatgaa 7320

aacctgagac gcaattggct cgaattattt tagaggtcga gtacacctca accccaccag 7380

gaatctggtc atgaatatga ctggtggggg taaatttgtt ataaccagaa tagc 7434

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Phe Arg Val

1 5 10 15

Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val Trp

20 25 30

Glu Ser Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln Gly

35 40 45

Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asp Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

50 55 60

Asn Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Gly Leu

65 70 75 80

Val Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser His

85 90 95

Leu Met Leu Ala Lys Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly Ile

100 105 110

Leu Arg Cys Gln His Gly Val Ile Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly Asn

115 120 125

Gly Leu Val Gly Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp Glu

130 135 140

Glu Ala Met Glu Gln Gly

145 150

<210> 5

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Thr Gly Phe

1 5 10 15

Thr Asp Ala Val Ala Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Leu Ile

20 25 30

Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ile Lys Leu

35 40 45

Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val Thr

50 55 60

Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp Ala

65 70 75 80

Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Ile Ala Gln

85 90 95

Lys Gln Ser

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys Gly

1 5 10 15

Phe Glu Trp Ile Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu Lys

20 25 30

Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Arg Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn Asn

35 40 45

Leu Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu Gln

50 55 60

Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Met Phe Gly Asn Val Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Tyr Gln Pro Leu Tyr Ala Thr Glu

85 90 95

Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn Tyr Met Gln

100 105 110

Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg Gly

115 120 125

Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg Ala

130 135 140

Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Pro

145 150 155 160

Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp Asp

165 170 175

Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln Met

180 185 190

Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu Lys

195 200 205

Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala Ser

210 215 220

Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg Arg

225 230 235 240

Phe Tyr Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr Asp

245 250 255

Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu Asn

260 265 270

Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys Ala

275 280 285

Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp Thr

290 295 300

Val Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Ser Asn Arg Ser Ala Val Gly

305 310 315 320

Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln Gly

325

<210> 7

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Pro Pro Lys Phe Arg Pro Ile Arg Ile Ser Leu Glu Glu Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Asp Val Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu Val

20 25 30

Arg Gln Tyr Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro Thr

35 40 45

Asn Val Glu Arg His Leu Ser Arg Ala Val Leu Ile Met Gln Ser Ile

50 55 60

Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys Leu

65 70 75 80

Phe Ala Gly Phe Gln Gly

85

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Val Leu Lys Lys Pro Ile Leu Arg

1 5 10 15

Thr Ala Thr Val Gln Gly

20

<210> 9

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile Arg Gln

1 5 10 15

Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp Arg

20 25 30

Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp Val

35 40 45

Glu His Lys Leu Val Asn Ile Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp Glu

50 55 60

Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Ile Thr Leu Asp Thr Asn Glu

65 70 75 80

Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Ala Ala

85 90 95

Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met Phe

100 105 110

Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser Gly

115 120 125

Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala Gly

130 135 140

Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Val Ile Gly Ile His

145 150 155 160

Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg Ser

165 170 175

Tyr Phe Ala Ser Glu Gln Gly

180

<210> 10

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn Ile

1 5 10 15

Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp Ile

20 25 30

Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu His Ser Lys Asp Pro Arg

35 40 45

Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn

50 55 60

Thr Ile His Glu Pro Asp Glu Tyr Ile Lys Glu Ala Ala Leu His Tyr

65 70 75 80

Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asn Ile Asp Thr Ser Gln Met Ser Met

85 90 95

Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Asp Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu His

100 105 110

Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp

115 120 125

Ile Leu Asp Pro Thr Thr Arg Asp Val Ser Lys Met Lys Phe Tyr Met

130 135 140

Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu

145 150 155 160

Leu Arg Ser Ile Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu

165 170 175

Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Ala Phe Gly His

180 185 190

Leu Tyr Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser Ala

195 200 205

Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu

210 215 220

Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu

225 230 235 240

Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu Ile Gly

245 250 255

Tyr Gly Asn Glu Ala Ile Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr His

260 265 270

His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro Ser

275 280 285

Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile

290 295 300

Ile Arg Ser Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp Glu

305 310 315 320

Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe

325 330 335

Pro Ile Asp Cys Ser Glu Leu Ala Arg Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu

340 345 350

Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Asn Trp

355 360 365

Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp Glu Gln Phe

370 375 380

Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu Ser

385 390 395 400

Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser

405 410 415

Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Gln Glu Tyr Glu Lys Phe

420 425 430

Val Ser Thr Ile Arg Ser Val Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala Ile Pro

435 440 445

Asn Tyr Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe

450 455 460

<210> 11

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtttggtc aacaatccgg ggctatctat gtaggtaact tcagagtggt aaaccgacat 60

ctcgccactc acaatgattg ggcaaatcta gtatgggaaa gtagttcacg agatcttttg 120

gtgtcctcca ccactgctca gggatgtgat accattgccc gatgtgattg tcaaacagga 180

gtgtattact gcaactctaa aaggaaacac tacccggtca gtttttctaa gcccggcctc 240

gtttttgtgg aagctagtga gtattaccct gctagatatc agtcacacct catgcttgcg 300

aagggacatt ctgaacccgg ggactgcggt ggcattctta ggtgccaaca tggcgtgatt 360

ggtatcgtgt ccactggtgg taatggactt gttggatttg cagatgtcag agatcttttg 420

tggttggatg aagaagctat ggaacagggt 450

<210> 12

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgtcagatt acatcaaagg gctcggtgac gcatttggaa ctggcttcac tgatgcagtg 60

gctagggagg tggaggctct taagaattac cttataggat ctgaaggggc tgttgaaaag 120

atcttgaaga atttaattaa gctgatctca gcattagtca tagtgatcag gagtgattat 180

gacatggtaa ctctcacagc gaccttggca ctcatagggt gccatggcag cccctgggcg 240

tggatcaagg ctaagacagc atccatttta ggcatcccta tcgcccagaa gcagagt 297

<210> 13

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcgtcatggc tcaagaagtt taacgacatg gccaatgccg ccaagggatt tgagtggatt 60

tccaataaga tcagcaaatt cattgattgg cttaaagaga aaattatacc agcagctaga 120

gagaaggttg aatttttgaa caacctaaaa caactgccat tgttggagaa ccaaatctca 180

aacctggagc aatccgctgc ttcgcaagaa gaccttgagg caatgtttgg gaacgtatcg 240

tatctcgctc acttctgccg caaataccaa ccactttatg ctacagaagc caaaagagtt 300

tatgctttgg aaaagaggat gaacaattac atgcagttca agagcaaaca ccgtattgaa 360

cctgtatgtc ttatcatcag aggctcccca ggtactggaa agtccttggc aactggtata 420

atcgctcgag caatagctga caaataccac tctagtgtgt actcacttcc accagatcca 480

gaccactttg atggatacaa acagcaagtg gtcacagtta tggacgatct atgccaaaac 540

cctgatggca aggatatgtc actcttttgc cagatggtat ccaccgtaga ttttatccca 600

ccaatggctt ctttggaaga gaaaggagtt tcattcacat ctaaatttgt tattgcatcc 660

actaatgcta gcaacatcat agtgccaaca gtgtctgatt ctgacgctat tcgccgcagg 720

ttctacatgg actgcgacat cgaggtgacg gactcatata aaacagactt gggtaggtta 780

gatgctggaa gagctgccaa attatgctct gaaaataaca cagcaaactt caaacgctgc 840

agcccgctag tgtgcgggaa ggctatccag ttaagagata ggaagtccaa agttagatac 900

agtgtggata cagtggtttc agagctcata agggaataca gtaacaggtc tgccgttgga 960

aacacaattg aagcgttgtt ccagggg 987

<210> 14

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccacccaagt ttagacctat tagaattagt cttgaggagg cgccagcacc agatgttatt 60

agtgatcttc ttgccagtgt ggatagtgaa gaggtgcgcc aatactgtag agaccaaggt 120

tggatcatac cagaaactcc taccaacgtt gagcgacatt taagtagggc tgtgctaatc 180

atgcaatcca ttgctacggt cgttgcagta gtctcactgg tgtatgttat ctacaagctt 240

tttgctggat ttcagggt 258

<210> 15

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcgtattctg gcgctcctaa gcaagtgctc aagaaaccta tcctccgcac ggcaacagtg 60

caagga 66

<210> 16

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctagccttg attttgccct atctctactg agaaggaaca tcagacaggt tcagacagat 60

caagggcact tcactatgct gggcgttagg gatcgcttag cagttctccc gcgccattcg 120

cagcctggaa aaacaatctg ggtggaacac aaactcgtga acatcctgga tgctgtcgag 180

ttggtggacg agcaaggggt caacctagag ctcactctaa tcactcttga taccaatgag 240

aaattcagag atatcaccaa gttcattcca gaaaacatta gtgctgctag tgacgccacc 300

ctagtgatta acacagaaca catgccctca atgtttgtgc ctgtgggaga tgtcgtacaa 360

tacggtttcc tgaatctcag tggaaagccc acccatcgca ccatgatgta caatttccct 420

actaaggcag gacagtgtgg aggagtggtg acatcagttg gcaaagtcat tggaattcac 480

atagggggca atggcaggca aggtttctgt gcgggactta agagaagcta ctttgccagt 540

gagcaagga 549

<210> 17

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagatccaat gggtaaaacc taacaaagaa actgggagac tcaacatcaa cgggccaact 60

cgcaccaagc tcgaacctag tgtgttccat gatatctttg agggcaacaa ggaaccagca 120

gtcttacaca gcaaagaccc tcgcctcgag gtagattttg agcaagcatt gttctccaag 180

tatgtaggaa acactataca tgagcctgat gaatatatca aggaggcagc cctacattat 240

gcaaatcagt tgaagcagct aaacatagat acttctcaaa tgagcatgga agaggcttgc 300

tacggcacag ataaccttga agctatagac cttcacacta gtgcaggcta cccctacagc 360

gccttgggaa tcaagaagag ggatatctta gaccccacca ccagggatgt gagtaagatg 420

aagttctaca tggacaagta tggtcttgac ctcccttact ctacttatgt taaggatgag 480

ctacgctcaa tagataagat caagaaaggg aaatcccgct taattgaagc tagcagtttg 540

aatgactcag tttacctcag aatggccttc ggacatctct atgaaacttt ccatgcaaac 600

cctgggactg tgactggttc ggctgtggga tgtaacccag atgtgttctg gagcaaattg 660

ccaatcctgc tccccggttc cctctttgct tttgactact cgggctatga tgctagtctc 720

agcccagttt ggtttagagc attggagcta gtccttagag agataggcta cggtaacgag 780

gcaatctcac tcatcgaagg gatcaatcat acacaccatg tatatcgcaa caaaacttat 840

tgcgtacttg gtgggatgcc atcaggctgt tcaggaacat ccattttcaa ctcaatgatt 900

aacaacatca ttatcagatc attgcttatc aaaacattta agggtattga cctggatgaa 960

ctcaacatgg ttgcttatgg ggacgatgta cttgctagct acccttttcc tattgactgc 1020

tcagagctag caagaacagg caaggagtat ggtttaacca tgacccccgc agataagtct 1080

ccttgcttca acgaagttaa ttgggaaaat gcaacctttc ttaagagagg tttcttgcct 1140

gatgaacaat ttccattttt gattcatccc accatgccaa tgaaggagat tcacgaatcc 1200

atccggtgga ctaaggacgc acgtaatact caagatcacg tgcgatcctt gtgtctattg 1260

gcatggcaca acggcaaaca agaatatgaa aaatttgtaa gtacaattag atctgtccca 1320

ataggaaagg cactggctat tccaaattat gaaaacctga gacgcaattg gctcgaatta 1380

ttt 1383

<210> 18

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttaaaacagc ctgtgggttg tacccaccca cagggcccac tgggcgctag cacactgatt 60

ctatggaatc tttgtgcgcc tgttttataa cccctttccc aaaactgtaa tttagaagaa 120

tattacacta ccgatcaata gtgggcatgg cgcgccagcc atgtctagat caagcacttc 180

tgtctccccg gattgagtat caatagactg ctagcgcggt tgaaggagaa aacgtccgtt 240

acccggctaa ctacttcgag aaacttagta gtaccattga agctgcagag cgtttcgctc 300

agcactcccc cagtgtagat caggtcgatg agtcactgca ctccccacgg gcgaccgtgg 360

cagtggctgc gttggcggcc tgcctatggg gcaacccata ggacgctcta aagtggacat 420

ggtgcgaaga gtctattgag ctagttagta gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatccc 480

aactgcggag cacatgccct caatccaggg ggtggtgtgt cgtaacgggc aactctgcag 540

cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttattc ttatactggc tgcttatggt 600

gacaattgag agattgttac catatagcta ttggattggc catccagtga caaacagagc 660

tttgatatac ttgttcgtgg gtttcgttcc actcaccagt cgtacagttt atactctaaa 720

gtacattctg actttgaaca atagaaa 747

<210> 19

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggtcgagta cacctcaacc ccaccaggaa tctggtcatg aatatgactg gtgggggtaa 60

atttgttata accagaatag c 81

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cyttgtgcgc ctgtttt 17

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

attgtcacca taagcagcc 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caagyacttc tgtmwcccc 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cccaaagtag tcggttcc 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cccccactga ggctaacat 19

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctcgtgagct actttccc 18

Claims (5)

1.柯萨奇病毒A6型毒株，其特征在于，其基因组序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A6型毒株，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19532。

3.生物材料，其特征在于，其为以下（1）-（5）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

（2）含有（1）中所述核酸分子的表达盒；

（3）含有（1）中所述核酸分子的重组载体；

（4）含有（1）中所述核酸分子的重组微生物；

（5）含有（1）中所述核酸分子的细胞系。

4.权利要求1或2所述的柯萨奇病毒A6型毒株或权利要求3所述的生物材料的如下任意一种应用：

（1）在非诊断和治疗目的柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（2）在非诊断和治疗目的柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；

（3）在非诊断和治疗目的柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（5）在预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的非诊断和治疗目的药物的筛选或药效评价中的应用；

（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；

（7）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的疫苗中的应用；

（8）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物中的应用；

（9）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗体中的应用；

（10）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗血清中的应用。

5.一种产品，其特征在于，其含有以下（1）-（2）中的任意一种或多种的组合：

（1）权利要求1或2所述的柯萨奇病毒A6型毒株；

（2）权利要求3所述的生物材料。

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