CN107384943A - 柯萨奇病毒a6病毒样颗粒在昆虫细胞中的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了柯萨奇病毒A6病毒样颗粒在昆虫细胞中的制备及其应用,具体的本发明通过广泛而深入的研究,获得一种制备柯萨奇A6病毒样颗粒的方法,该方法中使用经密码子优化了的柯萨奇A6病毒P1蛋白和3CD蛋白编码序列,在昆虫细胞中表达,能够自动组装形成VLP,且表达量高,易于纯化,纯化获得VLP具有较强的免疫原性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及柯萨奇病毒A6病毒样颗粒在昆虫细胞中的制备及其应用
背景技术
手足口病是一种接触性传播疾病,广泛流行于亚太平洋地区。主要感染五岁以下儿童引起发热,手、足、口和臀部疱疹,以及咳嗽等症状,少数患儿可在短期内出现严重神经症状和心肺系统并发症,甚至死亡。但是,目前还没有针对手足口病的可用疫苗。
自2008年,肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒16型(CA16)因其广泛传播流行成为手足口病的两个主要病原,疫苗的研究开发也多针对该两种病毒。然而,最近几年,关于柯萨奇CA6引起的手足口病全球流行,尤其是亚洲和欧洲地区流行的报道不断增多,吸引了广泛的关注。柯萨奇CA6病毒感染可以引起发热、疱疹等典型手足口病症状,同时伴有疱疹爆发处溃疡、结痂以及脱甲等非典型手足口病症状,并且不仅可感染幼年儿童也可对成年人造成严重伤害。最近有研究报道揭示柯萨奇CA6病毒颗粒的衣壳蛋白组成,并证明非结构蛋白区域(2A-3D)的变化是导致该病毒感染引起非典型手足口病症状的重要原因。
以中国某些省市的临床研究报告为例,2013年,广东省60.3%的手足口病爆发是由于柯萨奇CA6病毒感染引起,吉林长春爆发的手足口病案例中66.9%也由该病毒导致。这些临床研究报告显示了柯萨奇CA6的流行越来越广泛,逐渐成为手足口病爆发的主要病原之一,而且,免疫了EV71或CA16疫苗的人群仍然可以被柯萨奇CA6病毒感染,所以针对柯萨奇CA6的疫苗开发十分必要,也能为以后双价或多价疫苗的研究和发展作铺垫。
因此,为了有效地、有针对性地预防柯萨奇CA6感染,本领域迫切需要开发针对柯萨奇CA6的疫苗及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在昆虫细胞中制备的柯萨奇病毒A6病毒样颗粒、其制备方法及其应用。
本发明的第一方面,提供了一种分离的经密码子优化的多核苷酸,所述多核苷酸编码柯萨奇A6病毒P1蛋白;并且所述多核苷酸选自下组:
(a)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸;
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)的多核苷酸;
(c)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的第二方面,提供了一种表达载体,所述表达载体含有本发明第一方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述表达载体还包括编码柯萨奇A6病毒3CD蛋白的多核苷酸序列。
在另一优选例中,所述表达载体包括第一表达盒和第二表达盒,所述第一表达盒包括SEQ ID NO.3所示的多核苷酸或其互补序列;所述第二表达盒包括SEQ IDNO.6所示的多核苷酸或其互补序列。
在另一优选例中,所述表达载体为重组杆状病毒。
在另一优选例中,所述第一表达盒还包括启动子,所述启动子位于SEQ ID NO.3所示的多核苷酸的上游,优选地所述启动子为AcMNPV p10启动子。
在另一优选例中,所述第二表达盒还包括启动子,所述启动子位于SEQ ID NO.6所示的多核苷酸的上游,优选地所述启动子为polyhedrin启动子。
本发明的第三方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第二方面所述的表达载体,或者在基因组中整合有本发明第一方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述宿主细胞为昆虫细胞。
在另一优选例中,所述宿主细胞为Sf9细胞。
本发明的第四方面,提供了一种柯萨奇病毒A6病毒样颗粒(VLP),所述病毒样颗粒由本发明第三方面所述的宿主细胞表达。
本发明的第五方面,提供了一种制备柯萨奇病毒A6VLP的方法,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养本发明第三方面所述的细胞,从而表达出本发明第四方面所述的病毒样颗粒(VLP);和
分离所述病毒样颗粒(VLP)。
本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,所述的组合物含有本发明第四方面所述的病毒样颗粒(VLP)、本发明第一方面所述的多核苷酸或者本发明第二方面所述的表达载体或者本发明第三方面所述的宿主细胞,以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中,所述药物组合物包括疫苗组合物。
在另一优选例中,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中,所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1.CA6-P1和3CD蛋白在昆虫细胞中共表达。(A)pFBD-CA6-P1/3CD质粒构建示意图。Tn7R和Tn7L分别是Tn7转座子的右边和左边两个部分;Gentamicin,庆大霉素抗性基因;HSV tkpA,多腺苷酸化信号;Pp10,AcMNPVp10启动子基因;Pph,polyhedrin启动子基因;SV40pA,SV40多腺苷酸化信号。(B)杆状病毒感染Sf9细胞后,ELISA检测分析细胞裂解液。Mockinfection(Sf9组):未感染杆状病毒的Sf9细胞裂解液;CA6-P1/3CD:经Bac-CA6P1/3CD感染的Sf9细胞裂解液。(C)Western Blot分析CA6-P1/3CD的表达。纯化的P1/3CD蛋白和小鼠体内扩增获得的CA6病毒在12%的聚丙烯酰胺凝胶上分离开后转移到PVDF膜上用相应的多克隆抗体进行western blot检测。Mock(Sf9组):未感染杆状病毒的Sf9细胞裂解液;CA6/Gdula:经Bac-CA6P1/3CD感染的Sf9细胞裂解液。
图2.CA6病毒样颗粒的组装分析。经10%-50%蔗糖密度梯度离心后,从上往下依次收集12层样品。(A)以特异性抗CA6-VP0多克隆抗体为一抗,ELISA检测分析各层的OD450吸光值。(B)分别以多克隆抗体抗CA6-VP0,VP1和VP3为一抗,用Western Blot对各层进行检测分析。(C)电子显微镜观察CA6病毒样颗粒。Bar=100nm。
图3.CA6-VLP免疫原免疫小鼠后产生的特异性抗体反应。(A)SDS-PAGE和WesternBlot检测分析CA6-VLP免疫原。Control(Sf9组):未感染的Sf9细胞。CA6-VLP组:感染Bac-CA6-P1/3CD的Sf9细胞。(B)取重组CA6-VP0、VP1和VP3等比例混合物作为抗原进行包板,第三次免疫后两周血清进行ELISA检测分析,检测血清作1:20稀释。(C)取表达纯化的免疫原CA6-VLP作为抗原进行包板,第三次免疫后两周血清进行ELISA检测分析,检测血清作1:1000稀释。(D)取表达纯化的免疫原CA6-VLP作为抗原进行包板,对第三次免疫后两周血清进行血清浓度滴度测试。每个符号代表一只小鼠,横线表示该组的几何平均值。
图4.CA6-VLP抗血清能够体内保护新生小鼠免受同源株病毒CA6/Gdula和异源临床株病毒CA6/S0087b的攻击。(A和B)两组7日龄ICR小鼠分别腹腔注射100μl的抗Sf9(n=10)或抗VLP(n=12)抗血清,24h后用CA6/Gdula进行攻击。(C和D)两组7日龄ICR小鼠分别腹腔注射100μl的抗Sf9(n=12)或抗VLP(n=11)抗血清,24h后用CA6/S0087b进行攻击。病毒攻击后连续观察15d,每天记录小鼠的临床症状(A和C)和死亡情况(B和D)。临床症状评分等级如下:0,健康;1,行动迟缓;2,共济失调;3,瘫痪;4,死亡。
图5.CA6-VLP疫苗能够体内保护小鼠免受同源株病毒CA6/Gdula和异源临床株病毒CA6/S0087b的攻击。(A和B)两组ICR小鼠在1日龄和7日龄时分别腹腔注射2μgCA6-VLP疫苗(n=12)或Sf9细胞裂解液(n=13),14日龄时用CA6/Gdula进行攻击。(C和D)两组ICR小鼠在1日龄和7日龄时分别腹腔注射2μg CA6-VLP疫苗(n=12)或Sf9细胞裂解液(n=13),14日龄时用CA6/S0087b进行攻击。病毒攻击后连续观察15d,每天记录小鼠的临床症状(A和C)和死亡情况(B和D)。临床症状评分等级如下:0,健康;1,行动迟缓;2,共济失调;3,瘫痪;4,死亡。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一种制备柯萨奇A6病毒样颗粒的方法,该方法中使用经密码子优化了的柯萨奇A6病毒P1蛋白和3CD蛋白编码序列,在昆虫细胞中表达,能够自动组装形成VLP,且表达量高,易于纯化,纯化获得VLP具有较强的免疫原性。在此基础上,完成了本发明。
在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明的目的研究开发一种安全高效的CA6病毒(柯萨奇A6病毒)疫苗,能够保护机体免受该病毒的侵袭。利用昆虫杆状病毒表达系统共表达CA6的P1和3CD蛋白,用特异性多抗检测发现,P1蛋白能够被3CD切割获得衣壳蛋白VP0、VP1及VP3,该三种结构蛋白能自发组装形成缺乏核酸的病毒样颗粒。更重要的是,使用用该VLP疫苗免疫小鼠后成功获得了抗CA6-VLP血清,并且该CA6-VLP疫苗本身,不仅能够保护新生小鼠免于同源病毒CA6/Gdula的攻击,也能很好地保护小鼠免于异源病毒CA6/S0087b的感染。本发明研究开发的CA6-VLP疫苗能够保护机体免受CA6病毒侵害,为手足口病多价疫苗的研发提供保障。
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)
手足口病是一种主要感染五岁以下儿童的接触性传染疾病,流行于亚太地区。柯萨奇病毒6型(Coxsackievirus A6,CA6)是该病的主要致病原之一,近几年来关于该病毒感染儿童以及成人的报道不断增多。然而,现在还没有针对该病毒的可用疫苗。
在本研究中,利用昆虫杆状病毒表达系统对CA6的P1和3CD进行共表达,获得正确切割和组装的病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)。研究结果显示,P1蛋白可以被3CD正确切割获得能自发组装形成完整VLP的衣壳蛋白VP0,VP1和VP3。经VLP疫苗免疫的小鼠可以产生很强的血清抗体反应,因为缺乏适合的CA6病毒培养细胞系,阻碍了体外中和实验的实施,但是体内被动保护和主动保护效果很好。用抗CA6-VLP的血清腹腔注射七日龄新生小鼠后,分别用原始株CA6/Gdula或临床分离株CA6/S0087b病毒进行攻击,结果显示,抗VLP血清可以保护小鼠免受同源病毒和异源病毒的感染。同时,选取新生乳鼠在1日龄和7日龄进行CA6-VLP腹腔注射免疫,14日龄时分别用原始株CA6/Gdula或临床分离株CA6/S0087b病毒进行攻击,结果显示,CA6-VLP疫苗亦可以保护小鼠免受该两种病毒的感染。
柯萨奇病毒6型(Coxsackievirus A6,CA6)
柯萨奇A6病毒CA6与手足口病其他主要致病原CA16、CA10和EV71病毒相比,具有显著的差异,核苷酸同源性分别为76.4%、81.5%、73.8%,其氨基酸同源性分别为48.0%、22.8%、42.2%,因此可以认定CA6为完全不同于CA16、CA10和EV71的病毒。
在本发明的一个优选地实施方式中,柯萨奇A6病毒P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码柯萨奇A6病毒P1蛋白的野生型多核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一个优选地实施方式中,经过优化的柯萨奇A6病毒P1蛋白编码多核苷酸序列如下:
ATGGGTGCTCAGGTGTCCACCGAGAAGTCCGGTTCCCACGAGACTAAGAACGTGGCCACCGAGGGTTCCACCATCAACTTCACCAACATCAACTACTACAAGGACTCCTACGCTGCTTCCGCTTCCCGTCAGGACTTCGCTCAGGACCCCGCTAAGTTCACCCGTCCCGTGCTGGACACTATCCGCGAAGTGGCTGCTCCCCTGCAGTCCCCATCTGTCGAGGCTTGCGGTTACTCCGACCGTGTGGCTCAGCTGACCGTGGGCAACTCTACCATCACCACCCAAGAGGCTGCTAACATCGTGCTGTCCTACGGCGAGTGGCCCGAGTACTGCCCTTCTACCGACGCTACCGCTGTGGACAAGCCCACCAGACCTGACGTGTCCGTGAACCGTTTCTACACCCTGTCCACCAAGTCCTGGAAGACCGAGTCCACCGGCTGGTACTGGAAGTTCCCCGACGTGCTGAACGACACCGGCGTGTTCGGACAGAACGCTCAGTTCCACTACCTGTACCGTTCCGGTTTCTGCATGCACGTCCAGTGCAACGCTTCCAAGTTCCACCAGGGTGCTCTGCTGGTGGCTGCTATCCCCGAGTTCGTCGTGGCTGCTTCATCCCCCGCTACCAAGCCTAACGGCCAGGGCCTGTACCCTGACTTCGCCCACACCAACCCTGGCAAGAACGGTCAAGAGTTCCGTGACCCCTACGTCCTGGACGCTGGTGTCCCTCTGTCTCAGGCTCTGGTGTACCCCCACCAGTGGATCAACCTGCGTACCAACAACTGCGCTACCATCATCATGCCCTACGTGAACGCTCTGCCCTTCGACTCCGCTCTGAACCACTCCAACTTCGGCCTGGTGGTCATCCCCATCTCCCCACTGAAGTACTGCAACGGTGCTACCACCGAGGTGCCCATCACCCTGACAATCGCTCCTCTGAACTCCGAGTTCTCCGGACTGCGTCAGGCTATCAAGCAGGGTTTCCCCACCGAGCTGAAGCCCGGTACTAACCAGTTCCTGACCACCGACGACGGCACCTCCCCACCTATCCTGCCTGGTTTCGAGCCCACCCCCCTGATCCACATCCCTGGCGAGTTCACCTCTCTGCTGGACCTGTGCCAGATCGAGACTATCCTGGAAGTGAACAACACCACCGGAACCACCGGTGTCTCCCGTCTGCTGATCCCTGTGCGTGCTCAGAACAACGTGGACCAGCTGTGCGCTAGCTTCCAGGTGGACCCCGGTCGTAACGGTCCTTGGCAGTCCACTATGGTCGGACAAATCTGCCGCTACTACACCCAGTGGAGCGGTTCCCTGAAAGTGACCTTCATGTTCACCGGTTCCTTCATGGCTACCGGCAAGATGCTGATCGCTTACACCCCCCCTGGTTCCGCTCAGCCCGCTACTCGTGAAGCTGCTATGCTGGGCACCCACATCGTGTGGGACTTCGGCTTGCAGTCCTCTGTGACCCTCGTGATCCCCTGGATCTCCAACACCCACTTCCGTGCTGTCAAGACCGGTGGCGTGTACGACTACTACGCTACCGGTATCGTGACCATCTGGTATCAGACCAACTTCGTGGTGCCCCCCGACACCCCTACCGAGGCTAACATCATCGCTCTGGGCGCTGCTCAGAAGAACTTCACCCTGAAGCTGTGCAAGGACACCGACGAGATCCAGCAGACCGCTGAGTACCAGAACGACCCCATCACCAACGCTGTCGAGTCCGCTGTGTCCGCTCTGGCTGACACCACCATCTCCCGTGTGACCGCTGCCAACACCGCTGCTTCTACCCACTCCCTGGGTACTGGTCGTGTGCCCGCTCTGCAGGCTGCTGAGACTGGTGCTTCCTCCAACGCCTCCGACGAGAACCTGATCGAAACCCGTTGCGTGATGAACCGTAACGGTGTCAACGAGGCTTCCGTCGAGCACTTCTACTCCCGCGCTGGACTCGTGGGCGTGGTGGAAGTTAAGGACTCCGGCACCAACCTGGACGGTTACACCGTCTGGCCCGTGGACGTGATGGGTTTCGTGCAGCAGCGTCGCAAGCTGGAACTGTCCACCTACATGCGTTTCGACGCTGAGTTCACTTTCGTGTCCAACCTGAACGACTCCACCACCCCCGGCATGCTGCTGCAGTACATGTACGTGCCCCCTGGTGCTCCCAAGCCCGACTCCAGAAAGTCCTACCAGTGGCAGACCGCCACCAACCCCTCCGTGTTCGCTAAGCTGTCCGACCCCCCACCACAGGTGTCCGTGCCTTTCATGTCCCCTGCTACCGCTTACCAGTGGTTCTACGACGGTTACCCCACCTTCGGCGAGCACAAGCAGGCTACCAACCTGCAGTACGGCCAGTGCCCCAACAACATGATGGGACACTTCGCTATCCGTACCGTGTCCGAGTCTACCACTGGAAAGAACGTCCACGTGCGTGTGTACATGCGTATCAAGCACGTGCGCGCTTGGGTGCCCCGTCCTCTGCGTTCCCAAGCTTACATGGTCAAGAACTACCCTACCTACTCCCAGACCATCACTAACACCGCTACCGACCGTGCTTCTATCACCACCACCGACTACGAGGGTGGTGTCCCCGCTAACCCTCAGAGGACCTCTTAA(SEQ ID NO.3)。
在本发明的一个优选地实施方式中,优选的柯萨奇A6病毒P1蛋白氨基酸序列如下:
MGAQVSTEKSGSHETKNVATEGSTINFTNINYYKDSYAASASRQDFAQDPAKFTRPVLDTIREVAAPLQSPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPEYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVAAIPEFVVAASSPATKPNGQGLYPDFAHTNPGKNGQEFRDPYVLDAGVPLSQALVYPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLVVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQGFPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCQIETILEVNNTTGTTGVSRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPATREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPTEANI IALGAAQKNFTLKLCKDTDEIQQTAEYQNDPITNAVESAVSALADTTISRVTAANTAASTHSLGTGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTNLDGYTVWPVDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNDSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDSRKSYQWQTATNPSVFAKLSDPPPQVSVPFMSPATAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPLRSQAYMVKNYPTYSQTITNTATDRASITTTDYEGGVPANPQRTS(SEQID NO.4)
柯萨奇A6病毒3CD蛋白的氨基酸序列如下(CA6/Gdula-3CD):
GPSLDFALSLLRRNIRQAQTDQGHFTMLGVRDRLAILPRHSQPGKTIWIEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLLTLDTNEKFRDITKFIPEAITGASDATLVINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKIIGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQGEIQWIKPNKETGRLNINGPTRTKLEPSVFHDVFEGNKEPAVLTSKDPRLEVNFEQALFSKYVGNTLHEPDEYVTQAALHYANQLKQLDINTSKMSMEEACYGTEYLEAIDLHTSAGYPYSALGIKKRDILDPATRDTSKMKLYMDKYGLDLPYSTYVKDELRSLDKIKKGKSRLIEASSLNDSVYLRMTFGHLYEVFHANPGTITGSAVGCNPDVFWSKLPILLPGSLFAFDYSGYDASLSPVWFRALELVLREIGYTEEAVSLIEGINHTHHVYRNKTYCVLGGMPSGCSGTSIFNSMINNIIIRTLLIKTFKGIDLDELNMVAYGDDVLASYPFPIDCLELAKTGKEYGLTMTPADKSSCFNEVTWENATFLKRGFLPDHQFPFLIHPTMPMREIHESIRWTKDARNTQDHVRSLCLLAWHNGKEEYEKFVSTIRSVPIGKALAIPNFENLRRNWLELF(SEQ IDNO.5)。
编码柯萨奇A6病毒3CD蛋白的野生型多核苷酸序列如下:
CA6/Gdula-3CD:
ggacctagcttggactttgctttgtctctcctgaggcgtaacatcagacaggcgcagaccgaccagggtcacttcaccatgctgggcgtacgggaccgcttagctatcctgccacgccactcgcaaccagggaaaaccatctggatagaacacaaattggtcaatgtattagatgcagttgaattggtggatgaacaaggtgttaatttagaactcacactgctgaccttggacactaatgagaagtttagggacatcactaagttcattccagaggcaatcactggagcgagtgatgcaactctagttatcaacactgagcacatgccctcgatgtttgtaccagtaggtgacgttgtacagtatgggttcttgaatctcagtggtaaacctactcacagaaccatgatgtacaatttccctacaaaggcaggacaatgtggaggggtggtcacctcagttggcaagatcattggaatccacattggcggaaatggacgtcagggcttctgcgccggcttaaagaggagctacttcgccagtgaacaaggagaaatccagtggataaaacctaacaaagaaactgggaggctgaatattaatggtccaactcggaccaaattggagcccagtgtattccatgatgtgttcgagggcaacaaagagccggcggttttgaccagcaaggatcctaggttagaggttaattttgagcaagctctgttctctaagtacgtgggcaacactctacatgaacctgatgagtatgtgacacaagctgccctccactatgcaaatcagctgaaacaactagacataaacaccagcaagatgagcatggaggaggcgtgctatggtacagaatatttggaagcaatagacctgcatactagtgctgggtacccttatagcgccctgggtattaagaagagagacattctcgatccagctaccagagacacttccaagatgaaattatacatggacaagtatggactggatttgccctactccacttatgtaaaggatgagcttagatctctagacaaaattaagaaaggaaagtctcgcttaattgaggccagcagcctaaatgactctgtctaccttagaatgacttttggtcatctatatgaggtgtttcacgccaacccgggaaccataactggatctgcagtcgggtgtaatcctgatgtgttctggagtaagctgccaatcttactgccgggctcgctctttgcatttgactactcaggatatgatgcaagccttagtcctgtatggtttagagctctagagttggttctgcgggagatcggttacacggaggaggctgtgtcactcatagaaggaattaaccacactcaccacgtgtaccggaacaagacatactgtgttcttggtgggatgccctcaggttgctctggtacttccattttcaattccatgattaacaacataatcatcagaaccctcttgattaaaacgttcaaaggtatagacttagatgaattgaacatggtggcctacggggatgatgtgttggctagctacccatttcccattgattgcttggaattggcaaaaactggcaaggagtacggattgaccatgactcctgccgacaaatcatcctgtttcaatgaagtcacctgggagaatgcaactttcttaaaacggggtttcttaccagatcatcagtttccttttctgatccatcccaccatgcccatgagggaaatccacgagtccattcgctggaccaaggatgctcgtaatactcaggaccacgtgcgctccctttgtttgctggcatggcacaatggaaaagaggaatatgagaaatttgtgagcacaattagatcagttcccattggaaaagctttggcaataccaaattttgagaacttgagaagaaattggctcgaactattt(SEQ IDNO.6)
基因工程细胞
本发明提供了一种基因工程细胞(宿主细胞),所述基因工程细胞为真核细胞,并且所述细胞的基因组中整合有柯萨奇A6病毒P1蛋白的表达盒和3CD蛋白的表达盒;或者所述细胞中含有表达载体,所述表达载体含有柯萨奇A6病毒P1蛋白的表达盒和3CD蛋白的表达盒;
并且所述基因工程细胞在胞内表达柯萨奇A6病毒P1蛋白和3CD蛋白,且所述P1蛋白被所述3CD蛋白切割后形成衣壳蛋白VP0单白、VP1蛋白和及VP3蛋白,所述VP0单白、VP1蛋白和及VP3蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLP)。
在另一优选例中,所述细胞为昆虫细胞,优选为Sf9昆虫细胞。
在另一优选例中,所述的柯萨奇A6病毒P1蛋白的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件:启动子、起始密码子、柯萨奇A6病毒P1蛋白的ORF序列和终止密码子。
在另一优选例中,所述的柯萨奇A6病毒3CD蛋白的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件:启动子、起始密码子、柯萨奇A6病毒3CD蛋白的ORF序列和终止密码子。
本发明中,术语“可操作地连接”意指这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置,使得调控序列指导编码序列的表达。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物,它含有:(i)本发明的重组病毒样颗粒(VLP)或本发明的可编码重组病毒样颗粒的多核苷酸,以及(i i)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中,术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组病毒样颗粒或多核苷酸),也可以是多价的(含有多种重组病毒样颗粒或多核苷酸)。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型,其中包括(但并不限于):注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(1)药物组合物
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组病毒样颗粒或多核苷酸。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量,或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此,预先指定准确的有效量是没用的。然而,对于某给定的状况而言,可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的,有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克,较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组病毒样颗粒。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常,可将组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组病毒样颗粒),并且通常与“药学上可接受的载体”组合,这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外,这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外,抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于:(1)铝盐(alum),如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等;(2)水包油型乳剂配方,例如,(a)MF59(参见WO90/14837),(b)SAF,和(c)Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT),(3)皂素佐剂;(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA);(5)细胞因子,如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等;(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体;以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如,可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂),通常含有稀释剂,如水,盐水,甘油,乙醇等。另外,辅助性物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地,包括免疫原性组合物在内的疫苗,包含免疫学有效量的免疫原性多肽,以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内,可通过常规实验来确定。
通常,可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中,以增强佐剂效果。
此外,本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(iii)给药途径和剂量
一旦配成本发明的组合物,可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物,尤其是人。
当用作疫苗时,可用已知的方法将本发明的重组病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于):肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要,可以组合给药途径,或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予,且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组病毒样颗粒疫苗,即重组病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答,能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括(但并不限于):兔出血症病毒感染等。
在各疫苗剂份中所选用的重组病毒样颗粒的量,是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常,在感染宿主细胞后,各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg,较佳地为1μg-100mg,更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后,可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外,本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予,或者与其他治疗剂一起给予。
本发明的主要优点在于:
(1)首次揭示了一种基于柯萨奇A6病毒VLP的新型疫苗,能够更安全更高效地保护机体免于CA6病毒的感染,同时对手足口病主要致病原CA16、CA10和EV71等没有交叉保护,而CA6危害性愈加严重,开发CA6疫苗将为手足口病的广谱多价疫苗奠定基础,拓展手足口病疫苗的保护范围。
(2)本发明构建的含有柯萨奇A6病毒P1蛋白表达盒和3CD蛋白表达盒的载体,能够成功在基因工程细胞内表达柯萨奇A6病毒P1蛋白和3CD蛋白,且所述P1蛋白被所述3CD蛋白切割后形成衣壳蛋白VP0单白、VP1蛋白和及VP3蛋白,所述VP0单白、VP1蛋白和及VP3蛋白在所述基因工程细胞内部能够自主形成病毒样颗粒(VLP)。
(3)本发明使用经过多次优化的柯萨奇A6病毒P1蛋白密码子序列构建VLP表达载体,能够在昆虫细胞内高效表达,VLP得率显著提高。3CD蛋白在VLP形成过程中同样起到了重要作用,本发明针对3CD蛋白密码子序列进行优化,结果显示无法显著提高VLP的表达产量,因此,本发明中仍然采用野生型的3CD蛋白编码基因。
(4)目前CA6病毒在Vero等细胞上的扩增效果不佳,病毒的产量较低,对本株CA6病毒的中和滴度较低,这些诸多因素大大限制了CA6的灭活疫苗和减毒疫苗的开发,本申请是基于基因工程策略开发CA6新型疫苗,在病毒产量和免疫原性等方面具有显著优势,突破了开发CA6灭活疫苗或减毒疫苗的限制瓶颈。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料和方法
1.1病毒
本实验中用到的两株CA6病毒,CA6/Gdula(GenBank ID:AY421764.1)购自美国菌种保藏中心(ATCC#VR-165),CA6/S0087b(GenBank ID:KT183533.1)临床分离株由中国科学院上海巴斯德所疾病防控与诊断中心赠送。因为缺乏合适的细胞系用于该两株CA6病毒的培养,本发明人选用新生3日龄和8日龄ICR小鼠用于病毒的扩增。病毒的扩增方法如下,选取共40只ICR小鼠,分别腹腔注射CA6/Gdula 25μl和CA6/S0087b 50μl,待3日后小鼠出现瘫痪症状时处死,取四肢肌肉组织研磨溶于PBS获得含有病毒的组织研磨液。
研磨所得含有病毒的组织通过离心获得上清,作为CA6病毒库用于后续实验。该组织液通过实时荧光定量PCR的方法进行绝对定量,方法如下所述。
1.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
首先各取CA6/Gdula和CA6/S0087b 200μl病毒组织溶液,用Trizol法提取RNA,通过反转录获得相应的cDNA,同时将构建的CA6-VP1质粒作为模板,按一定的浓度梯度进行倍比稀释作为标准品,取相同体积的cDNA及质粒模板用特异性引物(正向引物5’-GAACACTTCTACTCCCG-3’(SEQ ID NO.7);反向引物5’-TTGCGCCGCTGTTGCAC-3’(SEQ ID NO.8))进行荧光定量PCR反应,根据CA6-VP1所作标准曲线分析获得病毒绝对含量。
1.3重组病毒衣壳蛋白与多克隆抗体
取上述病毒组织研磨液提取的CA6/Gdula RNA,反转录获得特异性cDNA,该cDNA作为模板用于扩增CA6-P1和3CD基因。其中CA6/Gdula-P1作为模板用于构建pET-CA6-VP0,pET-CA6-VP1和pET-CA6-VP3三个质粒,分别转化大肠杆菌BL21,并采用His表达系统表达纯化获得CA6/Gdula的特异性衣壳蛋白VP0,VP1和VP3。随后每组6只Balb/c小鼠,分别皮下注射VP1和VP3蛋白50μg/只,以及一只新西兰大白兔皮下注射VP0蛋白500μg,间隔两周进行加强免疫,共免疫三次,三免后两周采血分离血清获得特异性多克隆抗体抗CA6-VP0、VP1和VP3。
1.4质粒的构建
CA6/Gdula病毒cDNA的获得如上所述,用该cDNA作为模板,PCR扩增得到CA6-P1和CA6-3CD两个片段连接到pFBD载体上构建pFBD-CA6-P1/3CD质粒,具体方法如下。
首先采用PCR扩增获得3CD片段(正向引物:5’-ACCCGGGATCTCGAGCCATGGGACCTAGCTTGGACTTT-3’(SEQ ID NO.9);反向引物:5’-CCTCCCCCATCTCCCGGTACCCTAAAATAGTTCGAGCCAATT-3’(SEQ ID NO.10))采用一步法克隆试剂盒(ClonExpressTMII,Vazyme)将其克隆至pFastBacTMDual(pFBD,Invi trogen)载体上,获得pFBD-CA6-3CD质粒。
然后同样以该cDNA作为模板PCR扩增得到CA6-P1片段(正向引物5’-GGTCCGAAGCGCGCGGAATTCATGGGTGCACAAGTTTCAGCA-3’(SEQ ID NO.11);反向引物5’-GCTCTAGATTCGAAAGCGGCCGCCTAAAAAGTTCTCTGCGGGTT-3’(SEQ IDNO.12)),仍使用一步法克隆试剂盒将该片段克隆到pFBD-CA6-3CD上获得pFBD-CA6-P1/3CD质粒。
临床株SZc173/13(GenBank ID:KF682362.1)的优化的P1基因在金斯瑞公司(上海,中国)合成,克隆进pFBD vector(Invitrogen),产生质粒pFBD-CA6-optiP1。采用上述类似的策略将CA6-3CD的片段克隆到pFBD-CA6-optiP1,从而获得pFBD-CA6-optiP1/3CD质粒。
1.5重组杆状病毒的构建
获得pFBD-CA6-P1/3CD或pFBD-CA6-optiP1/3CD质粒后,利用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bacexpress ion system,Invitrogen)将纯化的质粒转化具有杆状病毒骨架的DH10BacTM感受态细胞(Invitrogen),并通过蓝白斑筛选,纯化获得杆粒Bac-CA6-P1/3CD或Bac-CA6-optiP1/3CD用于后续的表达。
1.6VLP的制备和纯化
小量检测验证表达成功后,取P3代杆状病毒进行VLP的大量表达。首先,用P3代杆状病毒感染昆虫细胞Sf9(Invitrogen),72h后收获细胞离心将培养基与细胞分离,并用含1%NP-40的Tris-Nacl缓冲液对沉淀细胞进行裂解破碎,得到裂解液经20%蔗糖垫进行超速离心浓缩,条件为27000rpm,6h,所得沉淀用Tris-Nacl重悬。然后,通过10%-50%蔗糖密度梯度离心,条件为39,000rpm,2.5h,蔗糖密度梯度离心后从上往下取12个等体积组分进行VLP含量的分析。收集富含VLP的组分混合,再进行20%蔗糖垫进行超速离心浓缩,条件仍为27000rpm,6h。未感染的Sf9细胞进行同样的收集纯化,作为空白对照。
纯化后的VLP用免疫印迹实验(Western Blot)进行蛋白定量。具体方法如下,以Hi s-Ni2+纯化后定量的重组衣壳蛋白CA6-VP0作为标准品,用该CA6-VP0标准品和待测浓度的CA6-VLP作Western Blot检测分析,以CA6-VP0的蛋白印记灰度作标准曲线,确定CA6-VLP的浓度。
1.7酶联免疫吸附实验
获得质粒Bac-CA6-P1/3CD后,用该质粒转染Sf9昆虫细胞获得P0代杆状病毒,后经过传代扩增获得P2、P3代,取P3代杆状病毒进行酶联免疫吸附实验。具体操作方法如下,以每孔50μl含杆状病毒的昆虫细胞上清包被96孔ELISA板,4℃过夜,然后经含5%脱脂牛奶的PBST在37℃封闭1h,最后分别以上述制备的抗CA6-VP0、VP1以及VP3多克隆抗体作为一抗37℃孵育2h,相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行孵育1h,最后用TMB显色终止后读取吸光值OD450。用于小量检测CA6-P1/3CD的表达。
1.8聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹实验
纯化并进行定量的CA6-VLP通过12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,然后做考马斯亮蓝染色或者转印到PVDF膜上进行免疫印迹实验。膜上的抗原分别通过衣壳蛋白特异性多克隆抗体(抗CA6-VP0,抗CA6-VP1和抗CA6-VP3)及其对应的HRP标记二抗进行检测分析。
1.9电镜检测
电子显微镜观察检测如前所述(25),CA6病毒样颗粒通过0.5%的水醋酸双氧铀进行染色后,在Tecnai G2Spirit电子显微镜下观察,进一步确定制备的样品已组装形成完整的病毒样颗粒。
1.10小鼠免疫
取纯化后的CA6-VLP疫苗用Tri s-NaCl稀释至40ng/μl,然后与10mg/mL商业化的铝佐剂(Invivogen,USA)按产品使用说明等体积1:1充分混合。
选用两组(6只/组)8周龄Balb/c母鼠分别腹腔注射Sf9细胞裂解液和CA6-VLP疫苗,2μg/只(据上述定量方法含有2μg VP0蛋白)。相隔两周加强免疫一次,共免疫三次。所有小鼠分别在三免后2周、3周、4周以及5周进行采血,分离血清用于抗体检测和体内被动保护实验。
1.11血清抗体检测
免疫了Sf9和CA6-VLP疫苗的小鼠血清中特异性抗体含量通过间接ELISA试验测定。检测方法如下,分别以大肠杆菌来源的CA6-VP0、VP1和VP3混合物(各100ng/孔)或纯化的CA6-VLP(50ng/孔)包板,4℃过夜,经含5%脱脂牛奶的PBST在37℃封闭1h,然后分别以抗Sf9和抗CA6VLP抗血清作为一抗孵育2h,相应HRP标记的二抗孵育1h后读取吸光值OD450,进行检测分析。
1.12体外交叉中和试验
经多次试验验证,CA6病毒不能在RD、Vero、293T以及Neuro-2A等常规细胞系中长期扩增,无法体外培养获得足量的高滴度病毒,所以未用获得的抗血清对CA6病毒进行体外中和效果的评价。仅检测了血清对CA16、CA10以及EV71病毒的中和效果,方法如下:取获得的免疫血清作16×,32×,64×,128×,256×,512×,1024×以及2048×倍比稀释后50μl/孔加至96孔板中,后分别加入100TCID50/孔CA16、CA10及EV71三种病毒,37℃孵育1h,加入104/孔的RD细胞,检测抗CA6-VLP血清对该三种病毒的体外中和效果。
1.13体内被动保护试验
为了评估抗-CA6-VLP抗血清的保护效果,选取7日龄ICR乳鼠分为四组,每组10只以上。在第一种实验方法中,选取两组乳鼠分别腹腔注射100μl灭活(56℃,30min)的抗-CA6-VLP抗血清或对照组抗-Sf9血清,24h后,腹腔注射1.17×106拷贝数的CA6/Gdula病毒。在另一实验方法中,选取剩余的两组乳鼠同样分别腹腔注射100μl灭活(56℃,30min)的抗-CA6-VLP抗血清或抗-Sf9血清,24h后,腹腔注射4.75×104拷贝数的CA6/S0087b病毒。随后,每天观察这些注射了血清和病毒的小鼠,记录他们的临床症状和死亡情况15天。临床打分的标准如下:0,健康;1,行动缓慢;2,共济失调;3,瘫痪;4,死亡。
1.14体内主动保护试验
为了评估CA6-VLP疫苗的保护效果,选取4只ICR孕鼠待产仔,该4只孕鼠产仔后即为4个实验组。在第一种实验方法中,选取两组乳鼠分别在1日龄和7日龄腹腔注射2μg CA6-VLP疫苗(上述定量方法,即含有2μg CA6-VP0)或对照组Sf9细胞裂解液,并在14日龄时同时腹腔注射2.92×1011拷贝数的CA6/Gdula病毒。在另一实验方法中,选取剩余的两组乳鼠同样分别在1日龄和7日龄腹腔注射2μg CA6-VLP疫苗(含有2μg CA6-VP0)或对照组Sf9细胞裂解液,并在14日龄时同时腹腔注射2.38×109拷贝数的CA6/S0087b病毒。随后,每天观察这些注射了VLP疫苗和病毒的小鼠,坚持记录他们的临床症状和死亡情况15天。临床打分的标准如下:0,健康;1,行动缓慢;2,共济失调;3,瘫痪;4,死亡。
1.15数据统计
统计学差异分析均使用GraphPad Prism(vers ion 5)软件完成。卡普兰·梅尔(Kaplan–Meier)生存曲线利用时序检验(log-rank test)完成,其他数据分析均利用双尾t-检测(Student's 2-tai led t-test)。统计学显著性分析表示如下:ns,无显著性差异(P≥0.05);*0.01≤P<0.05;**P<0.01;和***P<0.001。
实施例1CA6-VLP的表达
为了能够共表达CA6的P1和3CD蛋白,本发明人将P1和3CD编码多核苷酸序列一同插入pFBD载体上,P1和3CD分别位于pPH和pP10启动子的后面,获得pFBD-CA6-P1/3CD,其结构示意图如图1A所示。然后用该质粒转化DH10BacTM感受态细胞获得Bac-CA6-P1/3CD用于后续表达。本发明人采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,将Bac-CA6-P1/3CD转染Sf9细胞,以未转染质粒的Sf9细胞为对照,用间接ELISA(图1B)和Western Blot(图1C)检测CA6-P1/3CD的表达情况,抗CA6-VP0、抗CA6-VP1和抗CA6-VP3三种抗体检测均显示转染Bac-CA6-P1/3CD的细胞裂解液能够产生很强的特异性反应,而未转染质粒的Sf9细胞作为对照则对该三种抗体不产生明显反应。同时,Western Blot检测结果显示(图1C),利用杆状病毒Bac-CA6-P1/3CD表达产生的CA6-VLP主要由~36kDa的VP0,~28kDa的VP2,~34kDa的VP1以及~26kDa的VP3组装形成。
实施例2CA6-VLP的组装及抗原性鉴定
为了鉴定CA6-VLP的表达和组装,Bac-CA6-P1/3CD转染的Sf9和空白Sf9细胞裂解液经20%蔗糖垫后,进行10%-50%蔗糖密度梯度离心,从上往下依次取12层,并用间接ELISA和Western Blot检测各层蛋白的含量。ELISA分析结果显示,在#6,#7和#8层中富含较多的VP0,VP1和VP3蛋白(图2A)。Western Blot检测结果也同样显示,以抗CA6-VP0,VP1和VP3作为抗体,在这三层中能产生很强的特异性反应(图2B)。将富含VLP的各层收集混合后作20%蔗糖垫进行浓缩获得纯度较好浓度较高的CA6-VLP疫苗。取该溶液用透射电子显微镜进行分析,可观察到直径约为30nm的病毒样颗粒(图2C)。以上实验均证明了采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,以Bac-CA6P1/3CD转染Sf9细胞能够表达获得很好的CA6病毒样颗粒疫苗。
实施例3CA6-VLP免疫小鼠后的抗体反应
用以上方法对Bac-CA6P1/3CD转染的Sf9细胞进行表达和纯化,获得CA6-VLP疫苗如图3A所示,用于动物免疫实验。为了检测评估制备的CA6-VLP疫苗的免疫原性,12只Balb/c小鼠被分为两组,分别在0,2和4周腹腔注射Sf9细胞裂解液或CA6-VLP疫苗,并分别在第6和9周进行眼眶采血,分离获得抗Sf9和抗CA6VLP的特异性抗体血清用于ELISA检测分析和动物保护实验。一方面,用CA6衣壳蛋白混合物(VP0+VP1+VP3)作为抗原包板,ELISA检测结果显示,CA6-VLP组的血清与CA6重组衣壳蛋白混合物结合,产生很强的特异性反应,而Sf9组则没有产生明显反应(图3B)。另一方面,以CA6-VLP作为抗原进行包板,ELISA检测结果同样显示,CA6-VLP组的血清能产生很强的特异性反应(图3C),并且血清滴定浓度测定可达到几何平均值179,594(图3D)。该实验结果显示,CA6-VLP免疫小鼠后在体内产生了很强特异性免疫反应。
实施例4CA6-VLP血清的体外交叉中和实验
获得的抗CA6血清1:16起始倍比稀释,对CA16、CA10及EV71三种病毒的交叉中和实验结果证实CA6血清在最低稀释度对该三株病毒没有中和交叉效果。
实施例5CA6-VLP疫苗抗血清体内被动保护实验
为了确定抗CA6-VLP特异性抗体在体内的被动保护效果,7日龄新生小鼠先被动腹腔注射100μl的抗CA6VLP或抗Sf9抗血清,并在24h后接种CA6/Gdula或CA6/S0087b病毒进行攻击,实验结果如图4所示。注射抗Sf9血清的小鼠,用CA6/Gdula或CA6/S0087b病毒攻击后逐渐出现严重的临床症状,包括共济失调和瘫痪,并且均在攻毒后8d内达到100%的死亡率。然而,经过抗CA6VLP抗血清注射的小鼠,同样攻两种病毒后未出现任何临床症状,也未见死亡(4A-D)。以上实验结果证实抗CA6VLP血清能够很好地保护小鼠免于病毒的攻击。
实施例6CA6-VLP疫苗体内主动保护实验
为了进一步确定CA6-VLP疫苗在动物体内的主动保护效果,新生小鼠分别在1日龄和7日龄时免疫接种2μg CA6-VLP疫苗或空白对照Sf9细胞裂解液,并在14日龄时用CA6/Gdula或CA6/S0087b病毒进行攻击,实验结果如图5所示。注射Sf9细胞裂解液的小鼠,用CA6/Gdula或CA6/S0087b病毒攻击后很快出现严重临床症状,包括共济失调和瘫痪,经CA6/Gdula病毒攻击的小鼠在6日内达到100%死亡率,经CA6/S0087b攻击的小鼠亦在8d内达到90%的死亡率。然而,经过CA6-VLP疫苗注射的小鼠,同样攻两种病毒后仅出现轻微的一级迟缓症状,死亡率均小于20%(5A-D)。以上实验结果证实CA6-VLP疫苗能够保护小鼠免于同源病毒及异源病毒的攻击。
对比例1野生型P1和3CD编码多核苷酸序列
在该对比例中,针对临床株SZc173/13,采用上述同样的方法,使用优化的P1编码多核苷酸序列进行VLP的制备。结果表明,在Sf9细胞内成功表达获得CA6-VLP疫苗,相对野生型P1表达的VLP,优化后的P1表达的VLP产量显著提高(表达量至少提高了2倍),本申请建立了CA6-VLP制备的相关方法,验证了其作为疫苗的有效性,为CA6新型疫苗的产业化奠定了基础。
讨论
近年来有研究表明,由CA6病毒引起的手足口病在全球各个国家爆发,导致严重的公共健康问题,尤其是在中国的某些省份,CA6已经成为手足口病的主要病原体。研究和开发针对CA6的疫苗十分重要和迫切。
在本研究中,本发明人旨在利用昆虫杆状病毒表达系统研制出针对CA6的病毒样颗粒疫苗。首先,本发明人利用大肠杆菌表达系统表达获得了CA6/Gdula的三个重组衣壳蛋白CA6-VP0、VP1和VP3,免疫小鼠后获得针对该三种蛋白的特异性多克隆抗体抗CA6-VP0、VP1和VP3。利用这些抗体,本发明人验证了采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统获得的CA6-VLP疫苗由VP0、VP1和VP3组成,并且VP0能够被切割获得VP2蛋白,该部分蛋白的功能还未被很好地证实和解释。然后,本发明人以大肠杆菌表达获得的VP0为标准品,利用Western Blot蛋白免疫印迹灰度的方法测定CA6-VLP中VP0的含量,确定了本发明人研制的CA6-VLP疫苗的浓度可以达到3mg/L(所含VP0的含量)。在该部分试验中,本发明人建立了昆虫杆状病毒表达系统成功表达并且纯化获得CA6-VLP疫苗,并证明了该VLP由VP0、VP1和VP3蛋白组成,另外本发明人也建立了Western Blot定量方法以确定CA6-VLP的表达量。
表达获得CA6-VLP疫苗后,用该疫苗免疫小鼠获得特异性的抗CA6VLP抗血清,检测显示该抗血清能够结合CA6-VP0、VP1和VP3混合蛋白以及CA6-VLP蛋白,且反应强烈,体外验证了CA6-VLP疫苗免疫效果较好。经多种细胞系多次实验验证显示CA6病毒很难在体外扩增,限制了中和实验的进行。但是,本发明人成功建立了小鼠动物模型以培养和扩增CA6病毒,也保证了CA6-VLP疫苗体内保护实验的进行。
本发明人的研究表明,8日龄ICR小鼠对CA6病毒十分敏感,1.17×106拷贝数的CA6/Gdula和4.75×104拷贝数的CA6/S0087b病毒能够导致小鼠8d内100%的死亡率。并且实验显示,2.92×1011拷贝数的CA6/Gdula和2.38×109拷贝数的CA6/S0087b病毒能够导致14日龄ICR小鼠在8d内达到90%以上的死亡率。利用该动物模型,本发明人验证了100μl特异性抗CA6VLP血清及2μg CA6-VLP疫苗均能保护小鼠免受病毒攻击,且不论是同源病毒CA6/Gdula还是临床分离异源病毒CA6/S0087b,均能获得80%以上的保护。体内证明了本发明人研制的CA6-VLP疫苗的保护效果,尤其是对于临床分离病毒株,其意义重大。
在疫苗研究中,灭活疫苗是一种较简单快速的制备方法,由于没有找到合适的细胞系,CA6病毒很难在体外大量扩增获得,这严重阻碍了灭活疫苗的发展。然而,本发明人利用Sf9昆虫细胞表达纯化获得CA6-VLP,巧妙地避开了病毒扩增的问题。本发明人的研究结果也表明,通过昆虫杆状病毒表达获得的CA6-VLP疫苗,不限制于病毒的体外扩增,并且具有与病毒颗粒相同的衣壳蛋白和表面结构,能够很好地保护机体免受病毒的攻击,其作为一种全新的疫苗策略具有巨大的优势和潜能。
综上所述,本发明人首次成功研究开发了基于VLP策略的CA6疫苗,能够保护新生小鼠免受病毒的攻击。由于CA6和肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒16型(CA16),以及柯萨奇病毒10型(CA10)共感染和共流行的报道不断增多,该疫苗也为研究和开发全方面针对手足口病的多价疫苗奠定基础。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种分离的经密码子优化的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码柯萨奇A6病毒P1蛋白;并且所述多核苷酸选自下组:
(a)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸;
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)的多核苷酸;
(c)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求1所述的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体还包括编码柯萨奇A6病毒3CD蛋白的多核苷酸序列。
4.如权利要求2所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体包括第一表达盒和第二表达盒,所述第一表达盒包括SEQ ID NO.3所示的多核苷酸或其互补序列;所述第二表达盒包括SEQ ID NO.6所示的多核苷酸或其互补序列。
5.如权利要求2所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体为重组杆状病毒。
6.如权利要求4所述的表达载体,其特征在于,所述第一表达盒还包括启动子,所述启动子位于SEQ ID NO.3所示的多核苷酸的上游,优选地所述启动子为AcMNPV p10启动子;和/或,所述第二表达盒还包括启动子,所述启动子位于SEQID NO.6所示的多核苷酸的上游,优选地所述启动子为polyhedrin启动子。
7.一种宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞含有权利要求2所述的表达载体,或者在基因组中整合有权利要求1所述的多核苷酸;
优选地,所述宿主细胞为昆虫细胞。
8.一种柯萨奇病毒A6病毒样颗粒(VLP),其特征在于,所述病毒样颗粒由权利要求7所述的宿主细胞表达。
9.一种制备柯萨奇病毒A6 VLP的方法,其特征在于,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养权利要求7所述的细胞,从而表达出权利要求8所述的病毒样颗粒(VLP);和
分离所述病毒样颗粒(VLP)。
10.一种药物组合物,其特征在于,所述的组合物含有权利要求4所述的病毒样颗粒(VLP)、权利要求1所述的多核苷酸或者权利要求2所述的表达载体或者权利要求3所述的宿主细胞,以及药学上可接受的载体和/或辅料;
优选地,所述药物组合物包括疫苗组合物。
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