CN114807060A

CN114807060A - 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用

Info

Publication number: CN114807060A
Application number: CN202210715666.XA
Authority: CN
Inventors: 肖霞; 张德宝; 顾美荣; 李国顺; 陈磊; 郭林; 简伟; 肖海峰; 徐颖之; 张改梅; 刘建凯
Original assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-06-23
Also published as: WO2023246639A1; CN114807060B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A6型毒株及其免疫原性组合物和应用。本发明的柯萨奇病毒A6型毒株的VP4、VP2、VP3、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。该毒株为采用Vero细胞分离得到，对Vero细胞易感，能够获得较高的滴度，具有免疫原性好、交叉中和能力强等优势，可用于制备预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染或柯萨奇病毒A6型感染引起疾病的疫苗或药物。

Description

柯萨奇病毒A6型毒株及其免疫原性组合物和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A6型毒株及其免疫原性组合物和应用。

背景技术

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的一种婴幼儿常见传染病，5岁以下儿童为高危人群，典型表现为手、足、口腔等部位有皮疹、疱疹、溃疡等，可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症会导致残疾或死亡。

手足口病的主要致病血清型包括柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）A组4～7、9、10、16型和B组1～3、5型，埃可病毒（Echovirus）的部分血清型和肠道病毒71型（Enterovirus A71，EV-A71）等，肠道病毒各型之间无交叉免疫力。近年来，柯萨奇病毒A6型（CV-A6）已成为导致HFMD的主要病原体（Bian L, Wang Y, Yao X, et al.Coxsackievirus A6: a new emerging pathogen causing hand, foot and mouthdisease outbreaks worldwide[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2015, 13: 1061-1071.），CV-A6感染还会引起疱疹性咽峡炎、脱甲症等症状。

目前临床治疗中尚无针对CV-A6的抗病毒药物，因此研制CV-A6疫苗仍是最有效的方法。然而，Katsumi Mizuta等用CV-A6毒株感染不同细胞系时发现CV-A6毒株不能在Vero细胞中生长（Mizuta, Katsumi et al. “Longitudinal epidemiology of viralinfectious diseases combining virus isolation, antigenic analysis andphylogenetic analysis as well as seroepidemiology in Yamagata, Japan between1999 and 2018.” Japanese journal of infectious diseases (2019): n. pag.）卞莲莲等的研究也表明CV-A6的分离率可能低于1%（卞莲莲,刘思远,姜崴,毛群颖,高帆,杨晓明,梁争论.多价手足口病疫苗：现实与梦想[J].中国生物制品学杂志,2020,33(01):106-112.DOI:10.13200/j.cnki.cjb. 002971.）。现有技术尚未发现采用Vero 细胞株分离的CV-A6 毒株。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种柯萨奇病毒A6型毒株。

本发明的第二目的是提供与上述柯萨奇病毒A6型毒株相关的生物材料。

本发明的第三目的是提供含有上述柯萨奇病毒A6型毒株或其相关生物材料的免疫原性组合物以及疫苗、药物等产品。

本发明的第四目的是提供上述毒株、生物材料、免疫组合物的用途。

具体地，本发明提供以下技术方案：

首先，本发明提供一种柯萨奇病毒A6型毒株，所述毒株的VP4、VP2、VP3、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示，和/或，所述毒株的2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

具体地，以上所述的柯萨奇病毒A6型毒株的P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明提供的柯萨奇病毒A6型毒株的基因组编码氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、2、3、4所示的VP4、VP2、VP3、VP1蛋白以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白。

本发明提供氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示的VP4、VP2、VP3、VP1蛋白以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白组成的融合蛋白及其编码基因。

优选地，所述柯萨奇病毒A6型毒株的P1蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明提供一种柯萨奇病毒A6型毒株，其基因组序列如SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.12所示序列的完全互补序列所示。

本发明提供柯萨奇病毒A6型毒株V991，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型，保藏编号为CGMCC No.20386。

上述保藏编号为CGMCC No.20386的柯萨奇病毒A6型毒株的基因组编码氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示的VP4、VP2、VP3、VP1蛋白以及氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5、6、7、8、9、10和11所示的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白。

上述保藏编号为CGMCC No.20386的柯萨奇病毒A6型毒株的基因组序列如SEQ IDNO.12所示。

上述如SEQ ID NO.12所示的基因组序列中含有1个ORF 框，编码2201个氨基酸的蛋白，包括P1（VP4+VP2+VP3+VP1）、P2（2A+2B+2C）、P3（3A+3B+3C+3D）。

上述如SEQ ID NO.12所示的基因组序列中，第1至748位为5'UTR，第749至955位为VP4基因，第956至1723位为VP2基因，第1724至2443位为VP3基因，第2444至3358位为VP1基因，第3359至3808位为2A基因，第3809至4105位为2B基因，第4106至5092位为2C基因，第5093至5350位为3A基因，第5351至5416位为3B基因，第5417至5965位为3C基因，第5966至7354位为3D基因（含终止密码子），第7355至7435位为3'UTR。

本发明提供的上述柯萨奇病毒A6型毒株为非洲绿猴肾传代细胞（Vero）适应株，具有Vero细胞易感、滴度高、免疫原性好、交叉中和能力强等优势。

进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒A6型毒株相关的生物材料，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.4所示的VP1蛋白；

（2）序列如SEQ ID NO.13所示的P1蛋白；

（3）序列如SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

（4）序列如SEQIDNO.12所示或如SEQIDNO.12所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

（5）含有（3）或（4）中所述核酸分子的表达盒；

（6）含有（3）或（4）中所述核酸分子的重组载体；

（7）表达（1）或（2）中所述蛋白或含有（3）或（4）中所述核酸分子的重组微生物；

（8）表达（1）或（2）中所述蛋白或含有（3）或（4）中所述核酸分子的细胞系。

以上（3）、（4）中所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。

以上（5）中所述的表达盒为在所述核酸分子的上游和/或下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。

以上（6）中所述的重组载体为携带所述核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。

以上（7）中所述的微生物可为细菌或病毒。

以上（8）中所述的细胞系为动物细胞系。所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于非洲绿猴肾传代细胞（Vero）、RD细胞等。

本发明提供所述柯萨奇病毒A6型毒株的病毒样颗粒（VLPs），其含有选自VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白中的任意一种或多种；其中，VP4、VP2、VP3、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示；2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述蛋白的编码基因。

本发明提供含有以上所述的柯萨奇病毒A6型毒株的免疫原性组合物。

本发明还提供含有以上所述的生物材料的免疫原性组合物。

本发明还提供含有以上所述的病毒样颗粒的免疫原性组合物。

所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒A6型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒A6型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

所述免疫原性组合物中的柯萨奇病毒A6型毒株被灭活。

进一步地，本发明提供所述柯萨奇病毒A6型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物的以下（1）-（9）中任意一种应用：

（1）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物中的应用；

（2）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

（3）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

（4）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

（5）在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

（6）在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（7）在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（8）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

（9）在预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物筛选或药效评价中的应用。

以上（1）-（9）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒A6型毒株。

以上（1）-（4）和（9）中，所述柯萨奇病毒感染引起疾病优选为手足口病。

以上（8）中，所述的动物模型优选为鼠模型。

本发明提供一种产品，其含有以下（1）-（5）中的任意一种或多种的组合：

（1）所述柯萨奇病毒A6型毒株；

（2）所述生物材料；

（3）所述病毒样颗粒；

（4）所述免疫原性组合物；

（5）以所述柯萨奇病毒A6型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物为免疫原免疫动物制备得到的抗体或抗血清。

以上所述的产品优选为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染的产品，或者为用于柯萨奇病毒A6型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒A6型感染动物模型构建的产品。

其中，用于预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染的产品可为疫苗或药物。

本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，其包括：以所述柯萨奇病毒A6型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒或所述免疫原性组合物为免疫原免疫动物，得到抗柯萨奇病毒A6型的抗体或抗血清。

本发明提供一种疫苗，其含有所述柯萨奇病毒A6型毒株或所述生物材料。

本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。

优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒A6型毒株被灭活。

所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。

优选地，以上所述的疫苗中，所述柯萨奇病毒A6型毒株的含量为按蛋白浓度计0.2μg~2.0μg/ml，氢氧化铝的含量为0.3~1.5mg/ml。

用于灭活所述柯萨奇病毒A6型毒株的灭活剂可以为甲醛、β-丙内酯等。

本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒A6型毒株在Vero细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活和纯化后获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。

以上所述的纯化包括超滤浓缩和层析柱纯化。

以上所述的佐剂优选为铝佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗的制备方法包括：将所述柯萨奇病毒A6型毒株在Vero细胞上进行扩大培养，按MOI=0.0001~0.1接种病毒，待细胞病变达 +++~++++时，收获病毒液，经离心、灭活、纯化后，得到疫苗原液，将疫苗原液按蛋白浓度为0.2μg~2.0μg/ml与浓度为0.3~1.5mg/ml氢氧化铝佐剂，得到柯萨奇病毒A6型灭活疫苗。

上述方法中，柯萨奇病毒A6型毒株在Vero细胞上的培养可采用细胞工厂或生物反应器进行。

灭活病毒的方法可采用与病毒液体积比1:（3500~4500）的β-丙内酯于5±3℃灭活1~3天，然后于37℃水解1~4小时；或者采用与病毒液的体积比为1:1000~1:5000的甲醛灭活2~6 天。

本发明提供用于治疗柯萨奇病毒A6型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒A6型毒株的抗体或抗血清。

本发明还提供以上所述的产品、疫苗在预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染或柯萨奇病毒A6型感染引起疾病中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一株Vero细胞适应的柯萨奇病毒A6型毒株，该毒株为采用Vero细胞分离得到，对Vero细胞易感，能够获得较高的滴度，具有免疫原性好（可产生较高的血清中和效价和动物保护效果）、交叉中和能力强（与柯萨奇病毒A6型的不同基因型具有较好的交叉中和能力）等优势，可用于制备预防或治疗柯萨奇病毒A6型感染或柯萨奇病毒A6型感染引起疾病的疫苗或药物。

利用该毒株制备的疫苗可预防柯萨奇病毒A6型感染或柯萨奇病毒A6型感染引起的手足口病，具有较好的免疫效果。利用该毒株制备的免疫血清能够实现较好的被动免疫的效果，可用于手足口病的预防和治疗。

附图说明

图1为本发明实施例3中CV-A6血清对各基因型交叉中和效价。

图2为本发明实施例7中利用CV-A6的免疫血清进行被动保护实验的动物体重监测结果。

图3为本发明实施例7中利用CV-A6的免疫血清进行被动保护实验的动物临床评分结果。

图4为本发明实施例7中利用CV-A6的免疫血清进行被动保护实验的动物生存率结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中术语的解释：

MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。选择合适的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。

细胞病变效应（cytopathic effect）是指：在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆、坏死、从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用，简写CPE。CPE 程度常用+~++++表示：1+，<25%；2+， 25%-50%；3+， 50%-75%；4+，75%-100%。

本发明中，柯萨奇病毒A6型毒株（CV-A6）的筛选和性能验证过程大致概括如下：将临床手足口病患者标本经过处理，接种于非洲绿猴肾传代细胞（Vero）上，盲传三代，经鉴定、测序、动物免疫等初步筛选与评价后，经3次蚀斑纯化或者有限稀释法纯化，得到CV-A6纯化毒株，将CV-A6毒株按固定的MOI进行连续传代，并进行滴度、及基因序列检测；同时对该毒株的小鼠免疫血清进行交叉中和能力评价；选用Vero细胞进行CV-A6毒株培养，收获病毒液、经灭活、纯化后，得到疫苗原液，制备CV-A6疫苗，进行小鼠的动物免疫，评价其免疫原性，同时进行乳鼠被动保护试验，评价其保护效果。

实施例1 CV-A6病毒株的分离及培养

1、临床样本的处理

将临床样本按照手足口病预防控制指南（2009版）进行处理。

2、病毒分离

将处理好的样本，按一定比例接种至80~90%密度的健康无污染非洲绿猴肾传代细胞（Vero）中，35℃、5%CO₂培养箱中吸附半个小时以上，补液至培养体积，35℃、5%CO₂培养箱中培养，同时设置未加样本的细胞对照。使用倒置显微镜每天观察细胞，如出现肠道病毒致细胞病变效应（CPE）：细胞变圆，折光增强并脱离管壁等，记录其变化，连续观察7天内接种孔和对照孔细胞所发生的变化CPE（1+~4+）。

若CPE出现，观察到75%的细胞发生变化（3+），收获培养液并储藏在-20℃以下冰箱，冻融3次后，2000 rpm、4℃离心10 min，进行下一次传代，连续培养3代后，将第4代病毒液冻存。若7d后没有CPE出现，则继续盲传3代，若仍未出现CPE，则判定为阴性。

经病毒株的分离、培养以及病毒株的分子鉴定、滴度、免疫原性、交叉中和能力的检测和筛选，最终筛选得到一株滴度高、免疫原性好、交叉中和能力强的柯萨奇病毒A6型毒株V991。

实施例2 病毒株的鉴定及检测

将实施例1收获的柯萨奇病毒A6型毒株V991的第4代病毒液进行分子鉴定、基因组测序和滴度检测。

1、分子鉴定及基因组测序

采用RT-PCR法鉴定病毒，使用的肠道病毒核酸检测通用引物及VP1特异性引物如表1所示。

表1 肠道病毒核酸检测通用引物及VP1特异性引物

（1）病毒核酸提取

取第4代病毒液，按照说明书中添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸，将提取好的核酸保存至-70℃冰箱。

（2）HEV- 5UTR通用引物PCR检测

采用HEV-5UTR的两对通用引物59F/588R与153F/541R进行巢式PCR。

第1轮PCR扩增的反应体系组成如表2所示。

表2 第1轮PCR扩增反应体系

反应程序如下：55℃，30 min；94℃，2 min；20个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，68℃、40 s；68℃延伸5 min。

以第1轮PCR扩增产物为模板，进行第2轮PCR扩增。第2轮PCR扩增的反应体系组成如表3所示。

表3 第2轮PCR扩增反应体系

反应程序如下：94℃，2 min；30个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，72℃、40 s；72℃延伸5 min。

（3）CV-A6的VP1特异性序列的扩增

采用CV-A6-VP1特异性引物进行CV-A6的VP1特异性序列的扩增反应体系组成如表4所示。

表4 VP1的PCR扩增反应体系

反应程序如下：55℃，30 min; 94℃，2 min；30个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，68℃、70 s；68℃延伸 5 min。

（4）结果判断

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，HEV-5UTR通用引物扩增产物目的条带大小约400bp，CV-A6的VP1特异性条带大小约1kb，具体判定标准如表5所示。

表5 PCR扩增产物结果判断标准

上述鉴定结果显示柯萨奇病毒A6型毒株V991为柯萨奇病毒A6型。对柯萨奇病毒A6型毒株V991进行VP1序列和基因组测序，并根据VP1序列分型。

测序结果显示，该毒株的基因组序列如SEQ ID NO.12所示，基因型为D3型。

取柯萨奇病毒A6型毒株V991的第4代病毒液进行P1序列扩增与测序，目的片段大小约3Kb，扩增反应体系如表6。

引物序列如下：

CVA6-P1-F1 (5'-3')：CTATTGGATTGGCCATCCAGTGACCAACAG；

CVA6-P1-R (5'-3')：CTCGTGAGCTACTTTCCCATACTAAATTTG。

表6 P1序列的PCR扩增反应体系

反应程序如下：55℃，30 min; 94℃，2 min；30个循环：94℃、15 s，55℃、30 s，68℃、3 min；68℃延伸 5 min。

将扩增得到的目的条带送检测序。该毒株的P1序列如SEQ ID NO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13。

2、滴度检测

取柯萨奇病毒A6型毒株V991的第4代病毒液，10倍梯度稀释，从10^-1稀释至10^-10。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μl RD细胞悬液（1×10⁵个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加病毒维持液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃、5%CO₂培养箱中静置培养，第7天判断结果，每个样品进行3次重复检测。

病毒滴度计算：按Behrens-Karber公式计算LgCCID50。

Lg CCID₅₀/0.1ml=L+d(S-0.5)；

式中，L为病毒的最低稀释度的对数值；d为稀释度系数的对数值；S为CPE阳性孔比率总和。

经检测，培养3天，柯萨奇病毒A6型毒株V991的滴度为7.08 LgCCID₅₀/ml。

实施例3 CV-A6毒株的交叉中和能力检测

将柯萨奇病毒A6型毒株V991的免疫血清（以下简称CV-A6血清）采用微量细胞病变法进行交叉中和能力检测。具体方法如下：将血清于56℃水浴灭活30min后，从1:8开始稀释，加入96孔板，每个样品2孔，100μl/孔，2倍倍比稀释后，加入32~320CCID₅₀/0.05ml的病毒液，于36±1℃、5% CO₂培养箱，中和1~2小时。加入RD细胞悬液（1~2 ×10⁵个/ml），100μl/孔。置于5% CO₂培养7天，判定结果，中和效价＜8 判为阴性，≥8 为阳性。

将柯萨奇病毒A6型毒株V991的免疫血清分别与12株不同CV-A6病毒株进行交叉中和检测，其中1株原型株（A型），11株流行基因型（D3）（交叉中和检测委托中国食品药品检定研究院进行，毒株及其对应免疫血清均来自中国食品药品检定研究院并用于测试）。结果显示，CV-A6血清对原型株、流行亚型毒株均具有较好的中和能力（图1），表明柯萨奇病毒A6型毒株V991的交叉中和能力较好。

实施例4 CV-A6毒株三级种子库的建立及检定

按照《中国药典》（2020版）中生物制品生产鉴定用菌毒种管理及质量控制，建立三级种子库，即原始种子、主种子批及工作种子批，并进行相关检定。各检测项目合格后，放行使用。种子库的建立方法如下：将柯萨奇病毒A6型毒株V991按MOI（0.1~0.0001）接种于处于对数生长期的单层Vero细胞，每天观察病变情况，至病变达90%以上收获，建立三级种子库。

柯萨奇病毒A6型毒株V991已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型，保藏编号为CGMCC No.20386。

实施例5 CV-A6 疫苗的制备

取实施例4建立的柯萨奇病毒A6型毒株V991的工作种子批，采用细胞工厂或者生物反应器在Vero 细胞上进行扩大培养，按MOI=0.001接种病毒，待病变达 +++收获病毒液。将收获的病毒液经离心或过滤后灭活，灭活方法可采用与病毒液体积比1:4000的β-丙内酯于5±3℃灭活2天，然后37℃水解2小时，或者采用与病毒液体积比1:2000的甲醛灭活 4天。将灭活液进行超滤浓缩、层析柱纯化，纯化液经除菌过滤后获得疫苗原液，采用Lowry法测定其蛋白浓度不低于95%，上述方法中，灭活也可在病毒纯化后进行。

将得到的疫苗原液与氢氧化铝佐剂按适宜比例吸附后，得到CV-A6疫苗。CV-A6疫苗中，蛋白浓度为0.5μg/ml，氢氧化铝佐剂浓度为0.5mg/ml。

实施例6 CV-A6 疫苗的免疫原性检测

将实施例5制备的CV-A6 疫苗进行小鼠免疫，小鼠免疫的方法如下：将小鼠随机分成2组，每组小鼠10只按0、14天的免疫程序进行CV-A6 疫苗的腹腔免疫，0.5ml/只，于第28天进行采血，同时免疫病毒维持液作为对照组。采集的血清进行中和抗体检测，具体方法见实施例2。结果显示，一免14天，血清效价皆可100%阳转，中和抗体水平GTMs达1:585，二免后14天，中和抗体水平GTMs可达1:4419，对照组阳转率为0%，GTMs＜1：8，这表明使用柯萨奇病毒A6型毒株V991制备的CV-A6疫苗具有很好的免疫效果。

实施例7 被动保护效果检测

在已建立的CV-A6 1日龄Balb/C乳鼠致死动物模型基础上（建模方法参见CN202111109645.5），采用20倍LD₅₀的CV-A6攻毒毒株对1日龄Balb/C小鼠进行腹腔攻击，1小时后分别腹腔免疫CV-A6的6倍倍比稀释的免疫血清（1:300、1:50、1:8.3、1:1.4、1:0.2，免疫血清的制备方法参见实施例6）、稀释液（MEM溶液，pH 7.2~7.4），同时设置阴性对照及空白对照组，连续观察21天，记录乳鼠健康、发病及死亡情况，统计观察期末各组乳鼠的存活率，并采用Reed-Muench法计算免疫血清平均半数动物保护中和抗体效价（ED₅₀），结果表明，CV-A6免疫血清可有效保护乳鼠，ED₅₀为1:18.8 （图2、图3和图4）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 柯萨奇病毒A6型毒株及其免疫原性组合物和应用

<130> KHP221116019.3YS

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Glu Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Lys

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Arg Gln Asp Phe Ala Gln

35 40 45

Asp Pro Ala Lys Phe Thr Arg Pro Val Leu Asp Thr Ile Arg Glu Val

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Gln

65

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu

1 5 10 15

Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val

20 25 30

Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Ser Thr Asp Ala Thr

35 40 45

Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Tyr

50 55 60

Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser Thr Gly Trp Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala

85 90 95

Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Met His Val Gln Cys

100 105 110

Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Ala Ile Pro

115 120 125

Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Pro Val Ser Lys Pro Asn Gly Lys

130 135 140

Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln

145 150 155 160

Glu Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Val Pro Leu Ser Gln

165 170 175

Ala Leu Val Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys

180 185 190

Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu Pro Phe Asp Ser Ala

195 200 205

Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Val Val Ile Pro Ile Ser Pro Leu

210 215 220

Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro Ile Thr Leu Thr Ile

225 230 235 240

Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln

245 250 255

<210> 3

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Ser Asn Gln Phe Leu Thr Thr

1 5 10 15

Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly Phe Glu Pro Thr Pro

20 25 30

Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu Leu Asp Leu Cys Gln

35 40 45

Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Gly Thr Thr Gly Val

50 55 60

Asn Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn Asn Val Asp Gln Leu

65 70 75 80

Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn Gly Pro Trp Gln Ser

85 90 95

Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly Ser

100 105 110

Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys

115 120 125

Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Val Thr Arg

130 135 140

Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp Asp Phe Gly Leu Gln

145 150 155 160

Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe Arg

165 170 175

Ala Val Lys Thr Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr Ala Thr Gly Ile Val

180 185 190

Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro Pro Asp Thr Pro Thr

195 200 205

Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Asn Phe Thr Leu

210 215 220

Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Gln Gln Thr Ala Val Tyr Gln

225 230 235 240

<210> 4

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Gly Pro Ile Thr Asp Ala Val Glu Ser Ala Val Ser Ala Leu Ala

1 5 10 15

Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn Thr Ala Ala Ser Thr

20 25 30

His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr

35 40 45

Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys

50 55 60

Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser Val Glu His Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val Lys Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Ser Leu Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp Val Met Gly Phe Val

100 105 110

Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala

115 120 125

Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asp Ser Thr Thr Pro Gly Met

130 135 140

Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser

145 150 155 160

Arg Asn Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Ile Phe Ala

165 170 175

Lys Leu Arg Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro

180 185 190

Ala Thr Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu

195 200 205

His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met

210 215 220

Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu Ser Thr Thr Gly Lys

225 230 235 240

Asn Val Arg Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp

245 250 255

Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser Gln Ala Tyr Met Val Lys Asn Tyr Pro

260 265 270

Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Thr Asn Thr Ala Ala Asp Arg Ala Ser Ile

275 280 285

Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala Asn Pro Gln Arg Thr

290 295 300

Ser

305

<210> 5

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Arg Leu Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Phe Arg

1 5 10 15

Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr Arg Asn Asp Trp Val Asn Leu Val

20 25 30

Trp Glu Ser Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln

35 40 45

Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asp Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr

50 55 60

Cys Asn Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Ser

65 70 75 80

Leu Val Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser

85 90 95

His Leu Met Leu Ala Lys Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly

100 105 110

Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Ile Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly

115 120 125

Asp Gly Leu Val Gly Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp

130 135 140

Glu Glu Ala Met Glu Gln

145 150

<210> 6

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Thr Gly

1 5 10 15

Phe Thr Asp Ala Val Ala Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Leu

20 25 30

Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ile Lys

35 40 45

Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val

50 55 60

Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp

65 70 75 80

Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Ile Ala

85 90 95

Gln Lys Gln

<210> 7

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Asn Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys

1 5 10 15

Gly Leu Glu Trp Ile Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Arg Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn

35 40 45

Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Ser Asn Leu Glu

50 55 60

Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Ala Met Phe Gly Asn Val

65 70 75 80

Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Tyr Gln Pro Leu Tyr Ala Thr

85 90 95

Glu Ala Lys Arg Val Tyr Thr Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn His Met

100 105 110

Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg

115 120 125

Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg

130 135 140

Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp

145 150 155 160

Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp

165 170 175

Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln

180 185 190

Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu

195 200 205

Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala

210 215 220

Ser Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg

225 230 235 240

Arg Phe Tyr Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr

245 250 255

Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu

260 265 270

Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys

275 280 285

Ala Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp

290 295 300

Thr Val Val Ser Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asn Asn Arg Ser Ala Ile

305 310 315 320

Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln

325

<210> 8

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Pro Pro Lys Phe Arg Pro Ile Arg Ile Ser Leu Glu Glu Ala Pro

1 5 10 15

Ala Pro Asp Val Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu

20 25 30

Val Arg Gln Tyr Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro

35 40 45

Thr Asn Val Glu Arg His Leu Ser Arg Ala Val Leu Ile Met Gln Ser

50 55 60

Ile Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Leu Phe Ala Gly Phe Gln

85

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Lys Gln Val Leu Lys Lys Pro Ile Leu

1 5 10 15

Arg Thr Ala Thr Val Gln

20

<210> 10

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile Arg

1 5 10 15

Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp

35 40 45

Val Glu His Lys Leu Val Asn Ile Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp

50 55 60

Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Ile Thr Leu Asp Thr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Ala

85 90 95

Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met

100 105 110

Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser

115 120 125

Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala

130 135 140

Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Val Ile Gly Ile

145 150 155 160

His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg

165 170 175

Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln

180

<210> 11

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn

1 5 10 15

Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp

20 25 30

Ile Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu His Ser Lys Asp Pro

35 40 45

Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly

50 55 60

Asn Thr Ile His Glu Pro Asp Glu Tyr Ile Lys Glu Ala Ala Leu His

65 70 75 80

Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asn Ile Asp Thr Ser Gln Met Ser

85 90 95

Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Asp Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu

100 105 110

His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg

115 120 125

Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Arg Asp Val Ser Lys Met Lys Phe Tyr

130 135 140

Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp

145 150 155 160

Glu Leu Arg Ser Ile Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile

165 170 175

Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Ala Phe Gly

180 185 190

His Leu Tyr Glu Thr Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser

195 200 205

Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu

210 215 220

Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser

225 230 235 240

Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu Ile

245 250 255

Gly Tyr Gly Asp Glu Ala Ile Leu Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr

260 265 270

His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro

275 280 285

Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile

290 295 300

Ile Ile Arg Ser Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp

305 310 315 320

Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro

325 330 335

Phe Pro Ile Asp Cys Ser Glu Leu Ala Arg Thr Gly Lys Glu Tyr Gly

340 345 350

Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Asn

355 360 365

Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp Glu Gln

370 375 380

Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu

385 390 395 400

Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg

405 410 415

Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Gln Glu Tyr Glu Lys

420 425 430

Phe Val Ser Ala Ile Arg Ser Val Pro Ile Gly Lys Ala Leu Ala Ile

435 440 445

Pro Asn Tyr Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe

450 455 460

<210> 12

<211> 7435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttaaaacagc ctgtgggttg cacccaccca cagggcccac tgggcgctag cacactgatt 60

ctacggaatc tttgtgcgcc tgttttataa ccccttcccc caaaactgca acttagaaga 120

atattacact actgatcaat agcaggcatg gcgcaccagt catgtctaga tcaagcactt 180

ctgtctcccc ggactgagta tcaatagact gctagcgcgg ttgaaggaga aaacgtccgt 240

tacccggctg actacttcga gaaacttagt agcaccattg aagctgcgga gtgtttcgtt 300

cagcactccc ccagtgtaga tcaggtcgat gagtcactgc actccccacg ggcgaccgtg 360

gcagtggctg cgttggcggc ctgcctatgg ggcaacccat aggacgctct aaagtggaca 420

tggtgcgaag agtctattga gctagttagt agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 480

caactgcgga gcacatgccc tcaatccaga gggtggtgtg tcgtaacggg caactctgca 540

gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt cttgtattgg ctgcttatgg 600

tgacaattga gagattgtta ccatatagct attggattgg ccatccagtg acaaacagag 660

ctttgatata cttgtttgtg ggttttgttc cactcaccag tcgtacagtt cacactctaa 720

agtacattct gattctgaac aatagaaaat gggcgctcaa gtttcaacag aaaaatctgg 780

gtcgcacgag acaaagaatg tagcgaccga agggtctact atcaatttca ccaacatcaa 840

ttactataag gattcttatg cagcgtcagc tagtagacag gactttgcac aagaccccgc 900

aaagttcaca cgccccgtct tggataccat cagggaggtt gcagccccgc tgcaatcccc 960

ttctgttgag gcatgcggtt atagtgaccg agttgcacag ttgactgtgg gcaactcaac 1020

cattactacc caggaggcag ccaacattgt attgagttac ggagagtggc cagaatattg 1080

tccctccacg gatgctacag ctgtggacaa acctactcgc cctgacgtgt cagtgaatag 1140

gttctacaca ctgtcaacta agagttggaa gacagaatct actggctggt actggaaatt 1200

ccctgatgtg ctaaatgaca caggagtatt tggtcaaaac gcccaattcc actacttgta 1260

ccgctcgggt ttctgcatgc acgttcagtg taatgcaagc aagttccatc agggggccct 1320

tttagtggct gcaatccccg aatttgtggt tgctgcaagc agccccgtct cgaagcctaa 1380

tggaaaaggg ttgtacccag atttcgccca cactaaccca ggtaaaaatg gccaagagtt 1440

tcgagaccct tatgtcttgg atgctggtgt ccccctaagt caagcactgg tttaccccca 1500

tcaatggatc aatctacgaa ctaataactg cgcgaccatt attatgccat atgtcaatgc 1560

gcttccattt gattcagcgc ttaaccactc aaattttgga ttggttgtga tccctattag 1620

tcccttaaaa tattgtaatg gggctaccac agaagtgcca atcacactaa ctattgcccc 1680

acttaactcg gagtttagcg gtctccgaca agcaataaaa caagggttcc ccacagagct 1740

caagcctggt tccaatcagt ttctcacaac cgatgacggg acgtccccac caatactgcc 1800

cggttttgaa ccaactccat tgattcacat tcctggtgaa ttcacctcct tgttagattt 1860

gtgtcaaata gaaaccatac tagaagtcaa taacaccact ggcaccactg gagtcaatag 1920

attactaatc cctgttcgag cacagaacaa tgtggaccag ttgtgcgcat cattccaagt 1980

agaccctggg cgcaatggcc catggcaatc cacaatggtc ggtcagatct gcaggtatta 2040

cactcaatgg tcaggttccc ttaaggtaac ctttatgttc acaggttctt tcatggctac 2100

agggaaaatg ctgatagcct atacaccgcc tggtagtgct cagcccgtta caagagaagc 2160

agcaatgctt gggactcata tagtgtggga ttttggcttg caatcatcag ttaccctggt 2220

cataccttgg atcagtaata cccattttag agcagttaag actggagggg tatacgacta 2280

ctatgcaacc gggatcgtca ccatttggta ccaaaccaac tttgtagtgc caccagacac 2340

ccccactgag gctaatatta tagctcttgg agcagcacag aaaaacttta ccctaaagtt 2400

gtgtaaggac actgacgaga tccagcaaac agcagtgtac caaaatggtc ccattacaga 2460

tgcagtggaa agcgctgtga gcgcgcttgc tgacaccaca atatcccggg tgaccgcagc 2520

caacactgca gctagcaccc actccctggg aacagggcgt gtaccagcac tgcaagccgc 2580

agaaacggga gcaagctcta acgccagtga tgaaaacctt attgagaccc gctgtgtgat 2640

gaatcgaaac ggggttaatg aggcgagcgt ggaacacttt tactctcgtg cagggctggt 2700

aggagttgtg gaggtgaagg actcgggcac tagcctggat gggtacacag tttggcccat 2760

agatgtgatg ggcttcgtgc aacagcggcg caagctagag ttgtcaacat acatgcgctt 2820

tgatgccgag ttcacttttg tgtccaacct caatgacagc acgacacccg ggatgctgct 2880

gcagtatatg tatgtgccac caggggcccc taagccagac agcaggaatt cataccaatg 2940

gcagactgct actaacccgt cgatattcgc aaaattgaga gatccacccc cccaggtatc 3000

tgtcccgttc atgtcgccag caacggccta tcagtggttt tatgatggtt accctacatt 3060

tggtgaacac aaacaagcca ccaatttgca atatgggcaa tgtcctaata acatgatggg 3120

ccattttgct atccgaacag tcagtgaatc taccaccggg aaaaacgtcc gcgttcgggt 3180

gtacatgaga attaagcacg tgagagcttg ggtacctaga ccccttcgat cccaagcata 3240

tatggtcaag aactacccga catacagcca gacaataact aacactgcag ctgaccgtgc 3300

aagcataacc accacggatt atgaaggcgg agtaccagca aacccacaga ggacatctgg 3360

taggttaggt caacaatccg gggctatcta tgtaggcaac ttcagagtgg taaaccgaca 3420

tctcgccact cgtaatgatt gggtaaattt agtatgggaa agtagctcac gagatctttt 3480

ggtgtcctcc accactgctc agggatgtga tactattgcc cgatgtgatt gtcaaacagg 3540

agtgtattac tgcaactcta aaaggaaaca ctacccggtt agtttttcta agcccagcct 3600

cgtcttcgtg gaagctagtg agtattaccc tgccaggtat cagtcacacc ttatgcttgc 3660

gaagggacat tctgaacccg gggactgtgg tggcattctt aggtgccaac atggcgtgat 3720

tggtatcgtg tccactggtg gtgatggact tgttggattt gcagatgtca gagacctttt 3780

gtggctggat gaagaagcta tggaacaggg tgtgtcagat tacatcaaag ggctcggtga 3840

cgcttttgga actggcttta ctgatgcagt agctagggag gtggaggctc ttaagaacta 3900

cctcatagga tctgaagggg ctgttgaaaa gatcttaaag aatttaatta agctgatctc 3960

agcattagtc atagtgatca gaagtgacta tgacatggta accctcacag caaccttggc 4020

actcataggg tgtcatggca gcccctgggc gtggatcaag gctaagacag catccatctt 4080

aggcatccct atcgcccaga agcagagtgc gtcatggctc aagaagttta atgacatggc 4140

caatgctgct aagggacttg agtggatttc caataaaatc agcaaattta ttgattggct 4200

taaggagaaa attataccag cagctagaga gaaggttgaa tttttgaaca acctaaaaca 4260

actgccattg ttggagaacc aaatctcaaa cctggagcag tccgccgctt cgcaagaaga 4320

ccttgaggca atgtttggga acgtatcgta cctcgcccac ttctgccgta aataccaacc 4380

actttatgct acagaagcca aaagagttta tactttggaa aagaggatga acaatcacat 4440

gcagtttaag agcaaacacc gtattgaacc tgtatgtctt atcatcagag gctccccagg 4500

cactggaaag tccttagcaa ccggtataat tgcccgagca atagctgaca aataccactc 4560

tagtgtgtac tcactcccgc cagatccaga ccactttgat ggatacaaac agcaagtggt 4620

cacagttatg gacgatctat gccaaaatcc tgatggcaag gatatgtcac tcttttgtca 4680

gatggtatcc accgtagatt ttatcccacc aatggcttct ttggaagaga aaggggtttc 4740

attcacatct aaatttgtta ttgcatccac taatgccagc aacatcatag taccaacagt 4800

gtctgattct gatgctattc gccgcaggtt ctacatggac tgcgacatcg aggtaactga 4860

ctcatataaa acagatttgg gtaggttaga tgctggaaga gctgccaaat tatgctctga 4920

aaataacaca gcaaacttca aacgctgtag cccactggtg tgtgggaagg ccatccaatt 4980

aagagatagg aagtccaaag ttagatacag tgtggatacg gtggtttcag agctcataag 5040

ggaatacaat aacaggtctg ccattggaaa cacaattgaa gcgttgttcc aggggccacc 5100

caagtttaga cctattagaa ttagtcttga ggaggcgcca gcaccagatg ttattagcga 5160

tctacttgcc agtgtggata gtgaagaggt gcgccaatac tgtagagacc aaggttggat 5220

cataccagaa acccctacca acgttgagcg acatttaagt agggctgtgc taatcatgca 5280

atccattgcc acggtcgttg cagtggtctc actggtgtat gttatctaca agctttttgc 5340

tggatttcag ggtgcgtatt ctggcgctcc taagcaagtg ctcaagaaac ccatcctccg 5400

cacggcaaca gtgcaaggac ctagccttga ttttgcccta tccctactga gaaggaatat 5460

caggcaggtt cagacagatc aagggcactt cactatgctg ggtgtcaggg atcgcttggc 5520

agttctcccg cgccactcgc agcccggaaa aacaatctgg gtggaacaca aactcgtgaa 5580

catcctggat gctgtcgagt tggtggatga gcaaggggtt aacctagagc tcactctaat 5640

cactcttgat accaatgaga agttcagaga tatcaccaag ttcattccag aaaacatcag 5700

cgctgctagt gacgccaccc tagtgattaa tacagaacac atgccctcaa tgtttgtacc 5760

tgtgggagat gtcgtacaat acggtttcct gaatctcagt ggaaagccca cccatcgcac 5820

catgatgtac aacttcccca ctaaggcagg acagtgtgga ggagtggtga catcagttgg 5880

gaaagttatt ggaattcaca taggaggcaa tggtaggcaa gggttctgtg cgggacttaa 5940

gaggagctac tttgccagtg agcaaggaga gattcaatgg gtaaagccta acaaagaaac 6000

tgggagactc aacatcaacg ggccaactcg cactaagctc gaacctagtg tgttccatga 6060

tatctttgag ggcaacaagg aaccagcggt cttacacagc aaagaccctc gtctcgaggt 6120

ggattttgag caggcattat tctccaagta tgtaggaaac actatacatg agcctgatga 6180

atatatcaag gaggcagcct tacattatgc aaatcagttg aagcagctaa atatagacac 6240

ttctcaaatg agcatggaag aggcttgcta cggcacagac aaccttgaag ctattgacct 6300

tcacactagt gcaggctacc cctacagcgc cttggggatc aagaagagag atatcttaga 6360

ccccaccacc agggatgtga gtaagatgaa gttctacatg gacaagtatg gtcttgatct 6420

cccttactct acttatgtta aggatgagct acgctcaata gataagatca agaaggggaa 6480

atcccgctta attgaagcta gcagtttgaa cgactcagtt tacctcagaa tggccttcgg 6540

acatctctat gagactttcc atgcaaaccc tgggactgtg actggttcgg ctgtgggatg 6600

taacccggat gtgttctgga gcaagttgcc aatcctgctc cctggttccc tctttgcttt 6660

tgactactcg ggctatgatg ctagtctcag cccagtttgg ttcagagcat tggagctagt 6720

tcttagagag ataggttacg gtgacgaggc aatcttgctc atcgaaggga tcaatcatac 6780

acaccatgta tatcgcaaca aaacttattg cgtacttggt gggatgccat caggctgttc 6840

aggaacatcc attttcaatt caatgattaa caacattatc attagatcat tgcttatcaa 6900

aacttttaag ggtattgacc tggatgaact caacatggtt gcttatgggg acgatgtact 6960

tgctagttac ccttttccta ttgactgctc agaactagca agaacaggca aggagtatgg 7020

tttaaccatg acccccgcag ataagtctcc ttgcttcaat gaagttaatt gggaaaatgc 7080

aacctttctt aagaggggtt tcttgcctga tgaacaattt ccattcttga ttcaccccac 7140

catgccaatg aaggagattc acgaatccat tcggtggacc aaggatgcac gcaatactca 7200

agatcacgtg cgatccttgt gtctattggc gtggcacaac ggcaaacaag aatatgaaaa 7260

attcgtaagt gcaattaggt ctgtcccaat aggaaaggca ctggctattc caaattatga 7320

aaacctgaga cgcaattggc tcgaattatt ttagaggtcg aatacacctc aaccccacca 7380

ggaatctggt cgtgaatatg actggtgggg gtaaatttgt tataaccaga atagc 7435

<210> 13

<211> 870

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Glu Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Lys

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Arg Gln Asp Phe Ala Gln

35 40 45

Asp Pro Ala Lys Phe Thr Arg Pro Val Leu Asp Thr Ile Arg Glu Val

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Gln Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Ser Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Met His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Ala Ile Pro Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Pro Val Ser

195 200 205

Lys Pro Asn Gly Lys Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro

210 215 220

Gly Lys Asn Gly Gln Glu Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Pro Leu Ser Gln Ala Leu Val Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu

245 250 255

Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu

260 265 270

Pro Phe Asp Ser Ala Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Val Val Ile

275 280 285

Pro Ile Ser Pro Leu Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro

290 295 300

Ile Thr Leu Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg

305 310 315 320

Gln Ala Ile Lys Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Ser Asn

325 330 335

Gln Phe Leu Thr Thr Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly

340 345 350

Phe Glu Pro Thr Pro Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu

355 360 365

Leu Asp Leu Cys Gln Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Gly Val Asn Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn

385 390 395 400

Asn Val Asp Gln Leu Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn

405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala

450 455 460

Gln Pro Val Thr Arg Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Phe Arg Ala Val Lys Thr Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr

500 505 510

Ala Thr Gly Ile Val Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro

515 520 525

Pro Asp Thr Pro Thr Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln

530 535 540

Lys Asn Phe Thr Leu Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Gln Gln

545 550 555 560

Thr Ala Val Tyr Gln Asn Gly Pro Ile Thr Asp Ala Val Glu Ser Ala

565 570 575

Val Ser Ala Leu Ala Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn

580 585 590

Thr Ala Ala Ser Thr His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu

595 600 605

Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu

610 615 620

Ile Glu Thr Arg Cys Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser

625 630 635 640

Val Glu His Phe Tyr Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val

645 650 655

Lys Asp Ser Gly Thr Ser Leu Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp

660 665 670

Val Met Gly Phe Val Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr

675 680 685

Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asp Ser

690 695 700

Thr Thr Pro Gly Met Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala

705 710 715 720

Pro Lys Pro Asp Ser Arg Asn Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn

725 730 735

Pro Ser Ile Phe Ala Lys Leu Arg Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val

740 745 750

Pro Phe Met Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr

755 760 765

Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln

770 775 780

Cys Pro Asn Asn Met Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu

785 790 795 800

Ser Thr Thr Gly Lys Asn Val Arg Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys

805 810 815

His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser Gln Ala Tyr Met

820 825 830

Val Lys Asn Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Thr Asn Thr Ala Ala

835 840 845

Asp Arg Ala Ser Ile Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala

850 855 860

Asn Pro Gln Arg Thr Ser

865 870

<210> 14

<211> 2610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggcgctc aagtttcaac agaaaaatct gggtcgcacg agacaaagaa tgtagcgacc 60

gaagggtcta ctatcaattt caccaacatc aattactata aggattctta tgcagcgtca 120

gctagtagac aggactttgc acaagacccc gcaaagttca cacgccccgt cttggatacc 180

atcagggagg ttgcagcccc gctgcaatcc ccttctgttg aggcatgcgg ttatagtgac 240

cgagttgcac agttgactgt gggcaactca accattacta cccaggaggc agccaacatt 300

gtattgagtt acggagagtg gccagaatat tgtccctcca cggatgctac agctgtggac 360

aaacctactc gccctgacgt gtcagtgaat aggttctaca cactgtcaac taagagttgg 420

aagacagaat ctactggctg gtactggaaa ttccctgatg tgctaaatga cacaggagta 480

tttggtcaaa acgcccaatt ccactacttg taccgctcgg gtttctgcat gcacgttcag 540

tgtaatgcaa gcaagttcca tcagggggcc cttttagtgg ctgcaatccc cgaatttgtg 600

gttgctgcaa gcagccccgt ctcgaagcct aatggaaaag ggttgtaccc agatttcgcc 660

cacactaacc caggtaaaaa tggccaagag tttcgagacc cttatgtctt ggatgctggt 720

gtccccctaa gtcaagcact ggtttacccc catcaatgga tcaatctacg aactaataac 780

tgcgcgacca ttattatgcc atatgtcaat gcgcttccat ttgattcagc gcttaaccac 840

tcaaattttg gattggttgt gatccctatt agtcccttaa aatattgtaa tggggctacc 900

acagaagtgc caatcacact aactattgcc ccacttaact cggagtttag cggtctccga 960

caagcaataa aacaagggtt ccccacagag ctcaagcctg gttccaatca gtttctcaca 1020

accgatgacg ggacgtcccc accaatactg cccggttttg aaccaactcc attgattcac 1080

attcctggtg aattcacctc cttgttagat ttgtgtcaaa tagaaaccat actagaagtc 1140

aataacacca ctggcaccac tggagtcaat agattactaa tccctgttcg agcacagaac 1200

aatgtggacc agttgtgcgc atcattccaa gtagaccctg ggcgcaatgg cccatggcaa 1260

tccacaatgg tcggtcagat ctgcaggtat tacactcaat ggtcaggttc ccttaaggta 1320

acctttatgt tcacaggttc tttcatggct acagggaaaa tgctgatagc ctatacaccg 1380

cctggtagtg ctcagcccgt tacaagagaa gcagcaatgc ttgggactca tatagtgtgg 1440

gattttggct tgcaatcatc agttaccctg gtcatacctt ggatcagtaa tacccatttt 1500

agagcagtta agactggagg ggtatacgac tactatgcaa ccgggatcgt caccatttgg 1560

taccaaacca actttgtagt gccaccagac acccccactg aggctaatat tatagctctt 1620

ggagcagcac agaaaaactt taccctaaag ttgtgtaagg acactgacga gatccagcaa 1680

acagcagtgt accaaaatgg tcccattaca gatgcagtgg aaagcgctgt gagcgcgctt 1740

gctgacacca caatatcccg ggtgaccgca gccaacactg cagctagcac ccactccctg 1800

ggaacagggc gtgtaccagc actgcaagcc gcagaaacgg gagcaagctc taacgccagt 1860

gatgaaaacc ttattgagac ccgctgtgtg atgaatcgaa acggggttaa tgaggcgagc 1920

gtggaacact tttactctcg tgcagggctg gtaggagttg tggaggtgaa ggactcgggc 1980

actagcctgg atgggtacac agtttggccc atagatgtga tgggcttcgt gcaacagcgg 2040

cgcaagctag agttgtcaac atacatgcgc tttgatgccg agttcacttt tgtgtccaac 2100

ctcaatgaca gcacgacacc cgggatgctg ctgcagtata tgtatgtgcc accaggggcc 2160

cctaagccag acagcaggaa ttcataccaa tggcagactg ctactaaccc gtcgatattc 2220

gcaaaattga gagatccacc cccccaggta tctgtcccgt tcatgtcgcc agcaacggcc 2280

tatcagtggt tttatgatgg ttaccctaca tttggtgaac acaaacaagc caccaatttg 2340

caatatgggc aatgtcctaa taacatgatg ggccattttg ctatccgaac agtcagtgaa 2400

tctaccaccg ggaaaaacgt ccgcgttcgg gtgtacatga gaattaagca cgtgagagct 2460

tgggtaccta gaccccttcg atcccaagca tatatggtca agaactaccc gacatacagc 2520

cagacaataa ctaacactgc agctgaccgt gcaagcataa ccaccacgga ttatgaaggc 2580

ggagtaccag caaacccaca gaggacatct 2610

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctattggatt ggccatccag tgaccaacag 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgtgagct actttcccat actaaatttg 30

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccccactga ggctaacat 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcgtgagct actttccc 18

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cyttgtgcgc ctgtttt 17

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

attgtcacca taagcagcc 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caagyacttc tgtmwcccc 19

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cccaaagtag tcggttcc 18

Claims

1.柯萨奇病毒A6型毒株，其特征在于，所述毒株的VP4、VP2、VP3、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示；

和/或，

所述毒株的2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A6型毒株，其特征在于，所述毒株的基因组序列如SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.12所示序列的完全互补序列所示。

3.根据权利要求1或2所述的柯萨奇病毒A6型毒株，其特征在于，所述毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20386。

4.生物材料，其特征在于，其为以下（1）-（8）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.4所示的VP1蛋白；

（2）序列如SEQ ID NO.13所示的P1蛋白；

（3）序列如SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

（5）含有（3）或（4）中所述核酸分子的表达盒；

（6）含有（3）或（4）中所述核酸分子的重组载体；

5.一种柯萨奇病毒A6型毒株的病毒样颗粒，其特征在于，其含有选自VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D蛋白中的任意一种或多种；

其中，VP4、VP2、VP3、VP1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4所示；

2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6、7、8、9、10和11所示。

6.免疫原性组合物，其特征在于，其含有权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A6型毒株或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的病毒样颗粒。

7.权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A6型毒株或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的病毒样颗粒或权利要求6所述的免疫原性组合物的以下（1）-（9）中任意一种应用：

（5）在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

（8）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

8.一种产品，其特征在于，其含有以下（1）-（5）中的任意一种或多种的组合：

（1）权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A6型毒株；

（2）权利要求4所述的生物材料；

（3）权利要求5所述的病毒样颗粒；

（4）权利要求6所述的免疫原性组合物；

（5）以权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A6型毒株或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的病毒样颗粒或权利要求6所述的免疫原性组合物为免疫原免疫动物制备得到的抗体或抗血清。

9.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A6型毒株或包含权利要求4所述的生物材料。

10.权利要求9所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1~3任一项所述的柯萨奇病毒A6型毒株在Vero细胞上培养，收获病毒液，经灭活和纯化获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。