CN114717265B

CN114717265B - 一种适用于柯萨奇病毒a6培养的新型稳转细胞系及其应用

Info

Publication number: CN114717265B
Application number: CN202210388646.6A
Authority: CN
Inventors: 岳磊; 谢忠平; 李华; 谢天宏; 杨婷; 向虹; 王杰; 何鑫; 严敏
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114717265A

Abstract

本发明提供了一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系及其应用，构建所述新型稳转细胞系包括构建hKREMEN1慢病毒过表达载体、病毒包装和稳转细胞筛选。本发明克服了CVA6病毒在Vero细胞增殖不理想的问题，利用慢病毒技术，在非洲绿猴肾细胞（Vero）中过表达人KREMEN1基因，通过构建可稳定表达hKREMEN1受体的Vero细胞，大大提高了CVA6病毒在Vero细胞上的增殖能力，为手足口病疫苗研发奠定了良好基础，有利于疫苗制备及其有效性的评价。

Description

一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系及其应用

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，特别涉及一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系及其应用。

背景技术

手足口病常见于6岁以下婴幼儿，能够引起手、足、口等部位疱疹，也可以造成疱疹性咽颊炎、心肌炎、脑炎，严重者可导致死亡。引起手足口病的主要病原体包括EV71、CVA16、CVA6、CVA10、EVD68等多种肠道病毒。一直以来，EV71是引起手足口病，尤其是重症的主要病原体。2016年，EV71疫苗成功上市，并得到广泛接种。但是，EV71疫苗对引起手足口病的其他病原体并无交叉保护作用。目前手足口病的流性特征逐渐转变为CVA16、CVA6、CVA10等柯萨奇病毒占主导，多种肠道病毒共存。所以，研制针对CVA6等柯萨奇病毒的疫苗对于全面防控手足口病尤为重要。

多年来，研究人员在开发CVA6等手足口病相关柯萨奇病毒疫苗过程中难有突破。手足口病疫苗的开发策略主要包括：灭活、减毒、亚单位、VLP、核酸疫苗。随着EV71灭活疫苗的广泛接种，由EV71病毒引起的手足口病，尤其是重症得到了有效控制。借鉴EV71的成功经验，人们首先尝试灭活CVA6疫苗的开发。

目前CVA6病毒疫苗研发遇到的难点主要是：CVA6病毒在疫苗生产常用细胞(比如Vero细胞)上的分离和适应性较差。对于疫苗研发，分离和培养病毒是第一步。根据目前报道，CVA6等病毒分离多采用的是RD细胞。RD细胞属于肿瘤细胞，通过该细胞分离培养的病毒不可以用于疫苗生产。再者，细胞适应性的病毒不仅是疫苗生产的原料，也是评价疫苗保护效果的攻毒用毒株，而CVA6在RD细胞上的增殖能力也不理想。可见，缺乏易感的疫苗生产用细胞是当前限制疫苗研发的关键问题。

因此，如何能够获得适用于CVA6病毒培养的细胞系，是一个需要解决的问题。

发明内容

为了克服CVA6病毒在Vero细胞增殖不理想的问题，本发明的目的在于提供一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系及其应用，提高CVA6病毒在Vero细胞上的增殖能力。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，载体构建：

合成人源hKREMEN1基因片段，在Vero细胞中表达人KREMEN1基因，采用广谱性EFS启动子，构建hKREMEN1慢病毒过表达载体；

所述人源hKREMEN1基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2，病毒包装：

将步骤1构建得到的hKREMEN1慢病毒过表达载体，导入慢病毒包装细胞中进行转染，完成病毒包装，产生高滴度含人源hKREMEN1基因的慢病毒；

步骤3，稳转细胞筛选：

将上述高滴度含人源hKREMEN1基因的慢病毒加至Vero细胞中，并在转染一定时间后，利用嘌呤霉素进行筛选，从而获得稳定转染人源hKREMEN1的Vero细胞，即为所述适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系。

进一步的，步骤1构建得到的hKREMEN1慢病毒过表达载体为重组质粒：LV-EFS>hKREMEN1-CMV>EGFP/T2A/Puro。

进一步的，步骤2所述慢病毒包装细胞为293T细胞。

本发明的另一方面：

一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系，所述细胞系由上述构建方法构建得到。

本发明的第三方面：

一种上述适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系在制备疫苗中的应用。

进一步的，所述疫苗对CVA6病毒引起的手足口病具有预防保护作用。本发明相比现有技术的有益效果为：

本发明构建了稳定表达人源KREMEN1受体的Vero细胞，证明了CVA6病毒在该细胞系上比原始Vero细胞具有更优的增殖特性，为柯萨奇病毒疫苗A6的研发提供了一种新的细胞系，为手足口病疫苗研发奠定了良好基础，有利于疫苗制备及其有效性的评价。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1为过表达细胞的病毒转导效果图；其中，左图为自然光下细胞形态，右图为绿色荧光检测效果；

图2为CVA6病毒在对照细胞和实施例1所述新型稳转细胞系中增殖能力比较结果图。

具体实施方式

实施例

本实施例提供了一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，载体构建：

全基因合成人源hKREMEN1(NCBI参考序列：NM_032045.5)，基因序列为：

ATGGCGCCGCCAGCCGCCCGCCTCGCCCTGCTCTCCGCCGCGGCGCTCACGCTGGCGGCCCGGCCCGCGCCTAGCCCCGGCCTCGGCCCCGGACCCGAGTGTTTCACAGCCAATGGTGCGGATTATAGGGGAACACAGAACTGGACAGCACTACAAGGCGGGAAGCCATGTCTGTTTTGGAACGAGACTTTCCAGCATCCATACAACACTCTGAAATACCCCAACGGGGAGGGGGGCCTGGGTGAGCACAACTATTGCAGAAATCCAGATGGAGACGTGAGCCCCTGGTGCTATGTGGCAGAGCACGAGGATGGTGTCTACTGGAAGTACTGTGAGATACCTGCTTGCCAGATGCCTGGAAACCTTGGCTGCTACAAGGATCATGGAAACCCACCTCCTCTAACTGGCACCAGTAAAACGTCCAACAAACTCACCATACAAACTTGCATCAGTTTTTGTCGGAGTCAGAGGTTCAAGTTTGCTGGGATGGAGTCAGGCTATGCTTGCTTCTGTGGAAACAATCCTGATTACTGGAAGTACGGGGAGGCAGCCAGTACCGAATGCAACAGCGTCTGCTTCGGGGATCACACCCAACCCTGTGGTGGCGATGGCAGGATCATCCTCTTTGATACTCTCGTGGGCGCCTGCGGTGGGAACTACTCAGCCATGTCTTCTGTGGTCTATTCCCCTGACTTCCCCGACACCTATGCCACGGGGAGGGTCTGCTACTGGACCATCCGGGTTCCGGGGGCCTCCCACATCCACTTCAGCTTCCCCCTATTTGACATCAGGGACTCGGCGGACATGGTGGAGCTTCTGGATGGCTACACCCACCGTGTCCTAGCCCGCTTCCACGGGAGGAGCCGCCCACCTCTGTCCTTCAACGTCTCTCTGGACTTCGTCATCTTGTATTTCTTCTCTGATCGCATCAATCAGGCCCAGGGATTTGCTGTTTTATACCAAGCCGTCAAGGAAGAACTGCCACAGGAGAGGCCCGCTGTCAACCAGACGGTGGCCGAGGTGATCACGGAGCAGGCCAACCTCAGTGTCAGCGCTGCCCGGTCCTCCAAAGTCCTCTATGTCATCACCACCAGCCCCAGCCACCCACCTCAGACTGTCCCAGGTAGCAATTCCTGGGCGCCACCCATGGGGGCTGGAAGCCACAGAGTTGAAGGATGGACAGTCTATGGTCTGGCAACTCTCCTCATCCTCACAGTCACAGCCATTGTAGCAAAGATACTTCTGCACGTCACATTCAAATCCCATCGTGTTCCTGCTTCAGGGGACCTTAGGGATTGTCATCAACCAGGGACTTCGGGGGAAATCTGGAGCATTTTTTACAAGCCTTCCACTTCAATTTCCATCTTTAAGAAGAAACTCAAGGGTCAGAGTCAACAAGATGACCGCAATCCCCTTGCAATTCAGGACTCGGAAGTGACATCACTCATCTGGTCTCAGGGGCAGCCCAGAAGTATCTGA。

酶切回收KREMEN1片段，克隆到慢病毒载体。挑取4个单菌落接种于氨苄青霉素抗性的培养液中，培养过夜后，用小量质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)抽提质粒，质粒用AscI进行酶切鉴定，挑取阳性克隆进行测序验证，并将正确的重组质粒LV-EFS>hKREMEN1-CMV>EGFP/T2A/Puro用于下一步细胞转染，即hKREMEN1慢病毒过表达载体。

步骤2，病毒包装：

将上述步骤1构建得到的hKREMEN1慢病毒过表达载体包装慢病毒并进行滴度检测，确保病毒质量满足后续实验要求。具体步骤为：在转染前1天传代准备状态良好、处于对数生长期的293T细胞进行慢病毒包装；用0.25％胰蛋白酶消化293T细胞，10％血清的DMEM培养基培养24h，当细胞密度增加至80％以上时即可用于转染；在转染前2-4h用5mL不含抗生素的完全培养基换液。将步骤1构建得到的hKREMEN1慢病毒过表达载体和慢病毒对照质粒分别导入293T细胞；转染8h后，更换适量的新鲜培养液；可收集转染后48小时的慢病毒颗粒上清，并超速离心(50000g，2h，4℃)浓缩，完成病毒包装，产生高滴度含hKREMEN1基因的慢病毒。

步骤3，稳转细胞筛选：

取培养后的Vero细胞，用计数板调整细胞密度并接种于六孔板，分别加入含HumanKREMEN1基因的慢病毒75μL，5％CO₂ 37℃培养24h。分别在转染24h、48h、72h进行荧光显微拍照(100×)，转染48h结果如图1所示。为了获得稳定表达Human KREMEN1的Vero细胞系，转染48h后将细胞转移至10cm培养皿进行培养，更换为含嘌呤霉素(8mg·L^-1)的新鲜培养基，重复3次，获得稳定转染人源hKREMEN1的Vero细胞，即为所述适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系。

测试例

本测试例采用转染对照载体质粒的Vero细胞作为阴性对照，对实施例1获得的已转染的高表达Human KREMEN1的Vero细胞进行实时荧光定量PCR检测。

首先利用Trizol法提取细胞中的RNA，并将其逆转录成cDNA，并进行稀释，在50℃20min，95℃10min，95℃30s，60℃30s的条件下进行40个循环。并对所得结果进行分析，判断目的基因表达情况。

从上表可知，Human KREMEN1在Vero中实现了高表达，表达效率约为对照细胞的33倍。

进一步的，本测试例还评价了CVA6在实施例1所述新型稳转细胞系的增殖效果。具体操作为：

通过绘制CVA6在稳定转染Human KREMEN1的Vero细胞、转染空载体的Vero细胞，及原始Vero细胞上的增殖曲线，评价CVA6的增殖效果。感染前18-24小时进行不同细胞铺板(6孔细胞培养板)，感染时细胞密度控制在80％左右；第二天加入适量病毒悬液(MOI＝0.1)，37℃孵育；继续培养60小时，分别在0，12，24，36，48，60小时收获病毒；采用微孔病变法在RD细胞进行病毒滴度测定。

结果如图2所示，与原始Vero细胞和转染空载体的对照Vero细胞相比，CVA6在稳定表达Human KREMEN1的Vero细胞上感染性滴度显著升高。

最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种适用于柯萨奇病毒A6培养的新型稳转细胞系及其应用

<141> 2022-04-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggcgccgc cagccgcccg cctcgccctg ctctccgccg cggcgctcac gctggcggcc 60

cggcccgcgc ctagccccgg cctcggcccc ggacccgagt gtttcacagc caatggtgcg 120

gattataggg gaacacagaa ctggacagca ctacaaggcg ggaagccatg tctgttttgg 180

aacgagactt tccagcatcc atacaacact ctgaaatacc ccaacgggga ggggggcctg 240

ggtgagcaca actattgcag aaatccagat ggagacgtga gcccctggtg ctatgtggca 300

gagcacgagg atggtgtcta ctggaagtac tgtgagatac ctgcttgcca gatgcctgga 360

aaccttggct gctacaagga tcatggaaac ccacctcctc taactggcac cagtaaaacg 420

tccaacaaac tcaccataca aacttgcatc agtttttgtc ggagtcagag gttcaagttt 480

gctgggatgg agtcaggcta tgcttgcttc tgtggaaaca atcctgatta ctggaagtac 540

ggggaggcag ccagtaccga atgcaacagc gtctgcttcg gggatcacac ccaaccctgt 600

ggtggcgatg gcaggatcat cctctttgat actctcgtgg gcgcctgcgg tgggaactac 660

tcagccatgt cttctgtggt ctattcccct gacttccccg acacctatgc cacggggagg 720

gtctgctact ggaccatccg ggttccgggg gcctcccaca tccacttcag cttcccccta 780

tttgacatca gggactcggc ggacatggtg gagcttctgg atggctacac ccaccgtgtc 840

ctagcccgct tccacgggag gagccgccca cctctgtcct tcaacgtctc tctggacttc 900

gtcatcttgt atttcttctc tgatcgcatc aatcaggccc agggatttgc tgttttatac 960

caagccgtca aggaagaact gccacaggag aggcccgctg tcaaccagac ggtggccgag 1020

gtgatcacgg agcaggccaa cctcagtgtc agcgctgccc ggtcctccaa agtcctctat 1080

gtcatcacca ccagccccag ccacccacct cagactgtcc caggtagcaa ttcctgggcg 1140

ccacccatgg gggctggaag ccacagagtt gaaggatgga cagtctatgg tctggcaact 1200

ctcctcatcc tcacagtcac agccattgta gcaaagatac ttctgcacgt cacattcaaa 1260

tcccatcgtg ttcctgcttc aggggacctt agggattgtc atcaaccagg gacttcgggg 1320

gaaatctgga gcatttttta caagccttcc acttcaattt ccatctttaa gaagaaactc 1380

aagggtcaga gtcaacaaga tgaccgcaat ccccttgcaa ttcaggactc ggaagtgaca 1440

tcactcatct ggtctcaggg gcagcccaga agtatctga 1479

Claims

1.一种适用于柯萨奇病毒A6培养的稳转细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，载体构建：

所述人源hKREMEN1基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2，病毒包装：

步骤3，稳转细胞筛选：

将上述高滴度含人源hKREMEN1基因的慢病毒加至Vero细胞中，并在转染一定时间后，利用嘌呤霉素进行筛选，从而获得稳定转染人源hKREMEN1的Vero细胞，即为所述适用于柯萨奇病毒A6培养的稳转细胞系。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1构建得到的hKREMEN1慢病毒过表达载体为重组质粒：LV-EFS>hKREMEN1-CMV>EGFP/T2A/Puro。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2所述慢病毒包装细胞为293T细胞。

4.一种适用于柯萨奇病毒A6培养的稳转细胞系，其特征在于，所述细胞系由如权利要求1或2构建方法构建得到。

5.一种如权利要求4所述适用于柯萨奇病毒A6培养的稳转细胞系在制备疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗对CVA6病毒引起的手足口病具有预防保护作用。