CN107760719B - 柯萨奇病毒在过继免疫基因递送系统中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了柯萨奇病毒在过继性免疫治疗基因递送中的应用，所述柯萨奇病毒为柯萨奇B组3型病毒。可将柯萨奇病毒感染细胞后，采用IL‑7和/或IL‑15进一步激活细胞。本发明所述柯萨奇病毒具有小RNA病毒增殖的特性，仅在生存周期中进行RNA的复制，不会逆转录成DNA，不会整合基因组，外源基因通过RNA基因瞬时表达，无过量表达的细胞毒性，安全性大大提升。本发明所述用于免疫细胞治疗的基因递送系统具有巨大的发展潜力。

Description

柯萨奇病毒在过继免疫基因递送系统中的应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗的生物制品领域，具体地，本发明涉及一种柯萨奇病毒在 过继免疫基因递送系统中的应用。
背景技术
过继性免疫疗法(ACT)是将基因修饰的T淋巴细胞转移到应用对象，从而针对性治疗疾病的疗法。过继性免疫疗法在多种类型疾病的治疗方向具有巨大的潜能，所述疾病包 括癌症、感染性疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病和免疫缺陷。基因修饰是过继性免疫疗法 的重要步骤，起着增强效应性、增强靶向性、减低异体排异性等作用。
目前为止，过继性免疫疗法的基因修饰方式多种多样，临床最常见的就是逆转录病 毒和慢病毒载体介导的基因递送系统。同时，在过继性免疫疗法方面具有研发应用前景的其 他递送系统还包括mRNA电转染、睡美人转座子、微环DNA、腺病毒等。
T淋巴细胞作为过继性免疫疗法的承载体，其基因转导方式尚存在着效率低、基因组 整合引发的致癌风险和持续表达风险，以及制备繁琐、应用成本高昂等现状。而且，T淋巴 细胞本身原因造成基因递送较低，即使是非常成熟的慢病毒载体系统其递送效率可能也仍然 仅在60％左右。且慢病毒载体的应用伴随着多方面的顾虑，如其来源于HIV病毒、其外源 基因在基因组随机整合的特性等都造成了慢病毒载体应用的困扰。积极开发新型T淋巴细胞 载体，作为候选基因递送系统具有广阔市场。
发明内容
本发明的目的在于提供柯萨奇病毒在过继免疫基因递送系统中的应用。柯萨奇病毒 能够避免现有常用慢病毒载体在基因递送同时发生基因整合所带来的风险。具体的说，将柯 萨奇病毒感染免疫细胞并递送表达外源基因，用于过继免疫疗法。
柯萨奇病毒是一种可以感染人类的小RNA病毒，一般情况下仅在儿童中具有感染症 状，且其感染具有自愈性。柯萨奇B组3型(CVB3)病毒是柯萨奇病毒的一个重要亚型。CVB3病毒无包膜，基因组为单链正义RNA，长度为7400nt左右。
柯萨奇病毒因为其弱致病性，成为病毒载体的备选方案。同时，CVB3作为病毒载体还具有以下优点：外源基因不整合进宿主细胞、外源基因以RNA形式瞬时表达、能够感染 非分裂期细胞、拥有成熟的小鼠动物模型而评价方便。
本发明的具体方案如下：
柯萨奇病毒在过继免疫基因递送系统中的应用。优选的，所述柯萨奇病毒为柯萨奇B组3 型病毒。
本发明一个优选的技术方案，在所述柯萨奇病毒的5’-非翻译区与VP4蛋白基因之间 插入外源基因。进一步优选通过SfiI酶切位点在5’-非翻译区与VP4蛋白基因之间插入外源 基因。
本发明一个优选的技术方案，在外源基因与VP4蛋白基因之间插入3C蛋白酶特异性 切割位点的基因。外源基因表达产物与病毒蛋白通过3C蛋白切割，游离形成单独的蛋白。
本发明一个优选的技术方案，在所述柯萨奇病毒的VP1基因与2A基因之间插入外源 基因。外源基因表达产物在2A蛋白作用形成游离蛋白。
本发明所述的应用，可在将柯萨奇病毒转染细胞前，采用IL-7和/或IL-15激活细胞。优选IL-7和/或IL-15的用量为5-150ng/ml，优选40ng/ml。
本发明所述的应用，所述外源基因可以选自细胞结构组成分子、细胞物质运输分子、细胞能量转化分子、细胞信号通路分子、细胞周期调控分子、细胞增殖与分化相关分子、细胞运动调节分子和细胞报告分子中的一种或几种。
本发明另一目的在于提供一种过继免疫基因递送系统，由柯萨奇病毒转染细胞由制 得。
本发明的一个优选方案，CVB3病毒载体能够感染Jurkat T淋巴细胞，并向其递送外 源基因而不进行整合，达到瞬时表达的作用。
本发明所述的病毒载体基于减毒的柯萨奇B病毒Woodruff株。
本发明一个具体实施例为采用增强型绿色荧光蛋白(eGFP，enhanced greenfluorescent protein)作为外源蛋白进行病毒载体性能指证的模式蛋白。
优选的，本发明可用于T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞的细胞治疗基因 递送。
优选的，本发明可用于向T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞等用于细胞治 疗的细胞递送嵌合抗原受体基因(chimeric antigen receptor，CAR)、自杀基因(suicidegene)、淋巴细胞因子基因(如IL-12)等修饰细胞的外源基因。
本发明的优点：
本发明通过弱毒性病毒株的选取与进一步优化，特异性采用小RNA病毒家族的柯萨奇B3 病毒构建外源基因递送载体，并通过在Jurkat细胞中的传代获得全新的病毒载体，具有更强 的适应性和感染能力、外源基因递送能力。
柯萨奇病毒载体基于小RNA病毒增殖的特性，仅在生存周期中进行RNA的复制，不会逆转录成DNA，所以不会整合基因组。作为RNA病毒载体，外源基因通过RNA基因瞬时 表达，无过量表达的细胞毒性。通过筛选病毒弱毒株构建病毒载体，虽然感染性有所降低， 但安全性大大提升。作为免疫细胞治疗基因递送的备选方案，该发明具有巨大的发展潜力。
附图说明
图1为质粒pCVB3-SE构建的基因结构示意图。
图2为质粒pCVB3-SE酶切鉴定电泳结果图。
图3为质粒pCVB3-SE经过T7体外转录后得到的RNA产物电泳结果图。
图4为CVB3-SE病毒载体在HeLa中盲传第3代观察明场和荧光的记录。
图5为CVB3-SE病毒载体感染Jurkat细胞后不同时间点观察明场和荧光的记录。
图6为Jurkat细胞感染CVB3-SE、CVB3-Nancy后不同时间点的病毒增殖对比。
图7为CCK-8法评价CVB3-SE病毒载体对细胞活性的影响。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的 含义。
面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举 例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、CVB3-SE载体的构建与体外转录
增强型绿色荧光蛋白(eGFP，enhanced green fluorescent protein)作为外源蛋白，设计CVB3 载体，以Woodruff株为模板，经过Jurkat细胞的病毒多次传代获得突变体，其具体序列与原 Woodruff株序列的差异见表1，进行载体构建。通过SfiI酶切位点在5’-非翻译区与VP4蛋白 基因之间插入绿色荧光蛋白基因，在外源基因和VP4蛋白中插入3C蛋白酶特异性切割位点， 基因结构示意图如图1所示，委托北京奥科生物科技有限公司进行全基因合成，然后插入上 游含有T7启动子的质粒多克隆位点NotI和ClaI之间。经测序正确，使用Qiagen公司的质粒 纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得两个组合的重组表达载体的去内毒素质粒，即得到质粒 pCVB3-SE。
表1载体构建序列与原Woodruff株序列突变比较
Figure BDA0001442842590000041
使用ClaI酶切进行质粒酶切线性化处理，结果如图2所示，单酶切和双酶切的片段大小都 与插入外源基因后的基因片段大小相符，表明pCVB3-SE构建成功(泳道M：5K DNAMaker，泳道1：pCVB3-SE质粒XbaI单酶切，泳道2：pCVB3-SE质粒XbaI和HindIII双 酶切)。接着进行T7体外转录。按照下表配置体外转录混合物，然后37℃温育3h；体外转 录结束后，然后加入5μl DNase，37℃作用5min，去除原有模板。接着，按照RNeasy Plus Mini kit的说明书进行回收纯化RNA操作。然后对RNA产物进行电泳鉴定。结果如图3所 示(泳道1：RNAMarker 10000nt，泳道2：pCVB3-SE的T7转录产物)，条带大小与预期 ～8100nt大小相当，说明成功获得带有外源基因的病毒RNA转录产物。
PCR反应条件如下：
Figure BDA0001442842590000042
实施例2、CVB3-SE病毒载体转染与盲传
RNA转染HeLa细胞，基本按照thermo公司turbefact转染说明进行。具体步骤如下：1)转 染前铺板：消化HeLa细胞制成单细胞悬液，根据实验需要将适量细胞铺至相应的细胞培养 板中。以24孔板为例，按照5×104/孔的密度铺种细胞至24孔板，当培养板中的细胞生长至 覆盖60-80％孔底面积时进行转染。2)将1μg、2μg、4μgRNA与转染试剂按1:4的比例稀释 于50μl Opti-MEM培养基，形成转染复合物。设置1个对照孔注意：转染试剂不要接触到EP管的管壁。3)轻微吹打混匀后室温孵育15min，直接加入铺种的细胞板中。4)轻轻摇动培养板，使转染复合物均匀分布在培养板中。5)将培养板置于37℃、5％CO2恒温孵箱培养24-48h。培养过后，将细胞培养物反复冻融3次，取上清加入下一轮HeLa细胞中，进行感 染。如此3次，完成盲传。在盲传过程中观察病毒引起的细胞病变效应(CPE)和绿色荧光 蛋白表达情况。最后一次盲传病毒载体感染6小时后明场和绿色荧光分别由图4A和图4B 展示。结果表明，在常规细胞系中，该病毒载体能够高效递送外源基因进行表达。
实施例3、CVB3-SE病毒载体向Jurkat细胞递送绿色荧光蛋白的记录
为了评价CVB3-SE病毒载体向Jurkat细胞递送外源基因的情况，本发明对Jurkat细胞进行 了CVB3-SE感染评价。具体操作为，用无血清培养基调整Jurkat细胞浓度为1×106cell/ml， 加入CVB3-SE病毒载体后，放入4℃冰箱进行病毒吸附，2小时后取出，离心浓缩细胞，用 预冷的PBS清洗细胞2次，然后用5％FBS-1640培养基重悬Jurkat细胞种在细胞板中。可 选择在病毒感染的前一天，用20ng/ml IL-7和/或20ng/ml IL-15处理Jurkat细胞。在固定时 间观察细胞状态(图5A)和绿色荧光(图5B)表达情况。结果表明，CVB3-SE病毒载体 在Jurkat细胞中表达明显慢于HeLa细胞，在感染后6小时并未看见明显绿色荧光表达。在 感染后24小时，才观察到明显的绿色荧光蛋白表达。为了进一步说明CVB3病毒载体在基 因递送过程中，病毒基因转录组含量和外源基因表达之间的关系，本发明对感染后不同时间 点的Jurkat细胞培养物进行Taqman探针实时定量PCR实验。其中，CVB3-Nancy(
Figure BDA0001442842590000051
Number:VR-30TM)从ATCC购买后在HeLa细胞中培养扩增获得，与CVB3-SE的一样进行上述步骤的感染，在感染后特定时间进行培养物收集和实时定量PCR实验。(图6，图6A 为CVB3-SE病毒载体感染Jurkat细胞结果，图6B为CVB3-Nancy病毒载体感染Jurkat细胞 结果)，结果表明CVB3-SE病毒载体在Jurkat细胞中的增殖速度明显低于Nancy病毒。两个 实验结果表明，即使是同一病毒的不同亚型对Jurkat细胞的感染能力仍表现不同，在减毒高效的病毒载体研究开发方面，本发明平衡了两者之间的关系，对于免疫细胞基因治疗的载体 开发进行了有益的探索和多样化的丰富。
实施例4、CVB3-SE病毒载体与CVB3Nancy病毒株在Jurkat细胞中的毒性比较 为了评价CVB3-SE病毒载体相比于野生型CVB3病毒的细胞毒性，评估CVB3-SE病毒作 为载体的潜在能力，本发明通过CCK-8方法评价了CVB3-SE病毒载体与CVB3Nancy对于 Jurkat细胞的细胞活性的影响。结果如图7所示。表明虽然CVB3Nancy感染Jurkat细胞产 生了病毒浓度依赖的细胞毒性，但是CVB3-SE并未产生这种效应。展示了CVB3-SE作为病 毒载体的安全性。
序列表
<110> 胜武（北京）生物科技有限公司
<120> 柯萨奇病毒在过继免疫基因递送系统中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcctat tgggcgctag cactctggta 60
tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatat cccctccccc aactgtaact tagaagtaac 120
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ccccggactg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaagcgt tcgttatccg 240
gccaactact tcgaaaaacc cagtaacacc atagaggttg cagagtgttt cgctcagcac 300
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ccccctgtta gagagtcaaa ttgccacaat cgagcaaagt gcaccgtcac agagtgacca 4260
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gaactcaagc acagtgaaga cagagtatgg tgagttcacc atgttgggca tttatgatag 5460
gtgggccgtt ttgccacgtc atgccaaacc cggaccaacc atcctgatga atgaccagga 5520
ggtaggcgtg ctggacgcta aagagttagt ggataaggat ggtacaaacc tagaactgac 5580
actgctcaag ttgaacagga acgagaagtt cagagacatc agaggcttct tagcaaagga 5640
ggaggtggaa gtcaacgagg ccgtgctagc aattaatacc agtaaatttc ccaacatgta 5700
cattccggtg ggacaagtca cggattacgg tttcctaaac ctgggtggta cgcccactaa 5760
aagaatgctt atgtacaact tccccacgag agcaggtcaa tgtggcggag tactcatgtc 5820
caccggcaaa gtcctgggga tccatgttgg tggaaatggt catcaaggtt tctcagcggc 5880
acttctcaag cactatttca atgatgaaca aggagagatc gagtttattg agagctcaaa 5940
ggaagcaggg ttccctatta tcaacacacc tagtaagact aagctggagc cgagtgtctt 6000
ccaccaggtt tttgaaggtg acaaagagcc agcggtcctc aggaatggtg atccacgcct 6060
caaagtcaac tttgaggagg ccatattttc caagtacatc gggaatgtta acacacacgt 6120
ggatgaatac atgatggagg ctgttgacca ttatgccgga caattggcca ccctagacat 6180
tagcactgaa ccaatgaagt tggaggatgc tgtatacggt actgaaggcc ttgaggctct 6240
tgatctaaca acgagtgcag gttaccctta tgtcgccctg ggcatcaaga agagagacat 6300
cctctcaaag aagaccaggg accttactaa gctgaaagag tgcatggata agtacggtct 6360
aaacctacca atggtaacct atgtgaaaga cgaactcaga tctgcagaga aggtggcaaa 6420
gggaaagtcc aggctcattg aggcgtccag tttgaatgac tctgtggcaa tgagacagac 6480
attcggcaac ttgtacaaaa cttttcacct aaacccaggg gttgtgactg gcagtgctgt 6540
cgggtgtgac ccggacctct tttggagtaa aataccagtg atgttggacg gtcatctcat 6600
agcttttgat tattctggat atgatgctag cttgagtccc gtatggtttg cttgtttaaa 6660
actactactt gaaaaacttg gttactcgca caaggagacc aattacattg attacctgtg 6720
caactcccat cacctgtaca gggacaaaca ttattttgtg cggggtggca tgccatctgg 6780
atgttctggc acaagcatct ttaactcaat gataaataac atcataatca ggacactcat 6840
gctgaaggtg tacaaaggga tcgacttgga tcaattcagg atgattgctt atggtgacga 6900
tgtgattgca tcatacccgt ggcccataga tgcgtctttg cttgctgaag ctggcaagga 6960
ctatggatta atcatgacac cagcagacaa aggggagtgc ttcaatgaag ttacttggac 7020
taacgtcaca ttcctaaaga ggtattttag agcagatgaa caatacccct ttttagtgca 7080
ccccgttatg cccatgaaag acatacacga atcaatcaga tggaccaagg atccaaagaa 7140
tacccaagac catgtgcgct cattgtgctt attggcctgg cacaacgggg agcacgaata 7200
tgaggagttt atccgcaaaa tcaggagcgt cccagttgga cgttgtttga ctctacctgc 7260
gttctcaacc attcgtagga agtggttgga ctctttctaa attagagaca atttgatctg 7320
atttgaattg gcttaaccct actgtactaa ccgaactaga caacggtgca gtaggggtaa 7380
attctccgca ttcggtgcgg 7400

Claims (10)

1. 柯萨奇病毒在制备过继性免疫治疗基因递送系统中的应用，其特征在于所述柯萨奇病毒为柯萨奇B 组3型病毒，相对于SEQ ID No：1所示序列发生如下突变：第485位由C突变为A，第486位由A突变为C，第487位由G突变为A，第889位由T突变为C，第893位由A突变为G，第904位由G突变为A，第2071位由G突变为A，第2086位由C突变为T，第3832位由G突变为A，第7271位由A突变为T，第7273位由T突变为A。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于在所述柯萨奇病毒的5’-非翻译区与VP4 蛋白基因之间插入外源基因。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于通过SfiI 酶切位点在 5’-非翻译区与VP4蛋白基因之间插入外源基因。
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于在外源基因与VP4 蛋白基因之间插入3C蛋白酶特异性切割位点的基因。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于在所述柯萨奇病毒的VP1 基因与2A 基因之间插入外源基因。
6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于使用柯萨奇病毒载体向免疫细胞递送外源基因前，采用IL-7和/或IL-15激活细胞。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述IL-7和/或IL-15的用量为5-150ng/ml。
8. 如权利要求 1-7 任一项所述的应用，其特征在于所述过继免疫基因递送系统使用的细胞为T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞或DC细胞。
9.一种柯萨奇病毒，其特征在于所述柯萨奇病毒为柯萨奇B 组3型病毒，相对于SEQ IDNo：1所示序列发生如下突变：第485位由C突变为A，第486位由A突变为C，第487位由G突变为A，第889位由T突变为C，第893位由A突变为G，第904位由G突变为A，第2071位由G突变为A，第2086位由C突变为T，第3832位由G突变为A，第7271位由A突变为T，第7273位由T突变为A。
10.一种过继免疫基因递送系统，其特征在于由权利要求9所述的柯萨奇病毒感染细胞制得。
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