CN114941012B - 重组间充质干细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用重组间充质干细胞治疗炎症性肠病的方法，所述重组间充质干细胞包含过表达多个细胞因子的慢病毒载体。本发明还涉及包含所述慢病毒载体的宿主细胞，以及所述慢病毒载体和包含所述慢病毒载体的宿主细胞在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

Description

重组间充质干细胞及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地涉及病毒表达载体及其在细胞治疗中的应用。
背景技术
炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是病因学不明的肠道非特异性炎症性疾病。炎症性肠病患者在临床上表现为反复腹痛、腹泻、黏液血便，甚至各种全身并发症；多数反复发作，迁延不愈，其中一些患者因肠瘘等并发症而需手术治疗。5-氨基水杨酸盐目前是治疗急性溃疡性结肠炎的一线药物，但对克罗恩病的效果不佳；激素治疗时，其维持治疗的疗效并不确切，并可能引起不良反应。免疫抑制剂主要有硫嘌呤类药物和神经钙调蛋白抑制剂；已有多种免疫调节生物制剂应用于炎症性肠病的治疗，或正处在临床前研究阶段，如抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体。
以往动物实验及临床试验研究显示，骨髓间充质干细胞对自身免疫性疾病具有疗效，提示间充质干细胞的免疫调控能力具有良好临床应用前景。然而骨髓取材来源有限，属于有创操作，对细胞培养要求高，并容易受到伦理学限制。
目前常用溃疡性结肠炎(UC)的模型有醋酸模型、角叉菜胶模型、三硝基苯磺酸(TNBS)模型、细胞移植或基因敲除模型和葡聚糖硫酸钠(DSS)模型。其中DSS模型既可作为研究人类UC的致炎机理及抗炎药物模型,也可以作为免疫机理及遗传学研究的模型。
慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，对慢病毒自身的元件，如LTR，gag，pol和env等进行改造而发展起来的一类携带外源基因的病毒载体。根据其来源，主要有以下几种类型：HIV-1型(human immunodeficiency virus type1)载体系统,HIV-2型(humanimmunodeficiency virus type2)载体系统,猿类免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiency virus,SIV)，猫免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus,FIV)等，其中HIV-1型载体系统研究得最为广泛和深入。
白介素是非常重要的细胞因子家族，其功能涉及到免疫细胞的成熟、活化、增殖、调节等诸多过程，参与机体多种生理和病理反应。白介素家族中，促炎细胞因子主要有1L-1、1L-6和IL-8，抗炎因子主要包括IL-4、IL-10和IL-13。
到目前为止，药物治疗、手术治疗对不少炎症性肠病患者疗效欠佳，因此探索新的更为有效的治疗方法十分迫切。
发明内容
本发明提供了利用重组干细胞治疗炎症性肠病，尤其是溃疡性肠炎。所述重组干细胞，尤其是重组间充质干细胞(MSCs)能够同时表达IL-10，IL-13和IL-4。
第一方面，本发明提供了表达载体，包含所述表达载体的宿主细胞，或包含所述表达载体以及药学上可接受的赋形剂或载体的细胞药物组合物在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用，所述表达载体携带表达IL-10，IL-13和IL-4的编码序列。
在一些实施方案中，所述表达载体同时表达IL-10，IL-13和IL-4。
在一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒载体。
优选地，所述慢病毒载体包括载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’LTR，3’LTR，在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体包括如下3个质粒：(1)至少含有5’LTR和3’LTR，Ψ序列和目的基因的载体质粒；(2)含有包装所必需的gag和pol且任选含有调控基因rev和tat的包装质粒；以及(3)含有env基因的包膜质粒。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体包括如下4个质粒：(1)至少含5’LTR和3’LTR，Ψ序列和目的基因的载体质粒；(B)含有包装所必需的gag和pol的包装质粒；(C)含有env基因的包膜质粒；以及(D)含有rev的rev表达质粒。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体包括3个质粒：(1)至少含有5’LTR和3’LTR，Ψ序列和目的基因的载体质粒；(B)含有包装所必需的gag和pol的包装质粒；以及(C)含有env表达单元和rev表达单元的质粒。
在一些实施方案中，所述载体质粒的3’LTR和5’LTR包括一个或多个修饰。
在一些实施方案中，所述5’LTR和3’LTR的U3可以被缺失或突变。
优选地，所述3’LTR是缺失了U3区域的3’LTR(ΔU3/3’LTR)。
在一些实施方案中，所述5’LTR是缺失形式的5’LTR(Δ5’LTR)。
在一些实施方案中，所述载体质粒的5’LTR的启动子由选自以下的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
在一些实施方案中，与IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作地连接的启动子选自：短延伸因子1α(EF1α)启动子或其转录活性片段，RSV启动子和猿猴病毒40(SV40)启动子。
在一些实施方案中，与IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作地连接有RSV启动子，EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
在一些实施方案中，所述载体质粒还包括筛选标记物。
在一些实施方案中，所述筛选标记物为荧光素酶，增强的绿色荧光蛋白，链霉亲和素结合肽，嘌呤霉素抗性基因，氨苄抗性基因，卡那霉素抗性基因，和/或新霉素抗性基因。
在一些实施方案中，所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白(EGFP)/嘌呤霉素抗性基因(Puro)双报告标记物。
在一些实施方案中，所述载体质粒还包括SV40早期pA。
在一些实施方案中，所述载体质粒的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
在一些实施方案中，所述载体质粒包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节RNA转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地，所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
在一些实施方案中，所述载体质粒可以包含中央多聚嘌呤区(cPPT)或中心终止序列(CTS)作为顺式作用元件，cPPT/CTS序列可以是HIV1的cPPT/CTS，能够提高载体整合和转导效率。
在一些实施方案中，所述载体质粒从5’LTR区到3’LTR区依次包含：RSV启动子，5’LTR，Ψ序列，RRE，cPPT，EF1α启动子，Kozak翻译起始序列，分别由SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3显示的IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸，SV40，Kozak翻译起始序列，EGFR/Puro，WRPE，ΔU3/3’LTR和SV40早期pA。
所述IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸的顺序可以改变，只要是将IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸串联连接。
在一些实施方案中，所述IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸中，IL-10，IL-13和IL-4彼此之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
在一些实施方案中，所述2A肽为T2A肽，P2A肽，E2A肽或F2A肽。优选地，所述2A肽为T2A或P2A肽。
所述2A肽可以避免产生IL-10，IL-13和IL-4的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述EGFR/Puro的编码核苷酸中，EGFR和嘌呤霉素抗性基因之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
本发明的携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体在转染宿主细胞后可以同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子。
本发明的携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体无需制备三种载体质粒，仅需要一种载体质粒同时携带编码IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸，简化了操作成本，减少了转染多个病毒载体对细胞的损伤，有利于后续作为细胞药物制剂的质量控制。
在一些实施方案中，所述宿主细胞能够表达所述慢病毒载体中携带的目的核苷酸。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为干细胞。
在一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞可以同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子。所述的间充质干细胞是抗炎功能增强型的间充质干细胞。
所述的间充质干细胞可作为细胞药物制剂的细胞模型。
所述的间充质干细胞可用于治疗炎症性疾病，例如炎症性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体，并且过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞在细胞治疗中移植前已经过表达所述的三种抗炎因子，无需在移植后免疫响应，大大提高了所述间充质干细胞移植后的抗炎响应和有效性，在对炎症的治疗中具有起效时间大大缩短，疗效增加的效果。
本发明带有启动子，调节序列，翻译起始序列和筛选标记物，获得了同时携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体；实现了用一个慢病毒载体同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子；本发明构建的慢病毒载体还实现了高感染效率的可重复性，为炎性疾病，例如炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，的细胞治疗提供了有力的候选工具。尤其是，所述载体质粒中，在IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸前联用了RSV启动子、EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列，确保了载体质粒在干细胞内的高表达；三个抗炎因子之间用2肽序列分割，防止产生融合蛋白；同时载体质粒携有增强型GFP和抗生素Puro序列，方便转染效率的观察和必要时的药物筛选。
本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体，并且过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞可用于炎性疾病，例如炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗。所述慢病毒载体以及所述间充质干细胞提供了对于溃疡性肠炎特异性和靶向性的治疗，通过直接和间接的抗炎效果，靶向巨噬细胞极化，最终达到抑制炎症期炎症因子的浸润，促进修复期肠黏膜上皮细胞的修复的作用，从而提高治疗效果。尤其是，所述慢病毒载体以及所述间充质干细胞对急性肠炎的抗炎效果更高，维护肠黏膜结构的功效更好。
具体实施方式
在一些实施方案中，本发明构建了过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的慢病毒载体，命名为pLV[Exp]-EF1α>hIL10[NM_000572.3](ns):T2A:hIL13[NM_002188.3](ns):P2A:hIL4[NM_000589.4]-SV40>EGFP:T2A:Puro，所构建的载体设参见图1。载体中在三种抗炎因子基因上游联用了RSV promoter、EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列，从而确保了病毒质粒在干细胞内的高表达，三个抗炎因子之间用2A肽序列分割，防止产生融合蛋白。同时载体携有增强型GFP和抗生素Puro序列，方便转染效率的观察和必要时的药物筛选。
根据本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞的制备中，优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，所述培养步骤中细胞的接种密度为0.5×105～2.0×105，优选为1.2×105；和/或在转染步骤中，病毒转染复数MOI为10～30，优选为15-25，更优选为17-23，例如17，18，19，20，21，22或23。虽然病毒转染复数(MOI)越高，转染效率越高，但是随着MOI的增加，相应的毒性也会增加，因此要在转染效率和毒性之间进行平衡，本申请发现在用本发明的慢病毒载体转染间充质细胞时MOI选择15以上可以达到80％以上的较高转染效率，在MOI为20时可以达到90％的转染效率。
根据本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞的制备方法所获得的人脐带间充质干细胞中IL-13，IL-10和IL-4的蛋白表达水平相对于基线水平可以分别提高100倍，50000倍，以及40000倍以上。
根据本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞可用于制备细胞药物组合物。
所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻炎性疾病，例如炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗。
所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻与IL-10，IL-13和IL-4相关的疾病。
本发明的慢病毒载体携带三个基因，无需三种载体质粒，简化了操作和成本，减少多个病毒转染对细胞的损伤，有利于后续药物制剂的质控。
而且，用过表达抗炎因子的慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞，使细胞过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子，在移植前就大量表达，无需移植后才免疫响应，大大提高了人脐带干细胞移植后的抗炎响应和有效性，对炎症相关疾病的治疗具有起效时间缩短、疗效增加的特点。
此外，本发明同时过表达三个抗炎因子IL-10，IL-13和IL-4的慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞相比于现有技术中过表达抗炎因子TGFβ的骨髓间充质干细胞BMSCs，具有促进巨噬细胞向M2(抗炎)表型转化的协同作用，极化效果更加显著。
本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体，并且过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞可用于炎性疾病，例如炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗。所述慢病毒载体以及所述间充质干细胞提供了对于溃疡性肠炎特异性和靶向性的治疗，通过直接和间接的抗炎效果，靶向巨噬细胞极化，最终达到抑制炎症期炎症因子的浸润，促进修复期肠黏膜上皮细胞的修复的作用，从而提高治疗效果。尤其是，所述慢病毒载体以及所述间充质干细胞对急性肠炎的抗炎效果更高，维护肠黏膜结构的功效更好。名词解释：
慢病毒载体系统包括包装质粒，包膜质粒和载体质粒，并且可以为二质粒系统，三质粒系统或四质粒系统。三质粒系统是将慢病毒基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，并去除了所有的辅助序列。四质粒系统是在三质粒系统的基础上改进而来的，与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性，第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR，以启动载体质粒的表达。此外，三质粒系统和四质粒系统还有一个可以放置目的基因序列的载体，称作载体质粒。
IL-4主要由活化T细胞产生，其可抑制内皮细胞及单核细胞合成分泌IL-1、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子，起到抑制促炎细胞因子合成，发挥其抑制炎症反应的作用。IL-10主要由Th2细胞、活化的单核细胞和上皮细胞分泌产生，具有明确的免疫抑制活性。IL-13是1993年发现由活化T细胞产生的一种新的细胞因子，其与IL-4的受体α链具有同源性，信号转导途径和生物学活性也非常相似，具有抑制炎症反应的功能。
ψ序列是慢病毒基因组的衣壳化所需要的最小包装信号。
2A肽是来源于病毒的短肽通常为18～25个氨基酸长，通常被称作自我剪切肽，能使得一条转录物产生多种蛋白。
“干细胞”是指未分化的细胞，其能够长期自我更新，或能够产生初始细胞的至少一个相同拷贝；在单细胞水平下分化成多个，且在一些情况下，仅一个特殊的细胞类型；以及实现组织的活体内功能性再生。根据干细胞细的发育潜力将干细胞细分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和寡能干细胞。
间充质干细胞(MSCs)因其具有多向分化潜能和免疫调节功能，已被广泛用于再生医学、自身免疫性疾病的临床研究者。与其他干细胞，例如造血干细胞不同，MSCs是一类在体外能够扩增的干细胞。在本申请中UC-MSCs是从脐带获得的间充质干细胞，尤其是人脐带间充质干细胞。人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是来源于新生儿脐带的间充质干细胞，具有强大的增殖及多向分化能力。但是本领域技术人员应该知晓间充质干细胞的来源不仅限于人脐带间充质干细胞，其它来源的间充质干细胞也可实现本发明。
巨噬细胞是一种表型异质性的免疫细胞，在炎症(起始和消退)期间都具有重要作用。巨噬细胞经刺激可以极化为两种表型：(1)一种为经典活化(炎症)表型M1，可以被脂多糖(LPS)或干扰素γ(IFN-γ)等诱导，产生促炎细胞因子如TNFα、IL-1β等；(2)另一种为替代活化(伤口愈合)表型M2，可以被IL-4、IL-13等诱导，产生抗炎细胞因子如IL-10、IL-13、Arg1等。M1/M2巨噬细胞极化的平衡决定着一个器官在炎症或损伤中的命运。M1发挥促炎作用在炎症早期对抗刺激，但持续下去会造成组织损伤；M2发挥抗炎作用，促进组织修复、血管再生。
附图说明
图1显示了慢病毒过表达载体图谱。
图2显示了慢病毒转染的hUC-MSCs共聚焦显微镜观察转染效果。
图3显示了免疫荧光和流式检测eGFP表达情况。
图4上图显示了不同的细胞接种密度对细胞融合度的影响，下图显示了不同的Polybrene工作浓度对生长细胞的影响。
图5显示了hUC-MSCs转染病毒72h后，qPCR检测过表达的因子分泌显著增加。
图6显示了hUC-MSCs转染病毒72h/96h后，ELISA检测过表达的因子分泌显著增加。
图7显示了转染效率的可重复性。
图8显示了过表达IL-10，IL-13和IL-4的hUC-MSCs能够抑制巨噬细胞的M1表型，并且促进巨噬细胞的M2表型。
图9显示了与单独使用IL-4相比，同时过表达IL-10，IL-13和IL-4的hUC-MSCs能够起协同作用，促进巨噬细胞向M2的转化。
图10显示了现有技术中骨髓间充质干细胞BMSCs过表达抗炎因子TGFβ对巨噬细胞向M2表型极化的效果。
图11显示了急性肠炎造模小鼠正常组与模型组的对比观察结果。
图12显示了正常组、模型组、对照组和治疗组中，干细胞对急性肠炎小鼠远端结肠结构的保护作用。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1构建慢病毒载体
首先设计合成了过表达三个抗炎因子IL-10，IL-13和IL-4的慢病毒载体，命名为pLV[Exp]-EF1α>hIL10[NM_000572.3](ns):T2A:hIL13[NM_002188.3](ns):P2A:hIL4[NM_000589.4]-SV40>EGFP:T2A:Puro，载体设计图谱如图1所示。载体在插入的抗炎因子基因上游联用了RSV promoter、EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列，确保了病毒质粒在干细胞内的高表达，三个抗炎因子之间用2A肽序列分割，防止产生融合蛋白。所构建的慢病毒载体同时载体携有增强型GFP和抗生素Puro序列，方便转染效率的观察和必要时的药物筛选。
分析插入序列以及载体骨架上的限制性内切酶位点，选择能切出合适条带的酶消化质粒DNA，将消化的DNA跑琼脂糖凝胶电泳，EtBr染色，判断DNA片段的大小，设计靶向载体骨架和/或插入序列的引物。通过Sanger测序对核酸序列进行鉴定，比对完全正确。
实施例2慢病毒载体的包装以及转染
病毒载体质粒构建成功后，进行病毒包装，然后转染hUC-MSCs。转导D0天，选择P4-P8代的hUC-MSCs，将细胞按1×105-2×105/孔密度接种到6孔板中，培养基为DMEM/F12+10％FBS，在37℃5％CO2的培养箱中培养18-20h后，待细胞密度融合为30％-50％时进行转染。转导当天(D1)，在冰上解冻病毒液，轻柔混匀，按照MOI(MOI范围为10-30)吸取病毒数，加入到培养基中轻柔混匀。培养基用量以覆盖培养基表面积为宜，用量为100μL/mL，6孔板中培养基用量为1mL/孔。吸出原有培养基，将添加了病毒的培养基加入到培养了hUC-MSCs的6孔板中。同时向每孔中加入5-8μg/mL的辅助转染试剂Polybrene，混匀使病毒覆盖住每一处细胞，在37℃5％CO2的培养箱中培养6-8h。过度暴露于Polybrene会造成细胞中毒，因此转导时间不宜过长，否则可能会影响细胞状态。同时将带有空载体Vector的病毒液作为空白对照以同样的方法进行转导。
第二天，吸出含有病毒的培养基，加入新鲜的DMEM/F12+10％FBS培养基，在37℃5％CO2的培养箱中过夜培养。通常慢病毒携带的基因在转导第2天才开始表达，转染48-72h后可以观察到绿色荧光，命名为3IL-MSCs。每天观察荧光表达，在72h后共聚焦显微镜观察到GFP的绿色荧光蛋白的强表达(参见图2)，计数绿色荧光的百分比，同时流式分析确认感染效率(参见图3)，结果显示MOI为20时有效感染率超过90％。
以不同的细胞接种密度和不同的MOI值进行实验，结果发现，细胞接种密度以1.2×105/孔最佳(参见图4)，转染复数MOI为20转染效率最好(参见图3)，Polybrene适宜的工作浓度为6μg/mL(参见图4)。高密度的细胞和高浓度的辅助转染试剂都不利于细胞的存活，过表达的效果会降低(参见图4)。具体而言，以2×105的密度接种转染72h后细胞过密，会引起接触抑制生长，以1.2×105的密度接种转染当天融合度约为30％，转染72h后细胞融合度约为90％，生长状态良好。Polybrene的工作浓度试验了6μg/mL和8μg/mL，显微镜下荧光差异不大，浓度过大容易引起细胞中毒，因此选择6μg/mL。
为进一步确认过表达的因子的分泌增加，利用实时荧光定量PCR(图5)和ELISA(图6)的方法进行分析，基线水平抗炎因子低表达甚至检测不到，但过表达后细胞基因转录水平(图5)和上清中蛋白分泌水平(图6)显著升高，其中，IL-13蛋白分泌从感染前检测不到(10pg/mL以下)或空载体对照组(约20pg/mL)升高到超过2713pg/mL，分泌水平提高100倍以上；抗炎因子IL-10和IL-4分别提高50000和40000倍(参见图6)。
图5显示了hUC-MSCs转染病毒72h后，qPCR检测过表达的细胞因子IL-4，IL-10和IL-13的分泌显著增加，其中UP8 V M10表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为10的表达结果；UP4 L M15表示传代4次的人脐带间充质干细胞MOI为15的表达结果；UP8 L M20表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为20的表达结果。
图6也显示了以不同的MOI进行实验，病毒转染hUC-MSCs 72h/96h后，ELISA检测过表达的因子分泌显著增加，转染复数MOI为20，IL-13，IL-10和IL-4的过表达效果显著。
图7显示了感染效率的可重复性，其中UP8 V M10表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为10的表达结果；UP4 L M15表示传代4次的人脐带间充质干细胞MOI为15的表达结果；UP8 L M20表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为20的表达结果。
可以看出，通过载体设计和以上转染步骤的优化组合，保证了感染高效率和过表达的成功。
实施例3过表达IL-13，IL-10和IL-4的hUC-MSCs的上清的抗炎作用
实施例1和2构建和包装的慢病毒载体以MOI为20转染hUC-MSCs，转染72h后，收集培养基，1000g离心10min收集上清hUC-MSCs-CM。
将小鼠巨噬细胞系RAW264.7以3×105的密度接种到6孔板中，培养基为DMED/F12(HG)+10％FBS完全培养基。为了诱导M1极化，第二天将脂多糖(LPS)以100ng/mL的浓度加入到完全培养基中，诱导24h。阴性对照组(CON)用完全培养基(DMED/F12(HG)+10％FBS)培养4d；LPS组用100ng/mL LPS处理24后更换为完全培养基(DMED/F12(HG)+10％FBS)继续培养48h；为了解hUC-MSCs-CM在炎症环境中对RAW264.7的影响，实验组在100ng/mL LPS处理24h后，在新的完全培养基(DMED/F12(HG)+10％FBS)中加入不同浓度的hUC-MSCs-CM(1％、5％、10％)培养48h。收集巨噬细胞用于qPCR分析。
图8显示了巨噬细胞RAW264.7+100ng/mL LPS极化后，与过表达hUC-MSCs的上清共培养，检测其抗炎作用，根据qPCR的结果，不同条件下巨噬细胞的促炎细胞因子(TNF-α)和抗炎细胞因子(IL-10、IL-13和Arg1)的表达发生了变化。LPS刺激后，与对照组相比促炎细胞因子的mRNA水平升高，而抗炎细胞因子的mRNA水平没有明显变化。而hUC-MSCs-CM的添加下调了促炎细胞因子的水平，增强了抗炎细胞因子的表达，其中hUC-MSCs-CM添加5％的效果最为明显。实验证明，过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的hUC-MSCs-CM能够抑制M1表型和促进M2表型，通过对巨噬细胞极化产生影响进而影响炎症的发展。
巨噬细胞通过LPS向M1极化容易激活，而单独的IL4或者IL13很难使细胞向M2转化。将小鼠巨噬细胞系RAW264.7以3×105的密度接种到6孔板中，培养基为DMED/F12(HG)+10％FBS。为了诱导M2极化，第二天将IL-4重组细胞因子以10、20、50ng/mL的浓度加入到完全培养基中，诱导48h。阴性对照组(CON)用完全培养基(DMED/F12(HG)+10％FBS)培养3d。收集巨噬细胞用于qPCR分析。
根据qPCR结果(图9)，加入单独的IL-4后，与对照组相比抗炎因子除TGFβ上调，IL-10、IL-13、Arg1没有明显变化，促炎因子IL-1β没有显著下调。以上结果说明单独的IL-4很难使巨噬细胞向M2极化，而我们同时过表达三个抗炎因子IL-10，IL-13和IL-4能够起到协同作用，可以促进巨噬细胞向M2(抗炎)的转化。
与之相比，现有技术中骨髓间充质干细胞BMSCs过表达抗炎因子TGFβ，能够促进巨噬细胞向M2表型极化(参见图10)，但极化效果没有我们同时过表达三个抗炎因子IL-10，IL-13和IL-4显著。
实施例4急性溃疡性结肠炎小鼠模型的构建
DMED/F12+10％FBS完全培养基传代培养达到所需细胞时，收集3IL-MSCs相比及未进行基因编辑的MSCs，用生理盐水稀释到2.5×106/mL浓度备用。
将小鼠按随机数随机分入正常组、模型组、对照组和治疗组，分别为5、5、6、6只；右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)，分子量36,000～50,000，10g DSS粉溶于500ml自来水中，配成2％浓度，放入4℃冰箱保存。正常组小鼠自由饮用蒸馏水；其余3组自由饮用2％DSS 5天。
饮用DSS第3天，各组小鼠体重出现下降，饮水和进食明显减少；
饮用DSS第5天，小鼠体重下降很明显，出现懒动，精神萎靡，体温下降；
饮用DSS的6天，小鼠出现死亡。模型组死亡一只。
实验期间，正常组小鼠大小便正常、体重增加、毛发有光泽、饮食、活动、精神状态均正常。
参见图11，连续DSS给药5天模型组(右)小鼠血便，肛门红肿，带有血色，与左侧的正常组形成明显对比。
实施例5干细胞移植治疗及结肠组织病理学观察结果
造模第3天治疗组腹腔注射3IL-MSCs细胞5×105/200μL/只小鼠，对照组注射未编辑的MSCs，其他两组注射等量的生理盐水。
造模第7天，所有小鼠脱颈处死，采集远端结肠。40g/L多聚甲醛溶液固定结肠组织，常规石蜡包埋，4μm厚度切片做苏木精-伊红染色。显微镜下观察形态特点发现，正常健康组小鼠结肠组织可见黏膜上皮细胞完整，隐窝结构正常,腺体排列整齐，未见萎缩、坏死及炎性浸润等病变。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织病理学镜检可见结肠组织上皮细胞严重损伤脱落、腺体破坏、溃疡等病变，其溃疡灶数量较多且面积较大(图12黄色箭头)，并伴有大量的中性粒细胞等免疫细胞浸润(图12红三角所指)。与模型组比较，未编辑细胞对照组小鼠肠道上皮细胞破坏程度有所减轻，溃疡灶数量有所减少，溃疡面积减小。虽然中性粒细胞等免疫细胞浸润程度减轻，无论怎样，仍有半数小鼠结肠上皮细胞呈现大面积脱落。相比之下，治疗组只有少数小鼠结肠上皮细胞呈现小面积脱落，具体统计见表2。可见基因编辑后MSCs通过高水平的抗炎和靶向巨噬细胞的级联放大作用，有效抑制了炎症，从而避免了高炎症状态下肠粘膜上皮细胞的脱落，更大程度地维持了结构的完整性。
按照HI评分标准(表1)，进行组织病理学评分可见，治疗组比对照组的病理评分显著下降(16～4)(结果参见表2)，通过病理切片及评分可直观地看到，治疗组的结构完整性优于对照组。
表1
HI评分标准
Figure BDA0003476187270000131
表2
Figure BDA0003476187270000132
Figure BDA0003476187270000141
本方案制备的MSCs对急性肠炎的抗炎效果更高，维护肠黏膜结构的功效更好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 生物岛实验室
<120> 重组间充质干细胞及其应用
<130> CP21006SW
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 534
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360
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<213> Homo sapiens
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Claims (19)

1.包含表达载体的宿主细胞在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用，所述宿主细胞为间充质干细胞，所述表达载体携带表达IL-10，IL-13和IL-4的编码序列，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体包含载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’LTR，3’LTR，在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述3’LTR和/或5’LTR包括一个或多个修饰。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述5’LTR和3’LTR的U3被缺失或突变。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述3’LTR是缺失了U3区域的ΔU3/3’LTR。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述5’LTR是缺失形式的Δ5’LTR。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒的5’LTR的启动子选自：巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子；
与IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1A(EF1α)启动子或其转录活性片段，RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作连接有EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒还包括筛选标记物的编码核苷酸，所述筛选标记物选自荧光素酶，增强的绿色荧光蛋白，链霉亲和素结合肽，嘌呤霉素抗性基因，氨苄抗性基因，卡那霉素抗性基因和新霉素抗性基因中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白EGFP/嘌呤霉素抗性基因Puro双报告标记物，EGFP和嘌呤霉素抗性基因之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述EGFP/Puro双报告标记物的编码核苷酸可操作连接SV40启动子和Kozak编码序列。
12.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒还包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，逆转录病毒输出元件，中央多聚嘌呤区cPPT或中心终止序列CTS。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述逆转录病毒输出元件选自人类免疫缺陷病毒rev应答元件RRE和乙型肝炎病毒转录后调节元件HPRE。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述cPPT或CTS序列为HIV1的cPPT或CTS。
15.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒从5’LTR区到3’LTR区依次包含：RSV启动子，5’LTR，Ψ序列，RRE，cPPT，EF1α启动子，Kozak翻译起始序列，分别由SEQID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3显示的IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸，SV40，Kozak翻译起始序列，EGFP/Puro，WRPE，ΔU3/3’LTR和SV40早期pA。
16.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸中，IL-10，IL-13和IL-4彼此之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述2A肽为T2A肽，P2A肽，E2A肽或F2A肽。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述2A肽为T2A或P2A肽。
19.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
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