CN1526012A

CN1526012A - 一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途

Info

Publication number: CN1526012A
Application number: CNA028138198A
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 吴孟超; 岑信棠
Original assignee: 钱其军
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2022-07-12
Also published as: CN1219055C; CN1195056C; US20050048466A1; WO2003006640A1; US7491525B2; CN1339584A

Abstract

本发明提供一类能高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒及其增殖方法。该重组病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶启动子的有效控制，使其选择性地在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内增殖，而在无端粒酶活性的正常细胞内基本不增殖，同时其基因组中还插入了肿瘤治疗基因，使肿瘤治疗基因在肿瘤细胞内高效表达，从而通过病毒及抗癌基因双重作用，特异性杀灭肿瘤细胞。这种重组病毒可用于治疗多种肿瘤。

Description

一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内

特异性增殖的病毒及其用途发明领域

本发明一般地涉及重组病毒。更具体地说，本发明涉及一种高效表达肿瘤治疗基因，且在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途。

背景技术

恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。

端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞每分裂一次，端粒就会缩短，即端粒减少 50 ~ 200个核苷酸，当端粒缩短至一定程度，会导致细胞死亡。而当细胞发生恶变时，其端粒酶被激活，使肿瘤细胞分裂所致端粒的缩短进一步延长，从而维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡而获得永生，最终导致肿瘤细胞不断增殖，因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生及发展过程中起关键作用。端粒酶在大约 90%肿瘤细胞均阳性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，因此端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记。到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成， 1. RNA 组份（hTERC) , 它作为端粒重复合成的内源性模板；2. 端粒酶结合蛋白（TEP1) ; 3. 端粒酶催化亚基（telomerase catalytic subunit, 简写 hTERT) , 也有人称为端粒酶逆转录 S 基因 (telomerase reverse transcriptase gene)。 RNA组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亚基（hTERT) 在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞抹中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子在极大多肿瘤细胞内呈激活状态。

目前针对端粒酶为靶点的肿瘤治疗已有多方面研究， 1.以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤治疗法； 2.以端粒酶启动子（端粒酶催化亚基基因启动子和 /或端粒酶 RNA组份基因启动子）控制细胞凋亡基因或自杀基因的肿瘤基因治疗。 3. 以端粒酶催化亚基基因启动子控制的肿瘤增殖病毒的治疗。

以上治疗仍存在着明显问题，首先，约有 10%左右的人类肿瘤端粒酶阴性，它们依靠非端粒酶依赖机制（Alternative lengthening of telemere,简称 ALT)维持端粒的长度，尤其值得注意的是由于肿瘤细胞的高度异质性，即使某一肿瘤病人的肿瘤细胞的端粒酵阳性，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞端粒酶阳性，它也存在着非端粒酶依赖机制，因此单独针对端粒酶的肿瘤治疗方案不足以杀灭所有肿瘤细胞，如有研究表明应用端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性可导致肿瘤细胞中非端粒酶依赖机制（ALT) 进一步加强，从而不能有效杀灭肿瘤细胞。其次，在人类生殖细胞、造血干细胞及胃肠道的憩室细胞端粒酶阳性，因此，针对端粒酶为靶点的肿瘤治疗可能会导致上述细胞毒性。

肿瘤基因治疗是近十年兴起的新的临床研究，其结果表明：肿瘤的基因治疗方案是非常安全的，但其抗肿瘤效应也非常低，甚至无任何治疗作用。尽管原因是多方面的，但最主要原因是目前基因治疗的载体系统在体内存在着转染率低、抗癌基因表达量低及不能靶向肿瘤细胞等缺点，从而不能将抗癌基因转染给足够的肿瘤细胞，并使之高效表达，这严重阻碍着肿瘤基因治疗在临床中的疗效。如何提高基因治疗载体系统的转染率、抗癌基因的表达量及靶向肿瘤细胞的特异性，成为肿瘤基因治疗的关键。

近年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们已完成了多个病毒全部基因组的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行改造。改造后的病毒对肿瘤细胞的感染、复制增殖和溶解细胞的能力有效增强，而对正常细胞这种能力减弱甚至消失，因此这种病毒能在肿瘤细胞内进行选择性复制，当病毒感染肿瘤细胞后可数千倍甚至数百万倍增加病毒的数量，从而裂解肿瘤细胞，释放出新的病毒，再次感染肿瘤细胞，再次复制增殖，直至将全部肿瘤细胞杀灭，由于这种病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞影响不太，这种肿瘤细胞特异性增殖病毒被称为肿瘤增殖病毒，目前已有近十种肿瘤增殖病毒进入临床试验。

但单独应用肿瘤增殖病毒治疗仍有局限性，首先，肿瘤形成的机制非常复杂，异质性非常强，病人与病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显差异，就端粒酶而言，某一肿瘤病人的肿瘤细胞的端粒酶阳性，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞端粒酶阳性，因此利用某一肿瘤机制而增殖的病毒不足以杀灭所有肿瘤细胞。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化、混入正常细胞以及坏死区域也可能限制病毒扩散。再次，某此肿瘤的病毒受体（如柯萨奇病毒受体）表达不充分限制病毒对其感染。第四，病人的免疫反应限制病毒增殖和播散。目前，美国 ONYX 药物公司尝试单独应用 Elb 55kDa 蛋白缺失型病毒 ( ONYX- 015 )治疗肿瘤,其临床有效率只有 15 - 20 % ( Nemunaitis J. 等人，癌症研究（Cancer Res. ) , 2000, 60 (22) : 6359； US 567 因 7178 ; US 5801029 ) 。因此，本领域非常需要更有效，更具特异性，而对正常组织的副作用减至最小的肿瘤治疗方法。

发明概述

本发明提供了一种重组病毒，其特征在于该病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制；并且该病毒基因组中还包含可治疗肿瘤的基因的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述端粒酶基因启动子是下述之一：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶 RNA组份基因启动子。

本发明采用的端粒晦催化亚基基因启动子在转录起始位点下游添加多个拷贝的 E -盒核苷酸序列： 5， cacgtg 3， (SEQ ID NO： 27)。

本发明提供的重組病毒还可以：

1)有其它增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制；和 /或

2) 有至少一种其它增殖必需区蛋白功能缺失，但仍能在肿瘤细胞内特异性增殖。

本发明还提供了利用本发明的重组病毒治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤： 1 )将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞， 2 )使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码抗癌基因的核苷酸序列拷贝数增加及抗癌基因表达量增加；由此抑制肿瘤形成、生长及转移。适当地，本发明所述方法还包括在本发明所述病毒感染肿瘤细胞之前、同时和 /或之后施用化学抗肿瘤药物。

本发明还涉及所述重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

本发明还涉及所述重组病毒在制备可用于治疗肿瘤的药物中的用途。

附图简述图 1 是各种病毒 QW1 (Adv-hTERTp-Ela) , QW2 (Adv-hTER-Ep-Ela) , QW3 (Adv- hTERT-Ep-Ela-HRE-Elb)和 QW2-endostatin (Adv-hTERT- Ep- Ela- endostatin)的结构示意图。其中， QW1 (Adv-hTERTp-Ela)是端粒晦催化亚基基因启动子控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒， QW2 (Adv-hTER-Ep-Ela)是端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒， QW3 (Adv-hTERT-Ep- Ela-HRE- Elb)是端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A表达及缺氧作用元件（HRE)联合基础人巨细胞启动子控制 E1B 表达的减毒增殖腺病毒， QW2-endostatin (Adv-hTERT-Ep- Ela-endostatin)是携带内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒。

图 2显示了 QW1、 QW2及 QW3在正常及肿瘤细胞株中 48小时的增殖倍数。

图 3显示了端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A 表达的减毒增殖腺病毒（QW2)在正常及肿瘤细胞株中 E1A表达情况。

图 4显示了野生型 5型腺病毒（WAd5)及携带人内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A 表达的减毒增殖腺病毒（QW2-endostat in)在正常及肿瘤细胞抹中 48小时增殖倍数的比较。

图 5 显示了携带人内皮抑素基因的非增殖型腺病毒 (Ad-endostatin)及携带人内皮抑素基因的端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒（QW2-endostatin)在肿瘤细胞株中内皮抑素表达情况的比较。图 6显示了端粒酶催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E -盒序列控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒（QW2)、携带人内皮抑素基因的非增殖型腺病毒（Ad- endostatin)及携带人内皮抑素基因的端粒晦催化亚基基因启动子及其下游加入了 3个 E-盒序列控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒（QW2- endostatin)对 SCID小鼠体内移植人肝癌 Hep3B细胞的治疗效果的比较。

发明详述

如上文所述，本发明涉及一种重组病毒，其特征在于该病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒醉基因启动子的有效控制；并且该病毒基因组中还包含可治疗肿瘤的基因的核苷酸序列。

大约 90%肿瘤细胞具有端粒酶活性,而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，这表明端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记，到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成， 1. RNA 组份（hTERC) , 它作为端粒重复合成的内源性模板； 2. 端粒酶结合蛋白（TEP1) ; 3. 端粒酶催化亚基（telomerase catalytic subunit, 简写 TERT) , 也有人称为端粒酶逆转录酶基因（telomerase reverse transcriptase gene)。 RNA组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亚基（hTERT) 在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞抹中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子及端粒晦 RNA组份基因启动子在极大多肿瘤细胞内呈激活状态。

人与鼠的 TERT基因的顺式作用元件最近均已被克隆出来，其序列 GC含量高，缺少 TATA和 CAAT盒，但含有多个转录因子的结合位点，包括转录激活因子 Myc、 SP1和转录抑制因子 Madl、 p53、 MZF2等结合位点。通过对人的 TERT基因（hTERT)启动子 5，端进行截短，构建不同长度的启动子缺失突变体，来研究该启动子的活性，结果发现，在转录起始位点上游存在一个至少 181bp的启动子核心区域，这个区域对保持该启动子的活性很重要。 hTERT 基因启动子核心区域内含有 E-box ( CACGTG ) 和 SP1 结合位点。虽然 SP1转录因子在端粒酶阴性的体细胞中表达上调，它与其结合位点的结合对 hTERT基因转录的起始有促进作用，但相比之下，调节 hTERT基因转录表达的主要决定因素是与 E-盒（E-box)结合的因子，如 Myc、 Madl等。 Myc蛋白的高表达，可以明显提高 hTERT 基因启动子的活性，从而促进基因转录和增强端粒酶活性。除转录起始位点上游的 E-box ( - 187bp ~ - 182bp ) 以外，在 hTERT 基因转录起始位点下游、翻译起始位点之前还存在一个 E-box( + 22bp ~ + 27bp ) , 这个下游的 E-box可以被 Myc和 Madl结合，分别发挥激活和抑制 hTERT基因转录活性的作用。最新的研究认为， hTERT基因启动子转录起始位点下游的 E- box序列，是端粒酶阴性细胞负向调节机制的靶向位点，我们发现在转录起始位点下游添加 E-box序列拷贝数，可以明显抑制端粒酶阴性细胞的 hTERT 基因启动子活性，而在端粒酶阳性的细胞中， E-box 序列即有可能转变为能被激活因子如 Myc 家族成员 USF ( Upstream stimulatory factor ) 结合、并激活 hTERT基因转录的正向调节位点。同样通过启动子 5，端序列截短构建不同的缺失突变体的实验还发现：在 hTERT基因启动子核心序列上游还存在一个沉默子（Silencer ) , 约 400bp ( - 776bp ~ - 378bp ) , 其间含有多个 MZF2 ( Myeloid- specif ic zinc finger protein 2 ) 结合单元 ( Motif )。对这些位点引入突变，结果引起 hTERT基因转录的激活，而 MZF2 的过度表达及与其结合单元的相互作用则可以引起 hTERT基因转录的下调和端粒酶活性的降低。实验证明 hTERT基因启动子核心序列上游存在的沉默子是 hTERT 基因的负向调节区， MZF2是 hTERT基因的负向调节因子。 MZF2不仅在骨髓细胞中表达，在不同组织来源的细胞系中也有表达，表示 MZF2对 hTERT 基因的负向调节功能具有普遍性。这样看来， hTERT 基因的表达和端粒酶的活性被多种因素包括激活因子和抑制因子所牢牢控制，其调控的主要部位位于 hTERT基因转录的启动子结构区。

基因转录激活的调节受反式作用因子（如转录因子）与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子时会影响基因的转录水平。端粒晦催化亚基启动子及端粒酶 RNA组份基因启动子在具有端粒酶活性的细胞内特异性激活，从而使该启动子控制的基因产生转录。本发明应用端粒酶催化亚基启动子或端粒酶 RNA 组份基因启动子控制病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在上述具有端粒酶活性的细胞中表达，导致病毒只能在上述病毒具有端粒酶活性的细胞内增殖，而在上述无端粒酶活性的细胞内基本不增殖。这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭具有端粒酶活性的特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不再能够再增殖。在一个实施方案中，所述端粒酶基因启动子是下述之一：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶 RNA组份基因启动子。

本发明采用的端粒酶催化亚基基因启动子可在转录起始位点下游添加多个拷贝的 E-盒核苷酸序列（SEQ ID NO : 27) .

本发明所述病毒增殖必需区依所采用的病毒不同而不同，但容易为本领域技术人员知晓。本发明所述病毒至少有一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制 "是指病毒增殖必需基因与端粒酶基因启动子在病毒基因组中的相对位置，依所用病毒的不同可以是多种多样的，只要该增殖必需基因的转录能够受到端粒酶基因启动子有效控制即可。在一个实施方案中，本发明所述病毒中包含的端粒酶基因启动子可以在病毒增殖必需基因的转录起始位点之前适当的位置。在本发明的另一个实施方案中，端粒酶基因启动子可以替代病毒自身的启动子。在本发明的另一个实施方案中，本发明所述病毒还可以是在病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域包含至少一种端粒酶基因启动子的重组病毒。

本发明提出的能特异性杀灭具有端粒酶活性肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖所必需的基因的表达受端粒酶启动子控制。它由在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入端粒酶启动子而构成。该端粒酶启动子特异性在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在无端粒酶活性正常细胞内基本不激活，不能产生转录活性。该端粒酶启动子至少含有以下序列之一：端粒酶逆转录酶基因启动子，端粒酶 RNA组份基因启动子。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因，如单纯疱疹病毒早早期表达基因 ICE4。

本发明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因可以是以下一个腺病毒的早期表达基因： E1A、 E1B、 E2、 E4, 也可以是晚期表达基因。

人类腺病毒有 6个不同亚属，分为 A、 B、 C、 D、 E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。腺病毒基因分为两类，早期基因与晚期基因，早期基因包括 E1A、 E1B、 E2、和 E4。 EIA基因在病毒感染后即表达（0-2小时），是最早表达腺病毒蛋白，它作为反式激活转录调节因子，是其它病毒早期基因蛋白表达所必需的，同时它反式激活其它病毒启动子。因此，缺乏 E1A基因的表达，腺病毒 DNA复制的必需基因产物不能产生，腺病毒不能有效复制及增殖。

E1B基因的转录受 E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因 mRNA从细胞核转运到细胞浆中所必需的， E1B基因表达缺失可导致病毒后期基因表达不佳及不能关闭宿主细胞蛋白的合成。

E4基因位于病毒基因组的右未端，其开放阅读框 3 ( 0RF3 ) 和 0RF6能提高腺病毒主要晚期基因 mRNA的水平。缺乏 0RF3及 0RF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低 10⁶倍。

在又一个实施方案中，本发明提供了在病毒基因組中插入有选自下述的肿瘤治疗基因的重组病毒：（1)抑癌基因；（2)血管抑制基因；（3)细胞因子基因；（4)前药转换酶基因；及（5)细胞凋亡基因。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为抑癌基因。抑癌基因能抑制肿瘤细胞生长，抑癌基因可以选自，但不限于： P53、 Rb、 NF1、 VHL及 APC。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为血管抑制基因。血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。血管抑制基因可以选自，但不限于：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，为血浆纤维蛋白溶酶原中 Kringlel-4 结构、 Kringlel-5 结构、 Kringlel-3结构及 Kringlel- 3加上 Kringle5结构、干扰素 - α 基因、干扰素基因、干扰素 - Υ基因、血小板反应蛋白基因、血小板因子 4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂（PAI)基因、白细胞介素 -12 及纤维结合素基因。任选地，血管抑制基因中可以含有编码分泌型信号肽的核苷酸序列。该分泌型信号肽可以是外源的也可以是内源的，可以选自，但不限于：血管生成抑制因子自身信号肽， M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白 K链信号肽。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的重组病毒携带的肿瘤治疗基因为细胞因子基因。细胞因子基因具有激活免疫细胞，增加造血功能等。所述细胞因子基因可以选自，但不限于：白细胞介素 2、白细胞介素 12、粒 -单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素 - α、干扰素 - Ρ、干扰素 - γ、 Light及 Flt3配体。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重组病毒携带的肿瘤治疗基因为前药转换酶基因。前药转换酶基因可使无毒性药物转变成毒性药物，从而增强对肿瘤细胞的杀伤。所述前药转换酶基因可以选自，但不限于：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供的上述重組病毒携带的肿瘤治疗基因为细胞凋亡基因。细胞凋亡基因可导致真核细胞凋亡。所述细胞凋亡基因可以选自，但不限于： ICE、 capase-3, capase - 8、 capase—^

随着病毒在肿瘤细胞内复制，肿瘤治疗基因拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达肿瘤治疗基因。

本发明提供的重组病毒还可以：

1) 有其它增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制；和 /或

本发明所述病毒增殖必需区依所采用的病毒不同而不同，但容易为本领域技术人员知晓。本领域技术人员知晓，所述病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制 "是指病毒增殖必需基因与肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件在病毒基因组中的相对位置，依所用病毒的不同可以是多种多样的，只要该增殖必需基因的转录能够受到肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制即可。在一个实施方案中，本发明所述病毒中包含的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以在病毒增殖必需基因的转录起始位点之前适当的位置。在本发明的另一个实施方案中，肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以替代病毒自身的启动子。在本发明的另一个实施方案中，本发明所述病毒还可以是在病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域包含至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的重组病毒。

在一个实施方案中，所述重组病毒是单纯疱疹病毒，其病毒增殖必需基因含有早早期表达基因 ICP4。在又一实施方案中，所述重组病毒是腺病毒，其病毒增殖必需基因可以是以下腺病毒早期表达基因： E1A、 E1B、 E2、 E4, 也可以是腺病毒的晚期表达基因。

在一个具体的实施方案中，本发明所述重组病毒中的顺式作用元件可以选自，但不限于：缺氧反应元件，细胞 S期特异性启动子（E2F 启动子），甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子， ErbB2 增强子及启动子， ErbB3 增强子及启动子， ErbB4增强子及启动子， DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒緩素增强子及启动子， EB病毒中的 0rip， EB病毒 Orip中的 FR增强子， EB病毒 BamHI C- 启动子。缺氧反应元件（HRE)

肿瘤细胞不断增殖，其不断增多的肿瘤细胞数导致细胞耗氧量不断增加，因此在实体瘤中普遍存在着缺氧状态，极大多数实体瘤细胞均高效表达转录因子一缺氧诱导因子 l a ( HIF-1 α ) , 该转录因子可与缺氧反应元件（hypoxia- response element, HRE) 结合，促进其转录，因此在实体瘤中缺氧反应元件（HRE)可激活其转录水平， HRE 可来源于血管生长因子基因的启动子、促红细胞生成素基因的启动子、葡萄糖载体蛋白 1基因的启动子、血红素加氧酶基因的启动子和诱导型一氧化氧合酶基因的启动子等。

细胞 S期特异性启动子（E2F- 1启动子），

E2F - 1基因的表达同细胞周期相关，它是广泛表达的生长调控基因，在细胞 S期呈现出峰值转录活性。 RB蛋白及 RB家族的其它成员，可与 E2F - 1组成特异性复合体，遇制其激活转录的能力。因而， E2F - 1 受到 RB的下调控。在多种肿瘤细胞中，由于 Rb/P16INK4 a /_Cyclin D信号转导途径异常，从而导致 E2F- 1基因高表达，因此 E2F-1顺式作用元件在极大多数肿瘤细胞处于激活状态。

甲胎蛋白（AFP) 增强子及启动子

甲胎蛋白是一癌胚蛋白，它主要限于内胚层起源的分化组织 (如卵黄嚢、胎肝、内脏等）。它的表达水平随组织及发育阶段而有较大的变化。 AFP 在临床受到关注的原因是因为在大多数肝癌病人 AFP血浆浓度增高，一些疾病晚期的病人 AFP血浆浓度也升高。病人血浆中 AFP增高是由肝细胞癌的 AFP表达引起的，在肝癌周围的正常组织未出现 AFP的表达。因此，表达 AFP基因是肝癌细胞的特性。

据已出版的报道， AFP转录顺式作用元件对产生 AFP的细胞相关的细胞蛋白（如转录因子及共同因子）敏感，例如 AFP结合蛋白。转录顺式作用元件中至少需包含一个 AFP启动子和一个 AFP 增强子。源自 AFP基因的细胞特异性转录顺式作用元件已被鉴定。在 5，端距转录起始点上游近的序列中含有 AFP调控区（包括启动子、假定沉默子及增强子）。

在 AFP调控区中，人 AFP增强子位于 -3954到- 3335之间，人 AFP启动子位于 -174到 +29 (均相对于转录起始点）。并置这两种元件可产生一有全面功能的 AFP转录顺式作用元件。 Ido等描述了在肝癌细胞中特异表达的一长约 259bp启动子片段。（nt-230 到 +29 ) 。 AFP增强子位于 -3954到- 3335之间，包含两个区，分别命名为八和^ 启动子区包含了典型的 TATA盒和 CAAT盒。 AFP 转录调控元件最好要包含一个增强子区。当然， AFP的转录顺式作用元件含有两个增强子就更好。

关于 AFP的转录顺式作用元件可以包含任何数目的结构元件，而不是限于一个启动子，一个增强子；它可以是一个 AFP增强子同 AFP启动子；或一个 AFP启动子同一个异种增强子；或异种启动子同 AFP增强子；或前述元件的多重组合。 AFP的转录顺式作用元件中的启动子和增强子同编码利益基因的序列可以以任何方向及距离存在，只要元件内 AFP细胞特异性转录活性存在。目前构建的腺病毒载体还可包含一个 AFP的转录调控元件内源性沉默子，该元件亦可删除。

癌胚抗原（CEA) 增强子及启动子

CEA是一大小为 18000道尔顿、与肿瘤相关的糖蛋白抗原，主要出现在胃肠道内胚层生发的肿瘤，如结直肠癌、胃癌、胰腺癌，在一些其他腺癌如乳腺癌、肺癌亦有表现。由于在大多数 CEA阳性肿瘤的病人循环中可以检测到 CEA, 因而 CEA在临床上受到关注。在肺癌，约 50%的病例可在循环中检测到 CEA，在腺癌 CEA 的浓度超过 20ng/L，近 50%的胃癌患者血清 CEA阳性。 CEA的 5，端序列中呈现出细胞特异性活性。 CEA启动子区，位于该基因 5，端距转录起点上游的头 424个核苷酸，通过在产生 CEA细胞比非产生 CEA的 Hela细胞株表现出更高的启动子活性而展示出它的细胞特异性。另外，细胞特异性增强子区也被发现，可参阅 PCT/GB/02456。 CEA启动子、假定沉默子及增强子元件似乎包含在距起始转录点 14. 5Kb的区域中。对 CEA基因 5，端区域进一步研究发现，距转录起始点上游的两个区（-13. 6 到 -10. 7Kb, -6. lKbA 到 -4. 0Kb) , 当它们同多聚体化启动子相连时，可使报告基因在产生 CEA的 Lovo及 SW1463细胞株的表达增高且具特异性。 Richard 等也将启动子定位于距转录起始点 -90bp 到 +69bp之间的区域，其中 -41bp到 -18bp之间的序列对表达来说是必需的。 PCT/GB/02546描述了一系列 5，端呈现细胞特异性的片段，包括如下序列： nt- 299到 nt+69; nt-90到 nt+69; nt- 13600 到 -ntl0600, nt-6100到 nt-3800 (均相对于转录起始点而言）。另外，通过 CEA基因中的 -402到 +69的片段也可使相连基因具有組织特异性转录活性。

这里所提及的用到载体上的 CEA 的顺式作用元件来自哺乳动物细胞，包括但不局限于人类细胞。因此，只要载体中必需功能区存在，任何一种 CEA的顺式作用元件皆可被利用。

酪氨酸酶增强子及启动子

人酪氨酸酶基因在黑色素细胞特异性表达的顺式作用元件。该元件含有一长约 20bp名为酪氨酸酶远端元件（TDE ) 的序列，包含- CATGTG序列，位于距转录起始点的 - 1874到 - 1835之间。一包含人酪氨酸酶基因从- 209到 + 61间序列的启动子，被发现可以引导基因在黑色素细胞的特异性表达。与此相似，小鼠酪氨酸酶 5，端也有类似的一段序列登录基因库。小鼠的 TRP - 1基因的最小启动子已被识别，包括对于转录起始点 - 44到 + 107之间的序列。

在一些实例中，来自人酪氨酸酶基因 5，端的序列的黑色素细胞特异性的转录调控元件包含了相对于转录起始点 - 231到 + 65, 或含有- 1956到 - 1716之间的序列。黑色素细胞特异性的转录调控元件还可以包括以上两个并置的序列。据报道，距人酪氨酸酶转录起始点- 1956 到- 1716 间的序列能协同同种或异种启动子所启动的可操作连接报告基因在黑色素细胞特异性表达。因而，在一些实例中，黑色素细胞特异性的转录调控元件包含了异种启动子及通过操作与之相连的从- 1956到 - 1716间的序列。

尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA )增强子及启动子

uPA蛋白及其受体 uPAR, 在大多数常见肿瘤中有表达，且在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用。它们涉及乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、子宫癌。有关 uPA及 uPAR的转录顺式作用元件的序列已得到广泛的研究。

ErbB2增强子及启动子

其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。 C- erbB2/neu 基因为一转化基因，它编码一 185KD的同上皮生长因子受体相关的跨膜蛋白。在人类， C-erbB2/neu蛋白在胎儿发育过程中表达；在成人，这种蛋白用免疫组化的方法在许多正常组织上皮难以检测到。 C-erbB2/neu 基因的扩增及过度表达，同人类的许多肿瘤相关，如乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、胃癌及肺癌。在乳腺癌及卵巢癌， C- erbB2/neu 蛋白过度表达的后果已得到充分的研究。 C- erbB2/neu蛋白在 20 ^ 40%的乳腺癌及 30%的卵巢癌中过度表达，它同这两种类型疾病较差的预后相关。

人、大鼠、小鼠的 C-erbB2/neuTREs 已被识别且表现出针对表达 C-erbB2/neu细胞的特异性转录活性。

ErbB3增强子及启动子，其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。

ErbB4增强子及启动子，其为乳腺癌及胃癌细胞特异性激活增强子及启动子。

DF3乳腺癌相关抗原（MUC1)增强子

其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。 MUC1基因的蛋白产物（已知的有粘蛋白、 MUC1蛋白、表皮涎素、多形表皮粘蛋白或 PEM; EMA; DF3抗原； NPGP; PAS-0或 CA15. 3抗原）通常在胃、胰腺、肺、气管、肾脏、子宫、唾液腺、乳腺的腺体及管道的上皮细胞的顶端表达。在人类约 75 w 90%的乳腺癌中可发现粘蛋白的过度表达。粘蛋白的表达调控同乳腺癌的分化程度有一定关系。

MUCI基因在人乳腺癌细胞抹 MCF-7和 2R-75-的过度表达似乎发生在转录水平上。 MUCI基因的调控序列，包括距离转录起始点上游 0. 9Kb的序列已被克隆，其中包含的一顺式作用元件似乎同细胞特异性转录相关。

MUC1-的转录顺式作用元件从哺乳动物细胞取得，包括但不限于人类细胞，当然优先在人类细胞表达。 MUC1的转录顺式作用元件包含 MUCI基因 5，端的全部 0. 9Kb的序列。 MUCI的转录顺式作用元件也可包含了同启动子相连的如下序列（均相对于 MUCI转录起始点而言）： -725到 +31, nt-743到 nt+33, nt-750到 nt+33 及 nt - 598到 +485等。

前列腺素特异性抗原增强子及启动子

该前列腺素特异性抗原增强子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的 nt-5322 ~ nt- 3739, 启动子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的 nt- 540 ~ nt+12，该增强子与启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。

腺血管舒緩素增强子及启动子其可被特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。

爱泼斯坦氏 -巴尔氏病毒 (Epstein-Barr virus, 按常规简称为 EB病毒）中的 Orip、 EB病毒 Orip中的 FR、 EB病毒 BamHI C- 启动子、 EB病毒中的 Orip联合 EB病毒 BamHI C-启动子、 EB病毒 Orip中的 FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或 SV40基本启动子、在 EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。

在一个实施方案中，本发明提供了重组病毒，其基因组中至少有一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制，且另有其它的病毒增殖必需基因的蛋白功能缺失，但仍能在肿瘤细胞内特异性增殖。其中所述蛋白功能缺失可以是通过对编码基因的点突变、删除、插入突变实现的，也可以是天然突变产生的。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒 ElB 55Kda基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致 E1B 55Kda蛋白质功能异常。

在本发明的又一个实施方案中，所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒 ElB 19kDa基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致 E1B 19kDa蛋白质功能异常。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒 E1A基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致 E1A蛋白质功能异常。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是重组单纯疱疹病毒，其 ICP6基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致 ICP6蛋白质功能异常。

在本发明的又一个实施方案中，所述病毒是重组单纯疱疹病毒，其中该腺病毒双拷贝 ICP34. 5基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致双拷贝 ICP34. 5蛋白质功能异常。

本发明还提供了本发明重组病毒的增殖方法，包括将重组病毒（如重组腺病毒）感染端粒酶阳性的宿主细胞，从而使重組病毒特异性地在端粒酶阳性的宿主细胞中增殖。

使用只能在具有端粒酶活性的特殊靶细胞内增殖的腺病毒，可以在靶细胞中特异性增殖腺病毒并导致细胞死亡。在体外培养或在动物体内通过将修饰后的腺病毒与细胞复合物混合，腺病毒只能在具有端粒酶活性的细胞内增殖，也就是说除了具有端粒酶活性的细胞外，其他细胞不能被这种腺病毒杀死，由于腺病毒在具有端粒酶活性的细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中具有端粒酶活性的细胞被杀灭，一旦该具有端粒酵活性的细胞被破坏，腺病毒不再能够再增殖。

本发明提出上述重组病毒实际应用。例如将该重組病毒（如重组腺病毒）用于体外感染具有端粒醇活性的肿瘤细胞，导致细胞毒性。将重组病毒（例如重組腺病毒）用于抑制具有端粒晦活性的肿瘤细胞生长。将重组病毒（例如重組腺病毒）用于体内选择性杀灭具有端粒晦活性的肿瘤细胞。

重组病毒向靶细胞的送递有多种方式，包括但不限于脂盾体，本领域熟知的常规转染方法（如磷酸钙沉淀或电穿孔），直接注射，及静脉内灌注。送递方法主要取决于特定重组病毒（包括其形态）以及靶细胞的类型和位置（即细胞在体外还是在体内）。

若使用包装的重組病毒，则其可在适当的生理学上可接受载体中以剂量约 10⁴至约 10"给予。感染复数通常范围是约 0. 001 至 100。若所给予的是多核苷酸（即未包装成病毒），则其剂量可以是约 0. Ol g至约 1000 y g。具体的给药量可根据该病毒的有关常识（可方便地得自如已公布的文献）而定，亦可凭经验确定。重组病毒的给予可以是一次，也可以是多次，这取决于其目的用途和宿主的免疫应答能力，还可多重地同时注射给药。若不期望产生免疫应答，则可用各种免疫抑制剂减少免疫应答，以便能重复给药而不产生强免疫应答。

本发明还包括内含本文所述重组病毒的组合物，如药物组合物。这类组合物可体内给药。优选地，这些组合物更进一步包含药物学上可接受的赋形剂。这些可包含有效量的本发明重组病毒于药物学上可接受的賦形剂中的组合物适于以单位剂量形式、无菌的胃肠道外溶液或悬浮液、无菌的非胃肠道外溶液或口服液或悬浮液，水包油或油包水乳液等全身性给药于个体。非胃肠道外和胃肠道外药物送递配方为本领域已知，可参见 Remington's 药物科学， 18版， Mack Publishing (1990)。药物组合物还包括本发明重組病毒的冻干形式和 /或重建形式（包括包装成病毒的那些）。

本发明还提供治疗方法，其中将有效量的本文所述重组病毒施用于个体。应用重组病毒的治疗方法可用于肿瘤（如肝细胞癌）患者。还可用于肿瘤高危人群，如那些有此类病的家族史和 /或有已切除或以其它形式（如化疗）治疗过的疾病的个体。决定是否适于施用本发明的重组病毒将特别依据可评估的临床参数，如血清学指标及组织活检样品的组织学检查。通常施用含重组病毒的药物组合物。药物组合物如上述。

重组病毒的用量取决于多种因素，如具体的重组病毒类型，给药途径，个体的身体状况，疾病发展程度，所用的具体肿瘤治疗基因。

若施用包装的重组病毒，则用量为约 10⁴至约 10",优选约 10⁴ 至约 10¹²，更优选约 10⁴至约 10¹⁽⁾。若施用多核苷酸，则用量为约 0. 01 μ g至约 100 μ g，优选 0. 1 μ g至约 500 μ g, 更优选约 0. 5 至约 200 g。可同时或先后施用不止一种重组病毒。通常是周期性给药，同时监控任何反应。可经如肿瘤内、静脉内或腹膜内给药。

本发明的重組病毒可单独使用，也可与其它活性剂（如化疗剂，例如顺铂、 5-氟脲嘧啶、丝裂霉素（、碳铂、环磷酰胺等）联合使用，它们可促进达到所期望的目的。

与现有的肿瘤治疗方法相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用端粒酶启动子控制至少一个病毒增殖必需基因的转录，并同时将抗癌基因插入病毒基因组中，成功实现了病毒在端粒酶阳性的肿瘤细胞内特异性复制和增殖，形成高浓度病毒，直接破坏肿瘤细胞，同时在肿瘤细胞内随病毒复制而实现所携带的肿瘤治疗基因大量表达，产生协同作用，进一步杀灭端粒酶阴性的肿瘤细胞。本发明还利用肿瘤激活的顺式作用元件控制病毒另一增殖必需基因或通过基因突变使病毒必需基因功能缺失，使病毒不能在人类生殖细胞、造血干细胞及胃肠道的憩室细胞中增殖及复制，从而进一步减少对正常细胞的毒性。同时本发明也比单纯采用肿瘤基因治疗及特异性增殖病毒方法进行治疗更为有效。

具体实施方式

人类腺病毒有 6个不同亚属，分为 A、 B、 C、 D、 E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒 C亚属中的 5型（Ad5)作为例证，对本发明加以进一步具体说明，但不限于该例证。本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。

实施例 1: 携带端粒酶催化亚基基因启动子的克隆载体的构建。

自新鲜的正常人肝组织中抽提基因组 DNA,应用巢式多聚酶链反应（PCR)技术扩增端粒酶催化亚基基因启动子（方法参见 PCR Protools Current Methods and Applications, White BA主编， Humana Press Inc. 1993年出版一文献 1) ,在启动子 5，端入 EcoR I、 Not I及 Bgl I三个酶切位点，在启动子 3，端加入 Swa I、 BamH I两个晦切位点。

引物 1 : 5， CGG GCT CCC AGT GGA TTC 3， (SEQ ID N0 : 1) 引物 2 : 5， AAC GTG GCC AGC GGC AGC ACC TC 3， (SEQ ID NO : 2) 引物 3 : 5' GGA ATT CGC GGC CGC AGA TCT CAC AGA CGC CCA GGA ACC 3， (SEQ ID NO : 3)

引物 4 : 5' CGG GAT CCA TTT AAA TTG GCC GGG GCC AGG GCT TC 3， (SEQ ID NO : 4)

引物 1与引物 2进行第一次 PCR扩增，回收 370bp片段，再用引物 3与引物 4对 370片段进行第二次 PCR扩增，回收 270bp 片段，应用 EcoR I+BamH I对酶切，将该基因插入 pUC19载体（购于美国 ATCC公司）中进行测序，其测序结果见下： 5，

gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccaa tttaaatgga tec 3， (SEQ ID NO : 5)

结果表明端粒酶催化亚基基因启动子正确，将其命名为 pUC-hTERTp。

合成含有 3 χΕ-box的连接头

引物 5 : 5' TCG AGG ACG CAC GTG GGC GCA CGT GGG CGC ACG

TGG GAT TTA AAT A 3， (SEQ ID NO : 6)

引物 6： 5' AGC TTA TTT AAA TCC CAC GTG CGC CCA CGT GCG

CCC ACG TGC GCC T 3， (SEQ ID NO : 7) 将引物 5与引物 6进行变性，复性，应用磷酸激酵进行磷酸化，将其插入 _pUC-hTERTp中 Xho I与 Hind IE酶切位点（方法参见分子克隆实验指南第二版， J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社. 1996年出版一文献 2)。将该质粒进行测序，其测序结果见下： 5， gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac tcgacgcacg tgggcgcacg tgggcgcacg tgggatttaa ataagct 3' (SEQ ID NO : 8)

结果表明端粒酶催化亚基基因启动子正确，将其命名为 pUC-hTERT-Ep, 该端粒酶催化亚基基因启动子含有人端粒醇催化亚基基因启动子中 nt-213 至 nt+47 以及在其下游加入了 3 个 E- box序列，并在整个启动子的上游序列中加入了 Not I与 Bgl II 酶切位点，在整个启动子的下游序列中加入了 Swa I晦切位点。

例 2: 可携带抗癌基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A 表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。

pXC. 1载体购于加拿大 Microbix Biosystem Inc. (Toronto) , pXC. 1含有 5型腺病毒序列 bp22-5790。在该载体中 552bp处创立 7个新的、唯一的眸切位点，分别为 Age I、 Bst BI、 Not I、 Spe I、 Sal I、 Xho I和 Swa I，该位点位于 E1A起始密码前 12bp, 其方法采用定位突变双次 PCR技术（方法参见前述文献 1)。其引物分别为

引物 7: 5，-引物（含有 EcoR I酶切位点） 5，TTC AAG AAT TCT CAT GTT TG 3， (SEQ ID NO : 9)

引物 8: 3，—引物（在 5，端加入 ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAG TGC GGC CGC TTC GAA CCG GT) 5， ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAG TGC GGC CGC TTC GAA CCG GTG TCG GAG CGG CTC GGA

3， (SEQ ID NO : 10)

引物 9： 5，-引物（在 5，端加入 ACC GGT TCG AAG CGG CCG CAC TAG TGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG) 5， ACC GGT TCG AAG CGG CCG CAC TAG TGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG TGA CTG AAA ATG AGA CAT ATT A 3， (SEQ ID NO : 11)

引物 10: 3，-引物（含有 Xba I酶切位点） 5， TTC TCT AGA CAC AGG TGA TG 3， (SEQ ID NO : 12)

采用定位突变双次 PCR技术， PCR产物片段插入 pGEM_T-easy 载体中（方法参见 Promega公司操作说明书），命名为 pGEM_T_Ela。将该片段进行 DNA测序，其测序结果显示：在 pXC. 1质粒 bp552 位点中插入 TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCG GT, 从而产生 7个新的 Age I、 Bst BI、 Not I、 Spe I、 Sal I、 Xho I和 Swa I酶切位点，其它序列与 pXC. 1相同。应用 EcoR I与 Xba I双醇切 pGEM- T-E1A及 pXC. 1质粒，将 pGEM-T- E1A 中切出片段插入 pXC. 1质粒中 EcoR I及 Xba I位点中，使 pXC. 1 中 552插入一个 TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCG GT, 从而产生 7个 Age I、 Bst BI、 Not I、 Spe I、 Sal I, Xho I和 Swa I酶切位点，该位点位于 E1A起始密码前 12bp, 将该质粒命名为 pQWl。

pUC-hTERTp用 Not I+Swa I酶切，其酶切片段分别插入 pQWl 质粒中 Not I+Swa I酶切位点中，分别应用引物 4及 7进行 PCR 扩增，扩出 1310bp，这表明端粒酶催化亚基基因启动子已正向插入 pQWl质粒 Not I+Swa I位点，即腺病毒 5型 E1A起始密码子上游区 12bp处，命名为 pQW-hTERTp。 pUC- hTERT- Ep用 Not I+Swa I 酶切，其酶切片段分别插入 pQWl质粒中 Not I+Swa I酶切位点中，分别应用引物 6及 7进行 PCR扩增，扩出 1352bp, 这表明端粒酶催化亚基基因启动子加转录位点后 3个 E-盒序列已正向插入 pQWl 质粒 Not I+Swa I位点，即腺病毒 5型 E1A起始密码子上游区 12bp 处，命名为 pQW- hTER- Ep。

例 3. 可携带抗癌基因的端粒酶催化亚基基因启动子及缺氧元件分别控制 E1A及 E1B表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。

缺氧作用元件（HRE)联合基础人巨细胞启动子（mini-CMVp)由 5个拷贝的 HRE及基础人巨细胞启动子组成。其缺氧作用元件（HRE) 来源于血管内皮生长因子的启动子序列，其 5个拷贝的 HRE的核苷酸序列如下： 5，

CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA CAG GTC CTC TT 3， (SEQ ID NO : 13)

基础人巨细胞启动子（min i-CMVp)的序列如下：

5， GGT AGG CGT GTA CGG TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA GCT CGT TTA GTG AAC CGT CAG ATC 3' (SEQ ID NO : 14)

缺氧作用元件（HRE)联合基础人巨细胞启动子（mini-CMVp)含有以上两个序列，并在 5，-未端与 3， -未端分别加入 Spe I酶切位点，缺氧作用元件（HRE)联合基础人巨细胞启动子（mini-CMVp) 由上海申能博彩生物科技有限公司进行全长基因合成。经测序正确，命名为 pMD- HRE, 其核苷酸序列如下： 5，

ACTAGTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCAT ACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCC TCTTCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCACAGTGCATACGTG GGCTCCAACAGGTCCTCTTGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGA GCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGT 3， (SEQ ID NO : 15) 在 pQW-hTER-Ep质粒中使其缺失 E1B启动子，该启动子位于 pQW-hTER-Ep 质粒中 ntl926-nt2043 位置（即在 5 型腺病毒的 ntl595-ntl713位置），将该位置缺失并创立 1个新的、唯一的 Spe I酶切位点，该位点位于 E1B起始密码前 4bp, 其方法采用定位突变双次 PCR技术（方法参见前述文献 1)。其引物分别为

引物 11： 5， TCA CCT GTG TCT AGA GAA TGC 3， (SEQ ID NO : 16) 引物 12 : 5' CTC CCA AGC CTC CAT ACT AGT TTA AAC ATT ATC

TCA CCC TTT A 3， (SEQ ID NO : 17) 引物 13 : 5， ACT AGT ATG GAG GCT TGG GAG TGT TTG 3， (SEQ

ID NO : 18)

引物 14: 5， GGC CAG AAA ATC CAG CAG GTA 3， (SEQ ID NO: 19) PCR产物片段插入 pGEM-T-easy载体中（方法参见 Promega公司操作说明书），命名为 pGEM-T-ElB。将该片段进行 DM测序，其测序结果显示：在 pQW-hTER- Ep质粒 ntl926-nt2043位点缺失并插入产生 1个新的 Spe I酶切位点，其它序列与 pQW-hTER-Ep 相同。应用 Kpn I与 Xba I双酶切 pGEM-T-ElB及 pQW- hTER-Ep 质粒，将 pGEM- T-E1B中切出片段插入 pQW-hTER-Ep质粒中 Kpn I 及 Xba I位点中，使在 pQW-hTER-Ep质粒 ntl926-nt2043位点缺失并插入产生 1个新的 Spe I酶切位点，该位点位于 E1B起始密码前 4bp, 将该质粒命名为 pQW2-Spe。

将 pMD-HRE用 Spe I酶切，回收含有缺氧作用元件（HRE)联合基础人巨细胞启动子（mini-CMVp)片断，将其插入 pQW2-Spe质粒中的 Spe I醉切位点。应用 PCR技术分别验证其插入的正反方向引物 15 : 5， AGG TCT ATA TAA GCA GAG CTC 3，（SEQ ID NO : 20) 用引物 14及引物 15进行 PCR,其 PCR产物长度为 518bp，这表明缺氧作用元件（HRE)联合基础人巨细胞启动子（mini-CMVp)正向插入 E1B上游区，命名 pQW- hTERT- Ep-HRE。

例 4.端粒酶催化亚基基因启动子控制的减毒增殖腺病毒的重组。

293细胞抹购于加拿大 Microbix Biosystem Inc. (Toronto) , 是由剪切的 5型腺病毒 DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达 5型腺病毒 E1区，腺病毒 DNA对其具有高转染率。将含有 5型腺病毒左臂的质粒联合含有 5型腺病毒右臂的质粒共转染 293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将 pQW-hTERTp, pQW-hTERT-Ep 及 Adv- hTERT-Ep-HRE分别与含有 5 型腺病毒右臂的质粒 pBHGE3通过 Lipofectamine共转染至 293 细抹，其具体方法参见 GIBCO BRL公司的操作说明。 pBGHE3购于加拿大 Microbix Biosystems Inc. (Ontario) , pBGHE3含有 5型腺病毒右臂，含有 E3区。共转染后 9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得 E1A受端粒酶催化亚基基因启动子控制的腺病毒，分别命名为 Adv-hTERTp- Ela 、 Adv- hTERT- Ep- Ela及 Adv-hTERT-Ep- Ela-HRE-Elb，分别记为 QW1、 QW2及 QW3, 见附图由上迷方法构建的重组病毒的列表如下：

病毒名称含 Ad5左臂质粒含 Ad5右臂质粒

Adv-hTERTp-Ela QW1 pQW-hTERTp PBHGE3

Adv- hTERT- Ep - E la QW2 pQW-hTERT-Ep PBHGE3

Adv- hTERT- Ep- E la- HRE-Elb QW3 pQW- hTERT- Ep-HRE PBHGE3 腺病毒在 293 细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒（具体方法参见前述文献 2出版）。

Adv-hTERTp-Ela ( QW1 )为 5型腺病毒，在 E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，病毒其他 DNA序列与 5型腺病毒相同。 Adv-hTERT-Ep- Ela (QW2)为 5型腺病毒，在 E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子及 3个拷贝的 E-盒，病毒其他 DNA序列与 5型腺病毒相同。

Adv- hTERT-Ep- Ela-HRE-Elb (QW3)为 5型腺病毒，在 E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒晦催化亚基基因启动子及 3个拷贝的 E-盒，缺失 E1B的启动子，并在 E1B上游区插入 5个拷贝的缺氧作用元件联合基础 C V启动子，病毒其他 DNA序列与 5 型腺病毒相同。

例 5:端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的减毒增殖腺病毒在正常细胞及肿瘤细胞株的复制情况比较

正常细胞株肺成纤维细胞 MAC-5及 IMR-90均为端粒酶阴性，肿瘤细胞株包括：肝癌细胞抹 Hep G II及 Hep3B, 乳腺癌细胞株 MRD-231,肺癌细胞株 A549, 黑色素瘤细胞株 A375, 结肠细胞株 HT29, 胰腺癌细胞株 Pane- 1, 子宫頭癌细胞株 Hela，鼻咽癌细胞抹 CNE-2 及胃癌细胞株 SGC7901, 上述细胞除了鼻咽癌细胞株 CNE-2及胃癌细胞株 SGC7901购于中国科学院上海细胞所细胞库，其余细胞株购于美国 ATCC 公司，上述肿瘤细胞株的端粒醇均阳性。将上述细胞株按 5 xlO⁵细胞 /孔铺在 6-孔板中，在 37* 孵箱 5%C02 培养，第二天换无血清液体 lml，然后，分别加入病毒 Adv-hTERTp-Ela (QWl) 、 Adv-hTERT-Ep-Ela (QW2) 或 Adv-hTERT-Ep- Ela-HRE- Elb (QW3) , 其病毒量为 2. 5 χΐθ⁶/孔，培养 90分钟后，用磷酸盐緩冲液（PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入 5%胎牛血清的培养液培养，分别在 0小时及 48小时收集，冻融三次，用 TCID50法来检测病毒滴度（方法参见美国 Qbiogene 公司的 AdEasyTM操作手册），其结果见附图 2, 可见在正常细胞中的病毒复制能力 Adv-hTERT-Ep-Ela-HRE- Elb (QW3)病毒小于 Adv-hTERT-Ep-Ela (QW2)病毒小于 Adv-hTERTp-Ela (QWl)病毒；而在肿瘤细胞中病毒复制能力 Adv-hTERT-Ep-Ela-HRE-Elb (QW3) 病毒、 Adv-hTERT- Ep-Ela (QW2)病毒与 Adv-hTERTp-Ela(QWl)病毒相似。

应用蛋白印迹杂交技术（Western blot) 观察 Adv-hTERT-Ep-Ela (QW2) (具体方法参见文献 2)在正常细胞株中肺成纤维细胞 MAC-5及 IMR- 90中 E1A均不表达，而在肿瘤细胞株 A549、 Hep 3B及 Pane- 1中 E1A则高效表达，见附图 3。

例 6.携带人内皮抑素（endostatin) 基因的 El区缺失的腺载体的构建

pCA13载体购于加拿大 Microbix Biosystem Inc. (Toronto) , pCA13含有 5型腺病毒序列 bp22-5790并缺失 El区 342至 3523bp 片段，在 E1 缺失区插入了人巨细胞病毒（HCMV) IE 启动子 (-299— +72) 及 SV40 poly A加尾信号。应用多聚酶链反应（PCR) 技术人内皮抑素（endostatin) 基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总 RNA , 以随机引物作逆转录反应，在扩增人内皮抑素 (endostatin) 基因，并用两次多聚醇链反应（PCR)技术（方法参见文献 1)在基因前加入 M-成瘤蛋白（ Oncostatin-Μ )信号肽及信号肽前、基因结尾引入 EcoR I和 Xba I两个酶切位点。

引物 16 : 5， GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG

AGG ACG CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC 3' (SEQ

ID N0 : 21)

引物 17 : 5， CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA

AGC ATG GCG AGC CAC CGC GAC TTC CAG 3， (SEQ ID NO : 22)

引物 18 : 5' GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG

CTG TTC TCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TG 3， (SEQ ID NO : 23) 引物 17与引物 18进行第一次 PCR扩增，回收 615bp片段，再用引物 16与引物 18对 615bp片段进行第二次 PCR扩增，回收 647bp 片段，应用 EcoR I+Xba I 对酶切，将该基因插入 pbluescript IIKS (+)载体（购于美国 ATCC公司）中进行测序，其测序结果见下： 5，

GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCC TTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGT GCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGC GGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCT TCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGC CGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGC TGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCT TCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGT GTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACG TGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCA GGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCAT TGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG 3，（SEQ ID NO : 24) 将其 EcoR I+Xba I切下，定向插入 pCA13载体 EcoR I+Xba I 中，命名 pCA13- human endostat in。

例 6 : 携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的腺病毒载体的构建：

应用 Bgl II分别酶切 pCA13-human endostatin, 分别回收 1237bp (含有人巨细胞病毒（HCMV) IE启动子（-299—+72) 、含有 M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及 SV40 poly A加尾信号），将其插入 pUC- hTERTp中 Bgl II酶切位点，应用 PCR技术分别验证其插入的正反方向：其端粒酶催化亚基基因启动子 3，-端引物引物 19 : 5， TGG CCG GGG CCA GGG CTT C 3，（SEQ ID NO : 25) 引物 20 :人内皮抑素 3，-引物（位于 M -成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中 577- 600bp) 5， AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C 3，（SEQ ID NO : 26)

其引物 19与引物 20能扩增到 1108bp，表明含有人巨细胞病毒 (HCMV) IE启动子（-299—+ 72) 、含有 M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及 SV40 poly A加尾信号正向插入 pUC-hTERT-Ep Bgl II晦切位点。命名为 pUC - hTERT - Ep - endostatin。

应用 Not I和 Swa I双酶切 pUC-hTERT-Ep-endostatin, 回收片段，分别插入 pQW-hTERT- Ep中 Not I和 Swa I酶切位点，分别命名为 pQW_hTERT- Ep-endostatiri。

例 7:携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒与携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的腺病毒的重组。

293细胞株购于加拿大 Microbix Biosystem Inc. (Toronto) , 是由剪切的 5型腺病毒 DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达 5型腺病毒 E1区，腺病毒 DNA对其具有高转染率。将含有 5型腺病毒左臂的质粒联合含有 5型腺病毒右臂的质粒共转染 293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将 pCA13-endostatin 和 pQW-hTERT-Ep-endos tat in 分别与含有 5 型腺病毒右臂的质粒 pBHGE3通过 Lipofectamine共转染至 293 细株，其具体方法参见 GIBC0 BRL 公司的操作说明。 pBGHE3 及 pBHGlO购于加拿大 Microbix Biosystems Inc. (Ontario) , pBGHE3 含有 5型腺病毒右臂，含有 E3区； pBGHIO含有 5型腺病毒右臂，但缺失 E3区。共转染后 9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒和携带人内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A的增殖腺病毒，并，分别命名为 Ad-endostatin 与 Adv-hTERT-Ep_Ela-endostatin,分别记为 Ad-endostatin与 QW2—endostatin。由上述方法构建的重组病毒的列表如下：

含 Ad5右病毒名称含 Ad5左臂质粒

臂质粒

Ad-endostatin Ad- endostatin PCA13-endostatin PBHGE3

Adv-hTERT-Ep- PQW-hTERT-Ep-

QW2 -endostatin PBHGE3

Ela-endostatin endostatin

腺病毒在 293 细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒（具体方法参见前述文献 2出版）。 Ad-endostatin 为 E1区缺陷的携带人 endostatin的非增殖 5型腺病毒，即传统的腺病毒载体系统携带人的 endostatin 。 Adv- hTERT-Ep- Ela- endostatin ( QW2- endostatin ) 为 5型腺病毒，在 EIA转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，并在端粒酶催化亚基基因启动子上游区新建一个 Bgl II酶切位点，在该晦切位点中反向插入含有人巨细胞病毒（HCMV) IE 启动子 (-29 9- -+72) 、含有 M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及 SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他 DNA序列与 5型腺病毒相同。

例 8:携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的腺病毒的的体外在具有端粒酶活性的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人内皮抑素。

正常细胞抹肺成纤维细胞 MAC- 5及 IMR- 90均为端粒酶阴性，肿瘤细胞株包括：肝癌细胞株 Hep G n及 Hep3B，乳腺癌细胞株 MRD-231,肺癌细胞株 A549, 黑色素瘤细胞株 A375, 结肠细胞株 HT29, 胰腺癌细胞株 Panc-1，子宫颈癌细胞株 Hela, 鼻咽癌细胞株 CNE-2及胃癌细胞株 SGC7901, 将上述细胞株按 5 ><10⁵细胞 / 孔铺在 6-孔板中，在 37t)孵箱 5%C02培养，第二天换无血清液体 lml, 然后，分别加入野生型 5型腺病毒（WAd5)、携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒（Ad-endostat in)或携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A 表达的腺病毒 (Adv-hTERT-Ep-Ela-endostatin, QW2- endostatin)，其病毒量为 2. 5 x107孔，培养 90分钟后，用磷酸盐緩冲液（PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入 5%胎牛血清的培养液培养，分别在 0小时及 48小时收集，冻融三次，用 TCID50法来检测病毒滴度（方法参见美国 Qbiogene公司的 AdEasy™搡作手册），其结果见附图 4，可见野生型 5 型腺病毒（WAd5)在正常细胞及肿瘤细胞均复制及增殖，携带内皮抑素的增殖缺陷型腺病毒（Ad-endostatin) 在正常细胞及肿瘤细胞均不复制及增殖，携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A 表达的腺病毒 (Adv-hTERT-Ep-Ela-endostatin, QW2-endostatin)则只在端粒酶阳性的肿瘤细胞内增殖与复制而在端粒酶阴性的正常细胞基本不复制。

将胰腺癌细胞株 Panc-1及胃癌细胞株 SGC7901按 1 ><10⁵细胞 /孔铺在 6-孔板中，在孵箱 5%C02培养，第二天换无血清液体 lml , 然后，分别加入携带内皮抑素的非增殖腺病毒 (Ad-endostatin)或携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A 表达的腺病毒（Adv-hTERT-Ep- Ela-endostatin, QW2-endostatin) , 其病毒量为 5 10⁵/孔，培养 90分钟后，用磷酸盐緩冲液（PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入 5%胎牛血清的培养液培养，分别在 0天、 3天及 7天收集细胞上清， QW2- endostatin的内皮抑素的表达量 QW2- endostatin明显高于非增殖腺病毒（Ad-endostat in)，见图 5。

将感染肿瘤细胞株 Hep 3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒 QW2- endostatin, M0I为 1, 371：孵育 1 小时，感染后 7 天收集细胞，应用 QIAamp DNA Blood mini kit (德国 QIAGEN公司）提取病毒 DNA, 方法参见 QIAGEN 公司操作说明。将上述 QW2- endostatin提取的 DNA分别应用 Bgl II酶切，用 1%的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用 ³²P分别标记人内皮抑素 cDNA片段 (EcoR I与 Xba I双酶切 pCA13 - human endostatin, 回收 637bp) 作为探针，进行 souther blot 杂交，以 pCA13-human endostatin 作为人内皮抑素拷贝数对照（方法参见文献 2) , QW1- endostatin在肿瘤细胞株 Hep 3B及正常人成纤维细胞的每个细胞人内皮抑素拷贝数分别为 2 xl0⁴及 <10。

例 9:携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的腺病毒在棵鼠体内治疗移植肿瘤

将 4-5周龄的 SCID小鼠皮下接种细胞株 Hep3B细胞 1 10⁷，两周后给予端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的增殖腺病毒（QW2)、携带内皮抑素非增殖型腺病毒（Ad5-endostatin)或携带内皮抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制 E1A表达的增殖腺病毒（QW2- endostatin)治疗，每次 2 x l0⁸pfu, 共 5次，结果见图 6, 其未治疗組 4周后肿瘤体增加 3倍以上，而治疗组则肿瘤增加不明显，其疗效 QW2— endostatin优于 QW2及 Ad5—endostatin。

Claims

权利要求

1. 一种重组病毒，其特征在于该病毒的至少一个病毒增殖必需基因的转录受端粒酶基因启动子的有效控制；并且该病毒基因组中还包含肿瘤治疗基因的核苷酸序列。
2. 根据权利要求 1所述的重组病毒，其特征在于所述端粒酶基因启动子可以是下述之一：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶 RNA组份基因启动子。
3. 根据权利要求 2所述的重组病毒，其特征在于所述端粒酶基因启动子是端粒晦催化亚基基因启动子。
4. 根据权利要求 3所述的重組病毒，其特征在于所述端粒酶催化亚基基因启动子的转录起始位点下游添加了多个拷贝的 E-盒核苷酸序列（SEQ ID NO : 27)。
5. 根据权利要求 1所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒为腺病毒，并且至少一个所述腺病毒增殖必需基因是选自下述的腺病毒早期表达基因： E1A, E1B, E2, E4。
6. 根据权利要求 1所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒为腺病毒，并且至少一个所述腺病毒增殖必需基因是腺病毒晚期表达基因。
7. 根据权利要求 7所述的重组病毒，其特征在于所述肿瘤治疗基因选自：抑癌基因、血管抑制基因、细胞因子基因，前药转换酶基因或细胞凋亡基因。
8. 根据权利要求 7所述的重组病毒，其特征在于所述的抑癌基因可以是： P53、 P21、 Rb、 NF1、 VHL及 APC; 所述的血管抑制基因可以是：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中 Kringlel- 4结构、 Kringlel- 5结构、 Kringlel-3结构、 Kringlel-3加上 Kringle5结构、干扰素 - α基因、干扰素 - β基因、干扰素 - γ基因、血小板反应蛋白基因、血小板因子 4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂（ΡΑΙ)基因、白细胞介素 -12及纤维结合素基因；所述的细胞因子基因可以是：白细胞介素 2、白细胞介素 12、粒 -单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素 - α、干扰素 - Ρ、干扰素 - Y、 Light及 Flt3配体；所述的前药转换酶基因可以是：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；所述的细胞凋亡基因可以是： ICE、 capase-3> capase - 8、 capase—9。
9. 根据权利要求 8所述的重组病毒，其特征在于所述的血管抑制基因中含有编码分泌型信号肽的序列。
10. 根据权利要求 9所述的重组病毒，其特征在于所述分泌型信号肽可以是下述中的任何一种：血管生成抑制因子自身信号肽， M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白 K链信号肽。
11. 根据权利要求 1-10任一项所述的重组病毒，其特征在于所述病毒中：

1) 另一个增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制；和 /或

2) 至少一种增殖必需区的蛋白功能缺失，并且该重组病毒能在肿瘤细胞内特异性增殖。
12. 根据权利要求 11所述的重组病毒，其特征在于所述病毒的另一个增殖必需基因的转录受至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制，其中所述顺式作用元件选自：缺氧反应元件，细胞 S期特异性启动子，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，駱氨酸醉增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子， ErbB2增强子及启动子， ErbB3增强子及启动子， ErbB4增强子及启动子， DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒緩素增强子及启动子， EB病毒中的 Orip, EB病毒 Orip中的 FR增强子， EB 病毒 BamHI C-启动子。
13. 根据权利要求 11所述的重组病毒，其特征在于所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒的 ElB55Kda、 ElB19Kda和 /或 E1A基因编码的相应蛋白功能缺失。
14. 根据权利要求 11所述的病毒，其特征在于所述病毒是一种重组单纯疱疹病毒，该单纯疱疹病中 ICP6、双拷贝 ICP34. 5基因编码的相应蛋白功能缺失。
15. 根据权利要求 1-14任一项所述的重组病毒的增殖方法，其特征在于将重组病毒体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，从而在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内增殖。
16. 权利要求 1 - 14任一项所述的重组病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，导致具有端粒酶活性的肿瘤细胞毒性。
17. 根据权利要求 1 - 14 任一项所述的重组病毒用于治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤： 1 )将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞， 2 )使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码抗癌基因的核苷酸序列拷贝数增加及抗癌基因表达量增加；由此特异性直接杀灭肿瘤细胞抑制肿瘤形成、生长及转移。
18. 根据权利要求 17所述的方法，其还包括在权利要求 1 - 15 任一项所述重组病毒感染肿瘤细胞之前、同时和 /或之后施用化学抗肿瘤药物的步骤。
19. 根据权利要求 1 - 14 任一项所述的重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。
20. 根据权利要求 1 - 14 所述的重组病毒在制备可用于治疗肿瘤的药物中的用途。 <sup>2,</sup>- 一种药物组合物，其包含权利要求 1-14任一项所迷的重组病毒以及药学上可接受的载体。