KR100969171B1 - 종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 다음을 포함하는 유전자발현 조절서열: (ⅰ) HRE(hypoxia-responsive element: HRE) 인핸서 서열; 및 (ⅱ) 상기 HRE 서열의 다운스트림에 위치한 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터; 그리고, (b) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 유전자 서열을 포함하는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체, 특히 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 또한, 상기 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 선택적 종양세포 살상능 또는 고사능이 개선된 효과를 발휘하며, 특히 저산조 조건에서 크게 향상된 항종양 효과를 나타낸다. 또한, 암세포 내에서 재조합 아데노바이러스의 특이적 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

유전자전달체, 아데노바이러스, HRE, hTERT, TRAIL, 저산소, 종양세포, 암, 유전자치료

Description

종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체{Gene Delivery Systems Exhibiting Enhanced Tumor-Specific Expression}

본 발명은 종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체에 관한 것이다.

악성 종양의 성장은 영양분과 산소공급에 의해 크게 좌우된다. 특히, 산소는 암세포에서 적절한 에너지 대사를 위해 절대적으로 필요한 물질이다. 일반적으로 암세포는 급속한 성장 속도로 인하여 종양의 중심부에 쉽게 산소 부족 현상(hypoxia)이 나타난다. 암세포가 성장하면서 나타나는 산소 부족 현상은 암 치료와 암 진행에 있어서 매우 중요한 요소이다. 고형암내에서 산소 부족 지역은 암세포의 생존과 전이를 위한 운동성 및 혈관형성을 촉진시킴으로써 암의 진행에 유리한 작용을 하게 된다²². 또한 최근 연구에 의하면 암세포가 산소 부족 현상을 겪게 되면 항세포고사 물질의 발현이 증가하여 세포 고사가 억제 되고, 또한 방사선 치료요법과 항암 화학 치료 요법에 대한 내성을 가지게 된다고 보고되고 있다^{2 ,10}. 암세포가 가지는 이러한 특성으로 인해 야기되는 항암 치료의 한계점을 극복하기 위해 새로운 항암 치료법의 개발이 시급한 현실이다.

따라서 암 치료를 위한 효과적인 치료법으로 현재 바이러스를 이용한 방법들이 많이 개발되고 있다. 대표적으로 현재 증식 가능 아데노바이러스를 이용한 임상 시험들이 활발히 진행되고 있다^{3 -7}. 재조합 아데노바이러스는 세포의 분열 상태 여부에 관계없이 다양한 종류의 세포에 대한 우수한 유전자 전달 효율을 보이며 높은 역가의 바이러스를 쉽게 생산할 수 있고, 쉽게 농축할 수 있을 뿐만 아니라 생체 내에서도 유전자 전달이 용이하다¹². 또한 암을 유전자 요법으로 치료할 경우, 치료 유전자를 장기적 혹은 지속적으로 발현할 필요가 없으며, 치료용 바이러스 자체에 의해 유도되는 숙주의 면역반응도 크게 문제시되지 않으며 오히려 이점이 될 수 있기 때문에 아데노바이러스가 암 치료용 유전자 전달체로 각광을 받고 있다. 이러한 장점을 바탕으로, 최근에 암을 대상으로 하는 유전자 치료에 재조합 아데노바이러스를 이용하는 빈도수가 지속적으로 증가하고 있다^{12 -15}.

특히, 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양 세포 특이 증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 암세포에서만 특이적으로 증식하여 암세포를 죽일 수 있는 종양 살상 아데노바이러스는 바이러스의 증식으로 일차 감염세포 뿐만 아니라 주변의 종양 세포들도 이차적으로 감염할 수 있어 치료 효과를 현저히 증대 시킬 수 있으며, 주변의 정상세포에서는 종양 살상 아데노바이러스의 증식이 억제되므로 아데노바이러스에 의한 독성이 감소되는 이점도 있다. 또한 암 특이적 유전자 조절부위를 E1 유전자 부위에 삽입하여 암 조직에서만 더욱 선택적으로 증식하도록 제작된 재조합 아데노바 이러스도 개발되고 있다. 이에 따라 종양 특이적 살상 아데노바이러스의 임상 응용 가능성이 점차 증가 할 것으로 예상되고 있다^{16 ,17}.

암세포에서 나타나는 산소 부족 환경 하에서 HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α)와 p21^cip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)이 활성화되고, 그 발현이 증가함으로써 세포 주기가 억제됨에 따라 자신의 모든 생활사를 숙주세포에 의존적으로 살아가는 바이러스의 증식이 억제되는 현상이 나타난다. 바로 이것이 바이러스를 이용한 지속적인 암 치료에 대한 제한점으로 나타나고 있다⁸. 그러나 이를 역이용하여 산소 부족에 의해 조절되는 유전자들의 프로모터나 인핸서를 이용하면 암세포에 대한 특이성을 보다 증가시킬 수 있을 것이다. 이러한 사실을 바탕으로 본 연구에서는, 암세포 조직 발달을 위해 필요한 신생 혈관 생성에 관여하는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)의 인핸서 부분인 저산소-반응성 성분(hypoxia-responsive element: HRE)를 이용하여 암세포에서만 특이적 활성을 가진 벡터를 개발하고자 하였다.

인간 혈관 내피 성장인자 유전자의 인핸서 부분인 HRE는 산소부족에 의해 조절되는 몇몇 유전자들(예: Epo, VEGF, GAPDH)의 코딩부위에도 위치하며, 산소 수준이 아주 낮을 때만 단백질의 생산을 시작하도록 할 수 있는 조절부위이다. 보고에 의하면, 고형암 특이적 환경인 저산소 조건에서 높은 수준으로 발현되는 인간 혈관 내피 성장인자 프로모터 5’인접부위 중 HRE(-1.2 ~ -0.8 kb) 부위를 암세포 특이적 프로모터에 연결 시켰을 때 인 비트로 와 인 비보 모두에서 암 특이적이고 강화된 항암 활성을 나타내었다¹⁸. 이것은 고형암의 특징인 저산소증 상태에서 특이적으로 활성화될 수 있는 인핸서와 암세포 특이적 프로모터를 결합시키는 방법을 통해 암세포 특이성을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

유전자 치료를 통한 항암 치료를 하는 방안으로, 암세포 특이적인 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되어 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법과 함께 암세포 내에 세포고사를 유도 할 수 있는 치료 유전자를 전달시킬 수 있는 방안도 있다.

한편, TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)이 다양한 범위의 암세포에 세포고사를 유발하지만 정상적인 세포에는 세포독성을 보이지 않는다는 점에서 TRAIL이 새로운 생물학적 항암제로 적용할 수 있다는 가능성을 제공해 주고 있다. 또한 사멸 수용체(death receptor)를 통한 세포고사는 p53과 무관하게 암세포에 세포고사를 유발할 수 있는 장점이 있다²⁰.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암세포의 저산소 조건(hypoxia)에서도 바이러스의 복제가 억제되지 않으며, 오히려 종양세포 선택적 살상능 또는 고사능이 개선된 유전자 전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 유전자전달체 특히 재조합 아데노바이러스에 HRE 서열 및 상기 HRE 서열의 다운스트림에 위치한 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터를 포함하는 유전자발현 조절서열과 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된 유전자 서열을 추가적으로 삽입시킨 경우에는 저산소 조건에서 상술한 종양세포 선택적 살상능 또는 고사능이 크게 향상됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 저산소 조건 하에서의 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터의 변형체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 약제학적 항종양 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 다음을 포함하는 유전자발현 조절서열: (ⅰ) HRE(hypoxia-responsive element: HRE) 인핸서 서열; 및 (ⅱ) 상기 HRE 서열의 다운스트림에 위치한 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터; 그리고, (b) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 유전자 서열을 포함하는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체를 제공한다.

본 발명자들은 암세포의 저산소 조건(hypoxia)에서도 바이러스의 복제가 억제되지 않으며, 오히려 종양세포 선택적 살상능 또는 고사능이 개선된 유전자 전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 유전자전달체 특히 재조합 아데노바이러스에 HRE 서열 및 상기 HRE 서열의 다운스트림에 위치한 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터를 포함하는 유전자발현 조절서열과 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된 유전자 서열을 추가적으로 삽입시킨 경우에는 저산소 조건에서 상술한 종양세포 선택적 살상능 또는 고사능이 크게 향상됨을 확인하였다.

본 발명의 가장 큰 특징은 종양 세포 선택적 살상능 또는 고사능을 개선하기 위하여 HRE 인핸서 서열 및 hTERT 서열을 포함하는 유전자발현 조절서열을 이용하는 것이다. 즉, 본 발명의 유전자 발현조절서열은 인핸서 서열로서 HRE와 프로모터 서열로서 hTERT의 조합으로 이루어진 유전자발현 조절서열을 이용한다.

본 명세서에서 용어 “HRE”는 저산소-반응성 인핸서 서열을 의미한다. 저산소 조건에서 세포의 특정 유전자들의 발현이 조절된다(Bunn and Poyton Physiol . Rev . 76:839-885(1996); Dachs and Stratford Br . J. Cancer 74:5126-5132(1996); Guillemin and Krasnow Cell 89:9-12(1997)). 대부분의 종양세포는 불충분한 혈액공급을 받게 되는데, 이는 종양세포들이 일반적으로 혈관을 형성시키는 내피세포보다 빠르게 성장하기 때문이며, 이는 종양에서 저산소 상태를 유발하게 된다. 저산소 반응의 주요한 매개자는 전사 복합체 HIF(hypoxia inducible factor)-1α이며, 이는 다양한 유전자의 조절 부위에 있는 HRE와 상호작용 하며, 상기 유전자는 예컨대 혈관내피성장 인자(VEGF) 유전자, 그리고 에놀라아제-1와 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 같은 당분해 효소-코딩 유전자들을 포함한다. 본 발명은 이와 같이 저산소 조건에서 유전자들의 발현을 조절하며 HIF-1α와 상호작용하는 서열인 HRE를 이용한다. HRE는 유전자전달체, 특히 재조합 아데노바이러스의 종양세포 선택성을 크게 향상시키는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 HRE 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, HRE 서열에 의한 전사 활성을 향상시키기 위하여, HRE 반복 서열을 이용한다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 HRE 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 2-12번 반복, 보다 더욱 더 바람직하게는, 4-8번 반복된 서열, 가장 바람직하게는 5-7번 반복된 서열을 갖는다. 본 발명에서 이용되는 예시적인 HRE 서열은 서열목록 제15서열에 기재되어 있으며, 이는 HRE 서열이 6번 반복된 것이다.

본 발명에 이용된 HER 서열은 유전자전달체, 특히 재조합 아데노바이러스의종양세포 선택성 및 살상능 개선에 매우 중요한 역할을 한다. 일반적으로 암세포는 급속한 성장 속도로 인하여 종양의 중심부에 쉽게 산소 부족 현상이 나타난다. 암세포가 성장하면서 나타나는 산소 부족 현상은 암 치료와 암 진행에 있어서 매우 중요한 요소이며, 고형암내에서 산소 부족 지역은 암세포의 생존과 전이를 위한 운동성 및 혈관형성을 촉진시킴으로써 암의 진행에 유리한 작용을 하게 된다. 또한 암세포에서 나타나는 산소 부족 환경 하에서 HIF-1α와 p21^cip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)이 활성화되고, 그 발현이 증가함으로써 세포 주기가 억제됨에 따라 자신의 모든 생활사를 숙주세포에 의존적으로 살아가는 바이러스의 증식이 억제되는 현상이 나타난다. 바로 이것이 유전자전달체를 이용한 지속적인 암 치료에 대한 제한점이다. HRE는 이러한 문제점을 극복하는 데 기여한다.

한편, hTERT는 염색체 복제동안 텔로미어의 길이를 일정하게 유지하는데 관여하는 효소인 텔로머라제의 구성요소로서, 세포노화, 암, 세포불멸에 관여하는 것으로 알려졌다(Counter, C.M. et al. EMBO J. 11,1921-29(1992), Kim. N. W. et al. Science, 21:2011-5(1994), Harley, C. B. et al. Nature, 345:458-60(1990)). 텔로머라제의 활성은 사람의 경우 난소와 고환의 생식세포 및 임파구에서 관찰되나 그 외 정상 체세포에서는 관찰되지 않고 있다(Wright, W.E. et al. Dev . Genet . 18:173-9(1996)). 따라서 정상 체세포는 제한된 회수의 세포분열 후에는 텔로미어의 길이가 일정길이 이하로 감소되어 더 이상 분열하지 못하고 사멸된 다(Yasumoto, S. et al. Oncogene . 3:433-9(1996)). 반면에, 암 진행 전단계인 양성 종양 세포 및 암세포에서는 텔로머라제의 활성이 증가된다(Broccoli, D. et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 92:9082-6(1995). 난소암에서 텔로머라제의 활성 증가가 최초로 보고 된 이후, 혈액암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 유방암 등 거의 모든 인체 암에서 텔로머라제의 활성 증가가 관찰되고 있다(Counter, C.M. et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 91:2900-4(1994)). 텔로머라제의 기능에 필수적인 역할을 하는 hTERT의 발현은 텔로머라제의 활성과 관련되어 있으며, 최근에는 텔로머라제의 발현이 hTERT 프로모터의 활성, 즉 hTERT의 mRNA의 양에 따라 조절된다는 것이 밝혀졌다. hTERT의 활성을 조절하기 위한 최소의 프로모터의 크기는 181 bp이며, 야생형 hTERT 프로모터에는 2개의 c-Myc 결합부위와 5개의 Sp1 결합부위가 포함되어 있다. 정상세포에 비해 암세포에서 월등히 높게 발현되는 발암단백질(oncoprotein)인 c-Myc 및 Sp1와 상기된 결합부위의 결합은 hTERT의 프로모터를 활성화시킨다는 것이 보고되었다(Cerni, C. Mutat . Res . 462:31-47(2000)). Shoji 연구팀은 hTERT 프로모터를 이용하여 암세포 특이적 유전자 발현을 유도하여 캐스파제-8(Caspase-8)과 같은 아폽토시스를 유도하는 독성 유전자를 암세포에서만 발현시킬 수 있었다(Shoji, K. et al. Human Gene Therapy, 11:1397-406(2000)).

본 발명의 유전자전달체에서, hTERT는 종양세포에 대한 특이성을 향상시키는 작용을 한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 hTERT 프로모터는 변형 hTERT 프로 모터(mTERT 프로모터)이며 상기 mTERT 프로모터는 서열목록 제4서열에 기재된 천연형(natural-occurring) hTERT 프로모터에 추가적인 c-Myc 결합위치, Sp1 결합위치 또는 c-Myc 결합위치와 Sp1 결합위치를 포함한다.

천연형 hTERT 프로모터는 2개의 c-Myc 결합위치 및 5개의 Sp1 결합위치를 포함한다. 본 발명에서는 이러한 hTERT 프로모터의 종양세포 특이성을 더욱 높이기 위하여 추가적인 c-Myc 결합위치 및/또는 Sp1 결합위치를 도입시킨다.

천연형 hTERT 프로모터에 추가적으로 삽입되는 c-Myc 결합위치의 개수는 1-12개, 보다 바람직하게는 3-12개, 보다 더 바람직하게는 4-10개 결합위치, 가장 바람직하게는 6개이다. 천연형 hTERT 프로모터에 추가적으로 삽입되는 Sp1 결합위치의 개수는 1-9개, 보다 바람직하게는 3-8개, 보다 더 바람직하게는 4-7개 결합위치, 가장 바람직하게는 5개이다.

천연형 hTERT 및 변형 hTERT 내 Myc 결합 위치 서열은 서열목록 제9서열이며, Sp1 결합 위치 서열은 서열목록 제10-14서열 중에서 선택된다.

상기 추가적으로 삽입되는 c-Myc 결합 위치는 바람직하게는 서열목록 제5-8서열내 위치하고, 보다 바람직하게는 서열목록 제7-8서열내 위치하며, 가장 바람직하게는 서열목록 제8서열내 위치한다. 또한 추가적으로 삽입되는 Sp1 결합 위치는 바람직하게는 서열목록 제6-8서열내 위치하고, 보다 바람직하게는 서열목록 제7-8서열내 위치하며, 가장 바람직하게는 서열목록 제8서열내 위치한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변형 hTERT 프로모터는 서열목록 제4서열의 천연형 hTERT 프로모터에 (i) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열, (ⅱ) 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 (ⅲ) 상기 ⅰ)과 ⅱ)의 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 결합되어 있는 것이다.

천연형 hTERT 프로모터에 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열이 추가되는 경우, 상기 추가서열은 천연형 hTERT 프로모터의 5’또는 3’-말단에 결합할 수있으며, 바람직하게는 천연형 hTERT 프로모터의 3’-말단에 결합한다. 보다 바람직하게는, 천연형 hTERT 프로모터에 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열이 추가된 변형 TERT 프로모터는 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

천연형 hTERT 프로모터에 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열이 추가되는 경우, 상기 추가서열은 천연형 hTERT 프로모터의 5’또는 3’-말단에 결합할 수있으며, 바람직하게는 천연형 hTERT 프로모터의 5’-말단에 결합한다.

보다 바람직하게는, 천연형 hTERT 프로모터에는 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열과 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열 모두가 결합된다. 이 경우, 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열은 천연형 hTERT 프로모터의 5’또는 3’-말단에 결합할 수 있으며, 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열은 천연형 hTERT 프로모터의 5’또는 3’-말단에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 변형 TERT 프로모터는 서열목록 제8서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 바이러스는 서열목록 제7서열 또는 제8서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형 hTERT 프로모터를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 재조합 바이러스는 제8서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형 hTERT 프로모터를 포함한다. 제8서 열의 변형 hTERT는 하기의 실시예에서 mycTERT로 명명된다.

HRE 및 hTERT를 포함하는 유전자발현 조절서열은 발현하고자 하는 유전자 서열과 작동적으로 연결(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 연결된”은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된 발현 대상의 유전자는 특별하게 제한되지 않는다. 예를 들어, 발현하고자 하는 유전자는 유전자전달체의 지놈에서 유래된 유전자(예컨대, 아데노바이러스의 ElA 유전자) 또는 치료학적 트랜스 유전자(transgene)를 포함한다. 치료학적 트랜스 유전자는 아래에 상세하게 설명되어 있다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

HRE 서열 및 TERT 서열을 포함하는 유전자발현 조절서열과 상기 유전자 발현조절서열에 작동적으로 연결된 유전자 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달체에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러 스 (Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed . A. Meager (1999)), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed . A. Meager , (1999)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415 (1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066- 1073(1989)). 따라서, 본 발명의 유전자발현 조절서열은 E1A 유전자의 프로모터 서열 위치에 삽입되어 E1A 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전 달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp . Hematol . (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest ., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열 (릴랙신 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol ., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine (Gibco BRL)이 있다. 운반하 고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol . 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol . Cell . Biol . 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol . Cell Biol ., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol ., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl. Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 다르면, 본 발명은 (a) 아데노바이러스의 ITR(inverted terminal repeat) 서열; (b) 다음을 포함하는 유전자발현 조절서열: (ⅰ) HRE(hypoxia-responsive element: HRE) 인핸서 서열; 및 (ⅱ) 상기 HRE 서열의 다운스트림에 위치한 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터; 그리고, (c) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 유전자 서열을 포함하는 암세포 특이적 살사능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자발현 조절서열은 재조합 아데노바이러스의 E1A 유전자의 업스트림, 결실된 E3 유전자 영역 또는 E1A 유전자의 업스트림과 결실된 E3 유전자 영역 모두에 위치할 수 있다.

본 발명의 유전자발현 조절서열이 E1A 유전자의 업스트림에 위치하는 경우, 즉 E1A 유전자에 본 발명의 유전자발현 조절서열이 작동적으로 연결된 경우(HRE-hTERT-E1A), 재조합 아데노바이러스의 복제가 본 발명의 유전자발현 조절서열에 의해 조절된다.

본 발명의 유전자발현 조절서열이 결실된 E3 유전자 영역에 위치하는 경우에는, “유전자발현 조절서열-트랜스 유전자-폴리 A" 발현카세트 형태로 결실된 E3 유전자 영역에 삽입되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는다. 본 명 세서에서, 유전자와 관련하여 사용되는 용어 “비활성화”는 그 유전자의 전사 및/또는 해독이 정상적으로 이루어지지 아니하여, 그 유전자에 의해 코딩되는 정상적인 단백질의 기능이 나타나지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 비활성화 E1B 19 유전자는 그 유전자에 변이(치환, 부가, 부분적 결실 또는 전체적 결실)가 발생되어 활성의 E1B 19 kDa 단백질을 생성하지 못하는 유전자이다. E1B 19가 결실되는 경우에는 세포 고사능을 증가시킬 수 있고, E1B 55 유전자가 결실된 경우에는 종양세포 특이성을 갖게 한다(참조: 특허출원 제2002-23760호). 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 저산조 조건에서 더욱 향상된 항종양 효과를 나타내며, 암세포 내에서의 제한된 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 복제가능(replication-competent) 아데노바이러스에 기초한다. 따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함한다. 용어 “활성의 E1A 유전자”는 E1A 단백질의 고유한 기능을 할 수 있는 산물을 발현하는 E1A 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. E1A 유전자는 아데노바이러스 감염 직후 가장 먼저 발현되는 유전자 부위이다. E1A 단백질은 바이러스 복제에 필수적이다. 활성의 E1A 유전자 없으면, 바이러스 DNA 복제에 필수적인 유전자 산물이 생성되지 않기 때문에 바이러스 감염이 진행되지 않는다(Nevins Adv . Virus Res . 31:35-81(1989)).

본 발명의 재조합 아데노바이러스에서 E1A 서열은 천연형 뉴클레오타이드뿐만 아니라, E1A 고유의 기능을 발휘하는 범위에서 어떠한 변이(variations)도 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 글루탐산 잔기가 글리신으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 글리신으로 치환된 변이를 갖는 것이다. 종양 세포에서는 p53 단백질의 변이뿐 아니라 Rb의 돌연변이 혹은 Rb 관련 신호기전이 상당부분 손상되어 있기 때문에, Rb와의 결합능이 소실된 아데노바이러스는 정상 세포에서는 Rb의 활성으로 아데노바이러스의 복제가 억제 되지만 Rb의 기능이 억제된 종양 세포에서는 활발하게 복제되어 암세포를 선택적으로 살상할 수 있다. 따라서, 상술한 Rb 결합 부위에서의 변이를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암세포 특이성이 매우 우수하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 치료학적 트랜스 유전자를 추가적으로 포함한다. 바람직하게는, 상기 치료학적 트랜스 유전자는 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자를 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “치료학적 트랜스 유전자(therapeutic transgene)”는 암세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증 식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자 등이 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)’는 표적 세포내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제 인자 유전자에는, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자 (Lee et al., Nature, 1987, 329,642), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질 (adenomatouspolyposis coil protein)(미국특허공보 5,783,666호), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc . Nat . Acad . Sci, 95:3042-3047 (1998)), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘항원성 유전자(antigenic gene)’는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53 (Levine, A., 국제특허출원공개 WO 94/02167호)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제I형 항원에 결합시킬 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포독성 유전자(cytotoxic gene)’는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)’ 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자 (예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스 (growth arrest specific homeobox: GAX) 유전자 (국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO 96/30385호) 등이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포사멸 유전자(papoptotic gene)’는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)’는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS , 95:8795-800 (1998))와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

재조합 아데노바이러스에 삽입되는 트랜스 유전자는 프로모터-트랜스 유전자 -폴리 A 서열의 발현 카세트로 삽입되는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 프로모터로서, 본 발명의 유전자발현 조절서열(HRE-hTERT) 또는 통상적인 프로모터를 이용할 수 있다. 트랜스 유전자에 결합되는 통상적인 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 트랜스 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, inducible 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

트랜스 유전자를 발현시키기 위한 발현 컨스트럭트에서 트랜스 유전자의 다운스트림에 폴리아데닐화 서열이 결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리아네닐화 서열은, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res . 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol . Cell Biol . 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res . 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol . Cell . Biol . 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol . Cell . Biol . 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

가장 바람직하게는, 재조합 아데노바이러스에 삽입되는 트랜스 유전자는 TRAIL 유전자이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “TRAIL”은 아폽토시스를 일으키는 인자인 종양 괴사 인자(TNF)계 서열을 리간드를 의미한다. TRAIL은 다양한 종양세포를 살상시키지만, 정상세포는 TRAIL 처리에 저항성을 나타내는 것으로 알려져 있다( Ashkenazi et al., J. Clin . Invest ., 104:155-162(1999); Walczak et al., Nat . Med ., 5:157-163(1999); Walczak et al., Nature Med ., 3(2):157-163(1999)).

TRAIL-코딩 뉴클레오타이드 서열은 본 발명 재조합 아데노바이러스의 종양세포 살사능을 개선하는 작용을 한다.

본 발명에 사용된 TRAIL-코딩 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 E1A의 업스트림, E3 영역 또는 E4 영역, 보다 바람직하게는 E1A의 업스트림 또는 E3 영역 영역에 위치하며, 가장 바람직하게는 E3 영역에 위치한다.

암을 대상으로 유전자 치료를 시행하는 경우에는 일생동안 치료 유전자의 발현을 지속시킬 필요가 없고, 국소 투여할 경우에 아데노바이러스에 의한 면역반응이 크게 문제시 되지 않거나, 오히려 장점이 될 수 있기 때문에 아데노바이러스를 이용한 암유전자 치료제 개발 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 따라서, 본 발 명에서도 기본적으로 아데노바이러스의 지놈 골격을 이용하여 암의 유전자 치료를 달성하고 있다.

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

아데노바이러스 지놈의 작은 부분만이 cis에서 필요한 것으로 알려져 있기 때문에 (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981)), 아데노바이러스는 대량의 외래 DNA 분자를 운반할 수 있는 능력이 있으며, 이는 특히 293과 같은 특정 세포주를 이용하는 경우에 그러하다. 이러한 측면에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 있어서, 외래 서열 이외에 다른 아데노바이러스의 서열은 적어도 ITR 서열을 포함한다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

본 명세서에서 용어 “아데노바이러스”는 ‘아데노바이러스 벡터’와 동일하게 사용되고 있으며, ‘아데노비리디아에’ 속에 속하는 바이러스를 의미한다. 용어 ‘아데노비리디아에’는, ‘마스트아데노바이러스’ 속의 동물성 아데노바이러스 (인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 쥐 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 포함하며, 이에 한정되지 않는다)를 총체적으로 일컫는다. 특히, 인간의 아데노바이러스는 A-F 아속 (subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 인간의 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형 (Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형 및 제91형이 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에서의 아데노바이러스는, 인간의 아데노바이러스 제2 또는 제5 혈청형(serotype)에서 유래한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 다르면, 서열목록 제8서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터의 변형체를 제공한다.

상기에 hTERT 프로모터 변형체에 대한 기술이 있으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해서 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 개발된 유전자발현 조절서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스는 종양세포 선택성이 크게 증가되었있다. 더욱이, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 TRAIL 트랜스 유전자를 포함하는 경우, TRAIL 단백질을 분비하여 아폽토시스 촉진을 통해 항종양 효과가 현격히 증대되며, 특히 저산소 조건에서 HRE 인핸서에 의해서 증가된 아데노바이러스 복제를 나타내기 때문에, 결국 암세포-특이적으로 개선된 세포 고사능을 나타낸다. 이는 결과적으로 암치료에 필요한 바이러스 투여량을 감소시킬 수 있어 바이러스에 의한 생체내 독성과 면역반응을 크게 줄일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 뇌암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 식도암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 대장암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “치료 ”는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환 자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 x 10⁵ - 1 x 10¹⁵ PFU/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 x 10¹⁰ PFU를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독 소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 HRE 및 hTERT 조합으로 이루어진 유전자발현 조절서열을 이용한다.

(ⅱ) 본 발명의 HRE-hTERT 유전자발현 조절서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스는 선택적 종양세포 살상능이 크게 개선된다.

(ⅲ) 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 특히 저산조 조건에서 더욱 향상된 항종양 효과를 나타내며, 암세포 내에서의 제한된 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하였다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지 에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

대상 세포주 및 세포 배양

연구에서 사용된 세포주들은 인체 뇌암 세포주(U87MG, U343, U251N)와 폐암 세포주(A549, Sk-LuI), 간암 세포주(Hep1), 그리고 인체 정상 세포주인 섬유아세포주(WI38, BJ, IMR90)등을 사용하였으며, 모두 ATCC(American Type Culture Collection: Manassas, VA, 미국)에서 구입하였다. 그리고 아데노바이러스 초기 발현 유전자인 E1 부위가 숙주 유전체 내에 내재되어 있는 HEK293 세포주(ATCC, 미국)를 아데노바이러스 생산 세포주로 사용하였다. 모든 세포주들은 10%의 우태아 혈청(Gibco-BRL, Grand Island, NY, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle`s medium, Gibco BRL)으로 항생제 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco-BRL, 미국)을 첨가하여 5% CO₂의 존재 하에 37℃의 항온 배양기에서 배양하였다.

아데노바이러스들의 제작, 생산 및 역가 산출

6개의 HRE 인핸서가 인접해 있는 mycTERT 프로모터에 의해 E1A 유전자의 발 현이 조절되는 아데노바이러스를 제작하였다. 우선, pXC1/E1B19(E1B19가 결손 되고 E1B55를 포함하는 E1B 부위를 가짐)을 제작하였다. pXC1(Microbix Biosystems, Toronto, ON, Canada)를 XbaI과 BamHI 제한효소로 절단하여 E1A 유전자부위(9875-1339 bp)인 1.3 kb의 DNA 절편을 얻고, 이를 pSP72 클로닝 벡터(Promega, Madison, WI)에 삽입시켜 pSP72/pXC1/1.3kb 벡터를 제작하였다. E1B 19kDa 유전자의 개시코돈을 없애고 종료코돈으로 바꾸는 돌연변이를 유도하기 위해 위치-특이적 변이유발을 시행하고 pSP72/pXC1/1.3kb/E1B19를 제작하였다. 이어, pSP72/pXC1/1.3kb/E1B19를 XbaI/BamHI으로 다시 절단하고, XbaI/BamHI으로 절단한 pXC1 내에 재삽입시켜 pXC1/E1B19를 제작하였다. XbaI/KpnI으로 절단하여 생성된 절단 단편을 XbaI/KpnI으로 절단된 pXC1/mt#7에 삽입시켜 pXC1/mt#7/19를 제작하였다. 한편, pXC1/mt#7 벡터는 다음과 같이 제작하였다. pXC1을 XbaI과 BamHI 제한효소로 절단시켜 1.3 kb의 DNA 절편을 얻고, 이를 pSP72 클로닝 벡터(Promega, Madison, WI)에 삽입시켜 pSP72/pXC1/1.3kb 벡터를 제작하였다. 이어, E1A pRb-결합위치를 치환하기 위한 돌연변이를 유도하기 위해 아래의 올리고머와 QuickChange 위치-특이적 변이유발 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 위치-특이적 변이를 유도하여 pSP72/pXC1/mt#7 벡터를 제작하였다: 센스 프라이머: 5‘-GTACCGG AGGTGATCGGTGGTGGCGGAGGCGGGGGTGGCTTTCCACCCAG-3’; 안티센스 프라이머: 5‘-CTGGGTGGAAAGCCACCCCCGCCTCCGCCACCACCGATCACCT CCGGTAC-3’. 그 결과, pRb-결합위치인 CR1의 45번째 아미노산이 Glu에서 Gly로 치환되고, CR2의 121-127번째 아미노산이 DLTCHEA에서 GGGGGGG으로 치환되었다. pSP72/pXC1/mt#7 벡터 를 다시 XbaI/BamHI으로 절단하여 E1A pRb-결합위치에 돌연변이가 유도된 유전자의 DNA 절편을 얻고, XbaI/ BamHI 으로 절단한 pXC1 내에 재삽입시켜 pXC1/mt#7을 제작하였다.

상기 제작된 pXC1/mt#7/19을 EcoRI/XbaI 으로 절단하고 절단단편(인서트)을 EcoRI/XbaI 으로 절단한 pXC1/E1B19(NheI self)E1B55에 삽입시켜 pE1mt7/19(NheI self)E1B55를 제작 하였으며, 이 과정은 NheI self site를 넣기 위한 과정이다. 한편, pXC1/E1B19(NheI self)E1B55의 제작 과정은 다음과 같다. pXC1/E1B19의 E1B 19kDa 유전자를 포함하는 DAN 절편을 XbaI/KpnI으로 절단하고, XbaI/KpnI으로 절단된 pSP72에 삽입 한 후 PCR을 이용하여 E1B19kDa 유전자에 NheI site를 삽입하고 NheI으로 self ligation시켜 E1B19 유전자를 제거한 pSP72/E1B19(NheI)를 제작하였다. 이어, pSP72/E1B19(NheI)를 XbaI/KpnI으로 절단하여 NheI으로 self ligation시켜 E1B 19kDa 유전자가 제거된 유전자 부위를 포함하는 DNA 절편을 얻고 XbaI/KpnI으로 절단한 pXC1/E1B19내에 재삽입시켜 pXC1/E1B19(NheI self)E1B55를 제작하였다.

이어, 제작된 pE1mt7/19(NheI self)E1B55를 주형으로 하여 Rb7△19/E1B55 부위를 중합효소반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 증폭하여 원하는 유전자 부위를 얻었다. “Rb7△19/E1B55” 서열에서 Rb7은 아데노바이러스의 지놈에서 E1A 부위에 있는 Rb 결합 부위를 구성하는 아미노산 서열중에서 45번째 Glu가 Gly으로 치환되고, 121-127번째 아미노산 서열인 7개 Gly이 결손된 것을 의미한다(참조: 대한민국 특허 제746122호). △19/E1B55는 E1B 부위에서 E1B19가 결손된 것 을 나타낸다. 상기 PCR 과정에서 정방향 프라이머로 5’-GCGGAATTCACTCTTGAGTGCCAGCGAGTA-3’과 역방향 프라이머로 5’-CGCGGATCCACATTTCAGTACCTCAATCTG-3’을 사용하였으며, 클로닝상의 편의를 위해 EcoRI과 BamHI 제한효소 부위를 삽입하였다. 생성된 PCR 산물을 EcoRI과 BamHI으로 절단한 후, p△E1sp1B(Microbix Biosystems, Toronto, Canada)에 삽입하여 p△E1sp1B/Ψ#1/Rb7△19/E1B55 벡터를 얻었다.

이어, mTERT 프로모터를 포함하고 있는 pSEAP-mTERT 벡터(Eunhee Kim et al., Hum Gene Ther . 10;14(15):1415-28(2003))에 5 카피의 myc 결합위치를 삽입하기 위해, 5 카피의 myc 결합위치에 대한 서로 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다. 이때 5‘쪽에는 BglII 제한효소 인식부위(고딕체 부분)를 삽입시키고 3’쪽에는 BamHI 인식부위(이탤릭체 부분)를 삽입시켜 다음과 같은 올리고머를 DNA 합성기로 합성하고 이를 80℃에서 15분간 방치하고 천천히 식도록 하여 서로 합체되도록 한 뒤, pSEAP-mTERT를 BglII 로 절단하고 삽입하여, pSEAP2-mycTERT/SV40를 제작하였다. 5‘-GATCTACCACGTGGTACCACGTGGTACCACGTGGTACCACGTGGTACCACGTGGTCTG C -3’, 5‘-AGGTGCACCATGGTGCACCATGGTGCACCATGGTGCACCATGGTGCACCAGAC GGATC -3‘.

mycTERT는 본 발명자에 의해 개발된 mTERT 프로모터(참조: 대한민국 특허 제523028호)를 추가적으로 변형시킨 것으로서, mTERT 프로모터의 업스트림쪽에 5개의 myc 결합위치를 추가적으로 결합시킨 프로머터이다. mycTERT는 mTERT와 비교하여 암세포내에서의 프로모터 활성이 증가하는 이점(advantages)을 갖는다.

그런 다음, pE1sp1A(Ψ) (Microbix Biosystems, Toronto, ON, Canada)를 BamHI/EcoRI으로 절단하고 그 부위에 pSEAP2/mycTERT/SV40를 BglII/EcoRI로 절단하여 얻은 mycTERT 프로모터를 삽입하여 pE1sp1A/mycTERT/SV40를 제작하였다. 그러고 나서, p△E1sp1A/mycTERT/SV40 벡터를 ClaI과 EcoRI 제한효소로 절단한 후 상기 pBSKⅡSK(+)벡터(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 삽입하여 pBSKⅡSK(+)/mycTERT 벡터를 얻었다. 위에서 제작된 pE1sp1B/Ψ#1/Rb719/E1B55(인서트) 및 pBluescriptⅡSK+/mycTERT(벡터 템플레이트)를 EcoRI와 BamHI으로 절단하고, 라이게이션하여 pBluescriptⅡSK+/mycTERT/Rb719/E1B55를 벡터를 얻었다.

한편, pAF5.1[Δ2.7]-CAT 플라스미드(NAKABAYASHI et al., Molecular and cellular biology, p.5885-5893(1991))를 HindIII로 부분 절단하여 AFPΔ2.7을 얻어내고 pSP72 를 HindIII로 절단한 플라스미드와 라이게이션시켜 pSP72/hAFPΔ2.7을 제작하였다. 제작된 pSP72/hAFPΔ2.7를 XhoI과 XhaI 절단을 통해 AFPΔ2.7를 얻고 이를 XhoI과 NheI로 절단한 pGL3-basic 벡터(Promega)와 라이게이션 함으로써 pGL3/hAFPΔ2.7을 제작하였다. VEGF 유전자의 5’-플랭킹 부위의 HRE를 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 통하여 합성하였다: 5’- TCGAGCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTG3’ 및 3’ CGGTGTCACGTATGCACCCGAGGTTGTCCAGGAGAACAGCT5’. 합성된 HRE는 6개의 HRE(HRE₆)로 연쇄화 되었다. HRE₆는 각 끝 부분이 MluI 절단위치로 제작 되었다. pGL3/hAFPΔ2.7를 MluI으로 절단하고 HRE₆와 라이게이션하여 pGL3/HRE₆/hAFPΔ2.7를 제작하였 다.

pSEAP2(Clontech Laboratories, Inc., CA, USA)를 BglⅡ/HindⅢ로 절단하고 mycTERT를 삽입하여 pSEAP2/mycTERT/SV40를 제작하고, pSEAP2/mycTERT/SV40와 pE1sp1A(Microbix Biosystems, Toronto, ON, Canada)를 BglⅡ/EcoRI으로 절단하고 라이게이션하여 pE1sp1A/mycTERT/Rb719/E1B55을 제작하였다. 이어, 6개의 HRE 서열을 첨가하기 위해 pGL3/HRE₆/hAFPΔ2.7을 XhoI과 SalI 제한 효소로 절단하여 295 bp의 HRE6을 앞서 제작된 pE1sp1A/mycTERT/Rb719/E1B55를 XhoI으로 처리한 후에 라이게이션하여 pE1sp1A/HRE₆/mycTERT/Rb719/E1B55 벡터를 얻었다.

이렇게 제작된 pE1sp1A/HRE₆/mycTERT/Rb719/E1B55 벡터로부터 재조합한 인핸서와 프로모터를 XhoI과 BamHI 제한효소로 절단하여 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(참조: Agah R., et al., J Clin Investig. 100:169179(1997); Bett A. J. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 91:88028806(1994), Microbix, Ontario, Canada)에 삽입하여 pE1sp1B/HRE₆/mycTERT/Rb719/E1B55 벡터를 얻었다. 상기의 벡터를 XmnI 제한효소를 처리하여 단일가닥으로 만들고, BstBI 제한효소 처리로 단일가닥이 된 아데노바이러스 dl324BstBⅠ(S. B. Verca, University of Fribourg, Switzerland; Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))과 대장균 BJ5183(S. B. Verca, University of Fribourg, Switzerland)에 동시에 형질 전환시켜 유전자 상동 재조합(homologous recombination)을 유도함으로써, Ad-YKC11 벡터를 얻었다. BJ5183에서 획득한 재조합된 Ad-YKC11 벡터를 다시 DH5α 대장 균(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 형질 전환시켜 DNA를 증폭시켰다. DH5α 대장균으로부터 상동 재조합된 플라스미드 DNA를 수득하고 HindⅢ 제한효소로 처리하여 각각의 재조합된 아데노바이러스 유전체들을 선별하였다.

TRAIL을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제작하기 위하여, pORF-hTRAIL 벡터(Invivo Gen, CA, USA)를 NcoI/NheI로 절단하여 TRAIL 유전자를 분리해 내고 이를 BamHI으로 절단한 pSP72△E3 아데노바이러스 셔틀벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 삽입하여 pSP72△E3/TRAIL 벡터를 제작하였다. XmnI 제한효소 처리로 단일가닥 된 pSP72△E3/TRAIL 벡터와 SpeI 제한효소 처리로 단일가닥이 된 Ad-YKC11 벡터를 함께 대장균 BJ5183에 동시에 형질 전환시켜 유전자 상동 재조합을 유도하여, Ad-YKC11-TRAIL 벡터를 제작하였다. BJ5183에서 획득한 재조합된 플라스미드 DNA를 다시 DH5α 대장균에 형질 전환시켜 DNA를 증폭시켰다. DH5α 대장균으로부터 상동 재조합된 플라스미드 DNA를 수득하고 HindⅢ 제한효소로 처리하여 각각의 재조합된 아데노바이러스 유전체들을 선별하였다.

재조합된 각각의 아데노바이러스 플라스미드를 PacI으로 절단한 뒤, HEK293 세포주에 형질전환하여 Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스를 생산하였다. 이들 아데노바이러스들은 HEK293 세포주에서 증식시켜 CsCl₂ 농도구배로 농축하여 순수 분리하고, 제한 적정 분석(limiting titration assay) 또는 분광 광도계로 바이러스의 역가(plaque forming unit; PFU)를 결정하였다.

저산소 조건 처리

HRE에 의해 저산소 조건에서 바이러스의 복제 능력이 증가되는지 관찰하기 위해, 본 연구에서 진행한 실험 과정 중 모든 암 세포주와 정상 세포주에 각각의 재조합 바이러스들을 처리하고 바로 저산소 조건을 처리해 주었다. 저산소 조건을 유도하기 위하여, 저산소 가스(1% O₂, 5% CO₂ 및 94% N₂)가 유입될 수 있는 유출입 관이 삽입되어 있는 밀폐된 37℃ 항온 배양기를 사용하였다.

TRAIL 단백질 발현 양상 규명

Ad-YKC11-TRAIL의 세포감염에 따른 TRAIL의 발현 정도를 측정하기 위하여 ELISA를 시행하였다. U87MG 세포주(8 x 10⁵)를 100 mm³ 디쉬에 분주한 다음, 0.5 MOI(multiplicity of infection)의 Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 또는 Ad-YKC11-TRAIL 을 각각 감염시키고 24시간 후에 배지를 수득하였다. 대조군으로 이용된 Ad-Rb7Δ19은 아데노바이러스의 지놈에서 E1A 부위에 있는 Rb 결합 부위를 구성하는 아미노산 서열중에서 45번째 Glu가 Gly으로 치환되고, 121-127번째 아미노산 서열인 7개 Gly이 결손되어 있고, E1B에서 E1B19가 결손된 아데노바이러스이다. 수득된 세포 배양액 또는 순차적으로 희석한 TRAIL 재조합 단백질을 TRAIL에 특이적으로 인지하는 항체로 코팅된 96-웰 플레이트(Biosource International, Inc. California, USA)에 각각 넣고, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. 그 다음 바이오틴이 부착된 항체(BD Biosciences, CA, USA)를 플레이트에 넣은 뒤 실온에서 1시 간 동안 반응시키고, 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-HRP) 용액(BD Biosciences, CA, USA)을 세척된 플레이트에 넣어 30분간 발색시킨 뒤 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)로 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 450 ㎚에서 각각 측정하였으며, 표준 용량곡선에 따라 배양액 중에 발현된 TRAIL의 양을 산출하였다.

아데노바이러스의 증식 및 세포 살상 능력 검증

암세포 및 정상 세포에 대한 아데노바이러스의 세포 살상 능력을 검증하기 위하여, 인간 뇌암 세포주(U87MG, U343, U251N)와 폐암 세포주(A549, Sk-LuⅠ), 간암 세포주(Hep1), 그리고 인간 정상 세포주인 섬유아세포주(BJ, IMR90) 등을 24-웰 플레이트에 각각 분주하고 24시간 후 각각의 재조합 아데노바이러스를 여러 역가의 MOI로 처리하였다. 감염시킨 바이러스들 중 한 바이러스가 가장 낮은 역가에서 감염세포를 거의 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거하고 0.5% 크리스탈 바이올렛(50% 메탄올) 용액으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색한 후 세포 살상 능력을 비교 분석하였다.

MTT 분석

복제가능 아데노바이러스 감염에 따른 세포 살상 능력을 정량화하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 2 mg/ml) 분석을 수행하였다. 암 세포주와 정상 세포주들을 24-웰 플레이트에 각각 70-80% 컨플루언시(confluency)로 분주하고 24시간 후 각각의 재조합 아데노바이러스를 다양한 MOI로 처리하였다. 바이러스 감염 후 일정 시간이 지나고 나서 세포의 생존율을 측정하기 위해 배지를 제거한 후 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 각 웰 당 250 ㎕을 넣고, 5% CO₂의 존재 하에 37℃ 항온 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 플레이트 웰에 1 ml의 디메틸 술포사이드(dimethyl sulphoxide: DMSO, Sigma, USA)를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시킨 후, DMSO로 용출된 상층액을 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 상대적 생존율을 측정하였다. 세포의 생존율은 측정된 흡광도 값을 이용하여 다음과 같은 방법으로 계산하였다. 생존율(%) = [(실험군의 평균 색소 흡수률-기준 색소 흡수률)/(대조군의 평균 색소 흡수률-기준 색소 흡수률)] x 100.

전자현미경을 통해 살펴본 세포 형태

인체 뇌암 세포주인 U87MG를 60 mm³ 접시에 80% 컨플루언시로 분주하고 각각의 바이러스들을 1 MOI로 감염시켰다. 36시간 후 모든 세포들을 획득하여 원심분리하고 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. 감염된 세포들을 0.1 M PBS(pH 7.4)로 조정한 카르노브스키(Karnovsky) 고정액(2% 글루타르알데히드, 2% 파라포름알데히드 및 0.5% 염화칼슘)에 6시간 이상 고정한 후, 0.1 M 카코딜산-염산(pH 7.4)에 용해시킨 1% OsO₄에 2시간 고정하였다. 표본을 에탄올로 탈수한 뒤 에폰(Epon)에 포매하고 절편을 만들어 전자현미경으로 관찰하였다.

튜널 ( TUNEL ) 분석방법을 이용한 세포고사 관찰

각 재조합 아데노바이러스의 암세포에 대한 세포고사(아폽토시스) 유도능력과 TRAIL을 발현하는 Ad-YKC11-TRAIL에 의한 세포고사 정도를 비교하기 위하여, U87MG 세포주(7 x 10⁴)와 U251N 세포주(2 x 10⁵)를 2-웰 챔버 슬라이드(chamber slide)에 분주하고 각각의 바이러스들을 1 MOI로 감염시켰다. 48시간 후 배지를 제거하고, ApopTag 키트(Intergen, Purchase, NY)를 이용해 제조회사가 제시한 방법에 따라 TUNEL 분석을 수행하였다. 양성 대조군으로는 CPT(Camptothecin-11)(Sigma, St.Louis, MO, USA)를 1 μM로 48시간 동안 처리된 세포를 사용하였다. 발색여부를 확인하기 위해 퍼옥시다아제가 결합된 아비딘을 사용하여 디아미노벤젠(diaminobenzine: DAB, DAKO, Carpinteria, CA)과 반응시킨 후 세포들이 갈색으로 변하는 것이 육안으로 확인되면 증류수로 3회 세척하였다. 세포질을 관찰하기 위해 0.5% 메틸그린으로 다시 10분간 염색하고 세척한 후 자일렌 용액에 슬라이드를 완전히 적시고 퍼마운트(Permount, SP15-500; Fisher scientific, Fair Lawn, NJ)로 마운팅하여 현미경으로 관찰하였다. 현미경 상에서 두 곳 이상의 부위를 무작위로 정하여 전체 세포들 중 염색된 세포의 비율을 산출하였다.

PI ( Propidium iodide ) 염색을 통한 세포고사 관찰

재조합 아데노바이러스와 TRAIL 발현에 의한 세포 고사 유도 정도를 비교하기 위해, U87MG 세포주(8 x 10⁵)를 100 mm³에 분주하고 24시간이 지난 후 아데노바이러스를 2 MOI로 감염시켰다. 양성 대조군으로 1 μM CPT와 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 48시간 후 감염된 세포들을 회수하여 PBS로 2회 세척하였다. 70% 에탄올로 4℃에서 24시간 이상 고정시킨 후 PI/RNASE 염색 완충액(BD Bioscience Pharmingen)에 500 ㎕ 넣고 4℃에서 15분간 반응시킨 뒤 유세포 분석을 시행하였다.

아데노바이러스의 생산량 비교

재조합 아데노바이러스들의 암세포내 바이러스 생산량을 비교하기 위해 6-웰 플레이트에 1 x 10⁵개의 U87MG 암세포주를 분주하고 24시간 후 각각의 아데노바이러스들을 1 MOI로 감염시켰다. 바이러스 감염 후 3일 째에 세포와 배지를 각각 회수하였다. 감염된 세포는 얼림과 녹임을 3회 반복하여 바이러스를 방출시켰으며, 전제 바이러스의 역가는 HEK293 세포주에서 제한 적정 분석을 수행하여 산출하였다.

아데노바이러스의 생체 내 항종양 효과 검증

생후 6-8주 정도 경과된 수컷 누드마우스(BALB/c-nu)(Shizuoka Laboratory Center Inc, 일본)를 사용하여 실험을 진행하였다. 누드마우스의 복벽에 1 x 10⁷ 개의 U87MG 세포주를 피하 주사하였다. 폴리카보네이트 케이지에 5-6마리씩 넣어 멸균된 수돗물과 사료(중앙실험동물, 한국)를 공급하고 가능한 스트레스를 받지 않도록 조용한 분위기의 무균실(pathogene free room)에서 사육하였다. 모든 동물실험은 연세대학교 의과대학의 동물사육 및 실험 관련 규칙을 준수하였다. 종양의 용적이 약 100-150 mm³ 정도 성장하였을 때, 제작한 재조합 아데노바이러스(5 x 10⁷ PFU/30㎕)를 이틀 간격으로 세 번 종양 내에 직접 투여한 후 2일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다. 음성 대조군은 PBS를 이용하였고, 바이러스 투여와 같은 방법으로 투여하였다. 종양의 용적은 캘리퍼(caliper)를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정하고, 다음과 같은 공식으로 산출하였다. 종양의 용적(mm³) = (단축 mm)² x 장축 mm x 0.523

종양 조직 내 아데노바이러스의 증식 및 세포고사 유도 검증

생후 6-8주 정도 경과된 누드마우스의 복벽에 1 x 10⁷개의 U87MG 세포주를 피하 주사한 후 종양의 크기가 약 100-150 mm³ 정도 되었을 때, 5 x 10⁷ PFU의 Ad-YKC11 또는 Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 3회 종양 내 투여하였다. 마지막 바이러스를 투여한 후 3일경에 종양을 적출하여 10% 포르말린용액에 고정시킨 뒤 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 잘라 슬라이드로 만든 뒤, 이를 자일렌(xylene), 100%, 90% 및 70% 에탄올 용액에 차례로 넣어 파라핀을 제거한 후 헤마토실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 아데노바이러스와 TRAIL의 발현에 의해 종양 내 일어난 세포고사 여부도 동일한 부위의 파라핀 블럭 슬라이드를 이용하여 관찰하였다. ApopTaq 키트(Intergen, Purchase, NY)를 이용해 제조회사가 제시한 방법에 따라 튜널 분석을 시행하였으며, 포옥시다아제와 결합된 아비딘을 사용하여 DAB와 반응시킨 후 세포들이 갈색으로 변하는 것이 육안으로 확인되면 0.5% 메틸 그린으로 10분간 염색하고 현미경으로 관찰하였다. 또한 복제 가능 아데노바이러스가 종양 조직 내에서 활발히 복제가 되는가를 검증하기 위해 아데노바이러스의 E1A 부위와 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 형광 면역 염색을 시행하였다. 파라핀이 제거된 종양 조직 슬라이드를 3% H₂O₂ 용액에서 10분간 반응시켜 내인성 과산화 효소의 작용을 차단시키고, 블록킹 용액으로 30분간 비특이적인 항체 반응이 일어나지 않도록 한 후, E1A의 일차항체(SANTA CRUZ BIOTHECHNOLOGY)와 반응시켰다. 이어, 형광 다이가 결합된 이차항체 Alexa Fluor^TM488(Invitrogen, USA)와 반응시킨 뒤 E1A의 발현 양상을 확인하였다.

실험 결과

mycTERT 프로머터 제작 및 이를 이용한 암세포 특이적 활성 규명

제작된 mycTERT의 암세포 특이적 활성능을 검증하기 위하여, 여러 종류의 암 세포주(A549, Hep1, U343, U251N)와 정상 세포주(BJ, CBHEL)들을 hTERT, mTERT(Eunhee Kim et al., Hum Gene Ther . 10;14(15):1415-28(2003)), 또는 mycTERT 프로머터에 의해 LacZ의 발현이 유도되는 복제 불능 아데노바이러스들인 dl-TERT-Z, dl-mTERT-Z, 또는 dl-mycTERT-Z 아데노바이러스로 감염시킨 뒤 이틀 뒤에 LacZ 유전자 발현양상을 평가하였다. dl-TERT-Z, dl-mTERT-Z, 또는 dl-mycTERT-Z는 결실된 E1 영역에 LacZ 유전자가 삽입되고, LacZ 유전자의 업스트림에 hTERT, mTERT 및 mycTERT 프로머터가 각각 삽입된 복제불능 재조합 아데노바이러스이다. 24-웰 플레이트(well plate)에 2 x 10⁵개의 암세포와 정상세포를 각각 분주한 뒤, 다음날 β-갈락토시다아제를 발현하는 dl-TERT-Z, dl-mTERT-Z 또는 dl-mycTERT-Z 아데노바이러스를 암 세포는 MOI 50으로, 정상 세포는 MOI 100으로 각각 감염시키고 이틀 뒤 X-gal 염색을 실시하였다. β-gal의 활성은 고정액(1% 포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드 in H₂O)에서 5분간 세포들을 고정시킨 뒤, 염색용액(0.4 mg/ml X-gal, 4 mM 포타슘 페리시아나이드, 4 mM 포타슘 페로시아나이드, 2 mM MgCl₂ in PBS)으로 37℃에서 4-16 시간동안 반응시켜 관찰하였다. 도 2a-2b에서 나타낸 바와 같이, 실험에 이용된 모든 암 세포주들에서는 dl-mycTERT-Z에 의해 감염된 경우 dl-TERT 또는 dl-mTERT-Z 아데노바이러스에 의해 감염된 경우에 비해 LacZ의 발현이 현저히 높게 나타난 반면, 정상 세포주들에서는 MOI 100의 높은 역가에서도 dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z 아데노바이러스와 마찬가지로 LacZ의 발현이 매우 낮게 나타났다. 이러한 결과에 의해, 본 연구에서 제작한 mycTERT 프로머터 의 활성이 암 세포주에서는 야생형 hTERT와 mTERT 프로모터에 비해 크게 높지만, 정상 세포주에서는 mycTERT 프로모터의 활성이 매우 낮게 유지되어 mycTERT 프로모터의 암세포 특이적 활성이 hTERT와 mTERT 프로모터에 비해 크게 개선된 것을 알 수 있다.

mycTERT 프로모터에 의해 증식이 조절되는 Ad - mycTERT -Δ19 복제 가능 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상능 검증

Ad-mycTERT-Δ19 복제 가능 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상능을 검증하기 위하여, 대조군 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B19와 음성대조군 바이러스인 dl-CMV-Z, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-mycTERT-Δ19 아데노바이러스를 각각 여러 농도의 역가로 감염시켜 세포살상 정도를 관찰하였다. 상기 Ad-ΔE1B19는 E1B19 영역이 결실된 복제가능 아데노바이러스, dl-CMV-Z는 CMV 프로모터가 연결된 LacZ 유전자가 아데노바이러스의 E1 영역에 삽입된 복제가능 아데노바이러스, Ad-mTERT-Δ19는 E1B19 영역이 결실되고 mTERT 프로모터가 E1A의 내재 프로모터 영역에 치환된 복제가능 아데노바이러스, Ad-mycTERT-Δ19는 E1B19 영역이 결실되고 mycTERT 프로모터가 E1A의 내재 프로모터 영역에 치환된 복제가능 아데노바이러스이다. 24-웰 플레이트에 2-5 x 10⁴개의 여러 종류의 암세포주(U343, U251N, SK-Hep1, H460, A549, C33A, HeLa)와 정상 세포주(CBHEL)를 각각 분주한 후 다음날 dl-CMV-Z, Ad-ΔE1B19, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-mycTERT-Δ19 아데노바이러스를 여 러 역가로 각각 감염시켰다. 낮은 역가의 바이러스로 투여한 Ad-ΔE1B19 아데노바이러스가 세포를 거의 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거하고 플레이트 바닥에 남아있는 세포들을 0.5% 크리스탈 바이올렛(50% 메탄올)으로 고정하고 염색한 후 분석하였다. 도 3a에서 볼 수 있듯이, 실험에 사용된 모든 암세포주들에서는 암세포 특이적 살상능이 우수하다고 보고된 Ad-mTERT-Δ19에 비해 Ad-mycTERT-Δ19의 살상능이 크게 개선된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 도 3b에 나타낸 바와 같이 정상 세포주인 CBHEL에서는 Ad-mycTERT-Δ19이 Ad-mTERT-Δ19와 같이 낮은 세포 살상을 나타내어 Ad-mycTERT-Δ19의 암세포에 대한 특이성(specificity)이 우수함을 확인하였다.

산소 부족 환경에서 인핸서 HRE 에 의한 바이러스 복제 조절, TRAIL 을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 제작 및 TRAIL 의 발현 양상 규명

암세포의 저산소 조건에서 복제능이 선택적으로 증가하는 아데노바이러스를 제작하기 위해, 아데노바이러스에 내재적으로 존재하는 E1A의 프로모터를 변형된 TERT 프로모터(mycTERT)로 치환 후 삽입하여 E1A의 발현이 조절되도록 하였고, mycTERT 프로모터의 업스트림에 산소 농도가 낮아지면 발현이 증가하는 HIF-1 전사조절인자가 부착할 수 있는 HRE 인핸서를 삽입하였다. 또한, 암세포의 살상 능력을 증가시키기 위하여 E3 부위에 세포고사를 유도하는 TRAIL을 삽입하였다(도 4a).

우선, 제작된 Ad-YKC11-TRAIL에 의한 TRAIL의 발현 정도를 알아보기 위하여, U87MG 뇌암 세포주에 아데노바이러스(Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL)를 0.5 MOI로 각각 처리하고, 24시간 후에 배지를 회수하여 ELISA를 수행하였다. Ad-YKC11-TRAIL에 감염된 세포의 경우 정상산소 조건에서 3824± 108 ㎍/ml, 저산소 조건에서 5712± 92 ㎍/ml로 TRAIL의 발현이 유도되었다(도 5). 이러한 큰 발현 차이를 나타내는 결과들로부터, TRAIL을 발현하는 아데노바이러스의 감염에 의해 TRAIL의 발현이 효율적으로 일어남을 확인 할 수 있으며, 특히 HRE 인핸서에 의해 저산소 조건에서 TRAIL의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있다.

산소 부족 환경에서의 인핸서 HRE 에 의한 바이러스 복제 조절 및 TRAIL 을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 세포 살상 효과 비교 검증

HRE를 포함하도록 제작된 복제 가능 아데노바이러스와 E3 부위에 TRAIL을 포함하는 복제 가능 아데노바이러스의 정상산소 조건과 저산소 조건에서 세포 살상 능력을 비교 검증하기 위하여, 여러 종류의 암 세포주에 각각의 바이러스를 감염시켜 세포 살상 정도를 관찰하였다. 정상산소 조건과 저산소 조건은 24시간을 주기로 반복하여 처리하였으며, 사용된 인체 암 세포주로는 뇌암 세포주(U87MG, U251N, U343)와 간암 세포주(SK-Hep1)이며, 각각의 세포주에 아데노바이러스를 0.5-50 MOI로 처리하였다(도 6).

정상산소 조건에서는 모든 암세포 주에서 대조군 종양 세포 살상 아데노바이러스인 Ad-Rb7Δ19와 Ad-YKC11간의 세포 살상 능력이 큰 차이를 보이지 않았고, TRAIL을 발현하는 Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스를 처리한 경우에는 TRAIL에 저항성을 갖는 U343 (Reference: J. Neurooncol. 86:265-272, 2008)을 제외하고는 TRAIL에 의한 세포 고사로 인해 가장 낮은 MOI에서도 세포 살상 효과를 나타내었다. 하지만, 저산소 조건하에서의 실험군에서는 HRE를 포함하고 있는 Ad-YKC11이 Ad-Rb7Δ19에 비해 약 2-5배 증가된 세포 살상 능력을 나타내는 것을 관찰할 수 있었으며, Ad-YKC11-TRAIL을 감염시킨 U251과 U343 세포주에서는 정상산소 조건에서 보다 저산소 조건에서 증가된 세포 살상 능력을 관찰할 수 있었다.

HRE와 TRAIL 발현에 따른 암세포 살상 능력 상승효과를 보다 면밀하게 정량화하기 위해서 다양한 MOI로 아데노바이러스를 처리한 후 한 시점에서 살아있는 세포의 생존율을 측정할 수 있는 MTT 분석을 시행하였다. 각각의 바이러스 감염에 따른 세포 생존율은 실험에 사용한 세포주에서 바이러스를 처리하지 않은 경우의 세포 생존율을 100%로 환산하여 상대 비교하였다. 그 결과 본 실험에 이용된 모든 암 세포주들에서 세포 살상 효과 실험에서와 유사하게 정상산소 조건에서 보다 저산소 조건에서 Ad-Rb7Δ19에 비해 Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL를 처리한 실험군에서 세포 살상 능력이 크게 증가하였으며, 특히 U87MG의 경우에는 0.05 MOI에서 TRAIL에 의한 세포 살상 능력이 Ad-Rb7Δ19보다 4배, Ad-YKC11에 비해서는 3배로 각각 증가되는 것으로 나타났다(도 7a). 또한 정상산소 조건에서의 정상 세포주에서는 종양 세포 선택성이 약한 Ad-Rb7Δ19가 Ad-YKC11 보다 높은 종양 세포 살상 능력을 보이다가 저산소 조건하에서는 Ad-YKC11 바이러스의 세포 살상 능력이 Ad-Rb7Δ19에 비해 증가하는 양상을 보였으며, 이러한 결과를 통하여 HRE의 효과를 다시 검증할 수 있었다(도 7b).

재조합 아데노바이러스에 감염된 암세포의 전자 현미경적 소견

아데노바이러스와 TRAIL에 의한 세포사를 보다 면밀하게 관찰하기 위하여, Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL 바이러스 1 MOI로 감염된 U87MG 세포주를 전자현미경으로 관찰하였다(도 8). 바이러스에 감염되지 않은 U87MG의 핵, 세포막 및 세포내 다른 소기관들은 정상적인 모양을 갖추고 있었고, Ad-Rb7Δ19와 Ad-YKC11로 감염된 세포는 바이러스의 감염으로 정상 세포에 비해 핵이 비대해졌으며, 바이러스의 복제가 활발하게 이루어져 핵과 세포질 내에 고루 퍼져 있었지만 핵막과 세포막은 온전한 것을 관찰할 수 있었다. 이와는 대조적으로 세포고사를 유도하는 Ad-YKC11-TRAIL로 감염된 세포에서는 염색체의 형태를 알아볼 수가 없고, 세포막이 심하게 찢겨져 있는 모습이 관찰되어지는 것으로 보아 TRAIL에 의해 빠른 세포 분해가 일어나는 것을 관찰할 수 있었다.

재조합 아데노바이러스들의 세포 사멸 정도 비교와 검증

HRE와 변형된 TERT 프로모터(mycTERT)에 의해 E1A의 유전자 발현이 조절되며, TRAIL을 발현하는 아데노바이러스가 정상산소 조건과 저산소 조건에서 세포고사를 유도하는 정도를 비교하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.

1. 튜널 분석을 이용한 세포 사멸 검증

정상산소 조건과 비교하여 저산소 조건에서 HRE에 의한 바이러스 복제 증가와 TRAIL에 의한 세포 고사 유도 능력을 통해 세포 고사 진행이 상승적으로 증가하 는지를 검증하기 위하여, 초기 세포내고사의 특징인 DNA 절편화를 확인할 수 있는 튜널 분석을 시행하였다. U87MG 세포주(표 1a)와 U251N 세포주(표 1b)에 1 MOI로 각각의 아데노바이러스를 처리하고 48시간 후 실험을 진행하였다. 정상산소 조건과 비교하여 저산소 조건하에서 U87MG에 Ad-Rb7Δ19를 처리한 경우 세포 고사율이 감소한 반면에 HRE를 포함하고 있는 Ad-YKC11과 Ad-YKC11-TRAIL을 저산소 조건하에서 처리한 경우에는 세포 고사율이 27.93%와 29.93%씩 각각 증가함을 관찰할 수 있었다. U251N에서도 마찬가지로 저산소 조건(표 1b)하에서는, 양성 대조군으로 사용한 CPT와 Ad-Rb7Δ19를 처리한 경우에 각각의 세포 고사율이 정상산소 조건에서 비하여 25.36%, 23.10% 각각 감소하는 반면에, Ad-YKC11-TRAIL을 처리한 경우에는 정상산소 조건에 비해 세포 고사율이 감소되지 않고 약 3.03% 증가함을 관찰할 수 있었다.

이들 결과들을 토대로, 산소 부족으로 인한 세포주기 억제로 인하여 바이러스의 복제능이 감소되지만, 저산소 조건에서 오히려 활성을 가지는 HRE 인핸서를 포함하고 있는 바이러스의 경우에는 산소 부족 환경에서도 바이러스의 복제능이 감소되지 않거나 오히려 증가함으로써 세포 살상효과를 상승적으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

U87MG 세포의 아폽토시스 유발 결과

아폽토시스 세포비율(%)	PBS	1μM CPT	Ad-Rb7Δ19	Ad-YKC11	Ad-YKC11-TRAIL
정상산소조건	2.72± 0.32	60.93± 6.44	47.18± 3.92	39.47± 2.69	53.23± 2.82
저산소조건	5.17± 1.09	33.36± 8.85	25.75± 3.95	67.40± 5.433	83.16± 13.20

U251N 세포의 아폽토시스 유발 결과

아폽토시스 세포비율(%)	PBS	1μM CPT	Ad-Rb7Δ19	Ad-YKC11	Ad-YKC11-TRAIL
정상산소조건	0± 0	91.66± 8.33	52.89± 3.51	62.36± 6.73	87.71± 6.88
저산소조건	4.05± 2.16	66.30± 4.30	29.79± 13.64	64.34± 4.02	90.74± 4.89

표 1은 세포주에 PBS(음성 대조군), CPT(양성 대조군),Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL로 감염시킨 후 아폽토시스된 세포의 백분율을 나타낸 값이다.

2. PI 염색과 유세포 분석을 통한 세포 사멸 검증

세포고사의 또 다른 일반적 특징은 DNA가 무작위적으로 절편화되어 나타나는 subG1 세포군의 비율이 증가하는 현상이다. 일반적인 세포배양 조건에서는 G1, S, 그리고 G2/M기에 해당되는 세포군들이 일정한 비율로 유지되지만, 세포고사가 진행 중인 세포들은 염색체들이 작은 절편으로 나뉘어져 subG1 피크(peak)가 증가된다. TRAIL에 의한 세포 고사율 증가를 관찰하기 위해 U87MG 세포주에 Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL을 2 MOI로 처리하고 48시간 후에 회수하여 PI 염색을 통해 FACS를 이용하여 subG1 세포군의 증가를 관찰하였다. 정상산소 조건에서는 Ad-Rb7Δ19와 Ad-YKC11를 처리한 경우의 subG1 세포군이 각각 30.26%와 19.85%로, Ad-Rb7Δ19가 Ad-YKC11보다 약 10% 더 높은 subG1 세포군의 비율을 나타내었지만(도 9의 패널 A), 저산소 조건에서는 바이러스의 복제 감소로 인하여 정상산소 조건에 비해 Ad-Rb7Δ19에 의한 세포 고사는 23.05%로 감소되고 Ad-YKC11은 44.68%로 증가되었다(도 9의 패널 B). 그 결과 subG1 세포군의 비율이 Ad-Rb7Δ19에 비해 Ad-YKC11에 의한 세포 고사가 약 21% 증가한 것으로 관찰되었다. 또한 Ad-YKC11-TRAIL을 처리한 실험군에서는 TRAIL에 의한 강한 세포 고사로 인해 정상산소 조건이나 저산소 조건 모두에서 66.01% 및 77.12%로, 다른 실험군에 비해 높은 subG1 세포군의 비율을 나타내었고, 특히 저산소 조건에서는 정상산소 조건에 비해 약 11% 더 증가한 subG1 세포군의 비율을 나타낸 결과를 통하여 HRE와 TRAIL에 의해 강한 세포 고사가 유도되면서 빠르게 암세포를 살상할 수 있음을 알 수 있었다(표 2).

SubG1(%)	PBS	1μM CPT	Ad-Rb7Δ19	Ad-YKC11	Ad-YKC11-TRAIL
정상산소조건	14.7	77.71	30.26	19.85	66.01
저산소조건	10.63	64.90	23.5	44.68	77.12

표 2는 세포주에 PBS(음성 대조군), CPT(양성 대조군),Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL로 감염시킨 후 PI 염색 및 FACS 분석에 의해 결정된 subG1 세포를 백분율로 나타낸 값이다.

정상산소 조건과 저산소 조건 처리를 통한 재조합 아데노바이러스의 생산량 비교

저산소 조건에서 HRE에 의한 영향으로 Ad-YKC11과 Ad-YKC11-TRAIL의 바이러스 생산량이 증가하는지를 정량적으로 관찰하기 위해 바이러스 생산 실험을 진행하였다. U87MG 세포주를 Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL로 각각 감염시키고 72시간 후에 감염된 세포와 배양액을 각각 회수하여 바이러스의 역가를 산출하였다. 그 결과 저산소 조건을 처리하였을 때, Ad-Rb7Δ19에서는 바이러스의 생산량이 1.16 x 10⁹ PFU(정상산소 조건)에서 8.71 x 10⁸ PFUU(저산소 조건)로 감소된 반면에, HRE를 포함하고 있는 Ad-YKC11에서는 2.29 x 10⁸ PFU(정상산소 조건)에서 9.71 x 10⁸ PFU, Ad-YKC11-TRAIL에서는 2.34 x 10⁷ PFU(정상산소 조건)에서 8.98 x 10⁷ PFU(저산소 조건)로 각각 바이러스의 생산량이 증가된 것을 관찰할 수 있었다(도 10). 전체적인 바이러스 생산량이 Ad-Rb7Δ19가 가장 높게 나타난 것은 아데노바이러스에 내재되어 있는 프로모터가 변형된 mycTERT 프로모터에 비해 강한 활성을 가지고 있어서 이러한 결과를 보인 것으로 여겨지나 내재된 E1A의 프로모터는 선택성이 없다는 큰 단점을 가지고 있기 때문에 장기적으로 봤을 때는 mycTERT 프로모터를 사용하는 것이 유리하다고 판단되었다.

HRE 를 포함하고 TRAIL 을 발현하는 재조합 아데노바이러스들의 생체 내 항종양 효과 및 비교 검증

본 연구에서 제작한 각각의 재조합 아데노바이러스의 생체 내 항 종양 효과를 검증하기 위하여, 인체 뇌암 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스의 복부 피하에 주사하고, 형성된 종양의 용적이 약 100-150 mm³ 정도 되었을 때 5 x 10⁷ PFU의 Ad-Rb7Δ19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL을 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3번 종양 내에 투여한 후 종양의 성장을 관찰하였다(도 11a).

PBS를 투여한 대조군에서는 투여 후 21일경에 2022 ± 186 mm³ 으로 종양이 급속도로 증가한 반면에, Ad-YKC11 또는Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 마우스의 경우는 바이러스 투여 후 21일 경에 종양의 크기가 각각 927 ± 240 mm³, 385 ± 167 mm³ 로 음성 대조군인 PBS를 투여한 경우에 비해 종양의 성장이 크게 지연되었다. 특히, TRAIL을 발현하는 Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 마우스의 경우는 바이러스를 투여한 7마리 중 2마리에서 종양이 완전히 제거된 것을 관찰하였고, 이후 20일이 지나도 종양의 재성장은 관찰되지 않았다. 또한, Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 마우스의 생존율도 대조군 바이러스인 Ad-YKC11을 투여한 마우스에 비해 크게 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 11b). 이러한 결과에 의해, 생체 내 종양 모델에서도 Ad-YKC11-TRAIL의 우수한 항종양 효과를 확인 할 수 있었다.

TRAIL 을 발현하는 재조합 아데노바이러스 투여에 따른 종양조직의 변화 관찰

앞서 실험을 통해 검증되었듯이 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스의 TRAIL의 발현에 의한 개선된 항종양 효과가 실제로 종양 내 아데노바이러스의 복제와 TRAIL에 의한 세포고사에 의한 것인지를 확인하기 위하여 H & E 염색을 통해 조직의 상태를 관찰하였으며 튜널 분석을 통하여 세포고사를 검증하였다. 또한 조직 내에서 아데노바이러스의 복제를 관찰하기 위해 E1A 단백질의 발현을 조직 면역염색을 시행하여 검증하였다(도 12).

인체 뇌 종양세포주인 U87MG를 누드마우스 복벽 피하에 접종한 후 형성된 종양에 복제 가능 바이러스인 Ad-YKC11 또는 Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 3회 종양 내 주사한 후 3일 뒤에 종양 조직을 적출하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색을 시행하여 조직의 상태를 검증하였다. 그 결과, Ad-YKC11을 투여한 종양의 경우에는 조직의 국소적 부위에서만 세포괴사가 진행된 반면, Ad-YKC11-TRAIL를 투여한 종양에서는 조직 전체에서 세포괴사가 활발히 진행된 것을 관찰할 수 있었다(도 12의 패널 A).

이러한 종양 내 변화가 실제로 TRAIL의 발현에 의한 세포고사인지 확인하기 위해 동일한 블록의 슬라이드를 사용하여 튜널 분석을 시행하였다. 그 결과, 음성 대조군인 PBS를 처리한 종양 조직 내부에는 세포고사를 거의 확인할 수 없었지만 Ad-YKC11 또는 Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 종양 내부에서는 세포가 갈색으로 염색되는 것으로 보아 세포 고사가 일어남을 확인할 수 있었다. 그 중에서 Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 종양에서는 조직 전체가 갈색으로 염색될 만큼 높은 빈도로 세포고사가 활발히 유도됨을 관찰할 수 있었다(도 12의 패널 B).

또한, 종양 조직 내 아데노바이러스의 복제 양상을 검증하기 위하여, 아데노바이러스의 E1A 부위와 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 형광 면역 염색을 시행하였다. 복제 가능 아데노바이러스 Ad-YKC11과 Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 종양의 경우에는 E1A가 검출됨을 통해 아데노바이러스가 종양내부에서 복제함을 확인할 수 있었으며, 특히, Ad-YKC11을 처리한 종양 조직에서 보다 Ad-YKC11-TRAIL를 처리한 종양 조직에서 더 많이 검출되었다. (도 12의 패널 C).

고찰

암세포의 급속한 성장으로 인해 산소 소비가 증가함에 따라 암세포의 주변 환경은 산소 부족현상(산소분압 0-20 mmHg)이라는 비정상적인 생리학적 상황에 처하게 된다. 산소 부족현상은 암세포의 악성 형질 변환을 유도하고, Bcl-2와 자멸 억제자(Inhibitor of Apoptosis: IAP)와 같은 항 세포고사 유도물질의 발현을 증가시키고, 암 치료에 있어서 방사선 치료요법과 항암 화학요법에 대해 내성을 제공 하였다^{1 -2,10}. 따라서 암 치료를 위한 방법으로 현재 바이러스를 이용한 치료법들이 많이 개발되고 있고, 대표적으로 증식 가능 아데노바이러스가 새로운 암 유전자 치료법으로 대두된 이후 현재 이를 이용한 임상 시험들이 활발히 진행되고 있다^{3 -7}. 그러나 암세포의 산소 부족 현상으로 HIF-1α와 p21^cip1의 발현이 증가하고 활성화를 나타내어 세포 주기가 억제되고, 이에 따라 자신의 모든 생활사를 숙주세포에 의존적으로 살아가는 바이러스의 증식 또한 억제되는 것이 지속적인 암 치료에 대한 한계로 나타나고 있다⁸. 이러한 한계점을 극복하기 위한 방안으로 본 연구에서는 산소 부족 현상에서 오히려 바이러스의 복제가 증가하도록 유도되는 바이러스를 제작하여 정상산소 조건과 저산소 조건의 비교를 통해 저산소 조건에서 바이러스의 세포 살상 능력의 증가를 분석하였다. 또한 암세포의 세포 살상 능력을 증가시키기 위한 방법으로 정상 세포와 암세포에 대한 선택성을 가지고 암세포에 강한 세포 고사를 유도하는 물질인 TRAIL을 사용하였다¹¹.

산소 부족에 의해 조절되는 유전자들 중에 암세포 조직 발달을 위해 필요한 신생혈관 생성에 관여하는 VEGF의 인핸서 부분인 HRE를 암세포에 대한 선택성을 증가시키기 위해 변형된 mycTERT 프로모터와 연결시키고 이로 인해 아데노바이러스의 복제에 필요한 E1A 유전자의 발현이 조절되며 E3 지역에 세포고사 유도 물질인 TRAIL을 포함하는 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스를 제작하였다⁹. 이렇게 제작된 아데노바이러스를 인체 뇌암 세포주인 U87MG에 감염시켜 TRAIL의 발현을 관찰한 결과 정상산소 조건과 저산소 조건 모두에서 TRAIL의 발현이 강하게 유도됨을 확인할 수 있었다. 다양한 인체 암 세포주를 제작한 바이러스로 감염시킨 후 정상산소 조건과 저산소 조건을 처리하여 세포 살상 능력 증가 정도를 비교 검증한 결과, 실험에 사용한 모든 암 세포주에서 정상산소 조건에서는 Ad-Rb7Δ19와 Ad-YKC11에서 비슷한 세포 살상 능력을 나타내었으나, 저산소 조건에서는 HRE를 포함하고 있는 Ad-YKC11에서 증가된 세포 살상 능력을 보여주었다. 또한 암세포에 처리한 모든 바이러스 중에서 저산소 조건에서 Ad-YKC11-TRAIL에서 가장 높은 세포 살상 능력을 보여 주었다. 또한, 저산소 조건에서 아데노바이러스와 TRAIL에 의한 세포 고사가 증가됨을 튜널 분석과 DNA 절편화로 인한 SubG1 세포군의 증가를 관찰하는 실험을 통하여 확인하였다. 전자 현미경을 이용한 세포형태 관찰에서는 Ad-YKC11-TRAIL에 감염된 세포들이 TRAIL에 의한 강한 세포고사 유도에 의해 Ad-Rb7Δ19와 Ad-YKC11에 감염된 경우보다 훨씬 빠른 속도로 세포 분해가 일어남을 확인할 수 있었다.

저산소 조건에서 바이러스로 인한 세포 살상 능력이 증가되는 것이 실제 HRE에 의해 바이러스의 생산량이 증가됨에 따라 나타나는 현상인지 알아보기 위해 바이러스 생산량을 정량적으로 알아볼 수 있는 바이러스 생산량 실험을 시행하였다. 그 결과, 저산소 조건에서 Ad-Rb7Δ19는 바이러스의 생산량이 정상산소 조건에 비해 감소되는 반면에, HRE를 인핸서로 포함하고 있는 Ad-YKC11과 Ad-YKC11-TRAIL에서는 저산소 조건에서의 바이러스 생산량이 정상산소 조건에 비해 증가되는 것을 관찰할 수 있었고, TRAIL에 의해서 빠른 세포 고사가 유도됨으로 인하여 Ad-YKC11-TRAIL의 바이러스의 총 생산량은 Ad-YKC11보다 다소 감소됨을 관찰할 수 있었다.

Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스들의 생체 내 항종양 효과를 비교 검증해 본 결과, 생체 내 종양세포 안으로Ad-YKC11-TRAIL를 효율적이고 지속적인 전달로 인해 TRAIL에 의한 강한 종양세포 고사 유도 및 고사능 효과를 나타내었으며, U87MG 이종이식 모델(xenograft model)에서도 우수한 종양 성장 억제 효과를 확인할 수 있었다. 또한 생체 내 마우스 생존율 검증 실험에서도 Ad-YKC11-TRAIL을 처리하였을 때 Ad-YKC11을 처리한 경우에 비해 생존율이 크게 증가한 것을 관찰할 수 있었다. Ad-YKC11-TRAIL에 의한 개선된 종양 세포 선택적 복제 능력과 살상 능력은 H&E 조직 염색 및 E1A 단백질 조직면역 염색에서도 같은 결과로 확인 되었으며, 또한 튜널 분석에서도 높은 빈도로 세포고사를 나타내는 결과를 통해 우수한 항종양 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.

결론적으로, 본 연구에서 제작한 HRE를 포함하며 TRAIL을 발현하는 아데노바이러스인 Ad-YKC11-TRAIL은 HRE에 의해 저산소 조건에서도 바이러스 생산량이 정상산소 조건에 비해 억제되지 않고 오히려 증가하고, TRAIL이 종양 세포에서 고 발현됨에 따라 더욱 증대된 선택적 항종양 효과가 유도되는 것으로 사료된다.

결론

본 연구에서는 암세포의 산소부족 현상에서도 바이러스의 복제가 억제되지 않도록 고안하여 제작한 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-YKC11에 TRAIL을 삽입함으로써 저산소 조건에서도 바이러스의 복제능이 증가하여 결과적으로 증가된 암세포 살상 능력을 관찰할 수 있었고, 또한 삽입된 TRAIL에 의해 활발한 세포 고사가 유도됨으로 인하여 더욱 증대된 항종양 효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 제작되어진 Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스를 통해 바이러스를 이용한 암 유전자 치료의 제한점을 극복함으로써 암세포에 대한 살상 능력의 증가로 더욱 효율적인 암 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 mycTERT 뉴클레오타이드 서열이다.

도 2a-2b는 제작된 mycTERT의 암세포 특이적 활성능을 검증하기 위하여, 여러 종류의 암 세포주(A549, Hep1, U343, U251N)와 정상 세포주(BJ, CBHEL)들을 hTERT, mTERT, 또는 mycTERT 프로머터에 의해 LacZ의 발현이 유도되는 복제 불능 아데노바이러스들인 dl-TERT-Z, dl-mTERT-Z 및 dl-mycTERT-Z 아데노바이러스로 감염시킨 뒤 이틀 뒤에 LacZ 유전자 발현양상을 나타낸 이미지이다. (a) 암 세포주, (b) 정상 세포주,

도 3a-3b은 Ad-mycTERT-Δ19 복제 가능 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상능을 검증하기 위하여, 대조군 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B19와 음성대조군 바이러스인 dl-CMV-Z, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-mycTERT-Δ19 아데노바이러스를 각각 여러 농도의 역가로 감염시켜 세포살상 정도를 관찰. (a) 암 세포주, (b) 정상 세포주

도 4a-4l은 본 발명인 선택적 복제 가능 아데노바이러스 벡터의 모식도이다. Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스는 6개의 HRE 및 mycTERT 프로모터와 E1B의 19 kDa가 결손된 상태에서 발현되며, Ad-YKC11-TRAIL 아데노바이러스는 YKC11 아데노바이러스의 E3 부분에 TRAIL 유전자가 있는 것을 나타낸다(★부분은 E1A가 변형된 것으로서, ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 Gly으로 치환된 변이된 서열을 나타낸다. ΔE1B19 와 ΔE1B55는 E1B의 19 kDa 과 55 kDa이 각각 결실된 것을 나타내고, ΔE1B19/55는 E1B의 19 kDa 과 55 kDa이 모두 결실된 것을 나타낸다.).

도 5는 본 발명인 재조합 아데노바이러스에 감염된 U87MG 세포주가 분비한 TRAIL의 양을 나타낸 결과이다. U87MG 인체 뇌암 세포주에 PBS(1번), Ad-Rb7△19(2번), Ad-YKC11(3번) 또는 Ad-YKC11-TRAIL(4번) 아데노바이러스를 0.5 MOI로 투여하였다. TRAIL의 농도는 세포 감염 후 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 회수하여 ELISA로 측정하였다. TRAIL은 정상 조건 및 저산소 조건에서 다른 바이러스와 비교하여 TRAIL 유전자를 삽입한 바이러스인 Ad-YKC11-TRAIL에서 높게 발현되었다.

도 6은 생체외 정상산소 및 저산소 조건에서 선택적 복제 가능 아데노바이러스의 세포 살상능을 나타낸 이미지이다. 여러 종류의 암 세포주들과 아데노바이러스들을 상기 표시대로 24-웰 플레이트에 함께 투여하였으며 야생 타입 아데노바이러스 Ad-XC를 대조군으로 설정하였다. 다양한 아데노바이러스로 감염된 세포가 플레이트에 완전히 고정 되었을 때 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

도 7a-7b는 Ad-YKC11 및 TRAIL을 발현하는 Ad-YKC11-TRAIL의 향상된 종양세포 살상능 효과를 나타낸 결과이다. 정상 조건 및 저산소 조건에서 Ad-XC(X), Ad-Rb7△19(▲), Ad-YKC11(■) 및 Ad-YKC11-TRAIL(◆)를 종양 세포주에 0.05-100 MOI로 처리한 후 MTT 분석을 하였다. 수치는 아데노바이러스에 감염되지 않은 대조군에 대한 백분율로 표현하였으며 SD 값으로 나타내었다. (a) 암 세포주, (b) 정상 세포주

도 8는 Ad-Rb7△19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL에 각각 감염된 것과 감염 안된 U87MG 세포주의 36시간이 되는 시점에서 촬영한 전자현미경 이미지이다. 세포주를 상기 재료 및 방법으로 1 MOI로 감염시켰으며, 각각의 이미지는 A. PBS, B.Ad-Rb7△19, C.Ad-YKC11 및 D.Ad-YKC11-TRAIL를 나타낸 것이다. 위 이미지는 5000배율이고, 아래는 20000배율이다.

도 9은 TRAIL의 아폽토시스를 유도한 결과이고, U87MG 세포주에 CPT, Ad-Rb7△19, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL을 각각 2 MOI로 처리하였다. 감염 후 48시간이 되는 시점에서 세포주를 수거하고 PI 염색 후 형광-활성 세포 분류기로 분석하였으며 각 패널안의 수치는 sub G1기의 세포를 백분율로 나타낸 것이다.

도 10은 U87MG 세포주에 Ad-Rb7△19, Ad-YKC11 또는 Ad-YKC11-TRAIL를 1 MOI로 투여한 후 바이러스 양에 대한 결과이다. 바이러스는 감염 후 72시간이 지나서 세포와 배양액에서 회수되었고, 바이러스 역가는 HEK293 세포주에서 제한 적정 분석 방법 (limiting titration assay)을 이용하여 산출하였다.

도 11a-11b는 TRAIL을 발현하는 아데노바이러스에 의한 종양 억제를 나타낸 결과이다. 누드 마우스 복부 피하에 인체 뇌암 세포주인 U87MG를 1 x 10⁷의 농도로 주입하였다. 종양 형성 후 매 2일마다 Ad-YKC11, Ad-YKC11-TRAIL 및 음성 대조군인 PBS를 마우스 복부 종양 부위에 투여하였다. 화살표로 표시한 시간에 5 x 10⁷ PFU/30 ㎕ 농도로 각각의 바이러스를 세포주에 감염시켰으며, TRAIL을 발현하는 아데노바이러스인 Ad-YKC11-TRAIL는 Ad-YKC11와 비교하여 더 큰 항종양 효과를 나 타내었다. 종양의 성장은 2일 단위로 종양의 단축(w) 및 장축(L)을 측정하여 조사하였고, 종양의 용적은 다음과 같은 공식으로 구할 수 있다. 용적=0.523 x Lw²

도 12은 PBS, Ad-YKC11, 또는 Ad-YKC11-TRAIL로 투여한 U87MG 세포주 이종 이식에 대한 면역조직화학에 대한 결과이다. 조직학 분석을 하기위하여 아데노바이러스를 1,3 및 5일 간격으로 주입하고 종양 세포들을 회수하였다. (a) PBS, Ad-YKC11 및 Ad-YKC11-TRAIL 투여한 후 종양 세포를 H＆E 염색하였으며, Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 종양 조직 전체에서 세포 괴사가 관찰되었고, (b) Ad-YKC11-TRAIL을 투여한 종양 조직에서 Ad-YKC11를 투여한 것보다 절단된 DNA 및 아폽토시스된 세포 핵이 더 많이 관찰되었으며(튜널 분석), (c) E1A는 제한적으로 나타나는 Ad-YKC11를 처리한 것보다 Ad-YKC11-TRAIL를 처리한 조직에서 더 많이 검출되었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Toolgene,Inc <120> Gene Delivery Systems Exhibiting Enhanced Tumor-Specific Expression <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttgtcga g 41 <210> 2 <211> 847 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60 atctttacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120 gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180 gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc 240 aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt 300 tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag 360 agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac 420 tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg 480 cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg 540 ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca 600 aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 660 ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat 720 tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta 780 acaaatgagc acttaataga catggaccat gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt 840 ggctaag 847 <210> 3 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly *** Xaa 275 280 <210> 4 <211> 409 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctccgctggg gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg 60 ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggcaggccgg 120 gctcccagtg gattcgcggg cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga 180 ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga 240 ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc 300 ccctcccctt cctttccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct 360 gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac ccccgcgtg 409 <210> 5 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 5 ctgcaccctg ggagcgcgag cggcgcgcgg gcggggaagc gcggcccaga cccccgggtc 60 cgccggagca gctgcgctgt cggggccagg ccgggctccc agtggattcg cgggcacaga 120 cgccaggacc gcgcttccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc 180 cttcaccttc cagctccgcc tcctccgcgc ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg 240 tccccggccc agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc 300 cct 303 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 6 cacgtggtac cacgtggtac cacgtggtac cacgtggtac cacgtg 46 <210> 7 <211> 772 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 7 ctccgctggg gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg 60 ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggcaggccgg 120 gctcccagtg gattcgcggg cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga 180 ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga 240 ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc 300 ccctcccctt cctttccgcg gccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct 360 gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccac ccccgcgtga agcttgcatg 420 cctgcaggtc gactctagag gatctactag tcatatggat gagctcgagc tgcaccctgg 480 gagcgcgagc ggcgcgcggg cggggaagcg cggcccagac ccccgggtcc gccggagcag 540 ctgcgctgtc ggggccaggc cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gccaggaccg 600 cgcttcccac gtggcggagg gactggggac ccgggcaccc gtcctgcccc ttcaccttcc 660 agctccgcct cctccgcgcg gaccccgccc cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca 720 gccccctccg ggccctccca gcccctcccc ttcctttccg cggccccgcc ct 772 <210> 8 <211> 839 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 8 cacgtggtac cacgtggtac cacgtggtac cacgtggtac cacgtggtac cagctggtct 60 gggatctctc cgctggggcc ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg 120 cgggcgggga agcgcggccc agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc 180 aggccgggct cccagtggat tcgcgggcac agacgcccag gaccgcgctt cccacgtggc 240 ggagggactg gggacccggg cacccgtcct gccccttcac cttccagctc cgcctcctcc 300 gcgcggaccc cgccccgtcc cgacccctcc cgggtccccg gcccagcccc ctccgggccc 360 tcccagcccc tccccttcct ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg 420 cagcgctgcg tcctgctgcg cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc cgcgtgaagc 480 ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ctactagtca tatggatgag ctcgagctgc 540 accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc 600 ggagcagctg cgctgtcggg gccaggccgg gctcccagtg gattcgcggg cacagacgcc 660 aggaccgcgc ttcccacgtg gcggagggac tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc 720 accttccagc tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt cccgacccct cccgggtccc 780 cggcccagcc ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc ctttccgcgg ccccgccct 839 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cacgtg 6 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ttccagctcc gcctcctccg c 21 <210> 11 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cgcccc 6 <210> 12 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cccagcccc 9 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cccagcccct ccc 13 <210> 14 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ccgccc 6 <210> 15 <211> 246 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttgtcga gccacagtgc atacgtgggc 60 tccaacaggt cctcttgtcg agccacagtg catacgtggg ctccaacagg tcctcttgtc 120 gagccacagt gcatacgtgg gctccaacag gtcctcttgt cgagccacag tgcatacgtg 180 ggctccaaca ggtcctcttg tcgagccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt 240 gtcgag 246

Claims (22)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 다음을 포함하는 암세포 특이적 살사능이 개선된 재조합 아데노바이러스:

   (a) 아데노바이러스의 ITR(inverted terminal repeat) 서열;

   (b) 다음을 포함하는 유전자발현 조절서열: (ⅰ) HRE(hypoxia-responsive element: HRE) 인핸서 서열; 및 (ⅱ) 상기 HRE 서열의 다운스트림에 위치한 hTERT(human telomere reverse transcriptase) 프로모터; 그리고,

   (c) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 유전자 서열.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 HRE 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 2-10번 반복된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 hTERT 프로모터는 변형 hTERT 프로모터이며, 상기 변형 hTERT 프로모터는 서열목록 제4서열에 기재된 천연형(natural-occurring) hTERT 프로모터에 추가적인 c-Myc 결합위치, Sp1 결합위치 또는 c-Myc 결합위치와 Sp1 결합위치를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 hTERT 프로모터는 변형 hTERT 프로모터이며, 상기 변형 hTERT 프로모터는 서열목록 제4서열의 천연형 hTERT 프로모터에 (i) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열, (ⅱ) 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 (ⅲ) 상기 ⅰ)과 ⅱ)의 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
10. 제 6 항에 있어서, 상기 hTERT 프로모터는 변형 hTERT 프로모터이며, 상기 변형 hTERT 프로모터는 서열목록 제7서열 또는 제8서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 변형 hTERT 프로모터는 서열목록 제8서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
12. 제 6 항에 있어서, 상기 유전자발현 조절서열은 E1A 유전자의 업스트림에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
13. 제 6 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자 영역이 결실된 것이고, 상기 유전자발현 조절서열은 결실된 E3 유전자 영역에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
14. 제 6 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
15. 제 6 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 유전자발현 조절서열은 활성의 E1A 유전자의 업스트림에 위치해 있으며, E1A 유전자의 발현은 상기 유전자발현 조절서열에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
17. 제 15 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 Gly으로 치환된 변이를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
18. 제 6 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 치료학적 트랜스 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자는 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)-코딩 뉴클레오타이드 서열인 것을 특 징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
20. 제 18 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자 영역이 결실된 것이고, 상기 치료학적 트랜스 유전자는 결실된 E3 유전자 영역에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
21. 삭제
22. (a) 상기 제 6 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.

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