KR100993881B1 - 유전자 전달체의 유전자 전달효율 개선 및 바이러스 보존용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비양성자성 극성 용매를 유효성분으로 포함하는 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율 개선용 조성물, 그리고 (a) 유전자 전달체; 및 (b) 비양성자성 극성 용매를 포함하는 유전자 전달용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 비양성자성 극성 용매를 사용함으로써 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율을 크게 개선한다. 통상적으로 당업계에서는 유전자를 세포 내로 도입시키기 위하여 리포펙타민을 많이 사용하고 있으나, 본 발명의 비양성자성 극성 용매는 리포펙타민보다 훨씬 우수한 유전자 전달 효율의 개선을 나타낸다. 또한, 비양성자성 극성 용매(특히, DMSO)를 포함하는 본 발명의 조성물은 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 세포 손상을 거의 유발하지 않기 때문에 안전성의 측면에서도 우수한 특성을 나타낸다. 한편, 비양성자성 극성 용매를 포함하는 본 발명의 조성물은 캡시드 단백질을 갖는 바이러스에 대한 단기 및 장기 보존성이 우수하다.

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Description

유전자 전달체의 유전자 전달효율 개선 및 바이러스 보존용 조성물{Compositions for Enhancing Gene Delivery Efficiency of Gene Delivery Systems and for Preserving Viruses}

본 발명은 유전자 전달체의 유전자 전달효율을 증가시키는 기술에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율 개선용 조성물 및 유전자 전달용 조성물에 관한 것이다.

아데노바이러스가 감염하여 세포 내로 들어가는 기전은, 우선 대상 세포의 표면에 발현되어 있는 CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)와 아데노바이러스의 파이버 놉(knob) 사이의 결합에 의해 이루어진다. 아데노바이러스의 2차 수용체인 인테그린이 밝혀지면서 아데노바이러스의 파이버 놉과 CAR와의 1차 결합 이외에 펜톤베이스 단백질과 인테그린과의 2차 결합에 의해 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)가 일어나게 된다. 이후, 엔도사이토시스에 의해 엔도좀을 형성하게 되며, 엔도좀의 산성 pH에 의해 아데노바이러스는 세포 질내로 침투하게 된다. 그 후 핵공과 결합한 후에 아데노바이러스의 DNA가 핵안으로 이동하게 된다.

뇌암 세포주, 두경부암, 흑색종양 및 방광암 등의 경우 CAR의 발현이 낮음이 보고된 바 있으며, CAR의 발현이 낮은 세포주인 경우 아데노바이러스의 세포내 감염이 매우 저조하며, 세포내 CAR의 발현을 증가시켜 주면 아데노바이러스의 감염율이 증가한다는 결과를 통해 저조한 CAR 발현이 아데노바이러스 감염에 있어서 하나의 장벽으로 작용한다는 것을 알 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 유전자 전달체(gene delivery system)의 동물세포 내로의 유전자 전달효율을 증가시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 비양성자성 극성 용매(aprotic polar solvent)를 유전자 전달체와 병용하면 유전자 전달효율을 크게 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유전자 전달용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 약제학적 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 바이러스 보존용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비양성자성 극성 용매를 유효성분으로 포함하는 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유전자 전달체; 및 (b) 비양 성자성 극성 용매를 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 유전자 전달체(gene delivery system)의 동물세포 내로의 유전자 전달효율을 증가시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비양성자성 극성 용매(aprotic polar solvent)를 유전자 전달체와 병용하면 유전자 전달효율을 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 이용되는 비양성자성 극성 용매는 특별히 제한되지 않으며, 비양성자성 극성을 나타내는 한 본 발명에서 이용될 수 있다. 즉, 산성 수소원자를 지니지 않는 극성 용매는 본 발명에서 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 비양성자성 극성 용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide), DMF(dimethyl formamide), N-메틸피롤리돈, N-메틸모르폴린, γ-부티로락톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란 또는 헥사메틸포스포릭 트리아마이드이고, 가장 바람직하게는 DMSO이다.

DMSO는 C₂H₆OS의 화학식에서 나타나는 것처럼 비양성자성 극성 용매이다. DMSO는 비점이 높고(189°C) 인화점도 높으며(95°C) 독성이 낮은 화학적으로 매우 안정적인 용매로서 사용하기 쉬운 특성을 가지고 있다. 또한, DMSO는 펄프 공정 동안 만들어지는 부산물로서 수중 또는 토양중의 미생물에 의해 잘 분해 되어 장기간 잔류하지 않는 특징이 있다. DMSO는 친수성의 설폭사이드 그룹과 소수성의 두 개의 메틸 그룹으로 이루어진 비양성자성 화합물로서 극성 또는 비극성 화합물을 용해할 수 있다.

본 발명에 의해 유전자 전달효율이 개선될 수 있는 유전자 전달체는 특별하게 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 유전자 전달체는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res . 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀이다.

가장 바람직하게는 본 발명에 의해 유전자 전달효율이 개선될 수 있는 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스이다.

재조합 아데노바이러스의 경우, CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)를 통하여 세포 내로 감염된다. 그러나, 뇌암 세포, 두경부암 세포, 흑색종양 세포 및 방광암 세포 등의 경우 CAR의 발현이 낮기 때문에, 재조합 아데노바이러스에 의한 유전자 치료(gene therapy)에서 하나의 장벽이 되고 있다. 또한, CAR의 발현이 높은 세포의 경우에도, 재조합 아데노바이러스의 감염율을 높이 는 것은 유전자 치료에 큰 도움이 된다.

본 발명은 이러한 유전자 치료의 장벽을 극복할 수 있도록 한다. 예를 들어, 비양성자성 극성 용매를 이용하면 CAR-비의존적으로 아데노바이러스를 이용하여 유전자를 세포 내로 도입시킬 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 유전자 전달체의 예를 상세하게 설명하면 다음과 같다:

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 외래 유전자는 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람 직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 한편, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 또한, 상기 삽입 서열들은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템은 “프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열”구조를 갖으며, 상기 "프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열"은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된 것이다. 또한, “프로모터-첫 번째 목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열-IRES-두 번째 목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열”처럼 첫 번째 목적 뉴클레오타이드와 두 번째 목적 뉴클레오타이드가 IRES (internal ribosome entry site)에 의해 연결된 바이시스트론 (bicistronic) 발현 시스템에 의해서도 발현될 수 있다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사 체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp . Hematol . (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest ., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol ., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine (Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

본 발명에서 유전자 전달체에 의해 세포내로 운반될 수 있는 목적 뉴클레오타이드 서열은 어떠한 뉴클레오타이드 서열도 가능하며, 예컨대, 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자 [예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자 (costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)], 항원성 유전자, 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자가 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다.

자살 유전자는 세포가 외부 인자에 의해 살상되기 쉽도록 유도하는 물질을 발현하거나 세포에 독성 조건을 유발하는 핵산 서열이다. 이러한 자살 유전자로 잘 알려진 것은 티미딘 키나제(TK) 유전자이다 (미국특허 제5,631,236호 및 제5,601,818호). TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간사이클로비르 (gancyclovir)의 투여에 의해 선택적인 사멸에 민감하다. 종양 억제 유전자는 종양의 형성을 억제하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 가리킨다. 종양 억제 유전자는 포유동물에서 자연발생 유전자이며, 이 유전자의 결실 또는 불활성화는 종양 발생에 필수 전제인 것으로 믿어지고 있다. 종양 억제 유전자의 예로는 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2, 망막아세포종 유전자 (Lee et al. Nature, 329:642(1987)), 선종양 폴립증 장 단백질 (adenomatous polyposis coli protein; 미국특허 제 5,783,666 호), 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc . Nat . Acad . Sci ., 95:3042-3047(1998)), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 및 p21을 포함한 종양 억제 유전자의 INK4 계열의 일원 및 이의 치료학적으로 유효한 단편 (예, p56Rb, p94Rb 등)이 포함된다. 당업자는 상기 예시된 유전자 외에 기타 알려진 항종양 유전자 모두가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 용어 "항원성 유전자 (antigenic gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 PSA (prostate specific antigen), AFP (α- feto protein), p53 (WO 94/02167)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제 I 형 항원에 결합시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어 "세포독성 유전자 (cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소 (exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자 (예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스 (growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 (WO 97/16459 및 WO 96/30385) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 본 발명의 시스템에 의해 운반된다. 예를 들면, 사이토카인 (예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨 (예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자 (예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹 (단핵구 화학 주성단백질 1 (MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2 (MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3 (MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4 (MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β (MIP-1 β), 대식구 염증성 단백질 1γ (MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α (MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인 (ELC), 대식구 염증성 단백질 4 (MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5 (MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론 (p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인 (TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테롤 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 "친-세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF-, TRAIL, p53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "항-신생혈관생성 유전자 (anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

또한, 본 발명자들에 의해 아데노바이러스 유전자 치료에 적합한 것으로 규명된 릴랙신 유전자 또는 데코린 유전자도 유전자 전달체에 의해 세포내로 운반될 수 있는 유전자이다.

상술한 목적의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 서열 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.

본 발명에 따르면, 다양한 동물 세포에 유전자 전달체를 증가된 효율로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 포유동물(인간, 소, 돼지, 마우스, 래트, 염소, 햄스터, 양 및 말) 또는 조류 세포 (avian cells)에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 다양한 상태 또는 종류의 세포에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 정상세포, 암세포, 종양세포, 초기 배양 세포(primary-cultured cells) 및 줄기세포에 적용되어, 유전자 전달체를 증가된 효율로 도입시킬 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비양성자성 극성 용매를 유효성분으로 포함하는 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유전자 전달체; 및 (b) 비양성자성 극성 용매를 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 유전자 전달용 조성물을 세포를 포함하는 생시료(biosample)에 접촉시키는 단계를 포함하는 유전자 전달 방법을 제공한다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 아데노바이러스의 치료학적 유효량; (b) 비양성자성 극성 용매; 및 (c) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 아데노바이러스 이외에, 아데노바이러스의 세포 내 감염율을 높이기 위하여 사용되는 비양성자성 극성 용매는, 바람직하게는 DMSO(dimethyl sulfoxide), DMF(dimethyl formamide), N-메틸피롤리돈, N-메틸모르폴린, γ-부티로락톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란 또는 헥사메틸포스포릭 트리아마이드이고, 가장 바람직하게는 DMSO이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 이용되는 아데노바이러스는 유전자 치료에 이용되는 어떠한 아데노바이러스도 포함한다.

본 발명에서 이용되는 아데노바이러스의 지놈은 ITR(inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열 및 목적의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 약제학적 항종양 조성물은 종래의 재조합 아데노바이러스의 유전 자 전달 효율을 증대시켜, 아데노바이러스에 의한 암 치료 효능을 크게 증가시킨다.

아데노바이러스 지놈의 작은 부분만이 cis에서 필요한 것으로 알려져 있기 때문에 (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981)), 아네노바이러스는 대량의 외래 DNA 분자를 운반할 수 있는 능력이 있으며, 이는 특히 293과 같은 특정 세포주를 이용하는 경우에 그러하다. 이러한 측면에서, 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스에 있어서, 운반하고자 하는 목적의 유전자 이외에 다른 아데노바이러스의 서열은 적어도 ITR 서열을 포함한다.

목적 유전자는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역)또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E3 영역에 삽입된다. 한편, 다른 외래 뉴클레오타이드 서열 (예: 사이토카인, 면역-보조자극 인자, 자살 유전자 및 종양 억제 유전자)도 추가적으로 아데노바이러스에 포함시킬 수 있으며, 이는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역)에 삽입된다. 또한, 상기 삽입 서열들은 E4 영역에도 삽입될 수 있다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는다. 본 명세서에서, 유전자와 관련하여 사용되는 용어 “비활성화”는 그 유전자의 전사 및/또는 해독이 정상적으로 이루어지지 아니하여, 그 유전자에 의해 코딩되는 정상적인 단백질의 기능이 나타나지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 비활성화 E1B 19 유전자는 그 유전자에 변이 (치환, 부가, 부분적 결실 또는 전체적 결실)가 발생되어 활성의 E1B 19 kDa 단백질을 생성하지 못하는 유전자이다. E1B 19가 결여되는 경우에는 세포고사능을 증가시킬 수 있고, E1B 55 유전자가 결여된 경우에는 종양세포 특이성을 갖게 한다 (참조: 대한민국 특허출원 제 10-2002-0023760 호).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함한다. E1A 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 복제 가능한 특성을 갖게 된다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19/E1B 55 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19/E1B 55 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함하고, 목적의 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E3 영역에 삽입되어 있는 것이다.

또한, 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스는 “ITR-E1A-ΔE1B-프로모터-목적 유전자-폴리 A 서열” 구조를 갖으며, 상기 "프로모터-목적 유전자-폴리 A 서열"은 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다.

하기의 실시예에서 예증된 바와 같이, 비양성자성 극성 용매, 특히 DMSO를 병용하여 아데노바이러스를 투여하면, 아데노바이러스에 의한 유전자 전달 효율이 크게 개선되며, 이는 CAR 발현에 의존하지 않는다. 이러한 현격한 유전자 전달 효율의 증가는 아데노바이러스에 의한 항종양 효과를 크게 증대시키는 결과를 초래한다. 이러한 항종향 효과의 개선은 복제 가능 재조합 아데노바이러스뿐만 아니라, 복제 불능 재조합 아데노바이러스에도 나타난다.

아데노바이러스를 이용한 효과적인 항종양 효과를 유도하기 위해서는 빠른 속도로 성장하는 암세포에 비하여 보다 빠른 바이러스의 증식과 인접세포로의 확산을 통해 효과적인 세포 살상효과를 유발시킬 수 있어야 한다. 또한, 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료가 성공적으로 이루어지기 위해서는 높은 치료효과와 함께 안전성을 높이기 위한 방안이 개발되어야 한다. 본 발명에서 개발된 비양성자성 극성 용매의 병용 투여 방법은 아데노바이러스의 세포 내 감염속도를 크게 증가시켜 항종양 효과를 현격히 증대시킨다. 이는 결과적으로 암치료에 필요한 바이러스 투여량을 감소시킬 수 있어 바이러스에 의한 생체내 독성과 면역반응을 크게 줄일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종 양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주사 방법(injection)으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 10⁵ - 1 × 10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 10¹⁰ pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 비양성자성 극성 용매를 유효성분으로 포함하는 캡시드 단백질를 갖는 바이러스 보존용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 비양성자성 극성 용매가 캡시드 단백질에 의해 유전자 물질이 둘러싸여 있는 바이러스를 보존하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다는 것을 발견하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “캡시드”는 바이러스의 단백질 쉘을 의미한다. 캡시드는 단백질로 이루어진 몇 개의 올리고머성 서브유니트들로 구성되어 있으며, 바이러스의 유전물질을 둘러싼다. 캡시드는 구조에 따라 나눌 수 있으며, 대부분의 바이러스는 나선형(helical) 또는 이코사헤드럴(icosahedral) 구조(예컨대, 아데노바이러스)의 캡시드를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비양성자성 극성 용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide), DMF(dimethyl formamide), N-메틸피롤리돈, N-메틸모르폴린, γ-부티로락톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란 또는 헥사메틸포스포릭 트리아마이드이고, 가장 바람직하게는 DMSO이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 보전될 수 있는 캡시드 단백질에 의해 둘러싸여 있는 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 배시니아 바이러스이고, 가장 바람직하게는 아데노바이러스이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 비양성자성 극성 용매를 사용함으로써 유전자 전달체의 동물세포로의 유전자 전달 효율을 크게 개선한다.

(ⅱ) 통상적으로 당업계에서는 유전자를 세포 내로 도입시키기 위하여 리포펙타민을 많이 사용하고 있으나, 본 발명의 비양성자성 극성 용매는 리포펙타민보다 훨씬 우수한 유전자 전달 효율의 개선을 나타낸다.

(ⅲ) 유전자 치료에 이용되는 유전자 전달체의 경우, 원하는 효과를 발휘하기 위하여 세포 내로의 유전자 전달 효율이 매우 중요하다. 유전자 전달 효율이 문제되는 경우, 본 발명은 이 문제점을 획기적으로 개선시킬 수 있다.

(ⅳ) 비양성자성 극성 용매(특히, DMSO)를 포함하는 본 발명의 조성물은 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 세포 손상을 거의 유발하지 않기 때문에 안전성의 측면에서도 우수한 특성을 나타낸다.

(ⅴ) 또한, 비양성자성 극성 용매를 포함하는 본 발명의 조성물은 캡시드 단 백질을 갖는 바이러스에 대한 단기 및 장기 보존성이 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1.대상 세포주 및 세포배양

인간 간암세포주(Huh7 및 Hep1), 뇌암세포주(U87MG, U251N 및 U343), 폐암세포주(H1299, H460 및 A549), 유방암세포주(MDA-MB-435, MDA-MB-231 및 MCF-7), 두경부암세포주(FaDu, 1YB, QLL1 및 CAL27), 피부암세포주(A431), 전립선암세포주(DU145)와 같은 암세포주들과 인체 정상세포주(CBHEL 및 IMR90)를 사용하였다. 또한, 인간 골종양세포주 SJSA 및 U20S, 인간 섬유암종세포주 HT1080를 사용하였다.

마우스 세포주로는 흑색종세포주(B16F1, B16F10 및 B16BL6), 폐암세포주(CMT-64), 직장암세포주(CMT-93), 유방암세포주(EF43-fgf) 및 섬유아세포-유사 Mus dunni 세포주를 사용하였으며, 햄스터 난소세포주(Lec2)와 래트 세포주(YPEN) 를 사용하였다. 이들 세포주들은 모두 ATCC(America Type Culture Collection, Manassas, UA, USA)에서 구입하였으며 FADU 세포주(10% 우태아혈청이 함유된 MEM 배지)를 제외한 모든 세포주는 5% 또는 10%의 우태아혈청(AAAA)이 함유된 DMEM(AAAA) 배지를 배양액으로 항생제 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 첨가하여 5% CO₂의 존재 하에 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 리포펙타민은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, DMSO(dimethylsulfoxide)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

2. X-gal 염색법

리포펙타민 또는 DMSO에 의한 유전자 전달효율을 검증하고자 LacZ 표지유전자로 하는 바이러스를 이용하여 X-gal염색을 실시하였다. 다양한 세포주들을 3 X 10⁵개를 6-웰에 분주한 뒤, 다음날 LacZ 바이러스 단독(dl/LacZ, 참조: WO 2006/075819), 리포펙타민/Plus(2:6) 병용투여 또는 DMSO 병용투여 후 이틀 뒤에 X-gal 염색을 시행하였다. 세포를 고정액(1% 포름알데하이드, 0.2% 글루타르알데하이드 in H₂O)에서 5분간 고정하고, PBS로 2회 세척 후 X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-b-D galactopyanoside: Life Technologies, Rokuill, MD)이 포함된 염색 용액으로 37℃에서 12시간 동안 반응시켜 β-갈락토시다아제의 활성을 관찰하였다.

3. 세포병변(CPE) 분석

리포펙타민과 DMSO의 사용 여부가 아데노바이러스의 복제에 어떠한 영향을 미치는지 검증하기 위하여, 바이러스의 복제 결과로 나타나는 CPE를 비교하였다. 암세포들을 2-5 X 10⁴ 개의 세포로 24-웰 플레이트에 분주한 뒤, 본 발명자에 의해 개발된 복제가능 Ad-ΔB7 바이러스(참조: 대한민국 특허 제0746122호)를 1, 10, 100 또는 1000 MOI(multiplicity of infection)로 바이러스 단독투여, 리포펙타민과 병용투여, 2% DMSO 또는 5% DMSO와 병용투여 하였다. 이들 중 어느 한 바이러스가 1 MOI의 역가에서 감염세포를 완전히 사멸 시킨 시점에서 모든 배지를 제거하고 0.5% 크리스탈 바이올렛(50% 메탄올)으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색한 후 분석하였다. 본 명세서 전체적으로 DMSO의 농도를 표시하는 단위 %는 v/v%를 나타낸다.

4. 아데노바이러스의 생산량 비교

리포펙타민 또는 DMSO와 병용 투여 시 증가된 유전자 전달효율에 의한 바이러스 생산량을 비교하기 위하여, 24-웰 플레이트에 4 x 10⁴개의 A549, MDA-MB-231, Hep1 또는 FaDu 세포주를 분주하였다. 24시간 후 Ad-ΔB7 바이러스를 바이러스 단독, 리포펙타민, 또는 1% DMSO와 병용투여 하였으며 A549는 0.5 MOI, MDA-MB-231과 Hep1 세포주는 5 MOI, FaDu 세포주는 10 MOI를 감염시켰다. 감염 후 A549, MDA-MB-231 및 Hep1은 48시간 후에 FaDu 세포주는 72시간 뒤에 세포와 배지를 각각 회수하였다. 감염된 세포는 세 번의 얼림과 녹임을 반복하여 바이러스를 방출시 켰으며, 배지와 세포내의 바이러스의 역가는 HEK293 세포주에서 한계 타이터 분석(limiting titeration assay)을 수행하여 산출하였다.

5. FACS 분석

리포펙타민 또는 DMSO를 처리한 경우 세포내 아데노바이러스의 중요한 수용체인 CAR와 인테그린의 발현이 증가되는 여부를 검증하고자 A549, MDA-MB-231 또는 MDA-MB-435의 세포주를 6-웰에 5 x 10⁵ 분주한 뒤 리포펙타민, 2% 또는 5% DMSO를 처리한 후 4시간과 24시간 뒤 세포주를 수득하여 유세포기 분석을 실시하였다. 각각의 세포주를 수득한 뒤 PBS로 두 번 세척 한 뒤, FITC가 결합된 항-인테그린 α_Vβ₃ (마우스 항-인간 인테그린 α_Vβ₃ 단일클론 항체, 클론명: LM 609, Chemicon, AAAAa), 항-인테그린 α_Vβ₅(마우스 항-인간 인테그린 α_Vβ₅ 단일클론 항체, 클론명:P1F6, Chemicon) 항체를 넣어 4℃에서 45분간 반응 시킨 후 PBS로 2번 세척하고 2% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 유세포기 분석을 실시하였다. CAR의 경우는 1차 항체로 마우스 항-인간 CAR 정제 항체(RmcB, DiNonA)를 넣어 4℃에서 45분간 반응 시킨 후 PBS로 2번 세척한 뒤 PE가 결합된 염소 항-마우스 IgG 면역글로블린(cat number:80014F, DiNonA)를 첨가하였다. 이들을 4℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 각각의 세포를 PBS로 2번 세척하고 2% 파라포름알데하이드로 고정시킨 뒤 유세포 분석기 실험을 실시하였다.

6.DMSO에 의한 아데노바이러스 단백질의 안정성 검증 및 유용성 검증

DMSO는 인체 피부의 내부 각질의 변성을 유도하는 용매로 알려져 있다. 이러한 사실을 근거로 DMSO에 의해 아데노바이러스의 구조 단백질의 변성이 유도되는지를 검증하였다. 음성대조군으로는 아데노바이러스의 일반적인 보존용액인 4% 수크로오스 용액을 사용하였다. dl/LacZ 바이러스(참조: WO 2006/075819)를 4% 수크로스 용액, 20% DMSO가 함유된 수크로스 용액 또는 40% DMSO가 함유된 수크로스 용액에 용해시킨 뒤 0℃에서 6시간 방치한 후 바이러스 단독, 1% 또는 2% DMSO를 함유하여 두경부암 세포주인 1483 세포에 감염시킨 다음 48시간 뒤에 X-gal 염색을 실시하였다. 또한 DMSO는 화학 샤페론으로서 미스-폴딩된 단백질을 리폴딩시켜 단백질 집적 현상을 예방한다고 보고된 바 있다. DMSO에 의해 아데노바이러스의 집적이 저해되는지 여부를 검증하고자 4% 수크로스 보존제와 20% DMSO가 함유된 보존제에 용해되어 있는 dl/LacZ 아데노바이러스를 상온에 1일, 3일, 5일 및 7일 동안 방치한 후 8일째 X-gal 염색을 실시하였다.

7. DMSO를 이용한 단기간 또는 장기간 아데노바이러스 보존능 검증

DMSO는 세포의 저온 보존 용액으로서 매우 유용한 시약으로 알려져 있다. 이러한 사실을 근거로 DMSO를 이용하여 단기간 또는 장기간으로 아데노바이러스를 보존할 수 있는지 여부를 검증하였다. 음성 대조군으로는 아데노바이러스의 일반적인 보존용액인 4% 수크로스 용액을 사용하였다. dl/LacZ 바이러스를 4% 수크로스 보존제와 20% DMSO가 함유된 4% 수크로스 보존제에 용해시킨 뒤, 30분 또는 24시간 동 안 -80℃ 급속 냉동고에 보관한 후 X-gal 염색을 실시하였다. 또한 장기간으로 아데노바이러스를 보존할 수 있는지 검증하고자 같은 배치의 dl/LacZ 바이러스를 4% 수크로스 보존제 또는 20% DMSO가 함유된 4% 수크로스 보존제에 용해시킨 뒤 매달 -80℃에 보관한 후 7개월 뒤 모두 해동시켜 X-gal 염색을 실시하였다.

8. 전자현미경에 의한 세포 변화 분석

인간 폐암 세포주인 H460을 25T 플라스크에 1 x 10⁶ 분주한 뒤 다음날 세포를 스크레이퍼를 이용하여 수득한 뒤 원심분리하여 PBS로 두 번 세척하였다. 각각의 세포를 바이러스 단독 투여, 리포펙타민/Plus(2:6)과 병합투여 또는 2% DMSO와 병합투여한 뒤 5분, 1시간 후에 세포를 PBS로 2회 세척 후 2% 글루타르알데하이드로 고정하였다. 그 후 0.1 M 카코딜레이트-HCl(pH7.4)에 용해시킨 1% O_SO₄에 1시간 고정한 뒤 전자현미경으로 관찰하였다.

9. H&E 염색

종양내 DMSO에 의한 유전자 전달효율을 검증하고자 생후 6-8주 된 BALB/C 마우스((주)중앙실험동물, Korea) 복벽에 1 x 10⁶ EF43-fgf 세포주를 마우스 복벽에 주사한 뒤, 종양이 60-80 ㎣ 정도 성장하였을 때 dl/LacZ 바이러스를 1X 10⁸ PFU(plaque forming unit)로 이틀 간격으로 3회 종양내 주사하였다. 마지막 바이 러스 주사 후 3일 뒤 종양을 적출하여 X-gal 염색을 실시하였다. 또한 인체 두경부암세포주인 FaDu 세포주의 종양을 형성한 뒤 종양의 크기가 60-80 ㎣ 성장하였을 때 Ad-ΔB7 바이러스를 1 x 10⁸ PFU로 3회 주사한 뒤 마지막 바이러스 투여 후 3일 뒤 종양을 적출하여 H&E 염색(hemotoxyline-eosine staining)을 실시하였다.

10. 생체 내 항종양 효과 검증

인체 두경부암세포주인 FaDu 세포를 10% 우태아 혈청을 함유한 MEM(Invitrogen) 배지에서 단일층으로 배양하고, 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 처리한 후 Hanks' Balanced salt solution(HBSS)로 세척한 뒤 부유하여 마우스의 복벽에 피하 주사하였다. 종양세포 이식 후 약 8-10일 경, 종양의 크기가 약 60-80 ㎣정도 성장하면 Ad-ΔB7 아데노바이러스를 1 X 10⁸ PFU 용량으로 바이러스 단독, 리포펙타민/Plus(2:6)와 병용투여 또는 5% DMSO와 병용투여 하여 2일에 한번씩 5회 종양 내로 투여하였다. 음성대조군으로는 리포펙타민 단독 투여한 그룹과 DMSO 단독으로 투여한 그룹으로 실험하였다. 종양의 용적은 캘리퍼를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정한 후 다음과 같은 공식으로 산출하였다: 종양의 용적= (단축 mm)²x 장축mm x 0.523

실험 결과

1. 인간 세포주와 마우스 세포주에서 DMSO의 병용 투여에 따른 유전자 전달 효율 검증

DMSO에 의한 아데노바이러스의 유전자 전달효율을 검증하고자, 여러 종류의 인간 세포주들을 이용하여 LacZ 분석을 시행하였다. 표지 유전자로서 LacZ가 발현되는 복제 불능 아데노바이러스인 dl/LacZ를 MOI별로 감염시킨 뒤 X-gal 염색을 실시하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 아데노바이러스에 의한 세포 감염율이 낮은 세포주인 FaDu, 1YB, QLL1, CAL27, A431, MDA-MB-435, MCF-7, CBHEL 그리고 IMR90의 경우 아데노바이러스를 단독으로 감염시킨 것보다 리포펙타민 또는 DMSO와 병용 투여 시 증가된 유전자 전달효율을 관찰할 수 있었다. 특히, FaDu, 1YB, A431, CBHEL 및 IMR90과 같은 세포주들에서 DMSO와 함께 아데노바이러스를 투여하였을 경우가 리포펙타민과 아데노바이러스를 함께 투여한 경우보다 유전자 전달효율이 좀 더 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 1% DMSO에 비해 2% DMSO에서 유전자 전달효율이 약간 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

한편 아데노바이러스의 감염율이 높은 U87MG, U251N, U343, H1299, DU145, MDA-MB-231, Huh7, Hep1, H460 및 A549 세포주들의 경우에서는, 리포펙타민과 아데노바이러스를 병용 투여한 경우에서는 아데노바이러스를 단독으로 감염시킨 경우에 비해 유전자 전달효율이 오히려 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2). 이에 반하여, 아데노바이러스를 DMSO와 병용 투여한 경우에는, 유전자 전달효율이 바이러스를 단독으로 투여한 경우와 비슷하거나 근소하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, U87MG, DU145, MDA-MB-231, Hep1 및 A549 세포주의 경우에 아데노바이러스와 DMSO를 함께 병용 투여하였을 경우에 바이러스를 단독으로 투여한 경우에 비해 유전자 전달 효율이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 또한 DMSO를 1%로 병용 투여한 경우에 비해 DMSO를 2%로 병용 투여한 경우가 보다 증가된 유전자 전달효율을 유도하는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 마우스 및 래트 세포주들을 대상으로 유전자 전달효율을 검증해 본 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, CAR의 발현이 매우 저조하여 아데노바이러스의 감염율이 낮은 B16-F1과 B16-F10 마우스 흑색종 세포주들에서는 리포펙타민 또는 DMSO와 아데노바이러스를 병용 투여한 경우의 LacZ의 발현 효율이 아데노바이러스를 단독으로 감염시킨 경우에 비해 현저하게 증가하는 것을 관찰하였으며, 특히 DMSO와 아데노바이러스를 병용 투여한 경우의 LacZ 유전자 발현효율이 리포펙타민과 아데노바이러스를 병용 투여한 경우에 비해서도 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 아데노바이러스의 감염율이 비교적 높은 CMT-64, CMT-93, YPEN, E43-fgf 마우스 및 래트 세포주들에서는, DMSO와 아데노바이러스를 병용 투여한 경우의 유전자 전달 효율이 아데노바이러스를 단독으로 감염시킨 경우와 비슷하거나 약간 증가하는 것을 관찰한 반면, 리포펙타민과 병용투여한 경우에는 LacZ의 발현이 오히려 감소하는 것을 관찰하였다.

2. 리포펙타민과 DMSO와의 병용 투여에 의한 복제 가능 아데노바이러스의 세포 살상능 변화 검증

아데노바이러스를 리포펙타민 또는 DMSO와 함께 투여할 경우 리포펙타민 또는 DMSO가 아데노바이러스의 복제에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 복제 가능 아 데노바이러스를 이용하여 아데노바이러스의 복제에 따른 세포사멸정도를 CPE 분석으로 관찰하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 아데노바이러스에 의한 세포 감염율이 낮은 여러 종류의 인체 세포주들에 Ad-△B7 복제 가능 아데노바이러스를 단독 투여, 리포펙타민 또는 2% DMSO, 5% DMSO와 병용 투여한 경우에, 복제 가능 바이러스를 단독으로 투여한 것보다 DMSO와 병용 투여하였을 때 세포 살상능이 보다 증가하는 것을 관찰하였다. 특히, MCF-7, SJSA, HT1080 세포주들에서는 Ad-△B7 복제 가능 바이러스를 단독으로 투여한 것보다 리포펙타민 또는 DMSO와 병용 투여하였을 때 모두 세포 살상능이 보다 증가하였으며, 5%의 DMSO를 병용 투여한 경우에는 리포펙타민을 병용 투여한 경우에 비해 보다 나은 세포 살상능을 유도함을 관찰할 수 있었다. 또한, FADU, A431, U20S, CBHEL, IMR90 세포주들에서는 리포펙타민을 병용 투여한 경우에서는 아데노바이러스를 단독 투여한 경우와 비슷한 세포사멸 정도가 나타났지만, DMSO를 병용 투여한 경우에는 이보다 증대된 세포 살상능을 관찰 할 수 있었다. 즉, CAR의 발현이 저조한 여러 종류의 세포주에서 DMSO와 병용 투여한 복제 가능 아데노바이러스의 세포 살상능이 바이러스를 단독 투여한 경우에 비해 향상되었으며, 리포펙타민을 병용 투여한 경우보다도 세포 살상능이 증대됨을 확인할 수 있었다.

한편, CAR의 발현이 비교적 높아 아데노바이러스의 감염율이 높은 U87MG, U343, DU145, MDA-MB-231, Hep1, H460, A549 세포주들의 경우에서는, 앞서의 LacZ 분석에서 나타난 결과와 마찬가지로, 리포펙타민을 Ad-△B7 복제 가능 바이러스와 함께 병용 투여한 경우의 세포 살상능이 바이러스만을 단독 투여한 경우보다도 감 소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 하지만, 바이러스를 DMSO와 함께 병용 투여한 경우에서는 바이러스를 단독으로 투여한 경우보다 세포 살상능이 감소하지 않았으며, 특히 DU145, H460, 그리고 A549 세포주들에서는 세포 살상능이 증대되는 것을 관찰하였다. 또한, 마우스 및 래트 세포주들의 경우에서도, 복제 가능 아데노바이러스를 DMSO와 함께 병용 투여한 경우의 세포 살상능이 바이러스를 단독 투여한 경우에 비해 보다 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6). 특히, CMT-64 세포주에서는 복제 가능 아데노바이러스를 리포펙타민과 함께 병용 투여한 경우에는 오히려 세포 살상능이 바이러스를 단독 투여한 경우에 비해 감소하였지만, DMSO와 함께 병용한 경우에서는 전혀 세포살상능이 감소하는 것은 관찰되지 않았다.

3. DMSO 병용투여에 따른 아데노바이러스의 생산량 변화 검증

DMSO와의 병용투여에 의해 아데노바이러스의 세포 감염능이 증가되고 이에 따라 아데노바이러스의 생산량이 증가될 수 있는지를 알아보기 위하여, 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔB7을 MDA-MB-231과 A549 세포주에 각각 5 MOI 및 0.5 MOI로 처리한 후 48 시간 경에 감염된 세포와 배양액을 모두 회수하여 바이러스의 역가를 산출하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, MDA-MB-231과 A549 세포주 모든 경우에, 바이러스를 리포펙타민과 함께 병용 투여한 경우에는 바이러스를 단독 투여한 경우에 비해 바이러스 생산량이 크게 감소한 반면, DMSO를 함께 병용 투여한 경우에는 바이러스 생산량이 감소하지 않았다. 특히 A549 세포주의 경우에는 Ad-ΔB7 아데노바이러스를 DMSO와 함께 병용 투여한 경우에 바이러스를 단독 투여한 경우에 비해 약 4배 정도 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

4. 리포펙타민 또는 DMSO 병용 투여시 CAR와 인테그린의 발현변화 관찰

아데노바이러스를 DMSO와 함께 투여한 경우에 나타나는 향상된 유전자 전달 효율과 세포 살상능이, 아데노바이러스의 감염경로에 중요한 수용체인 CAR와 인테그린의 발현 증가에 의한 것인지를 확인하기 위하여, CAR와 인테그린의 발현량을 FACS 분석을 실시하여 검증하였다. MDA-MB-231, MDA-MB-435, A549 세포주들에 리포펙타민, 2% DMSO, 또는 5% DMSO를 4시간, 24시간 동안 처리한 후 세포를 수득하여 CAR, α_νβ₃, 또는 α_νβ₅ 의 발현 변화를 관찰하였다. 표 1에서 볼 수 있듯이, 실험에 이용된 모든 세포주들에서, 리포펙타민 또는 DMSO를 투여한 경우에 α_νβ₃, 또는 α_νβ₅ 인테그린의 발현량이 변화되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, CAR의 발현량도 큰 변화가 없음을 관찰할 수 있었다.

MDA-MB-231 세포주

항목	반응시간	배지 단독	리포펙타민	2% DMSO	5% DMSO
ανβ3	4 hr	6.20	6.45	6.45	6.24
	24 hr	5.78	6.86	6.41	6.30
ανβ5	4 hr	5.24	5.68	6.13	6.23
	24 hr	6.30	6.43	3.94	4.04
CAR	4 hr	18.52	20.36	17.73	17.29
	24 hr	27.12	32.76	32.23	35.93

MDA-MB-435 세포주

항목	반응시간	배지 단독	리포펙타민	2% DMSO	5% DMSO
ανβ3	4 hr	3.86	3.97	4.05	4.33
	24 hr	4.87	5.08	4.89	5.18
ανβ5	4 hr	2.90	2.71	2.99	3.00
	24 hr	2.39	2.48	2.38	2.58
CAR	4 hr	3.27	7.21	3.66	3.89
	24 hr	3.20	5.69	3.43	4.95

A549 세포주

항목	반응시간	배지 단독	리포펙타민	2% DMSO	5% DMSO
ανβ3	4 hr	6.35	7.60	6.74	6.4
	24 hr	6.66	8.17	6.79	6.80
ανβ5	4 hr	19.30	18.88	18.19	17.31
	24 hr	15.46	16.60	15.22	14.86
CAR	4 hr	22.70	25.33	23.88	26.06
	24 hr	42.24	45.59	46.70	47.09

5. DMSO에 의한 아데노바이러스의 구조적 안정성 변화 검증

아데노바이러스의 구조 단백질인 캡시드(capsid)는 DNA 게놈을 규칙적으로 둘러싸고 있으며, 파이버, 펜톤베이스, 그리고 헥손의 세 종류의 주요 단백질로 이루어져 있다. 특히, 아데노바이러스의 세포내 감염 시 중요한 역할을 하는 파이버에는 세포표면에 발현되는 CAR 수용체와 결합하는 놉 부분이 있으며, 놉은 2개의 β-쉬트의 3중 구조체로 이루어져 있다. 한편 DMSO는 단백질의 변성을 유도할 때 사용되는 용매로서 인체 피부의 내부 각질을 α-헤릭스 구조에서 β-쉬트 구조로 변성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실을 근거로 DMSO에 의해 아데노바이러스의 구조 단백질의 변성이 유도되는지를 검증하였다. 아데노바이러스를 최종농도 20% 혹은 40% DMSO에 용해한 뒤 0℃에서 6 시간 동안 항온처리한 뒤, LacZ의 발현정도를 관찰하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 아데노바이러스 저장 완충액(10 mM Tris, 2 mM MgCl₂)에 용해된 아데노바이러스 혹은 20%, 40% DMSO에 용해한 바이러스의 LacZ의 발현은 큰 차이가 없었으며, 특히, 이들 모두에서 아데노바이러스만을 감염시킨 경우에 비해 DMSO를 세포 감염시 첨가해준 경우에 LacZ 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 DMSO의 최종농도가 2%인 상태로 바이러스를 감염시킨 경우의 LacZ 유전자 전달효율이 DMSO의 최종농도가 1%인 상태로 바이러스를 감염시킨 경우에 비해 더 증대되는 것도 관찰할 수 있었다.

또한, DMSO는 화학적 샤페론으로서 세포내 단백질의 집적(aggregation)을 예방하며 미스-폴딩된 단백질을 리폴딩 시키는 샤페론 단백질의 역할과 유사하다고 보고된 바 있다. 이러한 배경 하에, 아데노바이러스의 집적 현상을 효과적으로 저해할 수 있는지 알아보기 위하여 dl/LacZ 아데노바이러스를 저장 완충액 또는 20% DMSO가 첨가된 저장 완충액에 넣어 -80℃에서 동결한 뒤, 각각의 바이러스를 1일, 3일, 5일 그리고 7일 동안 상온에서 방치한 뒤 아데노바이러스의 집적 정도를 LacZ 분석을 통해 관찰하였다. 도 9에서 관찰할 수 있듯이, 저장 완충액에 보존된 아데노바이러스는 LacZ의 발현이 급격하게 저해됨을 관찰할 수 있었으며, 특히 상온에서 24시간 동안 방치한 바이러스에서도 LacZ의 발현이 크게 감소함을 관찰할 수 있었다. 그러나 20% DMSO가 함유된 저장 완충액으로 보존된 바이러스의 경우 LacZ의 발현이 대조군 바이러스에 비해 전혀 저해되지 않음을 확인할 수 있었으며 상온에서 7일간 방치한 경우에서도 LacZ의 발현이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 DMSO가 아데노바이러스 집적을 저해하여 아데노바이러스 단백질의 구조적 안정성을 증가시켜줌을 확인할 수 있었다.

6. 아데노바이러스의 보존제로서의 DMSO의 활용도 검증

DMSO는 다양한 세포의 저온 보존 용액으로서 동결 과정 중에 과도한 탈수과정으로부터 세포를 보호하고 세포내 얼음 결정 형성을 억제하는 기능을 수행한다. 세포 저온 보존용액으로서의 그 유용성이 뛰어난 만큼 아데노바이러스의 보존능을 알아보기 위해, dl/LacZ 아데노바이러스를 4% 수크로스 또는 20%의 DMSO가 함유된 저장 완충액에 넣은 뒤 -80℃에 급속 냉동 후 각각 30분과 24시간 뒤 해동하여 LacZ의 발현을 관찰하였다. 도 10에서 볼 수 있듯이, 양성 대조군으로 사용된 4% 수크로스가 함유된 저장 완충액에서 보존된 아데노바이러스에 비해, 20%의 DMSO가 함유된 저장 완충액에서 보존된 아데노바이러스의 활성이 전혀 떨어지지 않음을 1483 두경부암 세포에서의 LacZ 발현량을 관찰함으로 알 수 있었다.

또한, DMSO에 의해 아데노바이러스의 장기적인 보존이 가능한지를 알아보기 위해, 수크로스가 포함된 저장 완충액 또는 20% DMSO가 포함된 저장 완충액에 아데노바이러스를 3.21 X 10¹² V.P의 역가로 넣어 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 동안 아데노바이러스를 -80℃에서 보관한 뒤, 동결 해동한 뒤 LacZ 분석을 실시하였다. 도 11에서 관찰할 수 있듯이, 20% DMSO가 함유된 저장 완충액에 보존된 아데노바이러스가 저장 완충액에 보존된 아데노바이러스에 비해 LacZ의 발현이 유사하거나 또는 근소하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

이상과 같은 결과들을 종합하여 볼 때, DMSO를 이용하여 아데노바이러스를 장기적으로 보존할 수 있으며, 현재 널리 쓰이고 있는 4% 수크로스 보존제보다 유전자 전달 효율도 증가시킬 수 있는 이점도 있음을 확인할 수 있었다.

7. DMSO에 의한 세포형태 변화 검증

DMSO 처리에 의한 세포의 형태학적 변화를 정밀하게 관찰하기 위하여, 주사전자 현미경(SEM)을 이용하여 세포 표면의 변화를 관찰하였다. H460 인체 폐암 세포주에 dl/LacZ 아데노바이러스를 50 MOI의 역가로 리포펙타민 또는 2% DMSO와 함께 병용투여하고 5분 또는 1시간 뒤 주사전자 현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다. 도 12a에서 볼 수 있듯이, dl/LacZ 아데노바이러스만을 단독으로 투여한 경우에는 아데노바이러스를 처리하지 않은 H460 세포와 세포 형태 또는 세포 표면이 유사하여 바이러스 감염에 의해 세포 표면 또는 형태는 거의 변하지 않음을 관찰할 수 있었다. 반면에, 리포펙타민을 처리한 세포의 경우에는, 세포표면에 많은 변화가 있었으며 특히 음성대조군에서 관찰된 세포 표면의 단백질들이 대부분 제거된 형태를 하고 있었다. 또한, 세포 표면에는 구멍들이 뚫려 있는 것도 관찰할 수 있었다. 하지만, 2% DMSO를 세포에 처리한 경우에는 세포 표면에 붙어있는 단백질들도 관찰되었으며, 리포펙타민을 처리한 경우처럼 세포막에 구멍이 뚫린 것은 관찰되지 않았다. 또한 투과전자 현미경(TEM)을 이용하여 이들 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 음성 대조군인 아데노바이러스를 처리하지 않은 H460 세포와 아데노바이러스를 단독으로 투여한 세포의 경우에는, 세포막이 온전하게 유지되어 있는 반면에, 리포펙타민을 병용 투여한 세포막은 손상이 일어나 세포막 일부분들이 떨어져 나가고 없는 것을 관찰할 수 있었다(도 12b). 이에 반하여, 2% DMSO를 아데노바이러스와 함께 병용 투여한 경우에는 세포막 손상이 관찰되지 않았으며, 이러한 결과는 앞서 관찰한 주사전자 현미경(SEM) 결과와 일치함을 확인할 수 있었다.

8. 종양 모델을 이용한 DMSO에 의한 생체내 유전자 전달 증대 효과 검증

EF43-fgf 마우스 유방암 모델을 이용하여 아데노바이러스와 DMSO의 병용 투여에 의한 유전자 전달 효율 증가 여부를 관찰하였다. 약 6주령의 웅성 BALB/C 마우스에 EF43-fgf 종양을 형성시키고 종양의 크기가 약 100-120 mm³ 정도로 자랐을 때, dl/LacZ 바이러스를 단독, 리포펙타민 또는 5% DMSO와 함께 이틀에 한번씩 3번 병용투여하고 마지막 바이러스 투여 후 3일경에 마우스 종양을 적출하여 X-gal 염색을 시행하였다. 도 13에서 볼 수 있듯이, 바이러스만을 투여한 경우에 비해 리포펙타민 또는 5%의 DMSO를 함께 병용 투여한 경우에서의 LacZ 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 특히 5% DMSO와 함께 병용 투여한 경우에서는 보다 넓은 부위의 종양조직에서 LacZ의 발현이 유도되고 리포펙타민을 함께 병용 투여한 경우보다도 아데노바이러스의 유전자 전달 효율이 크게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, DMSO의 병용투여에 따른 아데노바이러스의 유전자 전달효율 증가에 의해 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 항종양 효과가 증대될 수 있는지를 알아보기 위해, 인체 두경부암 FADU 세포주를 누드 마우스의 피하에 주사한 후 형성된 종양에 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔB7(1 X 10⁸ PFU)를 단독, 리포펙타민 또는 5% DMSO와 함께 아데노바이러스를 이틀에 한번씩 3번 병용 투여하여 아데노바이러스의 유전자 전달 효율 증가에 의한 항종양 효과가 증가되는지를 관찰하였다. 도 14a에서 볼 수 있듯이, 음성 대조군인 리포펙타민 또는 DMSO를 단독으로 투여했을 경우 종양이 급속하게 성장하여 27일 경에 각각 2001.66㎣, 2080.55㎣ 였으며, 바이러스를 단독으로 투여했을 경우에는 약 1078.28㎣ 정도 종양이 성장하였다. 이에 비해, DMSO와 바이러스를 병용 투여한 경우에는 종양의 크기가 약 574.86㎣로 종양의 성장이 크게 억제되었음을 확인할 수 있었다. 그러나 리포펙타민과 바이러스를 병용투여 했을 경우에는 바이러스를 단독으로 투여한 것에 비해 오히려 종양의 성장이 크게 증가하여 종양의 크기가 1903.03㎣로 성장하여 음성대조군과 종양의 크기가 비슷함을 관찰하였다. 종양 조직 내부의 변화를 좀 더 면밀히 관찰하기 위하여 H&E 염색을 실시하였다. 도 14b에서 볼 수 있듯이, Ad-ΔB7 아데노바이러스를 단독으로 투여한 경우에는 종양이 활발하게 성장하고 있음을 알 수 있었으며, 5% DMSO와 아데노바이러스를 병용 투여한 종양 조직에스는 종양의 크기가 현저하게 감소하였을 뿐 아니라 종양 내에 세포괴사가 많이 일어나 있음을 확인할 수 있었다. 하지만, 리포펙타민과 바이러스를 병용 투여한 경우에는, 종양의 크기가 감소되지 않았을 뿐 아니라, 종양 조직내에서도 암세포들이 활발하게 증식하고 있음을 종양의 성장이 활발하게 일어나고 있음을 관찰할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a는 두경부암 세포주인 FaDu, 1YB 및 QLL1에서 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 유전자 전달 효율을 조사한 X-gal 염색 결과를 보여주는 사진이다. “Ad”는 dl-Lac Z 아데노바이러스를 나타낸다.

도 1b는 두경부암 세포주인 CAL27, 피부암 세포주 A431, 유방암 세포주 MDA-MB-435과 MCF-7, 그리고 정상 섬유아세포 CBHEL과 IMR90에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 유전자 전달 효율을 조사한 X-gal 염색 결과를 보여주는 사진이다.

도 2a는 뇌암 세포주인 U87MG, U251N 및 U343에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 유전자 전달 효율을 조사한 X-gal 염색 결과를 보여주는 사진이다.

도 2b는 폐암 세포주 H1299, 전립선암세포주 DU145, 유방암 세포주 MDA-MB-231, 그리고 간암세포주 Huh7 및 Hep1에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 유전자 전달 효율을 조사한 X-gal 염색 결과를 보여주는 사진이다.

도 2c는 폐암세포주 H460 및 A549에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 유전자 전달 효율을 조사한 X-gal 염색 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 마우스 세포주인 흑색종세포주(B16F1, B16F10), 폐암세포주(CMT-64), 직장암세포주(CMT-93) 및 유방암세포주(EF43-fgf), 햄스터 난소세포주(Lec2)와 래트 세포주(YPEN)에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 유전자 전달 효율을 조사한 X-gal 염색 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 세포 살상능의 증가를 확인하기 위한 세포 병변 분석 결과를 보여준다. 인간 암세포주인 MCF-7, SJSA, HT1080, FADU, A431 및 U20S, 인간 정상 섬유아세포 CBHEL 및 IMR90를 이용하였다.

도 5는 CAR의 발현이 비교적 높은 세포주에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 세포 살상능의 증가를 확인하기 위한 세포 병변 분석 결과를 보여준다.

도 6은 마우스 및 래트 세포주에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 세포 살상능의 증가를 확인하기 위한 세포 병변 분석 결과를 보여준다.

도 7은 인간 암세포주에서 DMSO와 아데노바이러스의 병용투여에 따른 Ad-△B7 아데노바이러스의 생산량 증가를 보여주는 그래프이다. V.O, 아데노바이러스 단독투여; Lipo, 리포펙타민과 아데노바이러스의 병용투여; 1% DM: 1% DMSO와 아데노바이러스의 병용투여.

도 8은 DMSO에 의한 아데노바이러스의 구조적 안정성에 미치는 영향을 분석한 X-gal 염색 결과이다.

도 9a는 DMSO에 의해 아데노바이러스의 집적(aggregation)이 저해되는 지 여부를 분석한 X-gal 염색 결과이다. CNTL, 대조군으로서, dl/LacZ 아데노바이러스를 이용하였다. 저장 완충액은 10 mM Tris(pH 8.0), 2 mM MgCl₂ 및 4% 수크로스로 이루어져 있다.

도 9b는 DMSO에 의해 아데노바이러스의 집적이 저해되는 지 여부를 분석한 X-gal 염색 결과이다.

도 10은 DMSO에 의한 아데노바이러스의 단기 보존성을 분석한 X-gal 염색 결과이다.

도 11a 및 11b는 DMSO에 의한 아데노바이러스의 장기 보존성을 분석한 X-gal 염색 결과이다.

도 12a는 DMSO 처리에 따른 세포형태 변화를 관찰한 주사전자현미경(SEM) 사진이다.

도 12b는 DMSO 처리에 따른 세포형태 변화를 관찰한 투과전자현미경(TEM) 사진이다.

도 13은 EF43-fgf 유방암 세포주가 이식(xenotransplantation)된 마우스의 조직에 대한 H&E 염색(hemotoxyline-eosine staining) 결과 사진이다. 5% DMSO를 처리한 경우, 생체내 유전자 전달 효율이 증가하였음을 볼 수 있다.

도 14a 및 도 14b는 FaDu 두경부암세포주가 이식(xenotransplantation)된 마우스에서 5% DMSO와 아데노바이러스를 병용투여한 경우, 항종양 효능의 증가를 보여주는 그래프이다. 도 14b는 종양조직의 H&E 염색 결과 사진이다.

Claims (13)

1. 비양성자성 극성 용매를 유효성분으로 포함하는 아데노바이러스의 암세포로의 CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)-비 의존성 유전자 전달 효율 개선용 조성물.
2. (a) 아데노바이러스; 및 (b) 비양성자성 극성 용매를 포함하는 암세포로의 유전자 전달용 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 비양성자성 극성 용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide), DMF(dimethyl formamide), N-메틸피롤리돈, N-메틸모르폴린, γ-부티로락톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란 또는 헥사메틸포스포릭 트리아마이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 비양성자성 극성용매는 DMSO인 것을 특징으로 하는 조성물.
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6. (a) 아데노바이러스의 치료학적 유효량; (b) DMSO; 및 (c) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.
7. DMSO를 유효성분으로 포함하는 상온에서의 바이러스의 캡시드 단백질 안정성 개선용 조성물.
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10. 제 7 항에 있어서, 상기 캡시드 단백질에 의해 둘러싸여 있는 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 배시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 암세포는 뇌암 세포, 두경부암 세포, 흑색종양 세포 또는 방광암 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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