KR102543671B1 - 전자기장에 의한 항종양 효과가 증대된 아데노바이러스-pcion 복합체 - Google Patents

전자기장에 의한 항종양 효과가 증대된 아데노바이러스-pcion 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 외부 자기장이 인가된 조건 하에서, 페길레이션(PEGylation)된 자성나노파티클-카테콜 그래프트화 폴리-L-리신 가교체를 이용하여 항종양 아데노바이러스를 종양 세포 내로 도입하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, CAR-매개의 엔도사이토시스에 의한 아데노바이러스의 세포 내 유입에 비해 더욱 신속하고, 효율적으로 아데노바이러스를 세포 내로 전달할 수 있다.

Description

전자기장에 의한 항종양 효과가 증대된 아데노바이러스-PCION 복합체{Adenovirus-PCION Complex Having Enhanced Anti-cancer Effect by Using Electromagnetic Field}
본 발명은 외부 자기장이 인가된 조건 하에서, 페길레이션(PEGylation)된 자성나노파티클-카테콜 그래프트화 폴리-L-리신 가교체를 이용하여 항종양 아데노바이러스를 종양 세포 내로 도입하기 위한 조성물에 관한 것이다.
성공적인 암 유전자 치료는 독성이 없는 전달 시스템을 필요로 하고, 효율적인 형질 도입 및 이식유전자의 in vivo 발현을 얻을 수 있게한다. 아데노바이러스(adenovirus, Ad) 혈청형-5는 이의 높은 역가능(titer ability), 분할 및 비-분할 세포 모두에서의 높은 형질도입 효율 및 지놈 통합-매개의 돌연변이 생성의 부재로 인하여 임상 적용에서 널리 이용되어져 왔다. 몇몇의 임상 시험들이 암 유전자 치료를 위해 국소적으로 주입된 Ad의 성공적인 이용을 보고해왔다[1, 2]. Ad 기반의 암 유전자 치료는, 종래의 기술들보다 훨씬 우수한 암 세포-특이적 복제 항종양 Ad와 함께 발전을 계속해 왔다[3, 4]. 항종양 Ad는 자가-번식하고, 감염된 암 세포를 용해시키고, 감염된 세포 당 1000 내지 10000 카피의 자손을 생산하는 능력을 포함하는 많은 이점을 가지며, 이로써 종양에서의 인접 안 세포의 2차 감염의 원인이 된다[5]. 치료적 유전자-삽입된 항종양 Ad는 in vitro 및 in vivo에서 높은 유전자-전달 효율 및 잠재적 항 종양 효능을 보인다[6-8]. 그러나 Ad는 타겟 세포로의 유입을 위해 콕사키(coxsackie) 및 아데노바이러스 리셉터(CAR)에 의존하며, Ad-매개의 암 유전자 치료의 임상적 효능을 제한한다. 초기의 연구들은 낮은 CAR 발현을 갖는 세포들이 양호하지 못한 Ad 감염성을 보인다는 것을 밝혀왔다[9, 10]. 그러므로 CAR-음성 종양에서의 Ad의 형질도입 효율을 극복하는 것은 항종양 Ad의 치료적 효능을 향상시키는 필수적 단계이다.
현재 바이러스 및 비바이러스 성분의 장점들을 결합시킨 하이브리드 벡터가 개발되어있다[4, 11]. Ad의 CAR-의존성의 제한을 극복하기 위하여 제시된 하나의 전략은 Ad의 표면을 CAR-매개의 엔도사이토시스의 필요성이 없이 통과하는 폴리머로 개질시키는 것이다[12, 13]. 양이온성 폴리머[13-15] 또는 지질[16-18]로의 Ad 개질은 Ad-매개의 유전자 전달을 강화시킨다. 그러나 이러한 전략들은, 주입된 폴리머/지질-개질된 Ad가 급속도로 주변 비-타겟 조직들 내로 전파되기 때문에 타겟팅된 종양-특이적 Ad-매개의 유전자 전달을 도출해내지 않는다[19. 20].
자기장-강화된 전달이 이용될 때, 자기 나노입자들은 타겟 부위에서의 가속화된 벡터 축적을 제공한다. 이러한 접근은 입자 크기, 표면 전하 밀도, 및 치료적 약물 또는 유전자에 의한 표면 기능성을 조정하는 것에 의해 주문제작될 수 있고, 강화된 세포내 유입 및 복제 효율, 그리고 타겟 조직에 대한 특이적 전달의 결과를 얻을 수 있도록 한다[19-21, 23-25].
폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)-코팅된 초상자성 산화철(Fe3O4) 나노파티클에 대한 Ad 바이러스 커플링은, 이러한 벡터들이 외부 자기력(magnetic force, MGF)에 의해 영향을 받을 때 유전자 형질감염 효율을 향상시킨다[26]. 25 kDa PEI의 이용이 실질적인 세포 독성으로 인해 in vivo에서 제한된다는 점을 감안할 때, PEI-코팅된 초상자성 산화철 나노파티클-코팅된 Ad를 이용한 자기주입(magnetofection)은, 효율적이고 안전한 치료적 유전자의 전달을 위한 강한 플랫폼을 제공할 수 있다. 더욱이 자기 나노파티클 상의 PEI 코팅은 음이온성 뉴클레오티드, 예컨대 플라스미드 DNA 및 siRNA를 밀집 복합체 내로 밀집시키고, 양성자 스펀지 효과를 통한 엔도좀으로부터의 그들의 탈출을 가능케 한다[27, 28]. 자성 나노파티클에 의해 매개된 유전자 전달은 일반적인 폴리플렉스 형질감염에 비하여 더 높은 형질감염 효율을 나타낸다[20, 21]. Park et al(J.W. Park, K.H. Bae, C. Kim, T.G. Park, Clustered magnetite nanocrystals crosslinked with PEI for efficient siRNA delivery, Biomacromolecules 12 (2011) 457-465.)은 군집형성되고(clustered), 자기화되었으며(magnetize), PEI-캡슐화된, 초상자성 Fe3O4 입자가 자기 이력현상(magnetic hysteresis)을 나타냄이 없이 자화(magnetization) 특성을 향상시키고, 초상자성을 지속시킨다는 것을 보고하였다. 상술한 입자들은 세포 내의 더 빠른 침적 및 더 많은 축적을 유도하고, 약물 또는 유전자들을 MGF 하에서 신속하게 전달한다[29]. 게다가 PEG-코팅되고, 가교된, 산화철 나노입자(PCION)는 외부 MGF에 대한 응답으로 플라스미드 DNA를 간엽 줄기 세포 내로 효율적으로 전달하는 것으로 알려져 왔다[30].
본 발명은 항종양 Ad의 PCION과의 조합에 의한 in vitro 및 in vivo 치료학적 효능의 향상을 목적으로 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 항종양 아데노바이러스를 포함하면서, 항종양 아데노바이러스의 종양 세포 내 도입 효율을 향상시킨 항암치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 자성나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신을 포함하는 가교체를 페길레이션(PEGylation) 시킨 복합체에 항종양 아데노바이러스를 결합시킨 조성물의 경우, 외부 자기장의 인가에 의해 종양 세포 내로의 도입 효율이 월등하게 증가하는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항종양 아데노바이러스를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상호 결합된 (i) 자성나노파티클 및 (ii) 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신을 포함하고, 표면이 폴리에틸렌글리콜에 의해 페길레이션(PEGylation)된 가교체 및 (b) 상기 가교체와 결합된 항종양 아데노바이러스를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 항종양 아데노바이러스를 포함하면서, 항종양 아데노바이러스의 종양 세포 내 도입 효율을 향상시킨 항암치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 자성나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신을 포함하는 이온 가교체를 페길레이션(PEGylation) 시킨 복합체에 항종양 아데노바이러스를 결합시킨 조성물의 경우, 외부 자기장의 인가에 의해 종양 세포 내로의 도입 효율이 월등하게 증가하는 것을 규명하였다.
본 발명의 자성나노파티클은 수 나노미터 내지 수백 나노미터의 직경을 갖는 자기장에 감응하는 입자를 의미하고, 자기장에 감응하여 운동 특성을 제어할 수 있는 입자이기만 하면, 입자의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 자성 나노파티클은 1 nm 내지 200 nm의 입자 직경을 갖는다. 더욱 구체적인 일 구체예에서 본 발명의 자성 나노파티클은 1 nm 내지 50 nm의 입자 직경을 갖고, 다른 일 구체예에서 1 nm 내지 30 nm의 입자 직경을 가지며, 또 다른 일 구체예에서 1 nm 내지 20 nm의 입자 직경을 갖고, 또 다른 일 구체예에서 5 nm 내지 15 nm의 입자 직경을 갖는 자성나노파티클을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 바람직하게 본 발명의 자성 나노파티클은 마그헤마이트(Fe2O3), 마그네타이트(Fe3O4) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 "카테콜 그래프트화 폴리-L-리신"의 경우, 폴리-L-리신에 카테콜 기능기가 그래프트되어 있는 중합체를 의미하고, 일 구체예로서 폴리-L-리신의 일차 아민 그룹 및 카테콜 기능기 제공 화합물, 예컨대 하이드로카페산의 카복실산 그룹 사이의 화학적 커플링에 의한 컨쥬게이션을 통해 제조된 폴리-L-라이신(PLL)-3,4 디히드록시-1-페닐알라닌(DOPA)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신에 포함되는 폴리-L-리신은 수평균 분자량이 5×102 내지 3×105 인 것을 이용할 수 있다. 바람직하게는 수평균 분자량이 1×103 내지 1×105 인 것을 이용할 수 있으며, 더 바람직하게는 수평균 분자량이 5×103 내지 5×104 인 것을 이용할 수 있고, 더 바람직하게는 수평균 분자량이 1×104 내지 3×104인 것을 이용할 수 있다. 상술한대로 폴리-L-리신을 카테콜 기능기로 그래프트시키는 것은, 폴리-L-리신의 자성나노입자에 대한 강한 결합력을 부여하기 위함이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신은, 폴리-L-리신에 대한 카테콜 기능기 치환도가 5 내지 30인 것을 이용할 수 있다. 상술한 "폴리-L-리신에 대한 카테콜 기능기 치환도"는 100개의 L-리신 잔기당 결합되어 있는 카테콜 기능기의 수를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 가교체는 자성나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신이 10:1 내지 1:5의 중량비로 혼합되어 있는 것이다. 다른 일 구체예에서 자성나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신의 중량비는 5:1 내지 1:5이고, 또 다른 일 구체예에서 상기 중량비는 1:1 내지 1:5이다. 본 발명의 가교체는 자성나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신의 혼합에 의해 준비될 수 있으며, 보다 구체적으로 수중 유형(oil-in-water, O/W) 단일 에멀젼 및 증발 방법에 의해 제조될 수 있다. 구체적인 제조 방법에 대하여는 실시예 3을 참조할 수 있다. 본 명세서 상에서 언급된 자성나노파티클과 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신 간의 "상호 결합"은 상술한 제조 방법에 의해 형성될 수 있는 결합을 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "페길레이션(PEGylation)"은 폴리에틸렌글리콜을 이용한 표면 코팅을 의미하고, 본 발명의 상호 결합된 자성나노파티클과 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신의 노출된 표면의 잔여 아민 그룹들을 폴리에틸렌글리콜과 반응시켜 페길레이션시킬 수 있다. 본 발명의 가교체에 대한 페길레이션은 혈류 내에서의 자성나노파티클의 체류시간을 늘려주고, 자성나노파티클이 지닌 독성을 감소시켜주는 효과를 발휘한다.
본 명세서에서 "(a) 상호 결합된 (i) 자성나노파티클 및 (ii) 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신을 포함하고, 표면이 폴리에틸렌글리콜에 의해 페길레이션(PEGylation)된 가교체"는 PCION(PEGylated and cross-linked iron oxide nanoparticle)로 기재할 수 있다.
본 발명의 항종양 아데노바이러스는 세포 내 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터를 의미하는 것으로서, 종래 일반적으로 알려진 복제 불능 아데노바이러스 및 종양 세포 내 특이적으로 복제 가능하게 개발된 모든 아데노바이러스 벡터를 포괄하는 의미로 해석된다. 본 명세서 상에서 "아데노바이러스"는 간단히 "Ad"로 기재할 수 있으며, 특히 복제불능 아데노바이러스의 경우 "dAd"로 기재할 수 있다. 아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 항종양 효과를 얻기 위한 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)을 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 항종양 아데노바이러스의 항종양 효과 발현 또는 향상을 위한 외래 유전자는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 또한, 상기 외래 유전자 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스는 "프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열"구조를 가지며, 상기 "프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열"은 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다. 또한, "프로모터-첫 번째 목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열-IRES-두 번째 목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열"처럼 첫 번째 목적 뉴클레오타이드와 두 번째 목적 뉴클레오타이드가 IRES(internal ribosome entry site)에 의해 연결된 바이시스트론(bicistronic) 발현 시스템에 의해서도 발현될 수 있다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료는 매우 안전할 것으로 판단된다.
항종양 아데노바이러스의 경우, CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)를 통하여 세포 내로 감염되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 뇌암 세포, 두경부암 세포, 흑색종양 세포 및 방광암 세포 등의 경우 CAR의 발현이 낮기 때문에, 항종양 아데노바이러스에 의한 종양 치료에서 하나의 장벽이 되고 있다. 또한, CAR의 발현이 높은 세포의 경우에도, 항종양 아데노바이러스의 감염율을 높이는 것은 암 치료에 큰 도움이 된다.
본 발명은 이러한 암 치료의 장벽을 극복할 수 있도록 한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 외부 자기장의 인가 환경 하에서 사용하는 경우, CAR-비의존적으로 항종양 아데노바이러스를 세포 내로 도입시킬 수 있다. 본 발명의 외부 자기장의 인가는, 바람직하게 아데노바이러스를 전달하고자 하는 종양세포에 대한 국소적 자기장 형성일 수 있고, 보다 구체적으로는 본 발명의 조성물에 대한 종양 세포 방향으로의 자력의 인가를 의미한다. 본 발명의 자기장의 인가와 관련하여 자기주입(magnetofection) 방법에 관한 논문은 Kazumasa et al. Biomaterials (30):1809-1814(2009), Jonathan et al, Journal of Clinical Neuroscience 19:875-880(2012)의 내용이 참조로서 삽입된다. 본 발명에서 항종양 아데노바이러스에 의해 세포 내로 운반될 수 있는 외래 유전자 서열은 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자[예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자(costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)], 항원성 유전자, 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자가 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다.
자살 유전자는 세포가 외부 인자에 의해 살상되기 쉽도록 유도하는 물질을 발현하거나 세포에 독성 조건을 유발하는 핵산 서열이다. 이러한 자살 유전자로 잘 알려진 것은 티미딘 키나제(TK) 유전자이다(미국특허 제5,631,236호 및 제5,601,818호). TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간사이클로비르(gancyclovir)의 투여에 의해 선택적인 사멸에 민감하다. 종양 억제 유전자는 종양의 형성을 억제하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 가리킨다. 종양 억제 유전자는 포유동물에서 자연발생 유전자이며, 이 유전자의 결실 또는 불활성화는 종양 발생에 필수 전제인 것으로 믿어지고 있다. 종양 억제 유전자의 예로는 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2, 망막아세포종 유전자(Lee et al. Nature, 329:642(1987)), 선종양 폴립증 장 단백질(adenomatous polyposis coli protein; 미국특허 제 5,783,666 호), 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자(Cheng et al. Proc. Nat .Acad. Sci., 95:3042-3047(1998)), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 및 p21을 포함한 종양 억제 유전자의 INK4 계열의 일원 및 이의 치료학적으로 유효한 단편(예, p56Rb, p94Rb 등)이 포함된다. 당업자는 상기 예시된 유전자 외에 기타 알려진 항종양 유전자 모두가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 용어 "항원성 유전자 (antigenic gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 및 PSA(prostate specific antigen), AFP(α-feto protein), p53(WO 94/02167)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제 I 형 항원에 결합시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포독성 유전자(cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자(WO 97/16459 및 WO 96/30385) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 항종양 효과를 돕기위한 수단으로서, 본 발명의 아데노바이러스에 의해 운반될 수 있다. 예를 들면, 사이토카인(예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨(예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자(예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹(단핵구 화학 주성단백질 1(MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2(MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3(MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4(MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β(MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ(MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α(MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인(ELC), 대식구 염증성 단백질 4(MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5(MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론(p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인(TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테롤 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "친-세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF-, TRAIL, p53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.
또한, 본 발명자들에 의해 아데노바이러스 유전자 치료에 적합한 것으로 규명된 릴랙신 유전자 또는 데코린 유전자도 유전자 전달체에 의해 세포내로 운반될 수 있는 유전자이다.
상술한 목적의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 서열 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 가교체와 항종양 아데노바이러스 간의 결합은 가교체 표면의 양전하 특성과 아데노바이러스의 음전하 특성에 기인한다. 본 발명의 가교체 표면의 페길레이션 과정 후, 잔존하는 양전하성 표면 부분에 아데노바이러스가 결합을 형성할 수 있고, 복수의 아데노 바이러스 및 복수의 페길레이션된 가교체가 상호 결합되어 집합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 가교체와 본 발명의 항종양 아데노바이러스의 몰비율은 1:1 내지 1:5×107이다. 상기 몰비율은 항종양 아데노바이러스의 종류 및 특성 등에 따라 적절히 선정 가능하며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 타겟 종양 세포에 대한 외부자기장(MGF)의 인가에 의해 종양 세포 내로의 유입률이 향상되는 것이다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 외부 자기장(MGF)의 인가 환경에서 본 발명의 조성물을 주입하면, CAR 발현에 의존하지 않고, 종양 세포 내로의 아데노바이러스 전달 효율을 유의하게 향상시킬 수 있다. 이는 아데노바이러스의 의한 항종양 효과가 크게 증대됨을 의미한다. 이러한 항종양 효과의 향상은 복제 가능 재조합 아데노바이러스 및 복제 불능 재조합 아데노바이러스 모두에서 관찰된다.
아데노바이러스를 이용한 효과적인 항종양 효과를 유도하기 위해서는 빠른 속도로 성장하는 암세포에 비하여 보다 빠른 바이러스의 증식과 인접세포로의 확산을 통해 효과적인 세포 살상효과를 유발시킬 수 있어야 한다. 또한, 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료가 성공적으로 이루어지기 위해서는 높은 치료효과와 함께 안전성을 높이기 위한 방안이 개발되어야 한다. 본 발명에서 개발된 비양성자성 극성 용매의 병용 투여 방법은 아데노바이러스의 세포 내 감염속도를 크게 증가시켜 항종양 효과를 현격히 증대시킨다. 이는 결과적으로 암치료에 필요한 바이러스 투여량을 감소시킬 수 있어 바이러스에 의한 생체내 독성과 면역반응을 크게 줄일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 외부자기장의 인가에 의해 간 굴성(tropism)이 감소되는 것이다. 본 명세서 상의 용어 "간 굴성(tropism)"은 일반적인 양이온성 폴리머 및 네이키드 아데노바이러스에 내재된 특성으로서, 체내 주입된 양이온선 폴리머 또는 네이키드 아데노바이러스가 주로 간(liver)으로 이동하는 특성을 의미한다. 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 외부 자기장에 의한 자기적-가이드된 전달을 이용하는 경우, 그렇지 않는 경우에 비해 종양 대 간 유입율(tumor-to-liver uptake ratio)에서 450배의 증가를 나타내었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물에 포함되는 아데노바이러스가 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 상술한 다양한 암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서 상의 용어 "치료"는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 종양은 아데노바이러스 리셉터(CAR)-음성 종양이다. 자기장 인가 조건 하에서 본 발명의 조성물을 이용하여 아데노바이러스를 운반하는 경우, 아데노바이러스는 종래 알려진 CAR 경로를 통하지 않고도 세포 내로 도입될 수 있으며, 따라서, CAR-음성 종양에 대하여도 효율적으로 적용할 수 있다. 다만, 이는 CAR-음성 종양에 대하여도 적용할 수 있다는 의미이며, CAR-양성 종양에 대하여도 적용할 수 있는 것은 자명하다. CAR-음성 종양의 경우, 아데노바이러스의 세포 내 도입율이 현저히 저하되므로, 본 발명의 조성물을 이용한 자기주입법에 의해 아데노바이러스의 세포 내 도입율을 유의하게 향상시킬 수 있고, 이는 특히 CAR-음성 종양에 대하여 효과적으로 본 발명인 조성물의 적용이 가능하다는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 외부 자기장이 인가된 상태에서 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여하거나, 또는 상술한 투여 후 외부 자기장의 인가에 의해 본 발명의 조성물이 종양 세포 내로 유입되도록 가이드할 수 있다. 구체적으로는 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주사 방법(injection)으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1×105-1×1015 pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1×1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사하여 투여할 수 있으나, 상술한 다양한 요인들을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 항종양 아데노바이러스를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물을 자기주입(magnetofection)에 이용하는 경우, CAR-매개의 엔도사이토시스에 의한 아데노바이러스의 세포 내 유입에 비해 더욱 신속하고, 효율적으로 아데노바이러스를 세포 내로 전달할 수 있다.
(c) 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 항종양 Ad 고유의 바이러스 복제율 및 암 세포 항종양효과를 저해함이 없이, Ad가 세포 유입 되도록 할 수 있다.
도 1의 A는 PCION의 세포 독성을 나타낸다. HeLa 세포를 MGF하에서 PBS, 25 kDa PEI, 또는 PCION으로 24시간 동안 처리하였고, 세포 생존능을 CCK-8 분석을 통해 처리 48시간 후에 측정하였다. 결과를 PBS 단독의 음성 대조구 세포들에 대하여 정규화시켰다. 각각의 값들은 3회 독립 실험들의 평균±SD로 나타내었다(실험당 n=3). 도 1의 B는 MGF의 유무에 따른 로다민-표지된 PCION의 HeLa 세포 내로의 세포 유입을 나타낸다. DAPI로 핵(Nuclei)을 염색하였다. DIC(Diifferential interference contrast)는 차등간섭대비를 나타낸다. 도 1의 C는 U343, MCF7 및 B16F10 세포를 MGF의 유무 하에서 PCION으로 15분간 처리하고, PBS로 세척한 뒤, 철 염색 키트를 이용하여 염색한 결과를 나타낸다.
도 2의 A는 MGF의 존재 또는 부존재하에서 dAd 또는 dAd-PCION 복합체(2×105, 5×105, 2×106, 또는 5×106 몰 비율의 PCION 폴리머:dAd 파티클)의 도입 효율을 나타낸다. 도입 효율은 GFP 발현에 의해 측정하였다. 결과들은 3회 실험의 평균 GFP 발현(임의 형광 유닛(arbitrary fluorescence units))±SD를 나타낸다. MGF 부존재 하의 dAd-PCION에 대하여 ***P<0.001이다. 도 2의 B는 네이키드 dAd 및 dAd-PCION 복합체의 평균 사이즈 분포 및 제타 포텐셜을 나타낸다. 사이즈 및 전하는 5회 독립 실험의 평균±SD로 측정하였다. 도 2의 C는 PBS(pH 7.4) 내의 dAd, PCION 또는 dAd-PCION 복합체(5×106 PCION 폴리머:dAd 입자 몰비율)의 TEM 이미지를 나타낸다. 도 2의 D는 dAd-PCION(5×106 PCION 폴리머:dAd 입자 몰 비율) 복합체의 콜로이드 안정성을 나타낸다. dAd-PCION의 평균 사이즈를 PBS 내에서 7일까지 측정하였다. 사이즈는 5회 독립 실험의 평균±SD로 측정하였다.
도 3의 A는 암 세포주 A549, U343, SK-BR3, MCF7 및 B16F10에 대한, MGF의 존재 또는 부존재 하의 네이키드 dAd 또는 dAd-PCION의 형질도입 효율을 나타낸다. 세포주 A549, U343 및 SK-BR3를 10 MOI에서 형질도입시켰고, 세포주 MCF7 및 B16F10는 100 MOI를 이용하였다. 형질도입된 세포(PCION 폴리머:dAd 입자의 5×106 몰 비율을 이용하여 제조한 dAd-PCIONs)의 대표 형광 현미경 이미지이다. 본래의 배율(original magnification)은 100×이다. 도 3의 B는 유동 세포 분석법을 이용하여 측정한 GFP 발현을 나타낸다. 결과들은 3회 독립 실험의 평균±SD를 나타낸다. MGF 부존재하에서의 dAd-PCION에 대하여 ***P<0.001이다. 도 3의 C는 30% 인간 혈청의 존재 또는 부존재하의 네이키드 dAd 또는 dAd-PCION의 형질도입 연구를 나타낸다. 혈청의 존재 또는 부존재하에서의 dAd 또는 dAd-PCION의 45분간 배양 후, A549 세포를 네이키드 dAd 또는 dAd-PCION 복합체로 MGF의 존재하에서 24시간(dAd) 또는 15분(dAd-PCION)간 형질도입시켰다. 세포들을 형광 현미경으로 형질도입 24시간 후에 관찰하였다. 본래의 배율은 100×였다. 결과들은 3회 실험의 평균±SD를 나타낸다. 혈청의 부존재하 dAd에 대하여 ***P<0.001이다.
도 4는 대조구로서의 MGF 부존재하의 PBS 및 dAd-PCION과 함께, MGF의 존재하 dAd, PCION, 또는 dAd-PCION의 세포내 유입의 TEM 이미지를 나타낸다. U343 세포를 dAd, PCION, 또는 dAd-PCION 복합체(각각 100 MOI)로 처리 15분 후 TEM에 의해 분석하였다. 나타낸 데이터는 3회 독립 실험을 나타낸다. 본래의 배율: ×5000 및 ×20000.
도 5의 A는 MGF의 존재 또는 부존재하의 HmT 또는 HmT-PCION의 암 세포 사멸 효과를 나타낸다. A549, U343, SK-BR3, 및 C33A 세포에 대한 2 또는 5 MOI 및 MCF7 및 B16F10 세포에 대한 200 MOI에서의 HmT 또는 HmT-PCION을 이용하여 세포들을 감염시켰다. 감염 48시간 후, 세포 생존능을 MTT 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 3회 실험의 평균±SD를 나타낸다. **P<0.01, ***P<0.001. 도 5의 B는 MGF의 존재 또는 부존재하에서의 HmT 또는 HmT-PCION의 바이러스 생산을 나타낸다. U343 및 MCF7에 대해 각각 5 및 500 MOI로, MGF의 존재 또는 부존재하에서 HmT 또는 HmT-PCION에 의해 U343 및 MCF7 세포를 감염시켰다. 2일 후, 세포 용해물 내의 총 바이러스 수율을 정량적 PCR에 의해 측정하였다. 데이터는 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다. *P<0.05, ***P<0.001.
도 6의 A는 MGF의 존재 또는 부존재하에서의 HmT 또는 HmT-PCION 복합체의 항종양 효능을 나타낸다. MCF7 종양을 누드 마우스 내로 피하주입하여 이종이식하였다. 종양 사이즈가 100-12 mm3이 되었을 때, 마우스를 MGF 존재 하 PBS, MGF 존재 하 HmT, 또는 MGF의 존재 또는 부존재 하 HmT-PCION으로 단일 종양내 주입에 의해 처리하였다. N=6 마리/그룹이었다. 데이터는 평균±SD를 나타낸다. 처리 30일 후에서의 *P<0.05, MGF 존재 하의 PBS 또는 HmT에 대한 MGF 부존재 하의 HmT-PCION, 및 ***P<0.001, MGF 부존재하의 HmT-PCION에 대한 MGF 존재 하의 HmT-PCION. 도 6의 B는 MCF7 종양-함유 마우스의 생물형광 전체-바디 이미징을 나타낸다. 피하 MCF7 이종이식 종양을 갖는 마우스를 MGF 존재 하의 PBS, MGF 존재 하의 HmT, 또는 MGF의 존재 또는 부존재 하의 HmT-PCION로 종양 내 주입하였다. 생물형광 이미징을 처리 48시간 후에 수행하였다. 평균 광학 시그널 강도는 관심있는 영역에서 초당 얻어진 광자로서 표현된다.
도 7은 H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색된, PCNA(proliferating cell nuclear antigen) 또는 E1A에 대하여 면역 염색된, 또는 철 성분에 대해 염색된 각각의 그룹으로부터의 종양 구획의 현미경 사진을 나타낸다. 이미지들은 4회의 독립 실험을 나타낸다. 본래의 배율은 400×이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
시험 재료 및 방법
실시예 1: 세포 배양 및 아데노바이러스(Ad) 제조
모든 암 세포주들(Hela, U343, A549, SK-BR3, MCF7, 및 B16F10)을 10% 태아 소 혈청(FBS; Gibco-BRL) 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO2 함유의 습한 조건에서 배양하였다. 인간 경부암 세포주(human cervical cancer cell line, HeLa), 뇌암 세포주(U343), 폐암 세포주(A549), 유방암 세포주(SK-BR3 및 MCF7), 및 배아 신장 세포주(embryonic kidney cell line, HEK-293), 및 마우스 흑색종 암 세포주(melanoma cancer cell line, B16F10)를 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(the American Type Culture Collection)으로부터 구입하였다. 마그네토펙션(Magnetofection)-매개의 in vitro Ad 유전자 전달 효율을 GFP-발현의 복제-불능 Ad(dAd)를 이용하여 시험하였다[12]. HmT는 암-특이적 변형된 TERT 프로모터 및 저산소-반응성 엘리먼트의 제어하에서 복제하는 반딧불이 루시퍼라아제-발현 항종양 Ad이다. 아데노바이러스들을 HEK-293 세포들에서 번식시켰고, CsCl 구배 원심분리에 의해 정제시켰다. 바이러스성 입자들(Viral particles, VP)을 260 nm에서의 광학 농도 측정을 이용하여 계수하였고, 1 흡수성 유닛(absorbency unit)(OD260=1)은 1.1×1012 VP/ml과 균등하였다. 정제된 바이러스들은 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
실시예 2: 실험 재료
메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-석신이미딜-석시네이트(mPEG-SS, MW 2000)을 Sun Bio 사로부터 구입하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드를 Tokyo Chemical Industry 사로부터 구입하였다. 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(PLL, MW 25000), 하이드로카페산 및 로다민 B 이소싸이오시아네이트(MW 536.08)을 Sigma Aldrich로부터 입수하였다. CCK-8(the Cell Counting Kit-8)을 Dojindo Molecular Technologies 사로부터 구입하였다. 투석 멤브레인을 Spectrum Laboratories 사로부터 입수하였다. DMEM, RPMI 1640 배지, 둘베코 인산-완충된 식염수(PBS), FBS, 페니실린/스트렙토마이신, 및 트립신을 Gibco-BRL로부터 입수하였다. 10-nm 직경 이하 크기의 산화철 나노파티클을 National Creative Research Initiative Center for Oxide Nanocrystalline Materials 및 서울 대학교 화학 생물 공학부로부터 얻었다.
실시예 3: 페길레이션되고(PEGylated) 가교된 산화철 나노파티클(PCION)의 합성
카테콜-그래프트화된 PLL(PLL-DN) 폴리머들을 하이드로카페산으로부터의 카복실 산 그룹과 PLL의 일차 아민 그룹의 화학적 커플링에 의해 합성하였다. 2 mL의 메탄올에서 용해시킨 EDC(65 mg, 350 mmol)를 하이드로카페산(55.2 mg, 350 mmol)을 함유하는 2 mL의 DMF 용액과 천천히 반응시켰다. 반응물을 2 mL의 메탄올내로 분산된 PLL(100 mg, 4 mmol) 내로 첨가시킨 뒤, 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 폴리머를 HCl 용액(pH 4)에 대해 투석 멤브레인(3000 Mw 컷오프)으로 2일간 투석시킨 뒤, 감압 동결건조(lyophilized) 시켰다. 화학 구조 및 카테콜 그룹의 치환도를 1H-NMR 분광학(400 MHz에서 작동하는 Brucker DRX 400 분광계)을 이용하여 확인하였다.
가교된 산화철 나노파티클(cross-linked iron oxide nanoparticle, CION)을 수중 유형(oil-in-water, O/W) 단일 에멀젼 및 증발 방법에 의해 합성하였다. 산화철 나노파티클의 안정도를 높이기 위해서 올레산으로 코팅된 산화철 나노파티클 2 mg을 함유하는 클로로포름 용액 1 mL를 10 mL의 탈이온수 내에 분산된 PLL-DN 20 mg에 대해 첨가하였다. 동시에, 수중 유형(O/W) 에멀젼 적용을 위해, 혼합을 5분 동안 팁-타입 브랜손 소니피어(tip-type Branson sonifier)를 통해 30의 듀티 사이클(duty cycle) 및 3의 출력(output)으로 수행하였다. 감압 하에서 유기 용매를 증발시킨 후에, 결합되지 않은 PLL-DN 폴리머 및 남아있는 용매를 Amicon® Ultro-4 원심분리 필터(100 kDa의 Mw 컷오프)로 초미세 필터링(ultrafiltration)에 의해 제거하였다. 페길레이션된 CION(PCION)의 합성을 위해, 정제된 CION 2 mg을 1 mL의 탈이온수 내에 용해된 200μg의 mPEG-SS(Mw 2000)과 반응시킨 뒤, 이 용액을 Amicon® Ultra-4 원심분리 필터(100 kDa의 Mw 컷오프)를 이용하여 정제하여, 남아있는 mPEG-SS 폴리머를 제거하였다. 더욱이 200 μg의 PCIONs와 200 μL의 DMSO 내에 분산된 2 μg의 로다민 B 이소싸이오시아네이트의 컨쥬게이션에 의해 로다민 표지된 PCIONs를 제조하였다. 24시간 동안 반응 시킨 뒤, 최종 생성물을 탈이온수 내에서의 몇 회의 분산 및 원심분리에 의해 세척하였다.
실시예 4: In vitro 세포 생존력 분석 및 세포 내 PCION의 흡수
PCIONs의 독성을 확인하기 위해, 형질감염 실험에 앞서 24시간 동안 37℃에서 10%(v/v) FBS로 보충된 DMEM 내의 96-웰 플레이트(1×104 세포/웰) 내로 HeLa 세포를 분주하였다. HeLa 세포를 외부 자기장을 이용하여 1일간 0.01 μg/ml 내지 10 μg/ml 농도의 25 kDa PEI 또는 PCION 함유 DMEM으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포 생존능을 제조자의 지침에 따라 CCK-8 분석에 의해 평가하였고, 무처리 세포와 비교하였다.
PCION의 세포 내 흡수를 가시화하기 위해, 로다민-컨쥬게이션된 PCION(PCION-로다민)을 4-챔버 조직 배양 슬라이드 내에서 HeLa 세포(1×105 세포/웰) 내로 형질감염시켰다. 세포들을 15분 간 70-250 mT의 장 강도 및 50-130 T m-1의 구배를 갖는 영구 자석(MagnetoFACTOR 플레이트; chemicell GmbH)의 존재 또는 부존재하에서 배양시켰다. 처리된 세포들을 2회 PBS 용액으로 세척하였고, 1% 포름알데히드/PBS 용액으로 30분간 고정시켰으며, 세포들을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM510; Carl Zeiss Meditec AG)으로 관찰하였다. 철 염색을 위해 U343, MCF7 및 B16F10 세포를 처리 24 시간 전, 5×104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하였다. 그런 뒤 세포들을 5 μg/ml의 PCION으로 15분간 영구 자석(MagnetoFACTOR 플레이트)에 노출시키거나 노출시키지 않은 상태로 처리하였다. PCION-처리된 세포들을 PBS로 2회 세척하였고, 철 염색 키트(HT-20, Sigma Aldrich)로 평가하였다.
실시예 5: Ad-PCION 복합체의 물리화학적 특성화
Ad-PCION 복합체를 제작하기 위하여, Ad 입자(2 × 1010 VP/PBS, pH 7.4)를 다양한 농도의 PCION 폴리머와 혼합하였다. 그 결과 Ad 입자 당 2×105, 5×105, 2×106 및 5×106 PCION 비율이 되었다. 사용하기 전에 용액을 실온에서 30분 동안 반응하였다.
dAd-PCION 복합체(5×106 몰 비율)의 유체역학 직경 및 표면 전하를 He-Ne 레이저를 구비한 동적 광 산란 기구(Zeta-Plus)에 의해 632 nm 파장에서 측정하였다. PBS 내의 콜로이드 안정성을 시험하기 위해, dAd-PCION의 크기를 7일간(0, 1, 3 또는 7일) 측정하였다. 추가적으로, dAd-PCION 복합체의 크기 및 형태를 TEM(transmission electron microscopy)(The FEI TecnaiTM F20)을 통해 관찰하였다.
실시예 6: Ad-PCION 복합체의 형질도입 효율
MGF를 이용하거나 이용하지 않는, dADs 또는 dAd-PCION 복합체의 형질도입 효율을, CAR-positive A549, U343, 및 CAR-negative MCF7 및 B16F10 세포 내에서 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의한 GFP 발현 정량에 의해 측정하였다. 각 세포 주를 감염 24 시간 전 24-웰 플레이트 내에 5×104 세포/웰로 분주하였다. 세포들을 네이키드(naked) dAds 또는 dAd-PCION 복합체로 10(A549, U343, SK-BR3) 또는 100(MCF7, B16F10) 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)로 15분간, MGF의 존재 또는 부존재하에서 형질도입시켰고, 그 후 배지를 5% FBS를 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 형질 도입 24 시간 후, 세포들을 형광 현미경(Olympus IX81; Olympus Optical)에 의해 관찰하였다. 세포들을 또한 BD FACScan analyzer(Bection-Dickinson Biocsiences)로 CellQuest 소프트웨어(Becton-Dickinson)를 이용하여 관찰하였다; 10000회 시행으로부터의 데이터를 추가적인 분석을 위해 수집하였고, 상대적인 형광 강도의 값을 나타내었다.
실시예 7: 혈청 안정성 테스트
형질도입 효율 상의 혈청의 효과를 시험하기 위해, PCION(dAd 및 dAd-PCION)과 복합되거나 복합되지 않은 GFP-발현 Ad를 인간 혈청의 존재 또는 부존재하에서 37℃에서 45분간 배양하였다. A549 세포(5×104 세포/웰)를 네이키드 dAd 또는 dAd-PCION 복합체로 20 MOI에서 24 시간 동안(dAd) 또는 MGF의 존재하에서 15분간(dAd-PCION)배양시켰고, 그 후 배지를 5% FBS를 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 형질도입 24시간 후, 세포를 형광 현미경(Olympus IX81)로 관찰하였다. 세포들을 BD FACScan analyzer(Becton-Dickinson)로 CellQuest 소프트웨어(Becton-Dickinson)를 이용하여 관찰하였다; 10000회 시행으로부터의 데이터를 추가적인 분석을 위해 수집하였고, 상대적인 형광 강도의 값을 나타내었다.
실시예 8: TEM 이미징에 의한 Ad-PCION 복합체와 세포막의 상호작용의 평가
U343 세포를 5×104 세포/웰로 24-웰 플레이트에 24시간 동안 분주하였다. 이어서 세포들을 MGF의 존재하에서 PBS, 네이키드 dAd(100 MOI), PCION(100 MOI) 또는 dAd-PCION(100 MOI)을 가지고, 또는 MGF의 부존재하에서 dAd-PCION(100 MOI)을 가지고 15분간 처리하였다. 세포들을 PBS로 세척하였고, 3% 글루타르알데히드 및 2% 포름알데히드를 함유하는 카코딜레이트 버퍼(0.1 M)로 고정시켰으며, TEM을 위해 처리하였다[13]. RMC MT-6000 XL 마이크로톰을 90-nm-두께 구획들을 수집하기 위해 이용하였다. 세포 구획들을 가시화시켰고, JEM-2000EX ll TEM(JEPL; Nikon Corp.)로 캡춰하였다.
실시예 9: MTT 분석
MGF의 존재 또는 부존재하의 HmT 또는 HmT-PCION의 암 세포 사멸 효과를 평가하기 위해, U343, SK-BR3, MCF7, B16F10, 및 C33A 세포들을 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 배양이 50% 컨플루언스에 도달했을 때, 세포들을 네이키드 HmT 또는 HmT-PCION(A549, U343, SK-BR3 및 C33A에 대해 2 또는 5 MOI, 그리고 MCF7 및 B16F10 세포에 대해 50 또는 200 MOI)으로 15분간 MGF의 존재 또는 부존재하에서 감염시켰다. 감염 후, 배지를 5% FBS-함유 배지로 교체하였고, 37℃에서 배양시켰다. 감염 2일 후, PBS 내의 2 mg/ml의 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma Aldrich) 200 μL를 각 웰에 첨가시켰고, 37℃에서 4시간동안 배양시켰다; 그 후, 상청액을 제거하였고, 침전물을 1.0 ml 디메틸설폭사이드에 용해시켰다. 그런 뒤 플레이트를 마이크로플레이트 리더 상에서 540 nm에서 판독하였다. PBS-처리된 세포를 동시에 음성 대조군으로 분석하였다.
실시예 10: In vivo 항-종양 효능
HmT 및 HmT-PCION의 항종양 효과를 측정하기 위해, MGF의 존재 또는 부존재하에서, MCF7 이종이식(xenograft) 종양을 1×107 세포를 6 내지 8주령의 암컷 무 흉선 누드 마우스(Charles River Korea Inc.)의 복부에 피하 주입하는 것에 의해 확립시켰다. 종양이 100-120 mm3 부피에 다다른 뒤, 마우스들은 네 그룹으로 무작위 배치시켰고, MGF를 이용하여 30 μl의 PBS를, MGF를 이용하여 HmT(5×1010 VP)를, 또는 MGF를 이용하거나 이용하지 않고 HmT-PCION(5×1010 VP)를 종양 내로 주입하였다. 종양 성장을 처리 후 매 2일 마다 캘리퍼를 이용하여 측정하였다. 종양의 길이(L) 및 너비(W)를 측정하였고, 종양 부피를 하기 계산식에 따라 계산하였다:
종양 부피=0.523 LW2.
실시예 11: 조직학적 및 면역조직화학적 분석
MGF를 이용한 PBS, MGF를 이용한 HmT(5×1010 VP), 또는 MGF를 이용하거나 이용하지 않은 HmT-PCION(5×1010 VP)을 종양 내 주입 72 시간 후 MCF7 종양 조직을 획득하였다. 획득한 종양 조직을 10% 포르말린으로 고정시켰고, 파라핀-침지시켰으며, 5 μm 구획들을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였으며, 현미경으로 분석하였다. 종양 구획들을 또한, 각각 종양 세포 증식 및 종양 내의 Ad 복제를 나타내는 항-마우스 증식 세포 핵 항원(PCNA)(Dako 사) 또는 항-E1A(Santa Cruz Biotechnology) 항체로 염색하였다. 면역조직화학적 구획들은 마이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 대조염색하였다.
실시예 12: In vivo 몸 전체 생물발광 이미징
MCF7 종양 부피가 대략 150-200 mm3에 이르렀을 때, 종양-포함 마우스에 MGF를 이용한 PBS, MGF를 이용한 HmT(5×1010 VP), 또는 MGF를 이용하거나 이용하지 않은 HmT-PCION(5×1010 VP)를 종양 내 주입하였다. 처리 48시간 후 생물발광 이미징을 수행하였다. 마우스를 산소 및 D-루시페린(150 mg/kg; Caliper Life Sciences Inc.) 내의 2% 이소플루레인으로 채워진 챔버 내에서 마취시켰고, IVIS II 이미징 시스템(Caliper Life Sciences)을 이용하여 사진 및 발광 이미지를 얻었다. 관심있는 모든 몸 영역으로부터 백그라운드 추출(광자 flux/sec) 후 각 마우스에 대한 똑바로 누운 자세와 엎드린 자세의 합으로서 In vivo 생물발광 신호를 계산하였다.
실시예 13: 통계학적 분석
데이터는 평균±표준 편차(SD)로 나타내었다. 통계학적 비교를 StarView 소프트웨어(SAS Institute) 및 Mann-Whitney 비모수 테스트를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성을 정의하는 기준은 P<0.05였다.
실험 결과
1. PCION 클러스터의 제조 및 특성화
페길레이션된 자철석 나노파티클 클러스터(PCIONs)를 종래 알려진대로[30] 제조하였다. 요컨대, 분지형 PLL의 일차 아민 그룹 및 하이드로카페산의 카복실 산 그룹 사이의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 커플링 화학을 통하여 분지형 PLL과 DOPA를 컨쥬게이션시킴으로써, 폴리-L-라이신(PLL)-3,4 디히드록시-1-페닐알라닌(DOPA)의 합성을 수행하였다. 폴리-L-리신에 대한 카테기능기 치환도를 확인 결과 17 의 치환도를 나타내었다. 양성 대조구로서 이용된 25 kDa PEI와 함께, 생성된 PCION의 내재된 독성을 측정하기 위해 CCK-8 분석을 이용하였다(참조: 도 1a). 0.01에서부터 10 μg/ml까지 다양한 PCION 농도는 심지어 가장 높은 농도에서도 세포독성을 보이지 않았다. 현저히 대조적으로, 세포를 10 μg/ml의 25 kDa PEI로 처리시, 세포 생존능은 16.5%까지 유의하게 감소하였고, 25 kDa PEI의 유의한 독성을 확인하였다. 이전의 연구들은 많은 양이온성 아민 그룹을 함유하는 높은 분자량 화합물, 예컨대 분지형 PLL은 세포 막 생물학적 기능을 방해하는 것에 의해 세포 독성을 유도함을 보여주었다[31]. 양이온성 아민 그룹의 세포 독성에 대한 주요 역할이 알려졌고, DOPA 및 PEG의 컨쥬게이션으로 인한 PCION의 표면에서의 프리 아민의 감소가 낮은 PCION 세포독성의 결과를 낳은 것으로 추측된다.
2. PCION의 세포 흡수 효율 상의 MGF의 효과
생성된 PCION의 자성을 시험하기 위해, MGF의 존재 또는 부존재 상의 PCION-로다민을 이용한 공초점 현미경 분석을 수행하였다. 또한 철 염색 후 세포를 광학 현미경으로 관찰하였다. MGF의 존재 또는 부존재 상에서 15분간 HeLa 세포를 PCION-로다민으로 처리하였고, 1시간 후 형광 현미경으로 가시화하였다(참조: 도 1B). MGF 존재 상에서 PCION-로다민으로 처리한 세포에서 PCION-로다민의 충부한 세포 흡수가 있었던 반면, MGF의 부존재 하 PCION-로다민으로 처리한 세포에서 로다민 흡수가 관찰되지 않았다. 세포들을 철에 대해 염색하였을 때, 유사한 흡수 패턴이 관찰되었다(참조: 도 1C). MGF의 부존재 상에서 PCION으로 처리한 세 암 세포 주에서, 식별할 수 없는 철의 흔적들이 관찰되었다. 명백히 대조적으로, MGF의 존재 상에서 PCION으로 처리한 모든 세포 주에서 명확하고 식별가능한 청색의 철 염색이 관찰되었다. 상기 결과들은 MGF가 자성 나노물질, 예컨대 PCION의 세포 유입을 유의하게 향상시키는 것을 말해주고, 이전의 자기주입(magnetofection) 연구들과 일치한다[32, 33].
3. Ad-PCION 복합체의 물리화학적 성질
ad-PCION 복합체 제형을 최적화시키기 위해, GFP-발현 복제-불능 Ad(dAd)를 PCION과 다양한 몰 농도로 복합시켰고, MGF의 존재 또는 부존재 상에서 GFP 분석에 의해 측정하였다(참조: 도 2A). HeLa 세포에서, GFP 발현은 MGF의 존재 및 부존재 양쪽 모두에서 용량(몰 비율)-의존 방식으로 증가되었다. 그러나 MGF와 함께 처리한 HeLa 세포에서 더욱 큰 증가가 관찰되었고, PCION 폴리머:Ad 입자의 2×106 및 5×106 몰 비율에서, MGF 없는 세포와 비교하여 각각 6.4 배 및 9.3 배의 증가를 보였다(양 비교에서 모두 P<0.001였다). A549 세포에서 유사한 결과를 얻었고, PCION 폴리머:Ad 입자의 2×106 및 5×106 몰 비율에서, MGF 없는 세포와 비교하여 각각 9.8 배 및 13.4 배의 증가를 보였다(양 비교에서 모두 P<0.001였다). 상기 데이터들은 PCION 복합체 형성이 Ad 전달 효율을 유의하게 향상시키며, 특히 MGF의 존재하에서 더욱 그러하다는 것을 말해준다. 추가적으로 5×106보다 더 높은 PCION 폴리머:Ad 입자 몰 비율을 실험하였으나, 추가적인 전달 효율 향상 또는 세포 유입은 관찰되지 않았다. 이러한 결과들에 비추어, 계속되는 연구에서 5×106 몰 비율의 PCION을 선택하여 dAd-PCION 복합체 생성에 이용하였다.
최적화 dAd-PCION 제형의 크기, 표면전하, 및 형태를 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS), 제타 전위 및 TEM 각각을 이용하여 특성화시켰다. 예상한대로 dAd-PCION 복합체는 182.3 nm로 네이키드 Ad(74.6 nm) 또는 PCIONs(117.1 nm)에 비해 더욱 컸다(참조: 도 2B). dAd-PCION의 표면 전하 24.6 mV는 네이키드 dAd(-22.6 mV) 보다 더 높았으나 PCION(60.9 mV)보다 낮았으며, dAd-PCION 복합체가 잘 제조되었다는 것을 나타낸다. PCION과 비교하여 dAd-PCION의 감소된 표면 전하는 양이온성 PCION 및 음이온성 Ad 표면 사이의 강한 정전기적 상호작용에 기여할 수 있고, 고분자 전해질 복합체(polyelectrolyte complex)를 형성한다. dE1/GFP(dAd), PCION, 및 dAd-PCION의 TEM 이미지를 얻었다(참조: 도 2c). 본 발명의 DLS 및 제타포텐셜 데이터와 일치하게, TEM 이미지는 dAd-PCION 복합체가 네이키드 dAd 또는 PCION보다 더욱 큰 직경을 갖는다는 것을 확인시켜주었고, 성공적으로 형성된 dAd-PCION 복합체 내로의, 네이키드 dAd 및 PCION 사이의 물리적 결합을 설명해준다. 또한 PBS 버퍼 내의 dAd-PCION의 콜로이드 안정성을 측정하였다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, PCION-복합된 Ad는 7일의 기간 이상의 양호한 콜로이드 안정성을 나타낸다.
PEG와 같은 폴리머를 이용한 Ad의 표면 개질은 특이적 Ad 파이버/타겟 세포 리셉터 상호작용을 방해할 수 있고, 상기 복합체의 전달 효율을 감소시킨다[34]. 그러나 dAd-PCION 복합체에 대한 양(positive) 제타 전위 24.6 mV가 얻어지고, dAd-PCION이 음이온성 세포 막과의 친화적 상호작용에 의해 세포로 성공적으로 들어가는 것이 예상되었다. 종합적으로 상기 결과들은 5×106(PCION 폴리머:Ad 입자)의 몰 비율을 이용한 최적의 dAd-PCION 복합체 형성을 보여주고, 상기 고분자 전해질 복합체가 세포로 효율적으로 유입되며, 특히 MGF가 적용되었을 때 그러한 것이 예상되었다.
4. MGF 적용에 의한 Ad-PCION 복합체의 향상된 전달 효율
dAd 및 dAd-PCION의 형질도입 효율을 가시적으로 비교하기 위해, 다양한 암 세포 주를 다섯 실험 조건으로 처리하였다: 24 시간동안의 dAd를 이용한 형질도입; 15분 동안의 dAD+/-MGF를 이용한 형질도입; 및 15 분간의 dAD-PCION+/-MGF를 이용한 형질도입(참조: 도 3). 형질도입 24 시간 후에 모든 그룹의 GFP 발현 수준을 측정하였다. 예상한 바와 같이, CAR-음성 세포들(MDF7 및 B16F10)에서 GFP 발현이 관찰되지 않은 반면에, 24시간 동안 dAd-도입된 세포들은 CAR-양성 세포들(A549, U343, SK-BR3)에서 GFP 발현을 보였고, 네이키드 Ad의 CAR-의존 세포 유입 메카니즘을 확인하였다. MGF를 이용하거나 이용하지 않은 상태에서의 15분간의 네이키드 Ad의 형질도입은 어떠한 상기 세포 주들에서도 검출가능한 GFP 발현이 없었고, 15분은 네이키드 Ad 형질도입이 발생되기 위한 충분한 시간이 아님을 말해준다.
명백히 대조적으로, 15분 동안의 MGF의 존재하 dAd-PCION 복합체를 이용하여 형질도입된 모든 세포들은 다른 어떠한 처리보다 유의하게 높은 GFP 발현을 유도하였다(P<0.001). MGF의 존재 하 dAd-PCION으로 처리한 암 세포의 형광 수준을 FACS 분석으로 정량하였다. 이러한 처리는 MGF의 부존재 상의 dAd-PCION 형질도입으로 관찰되는 수준과 비교하여, A549, U343, SK-BR3, MCF7 및 B16F10 세포의 GFP 발현에서 각각 28배, 30배, 20배, 32배, 및 141배의 증가의 원인이 되었다. MGF의 부존재 하 dAd-PCION을 이용한 15분의 형질도입은 네이키드 dAd를 이용한 형질도입에 비해 더 많은 벡터 유입을 발생시키고, dAd-PCION의 양(positive) 표면 전하가 CAR-매개의 엔도사이토시스보다 더 높은 효율의 유입을 가능케 한다. 게다가 MGF의 존재는 모든 시험된 암 세포들 내로의 dAd-PCION 세포 유입을 크게 증가시켰다. 이러한 결과는 이전의 발견들과 일맥상통하고, MGF의 적용은 타겟 세포들 내로의 자성 나노물질의 세포 유입을 향상시켰다[21]. 종합하면, 상기 결과들은 본 발명에서 시험된 모든 세포 주에서의 눈에 띄게 증가된 GFP 발현이, dAd-PCION 벡터의 자성에 의해 촉발된, 빠른 세포 흡수에 의한 것임을 나타낸다.
양으로 하전된 복합체 및 음으로 하전된 혈청 단백질 사이의 정전 친화력으로 인해, 혈청 단백질은 유전자 벡터의 형질도입 효율 상에 상당한 충격을 가질 수 있다. 그러므로 30% 인간 혈청 상의 dAd-PCION의 안정성을 측정하였다. 37℃에서 45분간 혈청과 함께 또는 혈청 없이 네이키드 dAd 또는 dAd-PCION의 배양 후, A549 세포를 MGF의 존재 상에서 dAd 또는 dAd-PCION으로 처리하였다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, 혈청은 3.8% 네이키드 dAd의 형질도입 효율을 감소시켰고, 네이키드 Ad가 혈청에 의해 쉽게 비활성화될 수 있다는 것을 보여준다. 명백히 대조적으로, dAd-PCION-처리 세포들은 MGF의 존재하에서 인간 혈청 함량에 관계없이 유사한 GFP 발현 수준을 보였다. 이러한 결과들은 Ad의 PCION과의 복합화가 혈청에 대한 Ad의 활성을 보호할 수 있다는 것은 나타낸다.
MGF에 대해 이용된 dAd-PCION의 향상된 형질도입 효율을 더 조사하기 위해, TEM 이미징 연구를 수행하였다. U343 세포를 PBS, MGF를 이용한 네이키드 dAd(100 MOI), MGF를 이용한 PCION, 또는 MGF를 이용하거나 이용하지 않은 dAd-PCION (100 MOI)로 처리하였다. 처리 15분 후 TEM 이미지를 얻었다(참조: 도 4). 예상한대로, PBS 또는 dAd 처리에 의해서는 5000× 또는 20000× 배율 모두에서 어떠한 눈에 보이는 세포 내 Ad 입자도 얻을 수 없었다. MGF를 이용한 PCION에서 드문 전자-밀집 입자(delectron-dense particle)가 세포내에서 관찰되었고, 세포 유입 결과들은 도 1B 및 1C에 나타내었다. 세포들을 MGF를 이용하지 않은 dAd-PCION 입자로 처리하였을 때, 도 3의 결과에 따라, 네이키드 dAd보다 더욱 많은 입자들이 세포 내부 근처 및 세포 막 근처에서 발견되었다. 명백히 대조적으로 MGF의 존재하에서의 dAd-PCION의 처리는 세포 내부에서 관찰된 풍부한 수의 컨쥬게이션된 바이러스 입자의 결과를 도출하였고, 15 분 간 dAd-PCION의 향상된 세포 유입을 나타낸다. GFP 및 TEM은 자기주입(magnetofection)-매개의 dAd-PCION 세포 유입이 네이키드 Ad의 CAR-매개의 엔도사이토시스에 비해 더욱 효율적이고, 신속하다는 것을 확인시켜주었다.
5. MGF 인가에 의한 Ad-PCION 복합체의 개선된 항종양 효과 및 세포내 바이러스 복제
자기주입(magnetofection)-매개의 항종양 Ad(HmT)-PCION 복합체의 암 세포 사멸 효과를 조사하기 위해, MGF의 존재 또는 부존재 하에서 15 분간 형질 도입시킨 A549, U343, SK-BR3, MCF7, B16F10, 및 C33A 세포에서 MTT 분석을 수행하였다(참조: 도 5A). HmT 항종양 Ad는 그 E1A 영역 내의 6 카피의 저산소증-감응성 엘리먼트(hypoxia-responsive element, HRE) 및 개질된 hTERT 프로모터를 가지며[35], 그러므로 상기 HRE-hTERT 하이브리드 프로모터 하에서 바이러스 복제는 조절된다. 게다가 HmT는 그것의 E3 영역에 반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 함유하고, 세포내 복제의 지표로서[35] in vivo 루시퍼라아제 가시화를 가능케 한다. HmT-감염된 그룹은 최소한의 항종양 효과를 보이고, 15분은 네이키드 Ad에 대해 암 세포 내로 들어가기 위한 충분한 시간이 아님을 보여주는 GFP 발현 결과(참조: 도 3)와 일치한다. 암 세포 사멸 효능은 HmT 항종양 Ad가 PCION과 MGF 부존재 하에서 복합될 때, 네이키드 HmT에 비하여 완만하게 증가되고, 6.1%(A549), 8.7%(U343), 21.0%(SK-BR3), 8.7%(MCF7), 3.3%(B16F10), 및 10.4(C33A)의 암 세포 사멸의 증가를 보인다. 이는 촉진된 항종양 Ad 세포 유입이 양(positive) 하전된 PCION 입자에 의해 매개됨을 보여준다. MGF의 존재하에서의 HmT-PCION은 MGF를 이용하지 않은 네이키드 HmT 또는 HmT-PCION 양쪽과 비교하여 향상된 암 세포 사멸 효능을 유발한다. 구체적으로, 암 세포 사멸은 네이키드 항종양 Ad에 비하여 A549, U343, SK-BR3, MCF7, B16F10 및 C33A 세포에서 각각 12.9 배, 2.3 배, 5.8 배, 4.7 배, 7.0 배 및 4.3 배 증가된다(모든 세포 주에서 P<0.01). PCION 단독의 세포독성 분석은 10 μg 까지 세포 독성을 보이지 않았고(참조: 도 1A), 상기 결과는 MGF를 이용한 HmT-PCION 복합체의 향상된 세포 사멸 효과가 HmT 단독의 세포 독성에 기인한다는 것을 나타낸다. 이는 또한 PCION이 HmT의 항종양 활성을 방해함이 없이 HmT 벡터의 세포 유입을 가능케 하는 자기적(magnetically) 활성 운반체로서 역할한다는 것을 나타낸다.
HmT 바이러스 자손(progeny) 생산 및 암 세포 사멸 효과 사이의 상관 관계를 바이러스 생산 분석을 통해 연구하였다. U343 및 MCF7 세포를 PBS, HmT 또는 HmT-PCION 복합체로 MGF의 존재 또는 부존재하에서 15 분간 처리하였고, 새로운 배지로 교체하였다. 3일 후, 처리된 세포들로부터 생산된 바이러스 자손들을 정량적 PCR에 의해 측정하였다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, 바이러스 생산은 MGF의 존재 또는 부존재 하의 네이키드 HmT 또는 HmT-PCION의 암 세포 사멸 효과와 양의 상관 관계를 보였다(참조: 도 5A). 구체적으로 MGF의 존재하에서 HmT-PCION 복합체-감염된 U343 세포는, MGF의 부존재 하에서 HmT 또는 HmT-PCION으로 처리한 U343 세포에 비하여 각각 89 배 및 46 배 더 높은 바이러스 역가를 생산하였다(모든 비교에서 P<0.05). MGF의 존재하에서 HmT-PCION 복합체-감염된 MCF7 세포는 MGF의 부존재 하에서의 HmT 또는 HmT-PCION에 비하여 각각 2910배 및 1468배 더 높은 바이러스 생산을 가능케 한다(모든 비교에서 P<0.001). 상기 데이터는 MGF를 이용한 HmT-PCION 형질도입이 MGF를 이용하지 않은 네이키드 HmT 또는 HmT-PCION 모두에 대하여 항종양 효과를 유의하게 향상시킨다는 것을 확인시켜준다. 상기 결과는 MGF를 이용한 HmT-PCION 형질도입의 향상된 암 세포 사멸 효과가, 향상된 유입, 효율적인 바이러스 복제 및 잠재적 후속 항종양 효과에 기인한다는 것을 말해준다.
6. MGF 인가에 의한 항종양 Ad-PCION 복합체 형질도입의 향상된 치료적 효능
항종양 Ad의 in vivo 치료적 효능의 자기주입(magnetofection) 향상을 쥣과의(murine) MCF7-종양 이종 이식(xenograft) 모델에서 조사하였다. 종양이 100×120 mm3에 이르렀을 때, 마우스에 대해 MGF를 이용한 PBS, MGF를 이용한 HmT, 또는 MGF를 이용하거나 이용하지 않은 HmT-PCION을 종양 내 주입하였다. 처리 후 매일 종양 부피를 측정하였다(참조: 도 6A). 향상된 항 종양 효능이 자기주입 공정에 의해 매개되는 것을 배제하기 위해, HmT-PCION 비-MGF 대조군 그룹을 제외한 모든 그룹에서 자기주입(magnetofection)을 수행하였다. 도 3에서의 유전자 전달 효율 데이터와 일치하게, 네이키드 HmT는, CAR-음성 MCF7 암 세포에서의 네이키드 Ad의 낮은 감염 효율로 인해 유의한 항종양 효능을 유발하지 않는다. 본 발명의 in vitro 결과와 일관되게, MGF 없이 HmT-PCION 복합체-처리된 마우스는 PBS 또는 네이키드 HmT에 비하여 더욱 효율적으로 종양 성장을 지연시킨다(P<0.05). MGF를 이용한 HmT-PCION으로 처리한 마우스는 모든 다른 그룹보다 더욱 효율적인 종양 성장 감소를 나타내었다. MGF 인가를 이용한 HmT-PCION의 주입은 MGF를 이용한 PBS, MGF를 이용한 네이키드 HmT, 또는 MGF를 이용하지 않은 HmT-PCION과 비교하여 각각 3.9 배, 2.7 배 및 2.1 배 더 높은 치료적 효능의 결과를 야기하였다(P<0.001). 종양 성장에서의 이러한 눈에 띄는 감소는, MGF의 존재 하 PCION에 의한 효율적인 감염 후의 종양 조직에서 HmT의 효율적인 복제에 의해 매개된 종양-특이적 항종양효과에 기인한다.
이전의 연구들은 생물기여(biodistribution) 연구들[36, 37]에서의 PLL- 및 PEI-기반의 양이온성 폴리머의 유의한 간 트로피즘을 보여준다. in vivo HmT-PCION 복합체의 이동성 상의 통찰력을 얻기 위해, MGF를 이용한 PBS, MGF를 이용한 HmT, 또는 MGF를 이용하거나 이용하지 않은 HmT-PCION를 이용한 처리 후의 MCF7 종양-함유 마우스 모델 내의 HmT-PCION의 이동의 추적을 위해 IVIS 전신(whole-body) 루시퍼라아제 분석을 수행하였다(참조: 도 6B). PBS로 처리한 종양-함유 마우스는 루시퍼라아제 활성을 나타내지 않았다. MGF의 존재 하의 네이키드 HmT로 종양 내 처리한 마우스는 대부분 오직 종양에만 국소화된 완만한 루시퍼라아제 신호를 나타낸다. 대조적으로 MGF 없는 HmT-PCION으로 처리한 마우스는 종양 조직에서 루시퍼라아제의 최소한의 발현을 갖는 간 조직 내의 강한 루시퍼라아제 신호를 나타내고, PLL-기반의 양이온성 폴리머의 비-특이적 간 유입의 초기 발견을 확인하였다. 이러한 결과와 상반되게, MGF를 이용하여 국소적 종양 부위 내로 주입된 HmT-PCION은 간 내의 비-특이적 루시퍼라아제 발현없이 종양 조직 내의 강한 루시퍼라아제 발현을 유도한다. 이러한 결과들은, 부위-특이적 자기-가이드된 나노파티클이 일반적인 양이온성 폴리머에 내재된 비-특이적 간 트로피즘의 잠재적 위험을 극복할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. MGF를 이용한 HmT-PCION 복합체로 처리한 마우스에서, 처치 효능 및 안전성의 주요 측면인, 간에 대한 종양의 루시퍼라아제 신호 비율은 MGF를 이용하지 않는 HmT-PCION에 대해 450 배 증가된다. 그러므로 이러한 접근은, 자기주입(magnetofection)과의 조합에서의 더 안전하고, 더욱 효능이 큰 Ad-양이온성 폴리머 복합체-기반의 암 유전자 치료를 야기함에 있어서의 유의한 향상을 제공한다.
7. 조직학적 및 면역조직학적 분석
처치 3일 후 얻어진 종양 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색은, MGF를 이용하거나 이용하지 않은 HmT-PCION 복합체를 이용한 처치로부터의 치료학적 변화를 보여주었다. MGF를 이용하지 않은 HmT-PCION 또는 MGF를 이용한 HmT-PCION으로 처리한 종양 내에서 중간규모 및 확장된 네크로시스가 관찰된 반면에, MGF를 이용한 PBS 또는 MGF를 이용한 HmT로 처리한 종양 조직은 넓은 영역의 증식된 종양 세포를 나타내었다(참조: 도 7). HmT-PCION 복합체-매개의 종양 성장 억제의 분자적 메카니즘에 대한 더 많은 통찰을 얻기 위해, 면역조직학적 분석을 수행하였다. PCNA를 위한 종양 구획의 면역 염색은 어떠한 다른 처리 방법들과 비교하더라도 MGF를 이용한 HmT-PCION 복합체가 주입된 종양 내에서 더 적게 증식된 암 세포를 나타낸다. 종양 내의 바이러스 복제의 정도를 검출하기 위해, 조직 구획을 Ad E1A 항원-특이적 항체로 염색하였다. 매우 적은 양의 Ad E1A-양성 스팟들이 MGF를 이용한 네이키드 HmT 또는 MGF를 이용하지 않은 HmT-PCION 종양 내에서 관찰되었다. 명백히 대조적으로, 수많은 어두운 갈색 Ad E1A-양성 스팟들이 in vitro 바이러스 복제 분석 결과들과 일치하게 MGF에 더한 HmT-PCION로 처리한 종양 내에서 관찰되었다(참조: 도 5B). 이러한 데이터는 PCION이 MGF의 존재하에서의 HmT의 암 세포 유입을 가능케 하고, 궁극적으로 in situ 바이러스 복제를 증가시키는 것을 보여준다. 더욱이 철 염색 결과들은, MGF의 존재하에서 항종양 Ad가 PCION과 복합될 때, 향상된 항종양 Ad의 감염과 상호 연관된다. 종합하면, 상기 염색 데이터는 HmT-PCION의 향상된 치료적 효능이, 증가된 감염 효율 및 자기적으로 가이드된 HmT-PCION의 활성화된 복제에 기인한다는 생각을 뒷받침한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (11)

  1. (a) 자성 나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신의 가교 결합으로 형성된 가교체, 및 (b) 상기 가교체와 결합된 종양 살상 아데노바이러스(oncolytic adenovirus)를 포함하고,
    상기 상기 가교체는 그 표면이 폴리에틸렌글리콜에 의해 페길레이션(PEGylation)된 항암치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 나노파티클은 마그헤마이트, 마그네타이트 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 나노파티클은 1 nm 내지 200 nm의 입자 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신에 포함되는 폴리-L-리신은 수평균 분자량이 5×102 내지 3×105 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신은, 폴리-L-리신에 대한 카테콜 기능기 치환도가 5 내지 30인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 가교체는 자성나노파티클 및 카테콜 그래프트화 폴리-L-리신이 경우 10:1 내지 1:5인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 가교체와 상기 종양 살상 아데노바이러스의 몰비율은 1:1 내지 1:5×107인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 타겟 종양 세포에 대한 외부자기장(MGF)의 인가에 의해 종양 세포 내로의 유입률이 향상되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 외부자기장의 인가에 의해 간 굴성(tropism)이 감소되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 종양은 아데노바이러스 리셉터(CAR)-음성 종양인 것을 특징으로 하는 조성물.

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