KR100749858B1 - ｐ53 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (ⅰ) C-말단 조절부위의 결실, (ⅱ) E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합능이 상실되도록 N-말단 전사활성화 부위가 다른 전사활성화 부위 서열로 치환, 또는 (ⅲ) 상기 (ⅰ)과 (ⅱ)의 조합의 변이를 갖으며, 야생형과 비교하여 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체 단백질, 이를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달 시스템, 상기 핵산 분자를 포함하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스 및 상기 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 p53 변이체는 종양세포 살상능이 매우 우수하며, p53 변이체를 탑재한 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가로도 높은 종양세포 살상 효과를 유도할 수 있고, 재조합 아데노바이러스의 암세포 특이적 복제에 따른 p53 변이체의 암세포 내에서의 제한된 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

p53, 암, 종양, 아데노바이러스

Description

ｐ53 변이체 및 그의 용도{p53 Mutants and Its Uses}

도 1은 C33A 세포에서 pG13-루시퍼라아제 리포터 벡터의 트랜스활성화에 대한 야생형 p53, p53△30, p53-VP 또는 p53△30-VP의 영향을 보여주는 그래프이다. p53 활성은 루시퍼라아제 분석으로 결정하였다. 폴리오마 바이러스 최소 프로모터 서열의 업스트림에 있는 라이보좀 유전자 클러스터로부터 유래된 p53-결합 엘리먼트의 13 카피로 구성된 프로모터의 조절을 받는 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 pG13-luc과 야생형 p53 또는 p53의 변이체 (p53△30, p53-VP 또는 p53△30-VP)로 C33A 세포를 동시 형질전환시켰다. 변이된 p53-결합 엘리먼트를 포함하는 네가티브 대조군, MG15-luc을 야생형 또는 변이형 p53과 동시 형질전환시켰다. pG13-Luc 또는 MG15-Luc의 루시퍼라아제 활성을 0으로 정규화 하였다. 모든 데이터는 4회 실험으로부터 얻은 결과의 평균과 표준편차 (SD)로 나타내었다.

도 2a-2f는 복제-불능 (도 2a) 및 복제-가능 (도 2b-2f) 아데노바이러스 벡터의 구조를 나타낸다. dl/Z는 완전 결실된 E1 부위 및 E1 부위에 삽입된 β-gal 유전자를 포함한다; dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP 및 dl/p53△30-VP는 dl/Z의 E1 부위에 삽입된 야생형 p53, 변이체 p53△30, p53-VP 및 p53△30-VP를 각각 포함한다. Ad/mΔ19는 정상적인 E1A 및 E1B 55 kDa을 포함하며, E1B 19 kDa의 해독 개 시 코돈에 변이가 있어 비활성의 E1B 19 kDa이 만들어지며, E1A 발현은 본 발명자에 의해 개발된 mTERT 프로모터 (참조: 특허출원 제2003-12364호)의 조절 하에 있다; Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 및 Ad/m△19-p53△30-VP는 Ad/m△19의 E3 부위에 삽입된 야생형 p53, 변이체 p53△30, 및 p53△30-VP를 각각 포함한다. 도면에서, Ψ는 ITR (inverted terminal repeat) 및 패키지 시그널을 포함하는 서열을 나타내며, 기호 Ad는 아데노바이러스의 축약어이고, CMV는 CMV 프로모터를 나타내며, Pol A는 폴리 A 서열이고, IX는 단백질 IX 유전자, mTERT는 mTERT 프로모터를 나타낸다.

도 3은 복제-불능 아데노바이러스의 인 비트로 CPE 분석 결과이다. 24-웰 플레이트 내의 세포 단일층을 dl/Z, dl/p53, dl/p53Δ30, dl/p53-VP, 또는 dl/p53Δ30-VP로 20-500 MOIs로 감염시켰다. dl/Z는 네가티브 대조군이다. 낮은 MOIs 바이러스로 감염된 세포에서 완전한 라이시스를 나타내면, 나머지 세포층을 고정화하여 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

도 4는 야생형 p53 또는 p53 변이체를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스의 암세포 살상능을 보여주는 그래프이다. dl/Z, dl/p53, dl/p53Δ30, dl/p53-VP 또는 dl/p53Δ30-VP MOI 50 또는 150으로 암세포 단일층을 처리하였다. 전체 생존 생포에 대하여 MTT 분석을 실시하였고, 결과는 3회 실험의 평균이다.

도 5는 복제-가능 아데노바이러스의 인 비트로 CPE 분석 결과이다. 24-웰 플레이트 내의 세포 단일층을 dl/Z, Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 또는 Ad/m△19-p53△30-VP로 0.5-100 MOIs로 감염시켰다. dl/Z는 네가티브 대조 군이다. 낮은 MOIs 바이러스로 감염된 세포에서 완전한 라이시스를 나타내면, 나머지 세포층을 고정화하여 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

도 6은 야생형 p53 또는 p53 변이체를 발현하는 복제-가능 아데노바이러스의 암세포 살상능을 보여주는 그래프이다. dl/Z, Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 또는 Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스 MOI 1 또는 3으로 암세포 단일층을 처리하였다. 전체 생존 생포에 대하여 MTT 분석을 실시하였고, 결과는 3회 실험의 평균이다.

도 7은 야생형 p53 또는 p53 변이체를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스로 감염된 U343 세포에서 p53의 발현을 보여주는 사진이다. 6-웰 플레이트 상의 세포를 dl/Z, dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP, 또는 dl/p53△30-VP 아데노바이러스 50 MOI로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 세포 분쇄물에 대하여 p53 또는 β-액틴을 인지하는 항체를 이용하여 면역블롯팅 분석을 하였다.

도 8은 p53 변이체를 발현하는 복제-가능 아데노바이러스로 감염된 U343 세포에서 p53 및 p21의 발현을 보여주는 사진이다. 6-웰 플레이트 상의 세포를 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53-VP, or Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스 5 MOI로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 세포 분쇄물에 대하여 p53, p21 또는 β-액틴을 인지하는 항체를 이용하여 면역블롯팅 분석을 하였다.

도 9는 Annexin-V/PI 형광 분석 결과를 보여준다. 세포를 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 또는 Ad/m△19-p53△30-VP 바이러스로 감염시키거나 혹은 CPT로 처리하였다. 세포 펠릿을 100 ㎕ 결합 완충액에 재현탁시키고 Annexin-V (3 ㎕) 및 PI (5 ㎕)와 실온에서 반응시켰다. 염색된 세포를 FACS에서 분석하였다. 각각의 플롯에서, Annexin-V⁺/PI^-(초기 아폽토시스에 있는 세포, 오른쪽 아래 부분)의 백분율을 굵은 이태릭체로 나타내었다.

도 10은 인 비트로 TUNEL 분석 결과를 보여주는 사진이다. 1 μM CPT 또는 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 또는 Ad/m△19-p53△30-VP로 처리하고 48시간이 경과한 다음, 세포를 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제를 이용하여 DAB로 표지하고 메틸 그린으로 카운터 염색하여 아폽토시스가 발생된 세포를 검출하였다. 갈색 염색은 DNA 가닥 절단에 대한 포지티브 염색 결과이다. 3회 실험의 대표적인 결과가 나타나 있다. 배율은 x100과 x400이다.

도 11은 p53 변이체를 발현하는 복제-가능 아데노바이러스의 누드 마우스에서의 종양성장 억제능을 보여주는 그래프이다. U343 세포로부터 유래된 피하 종양에 PBS (네가티브 대조군)와 함께 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 또는 Ad/m△19-p53△30-VP를 투여하였다. 아데노바이러스 처리 후 종양 용적을 모니터링 하였다. 화살표는 처리 (5× 10⁷ PFU/마우스/처리)가 주어진 시기를 나타낸다. 값은 그룹 당 여섯 마리의 실험 동물에 대한 평균± SE로 나타나 있다.

도 12는 p53 변이체를 발현하는 복제-가능 아데노바이러스의 누드 마우스에서의 종양성장 억제능을 보여주는 그래프로서, 도 11에서의 실험보다 바이러스의 투여량을 5배 낮추어 실험한 결과이다.

본 발명은 신규한 p53 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 야생형 p53의 종양세포 살상능을 개선한 p53 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.

p53 유전자는 체내 시스템이 이상을 일으켜 암으로 발전될 수 있는 가능성을 인지하는 모니터적인 특성을 지니고 있는 종양억제 유전자로서, 23개의 인간 염색체 쌍 중 17번째 염색체에 위치하고 있다. 인간 p53 단백질은 총 393개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 야생형 p53은 인간뿐만 아니라 다른 많은 종류의 포유동물에서도 발견되며, 그 아미노산 서열은 종간에 잘 보존되어 있다¹. p53은 동종 사량체를 이루는 서열 특이적인 DNA 결합 단백질로서, 구조적으로 크게 다섯 부위로 나뉘어 진다^{2 -3}. N-말단에는 특정 유전자의 전사와 관련이 있는 전사 활성화 도메인이 존재하고 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 프로린-리치 도메인은 전사 활성화 도메인 다음에 위치한다. 그리고 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인은 p53 단백질의 중간 부위에 존재한다. 또한 C-말단 부위에는 p53 단백질이 서로 결합해 네 개의 동종 사량체를 만드는데 관여하는 도메인이 있고, 최말단 부위에는 p53 기능이 역으로 조절되는 부조절 도메인이 존재한다^{4 -5}.

N-말단 부위의 18-26 번째 아미노산 영역은 α-나선 구조를 형성하고 있으며, 이곳에 mdm2 단백질이 결합하게 되면 p53의 분해가 촉진된다. 또한, 이 부위는 스트레스에 의하여 인산화되면 mdm2가 p53으로부터 분리되어 p53을 안정화 또는 활성화시킬 뿐 아니라 p53 단백질이 세포핵으로부터 빠져나가 세포질로 이동하는 것을 억제해 세포핵 속에 p53 단백질을 축적시켜 세포고사를 일으키게 된다⁶. 그러나 p53 종양 억제 유전자에 돌연변이가 발생하지 않았어도 p53의 안정화를 조절하는 mdm2 유전자의 발현이 이상적으로 높은 경우에는 mdm2가 p53 단백질의 전사활성 부위인 N-말단의 TAD (transactivation domain) 부위에 결합해 p53 단백질의 분해를 촉진하여 암 발생을 유도할 수 있다⁷.

한편 N-말단 부위의 11-27 아미노산에는 아데노바이러스의 E1B 55 kDa 단백질이 결합하는 부위가 존재하며, 이 부위에 E1B 55 kDa 단백질이 결합하게 되면 p53의 불활성화를 유도한다⁸. 따라서 아데노바이러스를 매개하여 p53을 생체 내에 전달하고자 할 경우에는 E1B 55 kDa의 발현으로 p53의 활성화가 크게 감소할 수 있다. p53의 C-말단은 동종 사량체의 형성에 관여하며, 그 최말단 부위인 염기성 부위는 p53의 기능을 역으로 조절할 수 있는 부조절 도메인이 존재한다⁹.

p53은 세포고사를 유도하거나 세포의 성장을 억제하는 기능을 하며, 정상적인 체내 시스템 내에서는 음성 피드백 작용에 의해 낮은 수준의 농도로 유지된다⁴. 그러나 외부로부터 DNA 손상을 유도하는 신호 전달 체계가 활성화되면 곧 체내에서 높은 농도의 p53 발현이 유도되고 활성화된다.

암이 진행되는 경우에는 p53 유전자의 돌연변이가 동반되거나 비활성화된 경우가 많아 이러한 p53 유전자의 기능이 억제되는 경향을 보이게 된다. 최근까지의 연구 결과들에 의해 p53의 기능적 결함이 52종류 이상의 대부분의 암 발생에 직접 또는 간접적인 원인으로 작용한다고 밝혀졌다^{3 -4}. p53은 폐암, 난소암, 유방암, 직장암, 두경부암 등 약 50% 이상의 인체 종양 세포에서 유전자 변이가 나타나고, p53 유전자가 정상형으로 밝혀진 종양에서도 mdm2의 과다발현 또는 인간 파필로마 바이러스에 의한 감염 등으로 p53이 비활성화되어 있는 경우가 빈번한 것으로 보고 되었다. 특히, p53의 분해를 유도하는 mdm2 유전자의 발현이 이상적으로 높은 경우, mdm2가 p53 단백질의 전사활성 부위인 N-말단의 TAD (transactivation domain) 부위에 결합해 p53 단백질의 분해를 촉진시켜 육종, 신경아종, 뇌암, 유방암 등의 암을 유발한다고 보고 되었다^{7 ,10-12}. 따라서 mdm2의 발현이 높은 암의 경우에는 야생형의 p53을 도입하더라도 암세포 내에 고농도로 존재하고 있는 mdm2에 의해 p53의 분해가 유도되므로 p53에 의한 암세포 살상 효과를 크게 기대하기가 어렵다.

Liu 연구팀은 두경부암 세포주에 야생형 p53을 아데노바이러스를 이용하여 전달하여 세포고사를 유도할 수 있음을 보고하였으며¹³, 또한 시스플라틴이나 파크리탁셀과 같은 항암제를 이용하여 p53의 발현을 유도하여 암세포 살상효과를 증대 시키려는 시도도 이루어지고 있다¹⁴.

p53을 도입하여 항종양 효과를 유도하고자 하는 초기의 암 유전자 치료에는, 아데노바이러스의 복제에 필수적인 E1 유전자 대신에 야생형 p53 유전자를 삽입한 복제 불능 아데노바이러스를 주로 이용하였다¹⁶. 현재 p53 유전자를 탑재한 복제 불능 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료는 미국 MD Anderson Medical Center에서 제3상 임상으로 진행되고 있으며 암세포 억제와 인체 내 무독성이 검증되었다¹⁷. 하지만, 복제 불능 아데노바이러스는 1차 감염세포 또는 그 주변의 제한된 세포들에서만 항종양 효과를 유도하여 임상적인 실용성 면에서 많은 제약이 있음이 밝혀졌다.

이를 극복할 수 있는 한 방안으로, 암세포에서만 선택적으로 증식하여 살상하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 대한 연구가 활발히 이루어졌다. 암세포 선택적 살상을 유도할 수 있는 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 일차 감염세포에서만 치료효과를 유도할 뿐 아니라 바이러스의 지속적인 증식으로 주변의 종양세포들도 이차적으로 감염하여 치료효과가 도미노 현상과 같이 계속 퍼져 나갈 수 있어 암치료 효능을 현저히 증대시킬 수 있다. 또한, 주변의 정상세포는 감염되더라도 바이러스의 증식이 억제되어 독성과 부작용이 현격히 감소되는 이점도 있다.

본 연구실에서는 아데노바이러스의 초기 유전자인 E1B 19 kDa이 소실되어 암세포 살상능이 증대되고, 동시에 바이러스의 증식이 암세포 선택적으로 활성화되는 텔로머라아제 역전사효소 (telomerase reverse transcriptase: TERT) 프로모터에 의해서 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad/mΔ19의 우수한 생체 내/외 항종양 효과를 보고한 바 있다¹⁸. 아데노바이러스의 E1B 19 kDa 유전자는 강력한 세포고사 억제제인 Bcl-2와 구조적, 기능적으로 유사하며, 아데노바이러스의 초기 발현 유전자인 E1A에 의해 유도되는 세포고사를 억제한다고 알려져 있다. 본 연구실에서도 E1B 19 kDa 유전자가 소실된 아데노바이러스의 암세포 살상능이 세포고사의 활발한 유도와 더불어 크게 증가하였음을 보고하였다¹⁹. 또한, p53의 발현에 의한 세포 살상은 주로 세포고사에 의해 이루어지며 이들에 의한 항암효과는 암세포의 세포고사 기능이 정상적일 때 더욱 효과적이다. 따라서 E1B 19 kDa 유전자가 결손된 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 유전자 전달체로 이용하여 p53을 체내에 도입한다면, 아데노바이러스의 증식에 따른 암세포의 괴사뿐 아니라 아데노바이러스 또는 p53의 발현에 의해 유도되는 세포고사를 함께 활발하게 유도할 수 있어 항종양 효과를 크게 개선시킬 수 있을 것이다. 또한, TERT 프로모터는 암 진행 전단계인 전암 조직과 암세포주 및 암조직에서 활성이 선택적으로 증가한다고 알려져 있는 대표적 암세포 선택적 활성 프로모터로서^{20 -24}, 아데노바이러스의 증식이 TERT 프로모터에 의해서 조절되는 Ad/m△19 아데노바이러스는 암세포 선택적으로 증식하고, 그 결과 암세포 선택적 세포 살상을 유도할 뿐만 아니라 p53의 발현도 암세포 내에서만 지속적으로 발현시킬 수 있는 장점도 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은, 화학물질 또는 방사선 조사 방법을 이용해 p53의 발현을 유도하려는 종래의 시도와는 달리, p53의 서열을 조작하여 그 기능을 강화시킬 수 있는 변이체를 개발하고자 노력하였고, 그 결과 야생형 p53의 C-말단 조절부위 및/또는 N-말단 전사활성화 부위에 변이를 발생키는 경우에는 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체를 얻을 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 야생형과 비교하여 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 p53 변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 약제학적 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) C-말단 조절부위의 결손, (ⅱ) E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합능이 상실되도록 N-말단 전사활성화 부위가 다른 전사활성화 부위 서열로 치환, 또는 (ⅲ) 상기 (ⅰ)과 (ⅱ)의 조합의 변이를 갖으며, 야생형과 비교하여 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체 단백질을 제공한다.

본 발명자들은, 화학물질 또는 방사선 조사 방법을 이용해 p53의 발현을 유도하려는 종래의 시도와는 달리, p53의 서열을 조작하여 그 기능을 강화시킬 수 있는 변이체를 개발하고자 노력하였고, 그 결과 야생형 p53의 C-말단 조절부위 및/또는 N-말단 전사활성화 부위에 변이를 발생키는 경우에는 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체를 얻을 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서, p53을 언급하면서 사용하는 용어 “C-말단 조절부위”는 p53의 C-말단에 위치한 부조절 부위를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “C-말단 조절부위에서의 결실”은 p53의 C-말단의 부조절 기능을 상실케 하는 모든 결실 변이를 포함하는 의미를 갖는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, C-말단 조절부위에서의 변이는 야생형 p53 단백질의 C-말단에서부터 10-39개의 아미노산 (테트라머 형성 도메인 직전까지의 결실), 보다 바람직하게는 20-35개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 25-32개의 아미노산, 가장 바람직하게는 약 30개의 아미노산이 결실되는 것이다.

본 명세서에서, p53을 언급하면서 사용하는 용어 “N-말단 전사활성화 부위”는 p53의 N-말단에 위치해 있는 부위로서 p53의 전사인자로서의 활성을 결정하는 부위이며, Leu-22와 Trp-23 (E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합 부위), Leu-14와 Phe-19 (mdm2 결합 부위) 및 Trp-23과 Pro-27 (E1B 55 kDa 결합 부위) 중에서 적어도 하나의 부위를 포함하는 전사활성화 부위를 의미한다. 본 발명에 있어서, N-말단 전사활성화 부위에서의 변이는 상술한 E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합 부위에서의 변이이며, 바람직하게는 야생형 p53 단백질의 N-말단으로부터 14-30개 아미노산이 치환되도록 변이시키는 것이다.

본 발명의 N-말단에서의 변이의 특징은 N-말단에서의 E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합능을 상실케 하여 E1B 55 kDa과 mdm2 단백질에 의한 분해 기전을 우회함과 동시에 p53의 전사인자로서의 역할은 그대로 수행되도록 변이시키는 것이다. 이러한 전략을 위하여, 야생형 p53 단백질의 N-말단은 다양한 다른 전사활성화 부위 서열에 의해 치환될 수 있으며, 바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)의 VP16 전사활성 부위, GCN4, EWS, Sp1, Oct1, Oct2, AP-2, CTF/NF1 및 Gal4p를 포함하며, 가장 바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 전사활성 부위이다.

본 발명에 있어서, C-말단 조절부위의 결손을 갖는 p53 변이체 단백질은, p53의 C-말단의 부조절 기능을 상실케 하는 모든 변이체를 포함하며, 가장 바람직하게는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 것이다.

본 발명에 있어서, N-말단에서의 치환 변이를 갖는 p53 변이체 단백질은, E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합능을 상실케 하면서 전사인자로서의 활성을 갖는 모든 변이체를 포함하며, 가장 바람직하게는 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 있어서, C-말단의 변이와 N-말단의 변이를 동시에 갖는 p53 변이체 단백질은 서열목록 제7서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 변이체에 있어서 가장 바람직한 구현예는 C-말단의 변이와 N-말단의 변이를 동시에 갖는 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 p53 변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 서열목록 제4서열, 제6서열 및 제8서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

C-말단의 부조절 기능을 상실케 하는 변이 및/또는 E1B 55 kDa과 mdm2 단백질 결합능을 상실케 하면서 전사인자로서의 활성을 갖도록 하는 변이를 갖는다면, 본 발명의 p53 변이체는 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 p53 변이체 자체에 변화를 가져올 수도 있다. p53 변이체의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 p53 변이체와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 p53 변이체 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 p53 변이체와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모 두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 p53 변이체 단백질 또는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서 열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 p53 변이체는 야생형 p53과 비교하여 세포고사를 통한 종양세포 살상능이 매우 우수하여 암 치료제로서 매우 유용하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달 시스템에 있어서, 상기 목적 뉴클 레오타이드 서열은 상기 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템 (gene delivery system)을 제공한다.

본 발명의 유전자 전달 시스템은 p53 변이체를 운반 및 발현하기 위하여 제작된 것으로서, 운반 객체인 p53 변이체에 대한 상세한 내용은 위에 기재된 내용과의 중복기재를 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 유전자 전달 시스템을 제조하기 위해, p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, p53 변이체 유전자는 프로머터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, p53 변이체 유전자에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 p53 변이체 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CMV 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리아네닐화 서열을 포함한다 (예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 “프로모터-p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리 아데닐화 서열”의 구조를 갖는다.

본 발명의 유전자 전달 시스템에서, p53 변이체 유전자 이외에 다른 유전자들도 같이 운반할 수 있으며, 예컨대, 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자 [예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자 (costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)], 항원성 유전자, 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자가 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다.

자살 유전자는 세포가 외부 인자에 의해 살상되기 쉽도록 유도하는 물질을 발현하거나 세포에 독성 조건을 유발하는 핵산 서열이다. 이러한 자살 유전자로 잘 알려진 것은 티미딘 키나제(TK) 유전자이다 (미국특허 제5,631,236호 및 제5,601,818호). TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간사이클로비르 (gancyclovir) 의 투여에 의해 선택적인 사멸에 민감하다. 종양 억제 유전자는 종양의 형성을 억제하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 가리킨다. 종양 억제 유전자는 포유동물에서 자연발생 유전자이며, 이 유전자의 결실 또는 불활성화는 종양 발생에 필수 전제인 것으로 믿어지고 있다. 종양 억제 유전자의 예로는 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, Rb, MMAC-1, MMSC-2, 망막아세포종 유전자 (Lee et al. Nature, 329:642(1987)), 선종양 폴립증 장 단백질 (adenomatous polyposis coli protein; 미국특허 제 5,783,666 호), 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc . Nat . Acad . Sci ., 95:3042-3047(1998)), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 및 p21을 포함한 종양 억제 유전자의 INK4 계열의 일원 및 이의 치료학적으로 유효한 단편 (예, p56Rb, p94Rb 등)이 포함된다. 당업자는 상기 예시된 유전자 외에 기타 알려진 항종양 유전자 모두가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 용어 "항원성 유전자 (antigenic gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 PSA (prostate specific antigen), AFP (α-feto protein)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제 I 형 항원에 결합시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어 "세포독성 유전자 (cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소 (exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자 (예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스 (growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 (WO 97/16459 및 WO 96/30385) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 본 발명의 시스템에 의해 운반된다. 예를 들면, 사이토카인 (예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨 (예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자 (예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹 (단핵구 화학 주성단백질 1 (MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2 (MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3 (MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4 (MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β (MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ (MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α (MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인 (ELC), 대식구 염증성 단백질 4 (MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5 (MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론 (p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인 (TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC- 2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테롤 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 "친-세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF-α, TRAIL, p53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "항-신생혈관생성 유전자 (anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

상술한 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 서열 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.

본 발명의 유전자 전달 시스템은 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또 는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 릴랙신-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하 며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 p53 변이체 유전자는 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템은 “프로모터-p53 변이체 유전자-폴리 A 서열”이 연결된 구조를 갖으며, 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 p53 변이체 유전자는 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 p53 변이체 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, p53 변이체 유전자는 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). p53 변이체 유전자, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp . Hematol . (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로 서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열 (p53 변이체 유전자)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, p53 변이체 유전자를 세포내로 운반할 수 있 는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys . Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine (Gibco BRL)이 있다. p53 변이체 유전자를 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 p53 변이체유전자를 운반한다.

한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol . 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전 법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol . Cell. Biol . 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol . Cell Biol ., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol ., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아데노바이러스의 ITR (inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열 및 p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종래의 재조합 아데노바이러스에 p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 결합시켜, 아데노바이러스의 종양세포 살상능을 증대시켜, 아데노바이러스에 의한 암 치료 효능을 크게 증가시킨다.

아데노바이러스 지놈의 작은 부분만이 cis에서 필요한 것으로 알려져 있기 때문에 (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981)), 아네노바이러스는 대량의 외래 DNA 분자를 운반할 수 있는 능력이 있으며, 이는 특히 293과 같은 특정 세포 주를 이용하는 경우에 그러하다. 이러한 측면에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 있어서, p53 변이체 유전자 이외에 다른 아데노바이러스의 서열은 적어도 ITR 서열을 포함한다.

p53 변이체 유전자는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역)또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E3 영역에 삽입된다. 한편, 다른 외래 뉴클레오타이드 서열 (예: 사이토카인, 면역-보조자극 인자, 자살 유전자 및 종양 억제 유전자)도 추가적으로 아데노바이러스에 포함시킬 수 있으며, 이는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역)에 삽입된다. 또한, 상기 삽입 서열들은 E4 영역에도 삽입될 수 있다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는다. 본 명세서에서, 유전자와 관련하여 사용되는 용어 “비활성화”는 그 유전자의 전사 및/또는 해독이 정상적으로 이루어지지 아니하여, 그 유전자에 의해 코딩되는 정상적인 단백질의 기능이 나타나지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 비활성화 E1B 19 유전자는 그 유전자에 변이 (치환, 부가, 부분적 결실 또는 전체적 결실)가 발생되 어 활성의 E1B 19 kDa 단백질을 생성하지 못하는 유전자이다. E1B 19가 결여되는 경우에는 세포고사능을 증가시킬 수 있고, E1B 55 유전자가 결여된 경우에는 종양세포 특이성을 갖게 한다 (참조: 특허출원 제2002-23760호).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 인간 텔로미어 역전사효소 (telomere reverse transcriptase: TERT) 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 전사 조절서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로모터는 E1A 유전자의 업스트림에 위치한다. Shoji 연구팀은 hTERT 프로모터를 이용하여 암세포 특이적 유전자 발현을 유도하여 카스파아제-8과 같은 세포고사 (apoptosis)를 유도하는 독성 유전자를 암세포에서만 발현시킬 수 있었다 (Shoji, K. et al. A novel telomerase-specific gene therapy : gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter. Human Gene Therapy, 2000,11,1397-406.). 따라서, TERT 프로모터를 포함하는 본 발명의 재조합 아데오바이러스는 종양세포 특이성이 더욱 개선된다. 그러나 hTERT 프로모터만으로는 충분한 암세포 특이성을 달성하는데 한계가 있다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 TERT 프로모터는 본 발명자에 의해 개발된 m-TERT 프로모터이다 (참조: 특허출원 제2003-12364호). 본 발명자에 의해 개발된 m-TERT 프로모터의 구체적인 예는 서열목록 제9서열에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함한다. E1A 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 복제 가능한 특성을 갖게 된다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함하고, p53 변이체-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E3 영역에 삽입되어 있는 것이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 “ITR-E1A-비활성의 E1B 19-활성의 E1B 55-프로모터-p53 변이체 유전자-폴리 A 서열” 구조를 갖으며, 상기 "프로모터-p53 변이체 유전자-폴리 A 서열"은 결실된 E3 영역에 삽입된 것이다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 바람직한 일 실시예는 도 2d-도2f의 유전자 지도, 보다 바람직하게는 도 2e 또는 도 2f의 유전자 지도, 가장 바람직하게는 도 2f의 유전자 지도를 가진다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스에서, p53 변이체는 E1B 55 kDa과 mdm2 단백질에 의한 비활성화를 피할 수 있고 C-말단에 의한 부조절도 받지 않기 때문에, 감염된 세포 내에서 세포고사 유도 활성이 매우 크게 나타나 결국 우수한 종양세포 살상능을 나타낸다.

하기의 실시예에서 예증된 바와 같이, p53 변이체가 삽입된 아데노바이러스는 종양세포에서 세포고사를 통한 세포사멸을 유발하는 능력이 크게 개선되어 있고, 생체내에서도 종양세포의 성장을 크게 억제하는 작용을 한다. 그리고 p53 변이체가 삽입된 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가의 바이러스로도 높은 살상 효과를 유도할 수 있기 때문에 투여된 체내에서서의 안정성이 개선된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 본 발명의 재조합 아데노바이러스와 동일한 것이므로, 재조합 아데노바이러스에 대한 상세한 설명은 본 발명의 약제학적 조성물에도 그대로 적용된다. 따라서, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 개발된 p53 변이체 유전자-포함 재조합 아데노바이러스는 p53 활성의 증대와 세포고사 촉진을 통해 항종양 효과가 현격히 증대되며, 특히 E1B 55 유전자가 비활성화 되거나 인간 텔로미어 역전사효소 프로모터를 이용하는 경우에는, 암세포 특이적으로 세포살상능을 나타낸다. 이는 결과적으로 암치료에 필요한 바이러스 투여량을 감소시킬 수 있어 바이러스에 의한 생체내 독성과 면역반응을 크게 줄일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 뇌암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 뇌암에 이용된다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 10⁵ - 1 × 10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 10¹⁰ pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 약제학적 조성물에서, p53 변이체의 종양세포 살상능이 매우 우수하며, p53 변이체를 탑재한 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가로도 높은 종양세포 살상 효과를 유도할 수 있고, 재조합 아데노바이러스의 암세포 특이적 복제에 따른 p53 변이체의 암세포 내에서의 제한된 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

대상 세포주 및 세포배양

실험에 사용된 세포주들은 간암 세포주 (SK-Hep1, HepG2), 뇌암 세포주 (U251N, U343, U373MG, U87MG, U118MG, SNU-201), 폐암 세포주(A549), 자궁 경부암 세포주 (C33A)와 같은 인체 암세포주들과 인체 정상세포주 (IMR90, BJ, Chang, MRC5)들이며, 모두 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD)에서 구입하였다. 모든 세포주들은 10%의 우태아혈청 (GIBCO BRL, Grand island, NY)이 함유된 DMEM (GIBCO BRL, Grand island, NY)를 배양액으로 하고 항생제 페니실린/스트렙토마이신 (GIBCO BRL, Grand island, NY)을 첨가하여 5% CO₂의 존재 하에 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다.

p53 변이체 제작

p53의 C-말단 부위를 제거한 p53△30, p53의 N-말단 부위를 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus)의 VP16 전사활성 부위로 치환한 p53-VP, 그리고 p53의 N-말단 부위를 VP16 전사활성 부위로 치환하고 동시에 C-말단 부위를 제거한 p53△30-VP 변이체를 제작하였다.

(i) p53△30 제조

인간 p53 단백질의 C-말단에는 DNA 결합을 역으로 조절할 수 있는 영역이 존재한다. 따라서 생체 내에서 야생형 p53보다 높은 활성을 갖는 p53을 제조하기 위해 C-말단 부위를 유전적으로 변형시켰다. Johns Hopkins 대학의 Vogelstein 박사로부터 얻은 야생형의 p53 유전자를 아래의 PCR 기법을 이용해 증폭시킨 후, 이것을 pCEP4 플라스미드 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 이때 PCR에 사용한 프라 이머는 다음과 같다: 5‘ hp53-1 5'-GAT CCT CGA GAT GGA GGA GCC GCA GTC A-3 3'; 및 3‘ hp53-term 5'-GAT CGG ATC CTC AGT CTG AGT CAG GCC CTT C-3'. C-말단 부위에 있는 부조절 부위를 제거하는 과정은, 야생형의 인간 p53을 가지고 있는 상기 pCEP4-hp53를 PCR 프라이머 세트로 증폭한 후, XhoI과 BamHI 제한효소로 절단하여 CMV 프로모터를 가지고 있는 pCEP4 벡터에 클로닝 하여 실시하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 다음과 같다: 5‘ hp53-1 5'-GAT CCT CGA GAT GGA GGA GCC GCA GTC A-3'; 및 5‘ hp53-del30 5'-GAT CGG ATC CTC ACC TGC TCC CCC CTG GCT C-3'.

이렇게 하여 제작된 p53Δ30의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열 및 제4서열에 기재되어 있다.

(ii) VP16 전사활성 부위를 갖는 p53 변이체의 제조

p53 단백질의 전사활성은 암세포에서 세포자살을 유도하는데 결정적인 역할을 한다. 그런데 생체 내에서 p53의 활성도는 다운스트림 타깃 유전자인 mdm2에 의해 피드백 조절을 받는다. p53 항암유전자에 돌연변이가 발생하지 않았어도 이것의 안정성을 조절하는 mdm2 유전자의 발현이 이상적으로 높은 경우, 육종, 신경아세포종, 신경교종 그리고 유방암과 같은 암이 유발된다. 이것은 Mdm2가 p53 단백질의 전사활성 부위인 N-말단에 결합해 p53 단백질에 유비퀴틴화 (ubiquitination)를 유도함으로써 p53의 분해를 촉진시키기 때문이다. 따라서 Mdm2의 발현이 높은 암의 경우에는 야생형의 p53을 도입하더라도 암세포 내에 이미 존재하고 있는 Mdm2에 의해 분해가 일어나므로 p53에 의한 암세포 파괴효과를 크게 기대하기가 어렵다. 따라서 Mdm2의 과발현 때문에 일어난 일부의 암에 적용하기 위해 (1) Mdm2의 결합부위인 p53의 N-말단을 제거하고, (2) 강한 전사활성을 부여 할 목적으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 전사활성부위를 p53의 전사활성부위와 교체하는 스와프 실험 (swap experiment)를 수행하였다. 이는 p53과 유사한 활성을 보이는 p53 유도체를 만들어 항암 치료에 응용하려데 목적이 있다. 또한 p53의 C-말단 부위(부조절부위)를 제거한 p53인 p53(△30)의 N-말단에 VP16의 전사활성부위를 도입한 융합 컨스트럭트도 제조했다. VP16-p53과 VP16-p53(△30) 융합 컨스트럭트들은 PCR 프라이머들을 제조한 후, 앞과 유사한 방법으로 PCR을 통해 만들었다.

VP16의 트랜스활성화 도메인을 다음과 같은 VP16 트랜스활성화 도메인 증폭용 프라이머 세트 (5‘ VP16과 3’VP16) 및 pVP16 (BD Biosciences)을 이용해 PCR 증폭한 후 아가로스 젤에서 분리 및 정제하였다: 5‘ VP16 5'-GAT CCT CGA GAT GAA GCT ACT GTC TTC T-3', 3' VP16 5'-GAA GCT TCT GCA GAC GCG TCG. 그리고, 5‘ hp53-84와 3' hp53-term프라이머 세트와 상기 pCEP4-hp53를 이용해 인간 p53 유전자 부위를 증폭하고 아가로스 젤에서 분리 및 정제하였다: 5' hp53-84 5'-CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA, 3‘ hp53-term 5'-GAT CGG ATC CTC AGT CTG AGT CAG GCC CTT C-3'. VP16 트랜스활성화 부위에 대한 PCR 산물과 hp53 PCR 산물을 DNA 리가아제를 이용해 라이게이션한 후 XhoI과 BamHI으로 절단하고, 아가로스 젤 전기영동을 통해 원하는 밴드를 분리하였다. 분리한 DNA 단편은 동일 제한효소로 절 단한 pCEP4 벡터에 클로닝 하였다. 이렇게 하여 제작된 p53-VP의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제5서열 및 제6서열에 기재되어 있다.

한편, p53Δ30-VP 변이체는 다음과 같이 제조 하였다. VP16의 트랜스활성화 도메인 유전자의 증폭은 상술한 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하였다. 이어, p53Δ30 유전자의 증폭을 상술한 과정에 따라 실시하였다. VP16 트랜스활성화 부위에 대한 PCR 산물과 p53△30 PCR 산물을 DNA 리가아제를 이용해 라이게이션한 후 XhoI과 BamHI으로 절단하고, 아가로스 젤 전기영동을 통해 원하는 밴드를 분리하였다. 분리한 DNA 단편은 동일 제한효소로 절단한 pCEP4 벡터에 클로닝 하였다. 이렇게 하여 제작된 p53Δ30-VP의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제7서열 및 제8서열에 기재되어 있다.

p53 변이체를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스의 제작

야생형 p53과 함께 3종류의 변이체 p53들을 각각 아데노바이러스의 E1 셔틀벡터인 pCA14 (Microbix, Ontario, Canada)에 XhoI / EcoRV 제한효소를 이용하여 클로닝하여 pCA14-p53△30, pCA14-p53-VP, pCA14-p53△30-VP, 그리고 pCA14-p53을 제작하였다. 제작된 4종류의 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈벡터인 dl324BstBI (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입; Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))와 함께 대장균 BJ5183 (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입)에서 상동 재조합시켜 dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP, 또는 dl/p53△30-VP 아데노바이러스를 제작하였다. 제작된 모든 바이러스들은 PacI 제한효소로 절단하여 선형화시킨 후, 아데노바이러스 생산세포주인 HEK293 (Microbix, 캐나다국)에 lipofectamin (GIBCO BRL, Carlsbad, CA)을 이용하여 형질전환하여 바이러스를 생산하였다. 생산된 아데노바이러스들은 HEK293 세포주에 재감염시키고 아데노바이러스를 증식시켜 한계희석 방법과 플라크 분석으로 아데노바이러스의 역가를 결정하였다. 동물실험을 위해서 CsCl 농도구배 방법으로 아데노바이러스를 농축하여 순수 분리하였다.

p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 제작

p53의 C-말단 부위를 제거한 p53△30, p53의 N-말단 부위를 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 전사활성 부위로 치환한 p53-VP, 그리고 p53의 N-말단 부위를 VP16 전사활성 부위로 치환하고 동시에 C-말단 부위를 제거한 p53△30-VP 변이체들을 야생형 p53과 함께 각각 아데노바이러스의 E3 셔틀벡터인 pSP72△E3 (Promega, Madison, WI, USA)의 BamHI 부위에 삽입하여 pSP72△E3-p53△30, pSP72△E3-p53△30-VP 그리고 pSP72△E3-p53을 제작하였다. 제작된 3종류의 E3 셔틀벡터를 각각 XmnI 제한효소를 처리하여 단일가닥으로 만든 다음 Spe Ⅰ 제한효소를 처리하여 단일가닥이 된 종양 선택적 살상 아데노바이러스 토탈벡터인 Ad/m△19 (KCCM-10470, 대한민국 특허출원 제2003-12364호)와 함께 대장균 BJ5183에서 상동 재조합시켜 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스를 각각 제작하였다. 제작된 모든 바이러스들은 PacI 제한효소로 절단하여 선형화시킨 후, HEK293에 lipofectamin(GIBCO BRL, Carlsbad, CA)을 이용하여 형질전환하여 바이 러스를 생산하였다.

p53 변이체의 활성 비교 검증

제작된 각 p53 변이체의 세포 내에서의 활성 정도를 비교하기 위해, polyoma virus minimal promoter의 ribosomal gene cluster upstream으로부터 유래된 13 copy의 p53 결합부위가 luciferase 유전자 앞에 위치한 pG13-luciferase 벡터 (Johns Hopkins 대학에 있는 Vogelstein 박사로부터 제공받음; El-Deiry W, Kern S E, Pietenpol J A, Kinzler K W, Vogelstein B. Nat Genet. 1:45-49(1992); El-Deiry W, Tohino T, Velculescu V E, Levy D B, Parsons R, Trent J R, Lin D, Mercer W E, Kinzler K W, Vogelstein B. Cell. 75:817-825(1993))를 이용하여 루시퍼라아제 분석을 시행하였다. 자궁 경부암 세포주 C33A에 각각의 p53 변이체 또는 야생형 p53 유전자를 pG13-luciferase 또는 음성대조군 벡터인 MG15-luciferase와 함께 형질전환한 뒤 48시간 이후에 세포를 해리하였다. 해리된 세포용액을 원심분리한 후, 상층액만을 모아 개똥벌레 루시퍼라아제와 renilla 루시퍼라아제를 일정량 반응시킨 뒤 루시퍼라아제의 발광양을 측정해 p53의 활성 정도를 정량화하였다.

p53 변이체를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 세포 살상 효과 검증 ( CPE 분석)

p53 변이체를 발현하는 복제 불능 또는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능을 검증하기 위해, 인체 간암 세포주 (SK-Hep1, HepG2), 뇌암 세포주 (U251N, U343, U373MG, U87MG, U118MG, SNU-201), 폐암 세포주 (A549), 자궁 경부암 세포주 (C33A)와 같은 인체 암세포주들과 인체 정상세포주 (IMR90, BJ, Chang, MRC5)를 여러 역가의 아데노바이러스로 감염시킨 후 세포의 사멸 정도를 관찰하였다. 세포 살상의 정도는 0.5% 크리스탈 바이올렛 (in 50% 메탄올) 용액으로 염색하여 비교 분석하였다.

MTT 분석을 이용한 재조합 아데노바이러스의 세포 살상 효과 비교 검증

아데노바이러스 감염에 의한 세포 살상 정도를 보다 정량화하기 위해, 여러 종류의 암세포들과 정상세포주들을 24-웰 플레이트에 분주하고 24시간 후 여러 역가의 아데노바이러스를 감염시켰다. 바이러스 감염 후 2, 4, 6 및 8일째에 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 2 mg/ml) 용액을 각 웰 당 250 ㎕씩 넣고 37℃ 항온 배양기에서 4시간동안 배양 후 1 ml의 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하고 37℃에서 10분간 방치한 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률은 측정된 흡광도 값을 이용하여 다음의 수식으로 산출하였다: 생존율(%) = [(실험군의 평균 색소 흡수률 - 기준 색소 흡수률)/(대조군의 평균 색소 흡수률 - 기준 색소 흡수률)] x 100

면역블롯팅 분석

복제 불능 또는 복제 가능 아데노바이러스에 의해 발현되는 3 종류의 p53 변 이체와 야생형 p53의 단백질을 확인하기 위해, 293 세포주에 dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP, dl/p53△30-VP 아데노바이러스 또는 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP를 각각 2 MOI로 감염시키고 2일 뒤에, 라이시스 완충액 (50 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 0.5% NP-40, 프로테아제 억제제: PMSF, TLCK, TPCK)로 세포들을 용해시켜 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 시행하였다. 전기영동 후 젤에 있는 단백질들을 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막에 전기-전이시킨 다음, p53 또는 p21 단백질을 특이적으로 인지하는 항체 (pAb 240, 6A7; BD Biosciences, San Jose, CA)와 β-액틴 (Sigma, St. Louis, MO)을 일차 항체로 반응시키고 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 염소 항-마우스 IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)로 다시 반응시킨 후 ECL (enhanced chemiluminescence: sc-2048; SantaCruz Biotech., Santa Cruz, CA)을 이용해 p53 또는 p21 단백질의 발현 양상을 검증하였다.

FACS 분석

p53에 의해 유도되는 세포사를 FACS (flow cytometry analysis cell sorting) 분석을 통해 검증하였다. U343, U373MG, A549 및 U251N 세포주(1 x 10⁶개)를 25T 플라스크에 분주한 다음 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스 또는 양성 대조군으로 1 μM CPT(camptothecin)-11을 처리한 후 48시간 뒤에 감염된 세포들을 회수하여 1 x 결합 완충액으로 세척한 다음, ApoAlert Annexin V-FITC 아폽토시스 키트 (CLONTECH, Polo Alto, CA)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 Annexin V/PI 이중 염색 (double staining)하여 유세포 분석을 시행하였다.

튜널 분석을 통한 세포고사 관찰

p53 유전자가 세포사에 미치는 영향을 알아보기 위해, TUNEL 분석을 실시하였다. U343, U373MG, A549 그리고 U251N을 5 x 10⁴ 개로 챔버 슬라이드에 분주하고 각각의 바이러스를 3 MOI로 감염시키고 24시간 후에 배지를 제거한 뒤 ApoTag Kit (Intergen, Purchase, NY)을 이용해 제조회사가 제시한 방법에 따라 TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)-매개 dUTP 닉 말단 표지 (TUNEL) 분석을 시행하였다. 발색여부를 확인하기 위해 퍼옥시다아제와 결합된 아비딘을 사용하여 DAB (3,3’-diaminobenzine; Dako, Carpinteria, CA)와 반응시킨 후 세포들이 갈색으로 변하는 것이 육안으로 확인되면 증류수로 3회 세척하고, 0.5% 메틸 그린으로 10분간 염색하였다. 다시 증류수로 3회 세척한 후 커버 글래스로 고정시켜 현미경으로 관찰하여 현미경 상에서 네 곳 이상의 부위를 무작위로 정하여 전체 세포들 중 염색된 세포의 비율을 계산하였다.

생체 내 항종양 효과 검증

생후 6-8주 정도 경과된 누드마우스에 1 x 10⁷개의 인체 뇌암 세포주 U343을 마우스의 복벽 피하에 주사하였다. 종양의 크기가 약 50-80 ㎣ 정도 성장하였을 때 5 x 10⁷ plaque forming unit(PFU)/50 ㎕ 또는 1 x 10⁷ plaque forming unit(PFU)/50 ㎕ 용량으로 야생형 p53 또는 3 종류의 p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스와 음성 대조군인 PBS를 종양 내에 직접 1, 3 그리고 5일째에 투여하고 종양의 성장을 관찰하였다. 종양의 용적은 캘리퍼를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정한 후 다음과 같은 공식으로 산출하였다: 종양의 용적= (단축 mm)²x 장축mm x 0.523. 종양의 용적 비교는 Mann-Whitney test를 이용하여 통계학적으로 분석하였다.

실험 결과

p53 변이체의 활성도 검증

제작된 각 p53 변이체의 세포 내에서의 활성 정도를 비교하기 위해, 13 copy의 p53 유전자 결합부위가 루시퍼라아제 유전자 앞에 삽입된 pG13-luciferase 벡터에 p53 변이체가 결합하는 양을 측정하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, p53의 C-말단 부위를 제거한 p53△30, p53의 N-말단 부위를 헤르페스 심플렉스 바이러스의 VP16 전사활성 부위로 치환한 p53-VP, 그리고 p53의 N-말단 부위를 VP16 전사활성 부위로 치환하고 동시에 C-말단 부위를 제거한 p53△30-VP 변이체들의 활성도가 야생형 p53보다 모두 증가하였다. 또한 활성도 정도는 p53△30, p53△30-VP, p53-VP의 순서대로 증가하였으며, 특히 p53△30와 p53△30-VP의 활성은 야생형 p53에 비해 약 3-4배로 크게 증가하였다. 그러나 음성 대조군인 p53의 결합 부위가 변이되어 있는 MG15-luciferase 벡터를 이용한 경우에는 야생형 p53과 p53 변이체의 활성도는 거의 측정되지 않았다.

p53 변이체를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 제작 및 세포 살상 효과 비교 검증

아데노바이러스의 세포고사 유도능을 증가시키기 위해 복제 불능 아데노바이러스인 dl/Z의 E1 부위에 p53 유전자를 삽입한 아데노바이러스들을 제작한 후 (도 2a), 세포 살상 효과를 비교 검증하였다. dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP 및 dl/p53△30-VP 아데노바이러스와 대조군으로서 복제 불능 아데노바이러스인 dl/Z를 여러 종류의 종양세포주와 정상세포주에 여러 역가로 각각 감염시킨 뒤 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다.

도 3에서 보듯이 음성대조군인 dl/Z로 감염된 암세포들 (A549, HepG2, C33A, U251N, U343, U373MG 및 SNU-201)에서는 바이러스의 증식에 의한 세포 살상 효과가 관찰되지 않았으나, 야생형 p53과 p53 변이체를 발현하는 아데노바이러스의 경우, p53을 발현하지 않는 대조군 바이러스인 dl/Z에 비해 모두 증가된 높은 암세포 살상을 보였다. 또한, p53 변이체들에 의한 세포 살상능을 비교해본 결과 C-말단부위가 소실된 p53△30을 발현하는 dl/p53△30 복제 불능 아데노바이러스의 세포 살상능이 가장 높았다. 특히, 인체 폐암 세포주인 A549와 뇌암 세포주인 U343, U373MG 및 U251N에서는 dl/p53에 비해 약 50배 정도 높은 암세포 살상 효과를 나타 내어 p53 변이체의 발현으로 인한 현저히 증가된 암세포 살상능을 확인할 수 있었다 (도 3).

p53 변이체 발현에 따른 암세포 살상능 상승효과를 보다 정량화하기 위해서, 바이러스를 처리한 후 살아있는 세포의 생존률을 측정할 수 있는 MTT 분석을 시행하였다. A549, U373MG 및 U251N 세포주는 50 MOI 역가로, 그리고 U343 세포주는 100 MOI 역가로 dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP 또는 dl/p53△30-VP 복제 불능 아데노바이러스바이러스로 각각 감염시킨 뒤 A549, U373MG 및 U343N 세포주는 6일, 그리고 U251N 세포주는 8일 후에 살아남은 세포의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 본 실험에 이용된 모든 암세포주들에서 야생형 p53과 p53 변이체 발현에 의한 암세포 살상능이 음성 대조군인 dl/Z에 비해 크게 증가되었으며, 특히 dl/p53△30 아데노바이러스로 감염시킨 경우에는, 약 60-80% (U343, U251N, A549 및 U373MG)의 높은 세포 살상을 유도하였다.

p53 변이체 발현에 따른 세포고사 유도를 암세포 특이적으로 유도하기 위하여, 암세포에서만 선택적으로 증식할 수 있는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad/m△19의 E3 부위에 야생형 p53과 3종류의 p53 변이체를 각각 삽입하여 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스를 제작하였다(도 2b).

이들 제작된 아데노바이러스들의 세포 살상 효과를 비교 검증하기 위해, 여러 종류의 암세포주와 정상세포주에 각각 감염시킨 뒤 세포살상 정도를 비교 관찰하였다. 도 5에서 보듯이 음성 대조군인 dl/Z로 감염된 암세포들 (U87MG, U343, C33A, SK-Hep1, SNU-201, U118MG 및 U87MG)에서는 바이러스의 증식에 의한 세포 살상 효과가 관찰되지 않았으나, 복제 가능 아데노바이러스들인 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP로 감염시킨 경우에는 투여한 바이러스의 역가에 비례하여 세포 살상능이 증가됨을 확인하였다. 특히, p53의 N-말단 부위를 VP16 전사활성 부위로 치환하고 동시에 C-말단 부위를 제거한 p53을 발현하는 아데노바이러스인 Ad/m△19-p53△30-VP로 감염된 경우에는, 대조군 바이러스인 Ad/m△19와 다른 종류의 p53 변이체를 발현하는 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30에 비해 훨씬 증가된 암세포 살상 효과를 유도하였다. U87MG 세포주의 경우, Ad/m△19-p53△30-VP의 세포 살상능이 야생형 p53을 발현하는 Ad/m△19-p53에 비해 약 10배 정도, 그리고 U343과 SNU-201, U118MG 세포주의 경우에는 약 4-5배 정도 증가하였다. 이상의 결과들을 통해 p53 변이체 유전자, 특히 p53△30-VP를 삽입한 경우에 암세포 특이적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상효과가 현저히 증가됨을 확인하였다. 이와는 대조적으로, MRC5와 IMR90과 같은 정상세포주들에서는 야생형 p53과 p53 변이체 발현에 의한 암세포 살상능이 크게 증대되지 않아, 활성이 증대된 p53 변이체의 고발현에 따른 정상세포에서의 부작용이 거의 없음을 확인하였다.

또한, U343, U373MG 및 A549 세포주는 3 MOI 역가로, 그리고 U251N 세포주는 1 MOI 역가로 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 또는 Ad/m△19-p53△30-VP로 각각 감염시킨 뒤, U343, U373MG, A549 세포주는 5일 뒤, 그리고 U251N 세포주는 8일 후에 살아남은 세포의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 본 실험에 이용된 모든 세포주들에서 종양 선택적 살상 아데노바이러스 (Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP)의 세포 살상능이 복제 불능 아데노바이러스인 dl/Z에 비해 크게 증대되었다. 또한, 야생형 p53과 p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 세포 살상능은 U343 세포주를 제외한 다른 세포주들에서 대조군 바이러스인 Ad/m△19에 비해 세포 살상능이 증가하였으며, 특히, Ad/m△19-p53△30-VP의 세포 살상능이 가장 우수하였다.

p53 변이체를 발현하는 아데노바이러스로 감염된 암세포에서의 p53 , p21 단백질 발현 양상 비교

야생형 p53 및 변이체 p53을 발현하는 아데노바이러스에 의해 유도되는 p53의 발현 양상을 비교 검증하기 위해, U343 세포주를 dl/p53, dl/p53△30, dl/p53-VP, 또는 dl/p53△30-VP 복제 불능 아데노바이러스로 각각 감염시킨 뒤 48시간 경에 세포를 회수하여 야생형 및 변이체 p53을 모두 검출할 수 있는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 시행하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 음성 대조군인 dl/Z 바이러스로 감염된 경우에는 p53이 매우 약하게 검출된 반면, p53을 발현하는 모든 종류의 바이러스로 감염된 세포들에서는 p53이 보다 강하게 검출되었다. 특히, p53의 부조절 기능만이 상실된 dl/p53△30 바이러스에 의한 p53 발현이 가장 크게 증대되었으며, dl/p53-VP와 dl/p53△30-VP 바이러스에 의한 p53 발현도 크게 증대되었다. 이러한 p53의 발현 정도는 앞서 진행된 p53 활성 정도와 세포 살상능 검증을 위한 실험 결과를 뒷받침하는 결과이다.

또한, 야생형 및 변이체 p53을 발현하는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스 들인 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP와 대조군 바이러스인 Ad/m△19로 U343 세포주를 각각 감염시킨 뒤, p53, p21, Bax, 그리고 mdm2의 발현양상을 검증하였다. p53의 C-말단 부위가 제거된 2종류의 변이체 p53을 발현하는 아데노바이러스 (Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP)로 감염된 세포주에서의 p53 발현이 Ad/m△19-p53 아데노바이러스로 감염된 경우에 비해 현저히 증가되었으며, 특히 C-말단 부위가 제거되고 동시에 N-말단 부위가 VP16 전사활성 부위로 치환된 Ad/m△19-p53△30-VP에 의한 p53 발현량이 가장 크게 증가되었다. 이와 같은 결과들로, E1B 55 kDa 유전자가 내재하는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스를 이용하여 야생형 및 변이체 p53을 발현하는 경우에는, 부조절 기능이 상실되고 동시에 N-말단이 VP16 전사 활성 부위로 치환되어 E1B 55 kDa의 결합에 의한 p53의 불활성화를 우회할 수 있는 Ad/m△19-p53△30-VP에 의한 p53 발현이 가장 높음을 확인하였다. 또한 p21의 발현 양상을 검증해본 결과, 음성 대조군인 Ad/m△19 바이러스로 감염시킨 경우에 비해 야생형 및 변이체 p53을 발현하는 모든 종류의 아데노바이러스로 감염시킨 경우에 p21의 발현이 크게 증가하였다. 이들 결과를 통해, 활성이 증대된 p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스들에 의해 p53 발현량이 크게 증대되고, 또한 p53의 발현 증대로 인해 p21의 발현도 증가함을 알 수 있었다.

Annexin V/PI 염색과 유세포 분석을 통한 세포 사멸 기전 검증

야생형 및 변이체 p53 발현에 따른 세포고사 증대효과를 알아보기 위해, 초 기 세포고사 빈도를 확인할 수 있는 FACS 분석을 시행하였다. U343, U373MG, A549, 그리고 U251N 세포주를 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP 아데노바이러스로 MOI 10의 역가로 각각 감염시키고 48시간 뒤에 세포를 회수하여, 세포고사 진행정도를 Annexin-V와 프로피듐 요오다이드 (PI)로 이중염색(double staining)하여 확인하였다. Annexin-V는 세포고사 초기에 세포막 밖으로 유출되어 나온 포스파티딜세린 (PS)를 검출할 수 있는 반면에, PI는 세포사 후기에 세포막의 파괴로 PI가 세포 내로 들어가 핵 내에 있는 크로마틴과 결합할 수 있어 세포괴사 (necrosis)의 특징을 확인할 수 있다. 따라서 Annexin-V^-/PI^-는 건강한 세포를 의미하며, Annexin-V⁺/PI^-는 초기 세포고사가 일어난 세포, 그리고 PI⁺ 세포는 세포괴사가 일어난 세포를 의미한다. 세포고사를 유도하는 양성 대조군으로 이용된 1 μM의 CPT-11을 처리한 U343 세포의 경우에는 약 34.46%(Annexin-V⁺/PI^-)의 세포들이 세포고사로 진행되었으며, U373MG, A549 및 U251N 세포에서도 각각 13.11%, 42.82% 및 23.88%의 세포들이 세포고사로 진행되었다. Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP에 의해 감염된 U343 세포주에서는 각각 3.63%, 3.18%, 7.12% 및 12.29%의 세포들에서 세포고사가 유도되었고, U373MG 세포주는 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP 바이러스를 감염시킨 경우, 각각 8.92%, 7.86%, 8.15% 및 12.22%의 세포들에서, A549 세포주에서는 각각 25.10%, 25.98%, 25.64% 및 28.74%의 세포들에서, 그리고 U251N 세포주에서는 각각 8.01%, 15.96%, 16.32% 및 24.03%의 세포들에서 세포고사 가 유도되었다 (도 9). 이러한 결과들에 의해, U373MG, A549 및 U251N 세포의 경우에 의해서는 야생형 p53뿐 아니라 2종류의 변이체 p53을 발현하는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스들에 의해 세포고사가 크게 증대됨을 확인할 수 있었으며, 특히 Ad/m△19-p53△30-VP에 의해 감염된 경우에는 실험에 사용된 모든 세포주들에서 가장 효과적인 세포고사가 유도됨을 확인하였다. 또한, 세포고사 및 세포괴사에 의한 총체적인 세포사 (Annexin-V⁺ + PI⁺)를 비교해 볼 때도, Ad/m△19-p53△30-VP 바이러스 감염에 의한 세포사 비율이 현저히 증가하여, U343, U373MG, A549 및 U251N 세포주의 경우에는 각각 38.55%, 50.76%, 68.77% 및 47.82%로서 Ad/m△19 (31.72%, 24.63%, 53.13%, 38.88%)와 Ad/m△19-p53 (23.56%, 27.23%, 61.59%, 44.59%), Ad/m△19-p53△30 (26.54%, 32.1%, 64.39%, 47.93%)에 의한 세포사 비율에 비해 크게 증가하였다.

TUNEL 분석를 통한 세포 사멸 기전 검증

야생형 및 변이체 p53 발현에 따른 세포고사 증대효과를 알아보기 위한 또 다른 방법으로, 세포고사의 중요한 생화학적 특징 중의 하나인 DNA 절편화를 TUNEL 분석으로 검증하였다. 야생형 및 변이체 p53을 발현하는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP와 대조군 아데노바이러스로서 Ad/m△19를 MOI 3 역가로 U251N, 인체 뇌암 세포주에 감염시키고 48시간 뒤에 TUNEL 분석을 시행하여 세포핵 내의 DNA 절편화를 관찰하였다. 도 10 및 표 1에서 볼 수 있듯이, U251N 세포주가 Ad/m△19로 감염된 경우는 약 21.33%의 세포들이 갈색으로 흐리게 염색된 반면, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, 또는 Ad/m△19-p53△30-VP에 의해 감염된 경우에는 현저히 증가된 세포들 (30.04%, 39.57% 및 72.14%)이 진한 갈색으로 염색되어 높은 빈도로 세포고사가 유도됨을 확인할 수 있었다. 특히, 부조절 기능이 상실된 변이체 p53을 발현하는 Ad/m△19-p53△30 또는 Ad/m△19-p53△30-VP으로 감염된 경우의 세포고사 빈도가 야생형 p53을 발현하는 Ad/m△19-p53으로 감염된 경우에 비해 크게 증가하였음을 확인하였다. 또한, U343, U373MG 및 A549 세포주에서도 Ad/m△19-p53△30-VP로 감염된 경우에 유도되는 세포고사 빈도가 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, 또는 Ad/m△19-p53△30으로 감염된 경우보다 훨씬 증가되었음을 관찰할 수 있었다 (표 1).

처리 종류	아폽토시스 세포 비율 (%)
	U251N	A549	U373MG	U343
비처리	4.12± 3.12	5.34± 1.97	2.21± 3.57	3.67± 2.61
CPT	85.97± 7.21	70.48± 3.23	75.23± 9.32	86.45± 8.56
Ad/m△19	21.33± 4.35	23.27± 3.72	13.85± 8.52	19.55± 2.05
Ad/m△19-p53	30.04± 5.87	28.94± 7.82	19.89± 2.32	15.84± 1.41
Ad/m△19-p53△30	39.57± 2.56	32.29± 5.98	25.27± 5.32	30.04± 1.71
Ad/m△19-p53△30-VP	72.14± 8.45	56.32± 4.87	61.08± 3.25	64.14± 1.62

p53 변이체를 발현하는 복제 가능 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과 검증

야생형 및 변이체 p53을 발현하는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스들(Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30 및 Ad/m△19-p53△30-VP)의 생체내 항종양 효과를 비교 검증하기 위해, U343 인체 뇌암 세포주를 누드마우스에 접종한 후 형성된 종양에 5 x 10⁷ PFU의 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3번 종양내 투여한 후 종양의 성장을 관찰하였다. 음성 대조군인 PBS를 투여받은 누드마우스의 경우, 바이러스 투여 후 28일에 종양의 크기가 1,346± 391.2 mm³ 정도로 종양이 급격히 성장하였으나, 종양 선택적 살상 아데노바이러스들인 Ad/m△19, Ad/m△19-p53, Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP를 투여 받은 누드마우스의 경우는 종양의 성장이 크게 지연됨을 확인할 수 있었다 (도 11). 특히, Ad/m△19-p53△30 또는 Ad/m△19-p53△30-VP을 투여 받은 누드마우스의 경우에는 바이러스 투여 후 30일경에 종양의 크기가 각각 153.7± 103.8 mm³과 94.2± 36.2 mm³로 뚜렷한 항종양 효과를 유도하였다 (p＜ 0.05). 하지만, 야생형 p53을 발현하는 Ad/m△19-p53을 투여한 경우 (231.3± 63.2 mm³, 바이러스 투여 후 28일)에는 대조군 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad/m△19를 투여한 경우 (209.9± 72.3 mm³, 바이러스 투여 후 28일)보다 낮은 항종양 효과를 유도하였다. 상기의 실험결과들에서 확인된 바와 같이 4 종류의 복제 가능 아데노바이러스에 의한 항종양 효과가 매우 우수하여, 야생형 p53 또는 p53 변이체를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스들에 의해 유도되는 항종양 효과의 유의한 차이를 알아보기 어려웠다. 따라서 누드마우스에 투여하는 바이러스의 용량을 5배 낮추어 동일한 실험을 반복하였다. 즉, U343 인체 뇌암 세포주를 누드마우스에 접종한 후 형성된 종양에 1 x 10⁷ PFU의 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3번 종양내 투여한 후 종양의 성장을 관찰하였다. 도 12에서 볼 수 있듯이, 야생형 p53을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad/m△19-p53에 비해 p53 변이형을 발현하는 3 종류의 종양 선택적 살상 아데노바이러스들인 Ad/m△19-p53△30, Ad/m△19-p53△30-VP들의 항종양 효과가 보다 개선되었으며, 이들 중 특히 Ad/m△19-p53△30-VP의 항종양 효과가 가장 높음을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 야생형과 비교하여 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체 단백질, 이를 코딩하는 핵산 분자 및 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스 및 상기 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다. 본 발명의 p53 변이체는 종양세포 살상능이 매우 우수하며, p53 변이체를 탑재한 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가로도 높은 종양세포 살상 효과를 유도할 수 있고, 재조합 아데노바이러스의 암세포 특이적 복제에 따른 p53 변이체의 암세포 내에서의 제한된 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고 문헌

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서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

1. 서열목록 제5서열 또는 제7서열의 아미노산 서열로 구성되는 야생형과 비교하여 종양세포 살상능이 개선된 p53 변이체 단백질.
2. 삭제
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7. 삭제
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9. 상기 제 1 항의 p53 변이체 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제6서열 또는 제8서열의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
11. 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체에 있어서, 상기 목적 뉴클레오타이드 서열은 상기 제 9 항 또는 제 10 항의 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 배시니아 바이러스, 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
14. 아데노바이러스의 ITR (inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열 및 상기 제 9 항의 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자 영역이 결실된 것이고, 상기 제 9 항의 p53 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 상기 E3 유전자 영역의 위치에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
16. 제 14 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
17. 제 14 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
18. 제 14 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 텔로미어 역전사효소 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상의 Sp1 결합부위 중 어느 하나 이상을 포함하는 전사 조절서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
19. 제 14 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 도 2d-도2f에서 선택되는 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
20. (a) 상기 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.

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