KR100501881B1 - 피53단백질변이체및이의치료적용도 - Google Patents

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Abstract

종양 억제인자 유전자 p53의 산물로부터 유도되고 치료적 사용을 위한 증진된 기능을 지닌 단백질이 기술됨. 단백질은 특히 야생형 p53 단백질이 불활성화되는 증식성 질환 컨텍스트에 있어서 유리하게는 증진된 종양 억제인자 및 프로그래밍된 세포 치사 유도인자 기능있다. 이러한 분자를 암호화하는 핵산, 이를 함유하는 벡터, 및 특히 유전자 요법에 있어서 이들의 치료적 용도 또한 기술됨.

Description

피53 단백질 변이체 및 이의 치료적 용도
본 발명은 치료에 사용하기 위한 기능이 향상된, 종양 억제인자 유전자 p53의 산물로부터 유도된 단백질에 관한 것이다. 유리하게는, 본 발명은 특히 야생형 p53 단백질이 불활성화되는 증식의 병리적 상황에서 야생형 p53 단백질보다 우수한 종양 억제인자 및 프로그래밍된 세포 치사 유도기능을 지닌 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 분자를 암호화하는 핵산, 이를 함유하는 벡터 및 특히 유전자 요법에 있어서의 이들의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 산물은 특히 암과 같은 병리적 상황에 있어서 p53의 기능복구에 특히 적용된다.
야생형 p53 단백질은 세포 주기의 조절 및 세포 게놈의 온전성 유지에 관여되어 있다. 이러한 단백질은 주된 기능이 일부 유전자 전사의 활성화인자이며, 아직은 잘 규정되지 않은 어떤 과정에 의하여, 게놈 복제중 돌연변이 출현 동안 세포 주기의 G1기에 있는 세포를 차단하고, 다수의 DNA 수선 과정을 촉발시킬 수 있다. 더욱이, 이러한 수선 과정의 기능부전 또는 지나치게 많아 교정될 수 없는 돌연변이가 출현하는 경우, 이러한 단백질은 아폽토시스라 불리는 프로그래밍된 세포 치사 현상을 유도할 수 있다.
이러한 방식으로, p53 단백질은 비정상적으로 분화된 세포 또는 게놈이 손상을 입은 세포를 제거함으로써 종양 억제인자로서 작용한다.
p53의 이러한 주요 기능은 전사 인자로서의 자체의 기능, 다시 말하면 게놈 DNA 수준에서의 특정 서열 인식능 및 일반적 전사 머시너리 채용능의 이중 능력에 좌우된다.
p53 단백질은 5개의 기능성 영역을 규정하는 393 개의 아미노산을 포함한다(도 1 참조):
- 1 내지 73 번 아미노산으로 이루어지고 TBP 단백질과 같은 일반적 전사 머시너리의 일부 인자와 결합할 수 있는 전사 활성화 영역. 이러한 영역은 또한 다수의 후-전사 변형을 위한 자리이다. 이는 또한 p53 단백질과 다수의 기타 단백질, 특히 세포 단백질 mdm2 또는 엡스타인-바 바이러스의 단백질 EBNA5(EBV)(이들은 야생형 단백질의 기능을 차단할 수 있다)와의 다수의 상호작용 부위이기도 하다. 더욱이, 이러한 영역은 단백질 분해 민감성에 대한 PEST라는 아미노산 서열을 가지고 있다;
- 아미노산 73 내지 315 번 사이에 위치한 DNA 결합 영역. p53의 이러한 중앙 영역의 형태는 p53 단백질에 특이성을 띠는 DNA 성열의 인지를 조절한다. 이러한 영역은 야생형 단백질의 기능에 영향을 미치는 두가지 유형의 변형을 위한 자리이다:
(i) SV40 바이러스의 "대형 T" 항원 또는 우비퀴틴 시스템에 의한 자체 분해를 초래할 수 있는 HPV16 및 HPV18 바이러스의 E6 바이러스 단백질과 같은 p53의 기능을 차단하는 단백질과의 상호작용은 세포 단백질 E6ap(우비퀴티닐화 캐스케이드의 효소 E3)의 존재하에서만 발생할 수 있다;
(ii) p53의 기능에 영향을 미치는 점 돌연변이. 실질적으로 이의 전부는 이러한 영역에 위치하여 있다;
- 아미노산 315 내지 325번으로 이루어지고 자신의 주 기능을 발휘하는 구획내 단백질의 올바른 지향에 필수인 핵 편재화 시그널;
- 아미노산 325 내지 355 번으로 이루어지는 올리고머화 영역. 이러한 325 내지 355 영역은 다음과 같은 유형의 구조를 형성한다: β 시이트(326-334)-엘보우(335-336)-α 나선(337-355). 이러한 영역에 위치한 기능의 변경은 근본적으로 야생형 단백질의 기능에 가변적인 효과를 초래할 수도 있는 다양한 돌연변이체 형태와 야생형 단백질의 상호작용에 기인한다;
- p53 단백질의 기능을 양의 방식으로 또는 음의 방식으로 조정하는 다수의 후-해독 변형 부위인 아미노산 365 내지 393 번으로 이루어진 조절 영역. 이러한 영역은 야생형 단백질의 활성 조정에 지극히 중요한 역할을 한다.
p53 단백질의 기능은 다양한 방식으로 붕괴시킬 수 있다:
- 예를 들면, SV40 바이러스의 "대형 T", 엡스타인-바 바이러스의 EBNA5 단백질, 또는 세포 단백질 mdm2와 같은 다수의 인자에 의한 기능의 차단;
- 단백질분해 감수성 증가, 특히 p53의 우비퀴티닐화 사이클 중으로의 돌입을 촉진하는, 사람 유두종 바이러스 HPV16 및 HPV18의 E6 단백질과 상호작용시킴에 의한 단백질의 탈안정화. 이러한 경우에 있어서, 이들 두 단백질 간의 상호작용은 세포 단백질의 선행 부착을 통하여서만 일어날 수 있으며, 부착 부위의 E6ap 단백질은 불충분하게 알려져 있다;
- p53 유전자 수준에서의 점 돌연변이
- p53 대립유전자 하나 또는 둘 다의 결실.
뒤의 두 유형의 변형은 각종 유형의 암의 약 50%에서 발견된다. 이와 관련하여, 암 세포에서 보고된 p53 유전자의 돌연변이는 이러한 단백질을 암호화하는 유전자의 매우 큰 부분에 영향을 미치고, 이들은 이러한 단백질의 기능의 다양한 변형을 초래한다. 그러나, 이러한 돌연변이의 대다수는 p53 단백질에 특이성을 띠는 게놈 서열과의 접촉 영역으로 알려져 있는 p53 단백질의 중앙 부분에 위치하여 있음이 주목될 수 있다.
이러한 결과는 왜 p53 단백질의 돌연변이체 대부분이 야생형 단백질에 의하여 인지되는 DNA 서열에 더 이상 결합할 수 없고 따라서 전사 인자로서의 역할을 더 이상 발휘할 수 없는 주된 특성을 지니고 있으며, 일부 돌연변이체가 전사 수준에서 일부 유전자의 활성화와 같은 획득된 신 기능을 보유하는 것으로 나타나는 이유를 해명해 준다.
이러한 변형의 범위는 현재로서는 3개의 카테고리로 분류되고 있다:
- 산물이 두 대립 유전자 중 하나에서만 돌연변이가 있는 경우, 다른 대립 유전자에 의하여 암호화된 야생형 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 비기능성 단백질인 소위 말하는 약 돌연변이체. 이러한 카테고리의 주요 대표체는 H273 및 W248 돌연변이체이며, 후자는 암 증상에 대한 과민성을 위한 가족성 Li-Fraumeni 증후군에 특이성을 보인다.
- 산물이 두 대립 유전자 중 하나에서만 돌연변이가 있고 야생형 단백질과의 상호작용을 통하여, 야생형 단백질에 특이성을 띠는 DNA 서열에 더 이상 부착할 수 없는 비활성 혼합 올리고머를 형성함으로써 후자의 기능을 차단할 수 있는 우점-음성 돌연변이체. 이러한 카테고리의 주요 대표체는 G281 돌연변이체이다.
- 산물이 한편으로는 선행 카테고리의 돌연변이체와 같은 야생형 단백질의 기능을 차단하고, 다른 한편으로는 잘 알려지지 않은 메커니즘을 통하여 종양 발생을 촉진할 수 있고, 이에 따라 기능에 있어 이득을 제공하는 단백질인 우점-발암성 돌연변이체. 이러한 카테고리의 주요 대표체는 H175 돌연변이체이다.
항암성과 아폽토시스성 및 과증식성 유형의 다양한 병리에서의 관여를 감안해 볼 때, 야생형 p53 유전자는 유전자 및 세포 요법과정에 사용되어 왔다. 특히, 야생형 p53 유전자의 생체내 투여 및 p53의 기능 복구에 의한, 특정 과증식성 병리, 특히 암 치료가 제안되어 왔다. 투여는 바람직하게는 바이러스, 특히 아데노바이러스 (WO 94/24297) 또는 레트로바이러스 (WO 94/06910) 벡터에 의하여 수행될 수 있다.
야생형 p53 단백질을 암호화하는 핵산의 도입이 세포 생장의 정상 조절을 부분적으로 복구시킬 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, 이러한 결과가 고무적이기는 하지만, 이러한 절차의 유효성이 과증식성 세포내 전이 및 발현 후 p53 단백질의 치료 효능에 의하여 제한을 받는다. 사실, 암과 같은 과증식성 병리 상황은 세포 생장의 양성 및 음성 조절 네트웍에 설정된 평형의 붕괴에 연유한다. 두 대립 유전자 중 하나로부터 우점-음성 p53 돌연변이체의 출현, 예를 들면 mdm2와 같은 p53 불활성화 세포 파트너의 과발현, 또는 심지어는 감염 후 뒤따르는 바이러스 불활성화제의 존재를 통하여 야생형 p53 단백질에 의하여 발휘된 음성 대조군의 불활성화는 불활성화될 위험이 높은 야생형 p53 단백질의 재도입에 기초한 요법을 위한 비호적한 컨텍스트를 구성한다.
따라서, 치료 특성이 증진된 p53 유형의 단백질을 구비할 수 있는 것이 특히 중요하다. 특히, 구성적으로 활성을 띠고 우점-음성 및 발암성 돌연변이체 또는 기타 세포 또는 바이러스 단백질, 예를 들면 종양세포에서 발견되는 HPV18 및 HPV16으로부터의 E6, MDM2, EBV로부터의 EBNA5 등의 불활성화 효과에 무감각한 p53 분자를 준비하는 것이 특히 유리하다.
p53 단백질의 일부 변형은 선행기술에 기술되어 왔다. 따라서, 특허출원 WO 95/06661은 p53 단백질의 상동 영역, 즉 영역 343-351, 372-380 및 381-393 내의 일부 잔기에서의 변형에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 이러한 변형은 매우 사소한 것이고 생성 산물이 생체내 p53 단백질의 불활성 메커니즘으로부터 벗어나는 것을 허용하지 않는다. 더욱이, 이러한 단백질은 야생형 p53 단백질에 비해 향상된 활성을 지닌 것으로 보이지는 않는다.
문헌[참조: Hupp et al. Cell Vol 71 (1992) 875]는 30 개의 C 말단 잔기의 결실을 포함하는 p53의 유도체(p53△C-ter30)에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 이러한 단백질은 DNA와의 결합능을 보존하지만, 이의 아폽토시스 특성은 입증되지 않았다. 또한, 우점-음성 돌연변이체에 의한 불활성에 내성을 띠지도 않는다.
문헌[참조: Pietenpol et al. PNAS 91 (1994) 1998]은 p53 단백질, 특히 단백질 VP16-p53 (80-343)-GCN4로부터 유도된 키메릭 분자에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 이러한 분자는 야생형 p53 단백질과 비교하여 상당히 감소된 DNA 결합 및 전사 활성화능을 지닌다(40%). 더욱이, 다른 세포 성분과 상호작용하고 이에 따라 비특이적 세포 반응을 유도할 위험이 있는 비선택성 올리고머화 영역을 가지고 있다. 더욱이, 불활성화 메커니즘에 대한 저항성은 나타나지 않는다.
본 발명은 개선된 치료 특성을 지니고 있는 p53 단백질의 신규 변이체에 관한 것이다. 특히, 유전자, 특히 항암 요법에 사용하도록 순응된 변이체를 기술한다. 본 발명의 변이체는 구조적 변형에 의하여 p53 단백질로부터 유도되고, p53형 활성을 보존하며, 과증식성 세포에서 발현되며, p53 단백질에 비해 적어도 증진된 특성을 보인다. 이는 특히 증식억제 및/또는 아폽토시스 활성일 수 있다. 본 발명의 변이체는 유리하게는 증식억제 및/또는 아폽토시스 활성을 보유하거나, 하나는 증식억제 세포에 더욱 특이성을 띠거나 야생형 p53이 대상인 각종 변경에 덜 민감하다.
특히, 본 발명의 제 1 요지는 올리고머화 영역의 전부 또는 일부가 결실되고 인공 루이신 지퍼 영역에 의하여 치환되는 p53 단백질의 변이체에 관한 것이다. 앞에서 나타낸 바와 같이, p53 단백질은 일부 변이체, 특히 종양세포에서 발견되는 우점-음성 및 발암성 돌연변이체에 의하여 불활성화된다. 이러한 불활성화는 야생형 p53 단백질에 의하여 인지된 특이적 서열에 더 이상 결합될 수 없는, 야생형 p53 단백질 및 돌연변이체간의 불활성 혼합 올리고머 형성 결과이다. 본 발명은 일부 돌연변이체의 우점-음성 효과에 내성을 보이는 p53 단백질의 변이체, p53-의존성 사람 암의 거의 90%에 해당하는, 하나 또는 두 돌연변이된 대립 유전자를 보이는 세포 컨텍스트에서 활성을 보이는 변이체에 대하여 기술한다.
본 발명에 따른 변이체에 있어서, 야생형과 돌연변이체 형태간을 구별하지 못하는, 단백질의 천연 올리고머화 영역의 전부 또는 일부를 특이적인 올리고머화능을 지닌 동등물 영역으로 치환시킨다. 이러한 변형은 이량체를 형성하기 위하여 최적화된 인공 루이신 지퍼를 사용하여 수행된다. 이러한 인공 루이신 지퍼를 포함하는 본 발명에 따른 분자는 동일한 루이신 지퍼를 운반하는 다른 분자와만 올리고머를 형성하기 때문에 특히 유리하다. 이들은 따라서, 자신을 불활성화시킬 수 있는 p53 단백질의 우점-음성 또는 발암성 돌연변이체와 올리고머를 형성하지 않는다. 이들은 자신을 불활성화시킬 수 있거나 원치않는 효과를 유도할 수 있는, 올리고머화 영역을 운반하는 기타 세포 단백질과도 올리고머를 형성하지 않는다. 이들은 또한 호모-올리고머를 형성하고 따라서 고 선택성을 보유할 수 있으며, 이에 따라 과증식성 병리 상황에서 보다 우수한 활성을 보장한다.
본 발명에 따라, 인공 루이신 지퍼 영역은 따라서 유리하게는 올리고머화의 선택성을 보장하는, 천연상태에서는 존재하지 않는 영역이다. 더욱 바람직하게는, 올리고머화 영역은 서열번호 1로 표시된다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 변이체는 올리고머화 영역의 전부 또는 일부 결실 및 조절 영역의 전부 또는 일부 결실을 포함한다. 전술한 바와 같이, 올리고머화 영역은 잔기 325 내지 355 번 사이에 위치하고 조절 영역은 잔기 365 내지 393 번 사이에 위치한다. 이러한 유형의 변이체는 C 말단부(aa 365-393)를 통해 발휘된 음성 조절 효과의 전부 또는 일부가 결여되어 있기 때문에 전적으로 유리하다. 이러한 변이체는 비-조정성 및 가능하게는 증진된 활성을 지닌 잠정적으로 구성적으로 활성인 단백질을 구성한다. 유리하게는, 전체 조절 영역이 제거된다. 본 발명에 따른 바람직한 변이체는 잔기 326 내지 337 번까지, p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함한다.
이들 변이체의 작제에 사용된 중간체의 예는 특히 다음과 같다:
·서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된, 326 번 잔기에서부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함하는 pEC107 (75-325-lz);
·서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된, 337 번 잔기에서부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함하는 pEC110 (75-336-lz).
유리한 양태에 따라, 본 발명의 변이체에 있어서, p53 단백질의 위치 182에 있는 시스테인 잔기는 히스티딘으로 치환된다. 이러한 돌연변이는 특이적 결합 뉴클레오타이드 서열에 대한 변이체의 친화성을 유리하게 증가시킬 수 있게 한다. 따라서, 이러한 추가 변형의 도입으로 증가된 전사 활성화능을 추가로 지닌 분자의 수득이 가능해진다.
이를 다양한 변형을 조합하는 본 발명에 따른 변이체 제조를 위한 중간체 작제물의 정확한 예는 특히 다음과 같다:
·서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된, 326 번 잔기에서부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실, 및 위치 182에 히스티딘을 포함하는 pEC139 (75-325(H182)-lz);
·서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된, 337 번 잔기에서부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실, 및 위치 182에 히스티딘을 포함하는 pEC140(75-336(H182)-lz)
유리하게는, 본 발명에 따른 변이체에 있어서, 전사 활성화 영역의 전부 또는 일부 또한 결실되고 이종 전사 활성화 영역으로 치환된다. 또한, p53의 전사 활성화 기능이 종양 억제인자 또는 아폽토시스 유도인자로서 자신의 활성에 필수적임이 상기에서 시사되었다. 본 발명에 따른 변이체의 치료능을 증가시키기 위하여, 천연 전사 활성화 영역을 강력한 이종 전사 활성화 영역으로 치환시키는 것이 특히 유리하다. 따라서, 이러한 변이체는 다수의 장점을 보인다. 이들은 물론 높은 전사 활성화 활성을 보유한다. 그러나, 이들은 또한 N 말단부(aa 1-73)를 통해 발휘되는 음성 조절 효과에 무감각하게 제조된다. 사실, 이러한 영역은 자신의 단백질분해성 분해에 관여하는 PEST 서열을 함유한다. PEST 서열이 결여되어 있는 이종 전사 활성화 영역에 의한 이러한 영역의 치환으로 이러한 음성 조절이 가능해진다. 이러한 변이체는 또한, 분해를 유도할 수 있는 사람 유두종 바이러스(HPV)로부터의 E6 단백질과의 여타 상호작용의 감소, 또는 심지어는 억제를 특징으로 한다. 이들은 또한 야생형 p53 단백질의 활성에 영향을 미치는 MDM2 및 EBNA와 같은 기타 세포 단백질과의 상호작용에 덜 민감하다. 이렇게 하여 수득된 변이체는 따라서 증진된 안정성을 보유한다. 음성 조절에 민감한 영역(조절 및 전사 활성화 영역)에 민감한 영역의 제거는 특히 유리한 방식으로, 단백질분해 또는 불활성화를 유도하는 단백질의 표적이 아닌 분자를 유도한다.
유리하게는, 본 발명의 변이체에 있어서, 전사 활성화 영역은 잔기 1 내지 74 번의 결실에 의하여 제거된다. 이러한 분자를 생성하는 데 사용된 중간체 작제물은 근본적으로 pEC107(75-325-lz), pEC110(75-336-lz), pEC139(75-325(H182)-lz) 및 pEC140 (75-336(H182)-lz)이다.
제 1 양태에 따라, 이종 전사 활성화 영역은 VP16의 전사 활성화 영역이다. 이는 유리하게는 VP의 잔기 411 내지 490 번으로 이루어지며, 이의 서열은 서열번호 2에 도시되었다. 이러한 각종 변형을 조합하는, 본 발명에 따른 변이체의 정확한 예는 특히 다음과 같다:
·서열번호 2의 VP16의 전사 활성화 영역에 의하여 치환된 잔기 1 내지 74 번의 N 말단부의 결실 및 서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된 잔기 326 번으로부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함하는 pEC114(VP-75-325-lz). 변이체 pEC114의 완전 서열은 서열번호 25로 표시된다;
·서열번호 2의 VP16의 전사 활성화 영역에 의하여 치환된 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 N 말단부의 결실 및 서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된 잔기 337번으로부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함하는 pEC116(VP16-75-336-lz). 변이체 pEC116의 완전 서열은 서열번호 26으로 표시된다;
·서열번호 2의 VP16의 전사 활성화 영역에 의하여 치환된 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N 말단부의 결실 및 서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된 잔기 326번으로부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실, 및 위치 182에 히스티딘을 포함하는 pEC147(VP16-75-325(H182)-lz).
·서열번호 2의 VP16의 전사 활성화 영역에 의하여 치환된 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N 말단부의 결실 및 서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된 잔기 337번으로부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실, 및 위치 182에 히스티딘을 포함하는 pEC149(VP16-75-336(H182)-lz).
전술한 변형으로 해서, 본 발명의 변이체는 또한 세포 주기 및 아폽토시스의 정지인 잠정적으로 증진된 "킬러" 특성도 지닌다. 오리진의 영역의 치환 및 위치 182에서의 히스티딘의 존재에 의한 선택성 올리고머화 영역 및 개선된 전사 활성화력을 포함한 전술한 변형의 조합은 사실상 본 발명의 변이체에 상당히 향상된 치료능을 부여한다. 추가로, 본 발명에 따른 변이체는 일부(우점-발암성)돌연변이체의 출현을 피할 수 있게 해 준다. p53의 일부 돌연변이체의 기능에 있어서의 이득은 메커니즘의 수준 및 연루되는 p53 단백질의 영역 수준 모두에서 아직까지는 불충분하게 규정되어 있다. 십중팔구 이들 신 기능 중 일부는 일부 효능자 세포 파트너와의 조합에 따라 좌우될 것이다.
이러한 상호작용에 연루된 영역의 제거, 및 이의 형질전환 특성이 발암성 기능에 있어 이러한 이득의 출현을 방지하는 유형의 본원에 기술된 분자내에서 입증되었다. 따라서, 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드의 임상 배치의 제조 동안 또는 이러한 동일 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스 또는 화학 벡터의 임상적 배치의 생산 동안 무작위로 출현하는 돌연변이는 발암성 분자의 아집단을 생성하지 않을 것이다.
더욱이, 자체 기능을 억제하는 일부 분자의 부착에 필수적인 p53의 일부 영역의 제거로, 본 발명의 변이체 또한 더 높고 더욱 안정한 치료 활성을 지닌다. 최종적으로, 본 발명의 다양한 작제물 내 이종 단위(예를 들면,쥐 AS 단백질, 인공 올리고머화 영역 등)의 존재는 형질감염 세포의 치사 동안 면역 반응 및 이들 각종 단편의 외세포 배지 중으로의 방출을 촉발할 수 있고, 이에 따라 면역 시스템의 종양 세포와의 대항능력이 증가된다.
다른 양태에 따라, 이종 전사 활성화 영역은 바람직하게는 형질전환 세포에서는 활성을 띠지만 이웃의 건강한 세포에서는 활성을 띠지 않는 전사 활성화 영역이다. 본 발명은 사실 또한 자신의 기능이 본질적으로 형질감염 세포에서는 발휘되지만 이웃의 건강한 세포에서는 그렇지 않은 분자에 대해서도 기술한다. 비록, 내생성 야생형 p53을 포함하는 분화 세포내 야생형 p53의 외생성 발현이 생존능에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 듯 하지만, 그럼에도 불구하고 표적화된 세포에서만 기능을 띠게 될 단백질을 구비할 수 있는 것이 유리하다. 종양 세포 대 정상 세포에 대한 이러한 특이성은 바이러스 벡터의 표적화 특이성 수준 또는 특이적 발현 시스템의 디자인 수준에서 현격하게 효과가 있다. 본 발명은 기능 영역 중 하나가 근본적으로 형질전환 세포에 존재하는 세포 활성자의 부재하에서 스위치 오프되는 p53의 유도체에 대하여 기술한다.
따라서, 본 발명의 다른 요지는 바람직하게는 형질전환 세포에서 활성을 띠고, p53의 기능 영역 중 적어도 하나가 완전히 또는 부분적으로 결실되고 바람직하게는 형질전환 세포내에서 활성을 띠는 이종 영역에 의하여 치환되는, p53 단백질의 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 해당 p53의 기능 영역은 전사 활성화 영역이다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 요지는 바람직하게는 형질전환 세포에서 활성을 띠고, 천연 전사 활성화 영역이 완전히 또는 부분적으로 결실되어 있으며 바람직하게는 형질전환 세포에서 활성을 띠는 전사 활성화 영역으로 치환되는 p53 단백질의 변이체에 관한 것이다. 유리하게는, 천연 전사 활성화 영역의 결실은 p53으로부터 잔기 1 내지 74 번을 제거시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 특히, 발암성 Ras 단백질 또는 p53이 돌연변이체의 존재하에서 특이적으로 기능을 나타내는 p53의 변이체에 관한 것이다. 이러한 분자는 특히 야생형 p53 단백질의 전사 활성화 영역을 형질전환 세포에 존재하는 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역으로 치환함으로써 수득된다.
본 발명의 분자에 존재하는 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역은 다양한 유형을 취할 수 있다. 특히, 이는 표적화된 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체가 이러한 영역을 포함하는 경우 올리고머화 영역일 수 있다. 또한, 이는 전술한 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체와 상호 작용하는 것으로 알려져 있는 어떠한 합성 또는 천연 영역일 수도 있다. 이는 또한 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체에 대한 항체 또는 이의 단편이나 유도체일 수도 있다.
유리하게는, 이종 영역은 항체 또는 항체 단편 또는 유도체로 이루어진다. 항체 단편 또는 유도체는 예를 들면, 단편 Fab 또는 F(ab)′2, 항체의 영역 VH 또는 VL 또는 암에 의해 VL 영역에 결합된 VH 영역을 포함하는 일본쇄 항체(ScFv)이다. 본 발명에 따라 변형된 이러한 항체를 암호화하는 핵산 서열의 작제는 예를 들면 특허 US 4,946,778 또는 특허출원 WO 94/02610, WO 94/29446에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 바람직한 작제물은 p53 단백질의 돌연변이체에 대한 ScFv를 포함한다. 이들 돌연변이체는 형질전환 세포에서 출현하고 전사 활성화 영역을 보유한다. 본 발명에 따른 변이체에 의한 이들의 채용으로 형질전환 세포에서 선택적으로 활성을 띠는 키메릭 분자를 생성한다.
다른 바람직한 양태에 따르면, ScFv는 전사 활성화 복합체, 즉 다시 말해서, 형질감염 세포에 선택적으로 존재하되, 전사 활성화인자 활성이 결여되어 있는(예를 들면, 발암성 ras) 표적 분자와, 전사 활성화 영역을 운반하는 분자간의 복합체에 대한 것이다. 후자는 유리하게는, 전사 활성화 영역 및 세포성 분자에 선택적으로 결합하기 위한 영역(예를 들면, 안티-ras)를 포함한다. 이러한 분자의 부착은 전사 활성화 이원 복합체의 형성을 허용하며 이러한 복합체는 이어서 본 발명의 변이체에 의하여 채용된다.
활성의 이러한 특이성을 유도하는 변형의 여타 유형도 물론 특히 세포 유형에 특이성을 띠는 여타 전사 활성화 영역과 같이 본 발명의 프레임워크에 사용될 수 있다.
이러한 선택성 변이체는 유리하게는 특성을 더욱 개선하기 위하여 전술한 바와 같이 C 말단부에 추가의 변형을 포함한다. 따라서, 이들은 유리하게는 올리고머화 영역의 전부 또는 일부 결실을 포함하며, 이러한 영역은 이종 올리고머화 영역으로 치환시킬 수 있다. 이는 더욱 바람직하게는, 상기에서 정의한 바와 같이 인공 올리고머화 영역이다.
바람직하게는 형질전환 세포에서 활성을 띠는 본 발명에 따른 변이체의 특정예는 특히 다음과 같다:
· 형질전환 세포에 존재하는 p53 단백질의 돌연변이체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역에 의하여 치환된, 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N-말단부의 결실, 및 서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된, 잔기 326으로부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함하는 ScFv.안티p53*-75-325-lz;
· His182 돌연변이를 추가로 포함하는 ScFv.안티p53*-75-325(H182)-lz;
· 형질전환 세포에 존재하는 p53 단백질의 돌연변이체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역에 의하여 치환된, 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N-말단부의 결실, 및 서열번호 1의 인공 올리고머화 영역으로 치환된, 잔기 337로부터 p53 단백질의 C 말단부의 결실을 포함하는 ScFv.안티p53*-75-336-lz;
· His182 돌연변이를 추가로 포함하는 ScFv.안티p53*-75-336(H182)-lz;
· 형질전환 세포에 존재하는 p53 단백질의 돌연변이체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역에 의하여 치환된, 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N-말단부의 결실을 포함하는 ScFv.안티p53*-75-393;
· 위치 182에 히스티딘을 추가로 포함하는 ScFv.안티p53*-75-393(H182);
· 형질전환 세포에 존재하는 p53 단백질의 돌연변이체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역에 의하여 치환된, 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N-말단부의 결실을 포함하는 ScFv.안티p53*-75-367;
· 위치 182에 히스티딘을 추가로 포함하는 ScFv.안티p53*-75-367(H182);
· 형질전환 세포에 존재하는 p53 단백질의 돌연변이체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역에 의하여 치환된, 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N-말단부의 결실; 및 서열번호 3의 19 개의 아미노산으로 보충된, 잔기 367 번으로부터 C 말단부의 결실을 포함하는 ScFv.안티p53*-75-AS;
· 위치 182에 히스티딘을 추가로 포함하는 ScFv.안티p53*-75-AS(H182);
추가로, 바람직하게 활성이란 용어는 본질적으로 형질전환 세포내에서 발현될 때 이들 변이체가 자신의 활성을 발휘함을 나타낸다. 그러나, 잔류 활성이 비형질전환 세포에 존재할 수 있지만, 형질전환 세포에서 관찰되는 것 보다 더 적다.
본 발명은 서열번호 3이 서열(AS)과 융합된, 잔기 367 번에서로부터 C 말단부의 결실을 포함하는 p53 단백질의 변이체에 관한 것이다. 이러한 서열은 쥐의 p53 단백질의 선택적 스플라이싱 산물의 마지막 19 개의 아미노산에 해당한다. 따라서, 이러한 변이체는 27 개의 C 말단 아미노산이 19 개의 상이한 아미노산으로 치환되는 야생형 단백질의 선택적 스플라이싱 변이체로서 마우스에서 기술된 단백질에 기초한 올리고머화 영역의 변형을 보여준다.
이러한 변이체는 잠정적으로 증진된 DNA 결합에 특이적인 서열에 대한 친화성을 갖는다.
이러한 변이체는 유리하게는 자체 특성을 더욱 개선하기 위하여 전술한 바와 같이 N 말단부에 변형을 포함한다. 따라서, 이는 유리하게는 전사 활성화 영역의 전부 또는 일부의 결실을 포함하며, 이 영역은 이종 전사 활성화 영역으로 치환될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이는 단백질 VP16으로부터 유도된 전사 활성화 영역 또는 형질전환 세포에 존재하는 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역으로부터 유도된 전사 활성화 영역이다. 추가로, p53 단백질의 잔기 182는 유리하게는 히스티딘으로 치환된다.
본 발명에 따른 이러한 유형의 변이체의 정확한 예는 특히 다음과 같다:
· 전술한 ScFv.안티p53*-75-AS
· 서열번호 2의 서열의 VP16의 전사 활성화 영역에 의하여 치환된, 잔기 1 내지 74 번을 포함하는 p53 단백질의 N 말단부의 결실; 및 서열번호 3의 19 개의 아미노산으로 보충된, 잔기 367번으로부터 C 말단부의 결실을 포함하는 pEC143 (VP16-75-AS). 변이체 pEC143의 완전 서열은 서열번호 28로 나타내었다;
· 상술된 ScFv.안티p53*-75-AS(H182);
· pEC153 (VP16-75-AS(H182)), 위치 182에 히스티딘을 갖는 pEC143에 해당한다.
좀더 일반적인 방법으로, 본 발명은 전사 활성화 영역, DNA-결합 영역, 핵 중으로의 지시 영역, 및 올리고머화 영역을 포함하는 키메릭 단백질(DNA와의 결합을 위한 영역과 핵 중으로의 지시 영역은 사람 야생형 p53 단백질의 아미노산 75 내지 325(서열번호 4)로 이루어져 있음)에 관한 것이다. 본 출원인은 사실상 적합한 전사 활성화 및 올리고머화 영역과 커플링된 p53 단백질의 이러한 영역이 안정성, p53의 돌연변이체의 부정적인 효과에 대한 내성 및 일부 세포 인자에 의한 불활성화에 대한 민감성의 견지에서 특히 유리한 성질을 갖는 p53 유형 분자를 생성하도록 한다.
하나의 변이체에 따라서, DNA 결합을 위한 영역 및 핵 중으로의 지시 영역은 사람 야생형 p53 단백질의 아미노산 잔기 75 내지 336 서열번호 5)으로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 키메릭 단백질은 여러 유형의 전사 활성화 영역을 포함할 수 있다. 이것은 p53 단백질의 전사 활성화 영역일 수 있다. 바람직하게는, 이것은 예를 들면, VP16의 전사 활성화 영역 또는 형질전환된 세포에 존재하는 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 영역으로부터 선택된 이종 전사 활성화 영역이다.
올리고머화 영역에 관하여, 이것은 바람직하게는 인공적이고, 따라서 특정한, 예를 들면 특히 서열번호 1의 서열의 인공 루이신 지퍼와 같은 영역이다.
본 발명에 따른 키메릭 단백질은 추가로 위치 182에 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 바와 같은 키메릭 단백질의 정확한 예는 특히 pEC114, pEC116, pEC147 및 pEC149이다.
본 발명의 요지는 또한 상기에 정의된 바와 같은 변이체 또는 키메릭 단백질을 암호화하는 핵산이다.
본 발명에 따른 핵산은 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)일 수 있다. 추가로, 이것은 p53 유전자의 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있는 상보적 DNA(cDNA)일 수 있다. 이것은 사람, 동물, 바이러스, 합성 또는 반합성 기원일 수 있다. 이것은 다양한 방법으로, 특히 본 출원에 제시하는 서열을 사용하는 화학 합성 및 예를 들면 핵산 합성기에 의해 수득할 수 있다. 이것은 또한 특히 본 출원에 기술된 바와 같은 특정 탐침에 의해서 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 이것은 또한 라이브러리로부터 스크리닝된 서열의 화학적 변형(신장, 결실, 치환 등)을 포함하는 기술을 병용하여 수득할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 핵산은 당해 분야 기술자에게 공지되어 있는 기술에 따라서 제조할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산은 cDNA 또는 RNA이다.
본 발명에 따른 핵산은
(a) 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33 및 34의 서열 또는 이의 상보적 본쇄의 전부 또는 일부,
(b) (a) 서열과 하이브리드화하고 본 발명에 따른 유도체를 암호화하는 서열,
(c) 유전 암호의 축퇴성으로부터 발생한 (a)와 (b)의 변이체 중에서 유리하게 선택된다.
상술된 바와 같이, 본 출원인은 본 발명에 이르러 완전히 주목할만한 항증식성 및 아폽토시스성을 지닌, p53의 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 신규한 핵산 서열을 제조했다. 이러한 핵산을 세포내에서, 세포 기능장애를 없애거나 수정할 수 있는 본 발명에 따른 유도체를 생성하기 위한 치료제로서 사용할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 핵산, 발현을 허용하는 프로모터 및 전사의 종결을 위한 시그널을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 프로모터는 포유동물 세포, 바람직하게는 사람 세포에서 기능성인 프로모터들 중에서 유리하게 선택된다. 좀더 바람직하게는, 이것은 과증식성 세포(암, 재협착증 등)의 핵산의 발현을 허용하는 프로모터이다. 이점에 있어서, 다양한 프로모터를 사용할 수 있다. 이것은 예를 들면 p53 유전자 자체의 프로모터일 수 있다. 이것은 또한 (기타 단백질의 발현을 책임지거나 합성되는) 상이한 기원의 영역일 수 있다. 따라서, 이것은 유전자의 전사를 특이적 방법이거나 특이적이 아닌 방법으로, 유도성이거나 유도성이 아닌 방법으로, 강하거나 약한 방법으로 자극하거나 억제하는 프로모터 또는 유도된 서열일 수 있다. 특히 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열을 언급할 수 있다. 예를 들면, 이들은 표적 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 진핵세포 프로모터 중에서, 특히 편재성 프로모터(HPRT, PGK, α-액틴, 튜불린 등에 대한 유전자의 프로모터), 중간체 필라멘트의 프로모터(GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트, 케라틴 등에 대한 유전자의 프로모터), 치료 유전자의 프로모터(예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII, ApoAI 등에 대한 유전자의 프로모터), 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 지방산-결합 내장 단백질, 평활근 α-액틴 등에 대한 유전자의 프로모터) 또는 이와는 달리 자극 반응성 프로모터(스테로이드 호르몬에 대한 수용체, 레티노산에 대한 수용체 등)를 사용할 수 있다. 또한, 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열, 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터, 또는 이와는 달리 RSV LTR 프로모터 등일 수 있다. 추가로, 이러한 프로모터 영역을 활성화 또는 조절 서열, 또는 조직-특이성 또는 우성 발현을 허용하는 서열을 첨가함으로써 변형할 수 있다.
본 발명은 항증식 및/또는 아폽토시스성을 통하여 다수의 세포 기능장애를 방해함을 가능하게 하는 신규한 치료제를 제공한다. 이로인해, 본 발명에 따른 핵산 또는 카세트를 이들이 처리될 부위의 수준이거나 파괴되거나 처리될 세포와 직접 배양할 경우 주입할 수 있다. 사실상 네이키드 핵산이 특별한 벡터없이 세포로 침투할 수 있다고 기재되어 있다. 그렇지만, (1) 세포 침투의 효율, (2) 표적화, 및 (3) 세포외 또는 세포내 안정성을 개선함을 가능하게 하는 투여를 위한 벡터를 사용하는 것이 본 발명의 프레임워크 내에서 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 핵산 또는 카세트를 벡터에 혼입할 수 있다. 사용될 벡터는 화학적 기원(리포좀, 미립자, 펩타이드 복합체, 지질 또는 양이온성 중합체 등) 또는 바이러스 기원(레트로바이러스, 아데노바이러스, 허피스 바이러스, AAV, 박시니아 바이러스 등) 또는 플라스미드 기원일 수 있다. 바이러스 벡터의 사용은 바이러스의 고유 형질감염성에 의존한다. 따라서, 예를 들면, 아데노바이러스, 허피스 바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-수반 바이러스를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 벡터는 형질감염의 관점에서 특히 효율적이다. 이점에 있어서, 본 발명에 따른 바람직한 요지는 게놈이 상기에 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 결손 재조합 레트로바이러스에 있다. 본 발명의 다른 특정한 요지는 게놈이 상기에 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스에 있다. 본 발명에 따른 벡터는 또한 진핵 세포내 핵산의 전달 및 발현을 촉진할 수 있는 비바이러스성 제제일 수 있다. 화학적 또는 생화학적, 합성 또는 천연 벡터는 특히 편의성, 안전성의 이유로, 또한 형질감염시킬 DNA의 크기에 있어서 이론적인 한계가 부재함으로써 천연 바이러스에 대한 유리한 대체물을 나타낸다. 이러한 합성 벡터는 두 가지 주요한 기능, 즉 형질감염될 핵산을 응축시키는 기능과 세포 부착 및 원형질막 및 경우에 따라, 두 핵막을 통한 통과를 촉진시키는 기능을 지닌다. 핵산의 다음이온성을 극복하기 위해서 비바이러스성 벡터 모두는 다양이온성 전하를 지닌다.
본 발명에 사용된 핵산 또는 벡터는 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 및 경피 투여 용 등으로 제형할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터를 주사가능한 형태로 사용할 수 있다. 그러므로 주사 제형을 위해, 특히 치료하고자 하는 부위의 수준에서의 직접 주사에 약학적으로 허용되는 여타 비히클과 혼합할 수 있다. 이것은 특히 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수 첨가시, 주사액의 제조를 허용하는 멸균 또는 등장 용액, 또는 건조 특히 동결-건조 조성물일 수 있다. 환자의 종양중으로의 핵산의 직접적인 주사는 병에 걸린 조직 수준에서 치료 효과를 집중시키는 것을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 사용된 핵산의 용량은 다양한 파라미터에 따라서, 특히 유전자, 벡터, 사용된 투여 양식, 해당 병리 또는 원하는 치료 지속기간에 따라서도 조정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
이것은 또한 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
이것은 또한 상기에 정의된 바와 같은 p53의 적어도 하나의 변이체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
항증식성 때문에, 본 발명에 따른 약학 조성물은 과증식성 장애, 예를 들면 특히 암 및 재협착증의 치료에 가장 특히 적당하다. 따라서, 본 발명은 세포, 특히 과증식성 세포의 파괴를 위해 특히 효과적인 방법을 제공한다. 이러한 방법은 생체내 또는 생체외에서 사용할 수 있다. 생체외에서, 이는 본질적으로 하나 이상의 핵산 (또는 벡터 또는 카세트 또는 직접적으로 유도체의) 존재하에서 세포를 배양함에 있다. 생체내에서, 이는 본 발명에 따른 벡터(또는 카세트)의 활성량을, 바람직하게는 치료 부위(특히 종양)의 수준에서 직접 유기체에 투여함에 있다. 이점에 있어서, 본 발명의 요지는 또한 세포 또는 이들의 일부를 상기에 정의된 바와 같은 핵산과 접촉시킴을 포함하는 과증식성 세포 파괴 방법이다.
본 발명은 과증식성 세포(예를 들면, 비정상적 증식을 수행)의 파괴를 위해 생체내에서 유리하게 사용된다. 그럼으로써, 이것을 종양 세포 또는 맥관벽(재협착)의 평활근 세포의 파괴에 적용할 수 있다. p53의 돌연변이체가 관찰되는 암의 치료에 가장 특히 적합한다. 예로서, 대장 선암종, 갑상선 암, 폐 암종, 골수성 백혈병, 직장암, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, B 림프종, 난소암, 방광암, 교아종, 간암종, 골암, 피부암, 췌장암 또는 신장암 및 전립선 암, 식도암, 후두암, 두부암 또는 경부암, HPV-양성 후생식기암, 비인강의 EBV-양성 암, 세포 단백질 mdm2를 과잉 발현하는 암 등을 언급할 수 있다.
본 발명의 변이체는 MDM2 단백질을 추가로 과잉 발현하는 암, 및 HPV-양성 후생식기암과 같은 HPV 바이러스에 결부된 암의 치료에 특히 효과적이다.
본 발명은 설명적이지만 비제한적인 것으로 사려되어야 하는 하기 실시예에 더욱 상세히 기재되어 있다.
도 1: 야생형 p53 단백질의 기능성 영역도. TA: 전사-활성화 영역; DNB: DNA-결합 영역; NLS: 핵 위치선정 시그널; OL: 올리고머화 영역; REG: 조절 영역.
도 2: p53의 AS 형태를 암호화하는 cDNA의 작제도.
도 3: 작제물 pEC104, pEC106, pEC131, pEC132 및 pEC133 및 이의 변이체 H182를 암호화하는 cDNA의 클로닝도.
도 4: 인공 올리고머화 영역과의 융합에 의한 변이체 pEC107, pEC110, pEC139, 및 pEC140의 작제도.
도 5: 변이체 pEC114, pEC116, pEC141, pEC143, pEC145, pEC147, pEC149, pEC151, pEC153, 및 pEC155의 작제도.
도 6: 본 발명의 하이브리드 분자에 의한 특이적 이본쇄 DNA 서열의 인식도. 겔 지연 실험: HisV325와 야생형 p53 사이의 경쟁. 컬럼 1: HisV325 및 야생형 p53 부재하의 배양, 컬럼 2: 30 ng 야생형 p53, 컬럼 3: 2 + pAb421로서, 컬럼 4: 30 ng HisV325, 컬럼 5: 4 + pAb421로서, 컬럼 6: 30 ng HisV325 + 30 ng 야생형 p53, 컬럼 7: 6 + pAb421로서, 컬럼 8: 30 ng HisV325 + 15 ng 야생형 p53, 컬럼 9: 8 + pAb421로서, 컬럼 10: 30 ng HisV325 + 7.5 ng 야생형 p53, 컬럼 11: 10 + pAb421로서, 컬럼 12: 30 ng HisV325 + 4.5 ng 야생형 p53, 컬럼 13: 12 + pAb421로서, 컬럼 14: 30 ng HisV325 + 3 ng 야생형 p53, 컬럼 15: 14 + pAb421로서.
도 7: 야생형 p53 단백질 및 AS, V-325 및 V-336 변이체의 전사 활성화 활성도.
도 8: 야생형 p53 단백질 및 V-325, V-336 및 V-343 변이체의 전사 활성화 활성도.
도 9: SAOS-2 세포내 본 발명의 변이체의 발현도.
도 10: EB, EB-1 및 EB-V325 세포내 hdm2 및 WAF1 유전자의 유도도.
도 11: SAOS-2 세포내 p53 단백질 및 본 발명의 변이체의 전사 활성화 기능에 대한 E6 단백질의 효과도. 벡터 CMV의 양 - 작제물 = 100 ng
도 12: HeLa 세포내 p53 단백질 및 본 발명의 변이체의 전사 활성화 기능에 대한 E6 단백질의 효과도.
도 13: E6 단백질에 의해 유도된 분해로의 야생형 p53 단백질 및 본 발명의 변이체의 감수성도.
도 14: 본 발명의 변이체의 전사 활성화 작용에 대한 p53 H175의 우성-음성 돌연변이체의 효과도. 벡터 CMV의 양 - 작제물 = 100 ng
도 15: SAOS-2 세포내 p53 단백질 및 본 발명의 변이체의 전사 활성화 기능에 대한 hem2 단백질의 효과도. 벡터 CMV의 양 - 작제물 = 100 ng
도 16: hdm2 단백질을 과잉발현하는 세포의 생장에 대한 야생형 p53 단백질 및 V-325 단백질의 효과도.
도 17: 야생형 p53 단백질 및 V-325 단백질에 의한 아폽토시스의 유도도.
도 18: EB, EB-1 및 EB-V325 세포내 아폽토시스 유도의 동력학도.
실시예 A - p53 단백질의 변이체를 암호화하는 유전자 제조를 위해 필요한 다양한 뉴클레오타이드 단편의 작제
A1. 사람 야생형 p53을 암호화하는 cDNA의 작제
사람 p53 유전자를 올리고뉴클레오타이드 5'-1 및 3'-393을 사용하여 사람 태반 라이브러리(Clontech)로부터 DNA상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 클로닝한다.
올리고뉴클레오타이드 5'-1 (서열번호 6):
올리고뉴클레오타이드 3'-393 (서열번호 7):
이어서 이러한 산물을 벡터 pCRII(Invitrogene)로 PCR한 직후에 클로닝한다.
A2 - p53의 AS 형태를 암호화하는 cDNA의 작제
p53의 AS 형태는 쥐 p53 단백질의 대체 스플라이싱 산물의 최종 19 아미노산으로 보충된 사람 p53 단백질의 아미노산 1 내지 366을 암호화하는 단편을 포함한다.
p53의 AS 형태는 2 단계로 수득된다:
- 올리고뉴클레오타이드 5'-1(cf. 실시예 A1) 및 3'-367를 사용하여 p53 단백질의 아미노산 1 내지 367을 암호화하는 단편의 PCR 증폭.
올리고뉴클레오타이드 3'-367 (서열번호 8):
이렇게하여 수득된 PCR 단편을 벡터 pCRII(Invitrogene)로 클로닝한다. 이렇게하여 클로닝된 단편은 제한효소 XhoI에 대한 인식부위를 갖는다 (단편 1-367).
- 올리고뉴클레오타이드 5'-ASl, 5'-AS2, 3'-AS1 및 3'-AS2를 쥐 p53 단백질의 대체 스플라이싱 산물의 최종 19 아미노산을 암호화하는 단편을 구성하기 위해서 인산화하고 함께 하이브리드화한다.
5'-AS1 (서열번호 9):
5'-AS2 (서열번호 10):
3'-AS1 (서열번호 11):
3'-AS2 (서열번호 12):
이러한 단편을 단편 1-367의 XhoI 부위 수준에서 삽입한다(도 2 참조). 이렇게하여 제조된 유전자를 쥐 p53 단백질의 대체 스플라이싱 산물(AS)의 사람 변이체를 암호화한다.
이렇게하여 변형된 단백질 서열은 하기와 같다.
A3 - DNA 결합 영역을 운반하는 p53 단백질의 다양한 단편을 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 p53 의 모두 또는 일부의 DNA 결합 영역을 운반하는 사람 p53 단백질의 다양한 단편을 암호화하는 다양한 cDNA의 작제를 기재한다. 이러한 단편을 p53의 변이체의 작제에 사용한다. 이러한 단편은 다양한 올리고뉴클레오타이드에 의해서 실시예 A1과 A2에 기재된 주형상의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수득한다. 증폭 반응을 실시예 A4.1에 기재된 조건하에서 수행한다.
A3.1 - p53 및 이의 유도체 H182의 75-325를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 야생형 사람 p53 단백질(75-325)의 아미노산 75 내지 325를 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다.
이 cDNA를 하기 올리고뉴클레오타이드 5'-75 및 3'-325를 갖는 p53 DNA(실시예 A1에 기재) 상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한다.
5'-75 (서열번호 13):
3'-325 (서열번호 14):
사람 p53 단백질 상의 점 돌연변이(시스테인-> 히스티딘)를 운반하는 이 단편의 유도체는 하기 서열의 올리고뉴클레오타이드 H182를 사용하여, 애머샴(Amersham) 키트에 의해서 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 수득한다.
올리고뉴클레오타이드 H182 3' (서열번호 15):
이 단편을 75-325(H182)로 나타낸다.
A3.2 - p53의 74-336 영역 및 이의 유도체 H182를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 야생형 사람 p53 단백질의 아미노산 75 내지 336을 암호화하는 cDNA(75-336)의 작제를 기재한다.
이 cDNA를 하기의 5'-75 (서열번호 13) 및 3'-336을 갖는 p53 DNA(실시예 A1에 기재) 상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한다:
3'-336 (서열번호 16) :
사람 p53의 아미노산 182 상의 점 돌연변이(시스테인 -> 히스티딘)를 운반하는 이 단편의 유도체는 애머샴 키트에 의해서 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 수득한다 (서열번호 15). 이 단편을 75-336(H182)로 나타낸다.
A3.3 - p53의 74-343 영역을 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 야생형 사람 p53 단백질(75-343)의 아미노산 75 내지 343을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다.
이 cDNA를 하기의 5'-75 (서열번호 13) 및 3'-343을 갖는 p53 DNA(실시예 A1에 기재)상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한다:
3'-343 (서열번호 35) :
A3.4 - p53의 75-367 영역 및 이의 유도체를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 야생형 사람 p53 단백질 (75-367)의 아미노산 75 내지 367을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다.
이 단편은 올리고뉴클레오타이드 5'-75 (서열번호 13) 및 3'-367 (서열번호 8)을 갖는 실시예 A1에 기재된 p53 DNA 상의 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 수득한다.
이렇게하여 수득된 단편은 XhoI (75-367)에 대한 인식 부위를 포함한다.
사람 p53의 아미노산 182 상의 점 돌연변이(시스테인 -> 히스티딘)를 운반하는 이 단편의 유도체는 애머샴 키트에 의해서 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 수득한다(서열번호 15). 이 단편을 75-367(H182)로 나타낸다.
A3.5 - 75-AS 단편 및 이의 유도체 H182를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 쥐 p53 단백질의 대체 스플라이싱 산물의 최종 19 아미노산으로 보충된 야생형 사람 p53 단백질(75-366)의 아미노산 75 내지 366을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다.
이 단편은 실시예 A2에 기재된 AS 단편과 올리고뉴클레오타이드 5'-75 (서열번호 13) 및 3'-AS2 (서열번호 12)의 DNA 상 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한다.
사람 p53 단백질의 아미노산 182 상의 점 돌연변이 (시스테인 -> 히스티딘)를 운반하는 이 단편의 유도체는 올리고뉴클레오타이드 H182 (서열번호 15)를 사용하여 애머샴 키트에 의한 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 수득한다 (서열번호 15). 이 단편을 75-AS(H182)로 나타낸다.
A3.6 - p53의 75-393 단편 및 이의 유도체 H182를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 사람 p53 단백질(75-393)의 아미노산 75 내지 393을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이 단편은 올리고뉴클레오타이드 5'-75 (서열번호 13) 및 3'-393 (서열번호 7)를 갖는 실시예 A1에 기재된 p53 DNA 상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한다.
사람 p53 단백질의 아미노산 182 상의 점 돌연변이(시스테인 -> 히스티딘)를 운반하는 이 단편의 유도체는 올리고뉴클레오타이드 H182 (서열번호 15)를 사용하여 애머샴 키트에 의한 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 수득한다 (서열번호 15). 이 단편을 75-393(H182)로 나타낸다.
A4 - 전사-활성화 영역(전사 활성화 영역)을 운반하는 다양한 단편을 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 전사 활성화 영역을 운반하는 다양한 단편을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이어서 이러한 단편을 p53의 변이체의 작제에 사용한다.
A4.1 - PCR 반응
다양한 단편은 다양한 올리고뉴클레오타이드에 의해서 다양한 주형상의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수득한다. 증폭 반응을 하기의 조건하에서 수행한다: 공급자에 의해서 제공된, dNTP 농도 0.2 mM의 완충제내 앰플리타크(Amplitaq) DNA 폴리머라제 효소 (Perkin-Elmer), 100 ng의 주형 및 500 ng의 각각의 두 올리고뉴클레오타이드.
- 사이클: 91℃에서 2분
- 사이클: 91℃에서 1분
55℃에서 분
72℃에서 분
- 사이클: 72℃에서 5분
A.4.2 - 바이러스 단백질 VP16(VP16 TA)의 411-490 영역을 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 바이러스 단백질 VP16(VP16 TA)의 아미노산 411-490을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이 영역은 이 단백질의 전사 활성화 영역을 운반한다.
허피스 심플렉스 바이러스의 바이러스 단백질 VP16 (411-190)으로부터 유도된 전사 활성화 단편을 상기에 정의된 조건(cf. A4.1) 및 하기 올리고뉴클레오타이드 5'-VP16과 3'-VP16:
5'-VP16 (서열번호 17):
3'-VP16 (서열번호 18):
및 100 ng의 플라스미드 pUHD15-1[참조문헌: Gossen ＆ Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547]을 사용하여 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 수득한다.
이렇게하여 수득된 단편은 서열이 서열번호 2를 나타내는 334 염기쌍을 포함한다. 이것은 N-말단부에 PCR 클로닝 단계 동안 첨가된, 전사 개시를 위한 부위(ATG)에 의해 공급된 메티오닌 잔기를 포함한다.
A4.2 - 내생성 p53 단백질의 전사 활성화 영역(전사 활성화 영역)을 보충할 수 있는 다양한 단편을 암호화하는 cDNA의 작제
A4.2.1 - p53 단백질 (ScFv 421)을 결합시킬 수 있는 단일-쇄 항체를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 p53 단백질 (ScFv 421)을 결합시킬 수 있는 단일-쇄 항체를 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다. 세포내 수준에서 발현하는 이 작제물은 전사 활성화 영역을 보충하기 위해서 야생형 또는 변이체 내생성 p53 단백질을 결합시킬 수 있어야 한다.
ScFv 421을 암호화하는 cDNA(특허원 PCT/FR96/00477)를 해독 개시를 위한 부위(ATG)를 포함하고 해독 종결을 위한 어떠한 서열도 포함하지 않는 NcoI/NotI 단편의 형태로 추출할 수 있다.
이렇게하여 수득된 단편은 서열이 서열번호 36에 해당하는 766 염기쌍을 포함한다.
A4.2.2 - 야생형 p53 단백질 (325-360)의 325-360 영역을 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 야생형 p53 단백질(325-360)의 아미노산 325-360을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이 영역은 이 단백질의 올리고머화 영역을 운반한다. 세포내 수준에서 발현하는 이 작제물은 전사 활성화 영역을 보충하기 위해서 야생형 또는 변이체 내생 p53 단백질을 결합시킬 수 있어야 한다.
야생형 p53 단백질 (325-360)으로부터 유도된 올리고머화 영역은 상기에 정의된 조건(cf. A4.1) 및 하기 올리고뉴클레오타이드 5'-325과 3'-360:
5'-325 (서열번호 37):
3'-360 (서열번호 38):
를 100 ng의 p53 DNA(실시예 A1에 기재) 상에서 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득한다.
이렇게하여 수득된 단편은 서열이 서열번호 39에 해당하는 141 염기쌍을 포함한다. 이것은 N-말단부에 PCR 클로닝 단계 동안 첨가된, 해독 개시를 위한 부위(ATG)에 의해 공급된 메티오닌 잔기를 포함하고 해독의 종결을 위한 어떠한 서열도 포함하지 않는다.
A4.2.3 - 야생형 p53 단백질 (325-393)의 325-393 영역을 암호화하는 cDNA를 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 야생형 p53 단백질(325-393)의 아미노산 325-393을 암호화하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이 영역은 이 단백질의 올리고머화 영역을 운반한다. 세포내 수준에서 발현하는 이 작제물은 전사 활성화 영역을 보충하기 위해서 야생형 또는 돌연변이체 내생 p53 단백질을 결합시킬 수 있어야 한다.
야생형 p53 단백질 (325-360)로부터 유도된 올리고머화 영역은 상기에 정의된 조건(cf. A4.1) 및 하기 올리고뉴클레오타이드 5'-325(서열번호 37)과 3'-393.2:
3'-393.2 (서열번호 40):
를 100 ng의 p53 DNA(실시예 A1에 기재) 상에서 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 수득한다.
이렇게 하여 수득된 단편은 서열이 서열번호 41에 해당하는 243 염기쌍을 포함한다. 이것은 N-말단부에 PCR 클로닝 단계 동안 첨가된, 해독 개시를 위한 부위(ATG)에 의해 공급된 메티오닌 잔기를 포함하고 해독의 종결을 위한 어떠한 서열도 포함하지 않는다.
A5 - 올리고머화 영역을 운반하는 다양한 단편을 암호화하는 cDNA의 작제
본 실시예는 올리고머화 영역을 운반하는 다양한 단편을 암호화하는 다양한 cDNA의 작제를 기재한다. 이러한 단편을 p53 변이체의 작제에 사용한다. 이러한 단편은 다양한 올리고뉴클레오타이드에 의한 다양한 주형(상동 영역을 위한 p53 및 이종, 특히 인공적인 올리고머화 영역을 위한 다양한 기원의 주형) 상의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 수득한다. 증폭 반응을 상기 A4.1에 기재된 조건하에서 수행한다.
A5.1 - 인공 올리고머화 영역을 포함하는 cDNA의 작제
본 실시예는 인공 루이신 지퍼로 이루어진 인공 올리고머화 영역을 포함하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이러한 cDNA를 사람 p53 단백질의 단편 75-325(실시예 A3.1) 및 75-336(실시예 A3.2)로부터의 변이체, 및 시스테인 182의 수준에서 변형된 유도체의 작제에 사용한다.
이 cDNA를 하기의 6 올리고뉴클레오타이드로부터 작제한다:
lz1-5' (서열번호 19):
lz2-5' (서열번호 20):
lz3-5' (서열번호 21):
lz1-3' (서열번호 22):
lz2-3' (서열번호 23):
lz3-3' (서열번호 24):
이 올리고뉴클레오타이드를 포스포라미다이트 화학을 사용하여 자동 DNA 합성기에 의해서 합성한다. 이 6개의 올리고뉴클레오타이드는 올리고머화 영역이 하이브리드화 및 연결에 의해 간단히 수득되도록 허용하는 쌍으로의 상보성(lz1-5'/lz1-3', lz2-5'/lz2-3', lz3-5'/lz3-3') 및 중첩되는 상보성(lz1-3'/lz2-5', lz2-3'/lz3-5')을 나타낸다. 생성된 LZ 서열을 서열번호 1로 나타낸다.
A5.2 - 사람 p53의 천연 올리고머화 영역을 포함하는 cDNA의 작제
본 실시예는 사람 p53의 천연 올리고머화 영역을 포함하는 cDNA의 작제를 기재한다. 이 cDNA를 작제물 75-367(실시예 A3.3), 75-AS(실시예 A3.4), 75-393(실시예 A3.5)에 함유된 p53 및 시스테인 182 수준에서 변형된 유도체의 아미노산 325 내지 356을 암호화하는 단편으로 나타낸다.
실시예 B - p53 단백질의 다양한 변이체를 암호화하는 유전자의 작제
B1 - p53의 다양한 단편의 클로닝
실시예 A에 기재된 PCR에 의해 수득된 각각의 다양한 단편을 PCR후 제한효소 HindIII 및 NotI을 위한 인식 부위를 사용하여 벡터 pBC SK+ (Stratagene)으로 클로닝한다(도 3).
이러한 작제의 산물은 하기의 수를 운반한다:
75-325 -> pEC 104
75-336 -> pEC 106
75-343 -> pEC 171
75-367 -> pEC 131
75-AS -> pEC 132
75-393 -> pEC 133
이러한 산물로부터, 올리고뉴클레오타이드-지시성 시험관내 돌연변이유발 시스템(애머샴) 및 올리고뉴클레오타이드 H182를 사용하는 부위-지향성 돌연변이유발에 의해서, 위치 182에 히스티딘을 운반하는 상응하는 작제물을 수득한다. 이러한 작제물은 하기의 수를 운반한다:
75-325(H182) -> pEC 134
75-336(H182) -> pEC 135
75-367(H182) -> pEC 136
75-AS(H182) -> pEC 137
75-393(H182) -> pEC 138
B2 - 단편 75-325, 75-336 및 75-343, 및 이의 변이체 182와 루이신 지퍼의 융합
루이신 지퍼를 구성하는 올리고뉴클레오타이드(lzl-5', lzl-3', lz2-5', lz2-3', lz3-5' 및 lz3-3')를 T4 키나제의 보조를 받아 인산화하고 이들을 모두 함께 하이브리드화하고 제한효소 BamHI 및 NotI으로 사전에 분해된 벡터 pEC 104, 106, 134, 135 및 171로 삽입한다(도 4).
이러한 작제물의 산물은 하기의 수를 운반한다:
75-325-lz -> pEC 107
75-336-lz -> pEC 110
75-343-lz -> pEC 174
75-325(H182)-lz -> pEC 139
75-336(H182)-lz -> pEC 140
B3 - 전체 p53 단편과 전사-활성화 영역의 융합
최종 산물을 하기의 방법으로 수행된 3-파트너 연결에 의해 수득한다 (도 5):
실시예 A3에 기재되어 있는 VP16으로부터 유도된 전사-활성화 영역은 PCR 산물을 제한효소 HindIII 및 SalI로 분해함으로써 작제한다.
상기에서 수득된 다양한 p53 단편(75-325-lz, 75-336-lz, 75-343-lz, 75-AS, 75-367, 75-393 및 이의 H182 변이체)는 이들을 함유하는 플라스미드를 제한효소 SalI과 NotI으로 효소 분해한 후 분리한다.
가능한 조합물(활성화 영역/p53)이 구성되고 제한효소 HindIII 및 NotI으로 사전에 분해된 벡터 pBC SK+(Stratagene)으로 동시에 삽입된다.
이러한 작제의 산물은 하기의 번호를 갖는다:
VP 16-75-325-lz V-325 -> pEC 114 (서열번호 25)
VP 16-75-336-lz V-336 -> pEC 116 (서열번호 26)
VP 16-75-367 V-367 -> pEC 141 (서열번호 27)
VP 16-75-AS V-AS -> pEC 143 (서열번호 28)
VP 16-75-393 V-393 -> pEC 145 (서열번호 29)
VP 16-75-343 V-343 -> pEC 175 (서열번호 30)
VP 16-75-325(H182)-lz V-325H -> pEC 147
VP 16-75-336(H182)-lz V-336H -> pEC 149
VP 16-75-367(H182) V-367H -> pEC 151
VP 16-75-AS(H182) V-ASH -> pEC 153
VP 16-75-393(H182) V-393H -> pEC 155
VP 16 영역 대신에 전사 활성화인자 또는 전사 활성화 복합체와 특이적으로 결합하는 영역을 운반하는 상응하는 산물을 동일한 방법으로 작제한다. 이러한 작제물은 하기와 같이 나타낸다:
p53의 325-360 영역을 함유하는 산물은 전사 활성화 영역(1-74)에 대한 치환체로서 SalI 부위에서, 하기와 같은 상보적인 합성 올리고뉴클레오타이드 힌지-업 및 힌지-다운 쌍의 하이브리드화에 의해 수득된 DNA 단편의 삽입에 의해 수득된 합성 분리제(Hinge)를 첨가하도록 할 수 있다:
힌지-업 (서열번호 42):
힌지-다운 (서열번호 43):
생성된 힌지 이본쇄 DNA 서열은 하기와 같고
상응하는 단백질 서열은 (서열번호 44)이다:
상응하는 산물을 하기와 같이 나타낸다:
실시예 C - p53의 변이체를 위한 발현 벡터의 작제
본 실시예는 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 핵산의 전달에 사용할 수 있는 벡터의 작제를 기재한다.
C1 - 플라스미드 벡터의 작제
플라스미드 벡터의 작제에 있어서, 2가지 유형의 벡터를 사용한다.
- DNA 클로닝에 기재된 벡터 pSV2 [참조문헌: A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985]. 이 벡터는 진핵세포 발현 벡터이다. 변이체를 암호화하는 핵산을 HpaI-EcoRV 단편의 형태로 이 벡터에 삽입한다. 이렇게 하여 이들을 SV40 바이러스의 인핸서의 프로모터의 조절하에 배치한다.
- 벡터 pCDNA3(Invitrogen). 이것 또한 진핵세포 발현 벡터이다. 본 발명의 변이체를 암호화하는 핵산을 이렇게하여 초기 CMV 프로모터의 조절하에 이 벡터에 배치한다. 실시예 B3에 기재된 모든 작제물을 생체내 평가를 위한 다양한 시스템에서 시험하기 위해서 HindIII/NotI 단편의 형태로 이 벡터에 도입한다.
C2 - 바이러스 벡터의 작제
특정 양식에 따라서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 핵산의 생체내 전달 및 발현을 허용하는 바이러스 벡터의 작제 및 용도에 있다.
아데노바이러스에 관하여 좀더 상세하게 말해서, 구조 및 성질이 다소 변하는 다양한 혈청형이 특징이 되었다. 이들 혈청형 중에서, 유형 2 또는 5 사람 아데노바이러스 (Ad 2 또는 Ad 5), 또는 동물 기원의 아데노바이러스(출원 WO94/26914 참조)의 사용이 본 발명의 프레임워크 내에서 바람직하다. 본 발명의 프레임워크 내에서 사용할 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에서, 개, 소, 쥐(예: MAV1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예: SAV) 기원의 아데노바이러스를 언급할 수 있다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다 [예를 들면, 맨하탄 균주 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]. 바람직하게는, 사람 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스를 본 발명의 프레임워크 내에서 사용한다.
바람직하게는, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 ITR, 캡시드화 허용 서열 및 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 좀더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에서, 적어도 E1 영역은 비기능성이다. 고려되는 바이러스 유전자는 당해분야의 기술자에게 공지된 기술에 의해서, 특히 전체 억압에 의해서, 치환 또는 부분 결실에 의해서, 또는 고려되는 유전자내에 하나 이상의 염기를 첨가함으로써 비-기능성으로 될 수 있다. 이러한 변형은 시험관내(분리된 DNA 상의) 또는 그자체로, 예를 들면 유전자 공학 기술에 의해서, 또는 이와는 달리 돌연변이제로 처리함으로써 수득할 수 있다. 기타 영역, 특히 영역 E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4(WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) 및 L5(WO95/02697)을 또한 변형할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에 결실을 포함한다. 다른 바람직한 양태에 있어서, 이것은 E1 영역에, E4 영역 및 본 발명의 핵산을 삽입하는 수준으로 결실을 포함할 수 있다(FR94/13355 참조). 본 발명의 바이러스에서, E1 영역내 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스의 서열 상의 뉴클레오타이드 455에서 3329에 걸쳐있다.
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당해분야의 기술자에게 공지되어 있는 일부 기술에 의해서 작제할 수 있다 [참고문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히, 이들은 아데노바이러스와 특히 해당 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 간의 상동 재조합에 의해서 작제할 수 있다. 상동 재조합은 아데노바이러스 및 플라스미드를 적합한 세포주로 공-형질감염시킨 후 발생한다. 사용된 세포주는 바람직하게는 (1) 상기 요소에 의해 형질전환이 가능해야 하고, (2) 결손 아데노바이러스 게놈 부분을 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해서 통합된 형태로 보완할 수 있는 서열을 함유해야 한다. 세포주의 예로서, 특히, 게놈에 통합된, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 좌측부(12%)를 함유하는 사람 배 신장세포주 293 [참고문헌: (Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1977) 59] 또는 특히 출원 WO 95/26914호 및 WO95/02697호에 기재된 바와 같은 E1 및 E4 작용을 보충할 수 있는 세포주를 언급할 수 있다.
다음으로, 증식한 아데노바이러스는 실시예에 설명되어 있는 바와 같은 통상적인 분자 생물학 기술에 따라서 회수되고 정제된다.
아데노-수반 바이러스(AAV)에 있어서, 이들은 이들이 감염하는 세포의 게놈으로 안정한, 부위-특이적 방법으로 통합되는 상대적으로 작은 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 생장, 형태 또는 분화에 대한 영향을 유도하지 않고 광대한 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 사람의 병리상태에 수반되는 것 같지 않다. AAV의 게놈을 클로닝하고, 서열화하고, 특징화했다. 이것은 약 4700 염기를 포함하고, 각각의 말단에 바이러스에 대한 복제 기원으로서 제공되는 약 145 염기의 삽입된 반복 영역(ITR)을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 운반하는 두 필수 영역: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측부; 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈이 우측부로 분리된다.
시험관내 및 생체내 유전자의 전달을 위한 AAV로부터 유도된 벡터의 사용이 문헌 [참조: 특히 WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528)에 기재되어 있다. 이러한 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자에 의해서 치환되는 AAV로부터 유도된 다양한 작제물, 및 해당 유전자의 시험관내(배양액내 세포상) 또는 생체내(유기체내에서 직접)로의 전달을 위한 사용을 기재한다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 두개의 AAV 삽입된 반복 영역(ITR)에 의해 접경된 해당 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 플라스미드의, AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드의 사람 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포주로, 공-형질감염에 의해 작제할 수 있다. 사용할 수 있는 세포주의 예는 세포주 293이다. 생성된 재조합 AAV를 통상적인 기술에 의해 정제한다.
허피스바이러스와 레트로바이러스에 있어서, 재조합 벡터의 작제가 문헌 [참조: 특히 Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등]에 널리 기재되어 있다. 특히, 레트로바이러스는 분열 세포를 선택적으로 감염시키는 통합성 바이러스이다. 그러므로 이들은 암 적용을 위한 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스의 게놈은 본질적으로 두개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스에서 유도된 재조합 벡터에서, 일반적으로 gag, pol 및 env 유전자는 완전히 혹은 부분적으로 결실되고, 해당 이종 핵산 서열로 치환된다. 이러한 벡터는 특히 MoMuLV(쥐 몰로니 백혈병 바이러스, MoMLV 라고도 불려짐), MSV(쥐 몰로니 육종 바이러스), HaSV(하비 육종 바이러스), SNV(비장 괴사 바이러스), RSV(라우스 육종 바이러스) 또는 프렌드 바이러스 같은 다양한 유형의 레트로바이러스로부터 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산을 함유하는 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서는, 특히 LTR, 캡시드화 서열 및 앞서 언급한 핵산을 함유하는 플라스미드를 작제하고 나서 이를 플라스미드에서 결여된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 형질감염시키기 위해 사용한다. 일반적으로, 캡시드화 세포주는 이 결과로 gag, pol 및 env 유전자를 발현시킬 수 있다. 이런 캡시드화 세포주는 선행 기술에서, 특히 PA317 세포주(미국 4,861,719), PsiCRIP 세포주(WO 90/02806) 및 GP+envAM-12 세포주(WO 89/07150)에 기술되어 있다. 게다가, 재조합 레트로바이러스는 gag 유전자의 일부를 함유한 연장된 캡시드화 서열 뿐만 아니라, 전사 활성을 억제하기 위해 LTR에 변형을 포함할 수 있다[참조문헌; Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 그리고 나서, 생성된 재조합 레트로바이러스는 종래기술에 의해 정제된다.
본 발명의 수행을 위해, 결손 재조합 레트로바이러스 혹은 아데노바이러스를 이용하는 것이 가장 특히 유리하다. 실제로, 이들 벡터는 유전자를 종양 세포로 전달시키기 위한 특히 유리한 특성을 지니고 있다.
C3 - 화학 벡터
개발된 합성 벡터 중, 본 발명의 프레임워크내에서 폴리라이신 형 (LKLK)n, (LKKL)n, 폴리에틸렌이민 형 및 DEAE 덱스트란 형의 양이온 중합체 또는 양이온 지질 혹은 리포펙탄트를 이용하는 것이 바람직하다. 이들은 DNA를 응축시키고 세포막과의 결합을 증진시키는 특성을 지니고 있다. 후자 중에는, 핵 기원 펩타이드 뿐만 아니라 리포폴리아민(리포펙트아민, 트랜스펙탐 등), 다양한 양이온성 혹은 중성 지질(DOTMA, DOGS, DOPE 등)이 언급될 수 있다. 게다가, 수용체에 의해 중재된 표적화 형질감염의 개념이 개발되었으며, 이는 양이온성 중합체 및 이식하고자 하는 세포형의 표면에 존재하는 막 수용체를 위한 리간드간의 화학적 결합에 의해 복합체를 막에 부착시키는 과정을 지시하면서, 양이온성 중합체에 의해 DNA를 응축시키는 원리를 이용한다. 트랜스페린 및 인슐린을 위한 수용체 또는 간세포의 아시알로글라이코단백질을 위한 수용체의 표적화가 기술되어 있다. 화학 벡터와 같은 것을 이용하는 본 발명에 따른 조성물의 제조는, 일반적으로 단순히 다양한 성분을 접촉시키는, 당해분야의 숙련인에게 공지된 어떠한 기술에 따라 수행된다.
실시예 D
- p53 변이체의 기능 평가-
본 발명에 따른, p53 변이체는 다음의 기준에 대한 세포 시험에서 평가된다:
- 특이적 이본쇄 DNA 서열과의 결합
- 전사 활성화 기능
- 항증식 활성
- 아폽토시스 활성
- 몇몇 p53 돌연변이와 연계된 종양 가능성
이러한 평가를 위해 좀더 특이하게 사용되는 작제물은 실시예 B에서 기술된 작제물 V-325, V-336, V-343 및 AS이다.
실시예 D1
- 본 발명의 하이브리드 분자에 의한 특이적 이본쇄 DNA 서열의 인식
실시예 D1.1
- 하이브리드 분자의 생성
야생형 p53의 cDNA는 BamH I 부위에서 벡터 pBlueBac III(Invitrogen) 내로 클로닝시킨다. 효소 EcoR I 및 Not I으로 플라스미드 pEC114를 절단하여 수득된 V325 cDNA를 포함한 분획을 플라스미드 pAcHLT-A (Pharmingen)로 삽입시켜, 재조합 배큘로바이러스가 생성되도록 하는 벡터를 제조한다. 이것의 목적은 N-말단에서 특히, 6 히스티딘 잔기의 쇄를 포함하는 펩타이드 서열로 연결된 V325 단백질을 발현시키는데 있다. 이 벡터를 사용하여, 재조합 배큘로바이러스를 생성하고 제조자의 지시에 따라 (Invitrogen, Pharmingen) 정제한다. 각각의 배큘로바이러스로 감염된 SF9 곤충 세포의 핵 추출물을 이용하여 두 단백질을 균질하게 정제하며, 핵 추출물은 문헌[참조; C. Delphin, Eur. J. Biochem., 223, 683-692, 1994]에 의해 기술된 방법에 따라 수득된다.
야생형 p53은 다음의 프로토콜에 따라 모노클로날 항체 pAb421(Oncogene Sciences, Ab-1) 상에서 면역친화력에 의해 정제된다: 감염된 세포의 핵 추출물을 항체 pAb421이 공유결합된 단백질 A-아가로스 겔과 함께 4 ℃에서 세 시간 동안 배양한다. 1 M의 KCl 및 프로테아제 저해제를 포함한 pH 7.8의 50 mM 트리스- HCl 완충액으로 겔을 철저하게 세척한 후, p53(KKGQSTSRHK)에서 이 항체에 의해 인식된 에피토프에 상응하는 펩타이드로 p53 단백질을 용출시킨다. 이 펩타이드는 세척을 위해 사용된 용액 중 5 mg/ml 의 농도에서 사용된다. 센트리콘-30 (Amicon Grace)에서 농축시킨 후, 펩타이드로부터 용출된 p53을 분리하고 pH 7.5 의 50 mM 트리스-HCl, 0.2 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM ZnCl2, 10 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 0.1 % NP-40, 5% 글리세롤로 평형이 이루어진 슈퍼로스 6 HR10/30 컬럼에서 겔 투과에 의해 균질하게 정제한다. p53을 포함한 분획을 등분하고 이들이 사용될 때까지 -80 ℃에서 즉시 동결한다.
N-말단에서 6 히스티딘 잔기를 포함한 펩타이드 서열과 결합된 V325 단백질 (이하, 이를 HisV325로 명명함)을 Hochuli et al.에 의해 번안된 방법에 의해 정제한다[참조문헌; Bio/Technology Vol. 6 (1988) 1321]. 니켈-NTA 아가로스 겔을 적용하기 전에, 5 mM 머캅토 에탄올, 0.1% NP-40 및 프로테아제 저해제 칵테일을 포함한, pH 8의 50 mM 인산나트륨 완충액에서 평형이 이루어진 PD10 컬럼(파마시아)상에서 감염된 세포의 핵 추출물을 탈염한다. 니켈 NTA 아가로스 겔과 함께 핵 추출물의 배양은 4 ℃에서 한 시간 동안 이 완충액에서 교반하에 수행한다. 그 다음, pH 6에서 동일 완충액으로 겔을 철저히 세척한다. 0.1 M 이미다졸로 겔을 세척한 후, HisV325 단백질을 후자의 완충액에서 0.3 M 이미다졸로 용출시킨다. HisV325를 포함한 분획을 등분하고 이들이 사용될 때까지 -80 ℃에서 즉시 동결한다.
실시예 D1.2
- 특이적 이본쇄 DNA 서열의 작제
본 실험에 사용된 특이적 이본쇄 DNA 서열은 다음과 같은 서열의 두 합성 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다:
올리고 5568 (서열번호. 45):
GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA
올리고 5569 (서열번호. 46):
AGCTTCAACATGTTGGGACATGGTTGG
이러한 두 합성 올리고뉴클레오타이드를 다음과 같은 반응 배지 20 ㎕에서 각각의 올리고뉴클레오타이드 5 pmol을 37 ℃에서 30 분간 배양하여 P-33으로 표지시킨다:
트리스-HCl pH 7.6 50 mM
MgCl2 10 mM
디티오트레이톨 5 mM
스퍼미딘 100 M
EDTA 100 M
[-33P]ATP (애머샴) 50 Ci (1000-3000
Ci/mmol)
T4 키나제 (뵈링거) 10 U
다음, WAF-1 유전자의 프로모터 영역에서 p53에 의해 인식된 특이 서열을 포함하는 다음의 이본쇄 서열 WAF-RE를 재구성하기 위해 100 mM NaCl 존재하에 표지된 두 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화시킨다[참조문헌; W.S. E1-Deiry, Cell Vo175 (1993) 817]:
GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA
GCTTGTACAGGGTTGTACAACTTCGA
실시예 D1.3
- 본 발명의 하이브리드 분자에 의한 이본쇄 서열 WAF-RE의 인식
본 발명의 하이브리드 분자에 의한 이본쇄 서열 WAF-RE의 특이적 인식을 설명하기 위해, 하기에 기술된 원리로 겔 지연 실험을 수행한다. 전기한 실시예에 따라 제조된 서열 WAF-RE(2.4 x 10-9 M), 비특이적 결합을 제거하기 위해 사용된 콜드 경쟁제 올리고뉴클레오타이드(Promega) 1.2 x 10-6 M 및 야생형 p53의 존재하에 또는 부재하에 시험될 하이브리드 분자 30 ng(3 내지 30 ng 사이)을 첨가함으로써, 반응 배지 25 ㎕(pH 7.5 의 트리스-HCl 20 mM, 5 mM MgCl2, 0.05 mM ZnCl2, 5 mM 디티오트레이톨, 0.1 mg/ml BSA, 10% 글리세롤, 1% 노니데트 P-40, 0.1 M NaCl, 2 g/ml 아프로티닌, 2 g/ml E-64, 2 g/ml 루펩틴, 2 g/ml 펩스타틴)에서 DNA 결합반응을 수행한다. 특이 DNA 결합 활성 때문에, pAb421 항체 300 ng에 의해 야생형 p53을 활성화시키는 것이 가능하다[참조문헌; T. R. Hupp, Cell Vol 71 (1992) 875]. 반응 혼합물을 얼음에서 30 분간 배양하고 최종 혼합물은 200 V, 16 ℃에서 4% 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨다. 그 다음, 겔을 건조시키고 오토래디오그래피시킨다.
겔 지연에서 야생형 p53 및 HisV325 사이에서 경쟁의 대표적 실험 결과는 도 6에서 나타내고 있다. 이 결과는 His-V325가 야생형 p53 서열에 대한 필적할 만한 친화력으로 이본쇄 서열 WAF-RE를 인식함을 보여준다. 겔 지연에서 HisV325는 야생형 p53으로 수득된 것보다 훨씬 더 빠르게 이동하는 우세한 밴드를 보여주고 있음을 주목해야 할 것이다. 이는 HisV325가 이량체 형태로 결합함을 보여준다고 할 수 있다. 게다가, 기대한 것처럼, 이 밴드는 pAb421 존재에 의해 치환되지도 증폭되지도 않는다. 결국, pAb421 부재하에, 야생형 p53은 V325보다 훨씬 더 적게 RE-WAF와 결합한다.
실시예 D2
- 전사 활성화 기능의 평가
작제물의 전사 활성화 기능은 p53 단백질에 대한 두 대립 유전자가 결여된 SAOS-2(사람 골육종) 세포(HTB85 하에 ATCC에서 입수가능한 세포), 그리고 종양 세포주 H358[참조문헌; Maxwell & Roth, Oncogene 8 (1993), 3421] 및 헬라(ATCC CCL 2) 중 생체내 전사 활성화 시스템에서 평가된다. 이 시스템은 효소적으로 분석될 수 있고, 야생형 p53에 의한 특이적 인식을 위한 뉴클레오타이드 단위를 포함하는 프로모터에 종속되어 위치한 리포터 유전자의 사용에 근거하고 있다(실험적인 방법과 비교).
이 시험에서, 리포터 유전자는 CAT(클로람페니콜-아세틸 트랜스퍼라제) 유전자이고, p53에 의한 인식서열은 Funk 등에 의해 정의된 컨센서스 서열(p53RE)이다 [참조문헌; Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 2866].
이 기능의 평가는 3가지 다른 기준형에 대해 야생형 단백질의 것과 비교하여 수행된다.
실시예 D2.1
- 반응 용량에 있어 전사 활성화의 활성
10% 열-불활성화된 태 송아지 혈청으로 보충된 DMEM 배지 (Gibco BRL) 3 ml을 포함한 지름 6 cm의 페트리 디쉬에 세포(3.5 x 105)를 접종하고, 이를 37 ℃, CO2 (5%) 배양기에서 밤새 배양한다. 그리고 나서 형질감염제로 리포펙트아민 (Gibco BRL)을 사용하여 다음과 같은 방법에 의해 다양한 작제물을 형질감염시킨다: 전체 플라스미드 중 3 g 을 배양하고(리포터 플라스미드 0.5 g 중) 리포펙트아민 10 ㎕와 혈청이 없는 옵티-멤 배지(Gibco BRL) 3 ml를 함께 30 분간 배양한다(형질감염 혼합물). 이 기간동안, 세포를 PBS로 두번 세정하고 37 ℃에서 4시간 동안 형질감염 혼합물과 함께 배양한다. 그 후, 후자를 흡인하고 10% 열-불활성화된 태 송아지 혈청 및 37 ℃에서 48시간 동안 재증식된 세포로 보충된 DMEM 배지 3ml로 대체시킨다.
CAT 활성 분석을 위한 방법
형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 PBS로 한번 세척하고 나서 긁어 모으고, pH 8의 0.25 M 트리스 완충액 100 ㎕로 회수하며, 에탄올/고체 이산화탄소 조에서 동결-융해 사이클로 용해시킨다. 이리하여 수득된 전체 세포 추출물을 10,000 rpm에서 15분간 원심분리시키고 활성 분석을 위해 상등액을 회수한다. 후자는 세포 추출물 20 ㎕을 최종 조성이 다음과 같은 반응 혼합물 130 ㎕에 첨가함으로써 수행된다:
- 아세틸-조효소 A 0.4 mM
- 클로람페니콜,
D-트레오-(디클로로아세틸-1,2-14C) 23 M (200 nCi)
- 트리스 0.18 M pH 8
37 ℃에서 한시간 동안 배양한 후, 반응 산물을 에틸 아세테이트 250 ㎕로 추출한다. 이 중 20 ㎕는 95% 클로로포름 및 5% 메탄올을 포함한 혼합물에서 흐르도록 되어있는 실리카 평판상(박층 크로마토그래피)에 놓여진다. 이리하여 수득된 크로마토그래피 평판은 마침내 아세틸화의 다양한 산물의 비율(여기서 비율은 효소 클로람페니콜 아세틸-트랜스퍼라제의 활성 및 다양한 작제물의 전사 활성화 활성을 나타냄)을 계산가능하도록 하는 인스턴트 영상기(패카드 인스트루먼츠)를 사용하여 전개된다.
CMV 프로모터(pCDNA3)의 통제하에 놓여진 작제물과 함께 SAOS-2 주에서 수득된, 그리고 도 7 및 8에서 나타내어진 결과는 각각의 작제물에 대한 다음과 같은 특징을 보여준다:
- p53 단백질은 높은 투여량으로 포화되는 경향의 용량-의존성 활성을 지니고 있다(플라스미드 100 ng으로 부터). 이 포화상태는 이러한 조건 하에서 제한될 수 있는 보조인자의 부족을 나타내고 있는지도 모른다.
- AS 단백질은 야생형 단백질의 전사-활성 능력을 보유하고 있다.
- p53 단백질과 같이, V-325, V-336 및 V-343 단백질은 부분적으로, 높은 투여량하에서 포화하지 못하는 전사 활성화 활성을 지니고 있다. 따라서 포화의 명백한 부족은 활성에 있어 전체적인 증가를 야기시킬 수 있다. 게다가, 작제물 V-325는 상동인 V-336 및 V-343 보다 좀더 활성이 있는 것으로 나타난다. 이는 75-325 영역을 수반하는 키메릭 단백질이 특히 유용함을 나타내고 있다.
이러한 특성을 확인하기 위해, SAOS-2 세포주와 같이, p53 유전자의 두 대립유전자가 결여된 종양 세포주 H 358에서 유사한 실험이 수행된다. 이 실험에서, 각각의 형질감염은 CMV 프로모터에 종속되어 위치한 각각의 작제물 50 ng으로 수행된다. 표 1에서 나타난 결과는 두 변이체 V-325 및 V-336이 야생형 p53 단백질과 비교해서 증진된 전사 활성화 활성을 보여주고 있음을 명백히 하고 있다. 그러나 변이체 V-325의 활성이 훨씬 더 우수하다.
이 시험은 본 발명의 변이체가 증진된 p53의 특성 중 적어도 한가지를 지니고 있음을 확인시킨다.
활성에 있어서 이러한 차이는 발현에 있어서의 차이에 기인한 것이 아니라, 실제로 본 발명의 변이체의 증가된 활성에 기인한 것이라는 것을 입증하기 위해, 야생형 p53 단백질 및 변이체 V-325, V-336 및 V-343의 발현 수준을 SAOS-2 세포 에서 분석한다. 이를 위해, 선행 실험에서 사용된 각각의 플라스미드 3 g으로 세포를 형질감염시키고, 형질감염 후, 24시간 및 48시간 후 세포를 회수한다. 이 둘을 PBS 완충액(Gibco BRL)에서 세척한 후, 세포를 2 mM PMSF, 20 g/ml 아프로티닌, 2 g/ml E64, 2 g/ml 루펩틴 및 2 g/ml 펩스타틴으로 보충된 RIPA 완충액(10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% 넌이뎃-P40, 1% 나트륨 디옥시콜레이트, 0.1% 도데실 나트륨 설페이트) 50 ㎕에서 15 분간 4 ℃에서 파괴시킨다. 15,000 rpm에서 15 분간 원심분리 시킨 후, 상등액을 모으고, 이동 완충액 [참조문헌; Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970] 으로 보충하며, 앞서 기술된 프로토콜[참조문헌; Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970]에 따라 200 V 에서 변성 배지 중 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시킨다. 다음, 단백질을 제조자의 추천에 따라 NOVEX 반건조 이동 시스템을 사용하여 PVDF 막(NEN 조사 산물)으로 이동시키고, 모노클로날 항체 pAb 240(Oncogene Sciences, Ab-3) 및 ECL 키트(애머샴)를 사용하여 퍼옥시다제와 결합된 (Nordic Immunology) 2차 항체(안티-마우스 토끼 항체)에 의해 나타낸다.
도 9에서 나타낸 이 실험의 결과는 변이체 V-325 및 V-336은 야생형 p53의 것 보다 상당한 수준으로 발현되고 또한 변이체 V-343은 전기한 것들보다 좀더 잘 발현됨을 보여주고 있다. 게다가, 24 및 48시간에서 발현 수준의 비교는 각각의 작제물의 상대적인 안정성이 유사함을 나타내고 있다. 따라서 이 결과는 본 발명의 변이체 V-325 및 V-336의 증가된 활성이 V-343 변이체와는 대조적으로, 보다 나은 발현에 기인한 것이 아니라 아마도 증가된 전사 활성화능에 기인함을 보여주고 있다.
그 후, 본 발명의 변이체가 야생형 p53 인식 요소의 통제하에 놓여진 유전자를 활성화시킬 수 있음을 확인하기 위해, 일반적으로 p53 단백질에 의해 유도된, hdm2 및 WAF1 유전자의 발현을 관찰함으로써 내성 유전자의 활성 연구를 수행한다.
이 실험은 p53 단백질을 암호화하는 두 대립유전자가 결여된 EB 세포주(대장암)에서 수행된다[참조문헌; Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495]. 유도성 메탈로티오나인 프로모터의 통제하에 p53 단백질을 발현시키는 안정한 클론은 이 세포주(클론 EB-1[참조문헌; Shaw et al., PNA 89 (1992) 4495])으로부터 작제된다. 게다가, 유도 메탈로티오나인 프로모터의 통제하에 V-325 단백질을 발현시키는 다른 안정한 클론은 EcoR I-Not I 부위(pmIMTli-V-325)에서 V-325 단백질을 암호화하는 cDNA의 삽입에 의한 벡터 pmIMTli(P.Shaw로부터 수득)에서 유도된 플라스미드를 사용하여 작제된다. 이를 위해, 플라스미드 pmIMTli-V325 1.3 g 및 앞서 기술된 방법에 따른 플라스미드 pcDNA3 200 ng으로 형질감염시키고, 제네티신 800 g/ml를 포함한 배지에서 증식에 의한 형질감염 후, 안정한 클론을 선별한다. 유도 방법에서 V-325를 발현시키는 클론은 EB-1 클론 중 p53 단백질의 발현과 필적할 만한 수준에서 선별된다(EB-V325 클론).
EB 모세포(106 세포) 뿐만 아니라 EB-1 및 EB-V325 클론을 ZnCl2(200 M)로 처리하고 세포 추출물을 다양한 시간대에서 제조하고 전기영동시키며 앞서 기술된 바에 따라 막 이동시킨다. 이동된 단백질은 3가지 다른 항체에 의해 나타난다; p53 단백질에 대한 모노클로날 항체 pAb240, 하나는 hdm2 단백질에 대해, 나머지 하나는 WAF1 단백질에 대한 2가지 폴리클로날 항체. 도 10에서 나타낸, 이 실험 결과는 다음을 보여준다: 1) 유도없이 EB, EB-V325 및 EB-1 세포가 결여된 p53 단백질은 아연 처리 시작 후, 4 시간만에 EB-1 클론에서 발현되고, 변이체 V-325는 EB-V325 클론에서 같은 방법으로 발현된다. 2) 아연 처리 4시간 후, EB 세포에서 발현이 유도되는 WAF1 단백질은 EB-1 및 EB-V325 클론에서 발현이 16시간까지 지연되어 나타난다. 3) hdm2 단백질의 유도는 EB-1 및 EB-V325 클론에서만이 관찰가능한데, EB-V325 클론에서는 증가된 발현이 관찰된다.
이 결과는 V-325 변이체에 의한 전사 활성이 일반적으로 야생형 p53 단백질에 의해 유도된 유전자의 발현을 유도시키고, 또한 실제로 이 변이체가 야생형 p53 단백질에 비해 생리학적 환경에서 증가된 활성을 나타냄을 보여주고 있다.
실시예 D2.2
- 전사 활성화 기능에 관한 E6 단백질 (HPV 18)의 효과
사용된 방법은 실시예 D1.1에서 기술된 것과 일치한다. 이 형질감염 실험에서, CMV 프로모터(pCDNA3)의 통제하에 위치한 작제물은 SV40 프로모터(pSV2)의 통제하에서 E6을 발현시키는 플라스미드의 농도를 증가시킴과 동시에 형질감염시킨다. SAOS-2 세포주에서 수득되고 도 11에서 나타낸 결과는 각각의 작제물이 다음과 같은 특징을 가짐을 보여주고 있다:
- p53의 활성은 E6의 농도가 증가함에 따라 감소한다. 이 감소는 아마도 E6에 의해 유도된 p53의 붕괴를 의미한다;
- 단백질 V-336은 E6에 대한 반응성의 결여를 나타낸다;
- 단백질 V-325는 E6에 의해 조금 활성화될 수 있음을 나타낸다. 단백질 V-325는 항상, 또한 관찰된 모든 조건에서, p53보다 좀더 활성적이다. 단백질 E6에 대한 성질, HPV18-양성세포에서 (헬라) 작제물 V-325 및 V-336의 전사 활성화 활성(이러한 이유로 단백질 E6로 표현)에 있어서의 이러한 차이를 확인하기 위해, 시험되고 야생형 p53의 것과 비교된다.
앞서 기술된 방법에 따라 수행된 이 형질감염 실험에서, 다양한 작제물은 CMV 프로모터(pCDNA3)의 통제하에 위치한다.
도 12에서 나타낸 결과는 어떤 조건에서 두 작제물 V-325 및 V-336의 매우 명백한 전사 활성을 보여주며 또한 야생형 p53 단백질이 매우 불활성적, 다시말해 야생형 단백질과 대조적으로 이 두 작제물이 E6에 반응하지 않음을 암시하고 있다.
E6 단백질에 대한 반응성의 결여는 이 단백질에 의해 유도된 붕괴에 대해 좀더 나은 안정성을 나타내고 있는 것인지를 시험하기 위해, 시험관내에서 붕괴 실험을 수행한다.
이 실험에서 사용된 다양한 분자는 시험관내, 망상적혈구 용균액에서 해독에 의해 수득된다. 이는 전체 반응 용적 50 ㎕에 대해 제조자에 의해 기술된 실험 프로토콜에 따라 TNT 결합 망상적혈구 용균액 시스템 키트(Promega)를 사용하여 실시예 C1에서 기술된 분자(벡터 pcDNA3)이다.
이 실험을 위해, 본 발명의 하이브리드 분자, 야생형 p53 분자 뿐만 아니라 V-325 및 V-336을 방사능 표지된 하이브리드 분자를 형성하기 위해 35S-메티오닌(아머샴) 44 Ci(1175 Ci/mmol) 존재하에 시험관내에서 해독에 의해 생성한다. 부분적으로는, E6 단백질 (HPV18)을 35S-메티오닌이 부재하는 경우를 제외한 같은 조건하에서 생성한다.
다음, 방사능 표지된 산물(p53, V-325 및 V-336) 각각 2 ㎕를 방사능 표지되지 않은 E6 단백질 2 ㎕ 및 pH 7.5의 25 mM 트리스-HCl 완충액, 100 mM NaCl, 3 mM DTT의 최종 용적 40 ㎕ 중 망상적혈구 용균액 10 ㎕와 함께 30 ℃에서 배양한다. 반응배지 7.5 ㎕를 제거하고 이동 완충액 7.5 ㎕를 첨가하여 다양한 시간대에서 반응을 멈추고[참조문헌; Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970], 제조된 샘플을 앞서 기술된 프로토콜에 따라 200 V, 변성 배지 중 10 % 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다[참조문헌; Lammli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970]. 그리고 나서 겔을 건조시키고 반응 동안 붕괴되지 않은 본 발명의 변이체의 양을 평가할 수 있는 인스턴트 영상기 (패커드 인스트루먼츠)에 의해 겔을 나타낸다.
도 13에서 나타낸 이 실험의 결과는, V-325 및 V-336 변이체가 야생형 p53 단백질 보다 E6에 의해 유도된 붕괴에 대해 훨씬 더 내성이 있음을 보여준다. 그러나 내붕괴성은 V-325가 훨씬 더 우수하다. 실제로 이 결과는 앞서의 실험 중 (도 11 및 12) 전사 활성의 수준에서 관찰된 E6 단백질에 대한 야생형 p53 단백질과 V-325 및 V-336 변이체의 반응성에 있어서의 차이를 나타낸다.
이 성질은 이 두 작제물을 HPV16 또는 HPV18에 의한 감염과 결부된 병리의 치료를 위해 특히 유용한 수퍼 야생형 후보자로 만든다.
실시예 D2.3
- 전사 활성화 기능에 관한 우성-음성 p53 돌연변이체의 효과
이 실험에서는, 야생형 p53 단백질에 관해 우성-종양 및 우성-음성으로 기술된 돌연변이체 H175를 사용한다. 앞서 기술된 방법에 따라 수행된 형질감염 실험에서, H175 돌연변이체 뿐만 아니라 다양한 작제물이 CMV 프로모터(pCDNA3)의 조절하에 놓여진다. 돌연변이체 H175를 발현시키는 플라스미드의 농도를 증가시킴과 동시에 각각의 작제물을 형질감염시킨다.
도 14에서 나타낸 결과는 각각의 작제물에 대한 다음과 같은 특징을 보여준다:
- p53 단백질은 과량의 돌연변이형 H175 존재하에서 전사 활성화 활성의 감소를 보인다. 실제로 이런 돌연변이형은 야생형 p53 보다 좀더 안정하고 항상 과량으로 존재하기 때문에 이는 생리학적인 환경과 일치한다. 따라서, 이 돌연변이체의 우성-음성 효과는 여기서 측정된다.
- AS 단백질은 후자의 낮은 농도에 민감하기 때문에, 돌연변이체 H175의 우성-음성 효과에 대해 증가된 반응성을 나타낸다;
- 대조적으로, 단백질 V-325 및 V-336은 우성-음성 효과에 대해 민감할 뿐만 아니라 돌연변이형 H175 존재하에 용량-의존 방식으로 증가된 활성을 보인다. 한편, 이 시험에서, 단백질 V-325는 단백질 V-336과 비교해서 증가된 효과를 나타내는데, 이는 수퍼 야생형으로서의 가능한 상태를 좀더 확인시킨다.
실시예 D2.4
- 전사 활성화 기능에 관한 hdm2의 효과
사용된 프로토콜은 실시예 D1.1에서 기술된 것과 일치한다. 이 형질감염 실험에서, CMV 프로모터(pcDNA3)의 조절하에서 hdm2를 발현시키는 플라스미드(분획 1-134)의 농도를 증가시킴과 동시에 CMV 프로모터(pcDNA3)의 조절하에 위치한 작제물을 형질감염시킨다. SAOS-2 세포주에서 수득되고, 도 15에서 나타낸 결과는 각각의 작제물의 다음과 같은 특징을 보여준다:
- p53 단백질의 활성은 hdm2 농도가 증가함에 따라 감소한다. 실제로 이는 생리적인 환경과 일치한다.
- V-325 단백질은 hdm2에 의한 이러한 저해에 영향을 받지 않는 것으로 나타난다.
이러한 성질은 V-325 단백질을 hdm2의 고발현과 결부된 병리의 치료 및 p53 단백질의 N-말단 영역과 상호작용하는 세포 단백질의 과발현과 결부된 병리의 치료를 위해 수퍼 야생형 후보자로서 특히 유용하도록 만든다.
이 4가지 실험 결과는 본 발명에 따른 변이체, 특히 75-325-lz 또는 75-336-lz 영역을 포함하는 변이체가 다음을 나타내고 있음을 분명히 하고 있다; 1) 증가된 전사 활성화 활성, 2) HPV18로부터 E6 단백질의 효과에 대한 낮은 반응성, 3) 몇몇 p53 돌연변이체의 우성-음성 효과에 대한 반응성의 결여 및 심지어 이러한 조건에서 활성의 증가, 4) hdm2 단백질에 대한 반응성의 결여. 이런 다양한 특성은 매우 주목할 만하고 예기치 못한 것이며 본 발명의 변이체에 관해 상당한 치료의 이점을 제공한다.
실시예 D3
- 세포 증식의 효과
세포 증식에 관한 작제물 V-325 및 V-336의 효과는 이 3 가지 단백질을 발현시키는 플라스미드와 함께 형질감염이 뒤따르는 네오마이신 내성 콜로니의 형성을 위한 실험 중 세포주의 다양한 형태상에서 p53과 병행하여 시험된다.
앞서 기술된 방법에 따라 수행된 형질감염 실험에서, 다양한 작제물은 CMV 프로모터(pcDNA3)의 조절하에 놓여진다.
네오마이신 내성 콜로니 형성방법
형질감염 48 시간 후, 세포를 긁어모아 지름이 10 cm인 페트리 디쉬에 옮기고, 10 % 열-불활성화된 태 송아지 혈청 및 제네티신 400 g/ml(G418)로 보충된 10 ml의 DMEM 배지에서 다시 증식시킨다. G418 존재하에 15일간의 선별에 이어, 푹신으로 염색한 후, 계산에 의해 NeoR 콜로니 수를 결정한다.
이 실험은 표 2에서 나타낸 p53 및 Ras 단백질 상태 중 다양한 세포형에서 수행된다.
이 실험의 결과는 표 3 및 도 16에 나타나 있다.
이 결과는 V-325 및 V-336이 후자가 일반적으로 작용할 수 있는 세포 환경(야생형 p53 또는 이중 결실체)에서 적어도 야생형 p53 단백질만큼 효과적인 방법으로 세포 증식을 방해하는 능력을 소유하지만, 특히 이들은 야생형 p53 단백질이 거의 활성을 갖지 못하는 세포 환경 (hdm2 단백질의 과발현을 보여주는 HPV18 및 OsA-CL 세포로부터 E6 단백질을 발현시키는 헬라 세포)에서도 심지어 이같은 활성을 보유하고 있음을 보여준다.
실시예 D4
- 본 발명의 변이체의 아폽토시스 활성
본 발명의 변이체의 아폽토시스 활성은 EB, EB-1 및 EB-V325 세포, 또한 앞서 기술된 (실시예 D1) 유도 조건을 사용하여 연구되었다.
유도된 세포(106 세포)를 고정시키고 재현탁 및 2% BSA(PBS-BSA), 모노클로날 항체 pAb240 1 g으로 보충된 100 1의 완충액 A 중 실온에서 한 시간 동안 배양하기 전에, 1 ml 퍼미아픽스(Ortho Diagnostic Systems Inc.)에서 40 분간 배양하고 나서 완충액 A(0.5 % 트윈 20으로 보충된 PBS (Gibco BRL))에서 두 번 세척하여 침투시킨다. PBS-BSA 완충액에서 새로이 두번 세척한 후, 플루오레신과 결합된 2차 폴리클로날 항체 1 g으로 보충된 동일 완충액 100 l 중 실온에서 한 시간 동안 세포를 배양한다(GAM-FITC (Immunotech)). 다음, 세포를 완충액 A로 두번 세척하고, 프로피듐 요오다이드 5 g 및 RNase(DNase 없이) 1 mg을 포함한 같은 완충액 1 ml에서 재현탁시키며, 유동 사이토메트리에 의해 분석하기 전에 실온에서 30 분간 배양한다.
EB-1 및 EB-V325 세포상에서 수행된, 24 및 48 시간 유도실험 결과를 도 17에서 나타내고 있다. 이 조건하에서, 야생형 p53 단백질 또는 이의 변이체 V-325(항체 pAb240에 의해 검출)를 발현시키는 세포는 24 시간의 유도 후, G1 및 부-G1 기에서 널리 분포되고(아폽토시스), 그리고 나서 48 시간 후, 부-G1에서 필수적으로 분포된다. 이 결과는 야생형 p53 단백질과 같이, V-325 단백질이 아폽토시스를 유도할 수 있음을 분명히 나타내고 있다.
도 18에서 나타낸 EB 세포, EB-1 및 EB-V325 클론상에서 수행된 동역학 유도실험의 결과는 V-325 변이체가 야생형 p53 단백질보다 좀더 빠르고 좀더 대량으로 아폽토시스를 유도함을 나타내고 있다. 두 단백질이 이 클론에서 상당한 수준으로 발현된다는 사실을 고려할 때(실시예 D1과 비교), 이 결과는 야생형 p53 단백질에 비해 V-325 변이체의 증진된 활성에 관한 생각을 강화시킨다.
서열목록
(1)일반정보
(i)출원인:
(A) 성명: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 시: 앙토니
(E) 국명: 프랑스
(F) 우편번호: 92165
(G) 전화: (1) 40.91.69.22
(H) 팩시밀리: (1) 40.91.72.91
(ii)발명의 명칭: p53 단백질의 변이체 및 치료적 용도
(iii)서열수: 46개
(v)컴퓨터 판독 형태:
(A)매체형: 플로피 디스크
(B)컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C)운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 112 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
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(iv)안티센스: 없음
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(2) 서열번호 2에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 266 염기쌍
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(2) 서열번호 3에 대한 정보:
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(xi)서열배열: 서열번호 3:
(2) 서열번호 4에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 788 염기쌍
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(iv)안티센스: 없음
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(2) 서열번호 5에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 821 염기쌍
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(iv) 안티센스: 없음
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(2) 서열번호 6에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 15 염기쌍
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(2) 서열번호 11에 대한 정보:
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(i)서열특징:
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(2) 서열번호 26에 대한 정보:
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(2) 서열번호 27에 대한 정보:
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(2) 서열번호 28에 대한 정보:
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(A)길이: 816 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 28:
(2) 서열번호 29에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 1209 염기쌍
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(2) 서열번호 30에 대한 정보:
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(xi)특징:
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(2) 서열번호 31에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 1611 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 31:
(2) 서열번호 32에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 1065 염기쌍
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(2) 서열번호 33에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 963 염기쌍
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(ii)분자형: cDNA
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(ix)특징:
(A)명칭/키: CDS
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(xi)서열배열: 서열번호 33:
(2) 서열번호 34에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 1011 염기쌍
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(ii)분자형: cDNA
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(ix)특징:
(A)명칭/키: CDS
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(xi)서열배열: 서열번호 34:
(2) 서열번호 35에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 24 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 35:
(2) 서열번호 36에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 749 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 36:
(2) 서열번호 37에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 45 염기쌍
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(iv)안티센스: 없음
(xi)서열배열: 서열번호 37:
(2) 서열번호 38에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 24 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 38:
(2) 서열번호 39에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 749 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 39:
(2) 서열번호 40에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 27 염기쌍
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(xi)서열배열: 서열번호 40:
(2) 서열번호 41에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 749 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
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(iv)안티센스: 없음
(xi)서열배열: 서열번호 41:
(2) 서열번호 42에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 48 염기쌍
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(iv)안티센스: 없음
(xi)서열배열: 서열번호 42:
(2) 서열번호 43에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 48 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: cDNA
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(xi)서열배열: 서열번호 43:
(2) 서열번호 44에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 16 아미노산
(B)유형: 아미노산
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: 펩타이드
(iii)가설: 없음
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(xi)서열배열: 서열번호 44:
(2) 서열번호 45에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 26 염기쌍
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(C)본쇄형: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv)안티센스: 없음
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(2) 서열번호 46에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 26 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv)안티센스: 없음
(xi)서열배열: 서열번호 46:

Claims (17)

  1. 올리고머화 영역의 일부 및 조절 영역을 포함하는 p53 단백질의 C 말단부가 잔기 326번으로부터 잔기 337번까지 결실되고 서열번호 26의 잔기 334번으로부터 잔기 363번을 포함하는 인공 루이신 지퍼 영역으로 치환; 및
    전사 활성화 영역이 잔기 1번으로부터 잔기 73번까지 결실되고 VP16 전사 활성화 영역으로 치환된, p53 단백질의 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, p53 단백질의 182번 위치의 아르기닌 잔기가 히스티딘으로 치환된 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 잔기 1 내지 74번의 결실을 포함하는 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 전사 활성화 영역이 서열번호 2의 서열을 포함하는 변이체.
  5. p53의 182번 위치에 히스티딘을 포함하는, 서열번호 25의 서열의 V-325 화합물 또는 그의 변이체 V-325H.
  6. p53의 182번 위치에 히스티딘을 포함하는, 서열번호 26의 서열의 V-336 화합물 또는 그의 변이체 V-336H.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 변이체 또는 키메릭 단백질을 암호화하는 핵산.
  8. 제 7 항에 있어서, cDNA, RNA, 합성 또는 반합성 산인 핵산.
  9. 제 7 항에 있어서, 서열번호 25 또는 26의 서열의 핵산으로부터 선택되는 핵산.
  10. 제 7 항에 따른 핵산, 이의 발현을 허용하는 프로모터, 및 전사 종결 시그널을 포함하는 발현 카세트.
  11. 제 7 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 핵산이 이의 발현을 허용하는 프로모터 및 전사 종결 시그널을 포함하는 발현 카세트 내에 포함되는 벡터.
  13. 제 11 항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서, 결손 재조합 아데노바이러스, 레트로바이러스, AAV 또는 HSV인 벡터.
  15. 제 11 항에 있어서, 화학 또는 생화학 벡터인 벡터.
  16. 제 7 항에 따른 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 과증식성 질환 치료용 약학 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 따른 변이체 또는 키메릭 단백질을 포함하는 과증식성 질환 치료용 약학 조성물.
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