CZ14498A3

CZ14498A3 - Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické použití

Info

Publication number: CZ14498A3
Application number: CZ98144A
Authority: CZ
Inventors: Emmanuel Conseiller; Laurent Bracco
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1998-04-15
Also published as: KR100501881B1; HUP9901343A3; AU725841B2; EP0839194B1; HUP9901343A2; DK0839194T3; ZA966127B; TW444022B; ES2263161T3; SK6398A3; MX9800555A; NO322477B1; HU225937B1; CA2224468C; DE69636072T2; DE69636072D1; FR2736915B1; EP0839194A1; CA2224468A1; PT839194E

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká proteinů odvozených od produktu supresorového genu nádorů p53, které mají zlepšené funkce vzhledem k terapeutickému použití. Výhodně se také týká proteinů, které mají supresorové funkce nádorů a funkce induktoru programované buněčné smrti, které vynikají nad funkcemi proteinu p53 divokého typu, zejména v patologických souvislostech proliferace, ve kterých protein p53 divokého typu je neaktivní. Týká se zejména nukleových kyselin kódujících tyto molekly, vektorů je obsahující a jejich terapeutického použití, zejména v genové terapii. Produkty podle vynálezu jsou přizpůsobeny zvláště opravě funkcí p53 v patologických souvislostech zejména rakovinových.

Dosavadní stav techniky

Divoký protein p53 zasahuje do regulace buněčného cyklu a do udržování celistvosti genomu buňky. Tento protein, jehož základní funkce je být aktivátorem transkripce určitých genů, je schopný procesy ne ještě dobře definovanými blokovat buňku ve fázi G1 buněčného cyklu, tedy objevit mutace v průběhu replikace genomu a spustit určitý počet oprav DNA. V případě špatného fungování procesů oprav nebo v případě objevení velkého počtu mutačních dějů je tento protein schopen indukovat fenomén programované buněčné smrti, nazvané apoptóza.

Takovýmto způsobem protein p53 jedná jako nádorový supresor při vyloučení nepravidelně rozdělených buněk nebo buněk, jejichž genom byl poškozen.

Tato hlavní funkce proteinu p53 závisí na funkci

..... ·· ··· faktoru transkripce, jinými slovy závisí na dvou schopnostech rozpoznávat specifické sekvence na úrovni genomické DNA a získávat všeobecné vybavení transkripce.

Protein p53 obsahuje 393 aminokyselin, které definují pět funkčních domén (viz Obrázek 1):

- aktivační doména transkripce, tvořená aminokyselinymi 1 až 73, schopná vázat určité faktory všeobecné vybavení transkripce jako protein TBP. Tato doména je také sídlem určitého počtu posttranslačních modifikací. Je také místem počtu interakcí proteinu p53 s počtem jiných proteinů, zejména s buněčným proteinem mdm2 nebo proteinem EBNA5 viru Epstein-Barr (EBV), schopných blokovat funkci divokého proteinu. Tato doména má sekvenci aminokyselin nazvaných PĚST citlivých k proteolytické degradaci.

- DNA vazebná doména, umístěná mezi aminokyselinami 73 až 315. Konformace této centrální domény proteinu p53 řídí rozpoznání specifických sekvencí DNA proteinu p53. Tato doména je sídlem dvou typů změn určujících funkci divokého proteinu:

(i) interakce s proteiny blokujícími funkci proteinu p53 jako antigen 'velké T' viru SV40 nebo virovými proteiny Εβ virů HPV16 a HPV18 schopných vyvolat svou degradaci ubikvitinovým systémem. Tato posledně zmíněná interakce může být provedena jenom v přítomnosti buněčného proteinu EPap (enzym E3 ubikvidinové kaskády).

(ii) bodové mutace, které určují funkci proteinu p53 a jako jakýsi celek jsou umístěny v této oblasti.

- signál nukleární lokalizace, tvořený aminokyselinami 315 až 325, nepostradatelný ke správnému rozpoznání proteinu v místě, kde bude vykonávat svou základní funkci.

- oblast oligomerizace, tvořená aminokyselinami 325 až 355. Tato oblast 325 až 355 tvoří strukturu typu: β

skládaného listu (326 až 334) - zlom (335 až 336) - a helix a (337 až 355) . Změny funkcí umístěných v této oblasti jsou zejména způsobeny interakcí divokého proteinu s různými mutovanými formami, které mohou vést k různým vlivům na funkci divokého proteinu.

- doména regulace, tvořená aminokyselinami 356 až 393 je místem určitého počtu modifikací posttranslačních (glykolizace, fosforylace, fixace RNA...), které modulují funkci proteinu p53 pozitivním nebo negativním způsobem. Tato doména hraje velmi důležitou roli v modulaci aktivity divokého proteinu.

Funkce proteinu p53 může být narušena různými způsoby.

- blokace jeho funkce určitým počtem faktorů například antigenem 'velké T' viru SV40, proteinem EBNA5 viru Epstein-Barr nebo buněčným proteinem mdm2.

- destabilizace proteinu zvětšením jeho citlivosti k proteolýze, zejména interakcí s proteinem E6 viru lidského papilomu HPV16 a HPV18, který podporuje vstup proteinu p53 do ubikvidínového cyklu. V případě interakce mezi těmito dvěma proteiny může se provést destabilizace jen předběžnou fixací buněčného proteinu, proteinu E6ap, jehož nísto fixace je špatně známé.

- bodové mutace na úrovni genu proteinu p53

- delece jedné nebo dvou alel proteinu p53

Poslední dva typy modifikací jsou nalezeny asi v 50% různých typů rakoviny. Po tétp stránce mutace genu proteinu p53 zapsané v rakovinných buňkách zasahují velkou část genu kódujícího tento protein a mají za následek různé mutace funkcí tohoto proteinu. Může se uvést, že tyto mutace jsou z velké části umístěny v centrální části proteinu p53, u něhož se ví, že to je oblast kontaktu se specifickou genomickou sekvencí proteinu p53.

To vysvětluje, proč většina mutací proteinu p53 nemá jako základní charakteristiku možnost se fixovat k sekvencím kyseliny DNA, která rozpozná divoký protein a také možnost vyvolat svou roli transkripčního faktoru. Jinak se zdá, že určité mutace mají zkušenosti nových funkcí takových, jako je aktivace určitých genů na úrovni transkripce.

Soubor těchto modifikací se dělí v současné době do třech kategorií.

- mutace řečené slabé, jejichž produkt je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel, neuděluje funkci divokého proteinu kódovaného druhou alelou. Zástupci uvedené v této kategorii jsou mutanty H273 a W248, tento posledně uvedený mutant je specifický rodinnému syndromu Li-Fraumeni hypersenzibility k rakovinným chorobám

- dominantní negativní mutace, jejichž produktem je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel interakcí s divokým proteinem je schopný blokovat funkci tohoto proteinu tvorbou směsí neaktivních oligomerů, které se již nemohou fixovat k sekvenci specifické DNA divokého proteinu. Zástupce představující tuto kategorii je mutant G281.

- dominantní onkogení mutace, jejichž produktem je protein, který je schopný jednak blokovat funkci divokého proteinu jako je mutace předchozí kategorie, a jednak podporovat špatně známými mechanizmy nádorový vývoj, představující tak zesílení funkce. Zástupce představující tuto kategorii je mutant H175.

Divoký gen p53 byl použit v terapeutických genových a buněčných přístupech vzhledem k jeho antinádorovým a apoptickým vlastnostem a k jeho implikaci do počtu patologií hyperproliferativního typu. Bylo také navrženo léčit určité • · ··

hyperproliferativní patologie, zejména rakoviny, podáváním in vivo divokého genu p53, obnovou funkcí proteinu p53. Podávání může být provedeno především prostřednictvím virových vektorů, zejména adenovirů (WO94/24297) nebo adenovirů (W094/06910).

Bylo také prokázáno, že vložení nukleové kyseliny kódující divoký protein p53 umožňuje opravit částečně normální regulaci buněčného růstu. Jestli tyto výsledky budou povzbudivé, účinnost takovéhoto přístupu bude omezena terapeutickou účinností proteinu p53 po přenosu a expresi in vivo v hyperproliterativních buňkách. Patologické hyperproliferativní stavy takové, jako jsou rakoviny pocházejí z poruch rovnováhy, která se ustaví v negativních nebo pozitivních regulátorech buněčného růstu. Inaktivace negativního regulátoru provedená divokým proteinem p53, objevením dominantního negativního mutantu p53 od jedné ze dvou alel a zvýšená suprese buněčného proteinu inaktivujícího p53 jako například mdm2, viz přítomnost virového inaktivátoru následovaného infekcí, tvoří nepříznivou spojitost pro terapii založenou na reintrodukci divokého proteinu p53, který silně riskuje, že bude také inaktivován.

Je tedy obzvláště důležité upravit proteiny typu p53, které mají rozšířené terapeutické vlastnosti. Zejména bude obzvláště podstatně výhodné upravit aktivní molekuly p53, aby byly necitlivé k vlivu inaktivátoru dominantních negativních mutantů a onkogeních mutantů, jiných buněčných proteinů nebo virových proteinů například E6 HPV18 a HPV16, MDM2, EBNA5 EBV atd. vyskytujících se v nádorových buňkách.

Jisté modifikace proteinu p53 byly popsány ve vedlejších oborech. Také přihláška vynálezu WO95/06661 popisuje modifikace určitých reziduí homologové oblasti proteinu p53, zejména v oblastech 343-351, 372-380 a 381-393. Tyto modifikace jsou druhořadé a nedovolují výsledným produktům, aby unikly mechanizmu inaktivace proteinu p53 in vivo. Tyto proteiny vykazují zvýšenou aktivitu vzhledem k divokému proteinu p53.

Hupp at al. (Cell Vol 71 (1992) 875) popsali derivát proteinu p53 obsahující deleci 30 reziduí C-konce (p53AC-ter30). Tentokrát, jestliže tento protein zachovává schopnost vázat DNA, jeho apoptické vlastnosti nejsou prokázány. Není rezistentní k inaktívaci dominantními negativními mutanty.

Pietenpol et al. (PNAS 91 (1994) 1998) popsali chimérní molekuly odvozené od proteinu p53, zejména proteinu VP16-p53 (80-343)-GCN4. Tato molekula má schopnost vázat DNA a schopnost transfekce jasně sníženou vzhledem k divokému proteinu p53 (40%). Jinak má oligomerizace, riskující interakci sloučeninami, a tak riskuje indukci nespecifické buněčné odpovědi. Vlastnosti rezistence k inaktivačnímu mechanizmu nejsou indikovány.

oblast neselektivní s jinými buněčnými

Podstata vynálezu

Předložený vynález popisuje nové varianty proteinu p53, které mají zlepšené terapeutické vlastnosti. Popisuje zejména varianty přizpůsobené terapeutickému genovému použití, zejména protirakovinovému. Varianty podle vynálezu odvozené od proteinu p53 strukturní modifikací nebo strukturními modifikacemi zachovávají aktivitu typu p53 a exprimované v hyperproliferativních buňkách předkládají alespoň jednu vlastnost zlepšenou vzhledem k proteinu p53. Může se jednat zejména o antiproliferativní aktivitu nebo/a apoptickou aktivitu. Varianty podle vynálezu mají výhodně antiproliferativní vlastnost nebo/a apoptickou vlastnost, buď specifičtější hyperproliferativním buňkám nebo méně citlivé k různým změnám, kterým je podrobený divoký proten p53.

• ·

První předmět vynálezu se týká zejméma varianty proteinu p53, ve které celek nebo část oblasti oligomerizace je deletována a nahrazena umělou oblastí leucinového zipu. Jak je již naznačeno, protein p53 je inaktivován jistými mutanty, zejména dominantními negativními mutanty a onkogeními mutanty, které se vyskytují v nádorové buňce. Tato inaktivace je výsledkem tvorby směsi neaktivních oligomerů interakcí mezi divokým proteinem p53 a mutantem, který se už nemůže fixovat na specifickou sekvenci rozpoznanou divokým proteinem p53. Předložený vynález popisuje nyní varianty proteinu p53 odolné vůči dominantnímu negativnímu vlivu určitých mutací, tudíž popisuje aktivní varianty v buněčné souvislosti představující jednu nebo dvě mutované alely, to je případ více než 90% lidských rakovin p53.

Ve variantách podle vynálezu celek nebo část přírodní domény oligomerizace proteinu, který nedělá rozdílnost mezi divokými formami a mutanty, je nahrazen ekvivalentní doménou mající schopnost specifické oligomerizace. Tato modifikace je provedena za použití umělého leucinového zipu optimalizovaného pro tvorbu dimerů. Molekuly podle vynálezu obsahující takový umělý leucinový zip jsou zejména výhodné, protože tvoří oligomery jedině s dalšími molekulami nesoucími stejný leucinový zip. Netvoří tak oligomery s dominantními negativními mutanty nebo onkogeními mutanty proteinu p53 schopnými je inaktivovat. Netvoří ani oligomery s dalšími buněčnými proteiny nesoucími doménu oligomerizace, schopné je tak inaktivovat nebo indukovat nežádoucí vlivy. Mohou tvořit jen homooligomery, mají tak důležitou selektivitu zajišťující lepší aktivitu v souvislosti s hyperproliferativními patologiemi.

Podle předloženého vynálezu umělá doména leucinového zipu je tak výhodně doménou nepřítomnou v přírodním stavu zajišťující oligomerizační selektivitu. Doména oligomerizace je reprezentovaná sekvencí SEQ ID n°l.

V upřednostněném způsobu provedení vynálezu varianty zahrnují deleci celku nebo části domény oligomerizace a celku nebo části regulační domény. Jak je již dříve naznačeno, doména oligomerizace je umístěna mezi rezidui 325-355 včetně a regulační doména mezi rezidui 365-393 včetně. Tento typ varianty je docela výhodný, protože je úplně nebo částečně bez účinků negativní regulace provedené prostřednictvím části C-konce (aa 365-393) . Tyto varianty tvoří proteiny potencionálně podstatně aktivní, představující aktivitu nemodulovatelnoua případně zvětšenou. Oblast regulace je úplně výhodně zrušena. Upřednostněné varianty podle vynálezu zahrnují deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nebo 337.

Příklady zprostředkovatelů použitých pro konstrukci těchto variant jsou zejména:

-pEC107 (75-325-Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.

-pECHO (75-336-Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.

Podle způsobu provedení je výhodně ve variantách podle vynálezu cystein v pozici 182 proteinu p53 nahrazen histidinem. Tato mutace dovoluje výhodně zvýšit afinitu varianty pro specifické nukleotidové sekvence vázání. Vložení této doplňkové modifikace dovoluje tedy získat molekulu mající větší transaktivační potenciál.

Přesné příklady konstrukcí tvořených pro přípravu variant podle vynálezu kombinující tyto různé modifikace jsou zejména:

- pEC139 (75-325(H182)-Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 336 nahrazenou umělou doménou • · » · » · • · · oligomerizace sekvence SEQ ID n°l a histidinem v poloze 182.

- pEC140 (75-336(H182)-Iz) mající deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l a histidinem v poloze 182.

Výhodně je ve variantách podle vynálezu celek nebo část transaktivační domény deletován a nahrazen heterologní transaktivační doménou. Již dříve bylo naznačeno, že transaktivační funkce proteinu p53 jsou podstatné pro svou supresorovou aktivitu nádoru nebo induktoru apoptozy. Aby se zvýšil terapeutický potenciál variant podle vynálezu je zejména výhodné nahradit přírodní transaktivační doménu heterologní transaktivační doménou. Tyto varianty mají také počet nevýhod. Mají, jak se dalo očekávat, vysokou transaktivační aktivitu. Ale jsou také bez citlivosti k vlivům negativní regulace vykonanou prostředníkem části N-konce (aa 1-73) . Vskutku tato oblast obsahuje sekvenci PĚST odpovědnou za svou proteolytickou degradaci. Substituce této oblasti heterologní transaktivační doménou bez sekvencí PĚST dovoluje snížit tuto negativní regulaci. Tyto varianty jsou také charakterizovány snížením, dokonce i suprese, každé interakce s proteinem E6 viru lidského palindromu (HPV), který je schopný indukovat jejich degradaci. Jsou také méně citlivé k interakcím s dalšími buněčnými proteiny takovými, jako jsou MDM2 a EBNA, které určují aktivitu divokého proteinu p53. Varianty takto získané mají tak zvýšenou stabilitu. Suprese citlivých oblastí k negativní regulaci (regulační a transaktivační doména) zejména způsobuje to, že molekuly, které už nejsou cílem proteinů indukujících jejich proteolýzu nebo jejich inaktivaci.

Výhodně je ve variantách podle vynálezu transaktivační doména odstraněna deleci reziduí 1 až 74. Přechodné konstrukce použité pro realizaci takových molekul jsou zejména pEC107 (75-325-Iz), pECHO (75-336-Iz) , pEC139 • · ·· • fa · • · ··· • fa fa · · • · · • fa ·« (75-325(H182)-Iz) a pEC140 (75-336(H182)-Iz).

Podle prvního způsobu realizace heterologní transaktivační doména je transaktivační doména VP16. Je výhodně složená z reziduí 411 až 490 V916, jejichž sekvence je dána SEQ ID n°2. Přesné příklady variant podle vynálezu kombinující tyto různé modifikace jsou zejména:

- pEC114 (VP16-75-325-Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n’l. Úplná sekvence varianty pEC114 je reprezentována SEQ ID n°25.

- pEC116 (VP16-75-336-Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l. Úplná sekvence varianty pEC114 je reprezentována SEQ ID n°26.

- pEC147 (VP16-75-325(H182)-Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n’l, a histidin v poloze 182.

- pEC149 (VP16-75-336(H182)-Iz) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74, nahrazenou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337 nahrazenou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l, a histidin v poloze 182.

Vzhledem k dříve zmíněným modifikacím varianty podle vynálezu mají také vlastnosti 'vražedné', které vedou k ··

I 4 • · zastavení buněčného cyklu a apoptózy potencionelně zvýšené. Kombinace zmíněných modifikací, zahrnující přítomnost selektivní domény oligomerizace a transaktivační schopnost zvýšenou substitucí původní domény a přítomností histidinu v poloze 182 udělují vskutku variantám podle vynálezu terapeutické potenciály jasně zlepšené. Mimoto varianty podle vynálezu umožňují vyhnout se určitým mutacím (dominantním onkogením). Zesílení funkce určitých mutací proteinu p53 jsou ještě špatně definovány na úrovni jejích mechanizmů, na úrovni domén proteinu p53. Je tedy silně pravděpodobné, že tyto nové funkce budou záviset na kombinování s určitým partnerskými molekulovými efektory. Eliminace implikovaných domén z těchto interakcí, jejichž transformační vlastnosti byly prokázány ve smyslu popsaných molekul v předložené přihlášce vynálezu, jsou takové povahy, že zabraňují zvýšení onkogeních funkcí. Také mutace, které se objevují náhodným způsobem během přípravy klinických částí plazmidů kódujících popsané polypeptidy nebo během produkce klinických částí virových nebo chemických vektorů kódujících tyto stejné polypeptidy nevytvářejí podpopulaci onkogeních molekul.

Vzhledem k supresi určitých domén proteinu p53 nezbytných pro fixaci určitých inhibičních molekul své funkce, varianty podle vynálezu mají také terapeutickou vyšší a stabilnější aktivitu. Existence cizích motivů v různých konstrukcích podle vynálezu (např. myší protein AS, umělá doména oligomerizace atd.) je schopná zahájit imunitní reakci během smrti transfektovaných buněk v extracelulárním prostředí těchto různých fragmentů, zvyšujících tak schopnost imunitního systému k boji proti nádorovým buňkám.

Podle jiného způsobu provedení heterologní transaktivační doména je transaktivační doména aktivní přednostně v transformovaných buňkách a ne ve zdravých příbuzných buňkách. Předložený vynález popisuje vskutku také molekuly jejichž funkce se vyskytuje zejména v • · ·· ·

·· • · · • * · · · • · ·« · transformovaných buňkách a ne ve zdravých příbuzných buňkách. Zdá se, že exprese exogenu divokého proteinu p53 uprostřed buněčného děleni zahrnující endogen divokého proteinu p53 má malý nebo žádný vliv na životaschopnost, je nicméně výhodná možnost upravit protein, který bude nefunkční uprostřed cílové buňky. Tato specifičnost nádorových buněk oproti normálním buňkám je v současné době hodně zpracovaná na úrovni specifičnosti cílového virového vektoru nebo na úrovni koncepce specifického expresního systému. Předložený vynález nyní popisuje deriváty proteinu p53, jehož jedna z funkčních domén je v nepřítomnosti buněčného aktivátoru přítomná, zejména v transformovaných buňkách.

Jiný předmět předloženého vynálezu se týká varianty proteinu p53 aktivní přednostně v transformovaných buněk, ve kterých alespoň jedna z funkčních domén proteinu p53 je deletována celá nebo z části a je nahrazena heterologní doménou aktivní především v transformovaných buňkách. Funkční doména proteinu p53 je doména transaktivační. Předmět zejména upřednostňovaný podle vynálezu se týká varianty proteinu p53 aktivní přednostně v transformovaných buňkách, ve kterých přírodní transaktivační doména je deletována celá nebo z části a je nahrazena transaktivační doménou aktivní především v transformovaných buňkách. Přírodní transaktivační doména je deletována supresí reziduí 1 až 74 včetně proteinu p53.

Předložený vynález se týká zejména variant proteinu p53, které jsou specificky funkční v přítomnosti onkogeního proteinu Ras nebo mutantu proteinu p53. Tyto molekuly jsou získány zejména nahrazením transaktivační domény divokého proteinu p53 proteinovou doménou schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce.

Proteinová doména schopná specificky vázat transkripční transaktivátor nebo transkripční transaktivátorový komplex přítomný v molekulách vynálezu může být různého typu. Může se jednat zejména o doménu oligomarizace v případě, kde transaktivátor nebo transaktivační komplex zahrnuje zejména jednu takovou doménu. Může se také jednat o syntetickou doménu nebo známou přírodní doménu, která by interagovala s výše uvedeným transaktivátorem nebo transaaktivačním komplexem. Může se také jednat o protilátky, buď fragment nebo derivát protilátky řízený proti transaktivátoru nebo transaktivačnímu komplexu.

Heterologní doména je tvořena protilátkou, buď fragmentem nebo derivátem protilátky. Fragmenty nebo deriváty protilátek jsou například fragmenty Fab nebo F(ab)'2, oblasti VH nebo VL protilátky nebo také protilátky jednoduchého řetězce (ScFv) obsahující oblast VH vázanou k oblasti VL ramenem. Konstrukce sekvencí nukleových kyselin kódujících takovéto protilátky modifikované podle vynálezu byly popsány například v US4,946,778 nebo v přihláškách vynálezu W094/02610, WO94/29446.

Upřednostňovaná konstrukce podle vynálezu zahrnuje protilátku ScFv řízenou proti mutantu proteinu p53. Tyto mutanty se objevují v transformovaných buňkách a mají transaktivační doménu. Jejich získávání variantou podle vynálezu tvoří chimérní molekulu aktivní zejména v transformovabých buňkách.

Podle jiného upřednostňovaného způsobu, protilátka ScFV je řízená proti transaktivačnímu komplexu, tudíž komplexu mezi cílovou molekulou přítomnou zvláště v transformovaných buňkách, ale bez transkripční aktivity transaktivátoru (například onkogení ras) a molekulou nesoucí transaktivační doménu. Tato molekula výhodně zahrnuje transaktivační doménu a doménu selektivně vázanou k výše uvedené buněčné molekule (například ScFv anti-ras). Fixace této molekuly dovoluje tvorbu binárního transkripčního komplexu transaktivátoru, který vyvolává komplex, který je tedy získán variantou podle

• · vynálezu.

Všechny další typy modifikací vedoucí k těmto specifickým aktivitám mohou být použity v rámci předloženého vynálezu stejně jako každá transaktivační doména specifická pro určitý typ buňky.

Tyto selektivní varianty obsahují výhodně doplňkové modifikace v části C-konce, jak je již naznačeno, pro zlepšení jejich vlastností. Obsahují také výhodně deleci celku nebo části domény oligomerizace, která může být nahrazena celou heterologní doménou oligomerizace. Jedná se především o umělou doménu oligomerizace takovou, jaká je již definována.

Přesné příklady variant podle vynálezu aktivních především v transformovaných buňkách jsou zejména:

- ScFv.antip53*-75-325-Iz mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 326, substituovanou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.

ScFv.antip53*-75-325(H182)-Iz obsahující zvláště mutaci His 182.

- ScFv.antip53*-75-336-Iz mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 337, substituovanou umělou doménou oligomerizace sekvence SEQ ID n°l.

ScFv.antip53*-75-336(H182)-Iz obsahující zvláště mutaci His 182.

ScFv.antip53*-75-393 mající deleci části N-konce • · • 4 » · · proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce.

ScFv.antip53*-75-393(H182)-Iz obsahující zvláště histidin v poloze 182.

ScFv.antip53*-75-367 mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 368.

ScFv.antip53*-75-367(H182) obsahující zvláště histidin v poloze 182.

ScFv.antip53*-75-AS mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou doménou schopnou specificky vázat mutant proteinu p53 přítomný v transformované buňce a deleci části C-konce proteinu p53 od rezidua 367, přidanou k 19 aminokyselin sekvence SEQ ID n°3.

- ScFv.antip53*-75-AS(H182) obsahující zvláště histidin v poloze 182.

Termín aktivní naznačuje, že tyto varianty zkoušejí svou aktivitu zejména až když jsou exprimovány v transformovaných buňkách. Zbytkové aktivita může přece jen být v buňkách netransformovaných, ale nižší než v buňkách transformovaných.

Jiný předmět předloženého vynálezu se týká varianty proteinu p53 zahrnující deleci na C-konci od rezidua 367, sloučenou se sekvencí SEQ ID n°3 (AS). Tato sekvence odpovídá 19 posledním aminokyselin produktu alternativnímu myšímu proteinu p53. Tato varianta představuje tedy modifikaci domény oligomerizace založenou na proteinu popsaném u krys jako varianta alternativní divokému proteinu, ve kterém 27 • · · · · · · • · · • · 9·

9· ·· aminokyselin C-konce je nahrazeno 19 různými aminokyselinami. Tato varianta má afinitu pro specifické sekvence vazby k DNA potenciálně zvýšenou.

Tato varianta zahrnuje výhodně modifikace v části N-konce, jak je již naznačeno, pro zlepšeni jejích vlastností. Obsahuje výhodně deleci celé nebo části transaktivační domény, která může být nahrazena heterologní transaktivační doménou. Jedná se zejména o transaktivační doménu odvozenou od proteinu VP16 nebo proteinovou doménou schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce. Mimoto reziduum 182 proteinu p53 je výhodně nahrazeno histidinem.

Přesné příklady typu variant podle vynálezu jsou zejména:

- ScPv.antip53*-75-AS již dřivé popsaná, pEC143(VP16-75-AS) mající deleci části N-konce proteinu p53 obsahující rezidua 1 až 74 substituovanou proteinovou transaktivační doménou VP16 sekvence SEQ ID n°2 a deleci části C-konce od rezidua 367 přidanou k 19 aminokyselinám sekvence SEQ ID n°3. Kompletní sekvence varianty pEC143 je představena SEQ ID n°28.

- ScFv.antip53*-75-AS(H182) již dříve popsaná,

- pEC153(VP16-75-AS(H182)) odpovídá pEC143 s histidinem v poloze 182.

Podle všeobecnějšího způsobu se vynález týká všech chimérních proteinů zahrnujících transaktivační doménu, doménu DNA vazebnou, jadernou rozpoznávací doménu a doménu oligomerizace, ve kterých DNA vazebné domény a jaderné rozpoznávací domény jsou tvořeny aminokyselinami 75 až 325 lidského divokého proteinu p53 (SEQ ID n°4). Předkladatel vskutku ukázal, že tato oblast proteinu p53 spojená s transaktivační doménami přizpůsobenými doménám oligomerizace

• · · · 1 • · I « 9 ♦· ·

umožňje tvorbu molekul typu p53 mající vlastnos*ti zejména výhodné v oblasti stability, odolnosti k negativním vlivům mutantů proteinu p53 a citlivosti k inaktivaci různými buněčnými faktory.

Podle varianty DNA vazebná doména a jaderná rozpoznávací doména jsou tvořeny aminokyselinami 75 až 336 divokého lidského proteinu p53 (SEQ ID n°5).

Chimérní proteiny podle předloženého vynálezu mohou zahrnovat různé typy transaktivačních domén. Může se jednat o transaktivační doménu proteinu p53. Může se jednat zejména o heterologní transaktivační doménu vybranou například mezi transaktivační doménou VP16 nebo proteinovou doménou schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce.

Co se týče domény oligomerizace, může se jednat především o umělou doménu, tedy specifickou, například umělý leucinový zip, zejména sekvence SEQ ID n°l.

Chimérní proteiny podle předloženého vynálezu mohou mimoto obsahovat histidin v poloze 182.

Přesné příklady chimérních proteinů takových, jaké jsou popsány v předložené přihlášce vynálezu jsou zejména pECH4, pEC116, pEC147 a pEC149.

Předložený vynález se týká také každé nukleové kyseliny kódující vyriantu nebo chimérní protein takových, jaké jsou již definovány.

Nukleová kyselina podle vynálezu může být kyselina ribonukleová (RNA) nebo deoxyribonukleová (DNA). Mimoto se může jednat o komplementární cDNA případně obsahující jeden nebo více intronů genu p53. Může být lidského původu, zvířecího, virového, syntetického nebo semisyntetického. Může být získána různými způsoby, zejména chemickou syntézou za použití sekvencí uvedených v přihlášce vynálezu a například • 4 4 4 syntetizátorem nukleových kyselin. Může být získána tříděním bank pomocí specifických sond, zejména takových, jaké jsou popsány v přihlášce vynálezu. Může být také získána smíšenými technikami zahrnujícími chemické modifikace (elongace, delece, substituce atd.) tříděných sekvencí z bank. Všeobecným způsobem mohou být nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu připraveny podle všech odborníky známých technik.

Nukleová kyselina podle předloženého vynálezu je cDNA nebo RNA.

Nukleová kyselina podle předloženého vynálezu je výhodně vybrána mezi:

(a) celá nebo část sekvencí SEQ ID n°25, 26, 27, 28,

29, 31, 32, 33 a 34 nebo jejich komplementární vlákno, (b) každá sekvence hybridující se sekvencemi (a) kódující derivát podle vynálezu, (c) varianty (a) a (b) vyplývající z degenerace genetického kódu.

Jak je již naznačeno, předkladatel nyní vytvořil nové sekvence nukleové kyseliny kódující různé polypeptidy proteinu p53 mající antiproliferativní vlastnosti a apoptické docela význačné. Tyto nukleové kyseliny mohou být použity jako terapeutické agens, za účelem vyvolat v derivovaných buňkách podle vynálezu schopnost zničit nebo opravit buněčné disfunkce. V tomto ohledu předložený vynález se týká zejména kazet exprese obsahujících nukleovou kyselinu takovou jaká je již definována, promotor umožňující její expresi a terminační signál transkripce. Promotor je výhodně vybrán mezi funkčními promotory v savčích buňkách především lidských. Jedná se zejména o promotor umožňující expresi nukleové kyseliny v hyperproliferativní buňce (např. karcenogení) V tomto oledu mohou být použity různé promotory. Může se jednat například o • · • · • »

vlastní promotor genu p53. Může se jednat zejména o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů nebo syntetických proteinů). Může se jednat o každý promotor nebo odvozenou sekvenci stimulující nebo potlačující transkripci genu specificky nebo nespecificky, indukovatelně nebo neindukovatelně, silně nebo slabě. Mohou se uvést zejména sekvence promotory eukariontních genů nebo genů virových. Například se může jednat o sekvence promotorů pocházejících z genomu cílové buňky. Mezi eukariontními promotory se mohou použít zejména ubikvitinové promotory (promotor genů HPRT, PGK, a-aktin, tubulin atd.), vláknité promotory (promotor genů GFAP, desmin, vimentin, keratin atd.), promotory terapeutických genů (například promotor genů MDR, CFTR, Taktor VIII, ApoAI atd.), specifické promotory tkání (promotor genu pyruvát-kinasy, vilinu, proteinu střevní vazby mastných kyselin, a-aktin hladkého svalstva atd.) nebo také promotory odpovídající podnětu (receptor seroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Může se jednat o sekvence promotorů genů E1A a MLP adenoviru, ranný promotor CMV nebo také promotor LTR RSV atd. Mimoto tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány přídavkem aktivačních sekvencí, sekvencí regulačních nebo sekvencí umožňující tkáňově specifickou expresi nebo sekvencí majoritní.

Předložený vynález nabízí nyní nové terapeutické agens umožňující svými antiproliferativními vlastnostmi nebo/a apoptickými vlastnostmi interferovat s počtem disfunkčních buněk. Za tímto cílem nukleové kyseliny nebo kazety podle vynálezu mohou být injektovány na úrovni místa ošetření nebo inkubovány přímo s buňkami určenými ke zničení nebo ošetření. Bylo popsáno, že nukleové kyseliny nus mohou penetrovat do buněk bez zvláštního vektoru. Nicméně v rámci předloženého vynálezu se upřednostňuje použití vektoru podávání umožňující zvýšit (i) účinnost buněčné penetrace, (ii) cílení (iii) stabilitu extra a intracelulární.

• · • · • · ·

99 99

9 999

Podle provedení nukleová kyselina nebo kazeta zejména upřednostněná předloženým vynálezem je zahrnuta do vektoru. Použitý vektor může být chemického původu (lipozom, peptidový komplex, lipidy nebo kationické polymery atd.), virového původu (retrovirus, adenovirus, oparový virus, AAV, virus neštovic atd.) nebo plazmatického původu.

Použití virových vektorů spočívá na přirozených vlastnostech transfekce virů. Je možné použít například adenoviry, oparové viry, retroviry a viry AAV. Tyto vektory se jeví zejména výkonné z hlediska transfekce. Po této stránce upřednostněný předmět podle vynálezu spočívá v defektních rekombinantních retrovirech, jejichž genom obsahuje nukleovou kyselinu takovou, jaká je již dříve definovaná. Jiný předmět předloženého vynálezu spočívá zejména v defektních rekombinantních adenovirech, jejichž genom obsahuje nukleovou kyselinu takovou, jaká je již dříve definovaná.

Vektor podle předloženého vynálezu může zejména být nevirový agens schopný podporovat přenos a expresi nukleových kyselin v eukaryontních buňkách. Vektory chemické nebo biochemické, syntetické nebo přírodní, představují zajímavou alternativu přírodním virům, zejména z příjemných důvodů, bezpečnosti a zejména nepřítomnosti teoretické limity, která se týká velikosti DNA použité k transfekci. Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce, zkompaktnit nukleovou kyselinu pro transfekci a podporovat svou buněčnou fixaci, rovněž jako podporovat svůj přechod skrz plazmovou membránu a popřípadě dvě nukleární membrány. Pro potlačení polyanionické povahy nukleových kyselin mají nevirové vektory všechny náboje polykationické.

Nukleová kyselina nebo vektor použitý v předloženém vynálezu mohou být formulovány vzhledem k podávání, a to způsobem topikálním, orálním, parenterálním, intranasálním, nitrožilně, intramuskulárně, podkožně, intraokulárně, • 9 9 9 • 9 · <

transdermatologicky atd. Nukleová kyselina nebo vektor jsou výhodně použity v injektovatelné formě. Mohou to být směsi vehíkula farmaceuticky přijatelného pro injektovatelnou formu, zejména pro přímou injektaci na úrovni místa ošetření. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické nebo suché látky, především lyofilizované, které po přidání sterilní vody nebo fyziologického séra podle okolnosti, umožňují injektovatelnou formu. Přímé injektování nukleové kyseliny do nádoru pacienta je zajímavé, protože to dovoluje soustředit terapeutický vliv na úrovni postižené tkáně. Dávky nukleové kyseliny mohou být uzpůsobeny vzhledem k různým parametrům, zejména vzhledem ke genu, vektoru, způsobu použitého podávání, patologii nebo také vzhledem k délce léčení.

Vynález se týká zejména všech farmaceutických kompozic, které obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu takovou, jaká je již popsána.

Týká se zejména všech farmaceutických kompozic, které obsahují alespoň jeden vektor takový, jaký je již popsán.

Týká se také všech farmaceutických kompozic, které obsahují alespoň jednu variantu proteinu p53 takovou, jaká je již popsána.

Vzhledem k antiproliferativním vlastnostem farmaceutických kompozic podle vynálezu, jsou tyto kompozice přizpůsobeny zejména pro léčení hyperproliferativních chorob především rakovin a restenosy. Předložený vynález předkládá také metodu účinnou především pro destrukci buněk, zejména hyperproliferativních. Tato metoda může být použita in vitro nebo ex vivo. Ex vivo spočívá zejména v inkubaci buněk v přítomnosti jedné nebo více nukleových kyselin (nebo vektoru, kazety nebo přímo derivátu). Metoda použitá in vivo spočívá v podávání organizmu aktivního množství vektoru (nebo kazety) podle vynálezu přímo na úrovni místa ošetření (zejména ··· ·* • ·· ·· ošetření nádoru) . Po této stránce se vynález týká zejména metody destrukce hyperproliferativních buněk zkontaktováním těchto buněk nebo části z nich s nukleovou kyselinou, již dříve definovanou.

Předložený vynález je výhodně destrukci hyperproliferativních buněk použit in vivo pro (tj . v nenormální proliferaci) buněk nebo (resténosa).

Je tak aplikovatelný pro destrukci nádorových svalstva vaskulární stěny zejména léčení rakovin, ve Kupříkladu se mohou citovat buněk hladkého Je přizpůsobený kterých je přítomný mutant p53 adenokarcinomy tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinom plic, leukémie míchy, rakoviny konečníku, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny vaječníků, rakoviny močového měchýře, glioblastomy, hepatokarcinomy, rakoviny kostí, kůže, pankreasu, rakoviny ledvin a prostaty, rakoviny jícnu, rakoviny hrtanu, rakoviny hlavy a krku, rakoviny genitálií HPV pozitivní, rakoviny nosohltanu EBV pozitivní, rakoviny, ve kterých buněčný protein mdm.2 je silně exprimován atd.

Varianty podle vynálezu jsou zejména účinné pro léčení rakovin, ve kterých protein MDM2 je ktomě toho silně exprimován, stejně jako pro léčení rakovin spojených s virem HPV například rakovin genitálií HPV pozitivních.

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

Seznam obrázků

Obrázek 1: Funkční domény divokého proteinu p53. TA: Aktivační doména transkripce, DNB: DNA vazebná doména, NLS: signál nukleární lokalizace, OL: doména oligomerizace, REG: doména regulace.

Obrázek 2: Konstrukce cDNA kódující formu AS proteinu • · p53.

Obrázek 3: Klonování cDNA kódující konstrukce pEC104, pEC106, pEC131, pEC132 a pEC133 a kódující jejich variantu

H182 .

Obrázek 4: Konstrukce variant pEC107, pECHO, pEC139 a pEC140 fúzí s umělou doménou oligomerizace.

Obrázek 5: Konstrukce variant pEC114, pEC116, pEC141, pEC143, pEC145, pEC147, pEC149, pEC151, pEC153 a pEC155.

Obrázek 6: Rozpoznání sekvencí specifické dvouvláknové DNA hybridními molekulami vynálezu.

Pokus zpoždění na gelu: soutěž mezi HisV325 a divokým p53. sloupec 1: inkubace v nepřítomnosti HisV325 a divokého p53, sloupec 2: 30 ng divokého p53, sloupec 3: detto 2 + pAb421, sloupec 4: 30 ng HisV325, sloupec 5: detto 4 + pAb421, sloupec 6: 30 ng HisV325 + 30 ng divokého p53, sloupec 7: detto 6 + pAó421, sloupec 8: 30 ng HisV325 + 15 ng divokého p53, sloupec 9: detto 8 + pAb421, sloupec 10: 30 ng HisV325 + 7,5 ng divokého p53, sloupec 11: detto 10 + pAb421, sloupec 12: 30 ng HisV325 + 4,5 ng divokého p53, sloupec 13: detto 12 + pAb421, sloupec 14: 30 ng HisV325 + 3 ng divokého p53, slopec 15: detto 14 + pAAb421.

Obrázek 7: Transaktivační aktivita divokého proteinu p53 a varianty AS, V-325 a V-336.

Obrázek 8: Transaktivační aktivita divokého proteinu p53 a varianty V-325, V-336 a V-343.

Obrázek 9: Exprese variant vynálezu v buňkách SAOS-2.

Obrázek 10: Indukce genů hdm2 a WAF1 v buňkách EB, EB-1 a EB-V325.

Obrázek 11: Vliv proteinu E6 na transaktivační funkci proteinu p53 a variant vynálezu v buňkách SAOS-2. Množství

vektorů CMV-konstrukce = 100 ng.

Obrázek 12: Vliv proteinu E6 na transaktivační funkci proteinu p53 a variant vynálezu v buňkách HeLa.

Obrázek 13: Citlivost divokého proteinu p53 a variant vynálezu k degradaci indukované proteinem E6.

Obrázek 14: Vliv dominantního negativního mutantu proteinu p53 H175 na transaktivační funkci variant vynálezu. Množství vektorů CMV-konstrukce = 100 ng.

Obrázek 15: Vliv proteinu hdm2 na transaktivační funkci proteinu p53 a variant vynálezu v buňkách SAOS-2. Množství vektorů CMV-konstrukce = 100 ng.

Obrázek 16: Vliv divokých proteinů p53 a V-325 na růst buněk silně exprimující protein hdm2.

Obrázek 17: Indukce apoptózy divokými proteiny p53 a

V-325.

Obrázek 18: Kinetická indukce apoptózy v buňkách EB, EB-1 a EB-V325.

Příklady provedení vynálezu

Příklad A. Konstrukce různých nukleotidových fragmentů nezbytných pro realizaci genů kódujících varianty proteinu p53

Al. Konstrukce cDNA kódující divoký lidský protein p53

Gen lidského proteinu p53 byl klonován řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA banky lidské placenty (Clontech) za použití oligonukleotidů 5'-l a 3'-393.

Oligonukleotid 5'-l (SEQ ID n°6):

ATGGAGGAGCCGCAG

Oligonukleotid 3'-393 (SEQ ID n°7):

GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC

Produkt byl potom klonován přímo po PCR do vektoru pCRII (Invitrogen) .

A2. Konstrukce cDNA kódující formu AS proteinu p53

Forma AS proteinu p53 obsahuje fragment kódující aminokyseliny 1 až 366 lidského proteinu p53 připojený k 19 posledním aminokyselinám produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53.

Forma AS proteinu p53 byla získána ve dvou etapách:

-amplifikace PCR fragmentu kódující aminokyseliny 1 až 367 proteinu p53 za použití oligonukletidů 5'-l (viz příklad

Al) a 3'-367,

Oligonukleotid 3'-367 (SEQ ID n°8):

GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGCTCGAGTGAGC

Fragment PCR takto získaný byl pak klonován do vektoru pCRII (Invitrogen). Takto získaný fragment má rozpoznávací • · místo pro restrikční enzym Xho I (fragment 1-367).

-oligonukleotidy 5'-ASI, 5'-AS2, 3'-ASI a 3^ZAS2 byly fosforylovány potom společně hybridovány za účelem tvorby fragmentu kódujícího posledních 19 aminokyselin produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53.

5'-ASl (SEQ ID n°9):

TCGAGCCTGCAGCCTAGAGCCTTCCAAGCCCTCATGAAGGAGG

5'-AS2 (SEQ ID n°10):

AAAGCCCAAACTGCTGATGAATCGATATCGC

3'-ASl (SEQ ID n°ll):

TGAGGGCTTGGAAGGCTCTAGGCTGCAGGC

3'-AS2 (SEQ ID n°12):

GGCCGCGATATCGATTCATCAGCAGTTTGGGCTTTCCTCCTTCA

Tento fragment byl pak vložen na úrovni místa Xho I fragmentu 1-367 (viz Obrázek 2). Takto vytvořený gen kóduje variantu lidského produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53 (AS).

Takto modifikovaná sekvence je následující:

364 367 386

393

II I

I p53 : -AHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSDZ

AS: -AHSSLQPRAFQALMKEESPNCZZ

367:-AHSSZZ

A3. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty proteinu p53 nesoucí DNA vazebnou doménu.

• · · · • · ·· • · · • ·

Tento příklad popisuje konstrukci různých cDNA kódující různé fragmenty lidského proteinu p53 nesoucí celek nebo část DNA vazebné domény proteinu p53. Tyto fragmenty jsou pak použity v konstrukci variant proteinu p53. Byly získány amplifikační reakcí polymerasou na matricích popsaných v příkladu Al a A2 prostřednictvím různých oligonukleotidů. Amplifikační reakce byly provedeny za podmínek popsaných v příkladu A4.1.

A3.1. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-325 proteinu p53 a jeho derivát H182

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 325 divokého lidského proteinu p53 (75-325).

Tato cDNA byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 a 3'-325:

5'-75 (SEQ ID n°13):

GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCT

3'-325 (SEQ ID n°14):

GGCGGCCGCGGATCCCCATCCAGTGGTTTCTT

Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidu H182:

Oligonukleotid H182 3'(SEQ ID n°15) :

ATCTGAATGGCGCTC

Tento fragment byl označen 75-325(H182).

• ·

A3.2. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-336 proteinu p53 a jeho derivát H182

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 336 divokého lidského proteinu p53 (75-336).

Tato cDNA byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 (SEQ ID n°13) a 3'-336:

3'-336 (SEQ ID n°16) ;

GGCGGCCGCGGATCCTCACGCCCACGGATCTG

Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidu H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-336(H182).

A3.3. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-343 proteinu p53

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 343 divokého lidského proteinu p53 (75-343).

Tato cDNA byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 (SEQ ID n°13) a 3'-343:

3'-343 (SEQ ID n°35):

CGGATCCTCTCGGAACATCTCGAA

A3.4. Konstrukce cDNA kódující oblast 75-367 proteinu p53 a jeho derivát H182 • φ • · · · · · ···· · • · · · · · φ

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 367 divokého lidského proteinu p53 (75-367).

Tento fragment byl získán řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 (SEQ ID n°13) a 3'-367 (SEQ ID n°8).

Takto získaný fragment obsahuje rozpoznávací místo endonukleasou Xho I (75-367).

Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidu H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-367(H182).

A3.5. Konstrukce cDNA kódující fragment 75-AS a jeho derivát H182

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 366 divokého lidského proteinu p53 (75-366) přidané k 19 posledním aminokyselinám produktu alternativního sestřihu myšího proteinu p53.

Tento fragment byl získán řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA fragmentu AS (popsáno v příkladu A2) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 (SEQ ID n°13) a 3'-AS2 (SEQ ID n°12).

Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidu H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-AS(H182).

A3.6. Konstrukce cDNA kódující fragment 75-393 proteinu

p53 a jeho derivát H182

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 75 až 393 lidského proteinu p53 (75-393) . Tento fragment byl získán řetězovou amplifikační reakcí (PCR) na DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu AI) s následujícími oligonukleotidy 5'-75 (SEQ ID n°13) a 3'-393 (SEQ ID n°7).

Derivát tohoto fragmentu nesoucí bodovou mutaci na aminokyselině 182 lidského proteinu p53 (cystein -> histidin) byl získán mutagenezí řízenou prostřednictvím soupravy Amersham za použití oligonukleotidu H182 (SEQ ID n°15). Tento fragment byl označen 75-393(H182).

A4. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty nesoucí aktivační doménu transkripce (transaktivační doména).

Tento příklad popisuje konstrukci různých cDNA kódujících různé fragmenty nesoucí transaktivační doménu. Tyto fragmenty jsou pak použity v konstrukci variant proteinu p53.

A4.1. PCR reakce

Amplifikační reakcí polymerasou byly získány různé fragmenty na různých matricích prostřednictvím různých oligonukleotidu. Tyto amplifikační reakce byly provedeny za následujících podmínek: Enzym Amplitaq-DNA-polymerasa (Perkin-Elmer) v pufru dodaném dodavatelem s koncentrací 0,2 mM dNTP, 100 ng matrice a 500 ng každého ze dvou oligopeptidů.

-cyklus: 2 minuty při 91°C

-cykly: 1 minuta při 91°C minuta při 55°C

minuta při 72°C

-cyklus: 1 minuta při 72°C

A4.2. Konstrukce cDNA kódující oblast 411-490 virálního vektoru VP16 (VP16TA)

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 411-490 virálního proteinu VP16 (VP16 TA). Tato oblast nese transaktivační doménu tohoto proteinu.

Transaktivační fragment transaktivátoru odvozený od virálního proteinu VP16 (411-490) viru oparu byl získán řetězovou amplifikační reakcí (PCR) za použití podmínek již dříve definovaných (viz A4.1) a následujících oligonukleotidů 5'-VPl6 a 3'-VP16:

5'VP16(SEQ ID n°17):

AAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACC

3'-VP16 (SEQ ID n°18):

GGTCGACCACCGTACTCGTCAAT a 100 ng plazmidu pUHD15-l (Gossen a Bujard, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547).

Fragment takto získaný obsahuje 334 párů básí, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°2. Obsahuje ve své části N-konce methionin nesený iniciačním místem transkripce (ATG), přidaný tak do etapy klonování metodou PCR.

A4.2. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty schopné získávat aktivační doménu transkripce (transaktivační doména) proteinu p53 endogenu.

A4.2.1 Konstrukce cDNA kódující protilátku jednoduchého • · • · · · * » · · · • · ·

řetězce schopnou vázat protein p53 (ScFv 42)

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující protilátku jednoduchého řetězce schopnou vázat protein p53 (ScFv 421). Tato konstrukce vyjádřena na intracelulární úrovni musí být schopna fixovat protein p53 divokého endogenu nebo mutant za účelem získání své transaktivační domény.

cDNA kódující ScFv 421 (přihláška vynálezu PCT/FR96/00477) může být extrakt ve formě fragmentu Nco I/Not I, který zahrnuje iniciační místo translace (ATG) a žádnou terminační sekvenci translace.

Takto získaný fragment obsahuje 766 párů básí, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°36.

A4.2.2. Konstrukce cDNA kódující oblast 325-360 divokého proteinu p53 (325-360)

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 325-360 divokého proteinu p53 (325-360). Tato oblast nese doménu oligomerizace tohoto proteinu. Tato konstrukce na intracelulární úrovni, musí být schopna fixovat divoký protein p53 endogení nebo mutant za účelem získání své transaktivační domény.

Odvozená oligomerizační doména divokého lidského proteinu p53 (325-360) byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) za použití podmínek dříve definovaných (viz A4.1) a následujících oligonukleotidú 5'-325 a 3^z-360.

5'-325 (SEQ ID n°37):

AAGCTTGAATTCGTTAACGCCACCATGGGAGAATATTTCACCCTT

3'-360 (SEQ ID n°38):

GGGTCGACCTGGCTCCTTCCCAGC ··· · · · · · ·· • ··· · · · ··· · · ··«·» ··· na 100 ng DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al).

Takto získaný fragment obsahuje 141 párů básí, jejichž sekvence je daná SEQ ID n°39. Obsahuje na N-konci methionin nesený iniciačním místem translace (ATG), přidaný v etapě klonovaní PCR a neobsahuje žádnou sekvenci terminace translace.

A4.2.3. Konstrukce cDNA kódující oblast 325-393 divokého proteinu p53 (325-393)

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA kódující aminokyseliny 325-393 divokého proteinu p53 (325-393). Tato oblast nese doménu oligomerizace tohoto proteinu. Tato konstrukce na intracelulární úrovni musí být schopna fixovat divoký protein p53 endogení nebo mutant za účelem získání své transaktivační domény.

Tato odvozená oligomerizační doména divokého lidského proteinu p53 (325-360) byla získána řetězovou amplifikační reakcí (PCR) za použití podmínek dříve definovaných (viz A4.1) a následujících oligonukleotidů 5'-325 (SEQ ID n°37) a 3'-393.2:

3'-393 (SEQ ID n°40):

GGGTCGACCGTCTGAGTCAGGCCCTTC na 100 ng DNA proteinu p53 (popsáno v příkladu Al)

Takto získaný fragment obsahuje 243 párů básí, jejíchž sekvence je daná SEQ ID n°41. Obsahuje na N-konci methionin nesený iniciačním místem translace (ATG), přidaný tak v etapě klonovaní PCR a neobsahuje žádnou sekvenci terminace translace.

»· ·· • · · >·· · · • · · · · • fa · · ·· ·· • ·· ·· ·· · ·· · • · · ·· • · ···· · • · · · ··· ·· ··

A5. Konstrukce cDNA kódující různé fragmenty nesoucí doménu oligomerizace

Tento příklad popisuje konstrukci různých cDNA kódujících různé fragmenty nesoucí doménu oligomerizace. Tyto fragmenty jsou pak použity v konstrukci variant proteinu p53. Tyto fragmenty byly získány amplifikační reakcí polymerasou na různých matricích (p53 pro homologní oblast a matrice různého původu pro heterologní oblast oligomerizace, zejména umělou) prostřednictvím různých oligonukleotidů. Amplifikační reakce byly provedeny za podmínek popsaných v příkladu A4.1.

A5.1. Konstrukce oligomerizace cDNA obsahující umělou oblast konstrukci cDNA tvořenou umělým obsahuj ící leucinovým

Tento příklad popisuje umělou doménu oligomerizace, zipem. Tato cDNA je pak použita pro konstrukci variant od fragmentů 75-325 (příklad A3.1) a 75-336 (příklad A3.2) lidského proteinu p53 a jejich modifikovaných derivátů na úrovni cysteinu 182.

Tato nukleotidů, cDNA byla konstruována od 6 následujících

Izl-5'(SEQ ID n°19):

GATCTGAAGGCCCTCAAGGAGAAGCTGAAGGCC

Iz2-5'(SEQ ID n°20):

CTGGAGGAGAAGCTGAAGGCCCTGGAGGAGAAGCTG

Iz3-5'(SEQ ID n°21):

AAGGCACTAGTGGGGGAGCGATGATGAATCGATATCGC

Izl-3'(SEQ ID n°22):

CTCCTCCAGGGCCTTCAGCTTCTCCTTGAGGGCCTTCA • · · ·

Iz2-3' (SEQ ID n°23) :

TAGTGCCTTCAGCTTCTCCTCCAGGGCCTTCAGCTT

Iz3-3^Z(SEQ ID n°24) :

GGCCGCGATATCGATTCATCATCGCTCCCCCAC

Tyto oligonukleotidy byly syntetizovány prostřednictvím automatického syntetizátoru DNA za použití chemie fosfoamidů. Těchto šest oligonukleotidů představuje komplementárnost v párech (Izl-5'/Izl-3 ', Iz2-5'/Iz2-3', Iz3-5'/Iz3-3') a komplementárnost řetězcovou (Izl-3'/Iz2-5 ', Iz2-3'/Iz3-5 ') dovolující získat doménu oligomerizace jednoduchou hybridizací a ligaci. Výsledná sekvence LZ je daná SEQ ID n°l.

A5.2. Konstrukce cDNA obsahující přirozenou doménu oligomerizace lidského proteinu p53

Tento příklad popisuje konstrukci cDNA obsahující přirozenou doménu oligomerizace lidského proteinu p53. Tato cDNA je reprezentována fragmentem kódujícím aminokyseliny 325 až 356 proteinu p53 získaného v konstrukci 75-367 (příklad A3.4), 75-AS (příklad A3.5), 75-393 (příklad A3.6) a jejich derivátů na úrovni modifikovanýccysteinu 182.

Příklad B. Konstrukce genů kódujících různé varianty proteinu p53

Bl. Klonování různých fragmentů proteinu p53

Každý z různých fragmentů získaných PCR popsaný v příkladu A byl klonován po PCR do vektoru pBC SK+ (Stratagen) za použití rozpoznávacích míst enzymy restrikce Hind III a Not I (Obrázek 3).

• · φφφφ φ φ φ φ « φφ φφφ

Produkty těchto konstrukcí nesou následující čísla:

75-325 ->pEC 104

75-336 ->pEC 106

75-343 ->pEC 171

75-367 ->pEC 131

75-AS ->pEC 132

75-393 ->pEC 133

Od těchto produktů mutagenezí řízenou za použití mutageneze in vitro řízenou oligonukleotidovým mutagením systémem (Amersham) a oligonukleotidu H182 byly získány odpovídající konstrukce nesoucí histidin v pozici 182. Tyto

konstrukce nesou následující	čísla:
75-325(H182)	->pEC	134
75-336(H182)	->pEC	135
75-367(H182)	->pEC	136
75-AS(H182)	->pEC	137
75-393(H182)	->pEC	138

B2. Fúze leucinového zipu s fragmentem 75-325, 75-336 a 75-343 a s jejich variantou H182

Oiigonukleotidy obsahující leucinový zip (Izl-5', Izl-3', Iz2-5', Iz2-3', Iz3-5'a Iz3-3') byly fosforylovány pomocí T4 kinasy potom hybridovány všechny společně a vloženy do vektorů pEC 104, 106, 134 a 135 a 171, předběžně tráveny restrikčními enzymy BamHI a Notl (Obrázek 4).

Produkty těchto konstrukcí nesou následující čísla:

75-325-Iz

->pEC 107

	37
75-336-Iz	->pEC 110
75-343-Iz	->pEC 174
75-325(H182)-Iz	->pEC 139
75-336(H182)-Iz	->pEC 140

B3. Fúze aktivační domény traskripce se souborem fragmentů p53

Konečné produkty byly získány ligací ke třem společníkům následujícím způsobem (Obrázek 5):

Aktivační doména transkripce odvozená od VP16, popsaná v příkladu A3 byla připravena enzymovou digescí restrikčními enzymy Hind III a Sal I produktů PCR .

Byly izolovány různé fragmenty proteinu p53 (75-325-Iz, 75-336-Iz, 75-343-Iz, 75-AS, 75-367, 75-393 a jejich varianty H182) po enzymové digesci restrikčními enzymy Sall a Notl plazmidů je obsahující.

Možné kombinace (aktivační doména/p53) byly vytvořeny a současně vloženy do vektoru pBC SK+ (Stratagen) a přednostně tráveny restrikčními enzymy Hind II a Not I.

Produkty konstrukce nesou	následuj ící	čísla:
VP16-75-325-1 z	V-325	—>pEC	114	(SEQ	ID	n	°25)
VP16-75-336-IZ	V-336	— >pEC	116	(SEQ	ID	n	°26)
VP16-75-367	V-367	-->pEC	141	(SEQ	ID	n	°27)
VP16-75-AS	V-AS	-->pEC	143	(SEQ	ID	n	°28)
VP16-75-393	V-393	— >pEC	145	(SEQ	ID	n	°29)
VP16-75-343-Iz	V-343	-->pEC	175	(SEQ	ID	n	°30)
VP16-75-325(H182)-Iz	V-325H	-->pEC	147
VP16-75-336(H182)-Iz	V-336H	— >pEC	149

• · • · « • 4 • 4 ·

VP16-75-367(H182)	V-367H	-->pEC	151
VP16-75-AS(H182)	V-ASH	— >pEC	153
VP16-75-393(H182)	V-393H	— >pEC	155
Odpovídaj ící	produkty	nesoucí	oblast

specificky transaktivátor nebo transaktivační komplex k místu domény VP16 jsou konstruovány stejným způsobem. Tyto konstrukce jsou popsány následovně:

ScFv-75-325-Iz

ScFv-75-336-Iz

ScFv-75-367

ScFv-75-AS

ScFv-75-393

ScFv-75-325(H182)-Iz ScFv-75-336(H182)-Iz ScFv-75-367(H182) ScFv-75-AS(H182) ScFv-75-393(H182) (325-393)-75-325-Iz (325-393)-75-336-Iz (325-393)-75-367 (325-393)-75-AS (325-393)-75-393 (325-393)-75-325(H182)-Iz (325-393)-75-336(H182)-Iz (325-393)-75-367(H182) (325-393)-75-AS(H182) (325-393)-75-393(H182) (325-360)-75-325-Iz

S-325 -->pEC 176 (SEQ ID n°31 S-336

S-367

S-AS

S-393

S-325H

S-336H

S-367H

S-ASH

S-393H

393-325 -->pEC 177 (SEQ ID n°32 393-336

393-367

393-AS

393-393

393-325H

393-336H

393-367H

393-ASH

393-393H

360-325 —>pEC 178 (SEQ ID n°33 • ·«

I · · • ·

(325-360)	-75-336-Iz		360-336
(325-360)	-75-367		360-367
(325-360)	-75-AS		360-AS
(325-360)	-75-393		360-393
(325-360)	-75-325(H182)	-Iz	360-325H
(325-360)	-75-336(H182)	-Iz	360-336H
(325-360)	-75-337(H182)		360-367H
(325-360)	-75-AS(H182)		360-ASH
(325-360)	-75-393(H182)		360-393H
Produkty obsahující	doménu

transaktivační doménu (1-74) mohou být posouzeny smícháním syntetického separátoru (Hinge) získaného inzercí v místě Sal I s fragmentem DNA získaným hybridací syntetického oligonukleotidového páru komplementárního k Hinge-up a Hinge-down.

Hinge-up (SEQ ID n°42):

TCGAGGAGGTGGTGGCTCTGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTC

Hinge-down (SEQ ID n°43):

TCGAGAACCCCTACCGCCGGATCCTCCGCCTCCAGAGCCACCACCTCC

Sekvence výsledné dvouvláknové DNA Hinge je následující

TCGAGGAGGTGGTGGCTCGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCCTCCACC

ACCGAGACCTCCGCCTCCTAGGCCGCCATCCCCAAGAGCT a odpovídající proteinová sekvence je (SEQ ID n°44):

Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly

-Gly-Ser

Odpovídající produkty jsou popsány následovně:

• 9 (325-360)-Hinge-75-325-1 z (325-360)-Hinge-75-336-Iz (325-360)-Hinge-75-367 (325-360)-Hinge-75-AS (325-360)-Hinge-75-393 (325-360)-Hinge-75-325(H182)-Iz (325-360)-Hinge-75-336(H182)-I z (325-360)-Hinge-75-367(H182) (325-360)-Hinge-75-AS(H182) (325-360)-Hinge-75-393(H182) • · · · . « · · ··»· · • « · · · · ··· ·«· .· ·· ··· ·· ··

360h-325 -~>pEC 179 (SEQ ID n°34)

360h-336

360h-367

360h-AS

360h-393

360h-325H

360h-336H

360h-367H

360h-ASH

360h-393H

Příklad C. Konstrukce expresních vektorů variant proteinu p53

Tento příklad popisuje konstrukci vektorů použitelných pro přenos nukleových kyselin podle vynálezu in vitro nebo in vivo.

Cl. Konstrukce plazmidových vektorů

Pro konstrukci plazmidových vektorů byly použity dva typy vektorů.

-Vektor pSV2, popsán v DNA Cloning, A practical approarch Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je eukariontní vektor exprese. Nukleové kyseliny kódující varianty byly vloženy do vektoru ve formě fragmentů Hpal-EcoRV. Jsou tak umístěny pod řízením promotoru zesilovače transkripce viru SV40.

-Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Jedná se zejména o eukariontní expresní vektor. Nukleové kyseliny kódující • · ·· · ·· ·· «·· varianty podle vynálezu jsou tak umístěny do vektoru pod řízením ranného promutoru CMV. Všechny konstrukce popsané v příkladu B3 byly vloženy do vektoru ve formě fragmentu Hind III/Not I za účelem testování v různých systémech in vivo.

C2. Konstrukce virových vektorů

Vynález spočívá v konstrukci a použití virových vektorů umožňujících přenos a expresi in vivo nukleových kyselin, které jsou dříve definované.

Pokud se jedná zejména o adenoviry, byly charakterizovány různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se tak trochu mění. Mezi serotypy se s výhodou používají v rámci předloženého vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz přihláška vynálezu WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu používaných v rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry psího, hovězího a myšího původu (na příklad: Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího (na příklad: SAV). Adenoviry zvířecího původu jsou adenoviry psí, zejména adenovirus CAV2 [například souche manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)]. V rámci předloženého vynálezu se s výhodou používají adenoviry původu lidského nebo psího nebo jejich směs.

Defektní adenoviry předloženého vynálezu obsahují ITR, sekvenci umožňující zejména enkapsidaci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. V genomu adenoviru vynálezu alespoň oblast El je nefunkční. Pozorovaný virový gen může být zbaven funkce všemi odborníky známými technikami, zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více básí v požadovaném genu nebo požadovaných genech. Tyto modifikace mohou být provedeny in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, na příklad prostřednictvím technik genového oboru nebo také působením mutageních činidel. Mohou být modifikovány různé • · · oblasti, zejména oblast E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152), WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WÓ95/02697) .

Podle upřednostňovaného způsobu provedení adenoviry podle vynálezu obsahují deleci v oblasti El a E4. Podle jiného upřednostňovaného způsobu realizace zahrnuje deleci v oblasti El, kde je vložena oblast E4 a nukleová kyselina vynálezu (viz FR94 13355) . Ve virech podle vynálezu delece se přednostně rozprostírá v oblasti El nukleotidů 455 až 3329 v sekvenci adenoviru Ad5.

Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny obecnou rekombinací mezi adenovirem a plazmidem nesoucím mezi jiným sekvenci DNA zájmu. Obecná rekombinace nastane po kotransfekci zmíněného adenoviru do linie přizpůsobených buněk. Linie použitých buněk musí zejména (i) být transformovatelná uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenoviru, zejména v integrované formě za účelem vyhnutí se nebezpečí rekombinace. Například se může jednat o linii lidských ledvinových embrionárních buněk 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména, začleněnou ve svém genomu, levou část genomu adenoviru Ad5 (12%) nebo se může jednat o linie schopné doplnit funkce El a E4 tak, jak je popsáno zejména v přihláškách vynálezů n°WO 94/26914 a WO95/02697.

Adenoviry, které jsou rozmnoženy jsou získány a purifikovány podle klasických technik molekulární biologie tak, jak je popsáno v příkladech.

Pokud jde o viry AAV, jedná se o viry DNA relativně malé velikosti, které se začleňují do genomu buněk, které infikují, stabilním způsobem a regiospecificky. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, bez vyvolání vlivu na růst, morfologii nebo dělení buněk. Nezdá se, že by byly zahrnuty • ·

do patologií u lidí. Genom AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 4700 basí a na každém konci obsahuje oblast obrácené repetice (ITR) se 145 básemi, které jsou replikačního původu pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě oblasti nesoucí funkce enkapsidace: levou část genomu, která obsahuje gen rap implikovaný do virální replikace a exprese virových genů a pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4, 797, 368, US5, 139, 941, EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých geny rap nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a popisují jejich použití pro přenos in vitro (na buňky v kultuře) nebo in vivo (přímo do organizmu) výše uvedeného genu zájmu. Rekombinantní defektní AAV podle vynálezu mohou být připraveny kotransfekcí, v linii infikovaných buněk pomocným lidským virem (například adenovirem), plazmidu obsahujícího nukleovou sekvenci vynálezu lemovanou dvěmi oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV a plazmidu nesoucího gen enkapsidace (gen rap a cap) AAV. Použitelná linie buněk je na příklad linie 293. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Pokud jde o viry oparu a retroviry, konstrukce rekombinantních vektorů byly široce popsány v literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP178220? Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Retroviry jsou integrativní viry, selektivně infikující buňky ve fázi dělení. Tvoří tak vektory zájmu pro rakovinové aplikace. Genom retrovirů obsahuje zejména dvě LTR, jednu sekvenci enkapsidace a tři kódovací oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů, geny gag, • · • ·* «·

pol a env jsou všeobecně deletovány zčásti nebo úplně a nahrazeny sekvencí heterologní nukleoné kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být realizovány od různých typů retrovirů, zejména MoMuLV (murine moloney leukemia virus, také označen MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo také od Friendova viru.

Pro konstrukci rekombinantnich retrovirů podle předloženého vynálezu obsahující nukleovou kyselinu podle předloženého vynálezu, plazmid obsahující zejména LTR, sekvenci enkapsidace a výše uvedenou nukleovou kyselinu je konstruován, pak použit pro transfekci linie buněk řečené enkapsidace, schopné přinést ve transretrovirálních funkcích se sníženou schopností do plazmidu. Všeobecně jsou linie enkapsidací tak schopné exprimovat geny gag, pol a env. Tyto linie enkapsidace byly popsány v dřívějších oborech, zejména linie PA317 (US4,861,719), linie PsiCRIP (W090/02806) a linie GP+envAm-12 (W089/07150). Jinak rekombinantní retroviry mohou připustit modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako sekvence enkapsidace, obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantní retrovity jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Pro provedení předloženého vynálezu je především výhodné použití rekombinantního defektního adenoviru nebo retrovirů. Tyto vektory mají vskutku vlastnosti zajímavé zejména pro přenos genů do nádorových buněk.

C3. Chemické vektory

Mezi syntetickými vyvinutými vektory se s výhodou používají v rámci předloženého vynálezu kationické polymery polylyzinového typu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyethylenimin a DEAE dextran nebo také lipidy kationické nebo lipofektanty. Mají • · schopnost kondenzovat DNA a podporovat její spojení s buněčnou membránou. Mezi těmito posledně jmenovanými se mohou uvést lipopolyaminy (lipofektamin, transfektam atd.) různé kationické lipidy nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atd.), tak jako peptidy nukleárního původu. Byl vyvinut koncept cílové transfekce prostřednictvím receptorů, který využívá principu kondenzování DNA díky kationickému polymeru řídícímu fixaci komplexu k membráně díky chemické vazbě mezi kationickým polymerem a ligandem membránového receptorů, který je přítomný na povrchu buněčného typu, který má být roubován. Cílový receptor transferinu, inzulínu nebo receptor asialoglykoproteinů hepatocytů byl také popsán. Příprava kompozice podle vynálezu používající takovýto chemický vektor je realizována podle všech odborníky známých technik, všeobecně jednoduchým uvedením do kontaktu různých sloučenin.

Příklad D. Posouzení funkcí variant proteinu p53

Varianty proteinu p53 podle předloženého vynálezu byly oceněny v buněčném testu pro následující kritéria:

-vazba k sekvenci specifické dvouvláknové DNA

-transaktivační funkce

-antiproliferativní aktivita

-apoptická aktivita

-onkogení potenciální spojení s určitými mutacemi proteinu p53

Pro toto posouzení jsou použité konstrukce V-325, V-336, V-343 a AS, které jsou popsány v příkladu B.

Dl. Rozpoznání sekvence specifické dvouvláknové DNA • · • · · · • · • · « hybridními molekulami podle předloženého vynálezu

Dl.l Tvorba hybridních molekul cDNA divokého proteinu p53 byla klonována do vektoru pBlueBacIII (Invitrogen) v místě BamHI. Inzercí do plazmidu pAcHLT-A (Pharmingen) fragmentu obsahujícího cDNA V325 získaného digescí plazmidu pEC114 enzymy EcoR I a Nit I byl vytvořen vektor umožňující získat rekombinantní bakulovirus mající za cíl expresi proteinu V325 označeného na N-konci peptidovou sekvencí, obsahující mezi jiným spojení šesti zbytků histidinu. Od těchto vektorů rekombinantních byly vytvořeny bakuloviry a purifikovány podle výrobcem uvedených návodů (Invitrogen, Pharmingen). Tyto dva proteiny byly homogeně purifikovány od nukleárních extraktů hmyzích infikovaných buněk SF9 jejich bakuloviry, nukleární extrakty byly získány postupem popsaným Delphinem et al. (C. Delphin, Eur. J. Biochem., 223, 683-692, 1994).

Divoký protein p53 byl purifikován imunoafinitou na monoklonálních protilátkách pAb421 (Oncogene Sciences, Ab-1) podle následujícího protokolu: infikovaný nukleární extrakt buňky se inkubuje po dobu třech hodin při teplotě 4°C s proteinovým gelem A-agarosy, na kterém byla kovalntně vázána protilátka pAb421. Po extenzivním vymytí gelu pufrem 50 mM TrisHCl o pH 7,8 obsahující 1 M KC1 a inhibitory proteas, protein p53 se eluuje peptidem odpovídajícím epitopu, rozpoznaného touto protilátkou na protein p53 (KKGQSTSRHK), tento peptid byl použit v koncentraci 5 mg / ml v roztoku použitém pro vymývání. Po koncentraci na Centrikon-30 (Amicon Grace), eluovaný protein p53 se separuje a purifikuje k homogenitě permeací na gelu na koloně Superosa 6 HR10/30 ekvilibrované 50 mM TrisHCl pH 7,5, 0,2 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM ZnCl,, 10 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,1 % NP-40, 5% glycerolu. Frakce obsahující protein p53 jsou alikvotní a jsou bezprostředné zmrazený na -80°C až do použití.

• ·

Protein V325 označený na N-konci peptidovou sekvencí obsahující mezi jiným spojení šesti zbyktů histidinů nazvaný od nynějška HisV325 byl purifikován postupem, který byl upraven Hochuliem et al. (Bio/Technology Vol 6 (1988) 1321). Dříve než byl aplikován na gel (Niskel-NTA agarosa) nukleární extrakt infikovaných buněk, byl zbaven solí na koloně PD10 (Pharmacia) ekvilibrované 50 mM fosfátovým pufrem pH 8, který obsahoval 5 mM β-merkaptoethanolu, 0,1 % NP-40 a směs inhibitorů proteas. Inkubace nukleárního extraktu s gelem (Nickel-NTA agarosa) byla provedena v tomto pufru po dobu jedné hodiny při teplotě 4°C za současného míchání. Gel byl potom vymyt stejným pufrem o pH 6. Protein HisV325 je eluován 0,3 M imidazolem v posledně jmenovaném pufru po promytí gelu 0,1 M imidazolem. Frakce obsahující HisV325 jsou alikvotní a jsou okamžitě zmrazený na -80°C až do jejich použití.

Dl.2. Konstrukce sekvence specifické dvouvláknové DNA

Sekvence specifické dvouvláknové DNA použité v tomto pokusu je složena ze dvou syntetizovaných oligonukleotidu, jejichž sekvence je následující:

Oligo 5568 (SEQ ID n°45):

GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA

Oligo 5569 (SEQ ID n°46):

AGCTTCAACATGTTGGGACATGGTCG

Tyto dva syntetické oligonukleotidy byly značeny fosforem 33 třicetiminutovou inkubací při teplotě 37 °C 5 pmolů každého oligonukleotidu ve 20 μΐ následujícího reakčního prostředí:

Tris-HCl pH 7,6 mM

MgCl₂	10	mM
dithíotreitol	5	mM
Spermidin	100	μΜ
EDTA	100	μΜ
ΑΤΡ-γ-³³Ρ (Amersham)	50 μ	. Ci

1000-3000 Ci/mmol)

T4 kinasa (Boehringer) 10 U

Tyto dva oligonukleotidy takto značené byly hybridovány v přítomnosti 100 mM NaCl pro obnovení dvouvláknové sekvence WAF-RE obsahující specifiskou sekvenci rozpoznanou proteinem p53 v oblasti promotoru genu WAF-1 (W.S. EI-Deiry, Cell Vol 75 (1993) 817):

GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA

GCT T GTACAGGGT T GTACAACT T CGA

Dl.3 Rozpoznání dvouvláknové sekvence WAF-RE hybridními molekulami podle vynálezu

Pro prokázání specifického rozpoznání dvouvláknové sekvence WAF-RE hybridními molekulami podle vynálezu byly provedeny opožděné pokusy na gelu na základě principu popsaného dále. Reakce vazby DNA je provedena v 25 μΐ reakčním prostředí (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,05 mM ZnCl₂, 5mM dithíotreitol, 0,1 mg/ml BSA, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 0,lM NaCl, 2 gg/ml aprotinin, 2 pg/ml E-64, 2 gg/ml leupeptin, 2 pg/ml pepstatin) přidáním sekvence WAF-RE (2,4 10'⁹M) připravené podle předcházejícího pokusu, 1,2 10⁶M soutěžního chladného oligonukleotidu AP2 (Promega) použitého pro nespecifickou fixaci a 30 ng hybridních molekul pro testování přítomnosti nebo nepřítomnosti divokého proteinu p53 (mezi 3 a 30 ng) , divoký protein p53 může být aktivován pro svou aktivitu specifické fixace k DNA prostřednictvím 300

ng protilátky pAb421 (T.R. Hupp, Cell Vol 71 (1992) 875). Reakční směs se inkubuje po dobu 30 minut na ledu a konečná směs se podrobí nativní elektroforéze na 4% polyakrylamidovém gelu s pohybem při 200V a při teplotě 16’C. Gel se pak suší a autoradiografuje.

pokusu soutěže mezi divokým zpoždění na gelu je ukázán na ukazuje, že His-V325 rozpozná afinitou srovnatelnou s poznamenat, pruh, který ze se

Výsledek ukázkového proteinem p53 a HisV325 ve Obrázku 6. Tento výsledek dvouvláknovou sekvenci WAF-RE afinitou divokého proteinu p53. Může se HisV325 dává na opožděném gelu majoritní pohybuje rychleji než pruh získaný s divokým proteinem p53. Toto by mohlo naznačovat, že HisV325 se fixuje ve formě dimerů. Je tedy možné předpokládat, že tento pruh není ani posunut ani amplifikován přítomností pAb421. V nepřítomnosti pAb421 divoký p53 se fixuje mnohem méně RE-WAf než V325.

D2. Posouzení transaktivační funkce

Transaktivační funkce konstrukcí byla posouzena v systému transaktivace in vivo v buňkách SAOS-2 (lidský osteosarkom), nedostatečně vyvinutých pro dvě alely proteinu p53 (buňky přístupné ATCC pod číslem HTB85) a v nádorové linii H358 (Maxwell a Roth, Oncogene 8 (1993), 3421) a HeLa (ATCC CCL 2). Tento systém spočívá v použití donašečského genu dávkovatelného enzymaticky a umístěného v závislosti na promotoru obsahující nukleotidový motiv specifiského rozpoznání divokou formou proteinu p53 (viz experimentální protokoly).

V těchto testech, nosný gen je gen CAT (chloramfenikolacetyl-transferasa) a sekvence rozpoznání proteinem p53 je shodná sekvence (p53RE) definovaná Funkem a spolupracovníky (Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 2866).

• ·

Posouzení této funkce bylo provedeno ve srovnání s funkcemi divokého proteinu pro tři typy různých kritérií.

D2.1. Transaktivační aktivita v odpovídajících dávkách

Buňky (3,5 10⁵) byly naočkovány na Petriho misku o průměru 6 cm, která obsahovala 3 ml kultivační půdy DMEM (Gibco BRL) s přídavkem 10% telecího plodového séra inaktivovaného teplem a kultivovány přes noc pod 5% CO₂ při teplotě 37°C. Takto byly transfektované různé konstrukce za použití lopofectAMINu (Gibco BRL) jako agentu transfekce následujícím způsobem: 3 μρ plazmidu bylo inkubováno (mezi nimi 0,5 μg plazmidového reportéru) s 10 μΐ lipofectAMINu po dobu 30 minut se 3 ml kultivační půdy Opti-MEM (gibco BRL) bez séra (transfekční směs) . Během tohoto času se buňky dvakrát propláchly PBS a potom byly inkubvány 4 hodiny při teplotě 37°C s transfekční směsí, která byla pak odsáta a nahrazena 3 ml kultivační půdy DMEM (Gibco BRL) s přídavkem 10% telecího plodového séra inaktivovaného teplem a buňky byly ponechány ještě 48 hodin při teplotě 37°C.

Protokol dávkování aktivity CAT hodin po transfekci buňky byly jednou promyty PBS potom seškrábnuty a znovu zařazeny do 100 μΐ 0,25 M pufru Tris pH 8 a lyžovány třemi cykly zmražování - rozmražování probíhá v lázni ethanol / led. Buněčný extrakt takto získaný byl odstředěn při 10000 rpm po dobu 15 minut a získaný supernatant byl použit pro dávkování aktivity. Tato je provedena přídavkem 20 μΐ buněčného extraktu ke 130 μΐ reakční směsi, jejíž konečné složení je následující:

- Acetylkoenzym A 0,4 mM

- Chloramfenikol, D-threo-(dichloracetyl-1,2-¹⁴C 23mM (200nCi)

- Tris 0,18 M pH 8

Po jedné hodině inkubace při teplotě 37°C reakční • ·

produkty byly extrahovány 250 μΐ ethylacetátu, z tohoto extraktu 20 μΐ bylo umístěno na křemenné desce (chromatografie na tenké vrstvě) s eiuční směsí obsahující 95% chloroformu a 5% methanolu. Cromatografická destička takto získaná je nakonec vyvoláná pomocí detekčního přístroje (Pacckard Instruments), který umožňuje vypočítat poměr různých produktů acetylace, poměr ukazuje aktivity enzymu Chloramfenikol-acetyl-transferasa a tedy transaktivační aktivitu různých konstrukcí.

Získané výsledky v linii SAOS-2 s konstrukcemi umístěnými pod řízením promotoru CMV (pCDNA3) jsou uvedeny na Obrázku 7 a 8 a ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:

- protein p53 představuje dávku aktivity závislou, která směřuje k nasycení pro zvýšené dávky (od 100 ng plazmidu). Tato saturace může vyjádřit nezbytnost kofaktorů, které by byly limitující za těchto podmínek.

protein AS zachovává schopnost transaktivační aktivity divokého proteinu

- proteiny V-325, V-336 a V-343 prokazují, stejně jako protein p53, transaktivační aktivitu, nezdají se, že jsou schopné nasycení v silných dávkách. Je tedy možné, že tato zjevná nepřítomnost saturace potom vede k celkovému zvýšení aktivity. Je možné také pozorovat mimo jiné, že konstrukce V-325 je aktivnější než její homology V-336 a V-343, tato konstrukce navrhuje, aby chimérní proteiny obsahovaly oblast 75-325, a byly tak zejména výhodné.

S cílem potvrdit tyto vlastností byly provedeny podobné pokusy v nádorové linii H 358, která je stejně jako linie SAOS-2 vadná na obou alelách genu p53. V těchto pokusech, každá transfekce byla provedena s 50 ng každé konstrukce umístěné v závislosti promotoru CMV. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1, která jasně ukazuje, že dvě varianty V-325 a V-336 prokazují zlepšenou transaktivační aktivitu vzhledem k transaktivační aktivitě divokého proteinu p53 s tím, že opět opět lepší aktivitu vykazuje variant V-325.

Tabulka 1: Transaktivační aktivita v buňkách nádorové linie H358.

	pCDNA 3	divoký p53	V-325	V-336
relativní aktivita CAT	1	6	25	16

Tyto dva pokusy potvrzují, že varianty podle vynálezu mají alespoň jednu vlastnost vylepšeného proteinu p53.

Za účelem ověření, že tento rozdíl aktivit není způsoben rozdílem exprese, ale přírůstkem aktivity variant podle vynálezu, úroveň exprese divokého proteinu p53 a variant V-325, V-336 a V-343 byla analyzována v buňkách SAOS-2. Za tímto účelem buňky byly transfektovány 3 μς každého plazmidu použitého v předchozím pokusu a znovu získány 24 hodin a 48 hodin po transfekci. Po dvou promytí v pufru PBS (Gibco BRL) , buňky byly lyžovány po dobu 15 minut při teplotě 4°C v 50 μΐ pufru RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonídet-P40, 1% deoxycholátu sodného, 0,1% dodekylsulfátu sodného) s přídavkem 2 mM PMSF, 20 gg/ml aprotinu, 2 μg/ml E64, 2 μς/ιηΐ leupeptinu a 2 pg/ml pepstatinu. Po 15 minutách odstřeďování při 15000 rpm, supernatanty byly odebrány, přidány k elučnímu pufru (Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680-685, 1970) a podrobeny elektroforéze na 10% polyakrilovém gelu v denaturuj ícím prostředí 200V podle již popsaného protokolu (Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680-685, 1970). Proteiny byly potom přeneseny na membránu PVDF (NEN Resaerch Products) za použití přenosného systému semi-sec NOVEX za dodržení doporučení výrobce a detekovány pomocí monoklonálních protilátek pAb 240 (Oncogene Sciences, Ab-3) a sekundárních protilátek (králík, anti-myš) spřažených s peroxidasou (Nordic Immunology) za použití soupravy ECL • · · • · (Amersham).

Výsledky tohoto pokusu ukázány na Obrázku 9 dokazují, že varianty V-325 a V-336 jsou exprimovány na srovnatelné úrovni s variantami divokého proteinu p53, a že varianta V-343 se zdá poněkud lépe exprimována než předchozí varianty. Z většího srovnání úrovně exprese ve 24. a 48. hodině lze indikovat, že relativní stabilita každé konstrukce je podobná. Tento výsledek ukazuje, že aktivita variant podle vynálezu V-325 a V-336 není způsobena lepší expresí, ale pravděpodobně potenciálem aktivátoru přírůstku transkripce, což je v rozporu s variantou V-343.

Později s cílem potvrdit schopnost variant podle vynálezu aktivovat umístěný gen v závislosti na elementu rozpoznání divokého proteinu p53 byla provedena studie aktivity endogenních genů s ohledem na expresi genů hdm2 a WAF1 běžně indukovaných proteinem p53.

Tento pokus byl proveden v linii buněk EB (rakovina tračníku) vadných na obou alelách kódujících protein p53 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495). Stabilní klon exprimující protein p53 pod řízením promotoru indukovatelného methationinem z této linie byl konstruován (klon EB-1 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495)). Stejným způsobem byl konstruován další stabilní klon exprimující protein V-325 pod řízením promotoru indukovatelného methallotioneinem za použití plazmidu odvozeného od vektoru pmIMTIi (získaný podle P. Shawa) inzercí cDNA kódující protein V-325 z míst EcoR I Not I (pmIMTli-V325). Za tím účelem byly transfektovány buňky EB (3,5 10⁵ buněk) 1,3 pg plazmidu pmIMTli-V325 a 200 ng plazmidu pcDNA3 podle protokolu již dříve popsaného, stabilní klony byly šlechtěny po transfekci růstem v kultivačním mediu obsahujícím 800 gg/ml geneticinu. Byl vybrán klon exprimující V-325 indukovatelný na srovnatelné úrovni exprese proteinu p53 v klonu EB-1 (klon EB-V325).

·· • 44 44 ·· · · · • 4·· 4 4

4 4 · 4 4 · · · 4

444 ·· 44 • 4 •4 4444

4 4 44

4 444 4 4

4 4 4

444 44 44

Klony EB-1 a EB-V325 stejně jako rodičovské buňky EB (10⁶ buněk) byly podrobeny působení ZnCl₂ (200μΜ) a buněčný extrakt byl podroben v různých časech elektroforéze a přenesen na membránu, jak je dříve popsáno. Přenesené buňky byly detekovány třemi různými protilátkami, monoklonální protilátkou pAb240 řízenou proti proteinu p53 a dvěmi protilátkami polyklonálnímí, jednou řízenou proti proteinu hdm2 a druhou proti proteinu WAF1. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na Obrázku 9, který ukazuje, že: 1) protein p53, chybí v buňkách EB, EB-V325 a EB-1, v nepřítomnosti indukce je exprimován v klonu EB-1 4 hodiny po začátku působení zinku a varianta V-325 je exprimovaná stejným způsobem v klonu EB-V325, 2) protein WAF1, jehož exprese se zdá, že indukuje v buňkách EB působením zinku čtyři hodiny po začátku svou expresi prodlouženou až na 16 hodin v klonech EB-1 a EB-V325 a 3) indukce proteinu hdm.2 nebyla pozorovatelná, než v klonech EB-1 a EB-V325 se zvýšenou expresí v klonu EB-V325.

Tyto výsledky ukazují, že variantou V-325 se vyjadřuje indukcí indukovaných divokým proteinem p53 představuje přírůstek aktivity ve vzhledem k divokému proteinu p53.

aktivita transkripce exprese genů normálně a že tato varianta fyziologickém kontextu

D2.2-Vliv proteinu E6 (HPV18) na transaktivační funkci

Použité protokoly jsou shodné s těmi, které jsou popsané v příkladu Dl.l. V tomto pokusu konstrukce umístěné pod řízením promotoru CMV (pCDNA3) byly kotransfektovány s růstovou koncentrací plazmídu exprímujícího E6 pod řízením promotoru SV40 (pSV2). Získané výsledky v linii SAOS-2 jsou uvedeny na Obrázku 11 a ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:

aktivita proteinu p53 se snižuje se zvyšováním koncentrace E6, tento úbytek aktivity p53 je velmi • ·

pravděpodobně obrazem degradace proteinu p53, který je vyvolán E6.

- protein V-336 ukazuje absenci citlivosti na E6

- protein V-325 se zdá, že může být lehce aktivován E6. Protein V-325 je vždy a za všech situacích více aktivní než protein p53. Za účelem potvrzení rozdílu tohoto chování oproti proteinu E6, byla testována transaktivační aktivita konstrukcí V-325 a V-336 v pozitivních buňkách HPV18 (HeLa) exprimující protein E6 a porovnávána s transaktivační aktivitou divokého proteinu p53.

V tomto příkladu transfekce provedené podle protokolu již dříve popsaného byly umístěny různé konstrukce pod řízením promotoru CMV (pCDNA3).

Výsledky uvedené na Obrázku 12 ukazují velmi čistou transkripční aktivitu dvou konstrukcí V-325 a V-336 a velmi nízkou aktivitu divokého proteinu p53, to vychází z předpokladu, že tyto dvě konstrukce nejsou citlivé na E6 na rozdíl od divokého proteinu.

Pro testování, je-li tato nepřítomnost citlivosti k proteinu E6 odrazem lepší stability k degradaci indukované těmito proteiny, byly provedeny pokusy degradace in vitro.

Byly získány různé molekuly použité v tomto pokusu translací in vitro při lýze retikulocytů, molekul popsaných v příkladu Cl (vektor pcDNA3) za použití soupravy TNT Coupled Reticulocyte lysáte Systems (Promega) podle experimentálního protokolu, který popisuje dodavatel pro reakční objem 50 μΐ.

Pro tento pokus hybridní molekuly podle vynálezu V-325 a V-336 stejně jako divoký protein p53 jsou produkty translace in vitro v přítomnosti 44 gCi ³⁵S-methioninu (Amersham) (1175 Ci/mmol), aby se vytvořily tyto hybridní molekuly radioaktivně značené. Protein E6 (HPV18) je produkt vytvořený za stejných podmínek, ale v nepřítomnosti • · ··· ·· ·· ··· ·· ·· ³⁵S-methioninu.

μΐ každého produktu radioaktivně značeného (p53, V-325 a V-336) byly inkubovány při teplotě 30°C s 2 μΐ proteinu E6 radioaktivně neznačeným a s 10 μΐ lysovaného retikulocytu v konečném objemu 40 μΐ pufru 25 mM Tris-HCl pH

7,5, 100 mM NaCl, 3 mM DTT. Reakce byla zastavena v různých časových úsecích a vždy bylo odebráno z reakční směsi 7,5 μΐ a tento objem byl opět nahrazen přídavkem 7,5 μΐ elučního pufru (Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680-685, 1970), takto připravené vzorky byly podrobeny elektroforéze na 10% polyakrilovém gelu v denaturujícím prostředí při 200V podle předem popsaného protokolu (Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680-685, 1970). Gel byl potom sušen a detekován pomocí zařízení pro detekci (Packard Instruments), které umožňuje určit množství variant podle vynálezu, které nebyly degradovány v průběhu reakce.

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na Obrázku 14, který jasně ukazuje, že varianty V-325 a V-336 jsou rezistentnější než divoký protein p53 k denaturaci indukované E6, varianta V-325 vykazuje opět lepší vlastnosti v termínu rezistence k degradaci. Tyto výsledky odrážejí rozdíly citlivosti divokéko proteinu p53 a variant V-325 a V-336 k proteinu E6 pozorované na úrovni transkripční aktivity v předchozích pokusech (Obrázek 11 a 12).

Toto chování činí tyto dvě konstrukce výhodné zejména při léčení patologií spojených s infekcemi způsobenými HPV16 nebo HPV18.

D2.3. Vliv dominantního negativního mutantu proteinu p53 na transaktivační funkci

V tomto příkladu byl použit mutant H175 popsaný jako dominantní onkogení a dominantní negativní oproti divokému • · • · • · · · • ···· · · · · ··· · · · · ··· • · · · · · · · · · · · ····· · · · • ·· ·· ··· ·· ·» proteinu p53. V tomto příkladu transfekce provedeného podle protokolu již dříve popsaného byly umístěny různé konstrukce stejně jako mutant H175 pod řízením promotoru CMV (pCDNA3). Každá konstrukce byla kotransfektovaná s růstovou koncentrací plazmidu exprimujícího mutant H175.

Výsledky uvedené na Obrázku 14 ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:

- protein p53 snižuje svou transaktivační aktivitu v přítomnosti nadbytku mutované formy H175, to odpovídá fyziologické situaci, je známo, že tento typ v mutované formě je stabilnější než divoký protein p53, a je tedy vždy v nadbytku. Měří se tedy dominantní negativní vliv tohoto mutantu.

protein AS vykazuje přírůstek citlivosti k dominantnímu negativnímu vlivu mutantu H175, protože je citlivý ke slabším koncentracím tohoto mutantu.

- naopak proteiny V-325 a V-336 nejsou jenom citlivější k vlivu dominantnímu negativnímu, ale jejich zvýšená aktivita je závislá na velikosti dávky přítomné mutované formy H175. Opět v tomto pokusu protein V-325 vykazuje zvýšený tento vliv vzhledem k proteinu V-336 potvzující to trochu více ve svém možném statutu superdivokém.

D2.4. Vliv proteinu hdm2 na transaktivační funkci

Použité protokoly jsou identické k již dříve popsaným v příkladu Dl.l. V tomto příkladu transfekce byly konstrukce umístěny pod řízením promotoru CMV (pcDNA3), byly kotransfektovány s růstovou koncentrací plazmidu exprimujícího hdm2 (fragment 1-134) pod řízením promotoru CMV (pcDNA3). Výsledky získané v linii SAOS-2, uvedené na Obrázku 15, ukazují následující vlastnosti pro každou konstrukci:

aktivita proteinu p53 se snižuje se zvyšováním koncentrace hdm2, což odpovídá fyziologické situaci

- protein V-325 se zdá být necitlivý k této inhibici hdm2 .

Toto chování činí protein V-325 superdivokým kandidátem výhodnými zejména pro léčení patologií spojených se superexpresí hdm2 a také při léčení patologií spojených se silnou expresí buněčných proteinů interagujících s N-koncem proteinu p53.

Výsledky těchto čtyř pokusů jasně ukazují, že varianty podle vynálezu, zejména varianty obsahující oblast 75-325-Iz nebo 75-336-Iz, představují 1) zvýšenou transaktivační aktivitu, 2) menší citlivost k vlivu proteinu E6 HPV18, 3) nepřítomnost citlivosti k dominantnímu negativnímu vlivu jistých mutantů proteinu p53 a vzrůst aktivity v takovém kontextu a 4) nepřítomnost citlivosti k proteinu hdm2. Tyto různé vlastnosti jsou docela pozoruhodné a nečekané a udělují variantám podle vynálezu terapeutické význačné přednosti.

D3. Vliv na buněčný růst

Vliv konstrukcí V-325 a V-336 na buněčný růst byl testován současně s proteinem p53 na různých typech buněčných linií v pokusu o tvorbu rezistentních kolonií k neomycinu následující transfekci plazmidu exprimující tyto tři proteiny.

V tomto pokusu transfekce provedené podle protokolu již dříve popsaného byly umístěny různé konstrukce pod řízením promotoru CMV (pCDNA3).

Protokol tvorby kolonií rezistentních k neomycinu hodin po transfekci buňky byly odebrány a umístěny na Petriho miseky o průměru 10 cm a podrobeny růstu s 10 ml

kultivačního média DMEM s přídavkem 10% plodového hovězího séra inaktivovaného teplem, které obsahuje 400 gg/ml geneticinu (G418). Po 15 dnech kultivace v přítomnosti G418 byl počet kolonií Neo^R určen počítáním po barvení fuchsinem.

Tyto pokusy byly provedeny na různých typech buněk, jejichž statut proteinů p53 a Ras je uveden v Tabulce 2.

Tabulka 2: Statut buněčných linií použitých v testu tvorby kolonií Néo^R

linie	p53	Ras	superexpres e hdm2	n°ATCC
SAOS-2	- /-	9	-	HTB 85
HCT116	9	mutovaný Ki-Ras	—	CCL 247
H322	L 248	9	-	(*)
H460	divoký	mutovaný Ki-Ras	—	HTB 177
HeLa	divoký	9	-	CCL 2
OsA-CL	9	9	+	(**)

(*) Putnám et al., Surg. Oncol., 1 (1993), 49 (**) Oliner et al., Nátuře, 358, (1992), 80

Výsledky pokusů jsou uvedeny v Tabulce 3 a na Obrázku

16.

• · · • ' • *

Tabulka 3: Tvorba kolonií Néo^a

linie	vektor	divoký p53	V-325	V-336
SAOS-2	253	17	12	13
HCT116	112	62	58	61
H322	93	5	2	3
H460	153	110	87	92
HeLa	172	151	31	47

Tyto výsledky ukazují, že konstrukce V-325 a V-336 mají schopnost blokovat buněčný růst způsobem alespoň tak účinným jako divoký protein p53 v buněčných kontextech, kde tento protein může normálně fungovat (divoký p53 nebo dvojnásobně deletovaný), ale především, že tyto konstrukce zachovávají tyto aktivity dokonce i v buňkách, kde je divoký protein p53 velmi málo aktivní (buňky HeLa exprimující protein E6 HpV18 a buňky OsA-CL prezentující zvýšenou expresi proteinu hdm2). Tyto vlastnosti udělují variantám podle vynálezu významné terapeutické výhody.

D4. Apoptická aktivita variant podle vynálezu

Apoptická aktivita podle vynálezu byla studována za použití buněk EB, EB-1 a EB-V325 a podmínek indukce již dříve popsaných (příklad Dl).

Buňky takto indukované (10⁶ buněk) byly fixovány a permeabilizovány inkubací po dobu 40 minut v 1 ml Permeafixu (Ortho Diagnostic Systems Inc.), potom dvakrát promyty pufrem A (PBS (Gidco BRL) s přídavkem 0,5% Tweenu 20), pak byly resuspendovány a inkubovány po dobu jedné hodiny a při okolní teplotě ve 100 μΐ pufru A s přídavkem 2% BSA (PBS-BSA) a 1 pg monoklonální protilátky pAb240. Po dvou nových promytí pufrem PBS-BSA, buňky byly inkubovány po dobu jedné hodiny a při okolní teplotě v 100 μΐ stejného pufru s přídavkem 1 pg

polyklonální protilátky sekundárně vázané k fluoresceinu (GAM-FITC (Immunotech)). Potom byly buňky dvakrát promyty pufrem A, resuspendovány v 1 ml stejného pufru obsahujícího, 5 mg propidium jodidu a 1 mg RNasy (DNasa-free) a inkubovány po dobu 30 minut při okolní teplotě, potom byly analyzovány cytomericky.

Výsledky pokusu 24 a 48 hodinové indukce provedené na buňkách EB-1 a EB-V325 jsou uvedeny na Obrázku 17. Za těchto podmínek buňky exprimující divoký protein p53 nebo jeho variantu V-325 (detekovaný protilátkami pAb240) jsou majoritně rozděleny na fázi G1 a sub-Gl (apoptóza) po 24 hodinách indukce a po 48 hodinách hlavně na sub-Gl. Tento výsledek jasně ukazuje, že protein V-325 je schopný, stejně jako divoký protein p53, indukovat apoptózu.

Výsledky kinetického pokusu indukce provedeného na buňkách EB a klonech EB-1 a EB-V325 uvedené na Obrázku 18 ukazují, že varianta V-325 indukuje rychleji a mohutněji apoptózu než divoký protein p53. S ohledem na fakt, že tyto dva proteiny se zdají být exprimovány na srovnatelných úrovních v klonech (viz Dl) výsledek připouští myšlenku zlepšení aktivity varianty V-325 vzhledem k aktivitě divokého proteinu p53.

\> ·

Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace:

(i) podavatel:
(A)	Jméno:	RHONE-POULENC RORER
(B)	Ulice:	20, Raymond ARON
(C)	Město:	ANTONY
(D)	Země:	Francie
(E)	Směrovací číslo: 92165
(G)	Telefon: (1) 40.91.69.22
(H)	Fax: (	1) 40.91.72.91

(ii) název vynálezu: Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické použití (iii) počet sekvencí: 46 (iv) způsob luštění počítačem:

(A) Typ nosiče: Floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 112 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno « · · ·

(D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:

AGATCTGAAG GCCTCAAGG AGAAGCTGAA GGCCCTGGAG GAGAAGCTGA 50

AgGCCCTGGA GGAGaAgCTG AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATgATGAATG 100

GATATCGCGG CC 112 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 266 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:

AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACCG ATGTCAGCCT 50 GGGGGACGAG CTCCACTTAG ACGGCGAGGA CGTGGCGATG GCGCATGCCG 100 ACGCFCTAGA CGATTTCGAT CTGGACATGT TGGGGGACGG GGATTCCCCG 150 GGGCCGGGAT TTACCCCCCA CGACTCCGCC CCCTACGGCG CTCTGGATAT 200 GGCCGACTTC GAGTTTGAGC AGATGTTTAC CGATGCCCTT GGAATTGACG 250 AGTACGGTGG TCGACC 266 • ·

• · ·· · · 4 • · «

9 9 9 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 76 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 3:

TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGGAAAGCCC 50

AAACTGCTAG TGAGGATCCG CGGCCG 76 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 788 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 4:

GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCTA CACCGGCGGC 50

CCCTGCACCA GCCCCCTCCT GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC CCTTCCCAGA 100 ······ ··· <·· *· fc· ··» «· *·

AAACCTACCA	GGGCAGCTAC	GGTTTCCGTC	TGGGCTTCTT	GCATTCTGGG	150
ACAGCCAAGT	CTGTGACTTG	CACGTACTCC	CCTGCCCTCA	ACAAGATGTT	200
TTGCCAACTG	GCCAAGACCT	GCCCTGTGCA	GCTGTGGGTT	GATTCCACAC	250
CCCCGCCCGG	CACCCGCGTC	CGCGCCATGG	CCATCTACAA	GCAGTCACAG	300
CACATGACGG	AGGTTGTGAG	GCGCTGCCCC	CACCATGAGC	GCTGCTCAGA	350
TAGCGATGGT	CTGGCCCCTC	CTCAGCATCT	TATCCGAGTG	GAAGGAAATT	400
TGCGTGTGGA	GTATTTGGAT	GACAGAAACA	CTTTTCGACA	TAGTGTGGTG	450
GTGCCCTATG	AGCCGCCTGA	GGTTGGCTCT	GACTGTACCA	CCATCCACTA	500
CAACTACATG	TGTAACAGTT	CCTGCATGGG	CGGCATGAAC	CGGAGGCCCA	550
TCCTCACCAT	CATCACACTG	GAAGACTCCA	GTGGTAATCT	ACTGGGACGG	600
AACAGCTTTG	AGGTGCGTGT	TTGTGCCTGT	CCTGGGAGAG	ACCGGCGCAC	650
AGAGGAAGAG	AATCTCCGCA	AGAAAGGGGA	GCCTCACCAC	GAGCTGCCCC	700
CAGGGAGCAC	TAAGCGAGCA	CTGCCCAACA	ACACCAGCTC	CTCTCCCCAG	750
CCAAAGAAGA	AACCACTGGA	TGGGGATCCG	CGGCCGCC		788

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

charakteristika sekvence:
(A)	délka: 821 párů básí
(B)	typ: nukleotid
(C)	počet vláken: jedno
<D)	konfigurace: lineární

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE

	(xi) popis	sekvence:	SEQ ID NO 5:
GGGAAGCTTG	GGCCGGGTCG	ACCTGCACCA	GCAGCTCCTA	CACCGGCGGC	50
CCCTGCACCA	GCCCCCTCCT	GGCCCCTGTC	ATCTTCTGTC	CCTTCCCAGA	100
AAACCTACCA	GGGCAGCTAC	GGTTTCCGTC	TGGGCTTCTT	GCATTCTGGG	150
ACAGCCAAGT	CTGTGACTTG	CACGTACTCC	CCTGCCCTCA	ACAAGATGTT	200
TTGCCAACTG	GCCAAGACCT	GCCCTGTGCA	GCTGTGGGTT	GATTCCACAC	250

CCCCGCCCGG	CACCCGCGTC	CGCGCCATGG	CCATCTACAA	GCAGTCACAG	300
CACATGACGG	AGGTTGTGAG	GCGCTGCCCC	CACCATGAGC	GCTGCTCAGA	350
TAGCGATGGT	CTGGCCCCTC	CTCAGCATCT	TATCCGAGTG	GAAGGAAATT	400
TGCGTGTGGA	GTATTTGGAT	GACAGAAACA	CTTTTCGACA	TAGTGTGGTG	450
GTGCCCTATG	AGCCGCCTGA	GGTTGGCTCT	GACTGTACCA	CCATCCACTA	500
CAACTACATG	TGTAACAGTT	CCTGCATGGG	CGGCATGAAC	CGGAGGCCCA	550
TCCTCACCAT	CATCACACTG	GAAGACTCCA	GTGGTAATCT	ACTGGGACGG	600
AACAGCTTTG	AGGTGCGTGT	TTGTGCCTGT	CCTGGGAGAG	ACCGGCGCAC	650
AGAGGAAGAG	AATCTCCGCA	AGAAAGGGGA	GCCTCACCAC	GAGCTGCCCC	700
CAGGGAGCAC	TAAGCGAGCA	CTGCCCAACA	ACACCAGCTC	CTCTCCCCAG	750
CCAAAGAAGA	AACCACTGGA	TGGAGAATAT	TTCACCCTTC	AGATCCGTGG	800
GCGTGAGGAT	CCGCGGCCGC	C			821

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

charakteristika sekvence:
(A)	délka: 15 párů básí
(B)	typ: nukleotid
(C)	počet vláken: jedno
(D)	konfigurace: lineární

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 6:

ATGGAGGAGC CGCAG 15 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 42 párů básí (B) typ: nukleotid

(C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 7:

GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGTCTGA GTCAGGCCCT TC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 8:

GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGCTCGA GTGAGC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 43 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární • · ·

6θ ··· .......

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 9:

TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGG 43 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 10:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 31 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 10:

AAAGCCCAAA CTGCTGATGA ATCGATATCG C 31 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 11:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 30 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE • · · ·· · · ··· (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 11:

TGAGGGCTTG GAAGGCTCTA GGCTGCAGGC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 12:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 44 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 12:

GGCCGCGATA TCGATTCATC AGCAGTTTGG GCTTTCCTCC TTCA (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 13:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 39 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 13:

GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCT (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 14:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 32 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 14:

GGCGGCCGCG GATCCCCATC CAGTGGTTTC TT (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 15:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 32 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 15:

ATCTGAATGG CGCTC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 16:

• ·

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 32 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 16:

GGCGGCCGCG GATCCTCACG CCCACGGATC TG (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 17:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 39 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 17:

AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 18:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 23 párů básí • 9

999 9 9

9 9 9 9

9 9 9

99 (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 18:

GGTCGACCAC CGTACTCGTC AAT (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 19:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 33 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 19:

GATCTGAAGG CCCTCAAGGA GAAGCTGAAG GCC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 20:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno

• ·

I 4 • · (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 20:

CTGGAGGAGA AGCTGAAGGC CCTGGAGGAG AAGCTG (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 21:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 38 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 21:

AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 22:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 42 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA ·· 0· (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 22:

AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 23:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 42 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 23:

TAGTGCCTTC AGCTTCTCCT CCAGGGCCTT CAGCTT (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 24:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 33 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE ·· ·· φ ·· φφ • φφφφ Φ··· ··· φφφ φ φ ·· • · φ φ φ φ · Φ·Φ· · (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 24:

GGCCGCGATA TCGATTCATC ATCGCTCCCC CAG 33 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 25:

(i) charakteristika sekvence:

	(A)	délka: 1095 párů básí
	(B)	typ: nukleotid
	(C)	počet vláken: jedno
	(D)	konfigurace: lineární
(ii)	typ	molekuly: cDNA
(iii)	hypotetický: NE
(ili)	antimediátorová: NE
(ix)	charakteristika:
	(A)	jméno/CLE: CDS
	(B)	umístění: 1...1095

(xi) popis sekvence: SEQ ID NO 25:

ATG

TCC

ACG

GCC

CCC

CCG

ACC

GAT

GAC

AGC

CTG

GGG

GAC

GAG

42

Met

Ser

Thr

Ala

Pro

Thr

Asp

Val

Ser

Leu

Gly

Asp

Glu

1

5

10

CTC

CAC

TTA

GAC

GGC

GAG

GAC

GTG

GCG

ATG

GCG

CAT

GCC

GAC

84

Leu

His

Leu

Asp

Gly

Glu

Asp

Val

Ala

Met

Ala

His

Ala

Asp

15

20

25

GCG

CTA

GAC

GAT

TTC

GAT

CTG

GAC

ATG

TTG

GGG

GAC

GGG

GAT

126

Ala

Leu

Asp

Phe

Asp

Leu

Asp

Met

Leu

Gly

Asp

Gly

Asp

30

35

40

TCC

CCG

GGG

CCG

GGA

TTT

ACC

CCC

CAC

GAC

TCC

GCC

CCC

TAC

168

Ser

Pro

Gly

Pro

Gly

Phe

Thr

Pro

His

Asp

Ser

Ala

Pro

Tyr

45

50

55

GGC

GCT

CTG

GAT

ATG

GCC

GAC

TTC

GAG

TTT

GAG

CAG

ATG

TTT

210

Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gin Met Phe

65 70

ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGT CGA CCT GCA 252

Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Arg Pro Ala

80

CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT ACA CCA GCC CCC TCC 294

Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser

90 95

TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336

Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin

100 105 110

GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA 378

Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr

115 120 125

GCC	AAG	TCT	GTG	ACT	TGC	ACG	TAC
Ala	Lys	Ser	Val 130	Thr	Cys	Thr	Tyr
ATG	TTT	TGC	CAA	CTG	GCC	AAG	ACC
Met	Phe	Cys	Gin	Leu 145	Ala	Lys	Thr
GTT	GAT	TCC	ACA	CCC	TCG	CCC	GGC
Val 155	Asp	Ser	Thr	Pro	Pro 160	Pro	Gly
GCC	ATC	TAC	AAG	CAG	TCA	CAG	CAC
Ala	Ile 170	Tyr	Lys	Gin	Ser	Gin 175	His
CGC	TGC	CCC	CAC	CAT	GAG	CGC	TGC
Arg	Cys	Pro 185	His	His	Glu	Arg	Cys 190
GCC	CCT	CCT	CAG	CAT	CTT	ATC	CGA
Ala	Pro	Pro	Gin 200	His	Leu	Ile	Arg
GTG	GAG	TAT	TTG	GAT	GAC	AGA	AAC
Val	Glu	Tyr	Leu	Asp 215	Asp	Arg	Asn

TCC	CCT	GCC	CTC	AAC	AAG	420
Ser	Pro	Ala	Leu	Asn	Lys
135				140
TGC	CCT	GTG	CAG	CTG	TGG	462
Cys	Pro	Val	Gin	Leu	Trp

150

ACC	CGC	GTC	CGC	GCC	ATG	504
Thr	Arg	Val 165	Arg	Ala	Met
ATG	TCG	GAG	GTT	GTG	AGG	546
Met	Thr	Glu	Val 180	Val	Arg
TCA	GAT	AGC	GAT	GGT	CTG	588
Ser	Asp	Ser	Asp	Gly	Leu

195

GTG	GAA	GGA	AAT	TTG	CGT	630
Val	Glu	Gly	Asn	Leu	Arg
205					210
ACT	TTT	CGA	CAT	AGT	GTG	672
Thr	Phe	Arg	His	Ser	Val
	220

• ·

GTG

CCC

TAT

GAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

TGT

ACC

714

Val

Pro

Tyr

Giu

Pro

Giu

Val

Giy

Ser

Asp

Cys

Thr

225

230

235

ACC

ATC

CAC

TAC

AAC

TAC

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

756

Thr

Ile

His

Tyr

Asn

Tyr

Met

Cys

Asn

Ser

Cys

Met

Gly

240

245

250

GGC

ATG

AAC

CGG

AGG

CCC

ATC

CTC

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

798

Gly

Met

Asn

Arg

Pro

Ile

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

Glu

255

260

265

GAC

TCC

AGT

GGT

AAT

CTA

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

840

Asp

Ser

Gly

Asn

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser

Phe

Glu

Val

270

275

280

CGT

GTT

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG

AGA

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

882

Arg

Val

Cys

Ala

Cys

Pro

Gly

Arg

Asp

Arg

Thr

Glu

285

290

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

GGG

GAG

CCT

CAC

GAG

CTG

CCC

924

Glu

Asn

Leu

Arg

Lys

Gly

Glu

Pro

His

Glu

Leu

Pro

295

300

305

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

CCC

AAC

ACC

AGC

TCC

966

Pro

Gly

Ser

Thr

Lys

Arg

Ala

Leu

Pro

Asn

Thr

Ser

310

315

320

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

GGG

GAT

CTG

AAG

1008

Ser

Pro

Gin

Pro

Lys

Pro

Leu

Asp

Gly

Asp

Leu

Lys

325

330

335

GCC

CTC

AAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

1050

Ala

Leu

Lys

Glu

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Lys

340

345

350

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCA

CTA

GTG

GGG

GAG

CGA

TGA

1092

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Val

Gly

Glu

Arg

355 360

TGA *

365

1095 · ·

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 26:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1128 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1128

ATG Met

(xi) TCC ACG Ser Thr

popis

sekvence:

SEQ GTC Val

ID AGC Ser 375

NO CTG Leu

26:

GAC GAG CTC CAC

GCC Ala

ccc Pro 370

CCG ACC Pro Thr

GAT Asp

GGG Gly

Asp

Glu

Leu 380

His

TTA

GAC

GGC

GAG

GAC

GTG

GCG

ATG

GCG

CAT

GCC

GAC

GCG

CTA

GAC

GAT

Leu

Asp

Gly

Glu

Asp

Val

Ala

Met

Ala

His

Ala

Asp

Ala

Leu

Asp

385

390

395

TTC

GAT

CTG

GAC

ATG

TTG

GGG

GAC

GGG

GAT

TCC

CCG

GGG

CCG

GGA

TTT

Phe

Asp

Leu

Asp

Met

Leu

Gly

Asp

Gly

Asp

Ser

Pro

Gly

Pro

Gly

Phe

400

405

410

ACC

ccc

CAC

GAC

TCC

GCC

CCC

TAC

GGC

GCT

CTG

GAT

ATG

GCC

GAC

TTC

Thr

Pro

His

Asp

Ser

Ala

Pro

Tyr

Gly

Ala

Leu

Asp

Met

Ala

Asp

Phe

41 5

420

425

GAG

TTT

GAG

CAG

ATG

TTT

ACC

GAT

GCC

CTT

GGA

ATT

GAC

GAG

TAC

GGT

Glu

Phe

Glu

Gin

Met

Phe

Thr

Asp

Ala

Leu

Gly

Ile

Asp

Glu

Tyr

Gly

430

435

440

445

192

240

GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC

Gly

Arg

Pro

Ala

Pro 450

Ala

Pro

Thr

Pro 455

Ala

Pro

Ala

Pro 460

Ala

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

Pro

Ser

Trp

Pro 465

Leu

Ser

Val 470

Pro

Ser

Gin

Lys

Thr 475

Tyr

Gin

288

336 • · • · · · ·

GGC AGC Gly Ser

TAC Tyr 480

GGT Gly

TTC Phe

CGT CTG GGC

TTC Phe

TTG CAT Leu His

TCT GGG ACA GCC AAG

384

Arg

Leu

Gly 485

Ser

Gly 490

Thr

Ala

Lys

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

432

*

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Tyr

Ser

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys

Met

Phe

Cys

Gin

495

500

505

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

480

Leu

Ala

Lys

Thr

Cys

Pro

Val

Gin

Leu

Trp

Val

Asp

Ser

Thr

Pro

510

51 5

520

525

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

528

Pro

Gly

Thr

Arg

Val

Arg

Ala

Met

Ala

Ile

Tyr

Lys

Gin

Ser

Gin

His

530

535

540

1

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

CGC

TGC

TCA

GAT

576

Met

Thr

Glu

Val

Arg

Cys

Pro

His

Glu

Arg

Cys

Ser

Asp

545

550

555

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

624

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Gin

His

Leu

Ile

Arg

Val

Glu

Gly

Asn

560

565

570

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

ACT

TTT

CGA

CAT

AGT

GTG

672

Leu

Arg

Val

Glu

Tyr

Leu

Asp

Arg

Asn

Thr

Phe

Arg

His

Ser

Val

575

580

585

GTG

CCC

TAT

GAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

TGT

ACC

ATC

720

Val

Pro

Tyr

Glu

Pro

Glu

Val

Gly

Ser

Asp

Cys

Thr

Ile

590

595

600

605

CAC

TAC

AAC

TAC

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

ATG

AAC

CGG

763

His

Tyr

Asn

Tyr

Met

Cys

Asn

Ser

Cys

Met

Gly

Met

Asn

Arg

610

615

620

AGG

CCC

ATC

CTC

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

GAC

TCC

AGT

GGT

AAT

CTA

316

.

Arg

Pro

Ile

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

Glu

Asp

Ser

Gly

Asn

Leu

625

630

635

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG

AGA

864

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser

Phe

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Ala

Cys

Pro

Gly

Arg

640

645

650

GAC

CGG

ČGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAÁ

GGG

GAG

CCT

CAC

912

Asp

Arg

Thr

Glu

Asn

Leu

Arg

Lys

Gly

Glu

Pro

His

655

660

665

•

CAC

GAG

CTG

CCC

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

CCC

AAC

ACC

960

His

Glu

Leu

Pro

Gly

Ser

Thr

Lys

Arg

Ala

Leu

Pro

Asn

Thr

•

670

675

680

685

AGC

TCC

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

GGA

GAA

TAT

TTC

1008

Ser

Pro

Gin

Pro

Lys

Pro

Leu

Asp

Gly

Glu

Tyr

Phe

690

695

700

ACC

CTT

CAG

ATC

CGT

GGG

CGT

GAG

GAT

CTG

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

AAG

1056

Thr

Leu

Gin

Ile

Arg

Gly

Arg

Glu

Asp

Leu

Lys

Ala

Leu

Lys

Glu

Lys

705

710

715

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

1104

Leu

Lys

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Lys

720

725

730

128

GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA Ala Leu Val Gly Glu Ara * * ⁷35 ₇₄₀ (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 27:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 765 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...765

(

xi)

popis

sekvence:

SEQ

ID

NO

27:

ATG

TCC

ACG

GCC CCC

CCG ACC GAT

GTC

AGC

CTG

GGG

GAC

GAG

CTC

CAC

Met

Ser

Thr

Ala Pro

Pro Thr Asp

Val

Ser

Leu

Gly

Asp

Glu

Leu

His

380

385

390

TTA

GAC

GGC

GAG GAC

GTG GCG ATG

GCG

CAT

GCC

GAC

GCG

CTA

GAC

GAT

Leu

Asp

Gly

Glu Asp

Val Ala Met

Ala

His

Ala

Asp

Ala

Leu

Asp

395

400

405

TTC

GAT

CTG

GAC ATG

TTG GGG GAC

GGG

GAT

TCC

CCG

GGG

CCG

GGA

TTT

Phe

Asp

Leu

Asp Met

Leu Gly Asp

Gly

Asp

Ser

Pro

Gly

Pro

Gly

Phe

410

415

420

44

ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC

Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe

425 430 435 440

GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT

Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly lle Asp Glu Tyr Gly

445 450 455

192

240

81

• · • • • • ·

• • · · • · • · » · ·

• • • · • •

• · • • • • ·

• · · ·

• · • · · · • • · ·

• · • · • · • ·

GGT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCC

288

Gly

Arg

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Thr

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

460

465

470

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

336

Pro

Ser

Trp

Pro

Leu

Ser

Val

Pro

Ser

Gin

Lys

Thr

Tyr

Gin

475

480

485

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

384

Gly

Ser

Tyr

Gly

Phe

Arg

Leu

Gly

Phe

Leu

His

Ser

Gly

Thr

Ala

Lys

490

495

500

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

432

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Tyr

Ser

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys

Met

Phe

Cys

Gin

505

510

51 5

520

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

480

Leu

Ala

Lys

Thr

Cys

Pro

Val

Gin

Leu

Trp

Val

Asp

Ser

Thr

Pro

525

530

535

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

528

Pro

Gly

Thr

Arg

Val

Arg

Ala

Met

Ala

Ile

Tyr

Lys

Gin

Ser

Gin

His

540

545

550

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

CGC

TGC

TCA

GAT

576

Met

Thr

Glu

Val

Arg

Cys

Pro

His

Glu

Arg

Cys

Ser

Asp

555

560

565

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

624

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Gin

His

Leu

Ile

Arg

Val

Glu

Gly

Asn

570

575

580

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTC

ACC

CTT

CAG

ATC

CGT

GGG

CGT

GAG

CGC

TTC

672

Leu

Arg

Val

Glu

Tyr

Phe

Thr

Leu

Gin

Ile

Arg

Gly

Arg

Glu

Arg

Phe

585

590

595

600

GAG

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA

CTC

AAG

GAT

GCC

CAG

720

Glu

Met

Phe

Arg

Glu

Leu

Asn

Glu

Ala

Leu

Glu

Leu

Lys

Asp

Ala

Gin

605

610

615

GCT

GGG

AAG

GAG

CCA

GGG

AGC

AGG

GCT

CAC

TCG

AGC

TGA

765

Ala

Gly

Lys

Glu

Pro

Gly

Ser

Arg

Ala

His

Ser

★

620

625

630

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 28:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 816 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...816

(xi ) ATG TCC ACG

popis GCC CCC

sekvence;...

SEQ. GTC Val

ID AGC Ser 265

NO CTG Leu

28

CCG ACC Pro Thr

GAT Asp

GGG GAC GAG CTC CAC

48

Met

Ser

Thr

Ala

Pro 260

Gly

Asp

Glu

Leu 270

His

TTA

GAC

GGC

GAG

GAC

GTG GCG

ATG

GCG

CAT

GCC

GAC

GCG

CTA

GAC

GAT

96

Leu

Asp

Gly

Glu 275

Asp

Val Ala

Met

Ala 280

His

Ala

Asp

Ala

Leu 285

Asp

TTC

GAT

CTG

GAC

ATG

TTG GGG

GAC

GGG

GAT

TCC

CCG

GGG

CCG

GGA

TTT

1 44

Phe

Asp

Leu 290

Asp

Met

Leu Gly

Asp 295

Gly

Asp

Ser

Pro

Gly 300

Pro

Gly

Phe

ACC

CCC

CAC

GAC

TCC

GCC CCC

TAC

GGC

GCT

CTG

GAT

ATG

GCC

GAC

TTC

192

Thr

Pro 305

His

Asp

Ser

Ala Pro 310

Tyr

Gly

Ala

Leu

Asp 315

Met

Ala

Asp

Phe

GAG

TTT

GAG

CAG

ATG

TTT ACC

GAT

GCC

CTT

GGA

ATT

GAC

GAG

TAC

GGT

240

Glu 320

Phe

Glu

Gin

Met

Phe Thr 325

Asp

Ala

Leu

Gly 330

Ile

Asp

Glu

Tyr

Gly 335

GGT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCC

288

Gly

Arg

Pro

Ala

Pro 340

Ala Ala

Pro

Thr

Pro 345

Ala

Pro

Ala

Pro 350

Ala

ccc

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA TCT

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

336

Pro

Ser

Trp

Pro 355

Leu

Ser Ser

Ser

Val 360

Pro

Ser

Gin

Lys

Thr 365

Tyr

Gin

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

384

Gly

Ser

Tyr 370

Gly

Phe

Arg Leu

Gly 375

Phe

Leu

His

Ser

Gly 380

Thr

Ala

Lys

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

432

Ser

Val 385

Thr

Cys

Thr

Tyr Ser 390

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys 395

Met

Phe

Cys

Gin

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

480

Leu 400

Ala

Lys

Thr

Cys

Pro Val 405

Gin

Leu

Trp

Val 410

Asp

Ser

Thr

Pro

Pro 415

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

528

Pro

Gly

Thr

Arg

Val 420

Arg Ala

Met

Ala

Ile 425

Tyr

Lys

Gin

Ser

Gin 430

His

• ·

ATG ACG

GAG Glu

GTT GTG Val Val 435

AGG CGC Arg Arg

TGC CCC CAC

CAT His

GAG Glu

CGC Arg

TGC TCA GAT

576

Met

Thr

Cys

Pro 440

His

Cys 445

Ser

Asp

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

624

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Gin

His

Leu

lle

Arg

Val

Glu

Gly

Asn

450

455

460

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTC

ACC

CTT

CAG

ATC

CGT

GGG

CGT

GAG

CGC

TTC

672

Leu

Arg

Val

Glu

Tyr

Phe

Thr

Leu

Gin

lle

Arg

Gly

Arg

Glu

Arg

Phe

465

470

475

GAG

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA

CTC

AAG

GAT

GCC

CAG

720

Glu

Met

Phe

Arg

Glu

Leu

Asn

Glu

Ala

Leu

Glu

Leu

Lys

Asp

Ala

Gin

480

485

490

495

GCT

GGG

AAG

GAG

CCA

GGG

AGC

AGG

GCT

CAC

TCG

AGC

CTG

CAG

CCT

768

Ala

Gly

Lys

Glu

Pro

Gly

Ser

Arg

Ala

His

Ser

Leu

Gin

Pro

500

505

510

AGA

GCC

TTC

CAA

GCC

CTC

ATG

AAG

GAG

GAA

AGC

CCA

AAC

TGC

TGA

816

Arg

Ala

Phe

Gin

Ala

Leu

Met

Lys

Glu

Ser

Pro

Asn

Cys

*

★

515

520

525

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 29:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1209 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS

(B)

umístění:

1 . . .

1209

(xi)

popis

sekvence:

SEQ

ID NO

29:

ATG

TCC

ACG

GCC CCC

CCG ACC GAT

GTC

AGC CTG

GGG

GAC

GAG

CTC

CAC

48

Met

Ser

Thr

Ala Pro

Pro Thr Asp

Val

Ser Leu

Gly

Asp

Glu

Leu

His

275

280

285

• · ·

.....

TTA Leu

GAC

GGC

GAG

GAC

GTG

GCG

ATG

GCG

CAT

GCC

GAC

GCG

CTA

GAC

GAT

Asp 290

Gly

Glu

Asp

Val

Ala 295

Met

Ala

His

Ala

Asp 300

Ala

Leu

Asp

TTC Phe

GAT Asp

CTG Leu

GAC Asp

ATG Met

TTG Leu

GGG Gly

GAC Asp

GGG Gly

GAT Asp

TCC Ser

CCG Pro

GGG Gly

CCG Pro

GGA Gly

TTT Phe

305

310

315

320

ACC

CCC

CAC

GAC

TCC

GCC

CCC

TAC

GGC

GCT

CTG

GAT

ATG

GCC

GAC

TTC

Thr

Pro

His

Asp

Ser

Ala

Pro

Tyr

Gly

Ala

Leu

Asp

Met

Ala

Asp

Phe

325

330

335

GAG

TTT

GAG

CAG

ATG

TTT

ACC

GAT

GCC

CTT

GGA

ATT

GAC

GAG

TAC

GGT

Glu

Phe

Glu

Gin

Met

Phe

Thr

Asp

Ala

Leu

Gly

Ile

Asp

Glu

Tyr

Gly

340

345

350

GGT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCC

Gly

Arg

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Thr

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

355

360

365

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

Pro

Ser

Trp

Pro

Leu

Ser

Val

Pro

Ser

Gin

Lys

Thr

Tyr

Gin

370

375

380

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

Gly

Ser

Tyr

Gly

Phe

Arg

Leu

Gly

Phe

Leu

His

Ser

Gly

Thr

Ala

Lys

385

390

395

400

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Tyr

Ser

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys

Met

Phe

Cys

Gin

405

410

415

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

Leu

Ala

Lys

Thr

Cys

Pro

Val

Gin

Leu

Trp

Val

Asp

Ser

Thr

Pro

420

425

430

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

Pro

Gly

Thr

Arg

Val

Arg

Ala

Met

Ala

Ile

Tyr

Lys

Gin

Ser

Gin

His

435

440

445

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

CGC

TGC

TCA

GAT

Met

Thr

Glu

Val

Arg

Cys

Pro

His

Glu

Arg

Cys

Ser

Asp

450

455

460

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Gin

His

Leu

Ile

Arg

Val

Glu

Gly

Asn

465

470

475

480

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

ACT

TTT

CGA

CAT

AGT

GTG

Leu

Arg

Val

Glu

Tyr

Leu

Asp

Arg

Asn

Thr

Phe

Arg

His

Ser

Val

485

490

495

GTG

CCC

TAT

GAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

TGT

ACC

ATC

Val

Pro

Tyr

Glu

Pro

Glu

Val

Gly

Ser

Asp

Cys

Thr

Ile

500

505

510

CAC

TAC

AAC

TAC

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

ATG

AAC

CGG

His

Tyr

Asn

Tyr

Met

Cys

Asn

Ser

Cys

Met

Gly

Met

Asn

Arg

515

520

525

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768 • ·

AGG Arg

ccc Pro 530

ATC Ile

CTC Leu

ACC Thr

ATC ATC ACA CTG

GAA GAC Glu Asp

TCC AGT GGT

AAT CTA

816

Ile

Ile 535

Thr

Leu

Ser 540

Ser

Gly

Asn

Leu

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG

AGA

864

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser

Phe

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Ala

Cys

Pro

Gly

Arg

545

550

555

560

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

GGG

GAG

CCT

CAC

912

4

Asp

Arg

Thr

Glu

Asn

Leu

Arg

Lys

Gly

Glu

Pro

His

565

570

575

CAC

GAG

CTG

ccc

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

CCC

AAC

ACC

960

His

Glu

Leu

Pro

Gly

Ser

Thr

Lys

Arg

Ala

Leu

Pro

Asn

Thr

580

585

590

AGC

TCC

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

GGA

GAA

TAT

TTC

1008

Ser

Pro

Gin

Pro

Lys

Pro

Leu

Asp

Gly

Glu

Tyr

Phe

595

600

605

ACC

CTT

CAG

ATC

CGT

GGG

CGT

GAG

CGC

TTC

GAG

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

1056

Thr

Leu

Gin

Ile

Arg

Gly

Arg

Glu

Arg

Phe

Glu

Met

Phe

Arg

Glu

Leu

610

615

620

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA

CTC

AAG

GAT

GCC

CAG

GCT

GGG

AAG

GAG

CCA

GGG

1 104

Asn

Glu

Ala

Leu

Glu

Leu

Lys

Asp

Ala

Gin

Ala

Gly

Lys

Glu

Pro

Gly

625

630

635

640

GGG

AGC

AGG

GCT

CAC

TCC

AGC

CAC

CTG

AAG

TCC

AAA

AAG

GGT

CAG

TCT

1 1 52

Gly

Ser

Arg

Ala

His

Ser

His

Leu

Lys

Ser

Lys

Gly

Gin

Ser

645

650

655

ACC

TCC

CGC

CAT

AAA

CTC

ATG

TTC

AAG

ACA

GAA

GGG

CCT

GAC

TCA

1200

Thr

Ser

Arg

His

Lys

Leu

Met

Phe

Lys

Thr

Glu

Gly

Pro

Asp

Ser

660

665

670

GAC TGA TGA 1209

Asp * *

675 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 30:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1149 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE • · • · • · · (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1149

(

Xi)

popis

sekvence:

SEQ

ID

NO

30:

ATG

GCC

ACG

GCC

CCC

CCG

ACC

GAT

GTC

AGC

CTG

GGG

GAC

GAG

CTC

CAC

48

Met 1

Ala

Thr

Ala

Pro 5

Pro

Thr

Asp

Val

Ser 10

Leu

Gly

Asp

Glu

Leu 15

His

TTA

GAC

GGC

GAG

GAC

GTG

GCG

ATG

GCG

CAT

GCC

GAC

GCG

CTA

GAC

GAT

96

Leu

Asp

Gly

Glu 20

Asp

Val

Ala

Met

Ala 25

His

Ala

Asp

Ala

Leu 30

Asp

TTC

GAT

CTG

GAC

ATG

TTG

GGG

GAC

GGG

GAT

TCC

CCG

GGG

CCG

GGA

TTT

144

Phe

Asp

Leu 35

Asp

Met

Leu

Gly

Asp 40

Gly

Asp

Ser

Pro

Gly 45

Pro

Gly

Phe

ACC

CCC

CAC

GAC

TCC

GCC

CCC

TAC

GGC

GCT

CTG

GAT

ATG

GCC

GAC

TTC

192

Thr

Pro 50

His

Asp

Ser

Ala

Pro 55

Tyr

Gly

Ala

Leu

Asp 60

Met

Ala

Asp

Phe

GAG

TTT

GAG

CAG

ATG

TTT

ACC

GAT

GCC

CTT

GGA

ATT

GAC

GAG

TAC

GGT

240

Glu 65

Phe

Glu

Gin

Met

Phe 70

Thr

Asp

Ala

Leu

Gly 75

Ile

Asp

Glu

Tyr

Gly 80

GGT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCC

288

Gly

Arg

Pro

Ala

Pro 85

Ala

Pro

Thr

Pro 90

Ala

Pro

Ala

Pro 95

Ala

ccc

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

336

Pro

Ser

Trp

Pro 100

Leu

Ser

Val 105

Pro

Ser

Gin

Lys

Thr 110

Tyr

Gin

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

384

Gly

Ser

Tyr 115

Gly

Phe

Arg

Leu

Gly 1 20

Phe

Leu

His

Ser

Gly 125

Thr

Ala

Lys

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

432

Ser

Val 130

Thr

Cys

Thr

Tyr

Ser 135

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys 1 40

Met

Phe

Cys

Gin

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

480

Leu 145

Ala

Lys

Thr

Cys

Pro 150

Val

Gin

Leu

Trp

Val 1 55

Asp

Ser

Thr

Pro

Pro 1 60

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

528

Pro

Gly

Thr

Arg

Val 1 65

Arg

Ala

Met

Ala

Ile 1 70

Tyr

Lys

Gin

Ser

Gin 1 75

His

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

CGC

TGC

TCA

GAT

576

Met

Thr

Glu

Val 180

Val

Arg

Cys

Pro 185

His

Glu

Arg

Cys 190

Ser

Asp

• 9

9 • 9 9 ·

87

• • · ·

» * • ·

• • ·

• · • · · · ·

• 9

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

624

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Gin

His

Leu

Ile

Arg

Val

Glu

Gly

Asn

195

200

205

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

ACT

TTT

CGA

CAT

AGT

GTG

672

Leu

Arg

Val

Glu

Tyr

Leu

Asp

Arg

Asn

Thr

Phe

Arg

His

Ser

Val

210

215

220

GTG

CCC

TAT

GAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

TGT

ACC

ATC

720

Val

Pro

Tyr

Glu

Pro

Glu

Val

Gly

Ser

Asp

Cys

Thr

Ile

225

230

235

240

CAC

TAC

AAC

TAC

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

ATG

AAC

CGG

768

His

Tyr

Asn

Tyr

Met

Cys

Asn

Ser

Cys

Met

Gly

Met

Asn

Arg

245

250

255

AGG

CCC

ATC

CTC

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

GAC

TCC

AGT

GGT

AAT

CTA

816

Arg

Pro

Ile

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

Glu

Asp

Ser

Gly

Asn

Leu

260

265

270

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG

AGA

864

Leu

Gly

Arg

Asn.

Ser

Phe

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Ala

Cys

Pro

Gly

Arg

275

280

285

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

GGG

GAG

CCT

CAC

912

Asp

Arg

Thr

Glu

Asn

Leu

Arg

Lys

Gly

Glu

Pro

His

290

295

300

CAC

GAG

CTG

CCC

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

CCC

AAC

ACC

960

His

Glu

Leu

Pro

Gly

Ser

Thr

Lys

Arg

Ala

Leu

Pro

Asn

Thr

305

310

315

320

AGC

TCC

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

GGA

GAA

TAT

TTC

1008

Ser

Pro

Gin

Pro

Lys

Pro

Leu

Asp

Gly

Glu

Tyr

Phe

325

330

335

ACC

CTT

CAG

ATC

CGT

GGG

CGT

GAG

CGC

TTC

GAG

ATG

TTC

CGA

GAG

GAT

1056

Thr

Leu

Gin

Ile

Arg

Gly

Arg

Glu

Arg

Phe

Glu

Met

Phe

Arg

Glu

Asp

340

345

350

CTG

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

1104

Leu

Lys

Ala

Leu

Lys

Glu

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Lys

355

360

365

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCA

CTA

GTG

GGG

GAG

CGA

TGA

1 1 49

Ala

Leu

Glu

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Val

Gly

Glu

Arg

*

*·

370 375 380 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 31:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1611 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1611

ATG MET 1

( GCC ALA

xi) CAG GLN

popis

sekvence:

SEQ TCA SER

ID GGG GLY 10

NO GCA ALA

31:

GGG GLY 15

TCA SER

48

GTG VAL

CAG GLN 5

CTG LEU

CAG GLN

GAG GLU

CTT LEU

GTG VAL

GGG

GCC

TCA

GTC

AAG

TTG

TCC

TGC

ACA

GCT

TCT

GGC

TTC

AAC

ATT

AAA

96

GLY

ALA

SER

VAL

LYS

LEU

SER

CYS

THR

ALA

SER

GLY

PHE

ASN

ILE

LYS

20

25

30

GAC

TAC

TAT

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GAA

CAG

GGC

CTG

GAG

144

ASP

TYR

MET

HIS

TRP

VAL

LYS

GLN

ARG

PRO

GLU

GLN

GLY

LEU

GLU

35

40

45

TGG

ATT

GGA

TGG

ATT

GAT

CCT

GAG

AAT

GGT

GAT

ACT

GAA

TAT

GCC

CCG

192

TRP

ILE

GLY

TRP

ILE

ASP

PRO

GLU

ASN

GLY

ASP

THR

GLU

TYR

ALA

PRO

50

55

60

AAG

TTC

CAG

GGC

AAG

GCC

ACT

ATG

ACT

GCA

GAC

ACA

TCC

AAT

ACA

240

LYS

PHE

GLN

GLY

LYS

ALA

THR

MET

THR

ALA

ASP

THR

SER

ASN

THR

65

70

75

80

GCC

TAC

CTG

CAG

CTC

AGC

CTG

GCA

TCT

GAG

GAC

ACT

GCC

GTC

TAT

288

ALA

TYR

LEU

GLN

LEU

SER

LEU

ALA

SER

GLU

ASP

THR

ALA

VAL

TYR

85

90

95

TAT

TGT

AAT

TTT

TAC

GGG

GAT

GCT

TTG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

336

TYR

CYS

ASN

PHE

TYR

GLY

ASP

ALA

LEU

ASP

TYR

TRP

GLY

GLN

GLY

THR

100

105

110

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGA

GGC

GGT

TCA

GGC

GGA

GGT

GGC

TCT

384

THR

VAL

THR

VAL

SER

GLY

SER

GLY

SER

115

1 20

125

GGC

GGT

GGC

GGA

TCG

GAT

GTT

TTG

ATG

ACC

CAA

ACT

CCA

CTC

ACT

TTG

432

GLY

SER

ASP

VAL

LEU

MET

THR

GLN

THR

PRO

LEU

THR

LEU

1 30

135

1 40

TCG

GTT

ACC

ATT

GGA

CAA

CCA

GCC

TCC

ATC

TCT

TGC

AAG

TCA

AGT

CAG

480

SER

VAL

THR

ILE

GLY

GLN

PRO

ALA

SER

ILE

SER

CYS

LYS

SER

GLN

145

150

1 55

160

··

528

89

•

• • · ·

* ·

• • ·

• • · ·

AGC

CTC

TTG

GAT

AGT

GAT

GGa

AAG

ACA

TAT

TTG

AAT

TGG

TTG

TTA

CAG

SER

LEU

ASP

SER

ASP

GLY

LYS

THR

TYR

LEU

ASN

TRP

LEU

GLN

1 65

170

175

AGG

CCA

GGC

CAG

TCT

CCA

AAG

CGC

CTA

ATC

TAT

CTG

GTG

TCT

AAA

CTG

ARG

PRO

GLY

GLN

SER

PRO

LYS

ARG

LEU

ILE

TYR

LEU

VAL

SER

LYS

LEU

180

1 85

190

GAC

TCT

GGA

GTC

CCT

GAC

AGG

TTC

ACT

GGC

AGT

GGA

TCA

GGG

ACA

GAT

ASP

SER

GLY

VAL

PRO

ASP

ARG

PHE

THR

GLY

SER

GLY

SER

GLY

THR

ASP

195

200

205

TTC

ACA

CTG

AAA

ATC

AAC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

TTG

GGA

GTT

TAT

PHE

THR

LEU

LYS

ILE

ASN

ARG

VAL

GLU

ALA

GLU

ASP

LEU

GLY

VAL

TYR

210

215

220

TAT

TGC

TGG

CAA

GGT

ACA

CAT

TCT

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

TYR

CYS

TRP

GLN

GLY

THR

HIS

SER

PRO

LEU

THR

PHE

GLY

ALA

GLY

THR

51S______

230

235

240

AAG CTG GAG CTG AAA CGG GCG GCC GCA TTG CAG ACG CGT CGA CCT GCA LYS LEU GLU LEU LYS ARG ALA ALA ALA LEU GLN THR ARG ARG PRO ALA

245 250 255

576

624

672

720

768

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCC

CCC

TCC

TGG

CCC

PRO

ALA

PRO 260

THR

PRO

ALA

PRO 265

ALA

PRO

ALA

PRO

SER 270

TRP

PRO

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

GGC

AGC

TAC

GGT

LEU

SER

SER 275

SER

VAL

PRO

SER

GLN 280

LYS

THR

TYR

GLN

GLY 285

SER

TYR

GLY

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

TCT

GTG

ACT

TGC

PHE

ARG 290

LEU

GLY

PHE

LEU

HIS 295

SER

GLY

THR

ALA

LYS 300

SER

VAL

THR

CYS

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

CTG

GCC

AAG

ACC

THR 305

TYR

SER

PRO

ALA

LEU 310

ASN

LYS

MET

PHE

CYS 315

GLN

LEU

ALA

LYS

THR 320

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

CCC

GGC

ACC

CGC

CYS

PRO

VAL

GLN

LEU 325

TRP

VAL

ASP

SER

THR 330

PRO

GLY

THR 335

ARG

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

ATG

ACG

GAG

GTT

VAL

ARG

ALA

MET 340

ALA

ILE

TYR

LYS

GLN 345

SER

GLN

HIS

MET

THR 350

GLU

VAL

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

CGC

TGC

TCA

GAT

AGC

GAT

GGT

CTG

VAL

ARG

ARG 355

CYS

PRO

HIS

GLU 360

ARG

CYS

SER

ASP

SER 365

ASP

GLY

LEU

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

TTG

CGT

GTG

GAG

ALA

PRO 370

PRO

GLN

HIS

LEU

ILE 375

ARG

VAL

GLU

GLY

ASN 380

LEU

ARG

VAL

GLU

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

ACT

TTT

CGA

CAT

AGT

GTG

CCC

TAT

TYR 385

LEU

ASP

ARG

ASN 390

THR

PHE

ARG

HIS

SER 395

VAL

PRO

TYR 400

816

864

912

960

1008

056

1104

1152

1200

90

• · ·

• ·

·· ·

• · ·

• ·

GAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

TGT

ACC

ATC

CAC

TAC

AAC

TAC

1248

GLU

PRO

GLU

VAL

GLY

SER

ASP

CYS

THR

ILE

HIS

TYR

ASN

TYR

405

410

415

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

ATG

AAC

CGG

AGG

CCC

ATC

CTC

1296

MET

CYS

ASN

SER

CYS

MET

GLY

MET

ASN

ARG

PRO

ILE

LEU

420

425

430

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

GAC

TCC

AGT

GGT

AAT

CTA

CTG

GGA

CGG

AAC

1 344

THR

ILE

THR

LEU

GLU

ASP

SER

GLY

ASN

LEU

GLY

ARG

ASN

435

440

445

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG

AGA

GAC

CGG

CGC

ACA

1 392

SER

PHE

GLU

VAL

ARG

VAL

CYS

ALA

CYS

PRO

GLY

ARG

ASP

ARG

THR

450

455

460

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

GGG

GAG

CCT

CAC

GAG

CTG

CCC

1 440

GLU

ASN

LEU

ARG

LYS

GLY

GLU

PRO

HIS

GLU

LEU

PRO

____________

465

470

475

480

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

ccc

AAC

ACC

AGC

TCC

TCT

CCC

1488

PRO

GLY

SER

THR

LYS

ARG

ALA

LEU

PRO

ASN

THR

SER

PRO

485

490

495

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

GGG

GAT

CTG

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

1536

GLN

PRO

LYS

PRO

LEU

ASP

GLY

ASP

LEU

LYS

ALA

LEU

LYS

GLU

500

505

510

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

1584

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

LEU

515

520

525

AAG

GCA

CTA

GTG

GGG

GAG

CGA

TGA

1611

LYS

ALA

LEU

VAL

GLY

GLU

ARG

*

★

530

535

(2)Informace pro sekvenci SEQ iu NO: 32:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1065 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1065

(xi)

popis

sekvence:

SEQ ID

NO

32:

ATG

GGA

GAA

TAT

TTC

ACC

CTT

CAG

ATC

CGT

GGG

CGT

GAG

CGC

TTC

GAG

48

MET 1

GLY

GLU

TYR

PHE 5

THR

LEU

GLN

ILE

ARG 10

GLY

ARG

GLU

ARG

PHE 1 5

GLU

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA

CTC

AAG

GAT

GCC

CAG

GCT

96

MET

PHE

ARG

GLU 20

LEU

ASN

GLU

ALA

LEU 25

GLU

LEU

LYS

ASP

ALA 30

GLN

ALA

GGG

AAG

GAG

CCA

GGG

AGC

AGG

GCT

CAC

TCC

AGC

CAC

CTG

AAG

TCC

1 44

GLY

LYS

GLU 35

PRO

GLY

SER

ARG 40

ALA

HIS

SER

HIS 45

LEU

LYS

SER

AAA

AAG

GGT

CAG

TCT

ACC

TCC

CGC

CAT

AAA

CTC

ATG

TTC

AAG

ACA

192

LYS

LYS 50

GLY

GLN

SER

THR

SER 55

ARG

HIS

LYS

LEU 60

MET

PHE

LYS

THR

GAA

GGG

CCT

GAC

TCA

GAC

GGT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

240

GLU 65

GLY

PRO

ASP

SER

AS? 70

GLY

ARG

PRO

ala

PRO 75

THR

PRO._ 80

GCG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCC

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

288

ALA

PRO

ALA

PRO 85

ALA

PRO

SER

TRP

PRO 90

LEU

SER

VAL 95

PRO

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

336

SER

GLN

LYS

THR 100

TYR

GLN

GLY

SER

TYR 105

GLY

PHE

ARG

LEU

GLY 110

PHE

LEU

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

384

HIS

SER

GLY 115

THR

ALA

LYS

SER

VAL 120

THR

CYS

THR

TYR

SER 125

PRO

ALA

LEU

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

432

ASN

LYS 130

MET

PHE

CYS

GLN

LEU 135

ALA

LYS

THR

CYS

PRO 1 40

VAL

GLN

LEU

TRP

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

480

VAL 145

ASP

SER

THR

PRO

PRO 1 50

PRO

GLY

THR

ARG

VAL 1 55

ARG

ALA

MET

ALA

ILE 160

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

528

TYR

LYS

GLN

SER

GLN 165

HIS

MET

THR

GLU

VAL 170

VAL

ARG

CYS

PRO 175

HIS

CAT

GAG

CGC

TGC

TCA

GAT

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

576

HIS

GLU

ARG

CYS 180

SER

ASP

SER

ASP

GLY 1 85

LEU

ALA

PRO

GLN 190

HIS

LEU

ATC

CGA

GTG

GAA

GGA

AAT

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

624

ILE

ARG

VAL 195

GLU

GLY

ASN

LEU

ARG 200

VAL

GLU

TYR

LEU

ASP 205

ASP

ARG

ASN

ACT THR

TTT PHE 210

CGA CAT

AGT SER

GTG VAL

GTG VAL 215

GTG VAL

CCC PRO

TAT TYR

GAG CCG

CCT GAG

GTT VAL

GGC GLY

672

ARG

HIS

GLU

PRO 220

PRO

GLU

TCT

GAC

TGT

ACC

ATC

CAC

TAC

AAC

TAC

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

720

SER 225

ASP

CYS

THR

ILE 230

HIS

TYR

ASN

TYR

MET 235

CYS

ASN

SER

CYS 240

ATG

GGC

ATG

AAC

CGG

AGG

CCC

ATC

CTC

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

768

MET

GLY

MET

ASN 245

ARG

PRO

ILE

LEU 250

THR

ILE

THR

LEU 255

GLU

GAC

TCC

AGT

GGT

AAT

CTA

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

816

ASP

SER

GLY 260

ASN

LEU

GLY

ARG 265

ASN

SER

PHE

GLU

VAL 270

ARG

VAL

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG

AGA

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

864

CYS

ALA

CYS 275

PRO

GLY

ARG

ASP

ARG 280

ARG

THR

GLU

GLU 285

ASH

LEU

ARG

AAG

AAA

GGG

GAG

CCT

CAC

GAG

CTG

CCC

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

912

LYS

LYS 290

GLY

GLU

PRO

HIS

HIS 295

GLU

LEU

PRO

GLY 300

SER

THR

LYS

ARG

GCA

CTG

CCC

AAC

AGC

TCC

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

960

ALA 305

LEU

PRO

ASN

THR 310

SER

PRO

GLN 315

PRO

LYS

PRO 320

CTG

GAT

GGG

GAT

CTG

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

1008

LEU

ASP

GLY

ASP

LEU 325

LYS

ALA

LEU

LYS

GLU 330

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU 335

GLU

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCA

CTA

GTG

GGG

GAG

1056

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

VAL

GLY

GLU

340 345 350

CGA TGA TGA 1065

ARG * *

355 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 33:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 963 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA ·· ·· ·· ··· · · • · · • · · · (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...963 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 33:

ATG MET 1

GGA GLY

GAA GLU

TAT TYR

TTC PHE 5

ACC THR

CTT CAG LEU GLN

ATC ILE

CGT GGG

CGT ARG

GAG GLU

CGC ARG

TTC PHE 1 5

GAG GLU

48

ARG 10

GLY

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA

CTC

AAG

GAT

GCC

CAG

GCT

96

MET

PHE

ARG

GLU

LEU

ASN

GLU

ALA

LEU

GLU

LEU

LYS

ASP

ALA

GLN

ALA

20

25

30

GGG

AAG

GAG

CCA

GGT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

1 44

GLY

LYS

GLU

PRO

GLY

ARG

PRO

ALA

PRO

ALA

PRO

THR

PRO

ALA

35

40

45

CCT

GCA

CCA

GCC

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

1 92

PRO

ALA

PRO

ALA

PRO

SER

TRP

PRO

LEU

SER

VAL

PRO

SER

GLN

50

55

60

AAA

ACC

TAC

CAG

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

240

LYS

THR

TYR

GLN

GLY

SER

TYR

GLY

PHE

ARG

LEU

GLY

PHE

LEU

HIS

SER

65

70

75

80

GGG

ACA

GCC

AAG

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

___288

GLY

THR

ALA

LYS

SER

VAL

THR

CYS

THR

TYR

SER

PRO

ALA

LEU

ASN

LYS

85

90

95

ATG

TTT

TGC

CAA

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

336

MET

PHE

CYS

GLN

LEU

ALA

LYS

THR

CYS

PRO

VAL

GLN

LEU

TRP

VAL

ASP

100

105

110

TCC

ACA

CCC

CCG

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

384

SER

THR

PRO

GLY

THR

ARG

VAL

ARG

ALA

MET

ALA

ILE

TYR

LYS

115

120

125

CAG

TCA

CAG

CAC

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

432

GLN

SER

GLN

HIS

MET

THR

GLU

VAL

ARG

CYS

PRO

HIS

GLU

130

135

1 40

CGC

TGC

TCA

GAT

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

480

ARG

CYS

SER

ASP

SER

ASP

GLY

LEU

ALA

PRO

GLN

HIS

LEU

ILE

ARG

145

150

155

1 60

GTG

GAA

GGA

AAT

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

ACT

TTT

528

VAL

GLU

GLY

ASN

LEU

ARG

VAL

GLU

TYR

LEU

ASP

ARG

ASN

THR

PHE

1 65

1 70

175

CGA

CAT

AGT

GTG

CCC

TAT

CAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

576

ARG

HIS

SER

VAL

PRO

TYR

GLU

PRO

GLU

VAL

GLY

SER

ASP

180

185

190

·· · • · ·· • · · • · · • · · ·· ··· ·· * · · · • · ·· ··· · · • · · • ♦ • ··· • · · • · · fa ··

TGT CYS

ACC THR

ACC THR 195

ATC ILE

CAC HIS

TAC TYR

AAC ASN

TAC TYR 200

ATG MET

TGT CYS

AAC ASN

AGT SER

TCC SER 205

TGC CYS

ATG GGC

624

MET

GLY

GGC

ATG

AAC

CGG

ACG

CCC

ATC

CTC

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

GAC

TCC

672

GLY

MET

ASN

ARG

PRO

ILE

LEU

THR

ILE

THR

LEU

GLU

ASP

SER

210

215

220

AGT

GGT

AAT

CTA

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

720

SER

GLY

ASN

LEU

GLY

ARG

ASN

SER

PHE

GLU

VAL

ARG

VAL

CYS

ALA

225

230

235

240

TGT

CCT

GGG

AGA

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

768

CYS

PRO

GLY

ARG

ASP

ARG

THR

GLU

ASN

LEU

ARG

LYS

245

250

255

GGG

GAG

CCT

CAC

GAG

CTG

CCC

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

81 6

GLY

GLU

PRO

HIS

GLU

LEU

PRO

GLY

SER

THR

LYS

ARG

ALA

LEU

260

265

270

CCC

AAC

ACC

AGC

TCC

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

864

PRO

ASN

THR

SER

PRO

GLN

PRO

LYS

PRO

LEU

ASP

275

280

285

GGG

GAT

CTG

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

912

GLY

ASP

LEU

LYS

ALA

LEU

LYS

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

290

295

300

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCA

CTA

GTG

GGG

GAG

CGA

TGA

960

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

VAL

GLY

GLU

ARG

★

305

310

315

320

TGA

963

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO

34:

(i) charakteristika sekvence:

	(A)	délka: 1011 párů básí
	(B)	typ: nukleotid
	(C)	počet vláken: jedno
	(D)	konfigurace: lineární
(ii)	typ	molekuly: cDNA
(iii)	hypotetický: NE
(iii)	antimediátorová: NE
(ix)	charakteristika:

(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1011

ATG MET 1

GGA GLY

(XÍ GAA GLU

) popis sekvence:

: SEQ ID NO 34

CGC TTC GAG

48

TAT TYR

TTC PHE 5

ACC THR

CTT LEU

CAG GLN

ATC CGT

GGG GLY

CGT GAG

ILE

ARG 10

ARG

GLU

ARG

PHE 1 5

GLU

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA

CTC

AAG

GAT

GCC

CAG

GCT

96

MET

PHE

ARG

GLU 20

LEU

ASN

GLU

ALA

LEU 25

GLU

LEU

LYS

ASP

ALA 30

GLN

ALA

GGG

AAG

GAG

CCA

GGT

CGA

GGA

GGT

GGC

TCT

GGA

GGC

GGA

TCC

144

GLY

LYS

GLU 35

PRO

GLY

ARG

GLY

GLY 40

GLY

SER

GLY

GLY 45

GLY

SER

GGC

GGT

GGA

GGT

TCT

CGA

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

192

GLY

GLY 50

GLY

SER

ARG

PRO 55

ALA

PRO

ALA

PRO 60

THR

PRO

ALA

CCT

GCA

CCA

GCC

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

TCA

TCT

GTC

CCT

TCC

CAG

240

PRO 65

ALA

PRO

ALA

PRO

SER 70

TRP

PRO

LEU

SER

SER 75

SER

VAL

PRO

SER

GLN 80

AAA

ACC

TAC

CAG

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

TTC

TTG

CAT

TCT

288

LYS

THR

TYR

GLN

GLY 85

SER

TYR

GLY

PHE

ARG 90

LEU

GLY

PHE

LEU

HIS 95

SER

GGG

ACA

GCC

AAG

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

336

GLY

THR

ALA

LYS 100

SER

VAL

THR

CYS

THR 105

TYR

SER

PRO

ALA

LEU 110

ASN

LYS

ATG

TTT

TGC

CAA

CTG

GCC

AAG

ACC

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

384

MET

PHE

CYS 1 1 5

GLN

LEU

ALA

LYS

THR 120

CYS

PRO

VAL

GLN

LEU 125

TRP

VAL

ASP

TCC

ACA

CCC

CCG

CCC

GGC

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATC

TAC

AAG

432

SER

THR 130

PRO

GLY

THR 135

ARG

VAL

ARG

ALA

MET 140

ALA

ILE

TYR

LYS

CAG

TCA

CAG

CAC

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

480

GLN 145

SER

GLN

HIS

MET

THR 150

GLU

VAL

ARG

ARG 155

CYS

PRO

HIS

GLU 160

CGC

TGC

TCA

GAT

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC

CGA

528

ARG

CYS

SER

ASP

SER 165

ASP

GLY

LEU

ALA

PRO 170

PRO

GLN

HIS

LEU

ILE 175

ARG

GTG

GAA

GGA

AAT

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA

AAC

ACT

TTT

576

VAL

GLU

GLY

ASN 180

LEU

ARG

VAL

GLU

TYR 185

LEU

ASP

ARG

ASN 190

THR

PHE

CGA

CAT

AGT

GTG

CCC

TAT

GAG

CCG

CCT

GAG

GTT

GGC

TCT

GAC

624

ARG

HIS

SER 195

VAL

PRO

TYR 200

GLU

PRO

GLU

VAL 205

GLY

SER

ASP

TGT

ACC

ATC

CAC

TAC

AAC

TAC

ATG

TGT

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

672

CYS

THR 210

THR

ILE

HIS

TYR

ASN 215

TYR

MET

CYS

ASN

SER 220

SER

CYS

MET

GLY

96

• · · • · · · ·

• ·

• ··

»· **

GGC

ATG

AAC

CGG

AGG

CCC

ATC

CTC

ACC

ATC

ACA

CTG

GAA

GAC

TCC

720

GLY

MET

ASN

ARG

PRO

ILE

LEU

THR

ILE

THR

LEU

GLU

ASP

SER

225

230

235

240

AGT

GGT

AAT

CTA

CTG

GGA

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

768

SER

GLY

ASN

LEU

GLY

ARG

ASN

SER

PHE

GLU

VAL

ARG

VAL

CYS

ALA

245

250

255

TGT

CCT

GGG

AGA

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

816

CYS

PRO

GLY

ARG

ASP

ARG

THR

GLU

ASN

LEU

ARG

LYS

260

265

270

GGG

GAG

CCT

CAC

GAG

CTG

CCC

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA

CTG

864

GLY

GLU

PRO

HIS

GLU

LEU

PRO

GLY

SER

THR

LYS

ARG

ALA

LEU

275

280

285

CCC

AAC

ACC

AGC

TCC

TCT

CCC

CAG

CCA

AAG

AAA

CCA

CTG

GAT

912

PRO

ASN

THR

SER

PRO

GLN

PRO

LYS

PRO

LEU

ASP

290

295

300

GGG

GAT

CTG

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

960

GLY

ASP

LEU

LYS

ALA

LEU

LYS

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

305

310

315

320

CTG

AAG

GCC

CTG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCA

CTA

GTG

GGG

GAG

CGA

TGA

1008

LEU

LYS

ALA

LEU

GLU

LYS

LEU

LYS

ALA

LEU

VAL

GLY

GLU

ARG

jr

325

330

335

TGA

1 01 1

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 35:

(i) charakteristika sekvence:

(ii)	(A) délka: 24 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární typ molekuly: cDNA
(iii)	hypotetický: NE
(iii)	antimediátorová: NE
(ix)	charakteristika:
	(A) jméno/CLE: CDS

(B) umístění: 1...1095 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 35:

CGGATCCTCT CGGAACATCT CGAA 24 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 36:

(i) charakteristika sekvence:

	(A)	délka: 749 párů básí
	(B)	typ: nukleotid
	(C)	počet vláken: jedno
	(D)	konfigurace: lineární
(ii)	typ	molekuly: cDNA
(iii)	hypotetický: NE
(iii)	antimediátorová: NE
(ix)	charakteristika:
	(A)	jméno/CLE: CDS
	(B)	umístění: 1...749

(xi) popis sekvence: SEQ ID NO 36:

GCCATGGCCC	AGGTGCAGCT	GCAGGAGTCA	GGGGCAGAGC	TTGTGGGGTC	AGGGGCCTCA	60
GTCAAGTTGT	CCTGCACAGC	TTCTGGCTTC	AACATTAAAG	ACTACTATAT	GCACTGGGTG	120
AAGCAGAGGC	CTGAACAGGG	CCTGGAGTGG	ATTGGATGGA	TTGATCCTGA	GAATGGTGAT	180
ACTGAATATG	CCCCGAAGTT	CCAGGGCAAG	GCCACTATGA	CTGCAGACAC	ATCCTCCAAT	240
ACAGCCTACC	TGCAGCTCAG	CAGCCTGGCA	TCTGAGGACA	CTGCCGTCTA	TTATTGTAAT	300
TTTTACGGGG	ATGCTTTGGA	CTACTGGGGC	CAAGGGACCA	CGGTCACCGT	CTCCTCAGGT	360
GGAGGCGGTT	CAGGCGGAGG	TGGCTCTGGC	GGTGGCGGAT	CGGATGTTTT	GATGACCCAA	420
ACTCCACTCA	CTTTGTCGGT	TACCATTGGA	CAACCAGCCT	CCATCTCTTG	CAAGTCAAGT	480
CAGAGCCTCT	TGGATAGTGA	TGGAAAGACA	TATTTGAATT	GGTTGTTACA	GAGGCCAGGC	540
CAGTCTCCAA	AGCGCCTAAT	CTATCTGGTG	TCTAAACTGG	ACTCTGGAGT	CCCTGACAGG	600
TTCACTGGCA	GTGGATCAGG	GACAGATTTC	ACACTGAAAA	TCAACAGAGT	GGAGGCTGAG	660
GATTTGGGAG	TTTATTATTG	CTGGCAAGGT	ACACATTCTC	CGCTCACGTT	CGGTGCTGGG	720

ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCGGCCGC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 37:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 45 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 37:

AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTT 45 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 38:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 38:

• ·

·«

GGGTCGACCT GGCTCCTTCC CAGG 24 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 39:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 749 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 39:

AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT 60

GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT 120

141

GGGAAGGAGC CAGGTCGACC C (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 40:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 27 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE > a • ·

100 • » (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 40:

GGGTCGACCG TCTGAGTCAG GCCCTTC 27 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 41:

charakteristika sekvence:
(A)	délka: 749 párů básí
(B)	typ: nukleotid
(C)	počet vláken: jedno
(D)	konfigurace: lineární

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 41:

AAGCTTGAAT	TCGTTAACGC	CACCATGGGA	GAATATTTCA	CCCTTCAGAT	CCGTGGGCGT	60
GAGCGCTTCG	AGATGTTCCG	AGAGCTGAAT	GAGGCCTTGG	AACTCAAGGA	TGCCCAGGCT	120
GGGAAGGAGC	CAGGGGGGAG	CAGGGCTCAC	TCCAGCCACC	TGAAGTCCAA	AAAGGGTCAG	180
TCTACCTCCC	GCCATAAAAA	ACTCATGTTC	AAGACAGAAG	GGCCTGACTC	AGACGGTCGA	240
CCC						243

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 42:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 48 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA • · ·

101 • · ·· • · · · • · · · • · · · · • · · ·· · · (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 42:

TCGAGGAGGT GGTGGCTCTG GAGGCGGAGG ATCCGGCGGT GGAGGTTC 48 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 43:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 48 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 43:

TCGAGAACCC CTACCGCCGG ATCCTCCGCC TCCAGAGCCA CCACCTCC 48 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 44:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 16 nukleových kyselin (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetický: NE (v) typ fragmentu: interní ·· » « • · • ·«

102 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 44:

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10

Gly Ser (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 45:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 26 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 45:

GATCCGAACA TGTCCCAACA TGTTGA 26 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 46:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 26 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA

103

(iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 46:

AGCTTCAACA TGTTGGGACA TGGTCG 26

104

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Varianta proteinu p53 ve které, část domény oligomerizace stejně jako celá doména regulace je deletována a nahrazena umělou doménou leucinového zipu vyznačená t í m, že delece části C-konce je provedena od rezidua 326 nebo od rezidua 337.

- 2. Varianta podle nároku 1 vyznačené tím, že umělá doména leucinového zipu je doména nepřítomná v přírodním stavu zabezpečující oligomerizační selektivitu.

3. Varianta podle nároku 2 vyznačená tím, že doména leucinového zipu má sekvenci SEQ ID n°l.

4. Varianta podle nároku 1 až 3 vyznačená tím, že arginin v poloze 182 proteinu p53 je nahrazen histidinem.

5. Varianta podle jednoho z předchozích nároků, ve které část nebo celek transaktivační domény je deletován a nahrazen heterologní transaktivační doménou.

6. Varianta podle nároku 5 vyznačená tím, že zahrnuje deleci reziduí 1 až 74.

7. Varianta podle nároku 5 nebo 6 vyznačená tím, že heterologní transaktivační doména je transaktivační doména VP16.

SUBSTITUTE SHEET ·· • · ·

105

8. Varianta podle nároku 7 vyznačená tím, že transaktivační doména obsahuje sekvenci SEQ ID n°2.

9. Varianta podle nároku 5 nebo 6 vyznačená tím, že heterologní transaktivační doména je transaktivační doména specifická transformovaným buňkám.

- 10. Varianta podle nároku 9 vyznačená tím, že transaktivační doména je složena z proteinové domény schopné selektivně vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex přítomný v transformované buňce.

11. Varianta proteinu p53 účinná přednostně v transformovaných buňkách, ve které alespoň jedna z funkčních domén proteinu p53 je deletována zčásti nebo úplně a je nahrazena heterologní doménou účinnou přednostně v transformovaných buňkách.

12. Varianta podle nároku 11 vyznačená tím, že deletovaná a substituovaná funkční doména proteinu p53 je transaktivační doména.

13. Varianta podle nároku 12 obsahující transaktivační doménu účinnou přednostně v buňkách obsahujících onkogenní protein ras nebo mutant proteinu p53.

14. Varianta podle nároku 13 vyznačená tím, že transaktivační doména je proteinová doména schopná selektivně vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex

SUBSTITUTE SHEET

Φ· ·· č e n á tím, nebo derivát

106 přítomný v transformované buňce.

15. Varianta podle nároku 14 že proteinová doména obsahuje protilátek, zejména Fab nebo ScFv.

vyzná fragment

16. Varianta podle nároku 15 vyznačená tím, že proteinová doména obsahuje ScFv řízenou proti mutantu proteinu p53.

17. Varianta podle jednoho z nároků 12 až 16 vyznačená tím, že přírodní transaktivační doména je deletována supresí reziduí 1 až 74.

18. Varianta proteinu p53 obsahující deleci části C-konce od rezidua 366 sloučená se sekvencí SEQ ID n°3 (AS) .

19. Varianta podle nároku 18, ve které celek nebo část transaktivační domény je deletován a nahrazen heterologní transaktivační doménou.

20. Varianta podle nároku 18 nebo 19 vyznačená tím, že arginin v poloze 182 proteinu p53 je nahrazen histidinem.

21. Chimérní protein obsahující transaktivační doménu, DNA vazebnou doménu, rozpoznávací jadernou doménu a doménu oligomerizace, vyznačený tím, že DNA vazebná doména a rozpoznávací jaderná doména jsou tvořeny

SUBSTITUTE SHEET

107 • · · ·· aminokyselinami 75 až 325 divokého lidského proteinu p53 (SEQ ID n°4) .

22. Chimérní protein obsahující transaktivační doménu, DNA vazebnou doménu, rozpoznávací jadernou doménu a oblast oligomerizace, vyznačený tím, že DNA vazebná doména a rozpoznávací jaderná doména jsou tvořeny aminokyselinami 75 až 336 divokého lidského proteinu p53 (SEQ ID n°5) .

23. Chimérní protein podle nároku 21 nebo 22 v y z n ač e n ý t í m, že arginin v poloze 182 proteinu p53 je nahrazen histidinem.

24. Chimérní protein podle nároků 21 až 23 vyznačený t i m, že transaktivační doména je tvořena transaktivační doménou VP16.

25. Chimérní protein podle nároků 1 až 24 vyznačený t í m, že transaktivační doména je tvořena proteinovou doménou schopnou selektivně vázat transaktivétor nebo transaktivační komplex přítomný v transformovaných buňkách.

26. Chimérní protein podle nároku 21 až 25 vyznačený t i m, že doména oligomerizace je tvořena umělým leucinovým zipem.

27. Sloučenina V-325 sekvence SEQ IN n° 25 a její varianta V-325H obsahující histidin v poloze 182 proteinu

SUBSTITUTE SHEET • · ·

108 p53.

28. Sloučenina V-326 sekvence SEQ IN n° 26 a její varianta V-326H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

29. Sloučenina V-367 sekvence SEQ IN n° 27 a její varianta V-367H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

30. Sloučenina V-AS sekvence SEQ IN n° 28 a její varianta V-ASH obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

31. Sloučenina V-393 sekvence SEQ IN n° 29 a její varianta V-393H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

32. Sloučenina V-343 sekvence SEQ IN n° 30 a její varianta V-343H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

33. Sloučenina V-325 sekvence SEQ IN n° 31 a její varianta V-325H obsahující histidin v poloze 182 proteinu

34. Sloučenina 393-325 sekvence SEQ IN n° 32 a její varianta 393-325H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

SUBSTITUTE SHEET

109

35. Sloučenina 360-325 sekvence SEQ IN n° 33 a její varianta 360-325H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

36. Sloučenina 360h-325 sekvence SEQ IN n° 34 a její varianta 360h-325H obsahující histidin v poloze 182 proteinu p53.

37. Nukleová kyselina kódující variantu nebo chimerní protein podle nároků 1 až 36.

38. Nukleová kyselina podle nároku 37 vyznačená tím, že se jedná o cDNA, RNA, syntetickou nebo semisyntetickou kyselinu.

39. Nukleová kyselina podle nároku 37 vyznačená tím, že se jedná o sekvenci nukleové kyseliny vybrané mezi množinou sekvencí SEQ ID n° 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 a 34.

40. Kazeta exprese obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 37, promotor umožňující expresi a terminační signál transkripce.

41. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 37 nebo kazetu podle nároku 40.

42. Vektor podle nároku 41 vyznačený tím, že

SUBSTITUTE SHEET

00

110 ·· ·· • · · • 0 ·· se jedná o virální vektor.

43. Vektor podle nároku 42 vyznačený tím, že se jedná o rekombinantní defektní adenovirus.

44. Vektor podle nároku 42 vyznačený se jedná o rekombinantní defektní retrovirus.

45. Vektor podle nároku 42 vyznačený se jedná o rekombinantní defektní AAV.

46. Vektor podle nároku 42 v y z n a se jedná o rekombinantní defektní HSV.

47. Vektor podle nároku 41 vyznačený se jedná o chemický nebo biochemický vektor.

tím, že tím, že t i m, že tím, že

48. Farmaceutická kompozice obsahující nukleovou kyselinu nebo/a vektor podle jednoho z nároků 32 až 47.

49. Farmaceutická kompozice obsahující variantu nebo chimérní protein podle jednoho z nároků 1 až 36.

50. Farmaceutická kompozice podle jednoho z nároků 48 nebo 49 pro léčení hyperproliferativních poruch.

SUBSTITUTE SHEET