CA2219861A1 - .delta.p62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouveau polypeptide désigné .DELTA.P62, ou .DELTA.Sam68, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations, notamment en thérapie génique anti-cancéreuse.
Description
CA 02219861 1997-ll-21 W O 96/38556 PCTA~R9~ C2 AP62. SI~S VARIANTS. SE(~UE~CES NUCLEI~UES ET LEURS
UTILISATIONS
La présente invention conceme un nouveau polypeptide désigné
~P62, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique anti-cancéreuse.
Différents gènes, appelés oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceux-ci, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21, 10 jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nornbre de tumeurs humaines a été
associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire. La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caracteristiques constitue alonc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse.
In vivo, on ne connait pas la nature précise des évènements responsables de la transduction du signal initié par les protéines p21.
Cependant, un nombre croissant de résultats souligne la multiplicité des effecteurs qui interagissent directennent et préférentiellement avec la forme active (liée au GTP) des protéines ras. Parmi ces effecteurs, la protéine GAP a été la première dont l'implication dans la transduction W 09513~S~6 P~l/~n~ 2 du signal a été documentée. Il s'agit d'une protéine cytosolique présente chez tous les organismes eucaryotes qui possède la faculté
d'accélérer fortement l'hydrolyse du GTP, lié à la protéine normale. Elle possède deux domaines assurant des fonctions distinctes. Son extrémité carboxy-terminale porte l'activité catalytique qui interagit avec les protéines p21 et qui augmente leur activité GTPase. A son autre extrémité, en aval de la partie N-terminale, se trouve une juxtaposition de domaines SH2 et SH3 qui participent à la transduction du message et interagissent avec d'autres protéines. Parmi ces protéines se 10 trouvent deux protéines, p62 et p190, respectivement de 62kDa et 190 kDa qui sont fortement phosphorylées en tyrosine. Ces deux protéines forment un complexe spécifique avec GAP et sont immunoprécipitées par des anticorps dirigés contre différents épitopes de GAP. On sait en particulier que c'est au niveau des domaines SH2 de GAP que se font les interactions de p62 avec GAP. Les acides aminés 271 à 443 de p62 contiennent des tyrosines phosphorylées et semblent impliqués dans ces interactions. Ces mêmes phosphorylations semblent par ailleurs participer à des interactions entre p62 et l'adaptateur GRB2. D'autre part, tout au long de la séquence de p62, sont répartis des sites consensus riches en prolines qui participent à la liaison aux domaines SH3 des tyrosines kinases de la famille src ainsi que de la phospholipase C~.
La protéine p62 (ou encore Sam68) a été identifiée par Wong et al. (Cell 69 (1992) 5~1). Elle comporte 443 acides aminés, dont la séquence a été décrite dans la littérature (voir SEQ ID n~ 1).
CA 022l986l l997-ll-2l W O 96/38556 P~ h~l~/00802 En plus des caractéristiques Imentionnées ci-dessus, la protéine p62 présente plusieurs caracteristiques propres aux hnRNP
("heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein"):
- elle est riche en glycines - elle possède des régions riches en arginines - de plus, ses acides aminés 145 à 247 définissent une région de forte homologie avec une! hnRNP précédemment décrite, la GRP33. Cette région contient un site consensus de liaison aux ARNs homologue à celui contenu dans la hnRNP K. Ce site consensus est désigné KH domaine (KH = hnRNP15 Homolog). Les résidus conservés sont essentiels à la liaison aux ARl\ls et l'impact de la non intégrité de ce domaine dans une pathologie a été montré pour FMR1 qui est le produit du gene associé au retarcl mental qui est observé dans le syndrome du X-fragile (Siomi et al., t,ell 77 (1994) 33).
La présente invention réside notamment dans la démonstration de l'importance de la protéine p62 (Sam68) dans la prolifération et la mort cellulaires. Elle découle plus particulièrement de la mise en évidence que des dérivés de p62 sont capables d'interférer dans le processus de transformation cellulaire, et notamment d'inhiber les signaux transduits par les protéines ras et src. Elle découle en outre de la démonstration particulièrement surprenante que ces dérivés sont également doués de propriétés apoptotiques, et donc capables d'induire la mort cellulaire.
Un premier objet de l'invention concerne donc tout dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine GAP et p62. Préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d~inhiber au moins en partie le pouvoir oncogène des protéines ras eVou src. Encore W 096/38556 PCTA~RS~ ~2 pius préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d'induire la mort cellulaire par apoptose. Les dérivés selon l'invention sont également caractérisés par la perte de la capacité à interagir avec l'ARN de p62.
La présente invention décrit en particulier la mise en évidence, le clonage et la caractérisation d'une isoforme naturelle de la protéine p62. Cette isoforme, désignée Ap62 (ou ASam68), présente une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33, qui recouvre le domaine KH. En raison de cette délétion, '\p62 ne possède pas l'intégralité des propriétés de p62. Ainsi, Ap62 possède un domaine d'interaction avec GAP et GRB2 intact ainsi que les différentes séquences riches en prolines partenaires de SH3 (Figure 1).
Cependant, Ap62 n'est plus capable d'interagir avec les acides nucléiques en raison de la délétion du domaine d'homologie à la protéine GRP33. La demanderesse a également montré que le transfert de l'ADNc de ~p62 dans différents modèles cellulaires normaux ou tumoraux s'oppose à la coopération entre p62 et Ras et inhibe les signaux transduits par les protéines Ras normales et oncogéniques .
Surexprimée, la ~\p62 interfère donc avec les processus de prolifération et de différenciation et aboutit, dans les différents modèles cellulaires, à la mort cellulaire par apoptose.
Selon un mode préféré, I'invention concerne plus particulièrement tout dérivé de p62 portant au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33. Plus particulièrement, les dérivés selon l'invention comportent au moins une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de la protéine p62 telle que représentée sur la séquence SEQ ID
n~ 1, et qui recouvre le domaine KH. La délétion porte avantageusement sur plus de 10 acides aminés et, plus préférentiellement, sur plus de 30 acides W 096/38556 PCT~R9~ 2 aminés. Elle peut concerner un ou plusieurs sites à l'intérieur de cette région,d~s lors que le dérivé résultant présentle les propriétés décrites ci-avant.
D'une manière particulièrement avantageuse, le dérivé selon l'invention est un polypeptide comprencmt tout ou partie de la séquence SEQ
ID n~ 2 ou d'un variant de celle-ci. Le terme variant au sens de l'invention désigné tout polypeptide dont la structure se distingue de la séquence SEQ
ID n~ 2 par une ou plusieurs modifications de nature génétique, biochimique eVou chimique. Il peut s'agir en particulier de toute mutation, substitution, délétion, addition eVou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés o peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour s;on site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui c:onférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminanle à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.
D'une manière particulièrement préférée, les dérivés de l'invention retiennent au moins une partie de la protéine p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Cette partie de p62 est plus particulièrement constituée de tyrosines phosphorylées" localiées entre les résidus 200 à 450
UTILISATIONS
La présente invention conceme un nouveau polypeptide désigné
~P62, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique anti-cancéreuse.
Différents gènes, appelés oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceux-ci, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21, 10 jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nornbre de tumeurs humaines a été
associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire. La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caracteristiques constitue alonc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse.
In vivo, on ne connait pas la nature précise des évènements responsables de la transduction du signal initié par les protéines p21.
Cependant, un nombre croissant de résultats souligne la multiplicité des effecteurs qui interagissent directennent et préférentiellement avec la forme active (liée au GTP) des protéines ras. Parmi ces effecteurs, la protéine GAP a été la première dont l'implication dans la transduction W 09513~S~6 P~l/~n~ 2 du signal a été documentée. Il s'agit d'une protéine cytosolique présente chez tous les organismes eucaryotes qui possède la faculté
d'accélérer fortement l'hydrolyse du GTP, lié à la protéine normale. Elle possède deux domaines assurant des fonctions distinctes. Son extrémité carboxy-terminale porte l'activité catalytique qui interagit avec les protéines p21 et qui augmente leur activité GTPase. A son autre extrémité, en aval de la partie N-terminale, se trouve une juxtaposition de domaines SH2 et SH3 qui participent à la transduction du message et interagissent avec d'autres protéines. Parmi ces protéines se 10 trouvent deux protéines, p62 et p190, respectivement de 62kDa et 190 kDa qui sont fortement phosphorylées en tyrosine. Ces deux protéines forment un complexe spécifique avec GAP et sont immunoprécipitées par des anticorps dirigés contre différents épitopes de GAP. On sait en particulier que c'est au niveau des domaines SH2 de GAP que se font les interactions de p62 avec GAP. Les acides aminés 271 à 443 de p62 contiennent des tyrosines phosphorylées et semblent impliqués dans ces interactions. Ces mêmes phosphorylations semblent par ailleurs participer à des interactions entre p62 et l'adaptateur GRB2. D'autre part, tout au long de la séquence de p62, sont répartis des sites consensus riches en prolines qui participent à la liaison aux domaines SH3 des tyrosines kinases de la famille src ainsi que de la phospholipase C~.
La protéine p62 (ou encore Sam68) a été identifiée par Wong et al. (Cell 69 (1992) 5~1). Elle comporte 443 acides aminés, dont la séquence a été décrite dans la littérature (voir SEQ ID n~ 1).
CA 022l986l l997-ll-2l W O 96/38556 P~ h~l~/00802 En plus des caractéristiques Imentionnées ci-dessus, la protéine p62 présente plusieurs caracteristiques propres aux hnRNP
("heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein"):
- elle est riche en glycines - elle possède des régions riches en arginines - de plus, ses acides aminés 145 à 247 définissent une région de forte homologie avec une! hnRNP précédemment décrite, la GRP33. Cette région contient un site consensus de liaison aux ARNs homologue à celui contenu dans la hnRNP K. Ce site consensus est désigné KH domaine (KH = hnRNP15 Homolog). Les résidus conservés sont essentiels à la liaison aux ARl\ls et l'impact de la non intégrité de ce domaine dans une pathologie a été montré pour FMR1 qui est le produit du gene associé au retarcl mental qui est observé dans le syndrome du X-fragile (Siomi et al., t,ell 77 (1994) 33).
La présente invention réside notamment dans la démonstration de l'importance de la protéine p62 (Sam68) dans la prolifération et la mort cellulaires. Elle découle plus particulièrement de la mise en évidence que des dérivés de p62 sont capables d'interférer dans le processus de transformation cellulaire, et notamment d'inhiber les signaux transduits par les protéines ras et src. Elle découle en outre de la démonstration particulièrement surprenante que ces dérivés sont également doués de propriétés apoptotiques, et donc capables d'induire la mort cellulaire.
Un premier objet de l'invention concerne donc tout dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine GAP et p62. Préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d~inhiber au moins en partie le pouvoir oncogène des protéines ras eVou src. Encore W 096/38556 PCTA~RS~ ~2 pius préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d'induire la mort cellulaire par apoptose. Les dérivés selon l'invention sont également caractérisés par la perte de la capacité à interagir avec l'ARN de p62.
La présente invention décrit en particulier la mise en évidence, le clonage et la caractérisation d'une isoforme naturelle de la protéine p62. Cette isoforme, désignée Ap62 (ou ASam68), présente une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33, qui recouvre le domaine KH. En raison de cette délétion, '\p62 ne possède pas l'intégralité des propriétés de p62. Ainsi, Ap62 possède un domaine d'interaction avec GAP et GRB2 intact ainsi que les différentes séquences riches en prolines partenaires de SH3 (Figure 1).
Cependant, Ap62 n'est plus capable d'interagir avec les acides nucléiques en raison de la délétion du domaine d'homologie à la protéine GRP33. La demanderesse a également montré que le transfert de l'ADNc de ~p62 dans différents modèles cellulaires normaux ou tumoraux s'oppose à la coopération entre p62 et Ras et inhibe les signaux transduits par les protéines Ras normales et oncogéniques .
Surexprimée, la ~\p62 interfère donc avec les processus de prolifération et de différenciation et aboutit, dans les différents modèles cellulaires, à la mort cellulaire par apoptose.
Selon un mode préféré, I'invention concerne plus particulièrement tout dérivé de p62 portant au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33. Plus particulièrement, les dérivés selon l'invention comportent au moins une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de la protéine p62 telle que représentée sur la séquence SEQ ID
n~ 1, et qui recouvre le domaine KH. La délétion porte avantageusement sur plus de 10 acides aminés et, plus préférentiellement, sur plus de 30 acides W 096/38556 PCT~R9~ 2 aminés. Elle peut concerner un ou plusieurs sites à l'intérieur de cette région,d~s lors que le dérivé résultant présentle les propriétés décrites ci-avant.
D'une manière particulièrement avantageuse, le dérivé selon l'invention est un polypeptide comprencmt tout ou partie de la séquence SEQ
ID n~ 2 ou d'un variant de celle-ci. Le terme variant au sens de l'invention désigné tout polypeptide dont la structure se distingue de la séquence SEQ
ID n~ 2 par une ou plusieurs modifications de nature génétique, biochimique eVou chimique. Il peut s'agir en particulier de toute mutation, substitution, délétion, addition eVou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés o peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour s;on site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui c:onférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminanle à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.
D'une manière particulièrement préférée, les dérivés de l'invention retiennent au moins une partie de la protéine p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Cette partie de p62 est plus particulièrement constituée de tyrosines phosphorylées" localiées entre les résidus 200 à 450
2~; de la protéine p62 (Cf SEQ ID n~ 1'1. Un dérivé préféré selon l'invention comprend donc au moins (i) une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de p62 et (ii) une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Plus préférentiellement, la délétion porte sur les résidus 1 à 202.
A cet égard, la demanderesse a également montré que des dérivés selon l'invention présentant des propriétés particulièrement intéressantes W 096/38556 PCT/~ v2 peuvent être constitués de polypeptides comprenant essentiellement ia région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
Un exemple particulièrement préféré de polypeptide selon l'invention est représenté par le polypeptide l~p62 de séquence SEQ ID n~2, possédant une délétion des résidus 170-208 de la séquence de p62. Un autre exemple est représenté par le polypeptide p62-C comprenant les résidus 203 à 443 de p62 (séquence SEQ ID n~ 3).
Les résultats présentés dans la présente demande montrent notamment que ~p62 peut rentrer en compétition avec p62 vis à vis de GAP. GAP étant l'un des effecteurs des protéines Ras, /~p62 bloque les voies mitogènes qui en dépendent. Surexprimée par transfert de gène (transfection, infection, microinjection, etc) /\p62 induit la mort cellulaire par apoptose dans des celiules normales (fibroblastes NIH3T3 et Swiss 3T3) ou tumorales (H460;HCT116), et est capable d'inhiber la formation de foyers induits par ras. Ce même effet est obtenu avec le dérivé p62-C (comprenant essentiellement ia partie C-terminale de ~p62, qui recouvre la région comprise entre les acides aminés 203 et 443 et qui correspond au domaine d'interaction avec les domaines SH2 de GAP et de GRB2). Cette partie C-terminale contient également trois des sites d'interaction avec les domaines SH3, ceux ayant le plus d'affinité pour Fyn. L'activité thérapeutique importante des dérivés selon l'invention est liée à leur propriétés multiples, et notamment leur pouvoir de titration des domaines SH3 des protéines de la famille src (exemple:
fyn ), leur capacité d'inhibition du recrutement de GRB2 en titrant son domaine SH2, et leur capacité d'inhibition de la fonction effectrice de la protéine GAP pour les voies de signalisation qui dépendent de Ras.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-avant.
W 096/38556 ~l/rnD~ -2 L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou désoxyribonucl~éique (ADN) En outre, il peut s'agir d'un ADN
génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Il peut être d'origine humaine, animale, virale, synthétique! ou semi-synthétique. Il peut être obtenu de différentes manières et notamment par synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. Il peut également être obtenu par criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la demande (voir séquences SE~ ID n~ 6 et 7 par exemple). Il peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc) de séquences criblées à
partir de banques. D'une manière ~lénérale, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, I'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un ARN.
L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi:
(a) tout ou partie de la séquencel SEQ ID n~ 2 ou SEQ ID n~ 3 ou de leur brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avlec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'invention, (c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
Comme indiqué précédemment, la demanderesse a maintenant isolé
et caractérisé de nouvelles séquences d'acide nucléique codant pour des polypeptides clérivés de p62, ayant des propriétés antiprolifératives et apoptotiques tout à fait remarquable~s. Ces acides nucléiques peuvent maintenant être utilisés comme agents thérapeutiques pour produire dans les cellules des dérivés selon l'invention capables de détruire ou de corriger des dysfonctionnements cellulaires. A cet effet, la présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant un acide CA 02219861 1997-ll-21 W 096/38556 PCTi~h~ ~-2 nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de pr~férence humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléoique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène p62. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur Vlll, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, c~-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP
d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR
du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leurs propriétés antiprolifératives eVou CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT~R96/00802 apoptotiques d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires.
Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acidesnucléiques nus pouvaient plénétrer dans les cellules sans vecteur particulier.
Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) I'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la 10 présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé dans un vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique.
L'utilisation de vecteurs viraux rlepose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection.
A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vec:teurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de I'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa W 096/38556 P~l/rh~5~ 2 fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. o L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, I'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peut donc être mélangé à tout 10 véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agiren particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une 15 injection directe de l'acide nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie 20 concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant.
Elle concerne aussi toute composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé de p62 tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de W 096/38556 PCTA~R~G~ 2 cellules hyperprolifératives. Elle peut êbre utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'un ou plusieurs acides nucléiques (ou d'un ve!cteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment). A cet egard, I'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un acide nucléique tel que défini ci-avant.
La présente invention est avanl;ageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprolifération (i.e. en prolifération anormale).
Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules cle muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un oncogène activé est impliqué. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les c:ancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les Iymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, etc.
Les produits de l'invention sont egalement utiles pour l'identification d'autres partenaires des voies de signalisation des oncogenes, par recherche d'inhibiteurs, d'agonistes, de competiteurs ou de molecules interagissant in vivo avec ces produits.
Par ailleurs, I'invention concerne également les séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de contrôler - la transcription eVou la traduction d'ARNm cellulaires codant pour p62 ou ~p62. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites 30 dans la cellule cible en ARN complémentaires des ARNm cellulaires W 096/38556 P~li~G~ 2 Ap62 ou p62 et bloquer ainsi leur traduction en protéine selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléiques SEQ ID n~ 1, 2 ou 3, transcrites dans l'orientation inverse.
La présente invention concerne également l'utilisation de tout composé capable d'induire l'expression ou la surexpression de /~p62 dans une cellule pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Léqendes des figures Figure 1: Représentation schématique des domaines structuraux de p62 et ~p62.
Figure 2: Effet de p62 et /~p62 sur la transactivation par les protéines ras d'un RRE dérivé de l'enhancer du virus du polyôme.
Figure 3: Mise en évidence de la mort cellulaire induite par ~\p62 dans les fibroblastes NIH3T3.
Figure 4 : Mise en évidence de l'expression de Ap62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum.
Figure 5: Inhibition de la formation de foyers induite par les oncogenes.
Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la CA 02219861 1997-ll-21 W 096/385~6 P~l/rhS~C/a~E 2 centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, I'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littéralture [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F-.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular ~iology", John Wiley & ',ons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (E3ethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'a~arose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN
Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur.
La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un ~raitement ménagé par la nucléase S1 .
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée sielon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit CA 022l986l l997-ll-2l W O9~/3XS~6 PCTA~fi~.~ 1 2 distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [eolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B.
et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
o Exemples Exemple 1: Isolement de l'ADN complémentaire de ~p62.
L'ADN complémentaire de ~p62 a été isolé par PCR sur une population d'ADN complémentaire synthétisé à partir d' ARN poly A+
extraits de placenta humain. 1,ug d'ADN a été utilisé conjointement aux 15 amorces dérivées de la séquence de p62 et qui recouvrent les acides aminés 123 à 131 d'une part (oligo 5') et 437 à 443 d'autre part (oligo
A cet égard, la demanderesse a également montré que des dérivés selon l'invention présentant des propriétés particulièrement intéressantes W 096/38556 PCT/~ v2 peuvent être constitués de polypeptides comprenant essentiellement ia région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
Un exemple particulièrement préféré de polypeptide selon l'invention est représenté par le polypeptide l~p62 de séquence SEQ ID n~2, possédant une délétion des résidus 170-208 de la séquence de p62. Un autre exemple est représenté par le polypeptide p62-C comprenant les résidus 203 à 443 de p62 (séquence SEQ ID n~ 3).
Les résultats présentés dans la présente demande montrent notamment que ~p62 peut rentrer en compétition avec p62 vis à vis de GAP. GAP étant l'un des effecteurs des protéines Ras, /~p62 bloque les voies mitogènes qui en dépendent. Surexprimée par transfert de gène (transfection, infection, microinjection, etc) /\p62 induit la mort cellulaire par apoptose dans des celiules normales (fibroblastes NIH3T3 et Swiss 3T3) ou tumorales (H460;HCT116), et est capable d'inhiber la formation de foyers induits par ras. Ce même effet est obtenu avec le dérivé p62-C (comprenant essentiellement ia partie C-terminale de ~p62, qui recouvre la région comprise entre les acides aminés 203 et 443 et qui correspond au domaine d'interaction avec les domaines SH2 de GAP et de GRB2). Cette partie C-terminale contient également trois des sites d'interaction avec les domaines SH3, ceux ayant le plus d'affinité pour Fyn. L'activité thérapeutique importante des dérivés selon l'invention est liée à leur propriétés multiples, et notamment leur pouvoir de titration des domaines SH3 des protéines de la famille src (exemple:
fyn ), leur capacité d'inhibition du recrutement de GRB2 en titrant son domaine SH2, et leur capacité d'inhibition de la fonction effectrice de la protéine GAP pour les voies de signalisation qui dépendent de Ras.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-avant.
W 096/38556 ~l/rnD~ -2 L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou désoxyribonucl~éique (ADN) En outre, il peut s'agir d'un ADN
génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Il peut être d'origine humaine, animale, virale, synthétique! ou semi-synthétique. Il peut être obtenu de différentes manières et notamment par synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. Il peut également être obtenu par criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la demande (voir séquences SE~ ID n~ 6 et 7 par exemple). Il peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc) de séquences criblées à
partir de banques. D'une manière ~lénérale, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, I'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un ARN.
L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi:
(a) tout ou partie de la séquencel SEQ ID n~ 2 ou SEQ ID n~ 3 ou de leur brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avlec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'invention, (c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
Comme indiqué précédemment, la demanderesse a maintenant isolé
et caractérisé de nouvelles séquences d'acide nucléique codant pour des polypeptides clérivés de p62, ayant des propriétés antiprolifératives et apoptotiques tout à fait remarquable~s. Ces acides nucléiques peuvent maintenant être utilisés comme agents thérapeutiques pour produire dans les cellules des dérivés selon l'invention capables de détruire ou de corriger des dysfonctionnements cellulaires. A cet effet, la présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant un acide CA 02219861 1997-ll-21 W 096/38556 PCTi~h~ ~-2 nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de pr~férence humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléoique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène p62. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur Vlll, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, c~-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP
d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR
du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leurs propriétés antiprolifératives eVou CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT~R96/00802 apoptotiques d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires.
Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acidesnucléiques nus pouvaient plénétrer dans les cellules sans vecteur particulier.
Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) I'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la 10 présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé dans un vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique.
L'utilisation de vecteurs viraux rlepose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection.
A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vec:teurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de I'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa W 096/38556 P~l/rh~5~ 2 fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. o L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, I'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peut donc être mélangé à tout 10 véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agiren particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une 15 injection directe de l'acide nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie 20 concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant.
Elle concerne aussi toute composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé de p62 tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de W 096/38556 PCTA~R~G~ 2 cellules hyperprolifératives. Elle peut êbre utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'un ou plusieurs acides nucléiques (ou d'un ve!cteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment). A cet egard, I'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un acide nucléique tel que défini ci-avant.
La présente invention est avanl;ageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprolifération (i.e. en prolifération anormale).
Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules cle muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un oncogène activé est impliqué. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les c:ancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les Iymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, etc.
Les produits de l'invention sont egalement utiles pour l'identification d'autres partenaires des voies de signalisation des oncogenes, par recherche d'inhibiteurs, d'agonistes, de competiteurs ou de molecules interagissant in vivo avec ces produits.
Par ailleurs, I'invention concerne également les séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de contrôler - la transcription eVou la traduction d'ARNm cellulaires codant pour p62 ou ~p62. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites 30 dans la cellule cible en ARN complémentaires des ARNm cellulaires W 096/38556 P~li~G~ 2 Ap62 ou p62 et bloquer ainsi leur traduction en protéine selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléiques SEQ ID n~ 1, 2 ou 3, transcrites dans l'orientation inverse.
La présente invention concerne également l'utilisation de tout composé capable d'induire l'expression ou la surexpression de /~p62 dans une cellule pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Léqendes des figures Figure 1: Représentation schématique des domaines structuraux de p62 et ~p62.
Figure 2: Effet de p62 et /~p62 sur la transactivation par les protéines ras d'un RRE dérivé de l'enhancer du virus du polyôme.
Figure 3: Mise en évidence de la mort cellulaire induite par ~\p62 dans les fibroblastes NIH3T3.
Figure 4 : Mise en évidence de l'expression de Ap62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum.
Figure 5: Inhibition de la formation de foyers induite par les oncogenes.
Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la CA 02219861 1997-ll-21 W 096/385~6 P~l/rhS~C/a~E 2 centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, I'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littéralture [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F-.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular ~iology", John Wiley & ',ons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (E3ethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'a~arose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN
Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur.
La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un ~raitement ménagé par la nucléase S1 .
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée sielon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit CA 022l986l l997-ll-2l W O9~/3XS~6 PCTA~fi~.~ 1 2 distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [eolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B.
et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
o Exemples Exemple 1: Isolement de l'ADN complémentaire de ~p62.
L'ADN complémentaire de ~p62 a été isolé par PCR sur une population d'ADN complémentaire synthétisé à partir d' ARN poly A+
extraits de placenta humain. 1,ug d'ADN a été utilisé conjointement aux 15 amorces dérivées de la séquence de p62 et qui recouvrent les acides aminés 123 à 131 d'une part (oligo 5') et 437 à 443 d'autre part (oligo
3').
Les séquences de ces amorces sont les suivantes:
oligo 5': CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID n~ 4) oligo 3': TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID n~ 5) Les réactions ont été menées à 55~C et ont donné deux produits séparés par électrophorèse sur gel d'agarose:
- une bande de 987 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de p62 W O 96/38556 PCTAFRg~ ~t - une bande de 870 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de ~p62.
- Cette dernière bande a été clonée et sa séquence correspond exactement à ia séquence de p62, exception faite d'une délétion de 1 17 paires de bases dans le domaine d'homologie à la GRP33. La séquence complète de ~p62 est présentée SEQ ID n~ 2 (voir aussi figure 1).
L'existence de cette isoforme de p62 a été confirmée par criblage d'une banque d'ADN complémentaire de placenta humain établie dans 10 le vecteur ~gt 11. L'oligonucléotide utilisé pour ce criblage est un 24-mer correspondant à la jonction spéc:ifique de la délétion présente dans Ap62. La séquence de cet oligonucléotide est:
CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID n~ 6) Exemple 2: Construction de vecteurs d'expression de ~p62 et p62-C.
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisable pour le transfert des acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
2.1. Vecteur plasmidique:
Pour la construction de vec:teurs plasmidiques, 2 types de vecteurs ont été utilisés.
- Le vecteur SV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce .~
vecteur est un vecteur d'expression eucar,vote. Les acides nucléiques - codant pour les variants p62-C et /\p62 ont été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI. Ils sont ainsi placés sous le controle du promoteur de l'enhancer du virus ',V40.
W O 96/38556 PCTA~R~ '~-2 - Le vecteur pcDNA3 (Invitrogen). Il s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants p62-C et ~p62, été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI, sont ainsi placés sous le controle du prornoteur précoce du CMV.
2.2. Vecteur Viral Selon un mode particulier, I'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivodes acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.
Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus 20 CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide 25 nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, CA 022l986l l997-ll-2l W O 96/38556 P~l/~h~ 2 substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuve~nt également être modifiées, et notamment ia région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation n préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et l'acide nucléiqlue de l'invention (Cf FR94 13355).
Dans les virus de l'invention, la delétion dans la région E1 s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants d~éfectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entrle autre la séquence d'ADN d'intérêt.
La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J.
Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les Fonctions E1 et E4 telles que décrites 30 notamment dans les demandes n~ W0 94/26914 et W095/02697.
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCTA~R96/00802 Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustrg dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN
de taille relativement réduite, qui s'intbgrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance,la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a 10 été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome,qui contient le gbne cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO
91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep eVou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV
recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain(par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique de l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293.
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT/~h~-E~2 l"
Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques ~ classiques.
Concernant les virus de l'herpes et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New E,iologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des o rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à
partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV
("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"~; le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant un acide nucléique selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ledit acide nucléique est construit, puis utilisé pour translecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861,719); la lignée PsiCRlP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer I'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag ~Bender et al., J. Virol. 61 CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT~R9''~e~2 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.
2.3. Vecteur chimique Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans o le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n,(LKKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute techniqueconnue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
W 096/38556 ~l/rr~ ~6-2 Exemple 3: Inhibition de la transactivation de R.R.E (ras responsive elements~ due aux formes oncogéniques de Ras (Figure 2) ~ Des fibroblastes NIH 3T3 ont été transfectés par un gène rapporteur, celui de la chloramphénic:ol acétyl transférase, placé sous le contrôle d'éléments de réponse à Ras dérivés de l'enhancer du virus du polyôme. Ces éléments sont stimulés de 15 à 20 fois lorsque les cellules sont cotransfectées par un vecteur d'expression portant l'ADNc de l'oncogène Middle T(MT) de SV40. Cette stimulation n'est que peu affectée lorsqu'une cotransfection apporte les vecteurs d'expression de p62-C et de Ap62 (Cf exemple 2). Lorsque la cotransfection est réalisée, non plus avec MT mais avec la forme activée de l'oncogène Ha-ras (Val 12), I'activité CAT est stirnulée de 30 à 40 fois au dessus du niveau de base. L'expression de la p62 affecte peu cette stimulation alors que p62-C et ~p62 inhibent presque totalement toute activité due au Ras oncogénique. De la meme maniere, la stimulation obtenue par cotransfection avec l'oncogène v-src est fortement inhibée par les proteines p62-C et Ap62, mais pas par la p62.
Ces expériences ont été realisées avec 0,~,ug de vecteur permettant l'expression de MT ou de Ras VAL12 ou de v-src et 4~g de vecteur d'expression portant l'ADNic de p62-C ou de Ap62. Elles démontrent clairement le pouvoir des protéines de l'invention de s'opposer aux signaux ras oncogéniqiues.
Exemple 4: Mise en évidence de la mort cellulaire induite par ~p62 - dans les fibroblastes NIH3T3 (Figure 3).
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées avec une efficacité
de 60% par ~llg de vecteur d'expression de /\p62 (exemple 2).
W 096/38556 PCTAFR~,'0~--2 24 heures après la transfection, les cellules présentent une altération importante de leur viabilité par rapport au témoin. L'analyse de leur ADN révèle après migration sur gel d'agarose des échelles de dégradation caractéristiques des phénomènes d'apoptose. Les mêmes s phénomènes sont observés lorsque p62-C est transfectée dans les mêmes conditions que Ap62.
Exemple 5: Mise en évidence de l'expression de Ap62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum (Figure 4).
o Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été mis en culture (1), traités par 0,5 1l9 d'acide okadaïque (2), traités par 10 ng/ml de PMA et par 2 ,ug de ionomycine (3), soumis à 1 ~M de staurosporine (4) ou à 2 ,ug/ml de camptotécine (5) et enfin déprivés en sérum.
L'expression des ARN messagers de p62 et de ~p62 dans ces fibroblastes et au cours de ces différents traitements a été analysée. A
chaque traitement, trois points ont été analysés. Ces points correspondent à trois temps de traitement: 6, 12 et 24 heures.
Sonde 5' spécifique de ~p62 (SEQ ID n~ 7):
CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG
Sonde 5' spécifique de p62 (SEQ ID n~ 8):
AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC
Sonde 3'commun à p62 et à Ap62 (SEQ ID n~ 9):
GTATGTATCATCATATCCATATTC
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38SS6 PCT~R96/00802 Dans les fibroblastes mis en culture en présence de 10 % de sérum de veau foetal (SVF), I'ARNrn de p62 est mis en évidence alors que l'ARNm de Ap62 n'est pas détecté même après 24h de mise en culture. La situation est la même clU cours du traitement par l'acide 5 okadaïque. En revanche, une forte induction de l'ARNm de /~p62 est observée après 6 à 12 heures de traitement par le PMA et la ionomycine. Cet ARNm est aussi détectable après addition de staurosporine et est très fortement induit après 12 heures de traitement à la camptotécine. Lorsque les fibroblastes embryonnaires sont 10 déprivés en sérum, une forte induction de Ap62 est observée en même temps qu'une disparition du messager de p62.
Ces résultats démontrent donc que l'expression de l'ARNm de Ap62 est induite au cours de certaines situations apoptotiques dans les fibroblastes.
Exemple 6: Inhibition par ~p62 de la formation de foyers induite par ras Cet exemple decrit une autre etude montrant que de Ap62 interfere avec le processus de transformation induit par les oncogenes. Plus particulierement, cet exemple demontre que ~p62 est capable d'inhiber la formation de foyers induite par differents oncogenes (ras oncogenique, v-src) dans les cellules NIH-3T3, alors que p62 n'affecte pas ce phenomene.
Des fibroblastes NIH3T3 ont été co-transfectées par 0,1 ,ug de vecteur d'expression de v-Src ou Ha-Ras Val 12 et par 4 mg de vecteur d'expression de p62, de Ap62 ou vide (exemple 2). Les cellules ont été
maintenues en milieu contenant 10 ~/O de sérum de veau nouveau-né et W O 96/38556 PCT/~K9G~ E 2 le nombre de foyer a étE déterminé après fixation et coloration des cellules en présence de phénol fuchsin. Les expériences ont été
réalisées en triple.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que Ap62 diminue le nombre de foyers induits par v-src et Ha-Ras Val12 de 50 % environ. Cet effet reflète un pouvoir antagoniste spécifique de la transformation par v-src et Ha-Ras oncogénique puisque Ap62 n'affecte pas la formation de foyers induite par v-Raf. En outre, I'effet observé
n'est pas lié a une toxicité du produit puisque le nombre de colonies 10 résistantes à la néomycine après transfection par p62, 1~p62 ou un vecteur vide est comparable. Ces résultats confirment donc le rôle inhibiteur des molécules de l'invention dans le processus de transformation induit par les oncogènes. Ces résultats confirment ainsi l'utilité de ces produits dans des approches de correction des processus de prolifération cellulaire induits par les oncogEnes, ainsi que comme outil pour l'identification d'autres molécules active et/ou impliquées dans les voies de signalisation de ces oncogènes.
Exemple 7: Mise en évidence d'une interaction avec src in vivo Cet exemple décrit l'étude de l'interaction de ~p62 avec d'autres molécules. Il démontre que p62 et ~p62 sont capables d'interagir in vivo avec src.
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées par un vecteur d'expression de p62 ou de ~\p62 comprenant un marqueur myc ("myc teg") (exemple 2). Les cellules transfectées ont été maintenues en croissance asynchrone ou bloquées en phase mitotique par traitement W O 96/38556 PCT/~K~C~ 2 par du nocodazole. Les cellules ont ensuite été co-transfectées par un - vecteur d'expression de v-Src ou vide. 48 heures après, les cellules ont été Iysées et les complexes formés ont été immunodétectés au moyen d'anticorps anti-myc (anticorps 9E1t)) et d'anticorps anti-Src (anticorps s N16).
Les résultats obtenus montrent qlue p62 et ~p62 sont capables d'interagir in vivo avec src. En outre, alors que l'interaction entre p62 et src semble se produire uniquement dans les cellules mitotiques, ~\p62 lie de manière significative Src mêrne dans les cellules asynchrones.
o Cette interaction est renforcée dans les cellules mitotiques.
CA 022l986l l997-ll-2l WO 96/38556 PcI~ ~9 r~ ~~-2 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TELEPHONE: (1) 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: ~1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L'INVENTION: ~P62, SES VARIANTS, SEQUENCES
NUCLEIQUES ET LEURS UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 9 (iv) FORME D~l~ABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1332 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1. 1332 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC
Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gln ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA
CA 022l986l l997-ll-2l W 096l385~6 PCTAFR961'~3 2 Thr Pro Ser Arg Gln Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT
Ile Glu Lys Ile Gln Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG TTC AAT TTT GTG GGG AAG ATT
Leu Ile Pro Val Lys Gln Tyr Pro Lys Phe Asn Phe Val Gly Lys Ile CTT GGA CCA CAA GGG AAT ACA ATC AAA AGA CTG CAG GAA GAG ACT GGT
Leu Gly Pro Gln Gly Asn Thr Ile Lys Arg Leu Gln Glu Glu Thr Gly GCA AAG ATC TCT GTA TTG GGA AAG GGC TCA ATG AGA GAC AAA GCC AAG
r Ala Lys Ile Ser Val Leu Gly Lys Gly Ser Met Arg Asp Lys Ala Lys GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT
Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT
CA 022l986l l997-ll-2l W 096l38556 P~lj~h~ 2 Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA
Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC
Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gln Glu Gln Phe Leu Glu Leu Ser TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG
Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT
Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG
Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA
Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC
Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA
Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA
Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gln Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA
Gly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG
His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG
CA 022l986l l997-ll-2l 2!~
Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala. Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA. CGT TAT TAA
Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg Tyr *
~ 435 440 10 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 1215 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI--SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
tB) EMPLACEMENT:1,,1215 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC
Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg l~let Ser Arg Ser Ser Gly CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gln ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA
Thr Pro Ser Arg Gln Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys W 096/38556 P~l/~h~ 00802 ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT
Ile Glu Lys Ile Gln Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT
Leu Ile Pro Val Lys Gln Tyr Pro Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT
Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe Ile GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC
Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC
Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp Ile TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA
Cys Gln Glu Gln Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Va'l Pro Glu CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT
Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG
Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC
Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala CA 022l986l l997-ll-2l WO 96/38556 PCTII~VG~'--2 ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA
Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA
Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro l0 305 310 315 320 CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC
Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA
Ala Glu Gln Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu C,ly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT
Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gln Asp Ser TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG
Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG (,GA GCA TAC AGA GAG CAC CCA
Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro TAT GGA CGT TAT TAA
Tyr Gly Arg Tyr *
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUE:NCE:
(A) LONGUEUR: 7Z6 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1.. 726 CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCTAFR9'~ -2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG AGA GAC AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC
Met Arg Asp Lys Ala Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT
Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA
Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG
Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gln Glu CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT
Gln Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA
Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA
Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT
Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA
Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA
Ala Arg Thr Ala Gly Ile Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA
Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gln AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT/~h~ re~2 3.3 Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Asp Ser GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT
Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT
Tyr Gly Gln Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT
Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg TAT TAA
Tyr *
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
- (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQl7ENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT TGAG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
W 096/385~6 P~li~h~lC/00802 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TTAATAACGT CCATATGGGT GCTC
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CTGTCAAGCA GTATCCCAAG GAGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 p~lirh5l6c r~ C7 (A) LONGUEUR: 24 paires de bases ~B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
AAGGGCTCAA TGAGAGACAA AGCC
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide tC) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
40 GTATGTATCA TCAl'ATCCAT ATTC
Les séquences de ces amorces sont les suivantes:
oligo 5': CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID n~ 4) oligo 3': TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID n~ 5) Les réactions ont été menées à 55~C et ont donné deux produits séparés par électrophorèse sur gel d'agarose:
- une bande de 987 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de p62 W O 96/38556 PCTAFRg~ ~t - une bande de 870 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de ~p62.
- Cette dernière bande a été clonée et sa séquence correspond exactement à ia séquence de p62, exception faite d'une délétion de 1 17 paires de bases dans le domaine d'homologie à la GRP33. La séquence complète de ~p62 est présentée SEQ ID n~ 2 (voir aussi figure 1).
L'existence de cette isoforme de p62 a été confirmée par criblage d'une banque d'ADN complémentaire de placenta humain établie dans 10 le vecteur ~gt 11. L'oligonucléotide utilisé pour ce criblage est un 24-mer correspondant à la jonction spéc:ifique de la délétion présente dans Ap62. La séquence de cet oligonucléotide est:
CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID n~ 6) Exemple 2: Construction de vecteurs d'expression de ~p62 et p62-C.
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisable pour le transfert des acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
2.1. Vecteur plasmidique:
Pour la construction de vec:teurs plasmidiques, 2 types de vecteurs ont été utilisés.
- Le vecteur SV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce .~
vecteur est un vecteur d'expression eucar,vote. Les acides nucléiques - codant pour les variants p62-C et /\p62 ont été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI. Ils sont ainsi placés sous le controle du promoteur de l'enhancer du virus ',V40.
W O 96/38556 PCTA~R~ '~-2 - Le vecteur pcDNA3 (Invitrogen). Il s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants p62-C et ~p62, été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI, sont ainsi placés sous le controle du prornoteur précoce du CMV.
2.2. Vecteur Viral Selon un mode particulier, I'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivodes acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.
Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus 20 CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide 25 nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, CA 022l986l l997-ll-2l W O 96/38556 P~l/~h~ 2 substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuve~nt également être modifiées, et notamment ia région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation n préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et l'acide nucléiqlue de l'invention (Cf FR94 13355).
Dans les virus de l'invention, la delétion dans la région E1 s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants d~éfectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entrle autre la séquence d'ADN d'intérêt.
La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J.
Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les Fonctions E1 et E4 telles que décrites 30 notamment dans les demandes n~ W0 94/26914 et W095/02697.
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCTA~R96/00802 Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustrg dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN
de taille relativement réduite, qui s'intbgrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance,la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a 10 été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome,qui contient le gbne cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO
91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep eVou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV
recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain(par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique de l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293.
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT/~h~-E~2 l"
Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques ~ classiques.
Concernant les virus de l'herpes et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New E,iologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des o rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à
partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV
("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"~; le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant un acide nucléique selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ledit acide nucléique est construit, puis utilisé pour translecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861,719); la lignée PsiCRlP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer I'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag ~Bender et al., J. Virol. 61 CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT~R9''~e~2 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.
2.3. Vecteur chimique Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans o le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n,(LKKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute techniqueconnue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
W 096/38556 ~l/rr~ ~6-2 Exemple 3: Inhibition de la transactivation de R.R.E (ras responsive elements~ due aux formes oncogéniques de Ras (Figure 2) ~ Des fibroblastes NIH 3T3 ont été transfectés par un gène rapporteur, celui de la chloramphénic:ol acétyl transférase, placé sous le contrôle d'éléments de réponse à Ras dérivés de l'enhancer du virus du polyôme. Ces éléments sont stimulés de 15 à 20 fois lorsque les cellules sont cotransfectées par un vecteur d'expression portant l'ADNc de l'oncogène Middle T(MT) de SV40. Cette stimulation n'est que peu affectée lorsqu'une cotransfection apporte les vecteurs d'expression de p62-C et de Ap62 (Cf exemple 2). Lorsque la cotransfection est réalisée, non plus avec MT mais avec la forme activée de l'oncogène Ha-ras (Val 12), I'activité CAT est stirnulée de 30 à 40 fois au dessus du niveau de base. L'expression de la p62 affecte peu cette stimulation alors que p62-C et ~p62 inhibent presque totalement toute activité due au Ras oncogénique. De la meme maniere, la stimulation obtenue par cotransfection avec l'oncogène v-src est fortement inhibée par les proteines p62-C et Ap62, mais pas par la p62.
Ces expériences ont été realisées avec 0,~,ug de vecteur permettant l'expression de MT ou de Ras VAL12 ou de v-src et 4~g de vecteur d'expression portant l'ADNic de p62-C ou de Ap62. Elles démontrent clairement le pouvoir des protéines de l'invention de s'opposer aux signaux ras oncogéniqiues.
Exemple 4: Mise en évidence de la mort cellulaire induite par ~p62 - dans les fibroblastes NIH3T3 (Figure 3).
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées avec une efficacité
de 60% par ~llg de vecteur d'expression de /\p62 (exemple 2).
W 096/38556 PCTAFR~,'0~--2 24 heures après la transfection, les cellules présentent une altération importante de leur viabilité par rapport au témoin. L'analyse de leur ADN révèle après migration sur gel d'agarose des échelles de dégradation caractéristiques des phénomènes d'apoptose. Les mêmes s phénomènes sont observés lorsque p62-C est transfectée dans les mêmes conditions que Ap62.
Exemple 5: Mise en évidence de l'expression de Ap62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum (Figure 4).
o Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été mis en culture (1), traités par 0,5 1l9 d'acide okadaïque (2), traités par 10 ng/ml de PMA et par 2 ,ug de ionomycine (3), soumis à 1 ~M de staurosporine (4) ou à 2 ,ug/ml de camptotécine (5) et enfin déprivés en sérum.
L'expression des ARN messagers de p62 et de ~p62 dans ces fibroblastes et au cours de ces différents traitements a été analysée. A
chaque traitement, trois points ont été analysés. Ces points correspondent à trois temps de traitement: 6, 12 et 24 heures.
Sonde 5' spécifique de ~p62 (SEQ ID n~ 7):
CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG
Sonde 5' spécifique de p62 (SEQ ID n~ 8):
AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC
Sonde 3'commun à p62 et à Ap62 (SEQ ID n~ 9):
GTATGTATCATCATATCCATATTC
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38SS6 PCT~R96/00802 Dans les fibroblastes mis en culture en présence de 10 % de sérum de veau foetal (SVF), I'ARNrn de p62 est mis en évidence alors que l'ARNm de Ap62 n'est pas détecté même après 24h de mise en culture. La situation est la même clU cours du traitement par l'acide 5 okadaïque. En revanche, une forte induction de l'ARNm de /~p62 est observée après 6 à 12 heures de traitement par le PMA et la ionomycine. Cet ARNm est aussi détectable après addition de staurosporine et est très fortement induit après 12 heures de traitement à la camptotécine. Lorsque les fibroblastes embryonnaires sont 10 déprivés en sérum, une forte induction de Ap62 est observée en même temps qu'une disparition du messager de p62.
Ces résultats démontrent donc que l'expression de l'ARNm de Ap62 est induite au cours de certaines situations apoptotiques dans les fibroblastes.
Exemple 6: Inhibition par ~p62 de la formation de foyers induite par ras Cet exemple decrit une autre etude montrant que de Ap62 interfere avec le processus de transformation induit par les oncogenes. Plus particulierement, cet exemple demontre que ~p62 est capable d'inhiber la formation de foyers induite par differents oncogenes (ras oncogenique, v-src) dans les cellules NIH-3T3, alors que p62 n'affecte pas ce phenomene.
Des fibroblastes NIH3T3 ont été co-transfectées par 0,1 ,ug de vecteur d'expression de v-Src ou Ha-Ras Val 12 et par 4 mg de vecteur d'expression de p62, de Ap62 ou vide (exemple 2). Les cellules ont été
maintenues en milieu contenant 10 ~/O de sérum de veau nouveau-né et W O 96/38556 PCT/~K9G~ E 2 le nombre de foyer a étE déterminé après fixation et coloration des cellules en présence de phénol fuchsin. Les expériences ont été
réalisées en triple.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que Ap62 diminue le nombre de foyers induits par v-src et Ha-Ras Val12 de 50 % environ. Cet effet reflète un pouvoir antagoniste spécifique de la transformation par v-src et Ha-Ras oncogénique puisque Ap62 n'affecte pas la formation de foyers induite par v-Raf. En outre, I'effet observé
n'est pas lié a une toxicité du produit puisque le nombre de colonies 10 résistantes à la néomycine après transfection par p62, 1~p62 ou un vecteur vide est comparable. Ces résultats confirment donc le rôle inhibiteur des molécules de l'invention dans le processus de transformation induit par les oncogènes. Ces résultats confirment ainsi l'utilité de ces produits dans des approches de correction des processus de prolifération cellulaire induits par les oncogEnes, ainsi que comme outil pour l'identification d'autres molécules active et/ou impliquées dans les voies de signalisation de ces oncogènes.
Exemple 7: Mise en évidence d'une interaction avec src in vivo Cet exemple décrit l'étude de l'interaction de ~p62 avec d'autres molécules. Il démontre que p62 et ~p62 sont capables d'interagir in vivo avec src.
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées par un vecteur d'expression de p62 ou de ~\p62 comprenant un marqueur myc ("myc teg") (exemple 2). Les cellules transfectées ont été maintenues en croissance asynchrone ou bloquées en phase mitotique par traitement W O 96/38556 PCT/~K~C~ 2 par du nocodazole. Les cellules ont ensuite été co-transfectées par un - vecteur d'expression de v-Src ou vide. 48 heures après, les cellules ont été Iysées et les complexes formés ont été immunodétectés au moyen d'anticorps anti-myc (anticorps 9E1t)) et d'anticorps anti-Src (anticorps s N16).
Les résultats obtenus montrent qlue p62 et ~p62 sont capables d'interagir in vivo avec src. En outre, alors que l'interaction entre p62 et src semble se produire uniquement dans les cellules mitotiques, ~\p62 lie de manière significative Src mêrne dans les cellules asynchrones.
o Cette interaction est renforcée dans les cellules mitotiques.
CA 022l986l l997-ll-2l WO 96/38556 PcI~ ~9 r~ ~~-2 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TELEPHONE: (1) 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: ~1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L'INVENTION: ~P62, SES VARIANTS, SEQUENCES
NUCLEIQUES ET LEURS UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 9 (iv) FORME D~l~ABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1332 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1. 1332 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC
Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gln ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA
CA 022l986l l997-ll-2l W 096l385~6 PCTAFR961'~3 2 Thr Pro Ser Arg Gln Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT
Ile Glu Lys Ile Gln Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG TTC AAT TTT GTG GGG AAG ATT
Leu Ile Pro Val Lys Gln Tyr Pro Lys Phe Asn Phe Val Gly Lys Ile CTT GGA CCA CAA GGG AAT ACA ATC AAA AGA CTG CAG GAA GAG ACT GGT
Leu Gly Pro Gln Gly Asn Thr Ile Lys Arg Leu Gln Glu Glu Thr Gly GCA AAG ATC TCT GTA TTG GGA AAG GGC TCA ATG AGA GAC AAA GCC AAG
r Ala Lys Ile Ser Val Leu Gly Lys Gly Ser Met Arg Asp Lys Ala Lys GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT
Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT
CA 022l986l l997-ll-2l W 096l38556 P~lj~h~ 2 Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA
Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC
Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gln Glu Gln Phe Leu Glu Leu Ser TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG
Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT
Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG
Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA
Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC
Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA
Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA
Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gln Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA
Gly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG
His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG
CA 022l986l l997-ll-2l 2!~
Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala. Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA. CGT TAT TAA
Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg Tyr *
~ 435 440 10 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 1215 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI--SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
tB) EMPLACEMENT:1,,1215 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC
Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg l~let Ser Arg Ser Ser Gly CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gln ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA
Thr Pro Ser Arg Gln Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys W 096/38556 P~l/~h~ 00802 ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT
Ile Glu Lys Ile Gln Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT
Leu Ile Pro Val Lys Gln Tyr Pro Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT
Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe Ile GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC
Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC
Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp Ile TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA
Cys Gln Glu Gln Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Va'l Pro Glu CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT
Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG
Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC
Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala CA 022l986l l997-ll-2l WO 96/38556 PCTII~VG~'--2 ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA
Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA
Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro l0 305 310 315 320 CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC
Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA
Ala Glu Gln Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu C,ly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT
Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gln Asp Ser TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG
Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG (,GA GCA TAC AGA GAG CAC CCA
Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro TAT GGA CGT TAT TAA
Tyr Gly Arg Tyr *
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUE:NCE:
(A) LONGUEUR: 7Z6 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1.. 726 CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCTAFR9'~ -2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG AGA GAC AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC
Met Arg Asp Lys Ala Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT
Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA
Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG
Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gln Glu CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT
Gln Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA
Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA
Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT
Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA
Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA
Ala Arg Thr Ala Gly Ile Gln Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA
Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gln AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 PCT/~h~ re~2 3.3 Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Asp Ser GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT
Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT
Tyr Gly Gln Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT
Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg TAT TAA
Tyr *
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
- (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQl7ENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT TGAG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
W 096/385~6 P~li~h~lC/00802 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TTAATAACGT CCATATGGGT GCTC
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CTGTCAAGCA GTATCCCAAG GAGG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA 022l986l l997-ll-2l W 096/38556 p~lirh5l6c r~ C7 (A) LONGUEUR: 24 paires de bases ~B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
AAGGGCTCAA TGAGAGACAA AGCC
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide tC) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
40 GTATGTATCA TCAl'ATCCAT ATTC
Claims (25)
1. Dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine GAP
et p62, caractérisé en ce qu'il a perdu la capacité de p62 d'interagir avec l'ARN et en ce qu'il comporte une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP.
et p62, caractérisé en ce qu'il a perdu la capacité de p62 d'interagir avec l'ARN et en ce qu'il comporte une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP.
2. Dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il inhibe au moins partiellement les signaux transduits par ras.
3. Dérivé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33.
4. Dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n°2 ou d'un variant de celle-ci.
5. Polypeptide .DELTA.p62 de séquence SEQ ID n°2.
6. Dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
7. Dérivé selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 3.
8. Polypeptide p62-C de séquence SEC ID n°3.
9. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Acide nucléique selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc ou d'un ARN.
11. Acide nucléique selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi:
(a) tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 3 ou de leur brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon la revendication 1, (c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
(a) tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 3 ou de leur brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon la revendication 1, (c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
12. Acide nucléique de séquence SEQ ID n° 2.
13. Acide nucléique de séquence SEQ ID no3.
14. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 13, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
15. Vecteur comportant un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 13 ou une cassette selon la revendication 14.
16. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
17. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
18. Vecteur selon la revendication 17 caractérisé en ce que le vecteur viral dérive d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus AAV ou d'un virus de l'herpès.
19. Rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 13 ou une cassette selon la revendication 14.
20. Adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 13 ou une cassette selon la revendication 14.
21. Composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique selon larevendication 9.
22. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur selon la revendication 15.
23. Composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé selon la revendication 1.
24. Composition pharmaceutique selon les revendications 21 à 23 pour le traitement des cancers.
25. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 9 ou d'un vecteur selon la revendication 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
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