CA2347121A1

CA2347121A1 - Polypeptides (mbp1) capables d'interagir avec les mutants oncogeniques de la proteine p53

Info

Publication number: CA2347121A1
Application number: CA002347121A
Authority: CA
Inventors: Emmanuel Conseiller; Laurent Debussche; William Gallagher
Original assignee: Individual
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1998-10-12
Filing date: 1999-10-12
Publication date: 2000-04-20
Also published as: AU6095899A; WO2000022120A1; US20030049699A1; JP2002527063A; EP1121427A1

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la régulation du cycle cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne d e nouveaux polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de la protéine p53.

Description

POLYPEPTIDE (MBP1) CAPABLE D'INTERAGIR AVEC LES MUTANTS ONCO6ENIQUES DE LA

La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la régulation du cycle cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de la protéine p53.
La protéine p53 sauvage intervient dans la régulation du cycle cellulaire et dans le maintien de l'intégrité du génome de la cellule. Cette protéine, dont la fonction principale est d'être un activateur de la transcription de certains gènes, est susceptible de bloquer la cellule en phase G 1 du cycle cellulaire lors de l'apparition de mutations au cours de la réplication du génome, et d'enclencher un certain nombre de processus de réparation de l'ADN. Ce blocage en phase G 1 est dû
principalement à
l'activation du gène p21/WAFI. De plus, en cas de mauvais fonctionnement de ces processus de réparation ou en cas d'apparition d'évènements mutationnels trop nombreux pour être corrigés, cette protéine est capable d'induire le phénomène de mort cellulaire programmée, appelé apoptose.
De cette façon, la protéine p53 agit comme un supresseur de tumeur, en éliminant les cellules anormalement différenciées ou dont le génome a été
endommagé.
La protéine p53 comporte 393 acides aminés, qui définissent 5 domaines fonctionnels (voir Figure 1 ) - le domaine activateur de la transcription, constitué par les acides aminés 1 à
73, capable de lier certains facteurs de la machinerie générale de transcription comme la protéine TBP. Ce domaine est aussi le siège d'un certain nombre de modifications post-traductionnelles. Il est également le siège de nombreuses interactions de la protéine p53 avec de nombreuses autres protéines et notamment avec la protéine cellulaire MDM2 ou la protéine EBNAS du virus d'Epstein-Ban (EBV), capables de

2 bloquer la fonction de la protéine sauvage. De plus, ce domaine possède des séquences d'acides aminés dites PEST de susceptibilité à la dégradation protéolytique.
- le domaine de liaison à l'ADN, localisé entre les acides aminés 73 et 315.
La conformation de ce domaine central de p53 régule la reconnaissance de séquences d'ADN spécifiques de la protéine p53. Ce domaine est le siège de deux types d'altérations affectant la fonction de la protéine sauvage :
(i) l'interaction avec des protéines bloquant la fonction de la protéine p53 comme l'antigène 'grand T' du virus SV40 ou les protéines virales E6 des virus HPV 16 et HPV 18 capables de provoquer sa dégradation par le système de fubiquitine. Cette dernière interaction ne peut se faire qu'en présence de la protéine cellulaire E6ap (enzyme E3 de la cascade de fubiquitinilation).
(ü) les mutations ponctuelles qui affectent la fonction de la protéine p53 et dont la quasi-totalité observée dans les cancers humains sont localisées dans cette région.
- le signal de localisation nucléaire, constitué des acides aminés 315 à 325, indispensable au bon adressage de la protéine dans le compartiment où elle va exercer sa principale fonction.
- le domaine d'oligomérisation, constitué des acides aminés 325 à 355. Cette région 325 à 355 forme une structure de type : feuillet !3 (326-334)-coude (335-336}-hélice a (337-355). Les altérations de fonctions localisées dans cette région sont essentiellement dues à l'interaction de la protéine sauvage avec les différentes formes mutantes qui peuvent conduire à des effets variables sur la fonction de la protéine sauvage.
- le domaine de régulation, constitué des acides aminés 365 à 393, qui est le siège d'un certain nombre de modifications post-traductionnelles (glycosylations,

3 phosphorylations, fixation d'ARN,...) qui modulent la fonction de la protéine p53 de façon positive ou négative. Ce domaine joue un rôle extrêmement important dans la modulation de l'activité de la protéine sauvage.
Le fonctionnement de la protéine p53 peut être perturbé de différentes façons - par le blocage de sa fonction par un certain nombre de facteurs comme par exemple l'antigène 'grand T' du virus SV40, la protéine EBNAS du virus d'Epstein-Barr, ou la protéine cellulaire MDM2.
- par la déstabilisation de la protéine par augmentation de sa susceptibilité
à la protéolyse, notamment par interaction avec la protéine E6 des virus du papillome humain HPV 16 et HPV 18, qui favorise l'entrée de la p53 dans le cycle d'ubiquitinilation. Dans ce cas l'interaction entre ces deux protéines ne peut se faire que par la fixation préalable d'une protéine cellulaire, la protéine E6ap dont le site de fixation est mal connu.
- par des mutations ponctuelles au niveau du gène de Ia protéine p53.
- par délétion d'un ou des deux allèles de p53 Les deux derniers types de modifications sont retrouvés dans environ 50% des différents types de cancer. A cet égard, les mutations du gène de la proéine p53 repertoriées dans les cellules cancéreuses touchent une très grande partie du gène codant pour cette protéine, et ont pour résultats des modifications variables du fonctionnement de cette protéine. On peut cependant noter que ces mutations sont en grande majorité localisées dans la partie centrale de la protéine p53 dont on sait qu'elle est la région de contact avec les séquences génomiques spécifiques de la protéine p53. Ceci explique pourquoi la plupart des mutants de la protéine p53 ont comme principale caractéristique de ne plus pouvoir se fixer aux séquences d'ADN
que reconnaît la protéine sauvage et ainsi de ne plus pouvoir exercer leur rôle de facteur de transcription.

4 On regroupe actuellement l'ensemble de ces modifications dans deux catégories - les mutants dits faibles, dont le produit est une protéine non-fonctionnelle, qui, dans Ie cas de mutation sur un seul des deux allèles, n'affecte pas le fonctionnement de la protéine sauvage codée par l'autre allèle. Le principal représentant de cette catégorie est le mutant H273 spécifique du syndrome familial de Li-Fraumeni d'hypersensibilité aux affections cancéreuses.
- les mutants dominant-oncogéniques, dont le produit est une protéine qui a perdu la capacité de se lier à l'ADN et qui participe activement à la transformation néoplasique. Les mutants de cette catégorie ont perdu leur capacité
transactivatrice et sont plus stables que la protéine sauvage. Ils sont incapables d'inhiber la transformation des fibroblastes embryonnaires de rat et ils fonctionnent comme oncogènes en coopérant avec la forme activée de RAS dans la transformation de fibroblastes embryonnaires de rat (Eliyahu et al, Nature 312 ( 1984) 646 /
Parada et al, Nature 312 ( 1984) 649). Ce comportement peut être expliqué par deux mécanismes différents non exclusifs l'un de l'autre ;
(i) ces mutants génèrent une protéine non-fonctionnelle, qui, dans le cas de mutation sur un seul des deux allèles et par interaction avec la protéine sauvage, est capable de bloquer le fonctionnement de celle-ci par formation d'oligomères mixtes non-actifs qui ne peuvent plus se fixer aux séquences d'ADN
spécifiques de la protéine sauvage. Un tel mécanisme est invoqué dans le cas où l'on observe la transformation maligne des cellules après transfection des mutants en présence de p53 endogène.
(ü) ces mutants peuvent de plus présenter un phénotype "gain de fonction". Leur expression dans des cellules non tumorigènes n'exprimant pas de p53 endogène conduit à l'apparition de tumeurs chez la souris athymique (Dittmer et al, Nature Genetics 4 { 1993) 42). Ces mutants sont capables d'activer la trancription des gènes comme MDR ou PCNA n'ayant pas de séquences consensus reconnues par p53 ; activation qui se fait probablement par recrutement des facteurs de transcription spécifiques des mutants et qui peut participer à l'apparition du phénotype tumoral (Chin et a1, Science 255 ( 1992} 459; Deb et al, J. Virol. 66 ( 1992) 6164).
Enfin, il a été rapporté récemment que ces mutants peuvent perturber l'attachement de certaines

5 régions de l'ADN (MAR/SAR) au réseau de la matrice nucléaire (Müller et al, Oncogene 12 ( 1996) 1941 ).
De nombreux partenaires cellulaires ont été décrits pour la protéine p53.
Certains intéragissent aussi bien avec les conformations sauvage et mutées de la protéine et d'autres sont spécifiques de l'une ou l'autre des conformations (Iwabuchi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6098). I1 est concevable que certaines de ces propriétés 'gain de fonction' puissent être médiées par des partenaires protéiques spécifiques des mutants de p53, cependant de tels partenaires n'ont encore jamais été
identifiés. L'identification de tels partenaires permettrait de nouvelles approches dans les thérapies anti-cancéreuses basées sur la modification ou le contrôle de ces interactions et sur l'obtention de composés capables d'interférer dans l'interaction de ces partenaires protéiques avec les différentes formes de p53. La présente invention satisfait ce besoin et apporte en outre d'autres avantages.
Dans le but d'étudier ce phénotype "gain de fonction" susceptible d'impliquer des interactions protéine-protéine spécifiques de ce type de mutant, le système double-hybride a été utilisé pour rechercher des partenaires spécifiques du mutant H 175, principal représentant de cette catégorie de mutants. Une banque de cDNA
d'embryon de souris, fusionnée à la séquence du domaine de transactivation de (TA), a été criblée dans la souche de levure YCM 17 en utilisant comme protéine appât le domaine 73-393 du mutant H 175 fusionné au domaine de liaison à l'ADN
de Gal4 (DB). Ce criblage a permis d'isoler deux cDNA codant pour deux protéines différentes : la protéine MBP 1 et la Fibuline-2..
Les interactions entre ces deux protéines et le mutant H 175 de la protéine p53 ont pu être confirmées en cellules mammifères et des effets fonctionnels ont pu être

6 démontrés, aussi bien sur des propriétés de la forme mutée de la p53 que sur des propriétés de la forme sauvage.
La présente invention résulte donc de la mise en évidence par la demanderesse de nouveaux polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec différentes formes de la protéine p53. Plus précisément la présente invention résulte de l'identification, l'isolement et la caractérisation d'une nouvelle protéine et du gène correspondant, la dite protéine étant caractérisée en ce qu'elle est capable d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53 et avec les mutants H175 et 6281 en particulier. Cette protéine est appelée MBP 1 pour p53 Mutant Binding Protein. La présente invention résulte également de la mise en évidence qu'une autre protéine, la fibuline2, est capable d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53 et avec les mutants H I 75 et G28I en particulier.
La présente invention résulte également de la découverte des propriétés particulières de ces nouveaux partenaires protéiques de p53 qui de manière inattendue s'avèrent également être capables de bloquer les effets anti-prolifératifs de la forme sauvage de p53.
Ces nouveaux partenaires protéiques de p53 présentent en outre une synergie d'action très importante avec les mutants oncogéniques de p53, cette synergie s'exerce aussi bien pour la coopération oncogénique avec la forme activée de la protéine Ras que sur l'effet prolifératif des formes mutées de p53.
De plus et indépendamment de toute interaction avec p53, ces polypeptides présentent un effet positif sur la croissance cellulaire. En outre, un de ces partenaires, la protéine MBP1, présente les caractéristiques d'un oncogène immortalisant en coopérant avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
De part la spécificité et les effets synergiques que présentent ces nouveaux partenaires de p53 vis à vis de certaines formes mutées de p53, ces polypeptides constituent une cible thérapeutique de choix pour le traitement des cancers liés aux

7 mutations de la protéine p53.
En outre, ces polypeptides qui présentent des propriétés oncogéniques intrinsèques, constituent de nouvelles cibles potentielles pour le traitement du cancer en général.
Un premier objet de l'invention concerne donc des polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53. Ces polypeptides sont en outre capables de stimuler la croissance cellulaire et de bloquer les effets anti-prolifératifs de la forme sauvage de p53.
Selon un premier mode de réalisation, ces polypeptides comprennent tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID
N° 9 (fragment C-terminal de MBP 1 mucine) ou SEQ ID N° I 6 (MBP I mutine) ou un dérivé de celles-ci.
Selon un autre mode de réalisation, ces polypeptides comprennent tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID
N°31 (fragment C-terminal MBP I humaine) ou SEQ ID N°22 (MBP I humaine) ou un dérivé de celles-ci.
Enfin selon encore un autre mode de réalisation, ces polypeptides comprennent tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N° 33 (fragment C-terminal Fibuline-2 mutine) ou un dérivé de celle-ci.
De manière préférée les polypeptides de l'invention sont représentés par la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou ses dérivées Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant de la séquence considérée, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui de modifier leurs propriétés de liaison au formes mutées oncogéniques de p53, ou d'augmenter leur éfficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne les séquences polypeptidiques qui présentent des fonctions biologiques comparables à celles des polypeptides selon l'invention et notamment la capacité à interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53 et qui présentent un degré d'identité d'au moins 80 et de préférence au moins 90 % avec la séquence polypeptidique SEQ ID
N° 16 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou la séquence polypeptidique SEQ
ID N°33.
De préférence, les séquences polypeptidiques selon l'invention présentent au moins 95 % et de préférence encore au moins 97 % d'identité avec la séquence polypeptidique SEQ ID N° 16 ou la séquence polypeptidique SEQ ID
N°22 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°33.
De manière plus particulièrement préférée, les séquences polypeptidiques selon l'invention présentent au moins 98 % d'identité et de préférence encore au moins 99 % d'identité avec la séquence polypeptidique SEQ ID N° 16 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou Ia séquence polypeptidique SEQ
ID N°33.
Le terme séquence polypeptidique dérivée comprend également les fragments des séquences polypeptidiques indiquées ci-dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de (homme du métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de l'homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
Un autre objet de la présente invention concerne les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 15, SEQ ID N°21 et SEQ ID N°32 codant respectivement pour les séquences polypeptidiques présentées dans les séquences SEQ ID N° 16, ou SEQ ID
N°22 ou SEQ ID N°33.
Selon un mode particulier de l'invention, les séquences nucléotidiques comprennent tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 15 ou SEQ ID
N° 21 ou de leurs dérivées.
Selon un autre mode de l'invention, les séquences nucléotidiques comprennent tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 32 (cDNA
correspondant au fragment C-term de fibuline-2 murine) ou de ses dérivées.
Selon encore un autre mode, les séquences nucléotidiques comprennent la séquence SEQ ID N°23(cDNA MBPI murine , séquence partielle), ou la séquence SEQ ID N°30 (cDNA correspondant au fragment C-term de MBP1 humaine).
Selon un mode préféré, la séquence nucléotidique est représentée par la séquence SEQ ID N° 21 ou ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide selon l'invention. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs 5 résidus.
Le terme séquence nucléotidique dérivée comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes.
A cet égard la présente invention concerne toute séquence nucléotidique qui 10 présente au moins 70 % d'identité et de préférence au moins 85 % d'identité
avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 ou la séquence nucléotidique SED ID
N° 15 ou la séquence nucléotidique SEQ ID N°32.
De préférence, la séquence nucléotidique selon l'invention présente au moins 90 % et de préférence encore au moins 93 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 ou la séquence nucléotidique SED ID N°
15 ou la séquence nucléotidique SEQ ID N°32.
De manière plus particulièrement préférée, les séquences selon l'invention présentent au moins 95 % et de préférence encore 97 %, voire 98 % ou même 99 d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 ou Ia séquence nucléotidique SED ID N° 15 ou la séquence nucléotidique SEQ ID N°32.
De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d',hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation.

Un autre objet de l'invention concerne des séquences nucléotidiques capables de s'hybrider dans des conditions de stringence élevée avec les séquences nuciéotidiques définies ci-avant.
A cet égard, le terme condition de stringence élevée signifie que l'hybridation se produit si les séquences nucléotidiques présentent au moins 95 % et préférentiellement au moins 97 % d'identité.
Comme indiqué ci-avant, de telles séquences peuvent être notamment utilisées comme sondes de détection avec du RNA ou du cDNA ou du DNA
génomique pour isoler des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides selon l'invention. De telles sondes ont généralement au moins 15 bases. De préférence, ces sondes font au moins 30 bases et peuvent avoir plus de 50 bases. De manière préférée, ces sondes ont entre 30 et 50 bases.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN
(banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent être préparées â
partir de cellules de différentes origine par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucIéotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Au sens de la présente invention la dénomination formes oncogéniques ou forme mutées oncogéniques de p53 désigne les mutants dominant-oncogéniques, dont le produit est une protéine qui a perdu la capacité de se lier à l'ADN et qui participe activement à la transformation néoplasique. Les mutants de cette catégorie ont perdu leur capacité transactivatrice et sont plus stables que la protéine sauvage.
Les représentants de cette catégorie de mutants de p53 sont notamment les formes mutantes H 175, 6281, W248, et A 143.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif.
Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules d'insectes (SF9 ou SF21), les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes pour l'expression des acides nucléiques de l'invention ainsi que la production des protéines dérivées de ceux-ci.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID
N°I5, N°21, N°32, N°23 et N° 30 pour la production des poIypeptides selon l'invention.
Une autre application des séquences d'acides nucléiques selon l'invention est Ia réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant la traduction en protéine.
L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement , l'expression de polypeptides capables d'interagir avec la p53 comme la protéine MBP1 ou la fibuline2. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant et peuvent être obtenus par fragmentation, etc. ou par synthèse chimique.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour le transfert et la production in vitro, in vivo ou ex vivo de séquences antisens ou pour l'expression de protéines ou de polypeptides capables d'interagir avec la protéine p53.

A cet égard les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vitro, in vivo ou ex vivo.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant une séquence nucléotidique définie ci-avant. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou .tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant etc. II s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés, virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant ou des ARNm correspondants. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection des polypeptides selon l'invention et notamment de la protéine MBP1 humaine ou de la fibuline 2. Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent ausi être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour les polypeptides tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiéllement de cellules d'origines humaines. Les sondes de (invention comportent généralement au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 15 nucléotides, et de préférence encore au moins 20 nucléotides. Préférentiellement, ces sondes sont marquées préalablement à leur utilisation. Pour cela, différentes techniques connues de (homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc).
L'invention concerne également l'utilisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques codant 5 pour la protéine MBP 1 pour la réalisation de test de diagnostic de tissus cancéreux .
basés sur la detection du niveau d'expression de MBP1. A titre d'exemple de sondes nucléotidiques utilisables pour cette application, on peut citer notamment les séquences SEQ ID N°27 et SEQ ID N°28. Ces sondes nucléotidiques permettent de détecter l'amplification de l'expression de la protéine MBP1. Ces sondes peuvent être 10 des sondes ARN ou ADN. La présente invention met en évidence qu'une amplification de l'ARN messager codant pour la protéine MBP 1 humaine peut-être décelée dans certains types de tumeurs humaines et notamment dans le cas de cancers du colon. A cet égard, l'invention concerne également un procédé de diagnostic du cancer comportant le fait de détecter l'amplification de l'expression du gène codant 15 pour la protéine MBPI humaine.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par 'immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N°9 (fragment C-terminal MBP1 murine) ou SEQ ID
N°31 (fragment C-terminal MBP 1 humaine) ou les séquences polypeptidiques SEQ ID
N°22 (MBP I humaine) ou SEQ ID N°33 (fragment C-term Fibuline-2) ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps.
Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art.
L'invention a également pour objet des anticorps simple chaîne ScFv dérivés des anticorps monoclonaux définis ci-avant. De tel anticorps simple chaîne peuvent être obtenus selon les techniques décrites dans les brevet US 4,946,778, US
5,132,405 et US 5,476,786.
Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et/ ou révéler l'interaction entre la p53 et les polypeptides tels que définis ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en évidence et/ou l'isolement de ces composés, peut-être réalisée selon les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de s'opposer ou de bloquer l'activité de stimulation de la croissance cellulaire des polypeptides selon l'invention et notamment de la protéine MBP

humaine ou Fibuline 2 ou des fragments dérivés de ces protéines. Ces molécules sont également susceptibles de présenter des propriétés anti-cancéreuses et de s'opposer à
la fonction d'oncogènes immortalisants que présentent MBP 1 ou les polypeptides dérivés de MBP 1 qui coopèrent avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne (utilisation d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands sont en effet susceptibles de traiter certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire et notamment les cancers.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les formes mutées oncogènes de p53 et les polypeptides selon l' invention.
La mise en évidence etlou l'isolement de modulateurs ou de ligands capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les formes mutées oncogènes de p53 et les polypeptides selon l'invention, peut-être réalisée selon les étapes suivantes - on réalise la liaison d'une forme mutée de p53 ou d'un fragment de celle-ci à
un polypeptide selon l'invention ; il peut s'agir des formes mutées de p53 telles que H 175, 6281, W248, ou A 143 ou d'un fragment de celles-ci, il s'agit préférentiellement de la forme H175 ou encore de la forme 6281.
- on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la forme mutée de p53 et les polypeptides selon l'invention ;
- on détermine si la forme mutée de p53 ou les polypeptides selon l'invention sont déplacés de la liaison ou empêchés de se lier ;
- on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la forme mutée de p53 et les polypeptides selon l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de (interaction entre les formes mutées de p53 et les polypeptides de l'invention. Toujours selon un mode particulier, l'invention fournit un procédé d'identificatïon de molécules capables de bloquer l'interaction entre les formes mutées de p53 et la protéine MBP1 humaine ou fibuline 2 humaine. Un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de s'opposer aux effets de l'action des polypeptides selon l'invention avec les formes mutées de p53. En particulier de tels composés sont susceptibles de prévenir la coopération oncogénique entre la protéine MBP 1 et les formes mutantes oncogéniques de p53 telle notamment H 175.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié etlou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs sont en effet susceptibles de traiter certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire et notamment des cancers.
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. Il est en effet possible, à
partir des motifs protéiques actifs décrits dans la présente demande, de réaliser des molécules inhibitrices de l'interaction de MBP 1 ou de la fibuline2 avec les formes mutées oncogéniques de p53, ces molécules étant non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide de l'invention tel que décrit ci-avant pour la préparation de molécules non-peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité et reproduction de ces éléments par des structures non-peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon l'un et/ou l'autre des procédés décrit ci-avant, et/ou au moins un anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou un oligonucléotide antisens, et/ou un composé non exclusivement peptidiques tels que décrits ci-avant.
Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'interaction des formes mutées oncogènes de p53 avec les polypeptides MBP 1 ou Fibuline 2 et de ce fait peuvent être utilisées pour moduler la prolifération de certain type cellulaires. Plus particulièrement ces compositions pharmaceutiques sont destinées au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire et notamment au traitement des cancers. II s'agit en particulier des cancers associés à la présence de mutants oncogéniques de p53.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures Figure I . Domaines fonctionnels de la protéine p53 sauvage. TA : Domaine activateur de la transcription; DNB : domaine de liaison à l'ADN; NLS : signal de localisation nucléaire; OL : domaine d'oligomérisation;1ZEG : domaine de régulation.
Figure 2 : Interaction entre la protéine C-mbp I et les protéines p53 et H 175 en cellules mammifères.
Figure 3 : Interaction entre la protéine C-fibulin2 et les protéines p53 et H
175 en cellules mammifères.
Figure 4 : Comparaison des séquences protéiques codées par les ADNc mMBP I
(mucine) et hMBP 1 (humaine).
Figure 5 : Effets comparés des protéines C-mbp 1 et MBP 1 mucine sur la croissance cellulaire de cellules tumorales.
Figure 6 : Expression de l'ARNm codant pour la protéine MBPI chez la souris.
5 Figure 7 : Expression de l'ARNm codant pour la protéine MBPI dans différents tissus humains.
Figure 8 : Expression de l'ARN messager codant pour la protéine MBP 1 humaine dans des tumeurs du colon.
Exemple 1 - Construction des différents fragments nucléotidiques nécessaires au criblage 1-a - Construction du cDNA codant pour la p53 sauvage humaine Le gène de la p53 humaine a été cloné par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur de l'ADN d'une banque de placenta humain (Clontech) en utilisant les oligonucléotides 5'-1 et 3'-393.
Oligonucléotide 5'-1 (SEQ ID N° 1) AGATCTGTATGGAGGAGCCGCAG
Oligonucléotide 3'-393 (SEQ ID N° 2) AGATCTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Ce produit a ensuite été cloné directement après PCR dans le vecteur pCRII
(Invitrogène).
1-b - Construction des cDNA codant pour les différentes formes mutées de la p53 humaine I-b.(i) - Construction du cDNA codant pour ie mutant H175 de la p53 humaine Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 175 de la protéine p53 humaine (Arginine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN
de~
p53 (décrit dans l'exemple I-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H 175 de séquence Oligonucléotide H 175 3' (SEQ ID N° 3) GGGGCAGTGCCTCAC
Ce fragment a été désigné H 175.
1-b. (ü) - Construction du cDNA codant pour le mutant W248 de la p53 humaine Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 248 de la protéine p53 humaine (Arginine -> Tryptophane) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN
de p53 (décrit dans l'exemple I-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide W248 de séquence Oligonucléotide W248 3' (SEQ ID N° 4) GGGCCTCCAGTTCAT
Ce fragment a été désigné W248.
I-b (iii) - Construction du cDNA codant pour le mutant H273 de la p53 humaine Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur (acide aminé 273 de la protéine p53 humaine (Aspartate -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN
de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H273 de séquence WO 00/22120 PC'T/FR99/02465 Oligonucléotide H273 3' (SEQ ID N° 5) ACAAACATGCACCTC
Ce fragment a été désigné H273.
1-b (iv) - Construction du cDNA codant pour le mutant 6281 de la p53 humaine Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 281 de la protéine p53 humaine (Asparagine -> Glycine) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN
de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide 6281 de séquence Oligonucléotide 6281 3' (SEQ ID N° 6) GCGCCGGCCTCTCCC
Ce fragment a été désigné 6281.
1-c - Construction des cDNA codant pour les fragments 73-393 de la p53 humaine sauvage et du mutant H175 1-c (i) - Construction du cDNA codant pour le fragment 73-393 de la p53 humaine sauvage Cet exemple décrit la construction d'un cDNA codant pour les acides aminés 73 à 393 de la protéine p53 humaine sauvage (73-393wt).
Ce cDNA a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) avec l'oligonucléotide 3'-393 (SEQ ID
N° 2) et l'oligonucléotide 5'-73 suivant S'-73 (SEQ ID N° 7) AGATCTGTGTGGCCCCTGCACCA

I-c (ü) - Construction du cDNA codant pour le fragment 73-393 du mutant Cet exemple décrit la construction d'un cDNA codant pour les acides aminés 73 à 393 du mutant H 175 de la protéine p53 humaine (73-393H 175).
Ce cDNA a été obtenu par réaction d'amplification en chaire (PCR) sur l'ADN du mutant (décrit dans l'exemple I-b) avec les oligonucléotides 3'-393 (SEQ ID
N° 2) et 5'-73 (SEQ ID N° 7).
Exemple 2 - Construction des vecteurs d'expression dans la levure des fragments 73-393wt et 73-393H175 fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4 et des différentes formes de la p53 humaine entière (sauvage et mutée) fusionnées au domaine d'activation de la transcription de la protéine Gal4 Cet exemple décrit la construction de vecteurs permettant l'expression dans la levure des fragments 73-393wt et 73-393H175 sous forme d'une fusion avec le domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4 (DB) de la levure S. cerevisiae pour leur utilisation dans le système double-hybride et pour le criblage de banques de cDNA fusionnés au domaine d'activation de la transcription (transactivateur) de la même protéine Gal4 (TA).
2-a - Construction des vecteurs d'expression de levure des fragments 73-393wt et 73-393H175 fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4 Les fragments 73-393wt et 73-393H175 ont été clonés dans le vecteur pPC97 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ( 1992) 5789) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.
Les produits de ces constructions portent les noms suivants:

73-393wt dans pPC97 --> (plasmide pMA 1 ) --> DB-wt 73-393H 175 dans pPC97 --> (plasmide pEC 16)--> DB-H 175 2-b - Construction des vecteurs d'expression de levure des différentes formes de la p53 humaine entière (sauvage et mutée) fusionnées au domaine d'activation de la transcription de la protéine Gal4 Les différentes formes de la p53 humaine entière (sauvage et mutée) ont été
clonés dans le vecteur pPC86 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ( 1992) 5789) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.
Les produits de ces constructions portent les noms suivants:
p53 dans pPC86 --> (plasmide pEC 10)--> TA-wt H 175 dans pPC86 --> (plasmide pEC20)--> TA-H 175 H273 dans pPC86 --> (plasmide pEC87)--> TA-H273 6281 dans pPC86 --> (plasmide pEC88)--> TA-G28I
Exemple 3 - Clonage par le système double-hybride des partenaires de la protéine H175, et caractérisation de cette interaction en terme de spécificité
dans la levure Cet exemple décrit l'obtention des partenaires de la protéine H175 par le système double-hybride en utilisant la banque de cDNA d'embryon de souris pPC67 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ( 1992) 5789}, et la caractérisation, à
l'aide du même système double-hybride, de ces partenaires en terme de spécificité
d'interaction avec les différentes formes de la protéine p53 humaine (sauvage et mutée).
3-a - Isolement des partenaires de la protéine H175 3-a (i) - Génotype de la souche YCM 17 La souche YCM17 utilisée pour l'isolement des partenaires et pour la caractérisation de leur interaction avec les différentes formes de la protéine p53 humaine par le système double-hybride est une souche de levure du genre Saccharomyces cerevisiae qui possède le génotype suivant:
5 MATa, ~gal4, ~ga180, lys2, his3, trpl, leu2, ade2, ura3, canl, metl6:: URA3 pGALI-.
10 LacZ.
Cette souche de levure permet de détecter une réponse positive en système double-hybride par l'apparition du phénotype Ura+ et/ou du double phénotype Ura+/LacZ+, 10 3-a (ü) - Génotype de la souche TG 1 La souche TG1 utilisée pour la puri5cation des ADN plasmidiques est une souche de bactérie du genre E.coli qui possède le génotype suivant:
supE, hsdDS, thi, D(lac-proAB), F'[tra D36 proA+B+ lacIq lacZDMlS]
3-a (iii) - Construction de la souche YMA1 15 La souche YCM17 a été transformée par la méthode de Gietz et al (Yeast 11 (1995) 355) avec 1 ~g du plasmide pMA 1 permettant ainsi l'obtention de la souche YMA

qui exprime la protéine DB-H 175.
3-a (iv) - Isolement des partenaires de la protéine H 175 La souche YMA 1 a été transformée par la même méthode que celle utilisée dans 20 l'exemple C 1.3 en utilisant 100pg d'ADN de la banque pPC67, permettant l'obtention de 3,5.10' transformants parmi lesquels 404 présentent le phénotype Ura+
et 14 le double phénotype Ura+/LacZ+.
L'ADN plasmidique contenu dans les 14 clones présentant le double phénotype Ura+/LacZ+ a été isolé par la méthode de Ward (Nucl. Acids Res. 18 ( 1990}
5319) avant d'être utilisé pour transformer la souche TG 1. Les plasmides correspondants issus de la banque ont ensuite été purifiés et regroupés en deux sous-groupes de plasmides différents contenant chacun un cDNA codant pour deux protéines différentes:
- un cDNA codant pour la partie C-terminale (SEQ ID N° 8) d'un nouveau gène.
- un cDNA codant pour la partie C-terminale de la fibuline 2 marine (acides aminés 863 à 1195 (SEQ ID N° 32)) (Pan et al, J. Cell. Biol. 123 (1993) 1269).
Les protéines codées par ces deux cDNA sont appelées respectivement C-mbp 1 (mbp - 'p53 Mutant Binding Protein') et C-fibuline2, les protéines de fusion avec le domaine d'activation de la transcription de Gal4 sont nommées TA-C-mbpl et TA-C
fibuline2 et les plasmides correspondants sont nommés TA -C-MBP 1 et TA-C-FIB2 3 - b - Caractérisation de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-~buline2 et la protéine H175 dans la levure 3 - b (i) - Caractérisation de la spécificité de l'interaction entre la protéine DB-H 175 et les protéines TA-C-mbp 1 et TA-C-fibuline2 Dans le but de tester la spécificité des interactions décrites dans l'exemple 3-a (iv), les plasmides pPC86, TA-C-MBP1 et TA-C-FIB2 ont été réintroduits dans la souche YCM17 par co-transformation avec différents plasmides : le plasmide pPC97 codant pour la protéine DB, le plasmide pMA I codant pour la protéine DB-H 175, le plasmide pEC 10 codant pour la protéine DB-wt et le plasmide pPC76 codant pour une protéine de fusion entre le domaine de liason à l'ADN de la protéine Gal4 et un fragment de la protéine Fos humaine (acides aminés 132 à 211 ) (Chevray et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89 ( 1992) 5789) (DB-Fos). Après la co-transformation, les différents clones obtenus ont été testés pour les phénotypes associés aux gènes URA3 et LacZ

Les résultats de cette expérience sont présentés dans Ie Tableau 1.
TA TA-C-mbp 1 TA-C-fibuline2 DB Ura - / LacZ- Ura - / LacZ- Ura - / LacZ-DB-H 175 Ura - / LacZ- Ura + I LacZ+ Ura + I LacZ+
DB-wt Ura - / LacZ- Ura - / LacZ- Ura - / LacZ-DB-Fos Ura - / LacZ- Ura - / LacZ- Ura - / LacZ-Tableau l: Spécificité de l'interaction entre la protéine DB-H175 et les protéines TA-C-mbp 1 et TA-C-fibuline2 Ces résultats montrent que l'interaction entre la protéine DB-H175 et les protéines TA-C-mbp 1 et TA-C-fibuline2 est spécifique et qu'une telle interaction ne peut être obtenue ni avec la protéine DB seule, ni avec la protéine DB-wt ni avec Ia protéine contrôle DB-Fos.
3-b (ü} - Construction de protéines de fusion entre le domaine liaison à l'ADN
de Gal4 et les protéines C-mbpl et C-fibuline2 Les cDNA codant pour C-mbp i et C-fibuline2 ont été extraits des plasmides TA-C-MBP 1 et TA-C-FIB2, puis clonés dans le vecteur pPC97 en utilisant Ies sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Sal I et Not I.
Les protéines de fusion avec le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 ainsi obtenues sont appelées respectivement DB-C-mbp 1 et DB-C-fibuline2 et les plasmides correspondants DB-C-MBP 1 et DB-C-FIB2.

3-b (iii) Caractérisation de la spécificité de l'interaction entre les DB-C-mbpl et DB-C-fibuline2 et les protéines TA-H 175 et TA-6281 Dans le but de vérifier que l'interaction potentielle entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et la protéine H175 n'est pas un artefact dû à la fusion de l'un ou l'autre des partenaires avec l'un ou l'autre des domaines de Gal4, et de confirmer la spécificité de l'interaction avec la forme mutante de la protéine p53, une nouvelle expérience d'interaction dans la levure a été effectuée en utilisant des fusions différentes de celles de l'exemple 3-b (i).
Dans cette expérience, les protéines DB-C-mbp 1 et DB-C-fibuline2 ont été
testées contre les fusions du domaine d'activation de la transcription de Gal4 avec les formes entières de la protéine p53 (sauvage ou mutante) décrites dans l'exemple 2-b, en utilisant une souche de levure différente de la souche YCM17, la souche (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789).
Les résultats de cette expérience sont présentés dans le Tableau 2.
TA TA-wt TA-H175 TA-H273 TA-6281 DB LacZ - LacZ - LacZ - LacZ - LacZ -DB-C-mbp 1 LacZ - LacZ - LacZ + LacZ - LacZ +
DB-C- LacZ - LacZ - LacZ + LacZ - LacZ +
fibuline2 Tableau 2: Spécificité de l'interaction entre les protéines DB-C-mbpl et DB-C-fibuline2 et les protéines TA-H 175 et TA-6281 Ces résultats permettent d'une part de confirmer l'interaction observée lors du criblage. D'autre part, ces résultats mettent en évidence, Ia spécificité de l'interaction entre les protéines C-mbp 1 et C-Rbuline2 et certaines formes mutées de la protéine p53. En ce qui concerne cette spécificité, il est intéressant de noter, que ces protéines n'interagissent pas avec le mutant H273. En effet, ce mutant présente une conformation équivalente à celle de la protéine p53 sauvage car il est reconnu par l'anticorps PAb 1620 qui est spécifique de la forme sauvage et pas par l'anticorps PAb 240 qui est spécifique de la forme mutée (Medcalf et al, Oncogene 7 (1992) 71).
Ainsi, l'ensemble des données obtenues dans la levures montrent clairement que les deux protéines C-mbp I et C-fibuline2 sont des partenaires potentiels spécifiques des mutants oncogéniques de la protéine p53.
Exemple 4 - Interaction entre les protéines C-mbpl, C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères Cet exemple décrit la construction de plasmides pour l'expression des différentes protéines en cellules mammifères et la caractérisation de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de Ia protéine p53 en cellules mammifères.
4-a Construction des plasmides d'expression des différentes protéines en cellules mammifères 4-a (i) Construction du vecteur d'expression pBFA 107 Cet exemple décrit la construction d'un vecteur permettant l'expression dans des cellules mammifères de protéines portant une étiquette dérivée de la protéine c-myc (acides aminés 410-4I9) et reconnue par l'anticorps 9E10 (Oncogene Science).
Cette construction a été effectuée en utilisant comme vecteur de base le vecteur d'expression mammifère pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IItL Press, Oxford, Washington DC, 1985.
Le cDNA comprenant la séquence codant pour l'étiquette c-myc ainsi qu'un multisite de clonage (MCS) a été construit à partir des 4 oligonucléotides suivants c-myc 5' (SEQ ID N° 10):
GATCCATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGA
c-myc 3' (SEQ ID N° 11 ):
GATCTCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATG
5 MCS 5' (SEQ ID N° 12):
GATCTCGGTCGACCTGCATGCAATTCCCGGGTGCGGCCGCGAGCT
MCS 3' {SEQ ID N° 13):
CGCGGCCGCACCCGGGAATTGCATGCAGGTCGACCGA
Ces quatre oligonucléotides présentent des complémentarités deux à deux (c-10 myc 5' / c-myc 3', MCS 5' / MCS 3') et des complémentarités chevauchantes (c-myc 3' / MCS 5') permettant l'obtention de la séquence nucléotidique désirée par simple hybridation et ligation. Ces oligonucléotides ont été phosphorylés à l'aide de la T4 kinase, puis hybridés tous ensemble et insérés dans le vecteur d'expression pSV2 préalablement digéré par les enzymes de restriction Bgl II et Sac I. Le vecteur 15 résultant est le vecteur pBFA 107.
4-a (ü) - Construction des plasmides d'expression des protéines C-mbpl et C-fibuline2 étiquetées 20 Les cDNA codant pour les protéines C-mbp 1 et C-fibuline2 ont été extraits des plasmides TA-C-MBP1 et TA-C-FIB2 et clonés dans le vecteur d'expression mammifère pBFA 107 en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Sal I et Not I. On obtient ainsi les plasmides pBFA107-C-MBP1 et pBFA 107-C-FIB2 4-a (iii) Construction des plasmides d'expression des différentes formes de la protéine p53 Les cDNA codant pour les différentes formes de la protéine p53 (wt, H175, H273 et 6281 ) ont été insérés dans les vecteurs d'expression pSV2 et pcDNA3 (Invitrogen) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.
4 b - Interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères Cet exemple décrit la mise en évidence dans des cellules mammifères de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53. Ces expériences ont été effectuées par transfection transitoire et co-immunoprécipitation dans les cellules H1299 (cellules tumorales de type 'Non Small Cell Lung Cancer') déficientes pour les deux allèles de la protéine p53 (Mitsudomi et al, Oncogene 1 ( 1992) 171 ).
Les cellules (10~) sont ensemencées dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre contenant 8 ml de milieu DMEM (Gibco BItL) additioné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur, et cultivées sur la nuit dans un incubateur à COZ
(5%) à 37°C. Les différentes constructions sont alors transfectées en utilisant la lipofectAMINE (Gibco BRL) comme agent de transfection de la façon suivante: 6 pg de plasmide total (3 pg de chaque plasmide codant pour chacun des deux partenaires) sont incubés avec 20 ul de lipofectAMINE (Gibco BRL) pendant 30 min avec 3 ml de milieu Opti-MEM (Gibco BRL) (mélange de transfection). Pendant ce temps, les cellules sont rincées deux fois au PBS puis incubées 4 h à 37°C avec le mélange de transfection, après quoi celui-ci est aspiré et remplacé par 8 ml de milieu DMEM
additionné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et les cellules remises à pousser à 37°C.
Vingt quatre heures après la transfection, les cellules sont lavées une fois en PBS puis grattées, lavées de nouveau deux fois en PBS et remises en suspension dans 200p1 de tampon de lyse (HNTG: Hepes 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, Triton X-100 1%, glycérol 10%) additionné d'inhibiteurs de protéases (Aprotinine 2 pg/ml, pepstatine 1 pg/ml, leupeptine 1 ~,g/ml, E64 2 p.g/ml et Pefabloc 1 mM), incubées 30 min à 4°C et centrifugées 15 min à 15.000 rpm et 4°C. L'extrait cellulaire ainsi obtenu est soumis à une étape de 'pré-clearing' par incubation lh à 4°C
avec 16u1 d'un sérum de lapin pré-immun, puis 30 min à 4°C avec 200p1 d'immunoprecipitin (Gibco BRL) préparée selon les recommandations du fournisseur. Par la suite, l'extrait cellulaire ainsi nettoyé est séparé en 3 lots égaux dont chacun est incubé la nuit à 4°C avec un anticorps différent; 3 pg d'anticorps 9E10 (anti myc), 1 ug d'anticorps DO1 (anti p53) (Oncogene Science) et 1 p.g d'anticorps PAb416 (anti SV40 T-Ag utilisé comme anticorps contrôle) (Oncogene Science). Ce mélange [extrait cellulaire/anticorps) est ensuite additionné de 30p,1 d'immunoprecipitin et incubé 30 min à 4°C avant d'être centrifugé 30 sec à 15.000 rpm. Le culot contenant l'immunoprecipitin est ensuite lavé deux fois par 1 ml de tampon HNTG
additionné
d'inhibiteurs de protéases, puis resuspendu dans 30 ~.1 de tampon de dépot sur gel d'acrylamide (Laemmli, Nature 227 (1970) 680) et incubé S min à 95°C.
Après centrigugation 15 sec à 15.000 rpm, les surnageants sont déposés sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant (Novex) et les protéines séparées en utilisant le système de migration XCell II (Novex) suivant les recommandations du fournisseur, puis transférées sur membrane de PVDF (NEN Life Science Products) à l'aide du même système XCell II.
Les anticorps 9E10 et DOI utilisés pour la révélation des protéines transférées sont couplés à la biotine LCnHS (Pierce) suivant les recommandations du fournisseur.
Les membranes de transfert sont tout d'abord incubées 1 h à 4°C
dans 10 ml de tampon TTBSN (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCI ISO mM, NaN3 0,02%, Tween 20 0,1%) additionné de 3% d'albumine bovine sérique (BSA) (TTBSN-BSA), puis 2 h à
température ambiante avec 10 ml d'une solution de TTBSN-BSA contenant l'anticorps 9E10 hiotinylé (1 ug/ml). Après 6 lavages par 10 ml de tampon TTBSN, les membranes sont ensuite incubées 1 h à température ambiante avec 10 ml d'une solution de TTBSN-BSA contenant de l'ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma Immuno Chemicals) au I/5000', lavées de nouveau 6 fois au TTBSN et traitées au réactif ECL
(Amersham) pour la révélation des protéines par chemiluminescence. Les mêmes membranes sont ensuite traitées par l'anticorps DO1 biotinylé après avoir été
préalablement deshybridées (Ellis et al, Nature 343 (1990) 377) et en suivant le même protocole que pour l'anticorps 9E10.
4 - b (i) - Interaction entre la protéine C-mbp 1 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères Dans cet exemple, les cellules H 1299 ont été transfectées avec les combinaisons de plasmides suivantes avant immunoprécipitation et Western-blot pBFA 107 / pBFA 107-C-MBP 1 (3 p,g) + pSV2 / pSV2-p53 (sauvage ou mutant) (3 N~g) De plus la combinaison suivante servant de contrôle a été effectuée pBFA107-Sam68 (3 p,g) + pSV2-H175 (3 p.g) Ce contrôle sert à examiner si H175 peut ou non interagir soit avec l'étiquette myc soit avec une fusion entre l'étiquette myc et une protéine quelconque, la protéine Sam68 décrite par Lock et al (Cell 84(1996)23), n'étant pas censée interagir avec les différentes formes de la protéine p53.
Les résultats de cette expérience qui sont présentés dans la Figure 2 montrent que - la protéine C-mbpl peut interagir avec la protéine H175 dans des cellules mammifères - cette interaction est bien spécifique de la protéine C-mbp 1 car la protéine H 175 n'intragit pas avec le contrôle myc-Sam68 4-b (ü} - Interaction entre la protéine C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine pS3 en cellules mammifères Dans cet exemple, les cellules H 1299 ont été transfectées avec les combinaisons de plasmides suivantes avant immunoprécipitation et Western-blot pBFA107 / pBFA107-C-FIB2 (3 pg) + pSV2 / pSV2-pS3 (sauvage ou mutant) (3 p,g) Les résultats de cette expérience qui sont présentés dans la Figure 3 montrent que la protéine C-fibuline2 peut interagir spécifiquement avec la protéine H
17S dans des cellules mammifères.
La conclusion générale de ces expériences est que les protéines C-mbpl et C-fibuline2 sont capables d'interagir spécifiquement en cellules mammifères avec la protéines H17S. Ces résultats de même que ceux obtenus dans la levure (exemple 3) sont en accord avec 1/ la classification des mutants de la protéine pS3 - H 17S et 6281: dominants oncogéniques - H273: mutant faible 2/ la classification des différentes formes de la protéine pS3 en terme de conformation et de reconnaissance par des anticorps conformationnels - H 17S et 6281 : conformation mutante, PAb 1620 - / PAb 240 +
- pS3 et H273 : conformation sauvage, PAb 1620 + / Pab 240 -L'ensemble des ces données montrent que les protéines C-mbpl et C-fibuline2 interagissent avec les formes de la protéine pS3 présentant une conformation mutée, et qu'elles sont susceptibles d'avoir un effet sur des fonctions spécifiques des formes mutées de la protéine pS3.
De plus, de par la littérature, on sait qu'une fraction de la protéine pS3 peut exhiber une conformation mutante dans les cellules mammifères, en particulier 1/ la protéine p53, capable de se lier à l'ADN (Hupp et al, Nucl. Acids Res.

(1993) 3167), peut adopter une conformation mutante lorsqu'elle se lie à l'ADN
(Halazonetis et al, EMBO J. 12 ( 1993) I02 I ) 2/ la protéine p53 peut adopter deux conformations différentes au cours du 5 cycle cellulaire; la conformation dite 'suppresseur' (conformation sauvage, PAb 1620 + / PAb 240 -) et la conformation dite 'promoteur' (conformation mutante, PAb - / PAb 240 +) (Mimer & Watson, Oncôgene 2 (1990) 1683).
On peut donc supposer que les protéines C-mbpl et C-fibuline 2 sont 10 également susceptibles d'avoir un effet sur des fônctions spécifiques de la forme sauvage de la protéine p53.
Exemple 5 - Effet de la protéine C-mbpl sur la coopération oncogénique entre la protéine H175 et la protéine Ras-Va112 Cet exemple décrit les effets de la protéine C-mbp I sur une propriété du mutant oncogénique H 175, sa capacité à coopérer avec la forme mutée du proto-oncogène Ras (Ras-Va112) dans la transformation oncogénique de fibroblastes embryonnaires de rat Les fibroblastes embryonnaires de rat (REF) ont été préparés à partir de rats OFA (IFA-CREDO) selon la méthode décrite par C. Finlay {Methods in Enzymology 255 ( 1995) 389). Après décongélation, les cellules ( I,S.106) sont ensemencées dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre contenant 8 ml de milieu DMEM (Gibco BRL) additioné de 10% de sérum de veau foetal et cultivées sur la nuit dans un incubateur à CO, (5%) à 37°C, puis sont transfectées par les différents mélanges de plasmides (21 pg d'ADN) en utilisant le réactif CeIlPhect (Pharmacia) suivant les recommandations du fournisseur. 24 h après Ia fin de la transfection, les cellules contenues dans chacune des boites sont grattées puis réensemencées sur trois boites de Pétri de 10 cm et cultivées pendant 15 jours avant d'être colorées au cristal violet suivant le protocole décrit par C. Finlay (Methods in Enzymology 255 (1995) 389).

Les foyers de transformation sont alors visualisés et comptés.
Les plasmides utilisés au cours de cette série d'expériences sont les suivants:
- plasmide tampon: pSGS (Stratagene) - plasmide d'expression de la protéine Ras-Va112: pEJ-Ras (Shih & Weinberg, Cell 29 ( 1982) 161 ) - plasmide d'expression de la protéine c-myc entière: pSVc-mycl (Land et al, Nature 304 ( 1983) 596) - plasmide d'expression de la protéine H 175: pSV2-H 175 (exemple 4-a (iii)) - plasmide d'expression de la protéine C-mbpl: pBFA107-C-MBP1(exemple 4-a (ü)) Chaque point de transfection contient un mélange de trois plasmides â raison de 7 pg de chaque plasmide. Les résultats de deux expériences indépendantes sont reportés dans le Tableau 3.

Expérience I Expérience 2 contrôle 0 0 Ras-Val 12 0 0 c-myc 0 NT

C-mbp 1 0 NT

Ras-Va112 + c-myc 111 16 Ras-Val l 2 + c-myc + C-mbp113 12 Ras-Val 12 + H 175 0 16 Ras-Val 12 + C-mbp 1 0 3 Ras-Val 12 + H 175 + C-mbp13 30 Tableau 3. Effet de la protéine C-mbp 1 sur la coopération oncogénique entre la protéine H 175 et la protéine Ras-Val l 2 (NT: non testé , *: expérience effectuée avec 3 wg de plasmide pSVc-myc 1 ) Les résultats de ces expériences montrent que C-mbp 1 peut coopérer avec Ia forme activée de Ras pour la transformation des REF
- il existe une synergie entre les protéines H 175 et C-mbp 1 dans la coopération oncogénique avec Ras qui est spécifique de cette association car C-mbp 1 ne présente aucun effet sur la coopération oncogénique Ras / c-myc.
Exempte 6 - Effet des protéines C-mbpl et C-fibuline2 et relation avec les effets des différentes formes de la protéine p53 sur la croissance cellulaire des cellules tumorales Cet exemple décrit les effets des protéines C-mbpl et C-fibuline2 sur la croissance cellulaire des cellules tumorales et leur relation avec les effets des différentes formes de la protéine p53 sur cette même croissance cellulaire.
Ces effets des protéines C-mbpl et C-fibuline2 sur la croissance cellulaire ont été testés sur la lignée cellulaire H 1299 dans une expérience de formation de colonies résistantes à la néomycine suite à la transfection par des plasmides exprimant ces protéines.
Ces expériences de transfection ont été effectuées selon le protocole décrit dans l'exemple 4-b en utilisant 105 cellules par point et 1,5 p.g d'ADN total.
Les plasmides utilisés au cours de cette série d'expériences sont les suivants:
- plasmides d'expression des protéines p53 et H175: pSV2-p53 et pSV2-H175.
- plasmide d'expression de la protéine C-mbp 1: pBFA 107-C-MBP 1 (exemple 4-a (ü)) - plasmide d'expression de la protéine C-fibuline2: pBFA107-C-FIB2 (exemple 4-a (ü)) - plasmide conférant la résistance à la néomycine: pSV2-Neo pour une quantité
totale de 0,4 pg Protocole de formation de colonies résistantes à la néomycine . 48h après transfection, les cellules sont grattées et transferées dans 2 boites de Pétri de 10 cm de diamètre et remises en culture avec 10 ml de milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et contenant 400 pg/ml de généticine (G418). Après une sélection de 15 jours en présence de 6418, le nombre de colonies NeoR est déterminé par comptage après coloration à la fuchsine.
Les résultat de ces expériences sont reportés dans les Tableaux 4 et 5.

Nombre de colonies résistantes à la Néomycine Protéine exprimée Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 moyenné
Vecteur 36 (1,00) 52 (1,00) 73 (I,00) 1,00 C-mbpl100ng 45 (1,25) 49 (1,06) 69 (0,95) 1,09 C-mbplSOOng S1 (1,42) 71 (1,37) 110(1,51) 1,43 C-mbpl1000ng 70( 1,94} 83 (1,60) 160 (2,19) 1,90 p53 7 (0,19) 12 (0,23) 10 (0,14) 0,19 sauvage 100ng C-mbp 100ng 6 (0,17) 14 (0,27) 8 (0,11 ) 0,18 C-mbp SOOng 19 (0,53) 28 (0,54) 23 (0,32) 0,46 C-mbpl1000ng 32 (0,89) 50 (0,96) 51 (0,70) 0,85 p53 2 (0,06) 5 (0,10) 8 (0,11 ) 0,08 sauvage 200ng C-mbp 100ng 2 (0,06) 4 (0,08) 6 (0,08) 0,08 C-mbp SOOng S (0,14) 8 (0,15) 16 (0,22) 0,17 C-mbpl1000ng 9 (0,25) 20 (0,38) 28 (0,38) 0,35 H175 0ng 41 (1,14) 47 (0,90) 61 (0,84) 0,96 C-mbpl100ng 33 (0,92) 65 (1,25) 70 (0,96) 1,04 C-mbplSOOng 67 (1,86) 101 (1,94) 123 (1,68) 1,83 C-mbpl1000ng 162 (4,50) 128 (2,46) 316 (4,33) 3,76 H175 39 (1,08) 60 (1,15) 66 (1,10) 1,11 200ng C-mbpl100ng 43 (1,19) 54 (1,04) 75 (1,03) 1,10 C-mbplSOOng 59 (1,64) 129 (2,48) 163 (2,23) 2,12 C-mbp 1000ng 131 (3,64) 282 (5,42) 299 (4,10) 4,39 Tableau 4: Effet de la protéine C-mbp 1 sur la croissance cellulaire de cellules 5 tumorales Nombre de colonies résistantes à la Néomycine Protéine exprimée Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 moyenne Vecteur 36 (1,00) 52 (1,00) 73 (1,00) 1,00 C-fibuline2 100ng35 (0,97) 56 (1,08) 80 (1,10) 1,05 C-fibuline2 SOOng48 (1,33) 68 (1,31) 102 (1,40) 1,35 C-fibuline2 1000ng60( 1,67) 87 (1,67) 194 (2,66) 2,00 p53 sauvage 100ng7 (0,19) 12 (0,23) 10 (0,14) 0,19 C-fibuline2 100ng10 (0,28) 11 (0,21 13 (0,18) 0,22 ) C-fibuline2 SOOngIS (0,42) 30 (0,58) 26 (0,36) 0,45 C-fibuline2 1000ng35 (0,97) 44 (0,85) 45 (0,62) 0,81 p53 sauvage 200ng2 (0,06) 5 (0,10) 8 (0,11 ) 0,09 C-fibuline2 1 3 (0,08) 6 (0,12) 6 (0,08) 0,09 OOng C-fibuline2 500ng4 (0,1 I 10 (0, I 16 (0,22) 0,16 ) 9) C-fibuline2 1000ng10 (0,28) 18 (0,35) 28 (0,38) 0,34 H175 100ng 41 (1,14) 4? (0,90) 6I {0,84) 0,96 C-fibuline2 100ng47 (1,31) 54 (1,04) 84 (1,15) 1,17 C-fibuline2 SOOng84 (2,33) 95 (1,83) 156 (2,14) 2,10 C-fibuline2 1000ng143 (3,97) 138 (2,65) 270 (3,70) 3,44 H175 200ng 39 (1,08) 60 (1,15) 66 (1,10) 1,11 C-fibuline2 100ng51 (1,42) 63 (1,21) 80 (1,10) 1,24 C-fibuline2 SOOng74 (2,06) 146 (2,81) 142 (1,95) 2,27 C-fibuline2 1000ng158 (4,39) 230 (4,42) 284 (3,89) 4,23 Tableau 5: Effet de la protéine C-fibuline2 sur la croissance cellulaire de cellules tumorales Les résultats de ces expériences montrent que 5 - les protéines C-mbp 1 et C-fibuline2 ont un effet positif sur la croissance cellulaire - les protéines C-mbpl et C-fibuline2 sont capables de bloquer l'effet anti-prolifératif de la protéine p53, et ce indépendamment de leur effet prolifératif - l'effet prolifératif des protéines C-mbpl et C-fibuline2 est fortement augmenté en présence de la protéine H175 Exemple 7 - Clonage des ADNc codant pour la forme entière des protéines MBP1 murine et humaine.
Cet exemple décrit le clonage des ADNc codant pour la protéine MBP 1 murine entière et l'utilisation de ces dônnées pour le clonage d'un homologue humain de MBP 1.
7 a - Clonage de l'ADNc codant pour la forme entière de la protéine mbpl murine L'ADNc codant pour la partie C-terminale de la protéine mbp 1 murine a été
cloné par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de la banque SuperScript d'embryon murin (8,5 jours) (Gibco BRL) en utilisant l'oligonucléotide 3'-mMBP 1 et l'oligonucléotide SP6 (Gibco BRL).
Oligonucléotide 3'-mMBP 1 (SEQ ID N° 14) CGGTACTGGCAGAGGTAACTGG
Cette amplification a permis d'obtenir un produit unique présentant une taille d'environ 800 paires de bases qui a ensuite été cloné directement après PCR
dans le vecteur pCRII (Invitrogene) et séquencé. La séquence ainsi obtenue (SEQ ID
N° 23) montre un recouvrement de 368 paires de bases avec C-MBP 1 (SEQ ID N°

8) avec une identité stricte de séquence sur cette partie commune. De plus, en 5' de cette partie commune, on trouve une séquence additionnelle de 445 paires de bases présentant une phase de lecture ouverte et un codon d'initiation de la traduction.
Les deux fragments représentés par ces séquences ont ensuite été rassemblés par une ligation à trois partenaires en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction EcoR I, Pst I et Not I et le plasmide pBC-SK+

(STRATAGENE) permettant ainsi la reconstitution de l'ADNc MBP1 murin entier (mMBP 1 ) (SEQ ID N° I 5).
7-b Clonage de l'ADNc codant pour la forme entière de la protéine mbpl humaine La séquence du gène murin. MBP 1 a été utilisée pour une recherche d'homologie dans Genbank. Cette recherche a permis de montrer une forte homologie avec la séquence d'une EST humaine (g1548384). A partir de cette séquence, deux fragments d'ADNc ont été clonés par réaction d'amplification en chaine (PCR} sur l'ADN de la banque SuperScript de testicule humain (Gibco BRL) en utilisant les oligonucléotides 3'-hMBPI et SP6 (Gibco BRL) d'une part, et les oligonucléotides 5'-hMBP 1 et T7 (Gibco BRL) d'autre part.
Oligonucléotide 3'-hMBP 1 (SEQ ID N° 17) CTCCGCTCCGAGGTGATGGTC
Oligonucléotide 5'-hMBP 1 (SEQ ID N° 18) TGTAGCTACTCCAGCTACCTC
Ces amplifications ont permis d'obtenir deux produits présentant des tailles d'environ 1100 et 700 paires de bases qui ont ensuite été clonés directement après PCR dans le vecteur pCRII (Invitrogene) et séquencés. Les séquences ainsi obtenues (SEQ ID N° 19 et SEQ ID N° 20) montrent un recouvrement de 325 paires avec une identité stricte de séquence sur cette partie commune.
Les deux fragments représentés par ces séquences ont ensuite été rassemblés par une ligation à trois partenaires en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction EcoR I, Nco I et Not I et le plasmide pBC-SK+
(STRATAGENE) permettant ainsi la reconstitution de l'ADNc MBP1 humain entier (hMBP 1 ) (SEQ ID N° 21 ) présentant une phase de lecture ouverte et un codon d'initiation de la traduction.

La comparaison des séquences protéiques correspondant aux ADNc précédemment obtenus (Exemples 7-a et 7-b) (Figure 4) montre une identité
stricte de 95% dans la phase ouverte de lecture supposée (après le site de démarrage de la traduction (ATG) supposé). Par contre, une absence d'identité et une très mauvaise homologie sont observées entre les régions situées en amont de ce site de démarrage de la traduction (ATG) putatif. Ces données permettent donc de confirmer cette position comme démarrage de la traduction et par là même que ces deux ADNc codent bien pour les formes entières des protéines MBP 1 humaine (SEQ ID
N°22) et marine (SEQ ID N° 16).
7 - c Construction des plasmides d'expression en cellules mammifères des formes marine et humaine de la protéine mbpl Les ADNc codant pour les formes marine et humaine de la protéine MBP 1 contenus dans le vecteur pBC SK+, ont été insérés dans les vecteurs d'expression pSV2 et pcDNA3 (Invitrogen) en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Hind III et Not I.
Exemple 8 - Effets comparés des protéines C-mbpl et mbpl marine sur la croissance cellulaire des cellules tumorales Cet exemple décrit les effets comparés des protéines C-mbp 1 et mbp 1 marine sur la croissance cellulaire des cellules tumorales et leur relation avec les effets de la protéine H 175 sur cette même croissance cellulaire.
Ces effets de la protéine mbp 1 marine sur la croissance cellulaire ont été
testés sur la lignée cellulaire H 1299 dans une expérience de formation de colonies résistantes à la néomycine suite à la transfection par des plasmides portant les ADNc codant pour ces protéines.
Ces expériences de transfection ont été effectuées selon le protocole décrit dans l'exemple D2 en utilisant 105 cellules par point et 1,5 p.g d'ADN total.

Les plasmides utilisés au cours de cette série d'expériences sont les suivants:
- plasmide d'expression de la protéine H175: pSV2-H175.
- plasmide d' expression de la protéine C-mbp 1: pBFA 107-C-MBP 1 (exemple 4-a (ü)) - plasmide d'expression de la protéine mbpl murine: pSV2-mMBPI (exemple 7-c) - plasmide conférant la résistance à la néomycine: pSV2-Neo pour une quantité
totale de 0,4 pg Le protocole de formation de colonies résistantes à la néomycine utilisé est celui décrit dans l'exemple 6. Les résultat de cette expérience sont présentés dans le Tableau 6 et la Figure 5.
Nombre de colonies résistantes à la Néomycine Protéine exprimée Expérience 1 Expérience 2 Vecteur 61 ( 1,00) 71 ( 1,00) C-mbp 100ng 67 ( I ,10) C-mbplSOOng 96 ( 1,57) C-mbp 1000ng 278 ( 4,56) 239 ( 3,37) mbpl 100ng 94 ( 1,54) mbp SOOng 128 ( 2,10) mbpl 1000ng 419 ( 6,87) 562 ( 7,92) HI75 65 ( 1,07) 69 ( 0,97) 200ng C-mbp 1 OOng 72 ( 1,18 ) C-mbplSOOng 134 ( 2,20) C-mbp 1 OOOng 397 ( 6,51 ) 341 ( 4,80) mbpl 100ng 81 ( 1,33) mbpl SOOng 206 ( 3,38) mbp 1 OOOng 729 ( 11,95) 12 I 5 ( 17,11 1 ) Tableau 6 : Effets comparés des protéines C-mbp 1 et mbp 1 murine sur la croissance cellulaire de cellules tumorales Les résultats de cette expérience montrent que la protéine mbp 1 murine 5 présente les mêmes caractéristiques que la protéine C-mbpl, à savoir un effet positif sur la croissance cellulaire qui est fortement augmenté en présence de la protéine H 175.
De plus cet effet de la protéine mbpl est très fortement augmenté par rapport à la protéine tronquée C-mbp 1.
Exemple 8 bis - Coopération oncogénique des protéines C-mbpl et mbpl murine et mbpl humaine avec la protéine Ras-Va112 Cet exemple décrit les effets comparés des protéines C-mbp 1, mbp 1 murine et mbpl humaine dans une expérience de coopération oncogénique avec la protéine Ras-Va112.
Cette coopération oncogénique a été testée sur des fibroblastes embryonnaires de rat suite à la transfection par des plasmides portant les ADNc codant pour ces protéines et suivant le protocole décrit dans l'exemple 5.
Les résultats de cette expérience sont présentés dans le Tableau 7.

Expérience 1 Expérience 2 contrle 0 0 Ras-Val l 2 0 0 c-myc 0 0 C-mbp 1 0 0 mbp 1 0 0 Ras-Val I2 + c-myc 3 I 42 Ras-Val I2 + H 175 10 15 Ras-Va112 + C-mbp 1 4 4 Ras-Val 12 + mbp 1 murine 5 7 Ras-Va112 + mbpi humaine 6 6 Tableau 7: Coopération oncogénique des protéines C-mbp 1, mbp 1 murine et mbp humaine avec la protéine Ras-Va112 Les résultats de cette expérience montrent que les protéine MBP 1 murine et MBP 1 humaine présentent les mêmes caractéristiques que la protéine C-mbp 1, à
savoir la capacité de coopérer avec la protéine Ras-Va112 pour la transformation de fibroblastes embryonnaires de rat.
De façon intéressante, on note aussi que les fibroblastes ainsi transformés présentent un aspect morphologique tout à fait particulier qui diffère de celui obtenu avec l' oncogène c-myc.
Exempte 9 - Expression de la protéine MBP1 chez la souris et dans les tissus humains Cet exemple décrit l'étude de l'expression de l'ARN messager de MBP 1 chez la souris et dans différents tissus humains.

9-a Préparation des sondes Les sondes mMBP 1 et hMBP 1 sont constituées par les ADNc correspondants.
La sonde GAPDH (contrôle) a été générée par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de la banque SuperScript de testicule humain (Gibco BRL) (GAPDH) en utilisant les oligonucléotides suivants Oligonucléotide sens-GAPDH (SEQ ID N° 24) CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT
Oligonucléotide antisens-GAPDH(SEQ ID N° 25) AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC
Les sondes ont été radiomarquées au 'ZP-dCTP en utilisant le kit Rediprime (Amersharn) et les recommandations du fournisseur, et les nucléotides non incorporés ont été éliminés par chromatographie sur des colonnes MicroSpin G-25 (Pharmacie Biotech). Les Northern blots utilisés lors de cette expérience ont été obtenus chez Clontech. Les membranes ont été préhybridées avec la solution ExpressHyb (Clontech) 45 minutes à 65°c, puis incubées 2 heures avec les sondes radiomarquées à 65°C, lavées trois fois avec du tampon 2xSSC deux fois avec du tampon 2xSSC
additionné de 0,1% de SDS et enfin lavées avec du tampon 0,2xSSC additionné de 0,1% de SDS jusqu'à disparition du bruit de fond. Les membranes ont ensuite été
soumises a autoradiographie et une quantification du signal a été effectuée à
l'aide d'un instantimager (Packard instruments).
9-b Expression de la protéine MBPI chez la souris Cet exemple décrit l'étude de l'expression de l'ARN messager de MBP 1 chez la souris.
Les sondes utilisées dans cette expérience sont ies sondes mMBP 1 et GAPDH
. Les membranes utilisées dans cette expérience contiennent l'une des ARNm d'embryon de souris obtenus à différents stages du développement, et l'autre des ARNm représentatifs de différents tissus de souris adulte.
Les résultats de cette expérience (Figure 6) indiquent clairement que:
1 - un transcript unique de 1,8 kb est détécté aussi bien dans les ARNm d'embryon de souris que dans les tissus de souris adulte.
2 - ce messager présente des variations de niveaux d'expression au cours du développement, avec une forte abondance dans les stades précoces (7 jours) puis une diminution importante (I 1 jours) pour atteindre un niveau apparement constant.
3 - ce messager est modérément exprimé dans l'ensemble des tissus adultes testé à
l'exception d'une expression importante dans le poumon et les testicules.
Un tel niveau d'expression de transcript élevée dans une phase du développement embryonnaire ainsi que dans des tissus présentant un taux de croissance élevé, confirme l'implication du produit du gène MBP1 dans les processus de croissance cellulaire mise en évidence dans les exemples 5, 6 et 7.
9-c Expression de la protéine MBP1 dans les tissus humains Cet exemple décrit l'étude de l'expression de l'ARN messager de MBP 1 dans différents tissus humains.
Les sondes utilisées dans cette expérience sont les sondes hMBP 1 et GAPDH
Les membranes utilisées contiennent des ARNm représentatifs de différents tissus humain.

Les résultats de cette expérience (Figure 7) indiquent clairement que:
1 - deux transcripts de I,5 et 1,8 kb sont détéctés dans les tissus humains.
2 - ces messagers sont modérément exprimés dans l'ensemble des tissus testés et leur profil d'expression est comparable à celui du messager murin (forte expression dans le poumon et les testicules).
Ces résultats montrent que:
- il peut exister deux formes différentes de la protéine mbp 1 humaine avec possibilité d'épissage alternatif du messager.
- les ARNm codant pour la(les) protéines) mbp 1 humaines) tout comme leur homologue murin présentent un niveau d'expression élevé dans des tissus à taux de croissance élevé, et que le(s) produits) du gène MBP 1 humain pourrait(ent) donc aussi être impliqués) dans les processus de croissance cellulaire.
Les résultats présentés dans les différents exemples montrent que les protéines C-mbp 1, MBP 1 et C-fibuline2 interagissent spécifiquement avec les formes mutantes de la protéine p53 et que ces interactions conduisent à une synergie entre ces protéines et les mutants oncogéniques de la protéine p53 que ce soit pour la coopération oncogénique avec la forme activée de la protéine Ras ou pour l'effet proliférati~
De plus, les protéines C-mbp I , MBP 1 et C-fibuline2 présentent une activité
proliférative intrinsèque, et la protéine C-mbp 1 agit comme un oncogène immortalisant en coopérant avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
Les résultats présentés dans les différents exemples montrent que les protéines ou polypeptides C-mbpl, MBP1 et C-fibuline2 interagissent spécifiquement avec les formes mutantes de la protéine p53 et que ces interactions conduisent à une synergie entre ces protéines et les mutants oncogéniques de la protéine p53 que ce soit pour la coopération oncogénique avec la forme activée de la protéine Ras ou pour l'effet prolifératif.
De plus, les protéines C-mbpl, MBP1 et C-fibuline2 présentent une activité
proliférative intrinsèque, et les protéines C-mbp 1 et MBP 1 agissent comme des 5 oncogénes immortalisants en coopérant avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
Ces propriétés confèrent à MBP1 un rôle potentiel d'oncogène. Dans au moins un des test (exemple 8 bis) la protéine MBP 1 présente des propriétés oncogéniques accrues par rapport au polypeptide c-MBP I .

10 Enfin, la forte homologie présentée par les protéines MBP1 humaine et murine (95% d'identité stricte), et la similarité d'expression tissulaire de leurs messagers respectifs, permettent de conclure que la protéine MBP 1 humaine, qui pourrait être présente sous forme de deux variants différents (2 messagers distincts), possède(ent) des propriétés analogues à celles de son homologue W urine.
15 En conclusion, ces résultats décrivent la caractérisation d'une nouvelle protéine murine, MBPI, et de son(ses) homologues) humaine(s), qui présente des propriétés oncogéniques et qui interagit spécifiquement avec les formes mutées de la protéine p53. Cette interaction qui se traduit par un accroissement des propriétés oncogéniques de MBP1, pourrait constituer un élément fondamental de la capacité
20 oncogénique de ces mutants de la protéine p53.
De telles propriétés semblent aussi partagées par une autre protéine présentant des homologies avec MBP1, la fibuline 2. Cette protéine faisant partie d'une famille plus large, on peut envisager que ces propriétés puissent être étendues à
l'ensemble des membres de la famille des fibulines.
25 Ces interactions montrant une forte synergie entre les pouvoirs oncogéniques des protéines MBPI, fbuline2 et mutants p53, elles constituent un point d'action potentiel dans le traitement des cancers liés aux mutations de Ia protéine p53. De plus, les protéines MBP 1 et fibuline2 qui présentent des propriétés oncogéniques intrinsèques constituent des cibles potentielles pour le traitement du cancer en général.
Exemple 10 - Localisation chromosomique du gène MBPI humain La localisation chromosomique du gène MBPI a été effectué selon un protocole en quatre étapes (Lichter èt al, Science 247 ( 1990) 64) (Heng et al, Chromosoma 102 ( 1993) 325) ( Kischkel et al, Cytogenet. Cell Genet. 82 ( 1998) 95) - marquage de l'ADNc à la biotine par nick-translation - hybridation sur métaphases humaines normales (technologie en haute résolution) - révélation par la fluorescéine - visualisation et interprétation sur microscope à épifluorescence Cette étude d'hybridation de la sonde MBP 1 sur métaphases humaines a été
effectuée par analyse de 30 mitoses et a montré la présence d'un double spot sur les bras longs (bras q) des deux chromosomes 1 I en 11 q 13. De façon intéressante, cette région du chromosome 11 a été associée à un grand nombre de pathologies - maladie de Mac Ardle (Lebo et al, Science 225 ( 1984) 57) - Syndrome de Usher de type 1B (WeiI et al, Nature 374 (1995) 60) - néoplasie endocrine de type I (Teh et al, J. Intern. Med. 238 (1995) 249) - dystrophie de Best (Graff et al, Genomics 24 ( 1994) 425) - diabète insulino-dépendent (Davies et al, Nature 37 I ( 1994) 130) - spinocerebellar ataxia 5 (Ranum et al, Nature Genet. 8 ( 1994) 280) - syndrome de Bardet-Biedl (Leppert et al, Nature Genet. 7 (1994) 108) - ostéoporose (Gong et al, Am. J. Hum. Genet. 59 (1996} 146) De plus cette région du chromosome 11 est aussi le site d'évènements d'amplification associées à différentes de tumeurs solides (oesophage, tête et cou, vessie, sein et poumon) ( Lammie & Peters, Cancer Cells 3 (1991) 413).
Le gène MBPI pourrait donc être non seulement associé à un certain nombre de cancers mais aussi à un grand nombre de pathologies présentant des désordres de types rénaux, neuro-dégénératifs, osseux et autres. Parmi ces pathologies on peut citer notamment : les déficiences rénales aigues telles celles associées à la maladie de Mac Ardle, les retinis pigmentosa et certaines formes de cécité et de surdité
telles que celles associées au Syndrome de Usher de type 1B, l'hyperthyroïdie telle la forme associée à la néoplasie endocrine de type I, les pathologies liées à un défaut de pigmentation rétinienne telles que celles rencontrées dans la dystrophie de Best, le diabète insulino-dépendant, les pathologies neurodégénératives teiles que celles associées à l'ataxie cérébrospinale 5, les dystrophies rétiniennes, les désordres rénaux telles que les formes rencontrées dans le syndrome de Bardet-Biedl, et l'ostéoporose.
Exemple 11 - Expression de l'Ai2N messager codant pour la protéine MBPl humaine dans des tumeurs du colon Cet exemple décrit une analyse semi-quantitative de l'expression de l'ARN
messager codant pour la protéine MBP 1 humaine, effectuée en parallèle sur 9 tumeurs du colon et 9 prélèvements de tissus sains (colon) provenant des mêmes patients.
Les prélèvements ont été congelés à -70°C immédiatement après ressection et l'ARN total a été préparé par homogénéisation de IOOmg de tissu en utilisant la solution RNA NOW (Ozyme) et le protocole recommandé par le fournisseur. Par la suite, une synthèse d'ADNc a été effectuée à l'aide du kit First-Strand cDNA
Synthesis (Amersham Pharmacia Biotech) en utilisant 1,5 pg d'ARN total et selon les recommandations du fournisseur. Puis les gènes MBP 1 et (3-actine (contrôle) ont été
amplifiés par PCR en utilisant une quantité d'ADNc pour laquelle le niveau de produit de PCR est directement corrélable avec la concentration de substrat et le programme de cycles suivant 1 cycle 2min à 95°C
30 cycles 30sec à 94 lmin à 45°C
1 min à 72°C
1 cycle 3min à 72°C
Les oligonucléotides utilisés pour ces amplifications sont les suivants Oligonucléotide sens-MBP 1 (SEQ ID N° 27) GCCCTGATGGTTACCGCAAGA
Oligonucléotide antisens-MBP 1 (SEQ ID N° 28) AGCCCCCATGGAAGTTGACAC
Oligonucléotide sens-~3 -actin (SEQ ID N° 29) GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
Oligonucléotide antisens-~3-actin (SEQ ID N° 26) CGGTTGGCCTTGGGGTTCAGGGGGG
Les produits de PCR ainsi générés ont ensuite été analysés par électrophorèses sur gel d'agarose à 1%.
Les résultats présentés dans la figure 8 montrent clairement que l'ARN
messager codant pour la protéine MBP1 humaine est amplifié dans cinq des tumeurs étudiées en comparaison avec le tissu sain provenant du même patient, et ce, quelque soit le grade de la tumeur et indépendamment de leur statut concernant les gènes Ras et p53.
Les résultats de cet exemple montrent donc qu'une amplification de l'ARN
messager codant pour Ia protéine MBP 1 humaine peut-être décelée dans certains types de tumeurs humaines et soulignent donc un rôle potentiel de la protéine dans l'apparition et/ou le developpement de ces tumeurs.

LISTE DE SEQUENCES
<110> Rh8ne-Poulenc Rorer <120> Polypeptides capables d'interagir avec les mutants oncogéniques de la protéine p53 <130> Séquences <140>
<141>
<150> FR9812754 <151> 1998-10-12 <160> 33 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <z2o>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 1 agatctgtat ggaggagccg cag 23 <210> 2 <211> 29 <zi2> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide3'-393 (p53) <400> 2 agatctcatc agtctgagtc aggcccttc 2g <210> 3 <211> 15 <212> ADN
<2i3> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide H175 3' <400> 3 ggggcagtgc ctcac 15 <210> 4 <211> 15 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <z2o>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide W248 3' <400> 4 gggcctccag ttcat 15 <210> 5 <211> 15 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide H273 3' <400> 5 acaaacatgc acctc 15 <210> 6 <211> 15 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 6281 3' <400> s gcgccggcct ctccc 15 <210> 7 <211> 23 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 5'-73 <400> 7 agatctgtgt ggcccctgca cca 23 <zlo> s <211> 1021 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<221> CDS
<222> (1}..(885}

<220>

<223> Description de la squence artificielle: fragment C-term MBP1 murine <400> 8 tgc acc tgc cct gat ggt tac cga aaa att gga ccc 48 gaa tgt gtg gac Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Ile Gly Pro Glu Cys Val Asp ata gat gag tgt cgt tac cgc tat tgc cag cat cga 96 tgt gtg sac ctg Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Arg Tyr Cys Gln His Arg Cys Val Asn Leu ccg ggc tcc ttt cga tgc cag tgt gag cca ggc ttc 144 cag ttg gga cct Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Glu Pro Gly Phe Gln Leu Gly Pro sac sac cgc tct tgt gtg gat gtg aat gag tgt gac 192 atg gga gcc cca Asn Asn Arg Ser Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Asp Met Gly Ala Pro 50 55 60 ' tgt gag cag cgc tgc ttc sac tcc tat ggg acc ttc 240 ctg tgt cgc tgt Cys Glu Gln Arg Cys Phe Asn Ser Tyr Gly Thr Phe Leu Cys Arg Cys sac cag ggc tat gag ctg cac cgg gat ggc ttc tcc 288 tgc agc gat atc Asn Gln Gly Tyr Glu Leu His Arg Asp Gly Phe Ser Cys Ser Asp Ile gat gag tgc ggc tac tcc agt tac ctc tgc cag tac 336 cgc tgt gtc sac Asp Glu Cya Gly Tyr Ser Ser Tyr Leu Cys Gln Tyr Arg Cys Val Asn gag cca ggc cga ttc tcc tgt cac tgc cca cas ggc 384 tac cag ctg ctg Glu Pro Gly Arg Phe Ser Cys His Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu Leu gct aca agg ctc tgc cas gat att gac gag tgt gaa 432 aca ggt gca cac Ala Thr Arg Leu Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Glu Thr Gly Ala His cas tgt tct gag gcc cas acc tgt gtc sac ttc cat 480 ggg ggt tac cgc Gln Cys Ser Glu Ala Gln Thr Cys Val Asn Phe His Gly Gly Tyr Arg tgt gtg gac acc sac cgt tgt gtg gag ccc tat gtc 528 cas gtg tca gac Cys Val Asp Thr Asn Arg Cys Val Glu Pro Tyr Val Gln Val Ser Asp sac cgc tgc ctc tgc cct gcc tcc aat ccc ctt tgt 576 cga gag cag cct Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Asn Pro Leu Cys Arg Glu Gln Pro tca tcc att gtg cac cgc tac atg agc atc acc tca 624 gag cga agt gtg Ser Ser IIe Val His Arg Tyr Met Ser Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val cct gct gac gtg ttt cag atc cag gca acc tct gtc 672 tac cct ggt gcc Pro Ala Asp Val Phe Gln ile Gln Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gly Ala tac aat gcc ttt cag atc cgt tct gga aac aca cag ggg gac ttc tac 720 Tyr Asn Ala Phe Gln Ile Arg Ser Gly Asn Thr Gln Gly Asp Phe Tyr att agg caa atc aac aat gtc agc gcc atg ctg gtc ctc gcc agg cca 768 Ile Arg Gln Ile Asn Asn Val Ser Ala Met Leu Val Leu Ala Arg Pro gtg acg gga ccc cgg gag tac gtg ctg gac ctg gag atg gtc acc atg 816 Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met Val Thr Met aat tcc ctt atg agc tac cgg gcc agc tct gta ctg aga ctc acg gtc 864 Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr Val 2~ ttt gtg gga gcc tat acc ttc tgaagaccct cagggaaggg ccatgtgggg 915 Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe gccccttccc cctcccatag cttaagcagc cccgggggcc tagggatgac cgttctgctt 975 aaaggaacta tgatgtgaag gacaataaag ggagaaagaa ggaaaa 1021 <210> 9 <211> 295 <212> PRT

<213> Squence artificielle <223> Description de la squence artificielle:
fragment C-term MBP1 murine <400> 9 Cys Thr Cys Pro Asp Gly LysIleGlyPro Glu ValAsp Tyr Arg Cys 4flIle Asp Glu Cys Arg Tyr CysGlnHisArg Cys AsnLeu Arg Tyr Val Pro Gly Ser Phe Arg Cys GluProGlyPhe Gln GlyPro Gln Cys Leu Asn Asn Arg Ser Cys Val AsnGluCyaAsp Met AlaPro Asp Val Gly Glu Gln Arg Cys Phe Asn TyrGlyThrPhe Leu ArgCys Ser Cys 5~ 65 75 80 Asn Gln Gly Tyr Glu Leu AspGlyPheSer Cys AspIle His Arg Ser Asp Glu Cys Gly Tyr Ser LeuCysGlnTyr Arg ValAsn Ser Tyr Cys Glu Pro Gly Arg Phe Ser CysProGlnGly Tyr LeuLeu Cys His Gln Ala Thr Arg Leu Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Glu Thr Gly Ala His 5 Gln Cys Ser Glu Ala Gln Thr Cys Val Asn Phe His Gly Gly Tyr Arg Cys Val Asp Thr Asn Arg Cys Val Glu Pro Tyr Val Gln Val Ser Asp Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Asn Pro Leu Cys Arg Glu Gln Pro Ser Ser Ile Val His Arg Tyr Met Ser Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val Pro Ala Asp Val Phe Gln Ile Gln Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gly Ala Tyr Asn Ala Phe Gln Ile Arg Ser Gly Asn Thr Gln Gly Asp Phe Tyr Ile Arg Gln Ile Asn Asn Val Ser Ala Met Leu Val Leu Ala Arg Pro Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met Val Thr Met Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr Val 3~ 275 280 285 Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe <210> lo <211> 39 <212> ADN
4~ <213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide c-myc 5' <400> lo gatccatgga gcagaagctg atctccgagg aggacctga 39 5~ <210> 11 <211> 39 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <z2o>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide c-myc 3' <400> 11 gatctcaggt cctcctcgga gatcagcttc tgctccatg 3g <210> 12 <211> 45 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide MCS S' c400> 12 gatctcggtc gacctgcatg caattcccgg gtgcggccgc gagct 45 <210> 13 <211> 37 <212> ADN
2~ <213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide MCS 3' <400> 13 cgcggccgca cccgggaatt gcatgcaggt cgaccga 37 <210> 14 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 3'mMBPl <400> 14 cggtactggc agaggtaact gg 22 <210> 15 <211> 1513 <212> ADN
<213> Sêquence artificielle <220>
<221> CDS
5~ <222> (49)..(1377) <220>
<223> Description de la séquence artificielle: MBP1 murine (séquence complète) <400> 15 gctgtggcag aaacccctga cttctgccca ccacctccca gcctcagg atg ctc cct 57 Met Leu Pro ttt gcc tcc tgc ctc ccc ggg tct ttg ctg ctc tgg 105 gcg ttt ctg ctg Phe Ala Ser Cys Leu Pro Gly Ser Leu Leu Leu Trp Ala Phe Leu Leu ttg ctc ttg gga gca gcg tcc cca cag gat ccc gag 153 gag ccg gac agc Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Pro Gln Asp Pro Glu Glu Pro Asp Ser tac acg gaa tgc aca gat ggc tat gag tgg gat gca 201 gac agc cag cac Tyr Thr Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Glu Trp Asp Ala Asp Ser Gln His tgc cgg gat gtc aac gag tgc ctg acc atc ccg gag 249 gct tgc aag ggt Cys Arg Aap Val Asn Glu Cya Leu Thr Ile Pro Glu Ala Cys Lya Gly gag atg aaa tgc atc aac cac tac ggg ggt tat ttg 297 tgt ctg cct cgc Glu Met Lys Cys Ile Asn His Tyr Gly Gly Tyr Leu Cys Leu Pro Arg 70 75 ao tct gct gcc gtc atc agt gat ctc cat ggt gaa gga 345 cct cca ccg cca Ser Ala Ala Val Ile Sr Asp Leu His Gly Glu Gly Pro Pro Pro Pro gcg gcc cat gct caa caa cca aac cct tgc ccg cag 393 ggc tac gag cct Ala Ala His Ala Gln Gln Pro Asn Pro Cys Pro Gln GIy Tyr Glu Pro gat gaa cag gag agc tgt gtg gat gtg gac gag tgt 441 acc cag gct ttg Asp Glu Gln Glu Ser Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Thr Gln Ala Leu cat gac tgt cgc cct agt cag gac tgc cat aac ctt 489 cct ggc tcc tac His Asp Cys Arg Pro Ser Gln Asp Cys His Asn Leu Pro Gly Ser Tyr cag tgc acc tgc cct gat ggt tac cga aaa att gga 537 ccc gaa tgt gtg Gln Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Ile Gly Pro Glu Cys Val 4~ 150 155 160 gac ata gat gag tgt cgt tac cgc tat tgc cag cat 585 cga tgt gtg aac Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Arg Tyr Cys Gln His Arg Cys Val Aan ctg ccg ggc tct ttt cga tgc cag tgt gag cca ggc 633 ttc cag ttg gga Leu Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Glu Pro Gly Phe Gln Leu Gly 5~ cct aac aac cgc tct tgt gtg gat gtg aat gag tgt 681 gac atg gga gcc Pro Asn Asn Arg Ser Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Asp Met Gly Ala cca tgt gag cag cgc tgc ttc aac tcc tat ggg acc 729 ttc ctg tgt cgc Pro Cys Glu Gln Arg Cys Phe Asn Ser Tyr Gly Thr Phe Leu Cys Arg tgt aac cag ggc tat gag ctg cac cgg gat ggc ttc 777 tcc tgc agc gat Cys Asn Gln Gly Tyr GIu Leu His Arg Asp Gly Phe Ser Cys Ser Asp atc gat gag tgc ggc tac tcc agt tac ctc tgc cag tac cgc tgt gtc 825 Ile Asp Glu Cys Gly Tyr Ser Ser Tyr Leu Cys Gln Tyr Arg Cys Val aac gag cca ggc cga ttc tcc tgt cac tgc cca caa ggc tac cag ctg 873 Asn Glu Pro Gly Arg Phe Ser Cys His Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu ctg gct aca agg ctc tgc caa gat att gac gag tgt gaa aca ggt gca 921 Leu Ala Thr Arg Leu Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Glu Thr Gly Ala cac caa tgt tct gag gcc caa acc tgt gtc aac ttc cat ggg ggt tac 969 His Gln Cys Ser Glu Ala Gln Thr Cys Val Asn Phe His Gly Gly Tyr cgc tgt gtg gac acc aac cgt tgt gtg gag ccc tat gtc caa gtg tca 1017 Arg Cys Val Asp Thr Asn Arg Cys Val Glu Pro Tyr Val Gln Val Ser gac aac cgc tgc ctc tgc cct gcc tcc aat ccc ctt tgt cga gag cag 1065 Asp Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Aan Pro Leu Cys Arg Glu Gln cct tca tcc att gtg cac cgc tac atg agc atc acc tca gag cga agt 1113 Pro Ser Ser Ile Val Hie Arg Tyr Met Ser Ile Thr Ser Glu Arg Ser gtg cct gct gac gtg ttt cag atc cag gca acc tct gtc tac cct ggt 1161 Val Pro Ala Asp Val Phe Gln Ile Gln Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gly gcc tac aat gcc ttt cag atc cgt tct gga aac aca cag ggg gac ttc 1209 Ala Tyr Asn Ala Phe Gln Ile Arg Ser Gly Asn Thr Gln Gly Asp Phe tac att agg caa atc aac aat gtc agc gcc atg ctg gtc ctc gcc agg 1257 Tyr Ile Arg Gln Ile Asn Asn Val Ser Ala Met Leu Val Leu Ala Arg cca gtg acg gga ccc cgg gag tac gtg ctg gac ctg gag atg gtc acc 1305 Pro Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met Val Thr ~rJ 405 410 415 atg aat tcc ctt atg agc tac cgg gcc agc tct gta ctg aga ctc acg 1353 Met Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr gtc ttt gtg gga gcc tat acc ttc tgaagaccct cagggaaggg ccatgtgggg 1407 Val Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe gccccttccc cctcccatag cttaagcagc cccgggggcc tagggatgac cgttctgctt 1467 aaaggaacta tgatgtgaag gacaataaag ggagaaagaa ggaaaa 1513 <210> 16 <211> 443 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: MBP1 murine (séquence complète) <400> 16 Met Leu Pro Phe Ala Ser Cys Leu Pro Gly Ser Leu Leu Leu Trp Ala 1 s l0 15 Phe Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Pro Gln Asp Pro Glu Glu 15 Pro Asp Ser Tyr Thr Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Glu Trp Asp Ala Asp Ser Gln His Cys Arg Asp Val Asn Glu Cys Leu Thr Ile Pro Glu Ala Cys Lys Gly Glu Met Lys Cys Ile Aan His Tyr Gly Gly Tyr Leu Cjrs Leu Pro Arg Ser Ala Ala Val Ile Ser Asp Leu His Gly Glu Gly Pro Pro Pro Pro Ala Ala His Ala Gln Gln Pro Asn Pro Cys Pro Gln Gly Tyr Glu Pro Asp Glu Gln Glu Ser Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Thr Gln Ala Leu His Asp Cys Arg Pro Ser Gln Asp Cya His Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Ile Gly Pro Glu Cya Val Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Arg Tyr Cya Gln His Arg Cya Val Asn Leu Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Glu Pro Gly Phe Gln Leu Gly Pro Asn Asn Arg Ser Cya Val Asp Val Asn Glu Cya Asp Met Gly Ala Pro Cys Glu Gln Arg Cys Phe Asn Ser Tyr Gly Thr Phe Leu Cya Arg Cys Asn Gln Gly Tyr Glu Leu Hia Arg Asp Gly Phe Ser Cys Ser Asp Ile Asp Glu Cys Gly Tyr Ser Ser Tyr Leu Cys Gln Tyr Arg Cys Val Aan Glu Pro Gly Arg Phe Ser Cys Hia Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Ala Thr Arg Leu Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Glu Thr Gly Ala His Gln Cys Ser Glu Ala Gln Thr Cys Val Asn Phe His Gly Gly Tyr Arg Cys Val Aap Thr Asn Arg Cys Val Glu Pro Tyr Val 10 Gln Val Ser Asp Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Asn Pro Leu Cys Arg Glu Gln Pro Ser Ser Ile Val His Arg Tyr Met Ser Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val Pro Ala Aap Val Phe Gln Ile Gln Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gly Ala Tyr Asn Ala Phe Gln Ile Arg Ser Gly Asn Thr Gln Gly Asp Phe Tyr Ile Arg Gln Ile Asn Aan Val Ser Ala Met Leu Val Leu Ala Arg Pro Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met Val Thr Met Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr Val Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe <210> 17 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 3'hMBPl <400> 17 ctccgctccg aggtgatggt c 21 <210> 18 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 5'hMBPl <400> 18 tgtagctact ccagctacct c 21

11 <210> 19 <211> 1122 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description la squenceartificielle: cDNAP1 de MB

huma ine (squence partielle) <400> 19 aagccagccgagccgccagagccgcgggccgcgggggtgtcgcgggcccaaccccaggat60 gctccctgc gcctcctgcctacccgggtctctactgctctgggcgctgctactgttgct120 cttgggatcagcttctcctcaggattctgaagagcccgacagctacacggaatgcacaga180 tggctatgagtgggacccagacagccagcactgccgggatgtcaacgagtgtctgaccat240 ccctgaggcctgcaagggggaaatgaagtgcatcaaccactacgggggctacttgtgcct300 gccccgctccgctgccgtcatcaacgacctacacggcgagggacccccgccaccagtgcc360 tcccgctcaacaccccaacccctgcccaccaggctatgagcccgacgatcaggacagctg420 tgtggatgtggacgagtgtgcccaggccctgcacgactgtcgccccagccaggactgcca480 taacttgcctggctcctatcagtgcacctgccctgatggttaccgcaagatcgggcccga540 gtgtgtggacatagacgagtgccgctaccgctactgccagcaccgctgcgtgaacctgcc600 tggctccttccgctgccagtgcgagccgggcttccagctggggcctaacaaccgctcctg660 tgttgatgtgaacgagtgtgacatgggggccccatgcgagcagcgctgcttcaactccta720 tgggaccttcctgtgtcgctgccaccagggctatgagctgcatcgggatggcttctcctg780 cagtgatattgatgagtgtagctactccagctacctctgtcagtaccgctgcgtcaacga840 gccaggccgtttctcctgccactgcccacagggttaccagctgctggccacacgcctctg900 ccaagacattgatgagtgtgagtctggtgcgcaccagtgctccgaggcccaaacctgtgt960 caacttccatgggggctaccgctgcgtggacaccaaccgctgcgtggagccctacatcca1020 3~

ggtctctgagaaccgctgtctctgcccggcctccaaccctctatgtcgagagcagccttc1080 atccattgtgcaccgctacatgaccatcacctcggagcggag 1122 <210> 20 <211> s84 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description la squenceartificielle:
de cDNA

MBPlhumain (squence partielle) <400> 20 tgtagctactccagctacctctgtcagtaccgctgcgtcaacgagccaggccgtttctcc tgccactgcccacagggttaccagctgctggccacacgcctctgccaagacattgatgag tgtgagtctggtgcgcaccagtgctccgaggcccaaacctgtgtcaacttccatgggggc taccgctgcgtggacaccaaccgctgcgtggagccctacatccaggtctctgagaaccgc tgtctctgcccggcctccaaccctctatgtcgagagcagccttcatccattgtgcaccgc tacatgaccatcacctcggagcggagcgtgcccgctgacgtgttccagatccaggcgacc 5~ 360 tccgtctaccccggtgcctacaatgcctttcagatccgtgctggaaactcgcagggggac ttttacattaggcaaatcaacaacgtcagcgccatgctggtcctcgcccggccggtgacg ggcccccgggagtacgtgctggacctggagatggtcaccatgaattccctcatgagctac cgggccagctctgtactgaggctcaccgtctttgtaggggcctacaccttctgaggagca ggagggagccaccctccctgcagctaccctagctgaggagcctgttgtgaggggcagaat gagaaaggcaataaagggagaaag 684 <210> 21 <211> 1480

12 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<221> CDS
<222> (59)..(1387) <220>
<223> Description de la séquence artificielle: MHP1 humaine (sêquence complète?
<400> 21 aagccagccg agccgccaga gccgcgggcc.gcgggggtgt cgcgggccca accccagg 58 atg ctc ccc tgc gcc tcc tgc cta ccc ggg tct cta ctg ctc tgg gcg 106 Met Leu Pro Cys Ala Ser Cys Leu Pro Gly Ser Leu Leu Leu Trp Ala ctg cta ctg ttg ctc ttg gga tca gct tct cct cag gat tct gaa gag 154 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ser Ala Ser Pro Gln Asp Ser Glu Glu 20 25 3p ccc gac agc tac acg gaa tgc aca gat ggc tat gag tgg gac cca gac 202 Pro Asp Ser Tyr Thr Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Glu Trp Asp Pro Aap agc cag cac tgc cgg gat gtc aac gag tgt ctg acc atc cct gag gcc 250 Ser Gln His Cys Arg Asp Val Asn Glu Cys Leu Thr Ile Pro Glu Ala tgc aag ggg gaa atg aag tgc atc aac cac tac ggg ggc tac ttg tgc 298 Cys Lys Gly Glu Met Lys Cys Ile Asn His Tyr Gly Gly Tyr Leu Cys ctg ccc cgc tcc gct gcc gtc atc aac gac cta cac ggc gag gga ccc 346 Leu Pro Arg Ser Ala Ala Val Ile Asn Asp Leu His Gly Glu Gly Pro ccg cca cca gtg cct ccc gct caa cac ccc aac ccc tgc cca cca ggc 394 Pro Pro Pro Val Pro Pro Ala Gln His Pro Asn Pro Cys Pro Pro Gly tat gag ccc gac gat cag gac agc tgt gtg gat gtg gac gag tgt gcc 442 Tyr Glu Pro Asp Asp Gln Asp Ser Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala cag gcc ctg cac gac tgt cgc ccc agc cag gac tgc cat aac ttg cct 490 Gln Ala Leu Hie Asp Cys Arg Pro Ser Gln Asp Cys His Asn Leu Pro ggc tcc tat cag tgc acc tgc cct gat ggt tac cgc aag atc ggg ccc 538 Gly Ser Tyr Gln Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Ile Gly Pro gag tgt gtg gac ata gac gag tgc cgc tac cgc tac tgc cag cac cgc 586 Glu Cys Val Asp Ile Aap Glu Cys Arg Tyr Arg Tyr Cys Gln His Arg tgc gtg aac ctg cct ggc tcc ttc cgc tgc cag tgc gag ccg ggc ttc 634 WO OOf22120 PCT/FR99/02465

13 Cys Val Asn Leu Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Glu Pro Gly Phe cag ctg ggg cct aac aac cgc tcc tgt gtt gat gtg aac gag tgt gac 682 Gln Leu Gly Pro Asn Asn Arg Ser Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Asp atg ggg gcc cca tgc gag cag cgc tgc ttc aac tcc tat ggg acc ttc 730 Met Gly Ala Pro Cys Glu Gln Arg Cys Phe Asn Ser Tyr Gly Thr Phe ctg tgt cgc tgc cac cag ggc tat gag ctg cat cgg gat ggc ttc tcc 778 Leu Cys Arg Cya His Gln Gly Tyr Glu Leu His Arg Asp Gly Phe Ser tgc agt gat att gat gag tgt agc tac tcc agc tac ctc tgt cag tac 826 Cys Ser Asp Ile Asp Glu Cya Ser Tyr Ser Ser Tyr Leu Cys Gln Tyr cgc tgc gtc aac gag cca ggc cgt ttc tcc tgc cac tgc cca cag ggt 874 Arg Cys Val Asn Glu Pro Gly Arg Phe Ser Cys His Cys Pro Gln Gly tac cag ctg ctg gcc aca cgc ctc tgc caa gac att gat gag tgt gag 922 Tyr Gln Leu Leu Ala Thr Arg Leu Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Glu tct ggt gcg cac cag tgc tcc gag gcc caa acc tgt gtc aac ttc cat 970 Ser Gly Ala His Gln Cys Ser Glu Ala Gln Thr Cys Val Asn Phe His 3~ 290 295 300 ggg ggc tac cgc tgc gtg gac acc aac cgc tgc gtg gag ccc tac atc 1018 Gly Gly Tyr Arg Cys Val Asp Thr Asn Arg Cys Val Glu Pro Tyr Ile cag gtc tct gag aac cgc tgt ctc tgc ccg gcc tcc aac cct cta tgt 1066 Gln Val Ser Glu Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Asn Pro Leu Cys cga gag cag cct tca tcc att gtg cac cgc tac atg acc atc acc tcg 1114 Arg Glu Gln Pro Ser Ser Ile Val His Arg Tyr Met Thr Ile Thr Ser gag cgg agc gtg ccc gct gac gtg ttc cag atc cag gcg acc tcc gtc 1162 Glu Arg Ser Val Pro Ala Asp Val Phe Gln Ile Gln Ala Thr Ser Val tac ccc ggt gcc tac aat gcc ttt cag atc cgt gct gga aac tcg cag 1210 Tyr Pro Gly Ala Tyr Asn Ala Phe Gln Ile Arg Ala Gly Aan Ser Gln ggg gac ttt tac att agg caa atc aac aac gtc agc gcc atg ctg gtc 1258 Gly Asp Phe Tyr Ile Arg Gln Ile Asn Asn Val Ser Ala Met Leu Val ctc gcc cgg ccg gtg acg ggc ccc cgg gag tac gtg ctg gac ctg gag 1306 Leu Ala Arg Pro Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu

14 atg gtc acc atg aat tcc ctc atg agc tac cgg gcc agc tct gta ctg 1354 Met Val Thr Met Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu agg ctc acc gtc ttt gta ggg gcc tac acc ttc tgaggagcag gagggagcca 1407 Arg Leu Thr Val Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe ccctccctgc agctacccta gctgaggagc ctgttgtgag gggcagaatg agaaaggcaa 1467 taaagggaga aag 1480 <210> 22 <211> 443 <212> PRT

<213> Squence artificielle <223> Description squence MBP1 de la artificielle:

humaine (squence complte) <400> 22 Met Leu Pro Cys SerCys LeuProGly LeuLeu Trp Ala Ser Leu Ala Leu Leu Leu Leu LeuGly SerAlaSer GlnAsp Glu Leu Pro Ser Glu Pro Asp Ser Tyr GluCya ThrAspGly GluTrp Pro Thr Tyr Asp Asp Ser Gln His Cys AspVal AsnGluCys ThrIle Glu Arg Leu Pro Ala Cys Lys Gly Glu LysCys IleAsnHis GlyGly Leu Met Tyr Tyr Cys Leu Pro Arg Ser AlaVal IleAsnAsp HisGly Gly Ala Leu Glu Pro Pro Pro Pro Val Pro Pro Ala Gln His Pro Asn Pro Cys Pro Pro Gly Tyr Glu Pro Asp Asp Gln Aep Ser Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Gln Ala Leu His Asp Cys Arg Pro Ser Gln Asp Cys Hia Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Ile Gly Pro Glu Cys Val Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Arg Tyr Cys Gln His Arg Cys Val Asn Leu Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Glu Pro Gly Phe Gln Leu Gly Pro Asn Asn Arg Ser Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Asp Met Gly Ala Pro Cys Glu Gln Arg Cys phe Asn Ser Tyr Gly Thr Phe 5 Leu Cys Arg Cys His Gln Gly Tyr Glu Leu His Arg Asp Gly Phe Ser Cys Ser Asp Ile Asp Glu Cya Ser Tyr Ser Ser Tyr Leu Cys Gln Tyr Arg Cys Val Asn Glu Pro Gly Arg Phe Ser Cys His Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Ala Thr Arg Leu Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Glu Ser Gly Ala His Gln Cys Ser Glu Ala Gln Thr Cys Val Asn Phe Hia Gly Gly Tyr Arg Cys Val Aap Thr Asn Arg Cys VaI Glu Pro Tyr Ile Gln Val Ser Glu Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Asn Pro Leu Cya Arg Glu Gln Pro Ser Ser Ile Val Hia Arg Tyr Met Thr Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val Pro Ala Asp Val Phe Gln Ile Gln Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gly Ala Tyr Aan Ala Phe Gln Ile Arg Ala Gly Asn Ser Gln Gly Asp Phe Tyr Ile Arg Gln Ile Asn Asn Val Ser Ala Met Leu Val Leu Ala Arg Pro Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met Val Thr Met Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr Val Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe <210> 23 <211> 817 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: cDNA MBP1 murine (séquence partielle) <400> 23 gctgtggcag aaacccctga cttctgccca ccacctccca gcctcaggat gctccctttt 60 WO 00/22120 PCT/IïR99/02465 gcctcctgcc tccccgggtc tttgctgctc tgggcgtttc tgctgttgct cttgggagca 120 gcgtccccac aggatcccga ggagccggac agctacacgg aatgcacaga tggctatgag 180 tgggatgcag acagccagca ctgccgggat gtcaacgagt gcctgaccat cccggaggct 240 tgcaagggtg agatgaaatg catcaaccac tacgggggtt atttgtgtct gcctcgctct 300 gctgccgtca tcagtgatct ccatggtgaa ggacctccac cgccagcggc ccatgctcaa 360 caaccaaacc cttgcccgca gggctacgag cctgatgaac aggagagctg tgtggatgtg 420 gacgagtgta cccaggcttt gcatgactgt cgccctagtc aggactgcca taaccttcct 480 ggctcctacc agtgcacctg ccctgatggt taccgaaaaa ttggacccga atgtgtggac 540 atagatgagt gtcgttaccg ctattgccag catcgatgtg tgaacctgcc gggctctttt 600 cgatgccagt gtgagccagg cttccagttg ggacctaaca accgctcttg tgtggatgtg 660 aatgagtgtg acatgggagc cccatgtgag cagcgctgct tcaactccta tgggaccttc 720 ctgtgtcgct gtaaccaggg ctatgagctg caccgggatg gcttctcctg cagcgatatc 780 gatgagtgcg gctactccag ttacctctgc cagtacc g17 <210> 24 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide sens-GAPDH
<400> 24 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 25 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide antisens -GAPDH
<400> 25 agccttctcc atggtggtga agac 24 <210> 26 <211> 25 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 26 cggttggcct tggggttcag ggggg 25 <21a> 27 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide sens MBP1 <400> 27 gccctgatgg ttaccgcaag a 21 <210> 28 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide antisena MBP1 <400> 28 agcccccatg gaagttgaca c 21 <210> 29 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide sens actine <400> 29 gtggggcgcc ccaggcacca 20 <210> 30 <211> 1358 <212> ADN

<213> Squence artificielle <220>

<221> CDS

<222> (1}..(885) <220>

<223> Description de la squence artificielle:

fragment C-terni MBP1 humaine <400> 30 tgc acc tgc cct gat ggt aagatcgggcccgagtgtgtg gac tac cgc 48 Cys Thr Cys Pro Asp Gly LysIleGlyProGluCysVal Asp Tyr Arg ata gac gag tgc cgc tac tgccagcaccgctgcgtgsac ctg cgc tac 96 Ile Asp Glu Cys Arg Tyr CysGlnHisArgCysValAsn Leu Arg Tyr cct ggc tcc ttc cgc tgc gagccgggcttccagctgggg cct cag tgc 144 Pro Gly Ser Phe Arg Cys GluProGlyPheGlnLeuGly Pro Gln Cys aac aaccgctcctgtgttgatgtgaacgagtgtgacatgggggcccca 192 Asn AsnArgSerCysValAspValAsnGluCysAspMetGlyAlaPro tgc gagcagcgctgcttcaactcctatgggaccttcctgtgtcgctgc 240 Cys GluGlnArgCysPheAsnSerTyrGlyThrPheLeuCyaArgCys 65 70 ?5 80 cac cagggctatgagctgcatcgggatggcttctcctgcagtgatatt 288 Hia GlnGlyTyrGluLeuHisArgAspGlyPheSerCysSerAspIle gat gagtgtagctactccagctacctctgtcagtaccgctgcgtcaac 336 Asp GluCysSerTyrSerSerTyrLeuCysGlnTyrArgCysValAan gag ccaggccgtttctcctgccactgcccacagggttaccagctgctg 384 Glu ProGlyArgPheSerCysHisCysProGlnGlyTyrGlnLeuLeu gcc acacgcctctgccaagacattgatgagtgtgagtctggtgcgcac 432 Ala ThrArgLeuCysGlnAspIleAspGluCysGluSerGlyAlaHie cag tgctccgaggcccaaacctgtgtcaacttccatgggggctaccgc 480 Gln CyaSerGluAlaGlnThrCysValAsnPheHiaGlyGlyTyrArg tgc gtggacaccaaccgctgcgtggagccctacatccaggtctctgag 528 Cys ValAspThrAsnArgCysValGluProTyrIleGlnVaISerGlu aac cgctgtctctgcccggcctccaaccctctatgtcgagagcagcct 576 Asn ArgCysLeuCysProAlaSerAsnProLeuCyaArgGluGlnPro tca tccattgtgcaccgctacatgaccatcacctcggagcggagcgtg 624 Ser SerIleValHisArgTyrMetThrIleThrSerGluArgSerVal 4~ 195 200 205 ccc gctgacgtgttccagatccaggcgacctccgtctaccccggtgcc 672 Pro AlaAspValPheGlnIleGlnAlaThrSerValTyrProGlyAla tac aatgcctttcagatccgtgctggaaactcgcagggggacttttac 720 Tyr AsnAlaPheGlnIleArgAlaGlyAsnSerGlnGlyAspPheTyr 5~ att aggcaaatcaacaacgtcagcgccatgctggtcctcgcccggccg 768 Ile ArgGlnIleAsnAsnValSerAlaMetLeuValLeuAlaArgPro gtg acg ggc ccc cgg gag tac gtg ctg gac ctg gag atg gtc acc atg 816 Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met Val Thr Met aat tcc ctc atg agc tac cgg gcc agc tct gta ctg agg ctc acc gtc 864 Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr VaI

ttt gta 915 ggg gcc tac acc ttc tgaggagcag gagggagcca ccctccctgc Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe agctaccctagctgaggagcctgttgtgaggggcagaatgagaaaggcaataaagggaga975 aagaaagtcctggtggctgaggtgggcgggtcacactgcaggaagcctcaggctggggca1035 gggtggcacttgggggggcaggccaagttcacctaaatgggggtctctatatgttcaggc1095 ccaggggcccccattgacaggagctgggag.tctgcaccacgagcttcagtcaccccgag1155 aggagaggaggtaacgaggagggcggactccaggccccggcccagagatttggacttggc1215 tggcttgcaggggtcctaagaaactccactctggacagcgccaggaggccctgggttcca1275 ttcctaactctgcctcaaactgtacatttggataagccctagtagttccctgggcctgtt1335 tttctataaaacgaggcaactgg 1358 <210> 31 <211> 295 <212> PRT

<213> Squence artificielle <223> Description squence de la artificielle:

fragment C-terni MBP1 humaine <400> 31 Cys Thr Cys Pro GlyTyr LysIleGlyProGluCysValAsp Asp Arg Ile Asp Glu Cys TyrArg CysGlnHisArgCysValAsnLeu Arg Tyr Pro Gly Ser Phe CysGln GluProGlyPheGlnLeuGlyPro Arg Cys Asn Asn Arg Ser ValAap AsnGluCysAspMetGlyAlaPro Cys Val Cys Glu Gln Arg PheAan TyrGlyThrPheLeuCysArgCys Cys Ser 65 70 75 g0 His Gln Gly Tyr LeuHis AspGlyPheSerCysSerAspIle Glu Arg Asp Glu Cys Ser SerSer LeuCysGlnTyrArgCysValAsn Tyr Tyr Glu Pro Gly Arg SerCys CysProGlnGlyTyrGlnLeuLeu Phe His Ala Thr Arg Leu GlnAap AspGluCysGluSerGlyAlaHis Cys Ile Gln Cys Ser Glu GlnThr ValAsnPheHisGlyGlyTyrArg Ala Cys Cys Val Asp Thr Asn Arg Cys Val Glu Pro Tyr Ile Gln Val Ser Glu Asn Arg Cys Leu Cys Pro Ala Ser Asn Pro Leu Cys Arg Glu Gln Pro Ser Ser Ile Val His Arg Tyr Met Thr Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val ' 0 195 200 205 Pro Ala Asp Val Phe Gln Ile Gln Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gly Ala

15 Tyr Asn Ala Phe Gln Ile Arg Ala Gly Asn Ser Gln Gly Asp Phe Tyr Ile Arg Gln Ile Asn Asn Val Ser Ala Met Leu Val Leu Ala Arg Pro Val Thr Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Asp Leu Glu Met VaI Thr Met Asn Ser Leu Met Ser Tyr Arg Ala Ser Ser Val Leu Arg Leu Thr Val Phe Val Gly Ala Tyr Thr Phe <210> 32 <211> 1663 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<221> CDS
<222> (1)..(999) <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment c-terni fibuline 2 murine <400> 32 gag ggc tct gaa tgt gtg gat gtg aat gag tgt gag aca ggt gtg cat 48 Glu Gly Ser Glu Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Gly Val His ~JO cgc tgt ggc gag ggc caa ctg tgc tat aac ctc cct gga tcc tac cgc 96 Arg Cys Gly Glu Gly Gln Leu Cys Tyr Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Arg tgt gac tgc aag ccc ggc ttc cag agg gat gca ttc ggc agg act tgc 144 Cys Asp Cys Lys Pro Gly Phe Gln Arg Asp Ala Phe Gly Arg Thr Cys att gat gtg aac gaa tgc tgg gtc tcg ccg ggc cgc ctg tgc cag cac 192 Ile Asp Val Asn Glu Cys Trp Val Ser Pro Gly Arg Leu Cys Gln His aca tgtgagaacacaccgggctcctaccgctgctcctgcgctgctggc 240 Thr CysGluAsnThrProGlySerTyrArgCysSerCysAlaAlaGly ttc cttttggccgcagatggcaaacattgtgaagatgtgaacgagtgc 288 Phe LeuLeuAlaAlaAspGlyLysHisCysGluAspValAsnGluCys gag actcggcgctgcagccaggaatgtgccaacatctatggctcctat 336 Glu ThrArgArgCysSerGlnGluCysAlaAsnIleTyrGlySerTyr cag tgctactgccgtcagggctaccagctggcagaggatgggcatacc 384 Gln CysTyrCysArgGlnGlyTyrGlnLeuAlaGluAspGlyHisThr tgc acagacatcgatgagtgtgcacagggcgcgggcattctctgtacc 432 Cys ThrAspIleAspGluCysAlaGlnGlyAlaGlyIleLeuCysThr ttc cgctgtgtcaacgtgcctgggagctaccagtgtgcatgcccagag 480 Phe ArgCysValAsnValProGlySerTyrGlnCysAlaCysProGlu caa gggtatacaatgatggccaacgggaggtcctgcaaggacctggat 528 Gln GlyTyrThrMetMetAlaAsnGlyArgSerCysLysAspLeuAsp gag tgtgcactgggcacccacaactgctctgaggctgagacctgccac 576 Glu CysAlaLeuGlyThrHisAsnCysSerGluAlaGluThrCysHis aat atccaggggagtttccgctgcctgcgctttgattgtccacccaac 624 Asn IleGlnGlySerPheArgCysLeuArgPheAspCysProProAsn tat gtccgtgtctcacaaacgaagtgcgagcgcaccacatgccaggat 672 Tyr ValArgValSerGlnThrLysCysGluArgThrThrCysGlnAsp atc acggaatgtcaaacctcaccagctcgcatcacgcactaccagctc 720 Ile ThrGluCysGlnThrSerProAlaArgIleThrHisTyrGlnLeu aat ttccagacaggcctactggtacctgcacatatcttccgcatcggc 768 Asn PheGlnThrGlyLeuLeuValProAlaHiaIlePheArgIleGly cct gctcccgcctttgctggggacaccatctccctgaccatcacgaag 816 Pro AlaProAlaPheAlaGlyAspThrIleSerLeuThrIleThrLys ggc aatgaggagggctacttcgtcacacgcagactcaatgcctacact 864 Gly AsnGluGluGlyTyrPheValThrArgArgLeuAsnAlaTyrThr ggt gtggtatccctgcagcggtctgttctggagccgcgggactttgcc 912 Gly Val Val Ser Leu Gln Arg Ser Val Leu Glu Pro Arg Asp Phe Ala cta gat gtg gag atg aag ctt tgg cgc cag ggc tct gtc act acc ttc 960 Leu Asp Val Glu Met Lys Leu Trp Arg Gln Gly Ser Val Thr Thr Phe ctg gcc aag atg tac atc ttc ttc acc act ttt gcc cca tgaggtgaca 1009 Leu Ala Lys Met Tyr Ile Phe Phe Thr Thr Phe Ala Pro 1~ 325 330 tgtcaggcaa tccctccagg tgatgcctgg gcggtgggca gctgcgccac tcctaagtgg 1069 ctttttgctg tgactctgta acttaactta atcatgctga gctggttggt cttgagtctc 1129 taccctagag ggagggagat gcaccccagc aggcactgag tacaggccag ggtcacccga 1189 ggctagatgg tgacctgcaa actggaaaca gccatagggg gcttctgaac tccactcctc 1249 2~ aactatggct acagctgaca ttccattcct tcatccactg tgttcctcaa ttaaaaaaaa 1309 aaatcagctg tgcatggtag cacagacctt taatcctagc actggggagg cagaggtagg 1369 tagatctctg agttccaggc cagcctggtc tacactggga gttctaacca gccagagcta 1429 catagagaga ccctatctca acaaggaaaa aacgaaagaa atctctgtga gttccaggcc 1489 agcctggtct acgctgggag ttctaaccag ccagagctac atagagagat cctatctcaa 1549 caaggaaaaa tgaaagaaat cattttaaaa ggtttttttt tttgctgttg ttgtttaatg 1609 ataagagtag cacatataca ttattaaaaa tgatcaaata gcacagaaag gtta 1663 <210> 33 <211> 333 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment 4Q c-terni fibuline 2 murine <400> 33 Glu Gly Ser Glu Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Gly Val His Arg Cys Gly Glu Gly Gln Leu Cys Tyr Asn Leu Pro G1y Ser Tyr Arg Cys Asp Cys Lys Pro Gly Phe Gln Arg Aap Ala Phe Gly Arg Thr Cya Ile Asp Val Asn Glu Cys Trp Val Ser Pro Gly Arg Leu Cys Gln His Thr Cya Glu Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Cys Ala Ala Gly Phe Leu Leu Ala Ala Asp Gly Lys His Cys Glu Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Arg Arg Cys Ser Gln Glu Cys Ala Asn Ile Tyr Gly Ser Tyr Gln Cys Tyr Cys Arg Gln Gly Tyr Gln Leu Ala Glu Asp Gly Hia Thr Cjra Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ala Gln Gly Ala Gly Ile Leu Cys Thr Phe Arg Cys Val Asn Val Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Ala Cys Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Met Met Ala Aan Gly Arg Ser Cys Lys Asp Leu Asp 165 170 17s Glu Cys Ala Leu Gly Thr His Asn Cys Ser Glu Ala Glu Thr Cys Hia 2~ Asn Ile Gln Gly Ser Phe Arg Cys Leu Arg Phe Asp Cys Pro Pro Aen Tyr Val Arg Val Ser Gln Thr Lys Cys Glu Arg Thr Thr Cys Gln Aap Ile Thr Glu Cya Gln Thr Ser Pro Ala Arg Ile Thr His Tyr Gln Leu Asn Phe Gln Thr Gly Leu Leu VaI Pro Ala His Ile Phe Arg Ile Gly 3~ 245 250 255 Pro Ala Pro Ala Phe Ala Gly Asp Thr Ile Ser Leu Thr Ile Thr Lya Gly Asn Glu Glu Gly Tyr Phe Val Thr Arg Arg Leu Asn Ala Tyr Thr Gly Val Val Ser Leu Gln Arg Ser Val Leu Glu Pro Arg Asp Phe Ala Leu Asp Val Glu Met Lys Leu Trp Arg Gln Gly Ser Val Thr Thr Phe Leu Ala Lys Met Tyr Ile Phe Phe Thr Thr Phe Ala Pro

Claims

REVENDICATIONS

1. Polypeptide capable d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53, de stimuler la croissance cellulaire et de bloquer les effets anti-prolifératifs de la forme sauvage de p53.

2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID N
o 9 ou SEQ ID N o 16 ou un dérivé de celles-ci.

3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID N
o 31 ou SEQ ID N o 22 ou un dérivé de celles-ci.

4. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N o 33 ou un dérivé de celle-ci.

5. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est représenté
par la séquence polypeptidique SEQ ID N o 22.

6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5.

7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N o 15 ou de la SEQ ID N o 21 ou de leurs dérivées.

8. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N o 32 ou de ses dérivées.

9. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 ou 7 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID N o 15 ou la séquence SEQ ID N o 30.

10. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, 7 ou 9 caractérisée en ce qu'elle est représentée en SEQ ID N o 21.

11. Cellule hôte pour la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 à
10.

12. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à
caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 à 10 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit.

13. Cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 6 à 10.

14. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 à 10.

15. Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique, d'un cosmide ou de tout ADN non encapsidé par un virus.

16. Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant, et de préférence d'un virus recombinant défectif pour la réplication.

17. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 7 à 10 capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 5.

18. Sonde nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 7 à 10 ou l'ARNm correspondant.

19. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.

20. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 19 caractérisé
en ce qu'il est dirigé contre une séquence choisie parmi les séquences peptidiques présentées en SEQ ID N o 9 ou SEQ ID N o33 ou SEQ ID N o31 ou SEQ ID N o22.

21. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce qu'il possède la faculté de prévenir l'interaction entre les formes oncogéniques de p53 et un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.

22. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de se lier avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à
5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.

23. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre entre les formes oncogéniques de p53 et un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
a - on réalise la liaison de la forme oncogénique de p53 ou d'un fragment de celle ci avec ledit polypeptide ;

- on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la forme oncogénique de p53 et ledit polypeptide, - on détermine le déplacement ou l'inhibition de la liaison entre la forme oncogénique de p53 ;
- on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la forme oncogénique de p53 et ledit polypeptide ;

24. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 22.

25. Ligand capable de moduler ou d'inhiber l'interaction entre les formes oncogéniques de p53 et un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 23.

26. Utilisation d'un ligand selon la revendication 24 ou 25 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.

27. Utilisation d'un polypeptide capable d'interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53 et comprenant tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les séquences SEQ ID N o 9, N o 33, N o31, ou N o 22 ou d'un dérivé de celle -ci, selon l'une des revendications 1 à 5 pour la réalisation d'un composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable d'interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité et reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.

28. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une des revendications 19 à 21, et/ou un oligonucléotide antisens selon la revendication 17 et/ou un ligand selon l'une des revendications 24 ou 25 et/ou un composé selon la revendication 27.

29. Composition selon la revendication 28 destinée au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.

30. Composition selon la revendication 29 destinée au traitement des cancers.