CA2268018A1 - Peptides capables d'inhiber l'endocytose de l'app et sequences nucleotidiques correspondantes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux peptides capable d'inhiber au moins partiellement le phénomène d'endocytose de l'APP en interférant au niveau de l'interaction de la protéein FE65 avec la région cytoplasmique de l'APP.
Description
PEPTIDES CAPABLES D'INHIBER L'ENDOCYTOSE DE L'APP ET
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CORRESPONDANTES
La presente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement) la présente invention concerne de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins partiellement le phénomène d'endocytose de l'APP.
Le peptide (3 amyloïde) le constituant majeur de la plaque amyloïde, est un peptide d'environ 40 acides aminés de 4kDa) issu du clivage de fAPP
(Précurseur du Peptide Amyloïde). Il s'accumule de façon importante dans le cerveau, non seulement dans la maladie d'Alzheimer mais aussi dans le syndrôme de Down plus communëment appelé trisomie 21.
L'APP est une protéine glycosylée de 100 à 140kDa, possédant plusieurs domaines dont une région transmembranaire~, un domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique. La région de la molécoe plus spécifiquement concernée par l'expression du peptide (3 amyloïde chevauche en partie le domaine transmembranaire et s'étend d'autre part au sein du domaine extracellulaire. Trois formes majoritaires de l' APP, rêsultant d'un épissage alternatif, ont été caractérisées. Le gène de l'APP est localisé sur le chromosome 21 et des mutations y ont été identifiées dans 3 à
5% des patients atteints des formes familiales de la maladie d'Alzheimer.
Le rôle physiologique de fAPP n'est, à ce jour) pas complètement élucidé ;
toutefois, on pense qû il est impliqué dans l~e contact synaptique, agit à
titre de facteur de régulation de croissance) et est neuroprotectif.
Des données récentes de la lifté rature ont montré le rôle important de l'endocytose de fAPP pour la production du peptide (3 amyloïde, et ont permis d'identifier des éléments de séquence, au sein de la région cytoplasmique) utilisés comme signaux d'endocytose. C'est ainsi que des cellules transfectées avec une construction d'ADNc délétée du domaine C: terminal cytosolique de fAPP) permettent uniquement la production de la forme soluble de fAPP et ne produisent pas le peptide (3 amyloïde. Toutefois, in vi vo, on ne c;onnait pas encore la nature précise des événements responsables de l'activation de l'endocytose de fAPP ni de la transduction des signaux qui lui sont associés.
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CORRESPONDANTES
La presente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement) la présente invention concerne de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins partiellement le phénomène d'endocytose de l'APP.
Le peptide (3 amyloïde) le constituant majeur de la plaque amyloïde, est un peptide d'environ 40 acides aminés de 4kDa) issu du clivage de fAPP
(Précurseur du Peptide Amyloïde). Il s'accumule de façon importante dans le cerveau, non seulement dans la maladie d'Alzheimer mais aussi dans le syndrôme de Down plus communëment appelé trisomie 21.
L'APP est une protéine glycosylée de 100 à 140kDa, possédant plusieurs domaines dont une région transmembranaire~, un domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique. La région de la molécoe plus spécifiquement concernée par l'expression du peptide (3 amyloïde chevauche en partie le domaine transmembranaire et s'étend d'autre part au sein du domaine extracellulaire. Trois formes majoritaires de l' APP, rêsultant d'un épissage alternatif, ont été caractérisées. Le gène de l'APP est localisé sur le chromosome 21 et des mutations y ont été identifiées dans 3 à
5% des patients atteints des formes familiales de la maladie d'Alzheimer.
Le rôle physiologique de fAPP n'est, à ce jour) pas complètement élucidé ;
toutefois, on pense qû il est impliqué dans l~e contact synaptique, agit à
titre de facteur de régulation de croissance) et est neuroprotectif.
Des données récentes de la lifté rature ont montré le rôle important de l'endocytose de fAPP pour la production du peptide (3 amyloïde, et ont permis d'identifier des éléments de séquence, au sein de la région cytoplasmique) utilisés comme signaux d'endocytose. C'est ainsi que des cellules transfectées avec une construction d'ADNc délétée du domaine C: terminal cytosolique de fAPP) permettent uniquement la production de la forme soluble de fAPP et ne produisent pas le peptide (3 amyloïde. Toutefois, in vi vo, on ne c;onnait pas encore la nature précise des événements responsables de l'activation de l'endocytose de fAPP ni de la transduction des signaux qui lui sont associés.
2 L'élucidation du rôle exact de ces ;>ignaux d'endocytose dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et (approche thérapeutique de la maladie d'Alzheimer et plus généralement des maladies neurodégénératives.
La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse que la protéine FE65 ne constitue pas uniquement un activateur transcriptionnel dans le cerveau mais qu'elle interagit également au niveau de la region cytoplasmique de l'APP
en intervenant dans la modulation de l'endocytose de l'APP.
La présente invention résulte plus particulièrement de l'identification et de la caractérisation de régions particulières (dites régions effectrices) de la protéine FE65) impliquées dans la transduction des signaux d'activation de fendocytose de fAPP. La mise en évidence de l'existence de telles régions permet d' envisager la préparation de nouveaux peptides utilisables pharmaceutiqu.ement.
Au sens de la presente invention) la dénomination protéine FE65 couvre la protéine en soit ainsi que toutes ses formes homologues. Par forme homologue on entend désigner toute protéine équivalente à la protéine considérée) d'origine cellulaire diverse et notamment issue de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De pelles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Au sens de l'invention, il suffit qu'une séquence de ce type présente un pourcentage d'identité significatif pour conduire à un comportement physiologique assimilable â celui de la protéine FE 65 tel que revendiqué.
Un premier objet de l'invention concerne donc des peptides capables d' interférer au moins partiellement au niveau de Yinteraction de la protéine FE65) ou de l'une de ses formes homologues) avec la région cytoplasmique de l'APP.
Cette interférence d' un peptide selon l' invention peut se manifester sous différents aspects. Le peptide revendiqué peut ralentir) inhiber ou stimuler au moins partiellement l' interaction entre la protéine FE65 ou l' une de ses formes homologues avec la région cytoplasmique de l' APP. Die tels peptides sont préférentiellement des peptides capables ~''~ntagoniser au moins partiellement cette interaction.
WO 98I21327 PCTlFR96101775
La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse que la protéine FE65 ne constitue pas uniquement un activateur transcriptionnel dans le cerveau mais qu'elle interagit également au niveau de la region cytoplasmique de l'APP
en intervenant dans la modulation de l'endocytose de l'APP.
La présente invention résulte plus particulièrement de l'identification et de la caractérisation de régions particulières (dites régions effectrices) de la protéine FE65) impliquées dans la transduction des signaux d'activation de fendocytose de fAPP. La mise en évidence de l'existence de telles régions permet d' envisager la préparation de nouveaux peptides utilisables pharmaceutiqu.ement.
Au sens de la presente invention) la dénomination protéine FE65 couvre la protéine en soit ainsi que toutes ses formes homologues. Par forme homologue on entend désigner toute protéine équivalente à la protéine considérée) d'origine cellulaire diverse et notamment issue de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De pelles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Au sens de l'invention, il suffit qu'une séquence de ce type présente un pourcentage d'identité significatif pour conduire à un comportement physiologique assimilable â celui de la protéine FE 65 tel que revendiqué.
Un premier objet de l'invention concerne donc des peptides capables d' interférer au moins partiellement au niveau de Yinteraction de la protéine FE65) ou de l'une de ses formes homologues) avec la région cytoplasmique de l'APP.
Cette interférence d' un peptide selon l' invention peut se manifester sous différents aspects. Le peptide revendiqué peut ralentir) inhiber ou stimuler au moins partiellement l' interaction entre la protéine FE65 ou l' une de ses formes homologues avec la région cytoplasmique de l' APP. Die tels peptides sont préférentiellement des peptides capables ~''~ntagoniser au moins partiellement cette interaction.
WO 98I21327 PCTlFR96101775
3 Selon un mode particulier de (invention, les peptides sont capables de se lier au niveau du domaine d'interaction entre I~a protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues et la région cytoplasmique de fAPP.
Plus préférentiellement, les peptides de (invention comprennent tout ou partie de la sëquence peptidique codant pbur la protéine FE65 présentée en SEQ ID
N~l) SEQ ID N~2 ou un de ses dérivés.
Au sens de la présente invention) le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique) obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séduences ou des fragments de celles-ci et conservant la capacité d' interagir au niveau ~de l' interaction entre la protéine FE65) ou l' un de ses homologues, et la region cytoplasmique de l' APP. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Ix terme dêr~ivé
comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes) et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire?.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter leur efficacitë thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
En tant que peptide dérivé de la protéine FE65 et des formes homologues, on peut citer notamment tout peptide capable d'interagir avec la région cytoplasmique de fAPP) mais portant une région effectrice rendue non fonctionnelle. De tels peptides peuvent être obtenus par délétion, mutation ou disruption de cette région effectrice sur la protéine FE65 et des formes homologues. De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénèse. in vitro, par introduction d'éléments additionnels ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des élêments originels. Lorsqu'un dérivé tel que défini ci-dessus est réalisé, son activité
d'inhibiteur partiel de la fixation de la protéine FE65 et des formes homologues sur son
Plus préférentiellement, les peptides de (invention comprennent tout ou partie de la sëquence peptidique codant pbur la protéine FE65 présentée en SEQ ID
N~l) SEQ ID N~2 ou un de ses dérivés.
Au sens de la présente invention) le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique) obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séduences ou des fragments de celles-ci et conservant la capacité d' interagir au niveau ~de l' interaction entre la protéine FE65) ou l' un de ses homologues, et la region cytoplasmique de l' APP. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Ix terme dêr~ivé
comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes) et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire?.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter leur efficacitë thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
En tant que peptide dérivé de la protéine FE65 et des formes homologues, on peut citer notamment tout peptide capable d'interagir avec la région cytoplasmique de fAPP) mais portant une région effectrice rendue non fonctionnelle. De tels peptides peuvent être obtenus par délétion, mutation ou disruption de cette région effectrice sur la protéine FE65 et des formes homologues. De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénèse. in vitro, par introduction d'éléments additionnels ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des élêments originels. Lorsqu'un dérivé tel que défini ci-dessus est réalisé, son activité
d'inhibiteur partiel de la fixation de la protéine FE65 et des formes homologues sur son
4 site de fixation sur fAPP peut être mise en évidence. Toute technique connue de l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet effet.
Il peut ëgalement s'agir de fragmf:nts des séquences indiquées ci-dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique) sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de (homme du métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique) par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparêc~ chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc) selon les techniques connues de (homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
Par ailleurs, les peptides de (invention à savoir capables de ralentir ou d'inhiber au moins partiellement (interaction entre Ia protéine FE65 et des formes homologues et la région cytoplasmique de fAPP peuvent également être des peptides ayant une sêquence correspondant au site d'interaction de la protéine FE65 et des formes homologues sur la rëgion cytoplasmique de 1'APP.
D'autres peptides selon l'invention sont les peptides capables d'entrer en compétition avec les peptides définis ci-dessus pour l'interaction avec leur cible cellulaire. De tels peptides peuvent être synthétisés notamment sur la base de la séquence du peptide considéré, et leur capacité à entrer en compétition avec les peptides définis ci-dessus peut être déterminée.
Un autre objet de (invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un peptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de (homme du métier. En particulier) ces anticorps peuvent être prêparés par immunisation d'un animal contre un peptide de (invention, prélèvement du sang, et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de (homme de: !'art.
Plus préférentiellement, les anticorps ou fragments d'anticorps de (invention présentent la capacité d'inhiber au moites partiellement (interaction des peptides WO 98I21327 PCT/FR96l01775 revendiqués avec la région cytoplasmique de f APP. Ils peuvent ainsi être utilisés pour moduler fendocytose de l'APP.
Par ailleurs, ces anticorps peuvent également être utilisés pour détecter et/ou doser l'expression ou la surexpression de fAP'P dans des échantillons biologiques) et de
Il peut ëgalement s'agir de fragmf:nts des séquences indiquées ci-dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique) sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de (homme du métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique) par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparêc~ chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc) selon les techniques connues de (homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
Par ailleurs, les peptides de (invention à savoir capables de ralentir ou d'inhiber au moins partiellement (interaction entre Ia protéine FE65 et des formes homologues et la région cytoplasmique de fAPP peuvent également être des peptides ayant une sêquence correspondant au site d'interaction de la protéine FE65 et des formes homologues sur la rëgion cytoplasmique de 1'APP.
D'autres peptides selon l'invention sont les peptides capables d'entrer en compétition avec les peptides définis ci-dessus pour l'interaction avec leur cible cellulaire. De tels peptides peuvent être synthétisés notamment sur la base de la séquence du peptide considéré, et leur capacité à entrer en compétition avec les peptides définis ci-dessus peut être déterminée.
Un autre objet de (invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un peptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de (homme du métier. En particulier) ces anticorps peuvent être prêparés par immunisation d'un animal contre un peptide de (invention, prélèvement du sang, et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de (homme de: !'art.
Plus préférentiellement, les anticorps ou fragments d'anticorps de (invention présentent la capacité d'inhiber au moites partiellement (interaction des peptides WO 98I21327 PCT/FR96l01775 revendiqués avec la région cytoplasmique de f APP. Ils peuvent ainsi être utilisés pour moduler fendocytose de l'APP.
Par ailleurs, ces anticorps peuvent également être utilisés pour détecter et/ou doser l'expression ou la surexpression de fAP'P dans des échantillons biologiques) et de
5 ce fait, pour renseigner sur son état d'activation.
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. Il est en effet possible, à
partir des motifs protéiques actifs décrits dms la présente demande, de réaliser des molécules inhibitrices de la voie de signalisation dépendante de la protéine FE65 non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique.
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'invention. Il peut s'agir en particulier d'une séquence comprenant tout ou partie de la séquence présentée en SEQ ID N~1, SEQ ID N~2 ou une de leurs dérivés. Par séquence dérivée) on entend au sens de la présente invention toute séquence hybridant avec la séquence présentée en SEQ ID N~1 ou en SEQ ID
N~2 ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un peptide selon l'invention, ainsi que les séquences resultant de ces dernières par dégénérescence du code génétique.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques) d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues soit par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique), soit par synthèse chimique, soit par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques.
De telles séquences nucléotidiques peuvent être utilisées pour la production des peptides de l'invention. La présente demande concerne ainsi un procédé de préparation d'un tel peptide selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nuclêotidique selon (invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le peptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit peptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs) sequence "leader"
de sécrétion, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de (invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à
réplication
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. Il est en effet possible, à
partir des motifs protéiques actifs décrits dms la présente demande, de réaliser des molécules inhibitrices de la voie de signalisation dépendante de la protéine FE65 non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique.
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'invention. Il peut s'agir en particulier d'une séquence comprenant tout ou partie de la séquence présentée en SEQ ID N~1, SEQ ID N~2 ou une de leurs dérivés. Par séquence dérivée) on entend au sens de la présente invention toute séquence hybridant avec la séquence présentée en SEQ ID N~1 ou en SEQ ID
N~2 ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un peptide selon l'invention, ainsi que les séquences resultant de ces dernières par dégénérescence du code génétique.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques) d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues soit par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique), soit par synthèse chimique, soit par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques.
De telles séquences nucléotidiques peuvent être utilisées pour la production des peptides de l'invention. La présente demande concerne ainsi un procédé de préparation d'un tel peptide selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nuclêotidique selon (invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le peptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit peptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs) sequence "leader"
de sécrétion, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de (invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à
réplication
6 autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à rêplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être preparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines regians du génome de (hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes.
Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent) on peut citer les cellules animales, Ies levures) ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures) on peut citer les levures du genre Saccharomyces) Kluyveromyces) Pichia, Sohwanniomyces) ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO) C127, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulière~~nent Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.
Comme hôtes procaryotes, on préfère utili~~er les bactéries suivantes E.coli) Bacillus) ou Streptomyces.
Les séquences d'acides nucléiques ,<>elon l'invention peuvent également servir à
la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaire du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit) inhibant sa traduction en protéine.
L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement l'interaction des protéines FE65 sur la n~gion cytoplasmique de l'APP. De telles séquences peuvent être constituées par 'tout ou partie des séquences nucléiques définies ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de sêquences codant pour des peptides interagissant avec la région cytoplasmique de fAPP. De tels oliganucléotides peuvent être obtenus par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique.
Les séquences revendiquées peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies géniques, pour le transfert et l'expression in vivo de séquences antisens ou de peptides capables de moduler (interaction des protéines FE65 avec la région cytoplasmique de fAPP. A cet égard) les séquences peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux , permettant leur administration in vi vo (Médecine et Sciences
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes.
Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent) on peut citer les cellules animales, Ies levures) ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures) on peut citer les levures du genre Saccharomyces) Kluyveromyces) Pichia, Sohwanniomyces) ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO) C127, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulière~~nent Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.
Comme hôtes procaryotes, on préfère utili~~er les bactéries suivantes E.coli) Bacillus) ou Streptomyces.
Les séquences d'acides nucléiques ,<>elon l'invention peuvent également servir à
la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaire du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit) inhibant sa traduction en protéine.
L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement l'interaction des protéines FE65 sur la n~gion cytoplasmique de l'APP. De telles séquences peuvent être constituées par 'tout ou partie des séquences nucléiques définies ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de sêquences codant pour des peptides interagissant avec la région cytoplasmique de fAPP. De tels oliganucléotides peuvent être obtenus par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique.
Les séquences revendiquées peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies géniques, pour le transfert et l'expression in vivo de séquences antisens ou de peptides capables de moduler (interaction des protéines FE65 avec la région cytoplasmique de fAPP. A cet égard) les séquences peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux , permettant leur administration in vi vo (Médecine et Sciences
7 ( 1991 ) 705). A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus) rétrovirus, virus adéno-associé ou virus de (herpès. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon I'invention.
L'invention permet également lai realisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non) capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant) utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telies sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic) pour la détection de l'expression ou surexpression de fAPP, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et (isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à
partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines.
Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases) et elles peuvent par exemple comporter jusqli à (intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement) ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif) enzymatique) etc).
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un peptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute compK~sition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps et/ou un fragment d'anticorps tel que défini cl-avant, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides) anticorps et séquence nucléotidique définis ci-avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'activation des protéines APl' et de ce fait pour moduler son endocytose et la production de peptides (3 amyloïdE;. Plus particulièrement) ces compositions pharmaceutiques sont destinées à moduler (interaction entre les protéines FE65 et la région cytoplasmique de fAPP. Plus I>référentiellement, ces compositions sont destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement (interaction des protéines FE65 avec la région cytoplasmique de fAI'P. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinëes au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.
L'invention a encore pour objet (utilisation des molécules décrites ci-avant pour moduler (activation de fendocytose de fAPP ou le typage de maladies
L'invention permet également lai realisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non) capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant) utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telies sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic) pour la détection de l'expression ou surexpression de fAPP, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et (isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à
partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines.
Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases) et elles peuvent par exemple comporter jusqli à (intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement) ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif) enzymatique) etc).
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un peptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute compK~sition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps et/ou un fragment d'anticorps tel que défini cl-avant, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides) anticorps et séquence nucléotidique définis ci-avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'activation des protéines APl' et de ce fait pour moduler son endocytose et la production de peptides (3 amyloïdE;. Plus particulièrement) ces compositions pharmaceutiques sont destinées à moduler (interaction entre les protéines FE65 et la région cytoplasmique de fAPP. Plus I>référentiellement, ces compositions sont destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement (interaction des protéines FE65 avec la région cytoplasmique de fAI'P. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinëes au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.
L'invention a encore pour objet (utilisation des molécules décrites ci-avant pour moduler (activation de fendocytose de fAPP ou le typage de maladies
8 neurodëgénératives. En particulier, (invention concerne (utilisation de ces molécules pour inhiber au moins partiellement l'activation de l'endocytose de l'APP.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples et figures qui suivent) qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légendes des fig,rres Figure l: Représentation du vecteur pGAL4DB-CAPP
Figure 2: Représentation d'ADNs plasmidiques sur gels obtenus selon l'exemple 3.
Figure 3: Comparaison de fragments nucléotidiques de FE65 d'origines diverses MATERIELS ET TECHNIQUES MIS EN OEUVRE
1) Les souches de levures.utilisée5 sont:
La souche YCM du genre S.cerevisiae (M.9Ta, ura3-52, his3-200, ade2-10l, lys2-8D1, trpl -901, leu2-3,1l2, canr, gal4-:i42) ga180-538) URA3: : GALIl10-IacZ, LYS:: GALIl10-HIS3) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de cerveau par le système deu,r hybrides.
La souche L40 du genre S.cerevisiae (Mata, his3D200, trpl-901, leu2-3,112, ade2, LYS2:: (IexAop)4-HIS3, URA3:: (IexAop)8-hacZ, GALA) a été utilisée pour vérifier les interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est fusionné à la protëine LexA. Cette dernière est capable de reconnaître l'élément de réponse LexA
contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.
Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants:.
Milieu YPD complet: -Extrait de levures (10g/1) (Difco) -Bactopeptone (20g/1) (Difco) -Glucose (20g/1) (Merck) ç~
Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
Milieu YNB minimum:-Yeast Nitrogen Bas~~ (sans acides aminés) (6,7g/i) (Difco) - Glucose (20g/1) (Merck) Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu) iI est nëcessaire d'y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sont dépendantes à 50mg/ml. 100 Ng/ml d' ampicilline sont aj outés au milieu afin d' éviter les contaminations bactêriennes.
2) La souche de bactérig utilisée est :.
La souche TG1 d'Escherichia colt de génotype supE, hsd~5, thi, 0(lac-proAB), F'[tra D36 pro A+B+ IacIq lacZ~,M 15] . Elle a été employée comme moyen d' amplification et d'isolement de plasmides recombinants utilisés.
Elle a été cultivée sur Milieu LB: -NaCI (5g/1) (Difco) -Bactotryptone (lOg,n) (Difco) -Extrait de levure (5g/1) (Difco) Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
L'ampicilline a étë utilisée à 100~g/ml) cet antibiotique sert à sélectionner les bactéries ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet antibiotique.
3) Les~lasmides mis en oeuvre sont:.
Le vecteur pGBTlO. (Clontech),un plasmide navette de 5,4kb qui possède une origine réplication bactérienne et de levure lui pE~rmettant de se répliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l' ADN de GALA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. Il contient également le gène TRP1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sir un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l' ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries le possédant sur un milieu contenant de l' ampicilline.
Le vectew pGADlO. fourni par Clonte~ch et qui permet l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivatew de GAL4 et une protéine codée 5 par l' ADNc provenant d' une banque de cerveau) inséré au niveau d' un site EcoRI.
Le vectew pL.~x9 (pBTMII6) (Bartel et aI D.A Hartley Ed) Oxford University press page 153) de 5kb homologue au pGBTlO qui contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pow le~ répressew bactérien LexA et en amont d'un terminatew pow former une protéine de fusion.
10 4) les olig_onucléotides~le synthèse employés sont:.
CAA GTC GAC CTA GTT CTG CAT CTG CTC (SEQ ID N~3) CAA GAA TTC AAG AAA CAG TAC ACA TCC (SEQ ID N~4) Oligonucléotides qui ont permis d'obtenir le fragment PCR correspondant au CAPP
avec les sites EcoRI et SaII.
Les oligonucléatides sont synthétisés sw l' appareil Applied System ABI 394-08. Ils sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux fois par 10 volumes de n-butanol puis repris dans de l' eau. La quantification est effectuée par meswe de la densité optique (1D0 correspond à 30pg/ml).
Préparation des ADN plasmidiques.
Les grandes quantités d' ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation rapide d'ADN de Proméga.
Les petites quantités d' ADN sont préparées de la manière suivante: les bactéries contenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2m1 de milieu LB
dans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes à 14000 rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans 100p1 de la solution I (50mM de glucose, 25mM de tarnpon Tris HCl pHB, lOmM EDTA pH8)) lysées par 200p1 de la solution II (0.2M de NaOH) 1% de SDS). La solution de lyse est ensuite neutralisée par 150p1 de la solution III (3M d'acétate de potassium) 1l.5%
(v/v) d'acide acétique glacial). Après agitation des tubes jusqu'à obtenir un précipité
floconneux, 150pI u un mélange de phénol/Chloroforme (50% de phénol et 50% de chloroforme saturés en eau) sont ajoutës, et l'ensemble est agité 30 secondes.
La WO 98I21327 PCTlFR96/01775 phase acqueuse contenant l' ADN est recupérée après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm. L'ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume d'isopropanol puis centrifugé 5 minutes à 14000 rprn et séché à l' air pour enfin être repris dans 20p.1 de TE RNAse (solution de Tris-HCI lOm,M et d'EDTA 1mM avec 50~g/mt de RNAse).
G) Amplification enzy~nati e d' ADN ou PC~R (Polymerase Chain Reaction).
Les réactions de PCR sont effectuées dans wn volume final de 100A en presence de la matrice d'ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM, MgCl2 lmM, KCl 5 mM) gélatine 0,01%)) de 0,5 Elg de chacun des oligonucléotides et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide (5%). Le mélange est recouvert de 2 g<>unes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon. L'appareil utilisé est le "Crocodile II"
d'Appligene.
Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90~C, une température d'hybridation des ohgonucléotides à la matrice infèrieure de 5 à
10 degrés à la température de séparation des oligonucléotides et une température d'élongation par l'enzyme à 72~C.
7) Les ligatures.
Toutes les réactions de ligation sont effectuées à +14~C pendant une nuit dans un volume final de 10 ~1 en présence de l00 à 200 ng de vecteur, 0.5 à 2 pg d' insert, 40 UI d'enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et ur~ tampon de ligation (Tris-HCl 50 mM
pH
7,8; MgCI~ 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 rnM). Le témoin négatif est constitué par la ligation du vecteur en l'absence d'insert.
1 c.
$) La tranformation des bactéries par un ln asmidg est effectuée selon le protocole iv La totalité du volume de ligatàon ( 10p1) est utilisée pour transformer les bactéries TG 1 rendues compétentes par la méthode de Chl;ntg et al) ( PNAS,1988 86) 2172-2175).
Les bactéries TG 1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37~C) jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à
600nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB +
l00 g/1 de PEG 4000, 5% de DMSO) 10 mM de lvIgCl2) 10 mM de MgS04) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4~C
pendant 30 à
60 minutes, 200p.1 de bactéries sont mises a,u contact des produits de ligation pendant minutes sur la glace. Après addition de 200p1 de LB) les bactéries sont incubées 30 mn à 37~C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples et figures qui suivent) qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légendes des fig,rres Figure l: Représentation du vecteur pGAL4DB-CAPP
Figure 2: Représentation d'ADNs plasmidiques sur gels obtenus selon l'exemple 3.
Figure 3: Comparaison de fragments nucléotidiques de FE65 d'origines diverses MATERIELS ET TECHNIQUES MIS EN OEUVRE
1) Les souches de levures.utilisée5 sont:
La souche YCM du genre S.cerevisiae (M.9Ta, ura3-52, his3-200, ade2-10l, lys2-8D1, trpl -901, leu2-3,1l2, canr, gal4-:i42) ga180-538) URA3: : GALIl10-IacZ, LYS:: GALIl10-HIS3) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de cerveau par le système deu,r hybrides.
La souche L40 du genre S.cerevisiae (Mata, his3D200, trpl-901, leu2-3,112, ade2, LYS2:: (IexAop)4-HIS3, URA3:: (IexAop)8-hacZ, GALA) a été utilisée pour vérifier les interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est fusionné à la protëine LexA. Cette dernière est capable de reconnaître l'élément de réponse LexA
contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.
Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants:.
Milieu YPD complet: -Extrait de levures (10g/1) (Difco) -Bactopeptone (20g/1) (Difco) -Glucose (20g/1) (Merck) ç~
Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
Milieu YNB minimum:-Yeast Nitrogen Bas~~ (sans acides aminés) (6,7g/i) (Difco) - Glucose (20g/1) (Merck) Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu) iI est nëcessaire d'y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sont dépendantes à 50mg/ml. 100 Ng/ml d' ampicilline sont aj outés au milieu afin d' éviter les contaminations bactêriennes.
2) La souche de bactérig utilisée est :.
La souche TG1 d'Escherichia colt de génotype supE, hsd~5, thi, 0(lac-proAB), F'[tra D36 pro A+B+ IacIq lacZ~,M 15] . Elle a été employée comme moyen d' amplification et d'isolement de plasmides recombinants utilisés.
Elle a été cultivée sur Milieu LB: -NaCI (5g/1) (Difco) -Bactotryptone (lOg,n) (Difco) -Extrait de levure (5g/1) (Difco) Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).
L'ampicilline a étë utilisée à 100~g/ml) cet antibiotique sert à sélectionner les bactéries ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet antibiotique.
3) Les~lasmides mis en oeuvre sont:.
Le vecteur pGBTlO. (Clontech),un plasmide navette de 5,4kb qui possède une origine réplication bactérienne et de levure lui pE~rmettant de se répliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l' ADN de GALA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. Il contient également le gène TRP1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sir un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l' ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries le possédant sur un milieu contenant de l' ampicilline.
Le vectew pGADlO. fourni par Clonte~ch et qui permet l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivatew de GAL4 et une protéine codée 5 par l' ADNc provenant d' une banque de cerveau) inséré au niveau d' un site EcoRI.
Le vectew pL.~x9 (pBTMII6) (Bartel et aI D.A Hartley Ed) Oxford University press page 153) de 5kb homologue au pGBTlO qui contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pow le~ répressew bactérien LexA et en amont d'un terminatew pow former une protéine de fusion.
10 4) les olig_onucléotides~le synthèse employés sont:.
CAA GTC GAC CTA GTT CTG CAT CTG CTC (SEQ ID N~3) CAA GAA TTC AAG AAA CAG TAC ACA TCC (SEQ ID N~4) Oligonucléotides qui ont permis d'obtenir le fragment PCR correspondant au CAPP
avec les sites EcoRI et SaII.
Les oligonucléatides sont synthétisés sw l' appareil Applied System ABI 394-08. Ils sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux fois par 10 volumes de n-butanol puis repris dans de l' eau. La quantification est effectuée par meswe de la densité optique (1D0 correspond à 30pg/ml).
Préparation des ADN plasmidiques.
Les grandes quantités d' ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation rapide d'ADN de Proméga.
Les petites quantités d' ADN sont préparées de la manière suivante: les bactéries contenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2m1 de milieu LB
dans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes à 14000 rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans 100p1 de la solution I (50mM de glucose, 25mM de tarnpon Tris HCl pHB, lOmM EDTA pH8)) lysées par 200p1 de la solution II (0.2M de NaOH) 1% de SDS). La solution de lyse est ensuite neutralisée par 150p1 de la solution III (3M d'acétate de potassium) 1l.5%
(v/v) d'acide acétique glacial). Après agitation des tubes jusqu'à obtenir un précipité
floconneux, 150pI u un mélange de phénol/Chloroforme (50% de phénol et 50% de chloroforme saturés en eau) sont ajoutës, et l'ensemble est agité 30 secondes.
La WO 98I21327 PCTlFR96/01775 phase acqueuse contenant l' ADN est recupérée après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm. L'ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume d'isopropanol puis centrifugé 5 minutes à 14000 rprn et séché à l' air pour enfin être repris dans 20p.1 de TE RNAse (solution de Tris-HCI lOm,M et d'EDTA 1mM avec 50~g/mt de RNAse).
G) Amplification enzy~nati e d' ADN ou PC~R (Polymerase Chain Reaction).
Les réactions de PCR sont effectuées dans wn volume final de 100A en presence de la matrice d'ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM, MgCl2 lmM, KCl 5 mM) gélatine 0,01%)) de 0,5 Elg de chacun des oligonucléotides et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide (5%). Le mélange est recouvert de 2 g<>unes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon. L'appareil utilisé est le "Crocodile II"
d'Appligene.
Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90~C, une température d'hybridation des ohgonucléotides à la matrice infèrieure de 5 à
10 degrés à la température de séparation des oligonucléotides et une température d'élongation par l'enzyme à 72~C.
7) Les ligatures.
Toutes les réactions de ligation sont effectuées à +14~C pendant une nuit dans un volume final de 10 ~1 en présence de l00 à 200 ng de vecteur, 0.5 à 2 pg d' insert, 40 UI d'enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et ur~ tampon de ligation (Tris-HCl 50 mM
pH
7,8; MgCI~ 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 rnM). Le témoin négatif est constitué par la ligation du vecteur en l'absence d'insert.
1 c.
$) La tranformation des bactéries par un ln asmidg est effectuée selon le protocole iv La totalité du volume de ligatàon ( 10p1) est utilisée pour transformer les bactéries TG 1 rendues compétentes par la méthode de Chl;ntg et al) ( PNAS,1988 86) 2172-2175).
Les bactéries TG 1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37~C) jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à
600nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB +
l00 g/1 de PEG 4000, 5% de DMSO) 10 mM de lvIgCl2) 10 mM de MgS04) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4~C
pendant 30 à
60 minutes, 200p.1 de bactéries sont mises a,u contact des produits de ligation pendant minutes sur la glace. Après addition de 200p1 de LB) les bactéries sont incubées 30 mn à 37~C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.
9) Les séparation et extr~ct~n des ADN sont effectuées comme suit:
15 La séparation des ADN est realisée en fonction de leur taille par électrophorèse. Pour ce faire; différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments à séparer:
-gels de polyacrylamides précoulés (Novex) à 6%, 10% et 20% pour la séparation des petits fragments d'ADN (75 à 500pb) -gel d'agarose à 1% (Gibco BR.L) dans un tampon TBE (Tris base 90mM;
Borate 90mM; EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d'ADN
(supérieurs à 500pdb) -gel d'agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBE
pour la séparation de petits fragments (infèrieurs à 500 pdb).
Toute migration sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée dans un tampon TBE et en présence d'un marqueta- de poids moléculaire (1Kb ladder, Gibco BRL). L'ADN est mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200g/1 de Ficoll) 0,5g/1 de bleu de bromophénol) 50mM d'EDTA) avant d'être déposé sur gel. Après migration à 100 Volts et coloration au bromure d'éthydium (concentration 0.5pg/ml de gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV.
L'extraction de l'ADN de la bande d'un ~;el d'agarose est réalisée par électroélution comme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d' ADN est découpé au scalpel et mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à
SOOpI de TBE. L'ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse où il subit un champ électrique de 100 Volts. L' ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié
par deux extractions au phénol/chloroforme suivies de deux extractions au chloroforme, puis précipité en présence d'acétate de sodium 1),3M et de 2,5 volume d'éthanol absolu.
Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d' ADN est séché puis repris dans 20p1 l'eau.
15 La séparation des ADN est realisée en fonction de leur taille par électrophorèse. Pour ce faire; différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments à séparer:
-gels de polyacrylamides précoulés (Novex) à 6%, 10% et 20% pour la séparation des petits fragments d'ADN (75 à 500pb) -gel d'agarose à 1% (Gibco BR.L) dans un tampon TBE (Tris base 90mM;
Borate 90mM; EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d'ADN
(supérieurs à 500pdb) -gel d'agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBE
pour la séparation de petits fragments (infèrieurs à 500 pdb).
Toute migration sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée dans un tampon TBE et en présence d'un marqueta- de poids moléculaire (1Kb ladder, Gibco BRL). L'ADN est mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200g/1 de Ficoll) 0,5g/1 de bleu de bromophénol) 50mM d'EDTA) avant d'être déposé sur gel. Après migration à 100 Volts et coloration au bromure d'éthydium (concentration 0.5pg/ml de gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV.
L'extraction de l'ADN de la bande d'un ~;el d'agarose est réalisée par électroélution comme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d' ADN est découpé au scalpel et mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à
SOOpI de TBE. L'ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse où il subit un champ électrique de 100 Volts. L' ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié
par deux extractions au phénol/chloroforme suivies de deux extractions au chloroforme, puis précipité en présence d'acétate de sodium 1),3M et de 2,5 volume d'éthanol absolu.
Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d' ADN est séché puis repris dans 20p1 l'eau.
10) Séauença~e fluorescent des ADN plasmi;dic~ues.
Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4 didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent. L' incorporation de l'un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par la Taq polymérase de l' ADN à séquencer. Cette réaction donnera des fragments d' ADN
de tailles différentes) tous terminés en 3' par un des 4 didéoxyribonuclëotides.
Un pg d'un plasmide et 4 picomoles d'un primer sont ajoutés à 9,5p1 d'un "prénwc"
fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prisme. Le volume final doit être de 20p1 pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape de dénaturation à 96~C pendant 30 secondes,une étape d'hybridation à 50~C pendant secondes et une étape d'élongation à 60~C Fendant 4 minutes.
Les fragments d'ADN, obtenus après ;amplification, sont purifiés sur colonne d'exclusion (Chromaspin-30 de Clontech); et sont ensuite séchés au Speed Vac.
L'ensemble est repris par 5N.1 d'un mélange formé de 24p1 d'EDTA (50mM) et 120p1 de formamide désionisée. Après dénaturation à 96~C pendant 3 minutes, 3 à 5p1 sont déposés sur un gel d'électropharèse. Les différents fragments d'ADN sont séparés suivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de l'Appareil 370 DNA sequencer (Applied Biosystems) où les différentes fluorescentes vont être détectées.
Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4 didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent. L' incorporation de l'un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par la Taq polymérase de l' ADN à séquencer. Cette réaction donnera des fragments d' ADN
de tailles différentes) tous terminés en 3' par un des 4 didéoxyribonuclëotides.
Un pg d'un plasmide et 4 picomoles d'un primer sont ajoutés à 9,5p1 d'un "prénwc"
fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prisme. Le volume final doit être de 20p1 pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape de dénaturation à 96~C pendant 30 secondes,une étape d'hybridation à 50~C pendant secondes et une étape d'élongation à 60~C Fendant 4 minutes.
Les fragments d'ADN, obtenus après ;amplification, sont purifiés sur colonne d'exclusion (Chromaspin-30 de Clontech); et sont ensuite séchés au Speed Vac.
L'ensemble est repris par 5N.1 d'un mélange formé de 24p1 d'EDTA (50mM) et 120p1 de formamide désionisée. Après dénaturation à 96~C pendant 3 minutes, 3 à 5p1 sont déposés sur un gel d'électropharèse. Les différents fragments d'ADN sont séparés suivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de l'Appareil 370 DNA sequencer (Applied Biosystems) où les différentes fluorescentes vont être détectées.
11) Préparation de plasmides de la banque de cerveau (Clontech~).
La banque de fusion d' ADNc de cerveau est vendue sous forme de bactéries. Ces dernières contiennent un plasmide pGADlO renfermant un insert correspondant à
un ADNc de cerveau humain. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à la technique des oligodT et la technique d.es oligonucléotides dégénérés qui permet d' avoir les parties 5' des ARNm qui sont difficiles à obtenir par la première technique.
Ces cDNA sont clonés dans le vecteur pGAI)IO au niveau du site EcoRI.
Après vérification du titre de la banque) 21g1 de bactéries de la banque de fusion de cerveau, mises au préalablement dans 8 m1 de LB, sont étalées de façon non confluente sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous avons ainsi étalé 16 boites de 770 cm2 contenant un milieu LB+ampicilline. Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30m1 de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuber dans un shaker à 37~C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique de la Maxiprep. La concentration ~en ADN sera determinée à 260nm.
La banque de fusion d' ADNc de cerveau est vendue sous forme de bactéries. Ces dernières contiennent un plasmide pGADlO renfermant un insert correspondant à
un ADNc de cerveau humain. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à la technique des oligodT et la technique d.es oligonucléotides dégénérés qui permet d' avoir les parties 5' des ARNm qui sont difficiles à obtenir par la première technique.
Ces cDNA sont clonés dans le vecteur pGAI)IO au niveau du site EcoRI.
Après vérification du titre de la banque) 21g1 de bactéries de la banque de fusion de cerveau, mises au préalablement dans 8 m1 de LB, sont étalées de façon non confluente sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous avons ainsi étalé 16 boites de 770 cm2 contenant un milieu LB+ampicilline. Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30m1 de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuber dans un shaker à 37~C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique de la Maxiprep. La concentration ~en ADN sera determinée à 260nm.
12) Transformation de la levure par un ~lasnnide.
Les levures préalablement cultivées dans 100m1 de milieu liquide sont récoltées après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans 1m1 d'eau stérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 m1 d'eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette opération est répétée une nouvelle fois afin d'ëliminer toute trace du milieu de culture.
Les levures sont ensuite reprises par 1 m1 de la solution I de transformation (LiAc 0.1M) Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA 1mM). puis centrifugées à 3000 rpm pendant 3 minutes. Le culot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de transformation. 501 de cette suspension de levures sont mis en présence de 50pg d'ADN de sperme de saumon et de 1 à 5 ~g d' ADN plasmidique. 300A d' une solutïon II de transformation (LiAc 0.1M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDT,~ 1mM dans du PEG4ooo 40%) sont ensuite ajoutés, puis l'ensemble est mis à incubf:r à 28~C pendant 30 minutes. Un choc thermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-marie à
40~C pendant 15 minutes puis l'ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1 mn afin de récolter le culot cellulaire. Ce culot est repris dans 200.I d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite mises à
cultiver pendant 72 heures à 28~C.
Dans le cas particulier de la tranfor-rnaticm de la levure par la banque d' ADNc de cerveau, on procède comme suit:
La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-CAPP codant pour la partie C-terminale de l'APP fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Elle est cultivée dans 250m1 de milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu à 28~C sous agitation jusqu' à une densité de 10' celh~les/ml. L.es cellules sont récoltées par 5 centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250m1 d'eau.
Après une nouvelle centrifugation le culot cellulaire e;>t repris dans 100m1 d'eau et à
nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 1()inl de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28~C sous agitation. Après centrifugation les cellules sont à
nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 pl de la banque 10 d'ADNc de cerveau et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28~C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42~C pendant 20 minutt~s. Une centrifugation (3000 rpm pendant 5mn) est répétée 3 fois de suite) en reprenant à chaque fois le culot avec 10 ml d'eau stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. Ainsi le PEG toxique 15 pour les cellules a été éliminé. 2,4 m1 de cette suspension sont utilisés pour ensemmencer 250 m1 de milieu minimum contenant les acides aminés His) Lys, Ad et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28"C. Les 100 pl de cette suspension restants servent à vérifier l'efficacité de la transformation; pour cela des dilutions de 102, 10-3 et 10~ de cette suspension ont été réalisées et étalëes sur un milieu minimum contenant les acides aminés His) Lys) Ad. Après cuuture à 28~C durant 2 jours les colonies obtenues ont été comptées et le taux de transformation est déterminé en utilisant la formule : "nombre de colonies x facteur de cGlution". La culture de nuit est centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée à l'eau stÉ~rile deux fois de suite. Le culot est ensuite repris dans 2,5 m1 d'eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10m1 dans de l'eau stérile) sont utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cmz contenant un milieu YNB+Lys+Ad et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 pl restants sont utilisés pour effectuer les mëmes opérations que lors de la détermination du taux de transformation) afin de déterminer le taux d' amplification du nombre de colonies au cours d' une nuit de culture.
L' ADN (génomique et plasmidique) est extrait des levures de la manière suivante:.
La valeur d' une anse moyenne d' un clône d~e levure est mise dans 200p 1 d' une solution TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI l~DOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA 1mM), en présence de 3g de billes de verre de 450 pm de diamètre et de 200p.1 de phénol/chloroforme. Ce mélange est vortexé pendant 15 minutes, puis centrifugé
pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l' ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d' éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 mirmtes à 14000 rpm) le culot d' ADN
est séché et repris dans 201 de TEI2NAse. Cette solution d' ADN, qui correspond à
un mélange d' ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer des bactéries. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de miniprel>.
Les levures préalablement cultivées dans 100m1 de milieu liquide sont récoltées après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans 1m1 d'eau stérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 m1 d'eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette opération est répétée une nouvelle fois afin d'ëliminer toute trace du milieu de culture.
Les levures sont ensuite reprises par 1 m1 de la solution I de transformation (LiAc 0.1M) Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA 1mM). puis centrifugées à 3000 rpm pendant 3 minutes. Le culot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de transformation. 501 de cette suspension de levures sont mis en présence de 50pg d'ADN de sperme de saumon et de 1 à 5 ~g d' ADN plasmidique. 300A d' une solutïon II de transformation (LiAc 0.1M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDT,~ 1mM dans du PEG4ooo 40%) sont ensuite ajoutés, puis l'ensemble est mis à incubf:r à 28~C pendant 30 minutes. Un choc thermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-marie à
40~C pendant 15 minutes puis l'ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1 mn afin de récolter le culot cellulaire. Ce culot est repris dans 200.I d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite mises à
cultiver pendant 72 heures à 28~C.
Dans le cas particulier de la tranfor-rnaticm de la levure par la banque d' ADNc de cerveau, on procède comme suit:
La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-CAPP codant pour la partie C-terminale de l'APP fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Elle est cultivée dans 250m1 de milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu à 28~C sous agitation jusqu' à une densité de 10' celh~les/ml. L.es cellules sont récoltées par 5 centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250m1 d'eau.
Après une nouvelle centrifugation le culot cellulaire e;>t repris dans 100m1 d'eau et à
nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 1()inl de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28~C sous agitation. Après centrifugation les cellules sont à
nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 pl de la banque 10 d'ADNc de cerveau et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28~C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42~C pendant 20 minutt~s. Une centrifugation (3000 rpm pendant 5mn) est répétée 3 fois de suite) en reprenant à chaque fois le culot avec 10 ml d'eau stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. Ainsi le PEG toxique 15 pour les cellules a été éliminé. 2,4 m1 de cette suspension sont utilisés pour ensemmencer 250 m1 de milieu minimum contenant les acides aminés His) Lys, Ad et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28"C. Les 100 pl de cette suspension restants servent à vérifier l'efficacité de la transformation; pour cela des dilutions de 102, 10-3 et 10~ de cette suspension ont été réalisées et étalëes sur un milieu minimum contenant les acides aminés His) Lys) Ad. Après cuuture à 28~C durant 2 jours les colonies obtenues ont été comptées et le taux de transformation est déterminé en utilisant la formule : "nombre de colonies x facteur de cGlution". La culture de nuit est centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée à l'eau stÉ~rile deux fois de suite. Le culot est ensuite repris dans 2,5 m1 d'eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10m1 dans de l'eau stérile) sont utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cmz contenant un milieu YNB+Lys+Ad et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 pl restants sont utilisés pour effectuer les mëmes opérations que lors de la détermination du taux de transformation) afin de déterminer le taux d' amplification du nombre de colonies au cours d' une nuit de culture.
L' ADN (génomique et plasmidique) est extrait des levures de la manière suivante:.
La valeur d' une anse moyenne d' un clône d~e levure est mise dans 200p 1 d' une solution TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI l~DOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA 1mM), en présence de 3g de billes de verre de 450 pm de diamètre et de 200p.1 de phénol/chloroforme. Ce mélange est vortexé pendant 15 minutes, puis centrifugé
pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l' ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d' éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 mirmtes à 14000 rpm) le culot d' ADN
est séché et repris dans 201 de TEI2NAse. Cette solution d' ADN, qui correspond à
un mélange d' ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer des bactéries. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de miniprel>.
13) Test d'activité de la f3$alactosidase.
Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Grâce au phënomène d'adsorption on obtiendra une image fidèle de l'emplacement des clônes. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libërer ainsi l'activité l3galactosidase. Après décongelation) la feuille de nitrocellulose est déposée) colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman préalablement imbibé de 1,5m1 de solution F'BS (NaZHP04 60mM) NaHZP04 40mM, KCI lOmM, MgS04 lmM, pH7) et de 10 à 301 de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-(3-D-galactoside) à 50mg/ml de N,N.-diméthylformamide. La boite est ensuite placée dans une étuve à 37~C couvercle fern~ê pour éviter le dessèchement . Le temps d'apparition de la couleur bleue peut être tré;> variable, de quelques minutes à plusieurs heures. Ce test doit toujours se faire en présence d' un témoin positif dont l' interaction est connue et vire rapidement au bleu.
EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protêine de fusion entre la partie C-terminale du précurseur du peptide amyloïde (CAPP) et le domaine de liaison à l'ADN de GAL,4 Le criblage d' une banque utilisant le système double hybride nécessite que la rëgion C-terminale de l'APP (CAPP) soit fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de la protéine transactivatrice GAL4. L'expression de cette protëine de fusion est réalisée grâce au vecteur pGBTIO (cf matériels et méthodes) ) dans lequel nous avons introduit) li dans ie même cadre de lecture que la séquence correspondant au domaine de liaison à
l'ADN de GAL4 (GAL4DB)) la séquence codant pour le CAPP figurant dans la sequence présentée en SEQ ID N~1.
Le fragment d' ADN de 138 pdb correspondant aux 46 derniers acides aminés de l'APP a été obtenu par PCR à partir des oligonucléotides (SEQ ID N~3 et N~4) qui nous ont également permis d'introduire ies sites EcoRI et SaII aux extrémités de la séquence. Le fragment de PCR a été introdl;ût entre les sites EcoRI et SaII du multisite de clonage du plasmide pGBTlO en aval de la séquence correspondant au GAL4DB
pour donner le vecteur pGAL4DB-CAPP (fig.2).
La construction a été vérifiée par séquenyage de l'ADN. Cette vérification nous a permis de montrer que ce fragment ne présentait pas de mutations générées au cours de la réaction de PCR et qu' il était fusionné dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant au GAL4DB.
EXEMPLE 2: CRIBLAGE DE LA BANyUE DE FUSION DE CERVEAU.
Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transacti:vateur de GAL4, pouvant interagir avec notre protéine d' intérêt. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs His3 et LacZ dans la souche YCM.
Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à
partir d' ADNc provenant de cerveau humain. Comme cette banque nous a été fournie sous forme de bactéries, l' ADN plasmidique de l.a banque a tout d' abord été
purifié.
2.1) P~aration de l'ADN plasmidique d'une banaue de fusion..
L'ADN plasmidique de la banque d'AI)Nc de cerveau a été extrait suivant le protocole Clontech~ (voir matériels et méthodes) ~ 11). Lors de cette préparation ~1 était important de préserver la représentativité de la banque, c' est à dire, conserver le nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de 1,2.106 plasmides.
Afin de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cette préparation) le lot d'ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à
partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de deux fois la représentativité de la banque soit 4.106 colonies.
2.2) Transformation ~~n~ue de cerv<:au et sélection par le test d'activité
(~galactosidase.
Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide GAL4DB-CAPP. Pour préserver cette probabilité il est important d' avoir une bonne efficacité de transformation de la levure. Pour cela nous avons choisi un protocole de transformation ~de la levure donnant une efficacité de 105 cellules transformées par pg d'ADN. De plus comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré
utiliser une levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-CAPP. Cette souche YCM-CAPP de phénotype His-, Lys-, Leu- a été transformée par 100pg d' ADN
plasmidique de la banque de fusion. Cette quantité d'ADN nous a permis d'obtenir après estimation (voir matériels et méthodes) 10' cellules transformées, ce qui correspond à un nombre légèrement supérieur au nombre de plasmides indépendants que constitue Ia banque. D'après ce résultat nous pouvons penser que la quasi totalité
des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Ad.
A l' issu de cette sélection 1000 clones avec un phénotype His+ ont été
obtenus. Sur ces transformants un test d' activité (3galact~osidase a été effectué afin de valider par l'expression de l'autre gène rapporteur) La~.Z, ce nombre de clones obtenus.
68 des 1000 clones obtenus présentaient le double phénotype His+) (3Ga1+ pouvant correspondre à une interaction protéine-protéine.
EXEMPLE 3: ISOLEMENT DES PLASrVIIDES DE LA BANQUE
Afin d'identifier tes protéines pouvant interagir avec le CAPP) nous avons extrait les plasmides de la banque de fusion contenus dans les levures sélectionnées lors du 19' criblage double hybride. Pour pouvoir en obtenir en grande quantité) cet isolement nécessite au préalable une transformation d' E.coli par un extrait d' ADN des souches de levures positives. Comme le plasmide de: la banque contenu dans cet extrait est un plasmide navette levure/E.coli il pourra facilement se repliquer chez la bactérie. Afin d'éviter d'isoler le plasmide GAL4 DB - CAPP qui est lui aussi présent dans la levure nous avons travaillé sur des souches qui en sont dépourvues.
Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation par des extraits d' ADN de levures ont été analysées par digestion avec des enzymes de restriction et séparation des fragments d' AI)N sur gel d' agarose. Nous avons obtenu 3 profils de restriction différents sur les 5 clones analysés (7D) 3E) 9A, 3H, 3G) (fig 2}.
Ces résultats ont montré que 2 plasmides identiques sont au moins représentés dans 2 clones de levures différents, les clones 7D, ainsi que les clones 3H et 3G.
L'ADN du clone 3E est obtenu à partir de souches de phénotype His+ et (3GAL+.
EXEMPLE 4: DETERMINATION DE LA SEOUENCE DES INSERTS DES
PLASMIDES IDENTIFIES.
Le séquençage a été réalisé à partir de l'oligonucléotide (SEQ ID N~5) complémentaire de la région de GAL4TA .à proximité du site d' insertion de la banque de cDNA de cerveau, à 52 pdb du site EcoRI.
La comparaison des 3 séquences avec les séquences contenues dans les banques de données GENBank et EMBL (European Molecular Biology Lab} a montré que les séquences des ADNc qui étaient dans lca plasmides issus des souches 9A et 3H
présentent 87% d'homologie au niveau nucleïque avec le gène marin codant pour la protéine FE65, elles sont représentées en SEQ ID N~2) et que la séquence du plasmide issu de la souche 7D présente 60% d' homologie avec ce même gène ( voir figure 3).
L'analyse de la séquence des plasmides is:~us des souches 9A et 3H indique que ceux-ci contiennent deux régions chevauchantes correspondant à un même ARNm.
20~
S
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC ROBER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron (C) VILLE: ANTONY
IO (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TLPHONE: 40.91.69.22 (H) TLCOPIE: (1) 40.91.72.96 IS () TITRE DE L' INVENTION:
(iii) NOMBRE DE SQUENCES: 5 (iv) FORME DCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
2O (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SEÇiUENCE:
(A) LONGUEUR:1500 (B) TYPE: nuclëotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
4O (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR:1275 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linëa:ire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Arg Glu Glu Ser Gln Leu Thr Trp Thr Gly Phe Ala His Gly Glu Gly Phe Glu Asp Gly Glu Phe Trp Lys Asp Glu Pro Ser Asp Glu Ala Pro Met Glu Leu Gly Leu Lys Glu Pro Glu Glu Gly Thr Leu Thr Phe Pro GCT CAG AGC CTC AGC CCA GAG CCG TTG ~~CC CAA GAG GAG GAG AAG CTT 192 AIa GIn Ser Leu Ser Pro Glu Pro Leu Pro Gln Glu GIu Glu Lys Leu 1~ 50 55 60 CCC CCA CGG AAT ACC AAC CCA GGG ATC .AAG TGT TTC GCC GTG CGC TCC 240 Pro Pro Arg Asn Thr Asn Pro Gly Ile Lys Cys Phe Ala Val Arg Ser Leu Gly Trp Val Glu Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Pro Gly Arg Ser Ser Val Ala Val Asn Asn Cys Ile Arg Gln Leu Ser Tyr His Lys Asn Asn Leu His Asp Pro Met Ser Gly Gly Trp Gly Glu Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Leu Glu Asp Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Pro Gln Ser 3~ 130 135 140 Gln Ala Leu Leu His AIa Gln Pro Ile Ile Ser Ile Arg Val Trp Gly Val Gly Arg Asp Ser Gly Arg Glu Arg Asp Phe Ala Tyr Val Ala Arg Asp Lys Leu Thr Gln Met Leu Lys Cys His Val Phe Arg Cys Glu Ala Pro Ala Lys Asn Ile Ala Thr Ser Leu His Glu Ile Cys Ser Lys Ile Met Ala Glu Arg Gly Asn Ala Arg Cys Leu Val Asn Gly Leu Ser Leu 5~ 210 215 220 Asp His Ser Lys Leu Val Asp Val Pro Phe Gln Val Glu Phe Pro Ala Pro Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Phe Gln Val Tyr Tyr Leu Gly Asn Val Pro Val Ala Lys Pro Val Gly Val Asp Val Ile Asn Gly Ala Leu Glu Ser Val Leu Ser Ser Ser Ser Arg Glu Gln Trp Thr Pro Ser His 1~ Val Ser Val Ala Pro Ala Thr Leu Thr Ile Leu His Gln Gln Thr Glu Ala Val Leu Gly Glu Cys Arg Val Arg Phe Leu Ser Phe Leu Ala Val Gly Arg Asp Val His Thr Phe Ala Phe Ile Met Ala Ala Gly Pro Ala Ser Phe Cys Cys His Met Phe Trp Cys Glu Pro Asn Ala Ala Ser Leu Ser Glu Ala Val Gln Ala Ala Cys Met Leu Arg Tyr Gln Lys Cys Leu Asp Ala Arg Ser Gln Ala Ser Thr Ser Cys Leu Pro Ala Pro Pro Ala Glu Ser Val Ala Arg Gly Val Gly Trp Thr Val Arg Arg Gly Val Gln Ser Leu Trp Gly Ser Leu Lys Pro Lys Arg Val Gly Gly His Thr Pro TGA AGA AGC CCC ACC TTC CCT CCA CCT' 1275 * Arg Ser Pro Thr Phe Pro Pro Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCIs: SEQ ID NO: 3:
S (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQtJENCE:
(A) LONGUEUR
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simp:Le (D) CONFIGURATION: linéai:ce (ü ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAAGAATTCA AGAAACAGTA CACATCC
2O (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQ1;.1ENCE:
(A) LONGUEUR:23 (B) TYPE: nucléotide (c> NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 5:
Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Grâce au phënomène d'adsorption on obtiendra une image fidèle de l'emplacement des clônes. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libërer ainsi l'activité l3galactosidase. Après décongelation) la feuille de nitrocellulose est déposée) colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman préalablement imbibé de 1,5m1 de solution F'BS (NaZHP04 60mM) NaHZP04 40mM, KCI lOmM, MgS04 lmM, pH7) et de 10 à 301 de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-(3-D-galactoside) à 50mg/ml de N,N.-diméthylformamide. La boite est ensuite placée dans une étuve à 37~C couvercle fern~ê pour éviter le dessèchement . Le temps d'apparition de la couleur bleue peut être tré;> variable, de quelques minutes à plusieurs heures. Ce test doit toujours se faire en présence d' un témoin positif dont l' interaction est connue et vire rapidement au bleu.
EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protêine de fusion entre la partie C-terminale du précurseur du peptide amyloïde (CAPP) et le domaine de liaison à l'ADN de GAL,4 Le criblage d' une banque utilisant le système double hybride nécessite que la rëgion C-terminale de l'APP (CAPP) soit fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de la protéine transactivatrice GAL4. L'expression de cette protëine de fusion est réalisée grâce au vecteur pGBTIO (cf matériels et méthodes) ) dans lequel nous avons introduit) li dans ie même cadre de lecture que la séquence correspondant au domaine de liaison à
l'ADN de GAL4 (GAL4DB)) la séquence codant pour le CAPP figurant dans la sequence présentée en SEQ ID N~1.
Le fragment d' ADN de 138 pdb correspondant aux 46 derniers acides aminés de l'APP a été obtenu par PCR à partir des oligonucléotides (SEQ ID N~3 et N~4) qui nous ont également permis d'introduire ies sites EcoRI et SaII aux extrémités de la séquence. Le fragment de PCR a été introdl;ût entre les sites EcoRI et SaII du multisite de clonage du plasmide pGBTlO en aval de la séquence correspondant au GAL4DB
pour donner le vecteur pGAL4DB-CAPP (fig.2).
La construction a été vérifiée par séquenyage de l'ADN. Cette vérification nous a permis de montrer que ce fragment ne présentait pas de mutations générées au cours de la réaction de PCR et qu' il était fusionné dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant au GAL4DB.
EXEMPLE 2: CRIBLAGE DE LA BANyUE DE FUSION DE CERVEAU.
Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transacti:vateur de GAL4, pouvant interagir avec notre protéine d' intérêt. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs His3 et LacZ dans la souche YCM.
Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à
partir d' ADNc provenant de cerveau humain. Comme cette banque nous a été fournie sous forme de bactéries, l' ADN plasmidique de l.a banque a tout d' abord été
purifié.
2.1) P~aration de l'ADN plasmidique d'une banaue de fusion..
L'ADN plasmidique de la banque d'AI)Nc de cerveau a été extrait suivant le protocole Clontech~ (voir matériels et méthodes) ~ 11). Lors de cette préparation ~1 était important de préserver la représentativité de la banque, c' est à dire, conserver le nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de 1,2.106 plasmides.
Afin de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cette préparation) le lot d'ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à
partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de deux fois la représentativité de la banque soit 4.106 colonies.
2.2) Transformation ~~n~ue de cerv<:au et sélection par le test d'activité
(~galactosidase.
Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide GAL4DB-CAPP. Pour préserver cette probabilité il est important d' avoir une bonne efficacité de transformation de la levure. Pour cela nous avons choisi un protocole de transformation ~de la levure donnant une efficacité de 105 cellules transformées par pg d'ADN. De plus comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré
utiliser une levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-CAPP. Cette souche YCM-CAPP de phénotype His-, Lys-, Leu- a été transformée par 100pg d' ADN
plasmidique de la banque de fusion. Cette quantité d'ADN nous a permis d'obtenir après estimation (voir matériels et méthodes) 10' cellules transformées, ce qui correspond à un nombre légèrement supérieur au nombre de plasmides indépendants que constitue Ia banque. D'après ce résultat nous pouvons penser que la quasi totalité
des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Ad.
A l' issu de cette sélection 1000 clones avec un phénotype His+ ont été
obtenus. Sur ces transformants un test d' activité (3galact~osidase a été effectué afin de valider par l'expression de l'autre gène rapporteur) La~.Z, ce nombre de clones obtenus.
68 des 1000 clones obtenus présentaient le double phénotype His+) (3Ga1+ pouvant correspondre à une interaction protéine-protéine.
EXEMPLE 3: ISOLEMENT DES PLASrVIIDES DE LA BANQUE
Afin d'identifier tes protéines pouvant interagir avec le CAPP) nous avons extrait les plasmides de la banque de fusion contenus dans les levures sélectionnées lors du 19' criblage double hybride. Pour pouvoir en obtenir en grande quantité) cet isolement nécessite au préalable une transformation d' E.coli par un extrait d' ADN des souches de levures positives. Comme le plasmide de: la banque contenu dans cet extrait est un plasmide navette levure/E.coli il pourra facilement se repliquer chez la bactérie. Afin d'éviter d'isoler le plasmide GAL4 DB - CAPP qui est lui aussi présent dans la levure nous avons travaillé sur des souches qui en sont dépourvues.
Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation par des extraits d' ADN de levures ont été analysées par digestion avec des enzymes de restriction et séparation des fragments d' AI)N sur gel d' agarose. Nous avons obtenu 3 profils de restriction différents sur les 5 clones analysés (7D) 3E) 9A, 3H, 3G) (fig 2}.
Ces résultats ont montré que 2 plasmides identiques sont au moins représentés dans 2 clones de levures différents, les clones 7D, ainsi que les clones 3H et 3G.
L'ADN du clone 3E est obtenu à partir de souches de phénotype His+ et (3GAL+.
EXEMPLE 4: DETERMINATION DE LA SEOUENCE DES INSERTS DES
PLASMIDES IDENTIFIES.
Le séquençage a été réalisé à partir de l'oligonucléotide (SEQ ID N~5) complémentaire de la région de GAL4TA .à proximité du site d' insertion de la banque de cDNA de cerveau, à 52 pdb du site EcoRI.
La comparaison des 3 séquences avec les séquences contenues dans les banques de données GENBank et EMBL (European Molecular Biology Lab} a montré que les séquences des ADNc qui étaient dans lca plasmides issus des souches 9A et 3H
présentent 87% d'homologie au niveau nucleïque avec le gène marin codant pour la protéine FE65, elles sont représentées en SEQ ID N~2) et que la séquence du plasmide issu de la souche 7D présente 60% d' homologie avec ce même gène ( voir figure 3).
L'analyse de la séquence des plasmides is:~us des souches 9A et 3H indique que ceux-ci contiennent deux régions chevauchantes correspondant à un même ARNm.
20~
S
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC ROBER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron (C) VILLE: ANTONY
IO (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TLPHONE: 40.91.69.22 (H) TLCOPIE: (1) 40.91.72.96 IS () TITRE DE L' INVENTION:
(iii) NOMBRE DE SQUENCES: 5 (iv) FORME DCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
2O (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SEÇiUENCE:
(A) LONGUEUR:1500 (B) TYPE: nuclëotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
4O (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR:1275 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linëa:ire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Arg Glu Glu Ser Gln Leu Thr Trp Thr Gly Phe Ala His Gly Glu Gly Phe Glu Asp Gly Glu Phe Trp Lys Asp Glu Pro Ser Asp Glu Ala Pro Met Glu Leu Gly Leu Lys Glu Pro Glu Glu Gly Thr Leu Thr Phe Pro GCT CAG AGC CTC AGC CCA GAG CCG TTG ~~CC CAA GAG GAG GAG AAG CTT 192 AIa GIn Ser Leu Ser Pro Glu Pro Leu Pro Gln Glu GIu Glu Lys Leu 1~ 50 55 60 CCC CCA CGG AAT ACC AAC CCA GGG ATC .AAG TGT TTC GCC GTG CGC TCC 240 Pro Pro Arg Asn Thr Asn Pro Gly Ile Lys Cys Phe Ala Val Arg Ser Leu Gly Trp Val Glu Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Pro Gly Arg Ser Ser Val Ala Val Asn Asn Cys Ile Arg Gln Leu Ser Tyr His Lys Asn Asn Leu His Asp Pro Met Ser Gly Gly Trp Gly Glu Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Leu Glu Asp Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Pro Gln Ser 3~ 130 135 140 Gln Ala Leu Leu His AIa Gln Pro Ile Ile Ser Ile Arg Val Trp Gly Val Gly Arg Asp Ser Gly Arg Glu Arg Asp Phe Ala Tyr Val Ala Arg Asp Lys Leu Thr Gln Met Leu Lys Cys His Val Phe Arg Cys Glu Ala Pro Ala Lys Asn Ile Ala Thr Ser Leu His Glu Ile Cys Ser Lys Ile Met Ala Glu Arg Gly Asn Ala Arg Cys Leu Val Asn Gly Leu Ser Leu 5~ 210 215 220 Asp His Ser Lys Leu Val Asp Val Pro Phe Gln Val Glu Phe Pro Ala Pro Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Phe Gln Val Tyr Tyr Leu Gly Asn Val Pro Val Ala Lys Pro Val Gly Val Asp Val Ile Asn Gly Ala Leu Glu Ser Val Leu Ser Ser Ser Ser Arg Glu Gln Trp Thr Pro Ser His 1~ Val Ser Val Ala Pro Ala Thr Leu Thr Ile Leu His Gln Gln Thr Glu Ala Val Leu Gly Glu Cys Arg Val Arg Phe Leu Ser Phe Leu Ala Val Gly Arg Asp Val His Thr Phe Ala Phe Ile Met Ala Ala Gly Pro Ala Ser Phe Cys Cys His Met Phe Trp Cys Glu Pro Asn Ala Ala Ser Leu Ser Glu Ala Val Gln Ala Ala Cys Met Leu Arg Tyr Gln Lys Cys Leu Asp Ala Arg Ser Gln Ala Ser Thr Ser Cys Leu Pro Ala Pro Pro Ala Glu Ser Val Ala Arg Gly Val Gly Trp Thr Val Arg Arg Gly Val Gln Ser Leu Trp Gly Ser Leu Lys Pro Lys Arg Val Gly Gly His Thr Pro TGA AGA AGC CCC ACC TTC CCT CCA CCT' 1275 * Arg Ser Pro Thr Phe Pro Pro Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCIs: SEQ ID NO: 3:
S (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQtJENCE:
(A) LONGUEUR
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simp:Le (D) CONFIGURATION: linéai:ce (ü ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAAGAATTCA AGAAACAGTA CACATCC
2O (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQ1;.1ENCE:
(A) LONGUEUR:23 (B) TYPE: nucléotide (c> NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 5:
Claims (21)
1. Peptide caractérisé en ce qu'il est capable d'interférer au niveau de l'interaction de la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues avec la région cytoplasmique de l'APP.
2. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'interférence se traduit par un ralentissement, une inhibition ou une stimulation de ladite interaction.
3. Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est capable de se lier au niveau du domaine d'interaction entre la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues et la région cytoplasmique de l'APP.
4. Peptide selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou d'un dérivé de celles-ci.
5. Peptide capable d'entrer en compétition avec un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 au niveau du domaine d'interaction entre la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues et la région cytoplasmique de l'APP.
6. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable de moduler l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de l'APP
obtenu par reproduction des motifs actifs des peptides selon les revendications 1 à 5 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
obtenu par reproduction des motifs actifs des peptides selon les revendications 1 à 5 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
7. Séquence nucléotidique codant pour un peptide tel que défini en revendication 1 à 5.
8. Séquence nucléotidique selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence comprenant tout ou partie de la SEQ ID N°1, SEQ
ID N°2 ou d'une séquence dérivée de celles-ci.
ID N°2 ou d'une séquence dérivée de celles-ci.
9. Séquence selon la revendication 7 ou 8 introduite dans un vecteur viral ou non viral.
10. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 7 ou 8.
11. Anticorps ou fragment d'anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé
contre un peptide selon l'une des revendications 1 à 5.
contre un peptide selon l'une des revendications 1 à 5.
12. Sonde nucléotidique capable de s'hybrider avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 ou avec l'ARNm correspondant.
13. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 6 ou un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 11 ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 7 à 9.
14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur viral ou non viral recombinant dans lequel est incorporée une séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou 8.
15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral choisi parmi les rétrovirus et les adénovirus.
16. Composition pharmaceutique selon une des revendications 13 à 15 destinée à moduler l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de l'APP.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17 destinée à
interférer au niveau de l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de l'APP.
interférer au niveau de l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de l'APP.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 destinée au traitement des maladies neurodégénératives.
19. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 11 et/ou d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 7 ou 8 pour le typage de maladies neurodégénératives.
20. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou 8 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le peptide produit.
21. Virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
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