FR2740454A1 - Peptides capables d'inhiber l'endocytose de l'app et sequences nucleotidiques correspondantes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins partiellement le phénomène d'endocytose de l'APP.

Description

La présente invention concerne de nouvelles séquences peptidiques et nucléotidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux peptides capables d'inhiber au moins partiellement le phénomène d'endocytose de l'APP.

Le peptide ss amyloïde, le constituant majeur de la plaque amyloïde, est un peptide d'environ 40 acides aminés de 4kDa, issu du clivage de l'APP (Précurseur du
Peptide Amyloïde). Il s'accumule de façon importante dans le cerveau, non seulement dans la maladie d'Alzheimer mais aussi dans le syndrôme de Down plus communément appelé trisomie 21.

L'APP est une protéine glycosylée de 100 à 140ka, possédant plusieurs domaines dont une région transmembranaire, un domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique. La région de la molécule plus spécifiquement concernée par l'expression du peptide ss amyloïde chevauche en partie le domaine transmembranaire et s'étend d'autre part au sein du domaine extracellulaire. Trois formes majoritaires de
I' APP, résultant d'un épissage alternatif, ont été caractérisées. Le gène de l'APP est localisé sur le chromosome 21 et des mutations y ont été identifiées dans 3 à 5% des patients atteints des formes familiales de la maladie d'Alzheimer.

Le rôle physiologique de l'APP n'est, à ce jour, pas complètement élucidé toutefois, on pense qu'il est impliqué dans le contact synaptique, agit à titre de facteur de régulation de croissance, et est neuroprotectif.

Des données récentes de la littérature ont montré le rôle important de l'endocytose de l'APP pour la production du peptide ss amyloïde, et ont permis d'identifier des éléments de séquence, au sein de la région cytoplasmique, utilisés comme signaux d'endocytose. C'est ainsi que des cellules transfectées avec une construction d'ADNc délétée du domaine C terminal cytosolique de l'APP, permettent uniquement la production de la forme soluble de l'APP et ne produisent pas le peptide ss amyloïde. Toutefois, in vive, on ne connait pas encore la nature précise des événements responsables de l'activation de l'endocytose de l'APP ni de la transduction des signaux qui lui sont associés.

L'élucidation du rôle exact de ces signaux d'endocytose dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la maladie d'Alzheimer et plus généralement des maladies neurodégénératives.

La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse que la protéine FE65 ne constitue pas uniquement un activateur transcriptionnel dans le cerveau mais qu'elle interagit également au niveau de la région cytoplasmique de l'APP en intervenant dans la modulation de l'endocytose de l'APP.

La présente invention résulte plus particulièrement de l'identification et de la caractérisation de régions particulières (dites régions effectrices) de la protéine FE65, impliquées dans la transduction des signaux d'activation de l'endocytose de l'APP. La mise en évidence de l'existence de telles régions permet d'envisager la préparation de nouveaux peptides utilisables pharmaceutiquement.

Au sens de la présente invention, la dénomination protéine FE65 couvre la protéine en soit ainsi que toutes ses formes homologues. Par forme homologue on entend désigner toute protéine équivalente a la protéine considérée, d'origine cellulaire diverse et notamment issue de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Au sens de l'invention, il suffit qu'une séquence de ce type présente un pourcentage d'identité significatif pour conduire à un comportement physiologique assimilable à celui de la protéine FE 65 tel que revendiqué.

Un premier objet de l'invention concerne donc des peptides capables d'interférer au moins partiellement au niveau de l'interaction de la protéine FE65, ou de l'une de ses formes homologues, avec la région cytoplasmique de l'APP.

Cette interférence d'un peptide selon l'invention peut se manifester sous différents aspects. Le peptide revendiqué peut ralentir, inhiber ou stimuler au moins partiellement l'interaction entre la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues avec la région cytoplasmique de l'APP. De tels peptides sont préférentiellement des peptides capables d'antagoniser au moins partiellement cette interaction.

Selon un mode particulier de l'invention, les peptides sont capables de se lier au niveau du domaine d'interaction entre la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues et la région cytoplasmique de l'APP.

Plus préférentiellement, les peptides de l'invention comprennent tout ou partie de la séquence peptidique codant pour la protéine FE65 présentée en SEQ ID N"1,
SEQ ID N"2 ou un de ses dérivés.

Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et conservant la capacité d'interagir au niveau de l'interaction entre la protéine FE65, ou l'un de ses homologues, et la région cytoplasmique de l'APP. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type.De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire).

De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.

En tant que peptide dérivé de la protéine FE65 et des formes homologues, on peut citer notamment tout peptide capable d'interagir avec la région cytoplasmique de l'APP, mais portant une région effectrice rendue non fonctionnelle. De tels peptides peuvent être obtenus par délétion, mutation ou disruption de cette région effectrice sur la protéine FE65 et des formes homologues. De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénèse il vitre, par introduction d'éléments additionnels ou de séquences synthétiques, ou par des délétions ou des substitutions des éléments originels.Lorsqu'un dérivé tel que défini ci-dessus est réalisé, son activité d'inhibiteur partiel de la fixation de la protéine FE65 et des formes homologues sur son site de fixation sur l'APP peut être mise en évidence. Toute technique connue de l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet effet.

Il peut également s'agir de fragments des séquences indiquées ci-dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de l'homme du métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique.La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de l'homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.

Par ailleurs, les peptides de l'invention à savoir capables de ralentir ou d'inhiber au moins partiellement l'interaction entre la protéine FE65 et des formes homologues et la région cytoplasmique de l'APP peuvent également être des peptides ayant une séquence correspondant au site d'interaction de la protéine FE65 et des formes homologues sur la région cytoplasmique de l'APP.

D'autres peptides selon l'invention sont les peptides capables d'entrer en compétition avec les peptides définis ci-dessus pour l'interaction avec leur cible cellulaire. De tels peptides peuvent être synthétisés notamment sur la base de la séquence du peptide considéré, et leur capacité à entrer en compétition avec les peptides définis ci-dessus peut être déterminée.

Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un peptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier, ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un peptide de l'invention, prélèvement du sang, et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art.

Plus préférentiellement, les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention présentent la capacité d'inhiber au moins partiellement l'interaction des peptides revendiqués avec la région cytoplasmique de l'APP. Ils peuvent ainsi être utilisés pour moduler l'endocytose de l'APP.

Par ailleurs, ces anticorps peuvent également être utilisés pour détecter et/ou doser l'expression ou la surexpression de l'APP dans des échantillons biologiques, et de ce fait, pour renseigner sur son état d'activation.

L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. II est en effet possible, à partir des motifs protéiques actifs décrits dans la présente demande, de réaliser des molécules inhibitrices de la voie de signalisation dépendante de la protéine FE65 non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique.

La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'invention. Il peut s'agir en particulier d'une séquence comprenant tout ou partie de la séquence présentée en SEQ ID N 1, SEQ ID N"2 ou une de leurs dérivés. Par séquence dérivée, on entend au sens de la présente invention toute séquence hybridant avec la séquence présentée en SEQ ID N"1 ou en SEQ ID N"2 ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un peptide selon l'invention, ainsi que les séquences résultant de ces dernières par dégénérescence du code génétique.

Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues soit par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique), soit par synthèse chimique, soit par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques.

De telles séquences nucléotidiques peuvent être utilisées pour la production des peptides de l'invention. La présente demande concerne ainsi un procédé de préparation d'un tel peptide selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le peptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit peptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, sequence "leader" de sécrétion, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif.Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent etre préparés en utilisant des séquences a réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, I'intégration du vecteur.

Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.

Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.

Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent également servir à la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaire du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement l'interaction des protéines FE65 sur la région cytoplasmique de l'APP. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléiques définies ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides interagissant avec la région cytoplasmique de l'APP. De tels oligonucléotides peuvent être obtenus par fragmentation, etc, ou par synthèse chimique.

Les séquences revendiquées peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies géniques, pour le transfert et l'expression in vivo de séquences antisens ou de peptides capables de moduler l'interaction des protéines FE65 avec la région cytoplasmique de l'APP. A cet égard, les séquences peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vivo (Médecine et Sciences 2 (1991) 705). A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associé ou virus de l'herpès. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.

L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant, utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection de l'expression ou surexpression de l'APP, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à- partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines.

Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent par exemple comporter jusqu'à l'intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc).

L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un peptide tel que défini ci-avant.

Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps et/ou un fragment d'anticorps tel que défini ciavant, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.

Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps et séquence nucléotidique définis ci-avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'activation des protéines APP et de ce fait pour moduler son endocytose et la production de peptides ss amyloïde. Plus particulièrement, ces compositions pharmaceutiques sont destinées à moduler l'interaction entre les protéines FE65 et la région cytoplasmique de l'APP. Plus préférentiellement, ces compositions sont destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement l'interaction des protéines FE65 avec la région cytoplasmique de l'APP. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.

L'invention a encore pour objet l'utilisation des molécules décrites ci-avant pour moduler l'activation de l'endocytose de l'APP ou le typage de maladies neurodégénératives. En particulier, I'invention concerne l'utilisation de ces molécules pour inhiber au moins partiellement l'activation de l'endocytose de l'APP.

D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Légendes des figures:
Figure 1: Représentation du vecteur pGAL4DB-CAPP
Figure 2: Représentation d'ADNs plasmidiques sur gels obtenus selon l'exemple 3.

Figure 3: Comparaison de fragments nucléotidiques de FE65 d'origines diverses
MATERIELS ET TECHNIQUES MIS EN OEUVRE 1) Les souches de levures.utilisées sont:
La souche YCM du genre S.cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-lOl, lys2801, trpl-901, letl2-3,112, canr, gal4-542, gal80-538, URA3::GAL1/10-lacZ,
LYS::GAL1/10-HIS3) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de cerveau par le système deux hybrides.

La souche L40 du genre S.cerevisiae (Mata, his3D200, trpl-901, let(2-3,112, ade2,
LYS2:: (lexAop)4-HIS3, URA3::(lexAop)8-LacZ, GAL4) a été utilisée pour vérifier les interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est fusionné à la protéine LexA. Cette dernière est capable de reconnaître l'élément de réponse LexA contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.

Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants:
Milieu YPD complet: -Extrait de levures (10g/l) (Difco)
-Bactopeptone (20g/l) (Difco)
-Glucose (20g/l) (Merck)
Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco).

Milieu YNB minimum:-Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/l) (Difco)
- Glucose (20g/l) (Merck)
Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco).

Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu, il est nécessaire d'y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sont dépendantes à 50mg/ml. 100 pg/ml d'ampicilline sont ajoutés au milieu afin d'éviter les contaminations bactériennes.

2) La souche de bactérie utilisée est
La souche TGI d'Escherichia coli de génotype supE, hsdA5, thi, A(lac-proAB), F'[tra
D36 pro AtB' lacIq lacZ5MI 5]. Elle a été employée comme moyen d'amplification et d'isolement de plasmides recombinants utilisés.

Elle a été cultivée sur
Milieu LB: -NaCI (5g/l) (Difco)
-Bactotryptone (lOg/l) (Difco)
-Extrait de levure (5g/l) (Difco)
Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco).

L'ampicilline a été utilisée à l00ug/ml, cet antibiotique sert à sélectionner les bactéries ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet antibiotique.

3) Les plasmides mis en oeuvre sont:.

Le vecteur pGBTî0. (Clontech),un plasmide navette de 5,4kb qui possède une origine réplication bactérienne et de levure lui permettant de se répliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de
GAL4 et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. il contient également le gène TRIP 1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l'ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries le possédant sur un milieu contenant de l'ampicilline.

Le vecteur pGAD10, fourni par Clontech et qui permet l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et une protéine codée par l'ADNc provenant d'une banque de cerveau, inséré au niveau d'un site EcoRI.

Le vecteur pLex9 (pBTM116) (Bartel et al D.A Hartley Ed, Oxford University press page 153) de 5kb homologue au pGBT10 qui contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le répresseur bactérien LexA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion.

4) les oligonucléotides de synthèse emplovés sont:
CAA GTC GAC CTA GTT CTG CAT CTG CTC (SEQ ID N"3)
CAA GAA TTC AAG AAA CAG TAC ACA TCC (SEQ ID N 4)
Oligonucléotides qui ont permis d'obtenir le fragment PCR correspondant au CAPP avec les sites EcoRI et SalI.

Les oligonucléotides sont synthétisés sur l'appareil Applied System ABI 394-08. Ils sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux fois par 10 volumes de n-butanol puis repris dans de l'eau. La quantification est effectuée par mesure de la densité optique (IDO correspond à 30g/ml).

5) Préparation des ADN plasmidiques.

Les grandes quantités d'ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation rapide d'ADN de Proméga.

Les petites quantités d'ADN sont préparées de la manière suivante: les bactéries contenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2ml de milieu LB dans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes à 14000 rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans 100C11 de la solution I (50mM de glucose, 25mM de tampon Tris HCI pH8, 10mM EDTA pH8), lysées par 200p1 de la solution II (0.2M de NaOH, 1% de SDS). La solution de lyse est ensuite neutralisée par 150,u1 de la solution III (3M d'acétate de potassium, 11.5% (v/v) d'acide acétique glacial).Après agitation des tubes jusqu'à obtenir un précipité floconneux, 150CL1 d'un mélange de phénoUChloroforme (50% de phénol et 50% de chloroforme saturés en eau) sont ajoutés, et l'ensemble est agité 30 secondes. La phase acqueuse contenant l'ADN est récupérée après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm. L'ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume d'isopropanol puis centrifugé 5 minutes à 14000 rpm et séché à l'air pour enfin être repris dans 20111 de TE RNAse (solution de Tris-HCI 10mM et d'EDTA ImM avec 50 g/ml de
RNAse).

6) Amplification enzymatique d'ADN ou PCR (Polymerase Chain Reaction).

Les réactions de PCR sont effectuées dans un volume final de 100p1 en présence de la matrice d'ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM,
MgCl2 ImM, KCI 5 mM, gélatine 0,01%), de 0,5 g de chacun des oligonucléotides et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide (5%). Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon. L'appareil utilisé est le "Crocodile II" d'Appligene.

Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90 C, une température d'hybridation des oligonucléotides à la matrice inférieure de 5 à 10 degrés à la température de séparation des oligonucléotides et une température d'élongation par l'enzyme à 72 C.

7) Les ligatures.

Toutes les réactions de ligation sont effectuées à +14 C pendant une nuit dans un volume final de 10 Cll en présence de 100 à 200 ng de vecteur, 0.5 à 2 g d'insert, 40
UI d'enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et un tampon de ligation (Tris-HCl 50 mM pH 7,8; MgCl2 10 mM; DTT 10 mM; ATP I mM). Le témoin négatif est constitué par la ligation du vecteur en l'absence d'insert.

8) La tranformation des bactéries par un plasmide est effectuée selon le protocole suivant:.

La totalité du volume de ligation (10 l) est utilisée pour transformer les bactéries TG1 rendues compétentes par la méthode de Chung et al, (PNAS,1988 86, 2172-2175).

Les bactéries TGI sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37"C, jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à 600nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB + 100 g/l de PEG 4000, 5% de DMSO, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4 C pendant 30 à 60 minutes, 200 l de bactéries sont mises au contact des produits de ligation pendant 15 minutes sur la glace. Après addition de 200,ul de LB, les bactéries sont incubées 30 mn à 37 C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.

9) Les séparation et extraction des ADN sont effectuées comme suit:
La séparation des ADN est réalisée en fonction de leur taille par électrophorèse. Pour ce faire; différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments à séparer:
-gels de polyacrylamides précoulés (Novex) à 6%, 10% et 20% pour la séparation des petits fragments d'ADN (75 à 500pb)
-gel d'agarose à 1% (Gibco BRL) dans un tampon TBE (Tris base 90mM;
Borate 90mM; EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d'ADN (supérieurs à 500pdb)
-gel d'agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBE pour la séparation de petits fragments (infèrieurs à 500 pdb).

Toute migration sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée dans un tampon TBE et en présence d'un marqueur de poids moléculaire (1Kb ladder, Gibco
BRL). L'ADN est mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200g/l de Ficoll, 0,5g/1 de bleu de bromophénol, 50mM d'EDTA) avant d'être déposé sur gel. Après migration à 100 Volts et coloration au bromure d'éthydium (concentration 0.51lg/ml de gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV.

L'extraction de l'ADN de la bande d'un gel d'agarose est réalisée par électroélution comme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d'ADN est découpé au scalpel et mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à 500p1 de
TBE. L'ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse où il subit un champ électrique de 100 Volts. L'ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié par deux extractions au phénoUchloroforme suivies de deux extractions au chloroforme, puis précipité en présence d'acétate de sodium 0,3M et de 2,5 volume d'éthanol absolu.

Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d'ADN est séché puis repris dans 20p11'eau.

10) Séquençage fluorescent des ADN plasmidiques.

Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4 didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent. L'incorporation de l'un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par la Taq polymérase de l'ADN à séquencer. Cette réaction donnera des fragments d'ADN de tailles différentes, tous terminés en 3' par un des 4 didéoxyribonucléotides.

Un g d'un plasmide et 4 picomoles d'un primer sont ajoutés à 9,5l d'un "prémix" fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prisme Le volume final doit être de 20 l pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape de dénaturation à 96 C pendant 30 secondes,une étape d'hybridation à 50 C pendant 15 secondes et une étape d'élongation à 60 C pendant 4 minutes.

Les fragments d'ADN, obtenus après amplification, sont purifiés sur colonne d'exclusion (Chromaspin-30 de Clontech), et sont ensuite séchés au Speed Vac.

L'ensemble est repris par 5 l d'un mélange formé de 24p1 d'EDTA (50mM) et 120 l de formamide désionisée. Après dénaturation à 96 C pendant 3 minutes, 3 à 5tl1 sont déposés sur un gel d'électrophorèse. Les différents fragments d'ADN sont séparés suivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de l'Appareil 370 DNA sequencer (Applied Biosystems) ou les différentes fluorescences vont être détectées.

11) Préparation de plasmides de la banque de cerveau (Clontech).

La banque de fusion d'ADNc de cerveau est vendue sous forme de bactéries. Ces dernières contiennent un plasmide pGAD10 renfermant un insert correspondant à un
ADNc de cerveau humain. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à la technique des oligodT et la technique des oligonucléotides dégénérés qui permet d'avoir les parties 5' des ARNm qui sont difficiles à obtenir par la première technique.

Ces cDNA sont clonés dans le vecteur pGAD10 au niveau du site EcoRI.

Après vérification du titre de la banque, 2p1 de bactéries de la banque de fusion de cerveau, mises au préalablement dans 8 ml de LB, sont étalées de façon non confluente sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous avons ainsi étalé 16 boites de 770 cm2 contenant un milieu LB+ampicilline. Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30ml de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuber dans un shaker à 37 C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique de la Maxiprep. La concentration en ADN sera determinée à 260nm.

12) Transformation de la levure par un plasmide.

Les levures préalablement cultivées dans 100ml de milieu liquide sont récoltées après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans Iml d'eau stérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 ml d'eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette opération est répétée une nouvelle fois afin d'éliminer toute trace du milieu de culture. Les levures sont ensuite reprises par I ml de la solution I de transformation (LiAc 0. 1M, Tris-HCl pH 7,5 10mM, EDTA ImM). puis centrifugées à 3000 rpm pendant 3 minutes.Le culot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de transformation. 50 l de cette suspension de levures sont mis en présence de 5011g d'ADN de sperme de saumon et de I à 5 g d'ADN plasmidique. 300,ul d'une solution II de transformation (LiAc 0. IM, Tris-HCl pH 7,5 10mM, EDTA 1mM dans du PEG4000 40%) sont ensuite ajoutés, puis l'ensemble est mis à incuber à 28 C pendant 30 minutes. Un choc thermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-marie à 40 C pendant 15 minutes puis l'ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1 mn afin de récolter le culot cellulaire.Ce culot est repris dans 200p1 d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite mises à cultiver pendant 72 heures à 28 C.

Dans le cas particulier de la tranformation de la levure par la banque d'ADNc de cerveau, on procède comme suit:
La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-CAPP codant pour la partie Cterminale de l'APP fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Elle est cultivée dans 250ml de milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu à 28 C sous agitation jusqu'à une densité de 107 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250ml d'eau. Après une nouvelle centrifugation le culot cellulaire est repris dans 100ml d'eau et à nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 10ml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28 C sous agitation.Après centrifugation les cellules sont à nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 l de la banque d'ADNc de cerveau et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28 C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42 C pendant 20 minutes. Une centrifugation (3000 rpm pendant 5mn) est répétée 3 fois de suite, en reprenant à chaque fois le culot avec 10 ml d'eau stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PBS.Ainsi le PEG toxique pour les cellules a été éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemmencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys, Ad et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28"C. Les 100 ul de cette suspension restants servent à vérifier l'efficacité de la transformation; pour cela des dilutions de 10-2, 10-3 et 104 de cette suspension ont été réalisées et étalées sur un milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys, Ad. Après culture à 28 C durant 2 jours les colonies obtenues ont été comptées et le taux de transformation est déterminé en utilisant la formule : "nombre de colonies x facteur de dilution".La culture de nuit est centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée à l'eau stérile deux fois de suite. Le culot est ensuite repris dans 2,5 ml d'eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10ml dans de l'eau stérile, sont utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cm2 contenant un milieu YNB+Lys+Ad et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 1ll restants sont utilisés pour effectuer les mêmes opérations que lors de la détermination du taux de transformation, afin de déterminer le taux d'amplification du nombre de colonies au cours d'une nuit de culture.

L'ADN (génomique et plasmidique) est extrait des levures de la manière suivante:.

La valeur d'une anse moyenne d'un clône de levure est mise dans 200,u1 d'une solution
TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI 100mM, Tris pH8 10mM, EDTA ImM), en présence de 3g de billes de verre de 450 pm de diamètre et de 200Cl1 de phénol/chloroforme. Ce mélange est vortexé pendant 15 minutes, puis centrifugé pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l'ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d'ADN est séché et repris dans 20,ul de TERNAse. Cette solution d'ADN, qui correspond à un mélange d'ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer des bactéries.Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de miniprep.

13) Test d'activité de la ssgalactosidase.

Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Grâce au phénomène d'adsorption on obtiendra une image fidèle de l'emplacement des clônes. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l'activité ngalactosidase. Après décongelation, la feuille de nitrocellulose est déposée, colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman préalablement imbibé de 1,5ml de solution PBS (Na2HPO4 60mM, NaH2PO4 40mM,
KCI 10mM, MgSO4 ImM, pH7) et de 10 à 30111 de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3 indoyl-ss-D-galactoside) à 50mg/ml de N,N-diméthylformamide.La boite est ensuite placée dans une étuve à 37"C couvercle fermé pour éviter le dessèchement . Le temps d'apparition de la couleur bleue peut être trés variable, de quelques minutes à plusieurs heures. Ce test doit toujours se faire en présence d'un témoin positif dont l'interaction est connue et vire rapidement au bleu.

EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine de fusion entre la partie C-terminale du précurseur du peptide amyloide (CAPP) et le domaine de liaison à l'ADN de GAL4
Le criblage d'une banque utilisant le système double hybride nécessite que la région Cterminale de l'APP (CAPP) soit fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de la protéine transactivatrice GAL4. L'expression de cette protéine de fusion est réalisée grâce au vecteur pGBT10 (cf matériels et méthodes), dans lequel nous avons introduit, dans le même cadre de lecture que la séquence correspondant au domaine de liaison à
I'ADN de GAL4 (GAL4DB), la séquence codant pour le CAPP figurant dans la sequence présentée en SEQ ID N"1.

Le fragment d'ADN de 138 pdb correspondant aux 46 derniers acides aminés de l'APP a été obtenu par PCR à partir des oligonucléotides (SEQ ID N"3 et N04) qui nous ont également permis d'introduire les sites EcoRI et SalI aux extrémités de la séquence. Le fragment de PCR a été introduit entre les sites EcoRI et SalI du multisite de clonage du plasmide pGBTIO en aval de la séquence correspondant au GAL4DB pour donner le vecteur pGAL4DB-CAPP (fig.2).

La construction a été vérifiée par séquençage de l'ADN. Cette vérification nous a permis de montrer que ce fragment ne présentait pas de mutations générées au cours de la réaction de PCR et qu'il était fusionné dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant au GAL4DB
EXEMPLE 2: CRIBLAGE DE LA BANQUE DE FUSION DE CERVEAU.

Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec notre protéine d'intérêt. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire ltexpression des gènes rapporteurs His3 et LacZ dans la souche YCM.

Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à partir d'ADNc provenant de cerveau humain. Comme cette banque nous a été fournie sous forme de bactéries, l'ADN plasmidique de la banque a tout d'abord été purifié.

2.1) Préparation de l'ADN plasmidique d'une banque de fusion..

L'ADN plasmidique de la banque d'ADNc de cerveau a été extrait suivant le protocole Clontecht (voir matériels et méthodes, 11). Lors de cette préparation il était important de préserver la représentativité de la banque, c'est à dire, conserver le nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de 1,2.106 plasmides.

Afin de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cette préparation, le lot d'ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de deux fois la représentativité de la banque soit 4.106 colonies.

2.2) Transformation par banque de cerveau et sélection par le test d'activité ssgalactosidase.

Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide GAL4DB-CAPP. Pour préserver cette probabilité il est important d'avoir une bonne efficacité de transformation de la levure. Pour cela nous avons choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de 105 cellules transformées par ,ug d'ADN. De plus comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré utiliser une levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-CAPP. Cette souche
YCM-CAPP de phénotype His-, Lys-, Leu- a été transformée par 100pg d'ADN plasmidique de la banque de fusion.Cette quantité d'ADN nous a permis d'obtenir après estimation (voir matériels et méthodes) 1 107 cellules transformées, ce qui correspond à un nombre légèrement supérieur au nombre de plasmides indépendants que constitue la banque. D'après ce résultat nous pouvons penser que la quasi totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Ad.

A l'issu de cette sélection 1000 clones avec un phénotype His+ ont été obtenus. Sur ces transformants un test d'activité ssgalactosidase a été effectué afin de valider par l'expression de l'autre gène rapporteur, LacZ, ce nombre de clones obtenus. 68 des 1000 clones obtenus présentaient le double phénotype His+, ssGal+ pouvant correspondre à une interaction protéine-protéine.

EXEMPLE 3: ISOLEMENT DES PLASMIDES DE LA BANOUE
Afin d'identifier les protéines pouvant interagir avec le CAPP, nous avons extrait les plasmides de la banque de fusion contenus dans les levures sélectionnées lors du criblage double hybride. Pour pouvoir en obtenir en grande quantité, cet isolement nécessite au préalable une transformation d'E.coli par un extrait d'ADN des souches de levures positives. Comme le plasmide de la banque contenu dans cet extrait est un plasmide navette levure/E.coli il pourra facilement se répliquer chez la bactérie. Afin d'éviter d'isoler le plasmide GAL4 DB - CAPP qui est lui aussi présent dans la levure nous avons travaillé sur des souches qui en sont dépourvues.

Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation par des extraits d'ADN de levures ont été analysées par digestion avec des enzymes de restriction et séparation des fragments d'ADN sur gel d'agarose. Nous avons obtenu 3 profils de restriction différents sur les 5 clones analysés (7D, 3E, 9A, 3H, 3G) (fig 2).

Ces résultats ont montré que 2 plasmides identiques sont au moins représentés dans 2 clones de levures différents, les clones 7D, ainsi que les clones 3H et 3G. L'ADN du clone 3E est obtenu à partir de souches de phénotype His+ et '3GAL+.

EXEMPLE 4: DETERMINATION DE LA SEQUENCE DES INSERTS DES
PLASMIDES IDENTIFIES.

Le séquençage a été réalisé à partir de l'oligonucléotide (SEQ ID N"5) complémentaire de la région de GAL4TA à proximité du site d'insertion de la banque de cDNA de cerveau, à 52 pdb du site EcoRl.

La comparaison des 3 séquences avec les séquences contenues dans les banques de données GENBank et EMBL (European Molecular Biology Lab) a montré que les séquences des ADNc qui étaient dans les plasmides issus des souches 9A et 3H présentent 87% d'homologie au niveau nucleïque avec le gène murin codant pour la protéine FE65, elles sont représentées en SEQ ID N"2, et que la séquence du plasmide issu de la souche 7D présente 60% d'homologie avec ce même gène ( voir figure 3).

L'analyse de la séquence des plasmides issus des souches 9A et 3H indique que ceuxci contiennent deux régions chevauchantes correspondant à un même ARNm.

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.

(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 40.91.69.22
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96
(il) TITRE DE L' INVENTION:
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release 41.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1500
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(11) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ T NO: 1:
1/1 31/11
atg cga aac agt gca gcc agt gac gag gac tca agc tgg gcc acc tta tcg cag ggc agc
Met arg asn ser ala ala ser asp glu asp ser ser trp ala thr leu ser gln gly ser
61/21 91/31
ccc tcc tat ggc tct ccg gag gac aca gat tcc ttc tgg aac ccc aac gct ttc gag acg
pro ser tyr gly ser pro glu asp thr asp ser phe trp asn pro asn ala phe glu thr
121/41 151/51
gat tcc gat cta ccg gct gga tgg atg agg gtc caa gac acc tca ggg acc tac tac tgg
asp ser asp leu pro ala gly trp met arg val gln asp thr ser gly thr tyr tyr trp
181/61 211/71
cac atc cca aca ggg acc acc cag tgg gaa ccc cca ggc coq gcc tcc cca tca cag ggg
his ile pro thr gly thr thr gln trp qlu pro pro gly arg ala ser pro ser gln gly
241/81 271/91
aac agt ccc caa gaa gag tcc cag ctc acc tqq act ggc ttt gct cac caa gaa ggc ttt
dsn ser pro gln glu glu ser gln leu thr trp thr gly phe ala his gln glu gly phe
301/101 331/111
gag gaa gga gag ttt tgg aag gat gaa cct agt gaa gag gcc cca atg gag ttg gga ctg
glu glu gly glu phe trp lys asp glu pro ser glu glu ala pro met glu leu gly leu
361/121 391/131
aag gac cct gag gag ggg aca ttg ccc ttc tca gct cag agc ctc agc cca gag cca gtg
lys asp pro glu glu gly thr leu pro phe ser ala gln ser leu ser pro glu pro val
421/141 451/151
ccc cag gag gag gag aat ctg ccc caa cgg aac gcc aat cca ggg atc aag tgt ttc gct
pro gln glu glu glu asn leu pro gln arg asn ala asn pro gly ile lys cys phe ala
481/161 511/131 gtg cgc tcc cta ggc tgg gta gag atg act gag gag gag ctg gcc cca gga cgc agc agt val arg ser leu gly trp val glu met thr glu glu glu leu ala pro gly arg ser ser 541/181 571/191 gtg gca gtc aac aat tgt atc cgc cag ctc tcc tac cac aaa aac aat cta cat gat ccg val ala val asn asn cys ile arg gln leu ser tyr his lys asn asn leu his asp pro 601/201 631/211 atg tct gga ggc tgg gga gag gga aag gat ctg ctg ctc cag ctg gag gat gag acg cta met ser gly gly trp gly glu gly lys asp leu leu leu gln leu glu asp glu thr leu 661/221 691/231 aag ttg gtg gag cca cag aac cag aca ctg ctg cat gcc cag ccc atc gtc agc att cgc lys leu val glu pro gln asn gln thr leu leu his ala gln pro ile val ser ile arg 721/241 751/251 gtg tgg ggc gtt ggg cgg gac agt gga aga gag agg gac ttt gcc tac gta gct cga gat val trp gly val gly arg asp ser gly arg glu arg asp phe ala tyr val ala arg asp 781/261 811/271 aag ctg acc cag atg ctc aag tgc cac gtg ttt cgc tgt gag gca cct gcc aag aac atc lys leu thr gln met leu lys cys his val phe arg cys glu ala pro ala lys asn ile 841/281 871/291 gcc acc agc ctg cat gag atc tgc tcc aag atc atg tct gaa cgg cgc aat gct cgc tgc ala thr ser leu his glu ile cys ser lys ile met ser glu arg arg asn ala arg cys 901/301 931/311 ttg gta aat gga ctc tcc ctg gac cac tct aaa ctt gtg gat gtc cct ttc caa gtg gaa leu val asn gly leu ser leu asp his ser lys leu val asp val pro phe gln val glu 961/321 991/331 ttc cca gca cca aag aat gaa ctg gtg cag aag ttt caa gtc tat tac cta ggg aac gtg phe pro ala pro lys asn glu leu val gln lys phe gln val tyr tyr leu gly asn val 1021/341 1051/351 cct gtg gct aaa ccc gtt ggg gta gat gtg att aat gga gcc ctg gag tca gtc ctg tct pro val ala lys pro val gly val asp val lie asn gly ala leu glu ser val leu ser 1081/361 1111/371 tcc agt agt cgt gag cag tgg acc cca agt cac gtc agc gtg gcc cct gcc acc ctc acc ser ser ser arg glu gln trp thr pro ser his val ser val ala pro ala thr leu thr 1141/381 1171/391 atc ttg cac cag cag aca gaa gca gtg ctg ggg gag tgt cga atg cgg ttc ctc tcc ttc ile leu his gln gln thr glu ala val leu gly glu cys arg val arg phe leu ser phe 1201/401 1231/411 ctg gct tgt ggc aga gat gtg cac acg ttc gca ttc act atg gct gcc ggc cca gcc tcc leu ala val gly arg asp val his thr phe ala phe ile met ala ala gly pro ala ser 1261/421 1291/431 ttc tgc tgt cac atg ttt tgg tgc gag ccc aat gct gcc agt ctc tcg gag gct gtg cag phe cys cys his met phe trp cys glu pro asn ala ala ser leu ser glu ala val gln 1321/441 1351/451 gct gca tgc atg ctc cgc tac cag aag tgt ctg gat gct cgt tcc cag acc tcc acc tcc ala ala cys met leu arg tyr gln lys cys leu asp ala atg ser gln thr ser thr ser
1381/461 1411/471 tgc ctc cca gca ccc cct gcg gag tca gtt gcg aga cgt gta ggg tgg act gtc cgc agg cys leu pro ala pro pro ala glu ser val ala arg arg val gly trp thr val arg arg
1441/481 1471/491 ggt gtt cag tct ctg tgg ggt tcc ctc aag ccc aaa cgt cta gga tcc cag acc cca tga gly val gln ser leu trp gly ser leu lys pro lys arg leu gly ser gln thr pro OPA
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1275
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
CGG GAG GAG TCC CAG CTC ACC TGG ACA GGT TTT GCT CAT GGA GAA GGC 48
Arg Glu Glu Ser Gln Leu Thr Trp Thr Gly Phe Ala His Gly Glu Gly
1 5 10 15
TTT GAG GAT GGA GAA TTT TGG AAG GAT GAA CCC AGT GAT GAG GCC CCA 96
Phe Glu Asp Gly Glu Phe Trp Lys Asp Glu Pro Ser Asp Glu Ala Pro
20 25 30
ATG GAG CTG GGA CTG AAG GAA CCT GAG GAG GGG ACG TTG ACC TTC CCA 144
Met Glu Leu Gly Leu Lys Glu Pro Glu Glu Gly Thr Leu Thr Phe Pro
35 40 45
GCT CAG AGC CTC AGC CCA GAG CCG TTG CCC CAA GAG GAG GAG AAG CTT 192
Ala Gln Ser Leu Ser Pro Glu Pro Leu Pro Gln Glu Glu Glu Lys Leu
50 55 60
CCC CCA CGG AAT ACC AAC CCA GGG ATC AAG TGT TTC GCC GTG CGC TCC 240
Pro Pro Arg Asn Thr Asn Pro Gly Ile Lys Cys Phe Ala Val Arg Ser
65 70 75 80
CTA GGC TGG GTA GAG ATG ACC GAG GAG GAG CTG GCC CCT GGA CGC AGC 288
Leu Gly Trp Val Glu Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Pro Gly Arg Ser
85 90 95
AGT GTG GCA GTC AAC AAT TGC ATC CGT CAG CTC TCT TAC CAC AAA AAC 336
Ser Val Ala Val Asn Asn Cys Ile Arg Gln Leu Ser Tyr His Lys Asn
100 105 110
AAC CTG GAT GAC CCC ATG TCT GGG GGC TGG GGG GAA GGA AAG GAT CTG 384
Asn Leu His Asp Pro Met Ser Gly Gly Trp Gly Glu Gly Lys Asp Leu
115 120 125
CTA CTG CAG CTG GAG GAT GAG ACA CTA AAG CTA GTG GAG CCA CAG AGC 432
Leu Leu Gln Leu Glu Asp Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Pro Gln Ser
130 135 140
CAG GCA CTG CTG CAC GCC CAA CCC ATC ATC AGC ATC CGC GTG TGG GGC 480 Gln Ala Leu Leu His Ala Gln Pro Ile Ile Ser Ile Arg Val Trp Gly 145 150 155 160
GTC GGG CGG GAC AGT GGA AGA GAG AGG GAC TTT GCC TAC GTA GCT CGT 528
Val Gly Arg Asp Ser Gly Arg Glu Arg Asp Phe Ala Tyr Val Ala Arg
165 170 175
GAT AAG CTG ACC CAG ATG CTC AAG TGC CAC GTG TTT CGC TGT GAG GCA 576
Asp Lys Leu Thr Gln Met Leu Lys Cys His Val Phe Arg Cys Glu Ala
180 185 190
CCT GCC AAG AAC ATC GCC ACC AGC CTG CAT GAG ATC TGC TCT AAG ATC 624
Pro Ala Lys Asn Ile Ala Thr Ser Leu His Glu Ile Cys Ser Lys Ile
195 200 205
ATG GCC GAA CGG GGT AAT GCC CGC TGC TTG GTA AAT GGA CTC TCC CTG 672
Met Ala Glu Arg Gly Asn Ala Arg Cys Leu Val Asn Gly Leu Ser Leu
210 215 220
GAC CAC TCT AAA CTT GTG GAT GTC CCT TTC CAA GTG GAA TTC CCA GCG 720
Asp His Ser Lys Leu Val Asp Val Pro Phe Gln Val Glu Phe Pro Ala 225 230 235 240
CCT AAG AAT GAG TTG GTC CAG AAG TTC CAA GTC TAT TAC CTG GGG AAT 768
Pro Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Phe Gln Val Tyr Tyr Leu Gly Asn
245 250 255
GTA CCT GTT GCT AAA CCT GTT GGG GTA GAT GTG ATT AAT GGG GCC CTC 816
Val Pro Val Ala Lys Pro Val Gly Val Asp Val Ile Asn Gly Ala Leu
260 265 270
GAG TCA GTC CTG TCC TCC AGC AGC CGT GAA CAA TGG ACC CCA AGT CAT 864
Glu Ser Val Leu Ser Ser Ser Ser Arg Glu Gln Trp Thr Pro Ser His
275 280 285
GTC AGT GTG GCC CCT GCT ACC CTC ACC ATC TTG CAC CAG CAG ACA GAG 912
Val Ser Val Ala Pro Ala Thr Leu Thr Ile Leu His Gln Gln Thr Glu
290 295 300
GCA GTG CTG GGA GAG TGT CGG GTG CGT TTC CTC TCC TTC CTG GCC GTG 960
Ala Val Leu Gly Glu Cys Arg Val Arg Phe Leu Ser Phe Leu Ala Val 305 310 315 320
GGC AGA GAT GTC CAC ACG TTT GCA TTC ATC ATG GCT GCC GGC CCA GCC 1008
Gly Arg Asp Val His Thr Phe Ala Phe Ile Met Ala Ala Gly Pro Ala
325 330 335
TCC TTC TGC TGT GAC ATG TTC TGG TGC GAG CCC AAT GCT GCC AGC CTC 1056
Ser Phe Cys Cys His Met Phe Trp Cys Glu Pro Asn Ala Ala Ser Leu
340 345 350 TCA GAG GCT GTG CAG GCT GCG TGC ATG CTT CGC TAC CAG AAG TGT CTG 1104
Ser Glu Ala Val Gln Ala Ala Cys Met Leu Arg Tyr Gln Lys Cys Leu
355 360 365
GAT GCC CGT TCC CAG GCC TCC ACC TCC TGC CTC CCA GCA CCC CCT GCT 1152
Asp Ala Arg Ser Gln Ala Ser Thr Ser Cys Leu Pro Ala Pro Pro Ala
370 375 380
GAG TCT GTG GCA CGG GGT GTA GGG TGG ACT GTC CGC AGG GGT GTT CAG 1200
Glu Ser Val Ala Arg Gly Val Gly Trp Thr Val Arg Arg Gly Val Gln 385 390 395 400
TCG CTG TGG GGC TCC CTG AAG CCC AAA CGG GTG GGG GGC CAT ACC CCA 1248
Ser Leu Trp Gly Ser Leu Lys Pro Lys Arg Val Gly Gly His Thr Pro
405 410 415
TGA AGA AGC CCC ACC TTC CCT CCA CCT 1275
* Arg Ser Pro Thr Phe Pro Pro Pro
420 425 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
CAAGTCGACC TAGTTCTGCA TCTGCTC 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: CAAGAATTCA AGAAACAGTA CACATCC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:23
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23

Claims (21)

REVENDICATIONS

1. Peptide caractérisé en ce qu'il est capable d'interférer au niveau de l'interaction de la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues avec la région cytoplasmique de l'APP.

2. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'interférence se traduit par un ralentissement, une inhibition ou une stimulation de ladite interaction.

3. Peptide selon l'une des revendications I ou 2 caractérisé en ce qu'il est capable de se lier au niveau du domaine d'interaction entre la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues et la région cytoplasmique de l'APP.

4. Peptide selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la SEQ ID N"1, SEQ ID N"2 ou d'un dérivé de celles-ci.

5. Peptide capable d'entrer en compétition avec un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 au niveau du domaine d'interaction entre la protéine FE65 ou l'une de ses formes homologues et la région cytoplasmique de l'APP.

6. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable de moduler l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de I'APP obtenu par reproduction des motifs actifs des peptides selon les revendications 1 à 5 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.

7. Séquence nucléotidique codant pour un peptide tel que défini en revendication 1 à 5.

8. Séquence nucléotidique selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence comprenant tout ou partie de la SEQ ID N l, SEQ ID N 2 ou d'une séquence dérivée de celles-ci.

9. Séquence selon la revendication 7 ou 8 introduite dans un vecteur viral ou non viral.

10. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 7 ou 8.

11. Anticorps ou fragment d'anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide selon l'une des revendications I à 5

12. Sonde nucléotidique capable de s'hybrider avec un acide nucléique selon

l'une des revendications 1 à 5 ou avec l'ARNm correspondant.

13. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 6 ou un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 11 ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 7 å 9.

14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur viral ou non viral recombinant dans lequel est incorporée une séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou 8.

15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral choisi parmi les rétrovirus et les adénovirus.

16. Composition pharmaceutique selon une des revendications 13 à 15 destinée à moduler l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de l'APP.

17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17 destinée à interférer au niveau de l'interaction entre la protéine FE65 et la région cytoplasmique de l'APP.

18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 destinée au traitement des maladies neurodégénératives.

19. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 1 1 et/ou d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 7 ou 8 pour le typage de maladies neurodégénératives.

20. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 7 ou 8 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le peptide produit.

21. Virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.