CA2305781A1 - Acides nucleiques codant pour des proteines capables d'interagir avec les presenilines - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques et peptidiques, et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne des acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines.
Description
ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR DES PROTEINES CAPABLES
D'TNTERAGIR AVEC LES PRESENILINES
La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques et peptidiques, S et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne des acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines, les procédés de production des dites protéines ainsi que des compositions les contenant.
La maladie d'Alzheimer est la plus courante des démences. Sa fréquence globale augmente avec l'âge, elle est de 5 à 10% après 65 ans et de 20% au delà de 80 ans.
Actuellement, il n' existe aucun traitement spécifique et seuls des soins palliatifs peuvent être offerts aux patients. Cette maladie n'est vraiment confirmée qu' après l' analyse histologique du cerveau en post mortem par manque d'un diagnostic précis et précoce.
La maladie d' Alzheimer est liée à des lésions cérébrales organiques constituant des signes histologiques: plaques séniles, dégénérescences neurofibrillaires neuronales, perte et atrophie des neurones au niveau du cortex.
L'étiologie de la maladie est complexe, de nombreux gènes y sont impliqués et les différents mécanismes physiopathologiques auxquels ils participent ne sont pas entièrement compris.
Il a été décrit des altérations anatomiques du cerveau observées chez des patients de moins de 65 ans, liées aux démences préséniles. Actuellement, on englobe sous le terme "démences de type Alzheimer", les démences préséniles (avant 65 ans) aussi bien que les démences séniles (après 65 ans) présentant les mêmes caractéristiques.
Il existe deux formes de la maladie : des formes sporadiques, c'est-à-dire non liées à l'hérédité et des formes familiales.
Les formes sporadiques de la maladie sont les plus fréquentes, elles concernent 60 à 90% des patients et apparaissent le plus souvent après 65 ans.
Les
D'TNTERAGIR AVEC LES PRESENILINES
La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques et peptidiques, S et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne des acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines, les procédés de production des dites protéines ainsi que des compositions les contenant.
La maladie d'Alzheimer est la plus courante des démences. Sa fréquence globale augmente avec l'âge, elle est de 5 à 10% après 65 ans et de 20% au delà de 80 ans.
Actuellement, il n' existe aucun traitement spécifique et seuls des soins palliatifs peuvent être offerts aux patients. Cette maladie n'est vraiment confirmée qu' après l' analyse histologique du cerveau en post mortem par manque d'un diagnostic précis et précoce.
La maladie d' Alzheimer est liée à des lésions cérébrales organiques constituant des signes histologiques: plaques séniles, dégénérescences neurofibrillaires neuronales, perte et atrophie des neurones au niveau du cortex.
L'étiologie de la maladie est complexe, de nombreux gènes y sont impliqués et les différents mécanismes physiopathologiques auxquels ils participent ne sont pas entièrement compris.
Il a été décrit des altérations anatomiques du cerveau observées chez des patients de moins de 65 ans, liées aux démences préséniles. Actuellement, on englobe sous le terme "démences de type Alzheimer", les démences préséniles (avant 65 ans) aussi bien que les démences séniles (après 65 ans) présentant les mêmes caractéristiques.
Il existe deux formes de la maladie : des formes sporadiques, c'est-à-dire non liées à l'hérédité et des formes familiales.
Les formes sporadiques de la maladie sont les plus fréquentes, elles concernent 60 à 90% des patients et apparaissent le plus souvent après 65 ans.
Les
2 origines de la pathologie demeurent inconnues dans la plupart des cas.
Cependant, il a été établi que des traumatismes crâniens, des inflammations, des chocs affectifs ou des situations de grand stress augmentent la probabilité d' apparition de la maladie (Seubert et al., 1992).
5 Les fornzes familiales de la maladie représentent 10 à 40% des cas. Elle sont classées en deux groupes, les formes tardives (après 65 ans) et les formes précoces (avant 65 ans). Dans les cas précoces, l'affection se transmet selon un caractère dominant et autosomal.
En 1992, l'existence d'un locus AD3 a été mise en évidence sur le chromosome 14 et en 1995 le gène de la préséniline 1 (PS-1) a été isolé (le gène a été
initialement appelé S 182) (Sherrington et al., 1995). Des mutations du gène de la préséniline 1 sont impliquées dans 70% des formes trés précoces de la maladie (avant SS ans). De très rare cas de formes précoces sont liées à des mutations du gène de la préséniline 2 situé sur le chromosome 1 (Levy-Lahad et al. 1995). Ce gène présente 67% d'identité avec le gène de la préséniline 1.
Le gène est formé de 12 exons, les exons 3 à 12 codent pour la protéine. Il est exprimé de façon ubiquitaire et génère un transcript majoritaire de 2,7 kb et un transcript minoritaire de 7,5 kb (Kovacs, 1996). La protéine, comprend 467 acides aminés, et présente la structure d'une protéine membranaire. Elle présente au moins 8 20 domaines transmembranaires potentiels. Les acides aminés correspondant aux codons touchés par les mutations répertoriées se répartissent sur l'ensemble de la protéine, ils se situent aussi bien dans les régions hydrophobes (TIvI) que dans les boucles hydrophiles (BL), avec cependant, deux régions privilégiées, TM2 et BL6.
Actuellement, plus de 35 mutations ponctuelles ont été rapportées et les mutations identifiées jusqu'à présent sont presque toutes de type "faux sens"
(c'est à
due qu'elles aboutissent au changement ponctuel d'un acide aminé sur la séquence de la protéine). Toutefois, un autre type de mutation affectant l'épissage a récemment
Cependant, il a été établi que des traumatismes crâniens, des inflammations, des chocs affectifs ou des situations de grand stress augmentent la probabilité d' apparition de la maladie (Seubert et al., 1992).
5 Les fornzes familiales de la maladie représentent 10 à 40% des cas. Elle sont classées en deux groupes, les formes tardives (après 65 ans) et les formes précoces (avant 65 ans). Dans les cas précoces, l'affection se transmet selon un caractère dominant et autosomal.
En 1992, l'existence d'un locus AD3 a été mise en évidence sur le chromosome 14 et en 1995 le gène de la préséniline 1 (PS-1) a été isolé (le gène a été
initialement appelé S 182) (Sherrington et al., 1995). Des mutations du gène de la préséniline 1 sont impliquées dans 70% des formes trés précoces de la maladie (avant SS ans). De très rare cas de formes précoces sont liées à des mutations du gène de la préséniline 2 situé sur le chromosome 1 (Levy-Lahad et al. 1995). Ce gène présente 67% d'identité avec le gène de la préséniline 1.
Le gène est formé de 12 exons, les exons 3 à 12 codent pour la protéine. Il est exprimé de façon ubiquitaire et génère un transcript majoritaire de 2,7 kb et un transcript minoritaire de 7,5 kb (Kovacs, 1996). La protéine, comprend 467 acides aminés, et présente la structure d'une protéine membranaire. Elle présente au moins 8 20 domaines transmembranaires potentiels. Les acides aminés correspondant aux codons touchés par les mutations répertoriées se répartissent sur l'ensemble de la protéine, ils se situent aussi bien dans les régions hydrophobes (TIvI) que dans les boucles hydrophiles (BL), avec cependant, deux régions privilégiées, TM2 et BL6.
Actuellement, plus de 35 mutations ponctuelles ont été rapportées et les mutations identifiées jusqu'à présent sont presque toutes de type "faux sens"
(c'est à
due qu'elles aboutissent au changement ponctuel d'un acide aminé sur la séquence de la protéine). Toutefois, un autre type de mutation affectant l'épissage a récemment
3 été rapporté (Perez-T~r et al., 1995), dans ce cas, le gène est altéré par la perte de l' exon 9.
Le rôle des présénilines dans la cellule normale est encore mal connu. De nombreuses hypothèses ont été émises. Parmi ces hypothèses,la préséniline 1 (PS-1) pourrait avoir un rôle dans le trafic cellulaire. Cette hypothése est confortée par un résultat immunocytochimique qui a permis de localiser PS-1 au niveau du réticulum endoplasmique et de l'appareil de Golgi dans des cellules de neurogliome humain (Kovacs et al., 1996). Par ailleurs, PS-1 jouerait un rôle dans la communication cellulaire et les mécanismes d'endocytose et la protéolyse de l'APP (Dewji et Singer, 1996). Une troisième hypothèse implique PS-1 dans des interactions avec le cytosquelette et notamment les microtubules associés à la protéine Tau (Lew et Wang, 1996). Enfin, compte tenu de sa structure, PS-1 pourrait jouer le rôle d'un récepteur couplé aux protéines G participant à la transduction du signal ou encore celui d'un transporteur ou d'un canal ionique (Van Broeckhoven, 1995).
La recherche de partenaires interagissant avec les présénilines permettrait de comprenâre le rôle exacte des présénilines.
La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse d'acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines. La mise en évidence de tels acides nucléiques permet d'envisager la préparation de nouveaux polypeptides utilisables pharmaceutiquement.
Un premier objet de l'invention concerne donc des séquences nucléotidiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines.
Selon un mode particulier, les séquences nucléotidiques selon l'invention codent pour des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec tout ou partie de la grande boucle de la préséniline PS-1.
Le rôle des présénilines dans la cellule normale est encore mal connu. De nombreuses hypothèses ont été émises. Parmi ces hypothèses,la préséniline 1 (PS-1) pourrait avoir un rôle dans le trafic cellulaire. Cette hypothése est confortée par un résultat immunocytochimique qui a permis de localiser PS-1 au niveau du réticulum endoplasmique et de l'appareil de Golgi dans des cellules de neurogliome humain (Kovacs et al., 1996). Par ailleurs, PS-1 jouerait un rôle dans la communication cellulaire et les mécanismes d'endocytose et la protéolyse de l'APP (Dewji et Singer, 1996). Une troisième hypothèse implique PS-1 dans des interactions avec le cytosquelette et notamment les microtubules associés à la protéine Tau (Lew et Wang, 1996). Enfin, compte tenu de sa structure, PS-1 pourrait jouer le rôle d'un récepteur couplé aux protéines G participant à la transduction du signal ou encore celui d'un transporteur ou d'un canal ionique (Van Broeckhoven, 1995).
La recherche de partenaires interagissant avec les présénilines permettrait de comprenâre le rôle exacte des présénilines.
La présente invention résulte de la mise en évidence par la demanderesse d'acides nucléiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines. La mise en évidence de tels acides nucléiques permet d'envisager la préparation de nouveaux polypeptides utilisables pharmaceutiquement.
Un premier objet de l'invention concerne donc des séquences nucléotidiques codant pour des protéines capables d'interagir avec les présénilines.
Selon un mode particulier, les séquences nucléotidiques selon l'invention codent pour des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec tout ou partie de la grande boucle de la préséniline PS-1.
4 PCTIFR98/02093 Plus préférentiellement les séquences nucléotidiques selon l'invention comprennent tout ou partie de la SEQ ID N° 1 ou de ses dérivées ou tout ou partie de la SEQ ID
N°2 ou de ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le tertre séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique etJou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide selon l'invention. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être 15 réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des condirions variables d'hybridation (Maniatis et al.;1989).
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent ëtre préparées à partir de cellules de différentes origine par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de (homme du métier. Les séquences nucléotidiques de (invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de (invention peuvent être préparés selon toute technique connue de (homme du métier.
WO 99/168'14 PCT/F'R98/02093 La présente invention a également pour objet des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec les présénilines. De manière préférée, les polypeptides selon l'invention son capables d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS-1 et/ou la grande boucle de la préséniline PS-2. Plus
N°2 ou de ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le tertre séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique etJou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide selon l'invention. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être 15 réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des condirions variables d'hybridation (Maniatis et al.;1989).
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent ëtre préparées à partir de cellules de différentes origine par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de (homme du métier. Les séquences nucléotidiques de (invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de (invention peuvent être préparés selon toute technique connue de (homme du métier.
WO 99/168'14 PCT/F'R98/02093 La présente invention a également pour objet des protéines ou des polypeptides capables d'interagir avec les présénilines. De manière préférée, les polypeptides selon l'invention son capables d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS-1 et/ou la grande boucle de la préséniline PS-2. Plus
5 préférentiellement, il s'agit de polypeptides capables d'interagir avec la séquence d'amino-acides 310-463 de la grande boucle de la préséniline PS-1.
Au sens de la présente invention la dénomination préséniline couvre les présénilines PS-1 et PS-2 en elles même ainsi que leurs formes homologues correspondant notamment à des formes mutées de ces protéines.
La présente invention concerne également des polypeptides comprenant tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les séquences SEQ ID
N° 1 ou SEQ
ID N°2 ou d'un dérivé de celles-ci.
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant des séquences présentées en séquence SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'intéragir avec les 20 présénilines. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type.
Au sens de la présente invention la dénomination préséniline couvre les présénilines PS-1 et PS-2 en elles même ainsi que leurs formes homologues correspondant notamment à des formes mutées de ces protéines.
La présente invention concerne également des polypeptides comprenant tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les séquences SEQ ID
N° 1 ou SEQ
ID N°2 ou d'un dérivé de celles-ci.
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant des séquences présentées en séquence SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'intéragir avec les 20 présénilines. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type.
6 Il peut également s'agir de fragments des séquences peptidiques indiquées ci-dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de (homme du 5 métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché.
Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nuciéotidique peut également 10 être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de (homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
15 La présente invention a également pour objet (utilisation des polypeptides selon (invention, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de (activité des Présénilines.
En effet, il est envisageable de réguler le fonctionnement des Présenilines par le biais 20 des protéines selon (invention et notamment d'inhiber ou de ralentir (activité des Présénilines mutées.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de prépâration des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une 25 séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte 30 cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif.
Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en
Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nuciéotidique peut également 10 être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de (homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
15 La présente invention a également pour objet (utilisation des polypeptides selon (invention, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de (activité des Présénilines.
En effet, il est envisageable de réguler le fonctionnement des Présenilines par le biais 20 des protéines selon (invention et notamment d'inhiber ou de ralentir (activité des Présénilines mutées.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de prépâration des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une 25 séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte 30 cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif.
Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en
7 utilisant des séquences à réplication autonomes chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention.
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de (invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluvveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula.
S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou T'richoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfére utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacilles, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes pour (expression des acides nucléiques de l'invention ainsi que la production des protéines dérivées de ceux-ci.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ
ID N° 2, pour la production des protéines selon l'invention.
Une autre application des séquences d'acides nucléiques selon l'invention est la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec fARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine.
L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement , l'expression de protéines capables d'interagir avec les présénilines. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotiques définies ci-avant et peuvent être obtenus par fragmentation, etc.
ou par synthèse chimique.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention.
Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de (invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluvveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula.
S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou T'richoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfére utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacilles, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes pour (expression des acides nucléiques de l'invention ainsi que la production des protéines dérivées de ceux-ci.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ
ID N° 2, pour la production des protéines selon l'invention.
Une autre application des séquences d'acides nucléiques selon l'invention est la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec fARNm transcrit, inhibant sa traduction en protéine.
L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement , l'expression de protéines capables d'interagir avec les présénilines. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotiques définies ci-avant et peuvent être obtenus par fragmentation, etc.
ou par synthèse chimique.
8 Les séquences revendiquées peuvent être utilisées dans le cadre de thérapies géniques, pour le transfert et la production in vivo de séquences antisens ou l'expression de protéines ou de polypeptides capables de moduler (activité des présénilines. A cet égard les séquences peuvent être incorporées dans des vecteurs 5 viraux ou non viraux, permettant leur administration in vivo. Le vecteur peut être un plasmide dont l'obtention est connue de l'homme du métier. A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés ou virus de l'herpès. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant ou des ARNm correspondants, utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de 1 S diagnostic, pour la détection des présénilines, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la, mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et 20 préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de (invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent par exemple comporter jusqu'à l'intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire.
Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de (homme du métier peuvent être employées 25 (marquage radioactif, enzymatique, etc).
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d' anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par 30 immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant ou des ARNm correspondants, utilisables dans le cadre d'une thérapie génique. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de 1 S diagnostic, pour la détection des présénilines, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être utilisées pour la, mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et 20 préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de (invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent par exemple comporter jusqu'à l'intégralité d'une des séquences précitées ou de leur brin complémentaire.
Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de (homme du métier peuvent être employées 25 (marquage radioactif, enzymatique, etc).
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d' anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par 30 immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent
9 également être générés par préparation d'hybridom~ selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et/ ou de révéler l'interaction entre les présénilines et les polypeptides tels que définis ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les présenilines et les polypeptides selon l'invention.
La mise en évidence et/ou (isolement de modulateurs ou de ligands des polypeptides selon l'invention, est réalisé selon les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant un polypeptide de (invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de (invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de (invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre les présenilines et les polypeptides de (invention.
Un autre obj et de (invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologiques.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps etlou un fragment d'anticorps tel que 5 défini ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps et séquences nucléotidiques définis ci-avant ou des
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les présenilines et les polypeptides selon l'invention.
La mise en évidence et/ou (isolement de modulateurs ou de ligands des polypeptides selon l'invention, est réalisé selon les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant un polypeptide de (invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de (invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de (invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre les présenilines et les polypeptides de (invention.
Un autre obj et de (invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologiques.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide tel que défini ci-avant.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps etlou un fragment d'anticorps tel que 5 défini ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens, ainsi que toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-avant.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps et séquences nucléotidiques définis ci-avant ou des
10 fragments de ceux-ci sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Elle a également pour objet les compositions dans lesquelles les séquences nucléotidiques selon (invention sont incorporées dans un vecteur recombinant viral ou non viral.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées 15 pour moduler (activité des présénilines. Plus préférentiellement, ces compositions sont destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement (activité des présénilines et notamment les formes mutées. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.
Liste des figures Figure 1. Schéma de la préséniline I et de la partie utilisée pour le test ~
en double hybride.
Figure 2. Isolation de souches yBM-C et yBM-D par test d'auxotrophie des levures portant différents plasmides contenant notamment le clone C (correspondant à
la SEQ
ID N° 1 ) et le clone D (correspondant à la SEQ ID N°2) Figure 3. Expression des ARNm correspondants aux peptides C et D dans les tissus humains Figure 4. Schéma du vecteur d'expression mammifère utilisé.
Elle a également pour objet les compositions dans lesquelles les séquences nucléotidiques selon (invention sont incorporées dans un vecteur recombinant viral ou non viral.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées 15 pour moduler (activité des présénilines. Plus préférentiellement, ces compositions sont destinées à ralentir ou inhiber au moins partiellement (activité des présénilines et notamment les formes mutées. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21.
Liste des figures Figure 1. Schéma de la préséniline I et de la partie utilisée pour le test ~
en double hybride.
Figure 2. Isolation de souches yBM-C et yBM-D par test d'auxotrophie des levures portant différents plasmides contenant notamment le clone C (correspondant à
la SEQ
ID N° 1 ) et le clone D (correspondant à la SEQ ID N°2) Figure 3. Expression des ARNm correspondants aux peptides C et D dans les tissus humains Figure 4. Schéma du vecteur d'expression mammifère utilisé.
11 Figure 5. Expression des protéines de fusion C et D en cellules mammifères.
Figure 6 (a, b, c). Cartes des principaux vecteurs MATÉRIELS ET MÉTHODES
1) Les souches de levures utilisées sont tes suivantes:
S.cerevisiae YCM 79 (MATa, ade2, trpl, leu2, lys2, ura3, his3, gal4, ga180, metlfi ::
GALIlIO-URA3 lacZ,HIS3 :: GAL7 phleoR).
S.cerevisiae PCY 2 (MATa, Dgal4, Dga180, ade2, trpl, leu2, Ivs2, his3 URA3 ::
GAL!l!0- IacZ .
S.cerevisiae HF7 C (MATa, ura3, his3, ade2, trpl, leu2, lys2, gal4, ga180, canR , URA3 : : GAL4 binding site- CYCI-lacZ, LYS2 :: GAL!- HIS3).
S.cerevisiae L 40 (MATa, his3, ade2, trpl, leu2, lys2, URA3 :: LexA-lacZ, LYS2 ::
LexA-HIS3).
2) Les souches de bactéries utilisées sont les suivantes E.coli TG1 ( F'~ traD 36, Iacl q , lacZ D MI S, proA+B+J, supE, thi-l, D (lac pro AB), D (hsdM mcrB)S (rK~rtK McrB ).
E.coli BL21 (DE3) ( F , ompT, hsdSB (rB mB ), gal, dcm, (DE3).
3) Les milieux de culture mis en oeuvre pour les diverses souches sont les suivants milieu YPD complet pour les levures -Bacto-yeast extract ( 10 g/1) (Difco) -Bacto-peptone (20 g/1) (Difco)
Figure 6 (a, b, c). Cartes des principaux vecteurs MATÉRIELS ET MÉTHODES
1) Les souches de levures utilisées sont tes suivantes:
S.cerevisiae YCM 79 (MATa, ade2, trpl, leu2, lys2, ura3, his3, gal4, ga180, metlfi ::
GALIlIO-URA3 lacZ,HIS3 :: GAL7 phleoR).
S.cerevisiae PCY 2 (MATa, Dgal4, Dga180, ade2, trpl, leu2, Ivs2, his3 URA3 ::
GAL!l!0- IacZ .
S.cerevisiae HF7 C (MATa, ura3, his3, ade2, trpl, leu2, lys2, gal4, ga180, canR , URA3 : : GAL4 binding site- CYCI-lacZ, LYS2 :: GAL!- HIS3).
S.cerevisiae L 40 (MATa, his3, ade2, trpl, leu2, lys2, URA3 :: LexA-lacZ, LYS2 ::
LexA-HIS3).
2) Les souches de bactéries utilisées sont les suivantes E.coli TG1 ( F'~ traD 36, Iacl q , lacZ D MI S, proA+B+J, supE, thi-l, D (lac pro AB), D (hsdM mcrB)S (rK~rtK McrB ).
E.coli BL21 (DE3) ( F , ompT, hsdSB (rB mB ), gal, dcm, (DE3).
3) Les milieux de culture mis en oeuvre pour les diverses souches sont les suivants milieu YPD complet pour les levures -Bacto-yeast extract ( 10 g/1) (Difco) -Bacto-peptone (20 g/1) (Difco)
12 -Glucose (20 g/1) (Merk) Ce milieu peut être solidifié par addition d' agar (20 g/1) et rendu stérile à
110 °C
pendant 20 min dans un autoclave.
milieu YNB minimum pour les levures -Bacto-yeast nitrogen base without amino acids (6,7 g/1) (Difco) -Glucose (20g/1) (Merk) Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (20g/1) et stérilisée par autoclavage.
Les acides aminés ou les bases azotées nécessaires à la croissance des levures auxotrophes sont aj outés ensuite à SOmg/1. On aj oute aussi de l' Ampicilline à
100~g/ml pour éviter les contaminations bactériennes.
milieu LBcomplet pour les bactéries -Bacto-yeast extract (Sg/1) (Difco) -Bacto-tryptone ( 10 g/1) (Difco) -NaCI (S g/1) (Difco) Ce milieu peut ëtre solidifié par addition d' agar ( 12 g/1) et stérilisé par autoclave.
L'ampicilline ou la kanamycine sont ajoutées à 100 ~gJml pour sélectionner les bactéries ayant été transformées par les plasmides portant les marqueurs de résistance correspondants.
4) Les plasmides utilisés sont les suivants 20 Le vecteur pGBT9 (fig. 6 (a)), est un plasmide navette de 5,5 kb pouvant être propagé et sélectionné dans les bactéries E.coli aussi bien que dans les levures. Il possède une origine de réplication CoIE 1 et un gène de résistance à l' ampicilline (propagation et sélection dans E.coli.) ainsi qu'une origine de réplication 2mm et un
110 °C
pendant 20 min dans un autoclave.
milieu YNB minimum pour les levures -Bacto-yeast nitrogen base without amino acids (6,7 g/1) (Difco) -Glucose (20g/1) (Merk) Ce milieu peut être solidifié par addition d'agar (20g/1) et stérilisée par autoclavage.
Les acides aminés ou les bases azotées nécessaires à la croissance des levures auxotrophes sont aj outés ensuite à SOmg/1. On aj oute aussi de l' Ampicilline à
100~g/ml pour éviter les contaminations bactériennes.
milieu LBcomplet pour les bactéries -Bacto-yeast extract (Sg/1) (Difco) -Bacto-tryptone ( 10 g/1) (Difco) -NaCI (S g/1) (Difco) Ce milieu peut ëtre solidifié par addition d' agar ( 12 g/1) et stérilisé par autoclave.
L'ampicilline ou la kanamycine sont ajoutées à 100 ~gJml pour sélectionner les bactéries ayant été transformées par les plasmides portant les marqueurs de résistance correspondants.
4) Les plasmides utilisés sont les suivants 20 Le vecteur pGBT9 (fig. 6 (a)), est un plasmide navette de 5,5 kb pouvant être propagé et sélectionné dans les bactéries E.coli aussi bien que dans les levures. Il possède une origine de réplication CoIE 1 et un gène de résistance à l' ampicilline (propagation et sélection dans E.coli.) ainsi qu'une origine de réplication 2mm et un
13 gène TRP 1 (sélection chez les levures trp 1- déficientes pour la synthèse du tryptophane). Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la levure des protéines de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN (DLA) de GAL4 et des peptides d'intérêt.
Il possède un site multiple de clonage en aval de la région DLA de GAL4, le tout 5 étant situé entre le promoteur et le terminateur du gène ADHI codant pour l'alcool deshydrogènase 1. Le DLA de GAL4 contient une séquence signal de localisation nucléaire.
Les séquences correspondant à différentes parties de PS-I ont été insérées aux sites de clonage EcoRI/SaII.
10 Le vecteur pGADlO (fig. 6 (a)), est un plasmide navette de 6,6 kb. Il possède une origine de réplication ColEl et un gène de résistance à l'ampicilline qui permettent sa propagation et sa sélection dans E.coli.. Il contient aussi une origine de réplication de levure (2mm) et un gène de sélection LEU2 pour isoler les levures transformées. Il possède un site multiple de clonage en aval de la séquence codant pour le domaine 15 d'activation (DA) de GAL4 entre le promoteur et le terminateur de ADHl. Le DA de GAL4 contient une séquence signal de localisation nucléaire.
Ce plasmide a été utilisé pour réaliser une banque d'ADNc de cerveau humain commerciale (Clontech). Les séquences d'ADNc ont été insérées au site de clonage EcoRI.
20 Le vecteur pLex 9 (fig. 6 (b)), est un plasmide navette de 5 kb. Comme pGBT9, il possède l'origine ColEl, le gène Ampli, ainsi que l'origine de réplication 2mm et le gène TRPI. Cependant, la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN
est celle du répresseur bactérien Lex A. Le promoteur et le terminateur servant à
l'expression de la protéine de fusion sont également ceux du gène ADH1. Le DLA
de 25 Lex A contient la séquence signal de localisation nucléaire de SV40.
Les séquences corréspondantes à la grande boucle de PS-I ont été insérées aux sites de clonage EcoRI/SaII.
Il possède un site multiple de clonage en aval de la région DLA de GAL4, le tout 5 étant situé entre le promoteur et le terminateur du gène ADHI codant pour l'alcool deshydrogènase 1. Le DLA de GAL4 contient une séquence signal de localisation nucléaire.
Les séquences correspondant à différentes parties de PS-I ont été insérées aux sites de clonage EcoRI/SaII.
10 Le vecteur pGADlO (fig. 6 (a)), est un plasmide navette de 6,6 kb. Il possède une origine de réplication ColEl et un gène de résistance à l'ampicilline qui permettent sa propagation et sa sélection dans E.coli.. Il contient aussi une origine de réplication de levure (2mm) et un gène de sélection LEU2 pour isoler les levures transformées. Il possède un site multiple de clonage en aval de la séquence codant pour le domaine 15 d'activation (DA) de GAL4 entre le promoteur et le terminateur de ADHl. Le DA de GAL4 contient une séquence signal de localisation nucléaire.
Ce plasmide a été utilisé pour réaliser une banque d'ADNc de cerveau humain commerciale (Clontech). Les séquences d'ADNc ont été insérées au site de clonage EcoRI.
20 Le vecteur pLex 9 (fig. 6 (b)), est un plasmide navette de 5 kb. Comme pGBT9, il possède l'origine ColEl, le gène Ampli, ainsi que l'origine de réplication 2mm et le gène TRPI. Cependant, la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN
est celle du répresseur bactérien Lex A. Le promoteur et le terminateur servant à
l'expression de la protéine de fusion sont également ceux du gène ADH1. Le DLA
de 25 Lex A contient la séquence signal de localisation nucléaire de SV40.
Les séquences corréspondantes à la grande boucle de PS-I ont été insérées aux sites de clonage EcoRI/SaII.
14 Le vecteur pGEX-4T1 (fig. 6 (b)), est un plasmide bactérien de 4,9 kb. Il possède une origine de réplication pBR322, un gène de résistance à l' ampicilline, un gène lacIq pour réprimer le système beta-galactosidase. Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la bactérie des protéines de fusion entre la protéine glutathion S-transferase (GST) et des peptides d'intérêt. Il possède un site multiple de clonage en aval du gène de la GST pour insérer les séquences codant pour les peptides. L' ensemble est contrôlé par le promoteur tac à haut niveau d'expression inductible par l'IPTG. Après production de la protéine, le peptide d'intérêt peut être séparé de la GST par clivage à
la thrombine, car la séquence reconnue et clivée par cette enzyme a été
introduite entre ces deux régions.
Le vecteur pET-29a (fig. 6 (c)), est un plasmide bactérien de 5,4 kb. Il possède une origine de réplication pBR322, une origine de réplication du phage fl, un gène de résistance à la kanamycine, un gène lacIq. Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la bactérie des peptides d'intérêt fusionnés à une séquence S-Tag (partie catalytique de la protéine S ribonucléase) et une séquence His-Tag (peptide de 10 histidines) qui facilitent la détection et la purification de la protéine de fusion. Le promoteur de transcription T7 permet une forte expression après induction à l'IPTG. Une séquence reconnue et clivée par la thrombine a été introduite entre les séquences S-Tag et His-Tag.
5) Les oligonucléotides de synthèse employés A partir de la séquence de PS-I (Sherrington et al., 1995), différents couples d'oligonucléotides on été définis afin d'obtenir les fragments d'ADN
correspondant aux régions hydrophiles de PS-I. Ces oligonucléotides permettent d'introduire un site EcoRI en 5' et un site SaII en 3' de la séquence après amplification par PCR.
oligoA CAA GAA TTC TGT CCG AAA GGT CCA CTT (SEQ ID N° 3) oligoB CAA GTC GAC TCA GGT TGT GTT CCA GTC TCC (SEQ ID N°
4) i5 Les oligonucléotides A et B ont servi à obtenir les fragments BL6 et BM issus de la grande boucle.
oligoC CAA GAA TTC TCA ACA ATG GTG TGG TTG (SEQ ID N° 5) oligoD CAA GTC GAC TCA TTC CTC TGG GTC TTC ACC (SEQ ID N°
6) Les oligonucléotides C et D ont servi à obtenir le fragment BR issu d'une région plus courte de la grande boucle.
oligoE CAA GAA TTC ACA TTA TTA CTC CTT GCC (SEQ ID N° 7) oligoF CAA GTC GAC TCA GAT ATA AAA TTG ATG CAA (SEQ ID N° 8) Les oligonucléotides E et F ont servi à obtenir le fragment Ct, issu de la partie C-terminale de PSI.
oligoG CAA GAA TTC ATG ACA GAG TTA CCT GCA (SEQ ID N° 9) oligoH AA GTC GAC TCA ATG CTT GGC GCC ATA TTT (SEQ ID N° 10) Les oligonuciéotides G et H ont servi à obtenir le fragment Nt, issu de la partie N-terminale de PSI.
Les oligonucléotides I; J et K ont été utilisés pour amplifier et séquencer les inserts des plasmides pGBT9 et pGADlO. Ils sont, respectivement, complémentaires des séquences du DLA de GAL4, du DA de GAL4 et du terminateur ADH1.
oligoI GCG ACA TCA TCA TCG GAA GAG AG (SEQ ID N° 11) oligoJ CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CC (SEQ ID N° 12) oligoK GGC GAA GAA GTC CAA AGC (SEQ ID N° 13) 6) Les méthodes de biologie moléculaire.
Préparation de l'ADN plasmidique.
Les préparations en petite quantité et en grande quantité d'ADN plasmidique ont été
effectuées selon les protocoles décrits dans Maniatis et al. ( 1989).
Amplification en chaîne par la polymérise Taq thermostable (ou PCR).
La PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN entre deux régions connues où
peuvent se fixer des oligonucléotides (de 20 pb environ) qui serviront d'amorces à
une polymérise thermostable. Les réactions sont effectuées dans un volume final de 100 ~,1 en présence de la matrice d'ADN (50 ng), de dNTP (0,2 mM), de tampon PCR (TrisHCI pH 8,5, 10 mM, MgCl2 1 mM, KCl 5 mM, gélatine 0,01%), des deux oligonucléotides (500 ng chacun) et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérise. Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon.
Le programme utilisé comporte 32 cycles : 1 cycle de dénaturation de la matrice (5 min à 95 °C), 30 cycles (1 min de dénaturation à 95 °C, lmin d'hybridation des oligonucléotides sur la matrice d'ADN à 50 °C, 1 min d'élongation par la Taq polymérise à 72 °C) enfin 1 cycle d'élongation finale (S min à 72 °C).
La PCR peut être effectuée directement sur des cultures de bactéries ou de levures en phase exponentielle de croissance.
Séquençage par fluorescence.
La technique de séquençage utilisée est dérivée de la méthode de Songer et al.
(1977) et adapté pour le séquençage par fluorescence développé par Applied Biosystems. Le protocole utilisé est celui décrit par les concepteurs du système (Perkin Elmer, 1995).
Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide par ügation.
L'insert provenant d'un ADN plasmidique ou d'une réaction de PCR et le plasmide vecteur sont digérés 1 heure par des enzymes de restriction à 1 U/~.g d'ADN
dans Ieur tampon respectif (Biolabs). Les enzymes sont choisies en fonction des sites de clonage pour introduire l'insert en phase avec les autres domaines du vecteur.
Les fragments issus de la digestion sont séparés selon leur taille par électrophorése sur un gel " préparatif " d'agarose 0,8% fait dans du TBE (Tris S mM, borate 90 mM, EDTA 2mM, pH 8) avec O,S ~g/ml de BET. Du bleu de dépôt (1/10 de volume) est ajouté aux échantillons avant leur chargement sur le gel à côté
d'un marqueur de poids moléculaire ( 1 Kb ladder, Gibco BRL). La migration s' effectue à 90 volts/cm constants dans du TBE.
L'ADN est révélé sous U.V. par la fluorescence du BET qui s'est intercalé
entre les bases. Les morceaux de gel contenant les fragments d'ADN de tailles voulues (vecteur et insert) sont découpés au scalpel, introduits dans un boudin à
dialyse avec du TBE et soumis à une électrophorèse pendant 1 S min à 100 volts.
L'ADN extrait du gel est ensuite récupéré, traité par un volume de phénol/chloroforme/isoamylate (25/24/ 1 ), précipité par 3 volumes d' éthanol absolu 1 S en présence de NaCI 0,25 M, lavé une fois à l' éthanol 70%, séché et enfin repris dans 201 d'H20.
Après avoir estimé sur gel les quantités respectives de vecteur et d'insert, ces derniers sont mélangés dans un rapport de 1/1 en présence de 40 U.I. de T4 DNA
ligase, du tampon de Iigation 1X final (TrisHCl SO mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) dans un volume total de 20 ~.1. La Iigation s'effectue à
C pendant au moins une heure.
Transformation des bactéries par un plasmide.
1) La méthode dite au " TSB " (d'après Chung et Miller, N.A.R. vol 16, 1988) consiste à fragiliser la paroi des bactéries par un traitement au DMSO pour permettre 2S l'entrée de l'ADN dans les cellules. Son efficacité est de 106 transformants/~,g d'ADN. Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide pendant environ heures sous agitation (jusqu'à A.6oo=0,6). La culture est centrifugée 10 min à
rpm, le culot est repris dans 1/10 du volume initial par du TSB {milieu LB, PEG~
10%, DMSO 5%, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM), et incubé 15 min à 4°C.
Environ 50 ng d'ADN (10 ~1 pour le produit de ligation) sont ajoutés à 100.1 de bactéries compétentes, puis le mélange est incubé 30 min à 4 °C. Après addition de TSBgIu (TSB, glucose 20 mM) et incubation à 37 °C pendant 45 min, les bactéries sont étalées sur milieux LB avec l'antibiotique correspondant au gène de résistance porté
par le plasmide.
2) L'électroporation est une technique 1000 fois plus efficace que la méthode au TSB, elle est utilisée lorsqu'on dispose de trés faibles quantités d'ADN (comme après l' extraction des plasmides contenus dans les levures). Elle consiste â
fragiliser la paroi bactérienne par un choc électrique pour introduire l'ADN dans les cellules.
Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide sous agitation jusqu'à
A6~=0,6. La culture, incubée préalablement 15 min à 4 °C, est centrifugée 10 min à
3000 rpm et le culot est lavé successivement par 1 volume d'H20 glacée, 1/2 volume d'H20 glacée, et 1/5 volume de glycérol 10% glacé. Entre chaque lavage, les bactéries sont centrifugées 10 min à 3000 rpm pour enfin être reprises dans volume de glycérol 10% glacé. 40 wl de cette suspension de bactéries sont mélangés avec 1 ~,1 d'ADN dans une cuve à électroporation. Les cuves sont placées dans le Gene Pulser BioRad pour que les bactéries subissent un choc électrique (25 mF, 2,SkV, 200 V~ . Apr~s incubation à 37 °C pendant 45 min, les bactéries sont étalées sur milieu LB contenant l'antibiotique servant à la sélection.
Hybridation des ARNm après transfert sur membrane (ou Northern Blot).
Les membranes utilisées sont des membranes de nitrocellulose commerciales Clontech oil les ARNm issus de différents tissus humain ont déjà été
transférés et fixés.
La sonde d'ADN radioactive est préparée suivant le protocole « Rediprime DNA
Labelling System » Amersham. Ce protocole permet d'obtenir un taux d'incorporation du [32P] dCTP (50 mCi) supérieur à 55 % dans le fragment d'ADN
après une incubation de 10 min à 37 °C et de détecter une bande d'ARN
équivalent à
0,5 pg après une hybridation de 2 heures et une nuit de mise en autoradiographie.
Les membranes sont préhybridées avec 8 ml de solution d'hybridation (NaCI 1 M, NaH2P04 10 mM pH 7,4 ; Ficoll 10 mg/ml, polyvinylpyrrolidone 10 mg/ml, BSA 10 mg/ml, ADN de sperme de saumon 100 mg/ml, SDS 2%) environ 2 heures à 42 °C
sous agitation, puis elles sont hybridées avec la sonde à 2.106 cpm/ml mélangée avec 8 ml de solution d'hybridation pendant 24 heures à 42 °C sous agitation, elles sont ensuite rincées plusieurs fois avec ia solution 1 de lavage (NaCI 0,3 M, sodium citrate 30 mM pH 7, SDS 0,05%), lavées pendant 40 min dans cette même solution, incubées 40 min à 50 °C dans la solution 2 de lavage (NaCI 15 mM, sodium citrate 1,5 mM pH 7, SDS 0,1 %) et enfin elles sont soumises à une autoradiographie.
7) Les méthodes pour le système double hybride.
Principe du système.
Le système double hybride, développé par Song et Fields depuis 1989, est une technique de clonage par interaction in vivo, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il repose sur le fait que certains transactivateurs eucaryotes ne nécessitent que deux domaines pour fonctionner: un domaine de liaison à l' ADN (DLA) qui se fixe sur une séquence spécifique et un domaine d'activation (DA) qui recrute la machinerie de transcription (ARN polII). Lorsque les deux domaines sont séparés, le DA ne peut pas se positionner correctement et la transcription n' est pas induite.
Dans ce système, le DLA est fusionné à une protéine X et le DA à une protéine Y. Si les protéines X et Y interagissent, un complexe transactivateur fonctionnel se forme et induit l'expression d'un gène rapporteur placé en aval de la séquence reconnue par le DLA. L'expression du gène permet de révéler indirectement l'interaction entre les deux protéines.
Transformation de la levure par un ou deux plasmides différents.
Les levures sont rendues compétentes par un traitement au LiAc/PEG d'après la méthode décrite par Gietz (Gietz et al., 1995).
Les levures sont cultivées sur milieu solide YPD à 28 °C pendant une nuit. Elles sont 5 ensuite resuspendues dans 1 ml de solution I stérile (LiAc 0,1 M, TrisHCI 10 mM, EDTA 1mM pH7,5), centrifugées 1 min à 3000 rpm et reprises à nouveau dans 1 ml de solution I. 50 wl de la suspension sont alors mélangés à 5 ~,g d'ADN de sperme de saumon (ADN entraîneur), 1 à 5 ~g d'ADN plasmidique et 300 wl de solution II
stérile (LiAc 0,1 M, TrisHCI 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5, PEG4ooo 50%). Le 10 mélange est incubé 30 min à 28 °C puis subit un choc thermique pendant 20 min à 42 °C. Après centrifugation 1 min à 3000 rpm, les cellules sont lavées une fois à l'eau stérile et reprises dans 100 ~1 d'eau stérile. Puis, les levures sont étalées sur milieu gélosé YNB additionné des acides aminés et bases azotées nécessaires à leur croissance.Pour permettre la séiection des souches de levure transformées, les acides
la thrombine, car la séquence reconnue et clivée par cette enzyme a été
introduite entre ces deux régions.
Le vecteur pET-29a (fig. 6 (c)), est un plasmide bactérien de 5,4 kb. Il possède une origine de réplication pBR322, une origine de réplication du phage fl, un gène de résistance à la kanamycine, un gène lacIq. Ce plasmide est utilisé pour exprimer chez la bactérie des peptides d'intérêt fusionnés à une séquence S-Tag (partie catalytique de la protéine S ribonucléase) et une séquence His-Tag (peptide de 10 histidines) qui facilitent la détection et la purification de la protéine de fusion. Le promoteur de transcription T7 permet une forte expression après induction à l'IPTG. Une séquence reconnue et clivée par la thrombine a été introduite entre les séquences S-Tag et His-Tag.
5) Les oligonucléotides de synthèse employés A partir de la séquence de PS-I (Sherrington et al., 1995), différents couples d'oligonucléotides on été définis afin d'obtenir les fragments d'ADN
correspondant aux régions hydrophiles de PS-I. Ces oligonucléotides permettent d'introduire un site EcoRI en 5' et un site SaII en 3' de la séquence après amplification par PCR.
oligoA CAA GAA TTC TGT CCG AAA GGT CCA CTT (SEQ ID N° 3) oligoB CAA GTC GAC TCA GGT TGT GTT CCA GTC TCC (SEQ ID N°
4) i5 Les oligonucléotides A et B ont servi à obtenir les fragments BL6 et BM issus de la grande boucle.
oligoC CAA GAA TTC TCA ACA ATG GTG TGG TTG (SEQ ID N° 5) oligoD CAA GTC GAC TCA TTC CTC TGG GTC TTC ACC (SEQ ID N°
6) Les oligonucléotides C et D ont servi à obtenir le fragment BR issu d'une région plus courte de la grande boucle.
oligoE CAA GAA TTC ACA TTA TTA CTC CTT GCC (SEQ ID N° 7) oligoF CAA GTC GAC TCA GAT ATA AAA TTG ATG CAA (SEQ ID N° 8) Les oligonucléotides E et F ont servi à obtenir le fragment Ct, issu de la partie C-terminale de PSI.
oligoG CAA GAA TTC ATG ACA GAG TTA CCT GCA (SEQ ID N° 9) oligoH AA GTC GAC TCA ATG CTT GGC GCC ATA TTT (SEQ ID N° 10) Les oligonuciéotides G et H ont servi à obtenir le fragment Nt, issu de la partie N-terminale de PSI.
Les oligonucléotides I; J et K ont été utilisés pour amplifier et séquencer les inserts des plasmides pGBT9 et pGADlO. Ils sont, respectivement, complémentaires des séquences du DLA de GAL4, du DA de GAL4 et du terminateur ADH1.
oligoI GCG ACA TCA TCA TCG GAA GAG AG (SEQ ID N° 11) oligoJ CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CC (SEQ ID N° 12) oligoK GGC GAA GAA GTC CAA AGC (SEQ ID N° 13) 6) Les méthodes de biologie moléculaire.
Préparation de l'ADN plasmidique.
Les préparations en petite quantité et en grande quantité d'ADN plasmidique ont été
effectuées selon les protocoles décrits dans Maniatis et al. ( 1989).
Amplification en chaîne par la polymérise Taq thermostable (ou PCR).
La PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN entre deux régions connues où
peuvent se fixer des oligonucléotides (de 20 pb environ) qui serviront d'amorces à
une polymérise thermostable. Les réactions sont effectuées dans un volume final de 100 ~,1 en présence de la matrice d'ADN (50 ng), de dNTP (0,2 mM), de tampon PCR (TrisHCI pH 8,5, 10 mM, MgCl2 1 mM, KCl 5 mM, gélatine 0,01%), des deux oligonucléotides (500 ng chacun) et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérise. Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon.
Le programme utilisé comporte 32 cycles : 1 cycle de dénaturation de la matrice (5 min à 95 °C), 30 cycles (1 min de dénaturation à 95 °C, lmin d'hybridation des oligonucléotides sur la matrice d'ADN à 50 °C, 1 min d'élongation par la Taq polymérise à 72 °C) enfin 1 cycle d'élongation finale (S min à 72 °C).
La PCR peut être effectuée directement sur des cultures de bactéries ou de levures en phase exponentielle de croissance.
Séquençage par fluorescence.
La technique de séquençage utilisée est dérivée de la méthode de Songer et al.
(1977) et adapté pour le séquençage par fluorescence développé par Applied Biosystems. Le protocole utilisé est celui décrit par les concepteurs du système (Perkin Elmer, 1995).
Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide par ügation.
L'insert provenant d'un ADN plasmidique ou d'une réaction de PCR et le plasmide vecteur sont digérés 1 heure par des enzymes de restriction à 1 U/~.g d'ADN
dans Ieur tampon respectif (Biolabs). Les enzymes sont choisies en fonction des sites de clonage pour introduire l'insert en phase avec les autres domaines du vecteur.
Les fragments issus de la digestion sont séparés selon leur taille par électrophorése sur un gel " préparatif " d'agarose 0,8% fait dans du TBE (Tris S mM, borate 90 mM, EDTA 2mM, pH 8) avec O,S ~g/ml de BET. Du bleu de dépôt (1/10 de volume) est ajouté aux échantillons avant leur chargement sur le gel à côté
d'un marqueur de poids moléculaire ( 1 Kb ladder, Gibco BRL). La migration s' effectue à 90 volts/cm constants dans du TBE.
L'ADN est révélé sous U.V. par la fluorescence du BET qui s'est intercalé
entre les bases. Les morceaux de gel contenant les fragments d'ADN de tailles voulues (vecteur et insert) sont découpés au scalpel, introduits dans un boudin à
dialyse avec du TBE et soumis à une électrophorèse pendant 1 S min à 100 volts.
L'ADN extrait du gel est ensuite récupéré, traité par un volume de phénol/chloroforme/isoamylate (25/24/ 1 ), précipité par 3 volumes d' éthanol absolu 1 S en présence de NaCI 0,25 M, lavé une fois à l' éthanol 70%, séché et enfin repris dans 201 d'H20.
Après avoir estimé sur gel les quantités respectives de vecteur et d'insert, ces derniers sont mélangés dans un rapport de 1/1 en présence de 40 U.I. de T4 DNA
ligase, du tampon de Iigation 1X final (TrisHCl SO mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) dans un volume total de 20 ~.1. La Iigation s'effectue à
C pendant au moins une heure.
Transformation des bactéries par un plasmide.
1) La méthode dite au " TSB " (d'après Chung et Miller, N.A.R. vol 16, 1988) consiste à fragiliser la paroi des bactéries par un traitement au DMSO pour permettre 2S l'entrée de l'ADN dans les cellules. Son efficacité est de 106 transformants/~,g d'ADN. Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide pendant environ heures sous agitation (jusqu'à A.6oo=0,6). La culture est centrifugée 10 min à
rpm, le culot est repris dans 1/10 du volume initial par du TSB {milieu LB, PEG~
10%, DMSO 5%, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM), et incubé 15 min à 4°C.
Environ 50 ng d'ADN (10 ~1 pour le produit de ligation) sont ajoutés à 100.1 de bactéries compétentes, puis le mélange est incubé 30 min à 4 °C. Après addition de TSBgIu (TSB, glucose 20 mM) et incubation à 37 °C pendant 45 min, les bactéries sont étalées sur milieux LB avec l'antibiotique correspondant au gène de résistance porté
par le plasmide.
2) L'électroporation est une technique 1000 fois plus efficace que la méthode au TSB, elle est utilisée lorsqu'on dispose de trés faibles quantités d'ADN (comme après l' extraction des plasmides contenus dans les levures). Elle consiste â
fragiliser la paroi bactérienne par un choc électrique pour introduire l'ADN dans les cellules.
Les bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide sous agitation jusqu'à
A6~=0,6. La culture, incubée préalablement 15 min à 4 °C, est centrifugée 10 min à
3000 rpm et le culot est lavé successivement par 1 volume d'H20 glacée, 1/2 volume d'H20 glacée, et 1/5 volume de glycérol 10% glacé. Entre chaque lavage, les bactéries sont centrifugées 10 min à 3000 rpm pour enfin être reprises dans volume de glycérol 10% glacé. 40 wl de cette suspension de bactéries sont mélangés avec 1 ~,1 d'ADN dans une cuve à électroporation. Les cuves sont placées dans le Gene Pulser BioRad pour que les bactéries subissent un choc électrique (25 mF, 2,SkV, 200 V~ . Apr~s incubation à 37 °C pendant 45 min, les bactéries sont étalées sur milieu LB contenant l'antibiotique servant à la sélection.
Hybridation des ARNm après transfert sur membrane (ou Northern Blot).
Les membranes utilisées sont des membranes de nitrocellulose commerciales Clontech oil les ARNm issus de différents tissus humain ont déjà été
transférés et fixés.
La sonde d'ADN radioactive est préparée suivant le protocole « Rediprime DNA
Labelling System » Amersham. Ce protocole permet d'obtenir un taux d'incorporation du [32P] dCTP (50 mCi) supérieur à 55 % dans le fragment d'ADN
après une incubation de 10 min à 37 °C et de détecter une bande d'ARN
équivalent à
0,5 pg après une hybridation de 2 heures et une nuit de mise en autoradiographie.
Les membranes sont préhybridées avec 8 ml de solution d'hybridation (NaCI 1 M, NaH2P04 10 mM pH 7,4 ; Ficoll 10 mg/ml, polyvinylpyrrolidone 10 mg/ml, BSA 10 mg/ml, ADN de sperme de saumon 100 mg/ml, SDS 2%) environ 2 heures à 42 °C
sous agitation, puis elles sont hybridées avec la sonde à 2.106 cpm/ml mélangée avec 8 ml de solution d'hybridation pendant 24 heures à 42 °C sous agitation, elles sont ensuite rincées plusieurs fois avec ia solution 1 de lavage (NaCI 0,3 M, sodium citrate 30 mM pH 7, SDS 0,05%), lavées pendant 40 min dans cette même solution, incubées 40 min à 50 °C dans la solution 2 de lavage (NaCI 15 mM, sodium citrate 1,5 mM pH 7, SDS 0,1 %) et enfin elles sont soumises à une autoradiographie.
7) Les méthodes pour le système double hybride.
Principe du système.
Le système double hybride, développé par Song et Fields depuis 1989, est une technique de clonage par interaction in vivo, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il repose sur le fait que certains transactivateurs eucaryotes ne nécessitent que deux domaines pour fonctionner: un domaine de liaison à l' ADN (DLA) qui se fixe sur une séquence spécifique et un domaine d'activation (DA) qui recrute la machinerie de transcription (ARN polII). Lorsque les deux domaines sont séparés, le DA ne peut pas se positionner correctement et la transcription n' est pas induite.
Dans ce système, le DLA est fusionné à une protéine X et le DA à une protéine Y. Si les protéines X et Y interagissent, un complexe transactivateur fonctionnel se forme et induit l'expression d'un gène rapporteur placé en aval de la séquence reconnue par le DLA. L'expression du gène permet de révéler indirectement l'interaction entre les deux protéines.
Transformation de la levure par un ou deux plasmides différents.
Les levures sont rendues compétentes par un traitement au LiAc/PEG d'après la méthode décrite par Gietz (Gietz et al., 1995).
Les levures sont cultivées sur milieu solide YPD à 28 °C pendant une nuit. Elles sont 5 ensuite resuspendues dans 1 ml de solution I stérile (LiAc 0,1 M, TrisHCI 10 mM, EDTA 1mM pH7,5), centrifugées 1 min à 3000 rpm et reprises à nouveau dans 1 ml de solution I. 50 wl de la suspension sont alors mélangés à 5 ~,g d'ADN de sperme de saumon (ADN entraîneur), 1 à 5 ~g d'ADN plasmidique et 300 wl de solution II
stérile (LiAc 0,1 M, TrisHCI 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5, PEG4ooo 50%). Le 10 mélange est incubé 30 min à 28 °C puis subit un choc thermique pendant 20 min à 42 °C. Après centrifugation 1 min à 3000 rpm, les cellules sont lavées une fois à l'eau stérile et reprises dans 100 ~1 d'eau stérile. Puis, les levures sont étalées sur milieu gélosé YNB additionné des acides aminés et bases azotées nécessaires à leur croissance.Pour permettre la séiection des souches de levure transformées, les acides
15 aminés et les bases azotées correspondant aux marqueurs de sélection portés par les plasmides ne sont pas ajoutés. Les boîtes sont mises à l'étuve à 28 °C
pendant 3 J Ours.
Transformation de la levure par une banque d'ADNc.
La banque d'ADNc utilisée est une banque commerciale (Clontech) constituée à
20 partir d'ARNm d'un cerveau humain normal (homme de 37 ans décédé à la suite d'un traumatisme cérébral). Les ADNc ont été clonés dans le plasmide pGADlO en aval de la région du DA de GAL4 au site EcoRI. La moyenne de la taille des inserts est de 1,4 kb avec un écart type de 1 kb. La banque a été amplifiée une fois dans E.coli DHSa pour obtenir 1,2x106 clones indépendants dont 80% contiennent un insert.
Pour préserver une bonne représentativité de la banque, il est nécessaire d'avoir un nombre de transformants deux à dix fois plus grand que celui des clones indépendants WO 99/16874 PCT/P'R98/02093 obtenus lors de la construction de la banque. Nous utilisons donc un protocole qui permet d'obtenir une bonne efficacité de transformation (environ 10' transformants/100 ~,g d'ADN).
Les levures YCM79 préalablement transformées par le plasmide pGBT9 contenant une séquence correspondant à une région de PS-I sont cultivées une nuit dans 50 ml de milieu YNB +His +Lys +Ade +Met +Leu +Ura à 28 °C sous agitation. La densité
optique de cette préculture est mesurée pour évaluer le nombre de cellules par ml et permettre le calcul du volume à inoculer dans 250 ml de milieu YPD afm d'obtenir une culture de 10' cellules/ml (environ A~~=0,8) après une nuit à 28 °C
sous agitation.
Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation à 3000 rpm pendant 10 min, lavées deux fois avec 100 ml d'H~O stérile, reprises dans 10 ml de solution I
de transformation. La suspension est centrifugée lOmin à 30001pm et les cellules resuspendues dans 2,5 ml de cette même solution. Une partie de la suspension est prélevée (200 wl): la moitié servira de témoin négatif non transformé, l'autre moitié
sera transformée par un plasmide contrôle dont l'efficacité de transformation est connue. La suspension restante est mélangée à 100 ~.l de banque plasmidique d'ADNc à lmg/ml et 20 ml de solution II. Le mélange est incubé 1 heure à 28 °C
sous agitation puis 20 min à 42 °C avant d'être centrifugé 15 min à
3000 rpm. Le culot cellulaire est lavé une fois à l'eau et deux fois au PBS afm de bien éliminer le PEG qui a un effet toxique sur les levures, puis est repris dans 2,5 ml de PBS
stérile (Na2HP04 50 mM, KCl 10 mM, MgS04 1 mM, pH 7).
250 ml de milieu YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura sont ensemencés par cette suspension et incubés 4 heures à 28 °C sous agitation pour permettre l'expression des protéines hybrides, leur interaction éventuelle et l'expression du gène rapporteur URA3. Cependant, cette étape a pour conséquence de multiplier le nombre de clones positifs. Pour évaluer le taux d' amplification du nombre de colonies, 1 ml de culture est prélevé avant et aprës cette incubation et différentes dilutions sont étalées sur milieu gélosé YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura. Après croissance, le nombre de clones Leu+ Trp+ est déterminé pour évaluer la fréquence de transformation avant et après la période d'incubation et le taux d'amplification en est déduit.
Les cellules sont alors centrifugées 10 min à 3000 rpm, lavées deux fois à
l'eau stérile, reprises dans 10 ml d'YNB et étalées sur 10 boîtes de 435 cm2 contenant chacune 200 ml de milieu sélectif YNB +His +Lys +Ade +Met. Les boîtes sont mises à l'étuve à 28 °C pendant 3 jours.
Extraction de l'ADN plasmidique des levures.
Cette technique extrait aussi bien les plasmides que l'ADN génomique contenu dans les levures. Pour isoler les plasmides, il suffit de transformer des bactéries où seul l' ADN plasmidique peut se répliquer et d' analyser chaque clone après minipréparation .Les levures contenant les plasmides sont cultivées sur milieu solide YNB sélectif à 28 °C pendant une nuit. Elles sont ensuite resuspendues dans 200 ml de solution de cassage (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI 100 mM, Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) en présence de billes de verre (450 um de diamètre) et de 200 ml de phénol/chloroforme. Le mélange est agité 15 min sur un vortex puis centrifugé
2 min à 14000 rpm. La phase aqueuse est dialysée iheure sur membrane. Cette solution peut servir à la transformation des bactéries par électroporation.
Révélation de l' activité beta-galactosidase.
Ce test permet de vérifier l'expression du gène rapporteur LacZ codant pour la ~i-galactosidase dans les levures transformées.
Une feuille de nitrocellulose est déposée sur les clones de levures individualisés. La réplique est plongée 3 fois pendant 30 secondes dans de l'azote liquide pour casser les levures et permettre l'accès du substrat à la beta-galactvsidase. La feuille est ensuite posée, colonies vers le haut, sur un papier Whatman imbibé d'une solution de PBS/Xgal préparée extemporanément (100 ~,1 d'une solution de substrat Xgal â
mg/ml en diméthylformamide dans 5 ml de PBS) puis placée à 37 °C, température optimale pow l'activité enzymatique testée.
Le temps d'apparition de la coulew bleue qui révéle l'activité ~i-gal est très variable, de quelque minutes à plusieurs heures. Le test s'effectue en présence d'un témoin positif d'interaction qui vire rapidement au bleu et d'un témoin négatif qui reste blanc.
Test en goutte.
Ce test permet d'analyser le phénotype d'une souche de levure. Une goutte (environ 5 ml) d'une suspension de levwes légèrement trouble est déposée sw différents milieux gélosés sélectifs et non sélectifs, et la croissance des levures est observée après 2 jours d'incubation à 28 °C.
Ségrégation des plasmides.
Il s' agit de tester par une ségrégation plasmidique si le phénotype des levwes transformées est bien lié à la présence des plasmides.
Les levures sont cultivées une nuit sw milieu complet YPD à 28 °C. Ce milieu non sélectif permet la croissance des levwes conservant ou ne conservant pas les plasmides après la division cellulaire. Différentes dilutions de cette culture sont étalées pow obtenir entre 50 et 100 clones par boîte de milieu YPD après une nuit d'incubation à 28 °C. Le phénotype des clones est alors testé par répliques sur velours sw différents milieux sélectifs et la fréquence des cellules ne contenant pas de plasmide peut être estüriée après 2 jours d'incubation à 28 °C.
8) Les méthodes pour le test d'interaction in vitro .
Principe du test.
II s' agit de vérii~er l' interaction entre deux protéines en utilisant une technique biochimique de chromatographie d'affinité. Un extrait cellulaire contenant un des partenaires supposés de la protéine est ajouté à un support où la protéine appât a été
préalablement fixée. Si l'interaction existe entre la protéine et son éventuel partenaire, celui-ci aussi, sera retenu sur le support.
Expression des protéines de fusion chez E.coli .
Les protéines de fusion sont produites dans E.coli BL21(DE3) par l'intermédiaire des vecteurs d'expression pET et pGEX inductible par l'IPTG (Studier, 1991).
Les bactéries BL21(DE3), préalablement transformées par les plasmides recombinants, sont cultivées une nuit sous agitation dans du milieu LB avec l'antibiotique servant à la sélection (ampicilline pour pGEX ou kanamycine pour pET
à IOO~g/ml). 5 ml de cette préculture sont inoculés dans 45 ml de milieu LB+antibiotique afin d'obtenir une culture à A.soo=0,6 après 1 heure d'agitation à 37 °C. La production des protéines est alors induite par addition de 0,1 mM d'IPTG et les bactéries sont remises à 37 °C sous agitation entre 1 heure et 4 heures. Les cellules exprimant les protéines sont récoltées par centrifugation à 6000 rpm pendant S min. Les culots peuvent être gardés à -20 °C.
Extraction et analyse des protéines produites chez la bactérie.
Les culots bactériens contenant les protéines de fusion sont resuspendus dans 5 ml de TE (TrisHCl 50 mM pH 8, EDTA 2 mM). Les cellules sont lysées par du lysozyme 0,1 mg/ml final et 1% Triton X-100. Elles sont incubées 15 min à 30 °C
avant d'être placées dans la glace pour être soumises aux ultra-sons jusqu'à ce que la suspension bactérienne devienne fluide. Le lysat bactérien est centrifugé 15 min à 10000 rpm à 4 °C. Le surnageant contenant la protéine de fusion solubilisée peut être conservé à -20 °C.
A cette étape, les différentes fractions obtenues sont analysées par électrophorèse sur gel dénaturant (SDS PAGE). 60 lsl de la suspension bactérienne avant la centrifugation (fraction totale), 60 ~,1 de surnageant (fraction soluble) ainsi que 60 ~1 du culot resuspendu dans 5 ml de TE (fraction insoluble) sont prélevés. Les protéines contenues dans les différentes fractions sont dénaturées 10 min à 95 °C
en présence de 1/4 de volume de bleu de dépôt 4xL (TrisHCl 0,2 M pH 6,8, SDS 5%, glycérol 5%, 2-mercaptoethanol 0,5%, bleu de bromophénol) et chargées sur un gel de SDS
5 polyacrylamide 12% où elles sont séparées en fonction de leur masse moléculaire par electrophorèse. Après migration à 125 volts/cm, les protéines sont détectées par coloration du gel au bleu de Coomassie.
Solubilisation des protéines.
Lors de l'expression d'un gène exogène dans E.coli peuvent apparaïtre des agrégats 10 de la protéine exogène formant des corps d'inclusion. La protéine recombinante est alors facile à purifier par centrifugation mais elle est souvent difficile à
solubiliser.
Les protéines se trouvant dans les fractions insolubles sont dénaturées par de l'urée 6 M et du DTT 10 mM pendant 10 min à 37 °C puis renaturées par dialyse dans trois tampon successifs pendant au moins 6 heures chacun (TrisHCl 5 mM pH 8 / urée 2 15 M; TrisHCl 5 mM, pH 8 / urée 1 M; TrisHCl 5 mM, pH 8). Après 15 min de centrifugation à 10000 rpm, environ 5 à 10% de la protéine se trouve dans le surnageant qui peut être conservé à -20 °C.
Chromatographie d'affinité.
Pour que la rétention des protéines s'opère dans de bonnes conditions, la 20 concentration protéique des échantillons doit être supérieure à 40 mg/ml.
Cette concentration peut être estimée par une méthode colorimétrique (réactif de Bradford, par exemple).
200 ~,l de fraction soluble contenant la GST non fusionnée ou la GST-BM
(boucle mutée de la préséniline 1) sont incubés 2 min à 20 °C en présence de 300 ~1 de 25 « résine glutathion ». La fraction non retenue par les billes est prélevée.
La résine est lavée 4 fois par du tampon de lavage (TrisHCl pH 8, 20 mM, NaCI 150 mM, Triton X 100 0,1 %) afin d' éliminer les protéines fixées par adsorption non spécifique. 150 ~1 de résine ayant liée la GST ou la GST-BM sont incubés 1 heure à 4 °C
sous agitation avec 600 ~,1 de fraction soluble contenant STag ou STag-Pep126 . Les billes d'agarose sont ensuite centrifugées 1 min à 3000 rpm et lavées 4 fois par du tampon de lavage après prélèvement de la fraction non retenue.
Un aliquote de chaque fraction (soluble, non retenue et retenue par les billes) est déposée sur gel SDS PAGE après dénaturation à 95 °C en présence de bleu de dépôt et séparées par électrophorèse. Les protéines sont, ensuite, transférées sur membrane de nitrocellulose puis la membrane est colorée au rouge Ponceau (20 ~,g/ml) pour vérifier que le transfert des protéines a bien été réalisé.
Pour pouvoir détecter spécifiquement les protéines fusionnées avec le S-Tag, la membrane de nitrocellulose est saturée avec 1 % de gélatine dans du TBST
(TrisHCl 10 mM pH 8, NaCI 150 mM, 0,1 % Tween20) pendant 15 min et incubée 15 min avec la protéine S liée à la phosphatase alcaline. Après 4 lavages avec le TBST, l'activité
de la phosphatase alcaline est révélée par addition d'un tampon PA 1X
contenant du NBT et du BCIP selon la méthode Novagen.
9) Les méthodes d'ezpression des protéines recombinantes en cellules mammifères.
Construction d'un vecteur d'expression en cellules mammifères Pour l' expression en cellules mammifères, les séquences ID N° 1 et ID
N° 2 ont été
sousclonées par des méthodes classiques dans un vecteur sous le contrôle d'un promoteur viral fort (CMV).
Transfection de cellules La méthode établie pour les cellules COS 1 ou les cellules CHO, consiste à
utiliser un lipofectant dans un ratio de 1 pour 8 (poids/poids) par-rapport à l'ADN et un peptide synthétique (Hl) au même ratio afin d'optimiser la compaction de l'ADN et l'efficacité de transfection. Cette méthode repose notamment sur la neutralisation des S charges des phosphates de l'ADN par les charges positives du lipofectant.
Les cellules COS 1 sont cultivées en incubateur à 37 °C, 9S% d'humidité
et S % de CO~ dans le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contenant 4.S g/1 glucose (Gibco-BRL) supplementé avec 3 % de L-Glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine et 10 % de Sérum de Veau Foetal.
10 La veille de la transfection, les cellules sont ensemencées à une densité
de 2.S 106 cellules par boite de 100 mm. Le jour de la transfection legs cellules sont rincées 2 fois par du PBS (Phosphate Buffer Saline) et une fois en OptiMEM (composition brevetée; Gibco-BRL) pour une habituation d' au moins 1 S minutes en incubateur.
Par équivalent-boite de 100 mm, 8 ~g d'ADN plasmidique au total sont ajoutés à
1S ~1 d'OptiMEM et 64 ~g de peptide synthétique (H1). Aprés avoir vortexé
vigoureusement pendant 10 secondes, la lipofectamine (32 ~1, soit 64 ~,g) diluée dans 300 ~l d'OptiMEM est ajoutée au mélange précédent, aprés S minutes d'attente.
L'ensemble est une nouvelle fois vortexé vigoureusement puis laissé 30 minutes reposer. Cinq millilitres d'OptiMEM sont ajoutés par tube et le mélange vortexé est 20 placé sur les cellules (dont on a au préalable aspiré le milieu). Les cellules sont alors placées en incubateur pendant 4 heures, au terme desquelles le mélange est remplacé
par du milieu complet.
Lyse des cellules et dosage des protéines Les cellules sont le plus souvent lysées 48 heures après la transfection {au maximum 2S habituel d'expression). Le tampon de lyse contient 10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM
d'EDTA, 1 % de Triton X100, 1 % de NP40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (CompleteC~, Boehringer-Mannheim). Pour chaque plaque, après un rinçage au PBS, 800 p,l du tampon froid sont ajoutés. Les lysats subissent alors une sonication suivie d'une agitation au barreau magnétique à 4 °C pendant une nuit. Une centrifugation de 30 minutes à 15000 x g sépare le culot du surnageant.
Les protéines solubles sont alors dosées selon le kit BCA (Pierce) afin de pouvoir normaliser les expériences suivantes.
ï.mmunotransfert Les échantillons (lysats de cellules) sont dénaturés dans un volume égal de tampon de dépôt (125 mM Tris pH 6.8, 4% mlv SDS, 20 % glycérol, 0.02 % Bromophénol Blue, 50 mM Dithiothreitol) à 95 °C pendant 5 minutes. Pour l'analyse de l'expression des présénilines, les échantillons sont dénaturés en présence de 8 M urée et à 37 °C afin d'éviter l'agrégation propre aux présénilines à 95 °C.
Les échantillons sont déposés sur des gels Tris-Glycine (Novex), avec un pourcentage d'acrylamide différent selon le poids moléculaire à discriminer. Un marqueur de poids moléculaire est également déposé (Broad Range, BioRad). La migration a lieu pendant environ 2 heures à 100 volts constants dans du tampon SDS 1 X final (Novex). Le gel est ensuite transféré sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF
(tampon de transfert 1 X final (Novex) avec 10 % de méthanol) pendant 2 heures à
150 mA constants.
Après transfert, la membrane est bloquée pendant 2 heures à température ambiante dans 50 ml de PBS-T (PBS avec 0.5 % Tween) contenant 2 % de lait écrémé
(Merck). L'anticorps primaire (dilué à la concentration optimale de l'ordre du 1/1000e au 1/SOOOe, dans du PBS-T avec ou sans 2 % de lait écrémé) est laissé
sur une nuit à 4 °C. Après un bref rinçage en PBS-T, la membrane est incubée 45 minutes en présence du deuxième anticorps (Ig G anti-souris ou anti-lapin selon le cas, couplé à la peroxydase de raifort) dilué au 1/SOOOe dans un tampon dit «
ECL »
(Tris 20 mM, NaCI 150 mM, Tween 0.1 %).
La membrane est alors rincée 4 fois 15 minutes dans le tampon «ECL». Elle peut être révélée par le réactif ECL (Amersham) constitué de 2 tampons à mélanger extemporanément en volume égal. Différentes expositions d'un film photographique (Hyperfilm ECL ; Amersham) sont effectuées, suivies d'un développement.
EXEMPLES
Exemple 1: Isolement de partenaires spécifiques de PS 1 par criblage de banque de fusion d'ADNc de cerveau Dans le but d'isoler des partenaires spécifiques de la protéine PS l, une banque d'ADNc de cerveau humain a été criblée par la technique du double-hybride. Une banque d'ADNc fusionnés avec le DA de GAL4 a été utilisée et différentes protéines appâts ont été construites en fusionnant les régions hydrophiles de PS-I avec le DLA
15 de GAL4.
1.1 Construction des vecteurs permettant l'expression de protéines de fusion entre le DLA de GAL4 et les régions hydrophiles de PS 1.
Cinq protéines de fusion ont été réalisées grâce au vecteur pGBT9 dans lequel ont été
introduites les séquences correspondant à différentes régions hydrophiles de 20 dans le même cadre de lecture que la séquence du DLA de GAL4. Il a été
choisi d'identifier des protéines interagissant avec la région N-terminale (Nt, codons 1 à
81 ), la grande boucle (BL6, codons 263 à 407), la grande boucle avec la mutation L286V (BM), une région plus courte de la grande boucle (BR, codons 290 à 376) et enfin la partie C-terminale de la protéine (Ct, codons 421 à 467).
25 Les fragments d'ADN correspondant à ces différentes régions ont été obtenus par PCR à partir de la séquence entière de l'ADNc de PS 1. Les différents oligonucléotides utilisés ont permis l'introduction des sites EcoRI et SaII
aux extrémités de chaque séqueace amplifiée. Ainsi, les fragments de PCR ont pu être insérés entre les sites EcoRI et SaII du multisite de clonage de pGBT9 en aval et en phase avec la séquence du DLA de GAL4. Les différentes constructions obtenues, pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR et pGBT-Ct, ont été vérifiées par 5 séquençage de l'ADN. Cette vérification a montré que les fragments ne présentaient aucune mutation générée par la PCR et qu'ils étaient bien dans le même cadre ouvert de lecture que celui de la séquence du DLA de GAL4.
1.2 Obtention des souches de levures exprimant les protéines de fusion entre le DLA
de GAL4 et les régions hydrophiles de PS 1.
10 Comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents est un événement moins fréquent que sa transformation par un seul plasmide, une souche de levure préalablement transformée par le vecteur codant pour la protéine appât a été
utilisée, afin d'avoir la meilleure efficacité possible lors du criblage de la banque d' ADNc.
15 Pour cela, la souche de levure YCM 79 a été transformée par chacun des plasmides pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR et pGBT-Ct. Les levures contenant ces plasmides ont été sélectionnées pour leur phénotype Trp+ sur milieu ne contenant pas de tryptophane et respectivement appelées yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt. La présence de ces diff~ents plasmides dans chaque souche a été vérifiée en effectuant une PCR
20 directement sur les levures, à l'aide d'oligonucléotides complémentaires des séquences DLA et tADHI situées en 5' et 3' de l'insert. La taille des fragments de PCR obtenus permet de distinguer les différentes souches à l'exception des souches yBL6 et yBM.
1.3 Tests d'activité transactivatrice et d'interaction avec le DA de GAL4 des 25 protéines de fusion contenant les régions hydrophiles de PS 1.
Si une des protéines de fusion présente une activité transactivatrice ou si elle interagit avec le DA de GAL4, elle ne peut pas être utilisée comme appât dans le système double hybride car elle donne systématiquement une réponse positive en dehors de toute interaction protéine-protéine.
Le premier test consiste, donc, à vérifier que les régions hydrophiles de PS-I
ne possèdent pas d'activité transactivatrice lorsqu'elles sont fusionnées au DLA
de GAL4, c' est à dire capables d' induire, à elles seules, la transcription des gènes rapporteurs. Ce type d'activité peut, par exemple, être lié à la présence d'un domaine acide dans la protéine de fusion.
Pour ce test, l'expression des gènes rapporteurs LacZ et URA3 ont été
contrôlés directement sur les souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt.
Pour le deuxiéme test qui consiste à contrôler l'absence d'interactïon entre les protéines de fusion et le DA de GAL4, les souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt de phénotype Trp+ Leu- ont été transformées par le plasmide pGAD424 (équivalent au pGADlO) qui code pour le DA de GAL4. Les levures ont été sélectionnées sur un milieu sans tryptophane ni leucine et l'expression des gènes rapporteurs LacZ
et URA3 permettant de contrôler l'interaction a été testée sur les clones obtenus.
Dans tous les cas, les résultats des tests de l'activité ~i-galactosidase ainsi que ceux des tests en goutte sur milieu sélectif sans uracile se sont révélés négatifs.
Les protéines de fusions contenant les parties hydrophiles de PS-I ne présentent donc pas de propriété transactivatrice intrinsèque et n'interagissent pas avec le domaine d'activation de GAL4. Elles peuvent donc être utilisées comme protéines appâts pour le criblage de la banque.
1.4 Transformation des différentes souches de levure par la banque de fusion d' ADNc.
Le criblage de la banque de fusion permet d'identifier des clones exprimant des peptides fusionnés au DA de GAL4 interagissant avec la protéine appât. Si cette interaction existe, elle doit permettre la reconstitution d'ùn transactivateur fonctionnel capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs URA3 et ~acZ
dans la souche contenant la protéine appât.
Pour que le criblage soit représentatif, il est nécessaire que chaque plasmide indépendant constituant la banque soit présent dans, au moins, un clone de levure apr~ transformation. Pour cela, un protocole permettant théoriquement d'obtenir un nombre de transformants supérieur au nombre de plasmides indépendants de la banque a été utilisé (c~ matériels et méthodes).
Les 5 souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt de phénotype His-, Lys-, Ade-, Met-, Ura , Leu-, ont été transformées successivement par 100~g d'ADN plasmidique de la banque de fusion et les cellules transformées ont été sélectionnées sur un milieu YNB
+His +Lys +Ade +Met.
A l'issue de la première sélection, nous avons obtenu 32 clones ayant un phénotype Ura+ avec la souche yNt, 450 clones Ura+ avec yBL6, 128 avec yBM, 250 avec yBR
et 67 avec yCt. Un test d'activité (i-galactosidase a été effectué sur ces transformants afin de vérifier l'expression du deuxième gène rapporteur LacZ. Au total 6 clones présentaient le double phénotype Ura+, /3-gal+; 1 clone pour la souche yNt, 1 clone pour yBL6, 2 clones pour chacune des souches yBM et yBR, aucun clone pour yCt.
Les clones sont respectivement nommés yNt.A, yBL6.B, yBM.C, yBM.D.
EXEMPLE 2 : Isolement des plasmides de la banque.
Afin d'identifier les protéines pouvant interagir avec la boucle mutée ou la boucle réduite de PS 1, les plasmides contenus dans les levures yBM.C et yBM.D ont été
extraits. Les plasmides présents dans les préparations d'ADN ont été utilisés pour transformer des bactéries par électroporation.
Les plasmides, extraits des clones bactériens obtenus, ont été digérés par différentes enzymes. Cette analyse a mis en évidence 5 profils de restriction différents.
Les digestions des plasmides extraits des levures yBM.C et yBM.D présentent un profil commun correspondant au plasmide pGBT-BM ef deux profils différents correspondant au plasmide pGAD 10 contenant un insert de 2900pb correspondant à
la séquence ID N° 1 (pGAD-C étant issu de la souche yBM.C) et un insert de 1400pb correspondant à la séquence ID N° 2 (pGAD-D étant issu de la souche yBM.D).
2.1 Contrôle des plasmides isolés par transformation de différentes souches de levure.
Lors de la transformation des levures par les plasmides de la banque de cerveau, il est possible que plusieurs plasmides différents soient introduits dans une même cellule.
Afln de vérifier que les résultats d'interaction sont bien dûs à la présence des plasmides isolés et non à des plasmides surnuméraires, nous avons de nouveau testé
les protéines de fusion issues du criblage de la banque contre les différentes régions hydrophiles de PS-I dans la souche YCM 79 mais aussi dans les souches HF7 C et PCY 2.
HF7 C possède deux gènes rapporteurs HIS3 et LacZ . Le gène LacZ a un environnement promoteur différent de celui existant chez la souche YCM 79, ce qui permet de contrôler que l' obtention de clones ~i-gal+ n' est pas liée à un environnement promoteur spécifique mais bien à une interaction entre les protéines testées. PCY 2 présente l'avantage de ne posséder qu'un seul gène rapporteur LacZ
qui est exprimé plus fortement que dans les deux autres souches lorsque le transactivateur GAL4 est fonctionnel.
Nous avons transformé les trois souches de levure YCM 79, HF7 C et PCY 2 par les différents couples de plasmides pGBT-X/pGAD-Y (X correspondant à Nt, BL6, BM, BR ou Ct; Y correspondant à C ou D), pGBT9/pGAD424 (témoin d' interaction négatif) et pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65 (témoin d'interaction positif) (Russo et al., 1995). Nous avons testé l'auxotrophie et l'activité p-gal sur 3 à S clones issus de chaque transformation. Les résultats des boites sont présentés dans la figure 2.
Compte tenu de la différence de sensibilité des tests, l'interaction est confirmée quand les levures YCM 79 et HF7 C transformées se développent sur les milieux sélectifs sans uracile ou sans histidine, c'est à dire qu'elles expriment, de manière sûre, au moins un de leur gène rapporteur.
L'intensité de la réponse (colonies plus ou moins bleues, plus ou moins développées) est supposée être proportionnelle au taux d' expression des gènes rapporteurs.
Les variations de ce taux peuvent s' expliquer de différentes manières. Un faible taux peut résulter d'une faible interaction entre les protéines reconstituant le transactivateur GAL4. Il peut, aussi, être dû à l'intervention d'une troisième protéine qui déstabiliserait la formation du complexe, ou bien à une instabilité des protéines de fusion dans la levure, ou encore à l'état des levures. Les levures peuvent être dans un état de faible activité transcriptionnelle lié, par exemple, à un probléme de toxicité
des protéines exogènes.
Les protéines de fusions de la banque de cerveau qui ont été isolées n'interagissent pas avec la parle N-terminale et avec le C-terminal de PS 1. Par contre, elles semblent toutes interagir avec la région hydrophile BL6, la région hydrophile mutée (BM), ainsi que la forme réduite de cette région (BR).
2.2 Tests d'interaction des protéines de fusion de la banque avec des protéines ne contenant pas la boucle de PS 1.
Ce test permet de déterminer si les protéines de fusion issues de la banque interagissent de façon non spécifique par leur structure, leur charge, leur hydrophobicité avec les protéines appâts (faux positifs de type III) ou avec le DLA de GAL4 (faux positifs de type II).
Nous avons transformé les souches YCM 79, HF7 C et PCY 2 par les couples de plasmides: pGBT9/pGAD-Y (Y correspondant à C ou D), pGBT-LAM/ pGAD-Y, pGBT9/pGAD424 (témoin négatif] et pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65 (témoin positif). Le pGBT9 code uniquement pour le DLA de GAL4 alors que le pGBT-LAM fourni par Clontech code pour une protéine de fusion entre le DLA de GAL4 et la lamine qui interagit de façon non spécifique avec les régions hydrophobes d'autres protéines.
Il en résulte qu'aucune des levures ainsi transformée n'était capable d'exprimer leurs gènes rapporteurs. Ainsi, les levures YCM 79 présentaient le phénotype Ura-, ~i-gal-, 5 les levures HF7 C étaient toutes His-, (3-gal- et les levures PCY 2, ~i-gal-.
Ces résultats suggèrent que les protéines de fusion de la banque ainsi isolées, interagissent spécifiquement avec la région hydrophile BL6 de PS-I et ne se lient pas avec la lamine ou le DLA de GAL4.
2.3 Test d'interaction sur des levures transformées par le vecteur pLex 9 contenant la 10 région codant pour la boucle de PS 1.
Ce test permet de s' assurer que l' interaction des protéines n' est pas due à
une structure adoptée par lcs différents fragments de BL6 uniquement lorsqu'ils sont fusionnés au DLA de GAL4.
Pour vérifier cela, les fragments BL6 et BM ont été fusionnés à un autre DLA, celui 15 du répresseur bactérien LexA. Deux constructions plasmidiques supplémentaires (pLex-BS et pLex-BM) ont été réalisée, où les séquences de la boucle hydrophile BL6 et de la forme mutée ont été fusionnées au gène de LexA au niveau des sites EcoRI/SaII du plasmide pLex9.
Ensuite la souche de levure L40 dans laquelle l'expression des génes rapporteurs 20 HIS3 et LacZ est induite par la fixation du complexe DLA-LexA/DA-GAL4 sur le site opérateur de LexA a été transformée. L'interaction avec les couples de plasmides a été testée : pLex-BL6/pGAD-Y (Y pour C ou D), pLex-BM/pGAD-Y, pLex-RAS/pGAD-RAF (témoin d'interaction positif) (Vojtek et al., 1993) et pLex-RAS/pGAD424, pLex-BL6/pGAD424, pLex-BL6/pGAD-RAF, pLex-25 BM/pGAD424, pLex-BM/pGAD-RAF (témoins d'interaction négatifj.
Les résultats des tests en goutte sur milieux sélectifs sans histidine et des tests de l'activité ~i-gal se sont révélés positifs pour les souches contenant le plasmide pLex-BL6 quel que soit le plasmide pGAD-Y testé. Il en est de même pour les souches contenant pLex-BM quel que soit le plasmide pGAD-Y testé. Ce test montre que l'interaction obtenue n'est pas liée à une conformation particulibre qu'adopterait la région BL6 de PS-I lorsqu'elle est fusionnée avec le domaine de liaison à
l'ADN de GAL4.
EXEMPLE 3 : Identification des inserts des plasmides issus du criblage.
3. I Séquençage des inserts des plasmides pGAD-C et pGAD-D.
Les inserts des plasmides pGAD-C et pGAD-D ont été entièrement séquencés. Nous avons commencé le séquençage en utilisant les oligonucléotides complémentaires du DA de GAL4 et du tADH 1 afin de connaître la séquence du début et de la fin de chaque insert. Puis, à partir de l'extrémité de chaque séquence, nous avons constitué
des oligonucléotides de synthèse qui nous ont permis d'avancer dans Ies séquences sur les deux brins. De cette façon, nous avons séquencé totalement les 1400 pb de l'insert D correspondant à la séquence SEQ ID N°2. Par contre, pour l'insert C de 2900 pb (séquence SEQ ID N° 1 ), il a été nécessaire d' établir une carte de restriction puis d'effectuer ua sous clonage de différents fragments afin d'obtenir la totalité de la séquence.
L'insert D présente une phase ouverte de lecture sur la totalité de sa séquence (Seq ID
N°2 ). En revanche, l'insert C contient un codon stop en fln de séquence (Seq ID
N° 1 ).
Leur séquence peptidique présente un profil plutôt hydrophile ce qui est en conformité avec le choix de la méthode de criblage qui s'applique plutôt à des protéines hydrophiles.
3.2 Comparaison des séquences Cette comparaison doit permettre de savoir si les inserts codent pour un domaine peptidique dont la fonction est connue.
Les séquences nucléiques et peptidiques des inserts ont été comparées avec des séquences répertoriées dans les banques de données « Gen Bank » et « EMBL »
(European Molecular Biology Lab). Aucune similitude significative n'a été
trouvée entre les inserts et les gènes (ou les protéines) enregistrés dans ces banques.
Les séquences des inserts ont aussi été comparées entre elles. Elles ne présentent aucune similitude.
De plus, l'existence de motifs peptidiques susceptibles d'apporter des informations 10 sur la fonction des peptides codés par les insert a été recherché. Quelques sites potentiels de glycosylation, de phosphorylation et de myristylation ont été
trouvés mais qui ne permettent pas de formuler d'hypothèse quant à une éventuelle fonction des peptides.
3.3 Expression des ARNm correspondant aux peptides sélectionnés dans différents I S tissus humains.
Afin de conforter (idée que l'interaction entre ces peptides et PS I existe bien in vivo, il a été verifié que l' expression des ARNm des peptides isolés de la banque se situe dans les mêmes tissus que l'expression de l'ARNm de PS 1. L'expression dans des tissus spécifiques, des gènes contenant les séquences isolées a été recherchée et le 20 taux d' expression des ARNm correspondant aux insert C et D dans différents tissus humains a été analysé par Northern blot.
La sonde radioactive préparée à partir de l'insert C (séquence ID N°I) a permis d'hybrider un ARNm de 9,Skb exprimé spécifiquement dans le cerveau et plus particulièrement dans le cortex cérébral, le lobe frontal et le lobe temporal (c~ Fig3).
25 La taille de cet ARNm suggère que la protéine traduite est de grande taille.
EXEMPLE 4 : Test d'interaction in vitro .
Ce test permet de savoir que les interactions ne sont pas dépendantes du contexte levure. La reconstitution du transactivateur fonctionnel GAL4 n'est pas toujours due à une interaction directe entre les deux protéines, mais peut aussi être le résultat de la formation d'un complexe protéique entre les protéines de fusion et une ou plusieurs protéines endogénes de la levure. Ainsi, les interactions n' existeraient qu' en présence de protéines intermédiaires provenant de la levure et n'auraient pas de réalité en dehors de ce contexte.
Il a été choisi de confirmer les interactions entre la région hydrophile BL6 de PS l et les peptides isolés respectivement appelés PepC et PepD dans un système acellulaire.
Les protéines sont produites dans E.coli BL21 (DE3) afin d'en obtenir de grande quantité.Les 2 peptides isolés, ont été fusionnés â des peptides tag permettant leur détection et leur fixation sur des supports. Pour cela, il a été choisi de fusionner la protéine GST, qui se lie au glutathion, aux différentes formes de la région BL6 et le peptide S-Tag, reconnu spécifiquement par la protéine S, aux peptides isolés (cf.
matériel et méthode pour le principe du test).
4.1 Production d'une protéine de fusion entre le S-Tag et les peptides isolés lors du criblage de la banque d' ADNc.
Afin de construire les protéines de fusion entre le S-Tag et les deux peptides PepC et PepD. Les différents fragments EcoRI/EcoRI issus des plasmides pGAD-C et pGAD-D ont été insérés dans le même cadre de lecture que la séquence de S-Tag du vecteur pET-29a.
A ce stade, un plasmide (pET-D) a été obtenu contenant l'insert correspondant au PepD. Le séquençage partiel de ce plasmide a montré que l'insertion a été
réalisée dans la phase de lecture souhaitée.
Ce plasmide a permis l'obtention d'une protéine de 52kDa correspondant à la protéine de fusion STag-PepD. La protéine STag-PepD est produite dans les bactéries BL21 (DE3) aprés induction à l'IPTG.
4.2 Production d'une protéine de fusion entre la GST et la boucle hydrophile de PS 1.
Pour fusionner la GST avec l'une des trois formes de Ia région hydrophile BL6 de PS
1, le vecteur pGEX-4T1 a été utilisé dans lequel les fragments EcoRI/SaII
provenant des plasmides pGBT-BL6, pGBT-BM et pGBT-BR ont été introduits.
Le plasmide pGEX-BM correspondant à la boucle mutée de PS-I a été obtenu. Le séquençage a montré que l'insertion a bien été réalisée dans le cadre de Lecture de la séquence GST.
Ce plasmide a permis la production de la protéine de fusion GST-BM de 42kDa dans les bactéries BL21 (DE3) après induction à l'IPTG.
4.3 Solubilisation de la protéine de fusion GST-BM.
Après la lyse des bactéries, la protéine GST-BM reste entièrement dans la fraction 1 S insoluble alors que le peptide STag ainsi que la protéine STag-PepD et la GST se trouvent en partie dans la fraction soluble.
La solubilisation des protéines de fusion est absolument nécessaire pour réaliser la chromatographie d' affinité. Dans un premier temps, Ia protéine GST-BM a été
fixée de manière spécifique sur une résine de glutathion couplée de façon covalente à des billes d'agarose afin de pouvoir tester, ensuite, l'interaction de GST-BM avec les partenaires peptidiques de PS 1 fusionné au STag (cf. Matériels et méthodes).
Si les protéines ne sont pas solubilisées, elles sédimentent avec les billes en absence de toute liaison spécifique avec celles-ci.
Après solubilisation de la protéine de fusion GST-BM, le test est réalisé
selon les conditions décrites au paragraphe 8 de la section matériels et méthodes.
EXEMPLE 5: Expression des partenaires spécifiques des PS-1 en cellules mammifères.
5 5.1 Construction des vecteurs d'expression appropriés.
Ce test permet de vérifier si Ies interactions protéiques révélées en levure sont aussi détectables dans le contexte de cellules mammiféres et avec Ia protéine PS 1 complote insérée dans son environnement membranaire. Les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID
N°2, des partenaires, ont été sousclonées dans un vecteur d'expression de cellules 10 mammifères pCDNA3 portant une séquence additionnelle correspondant à
l'épitope myc en 5'terminale et un site de restriction EcoRI (Fig. 4) permettant le sousclonage en phase des séquences des partenaires.
Le fragment de restriction EcoRI de pGAD-D de 1400 bp a été isolé et souscloné
en phase dans le site EcoRI du vecteur d' expression. Les constructions portant l' ADNc 15 dans l'orientation correcte ont été choisies par analyse de restriction enzymatique.
En ce qui concerne le clone C, le fragment EcoRI( 1 )-HindIII(391 )de pGAD-C a d'abord été isolé. Un second fragment HindIII(392)-MscI(2892) (ce dernier site à
bout franc se trouvant au sein du vecteur pGADlO en aval de la région codante du clone C) a ensuite été isolé par digestion partielle. Les fragments EcoRI( 1 }-20 HindIII(391) et HindIII(392)-MscI(2892) ont été mis en Iigation ensemble avec le vecteur d' expression digéré avec EcoRI et EcoRV, ce dernier site étant à bout franc.
Les constructions correctes portant l'intégralité de la séquence codante de C
ont été
identifiées par analyse de restriction.
Ces constructions permettent de générer des protéines fusion portant l'épitope myc et 25 les peptides correspondant respectivement aux sequences ID N° 1 et ID N° 2.
5.2 Expression dans des cellules de mammifères Ces constructions ont été transfectées en cellules COS 1 par des méthodes standard.
Aprés Iyse cellulaire, les échantillons sont analysés par immunotransfert et révélation avec l'anticorps anti-myc. L'expression des partenaires a pu être détectée par immunotransfert en utilisant l'anticorps anti-Myc 9E10 (fig 5). Nous avons pu détecter une bande très intense de 120 kDa comme attendu pour pepC, démontrant une forte expression (piste C). Pour D, l'intensité de la bande détectée n'était pas 5 toujours constante. Par contre, l'expression en cellules CHO a pu être détectée. Dans ce type cellulaire, D est peut-être un peu plus stable et apparaît comme une protéine migrant vers 80 kDa (piste D).
Les deux protéines ont donc pu être exprimées et détectées en cellules mammifères.
LISTE DE SÉQUENCES
S (1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER
(B) RUE: 20 avenue Raymon Aron (C) VILLE: Antony (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 92165 (G) TLPHONE: 01.55.71.69.22 (H) TLCOPIE: 01.55.71.72.91 () TITRE DE L' INVENTION: Acides nucleiques codant pour des proteines capables d'interagir avec les presenilines.
( i) NOMBRE DE SQUENCES: 2 (iv) FORME DCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEMB D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
3O (i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SEQUENCB l:
(A) LONGUEUR: 2892 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ü i) HYPOTHÉTIQUE: NON
40 (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
4$ (B) EMPLACEMENT:1..2736 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Met Ile Pro Ile Phe His Asp Met Met Asp Trp Glu Gln Arg Lys Asa Gly Asn Phe Lys Gln Val Glu Ala Glu Leu Ile Asp Lys Leu Asp S
Ser Met Val Ser Glu Gly Lys Gly Asp Glu Ser Tyr Arg Glu Leu Phe Ser Leu Leu Thr Gln Leu Phe Gly Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Lys 1S Val Glu Gln Glu Thr Trp Arg Glu Thr Gly Ile Ser Phe Val Thr Ser Val Thr Arg Leu Met Glu Arg Leu Leu Asp Tyr Arg Asp Cys Met Lys Gly Glu Glu Thr Glu Asn Lys Lys Ile Gly Cys Thr Val Asn Leu Met Asn Phe Tyr Lys Ser Glu Ile Asn Lys Glu Glu Met Tyr Ile Arg Tyr Ile His Lys Leu Cys Asp Met His Leu Gln Ala Glu Asn Tyr Thr Glu 3S Ala Ala Phe Thr Leu Leu.Leu Tyr Cys Glu Leu Leu Gln Txp Glu Asp Arg Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Tyr Pro Ser Gln Thr Glu Trp Gln Arg Lys Glu Gly Leu Cys Arg Lys Ile Ile His Tyr Phe Asn Lys Gly Lys Ser Trp Glu Phe Gly Ile Pro Leu Cys Arg Glu Leu Ala Cys Gln SO TAC GAG AGC CTC TAT GAT TAC CAG AGC CTC AGC TGG ATT CGG.p,AA ATG 672 Tyr Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Gln Ser Leu Ser Txp Ile Arg Lys Met Glu Ala Ser Tyr Tyr Asp Asn Ile Met Glu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Glu Phe Phe Arg Val Gly Phe Tyr Gly Arg Lys Phe Pro Phe Phe Leu Arg Asn Lys Glu Tyr Val Cys Arg Gly His Asp Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Phe Gln Gln Arg Met Leu Ser Glu Phe Pro Gln Ala Val Ala Met Gln His Pro Asn His Pro Asp Asp Ala Ile Leu Gln Cys Asp Ala Gln Tyr Leu Gln Ile Tyr Ala Val Thr Pro Ile Pro Asp Tyr Val Asp Val Leu Gln Met Asp Arg Val Pro Asp Arg Val Lys Ser Phe Tyr Arg Val Asn Asn Val Arg Lys Phe Arg Tyr Asp Arg Pro Phe His Lys Gly Pro Lys Asp Lys Glu Asn Glu Phe Lys Ser Leu Txp Ile Glu Arg Thr Thr Leu Thr Leu Thr His Ser Leu Pro Gly Ile Ser Arg Trp Phe Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Val Glu Val Ser Pro Leu Glu Asn Ala Ile Gln Val Val Glu Asn Lys Asn Gln Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Gln Tyr S0 Gln His Lys Gln Val His Gly Asn Ile Asn Leu Leu Ser Met Cys Leu Asn Gly Val Ile Asp Ala Ala Val Asn Gly Gly Ile Ala Arg Tyr Gln 5 Glu Ala Phe Phe Asp Lys Asp Tyr Ile Asn Lys His Pro Gly Asp Ala Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Glu Leu Met Gln Glu Gln Val His Val 1~ 465 470 475 480 Leu Gly Val Gly Leu Ala Val His Glu Lys Phe Val His Pro Glu Met Arg Pro Leu His Lys Lys Leu Ile Asp Gln Phe Gln Met Met Arg Ala Ser Leu Tyr His Glu Phe Pro Gly Leu Asp Lys Leu Ser Pro Ala Cys Ser Gly Thr Ser Thr Pro Arg Gly Asn Val Leu Ala Ser His Ser Pro Met Ser Pro Glu Ser Ile Lys Met Thr His Arg His Ser Pro Met Asn 3~ 545 550 555 560 Leu Met Gly Thr Gly Arg His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser His Ala Ser Ser Glu Ala Gly Asn Met Val Met Leu Gly Aap Gly Ser Met Gly Asp Ala Pro Glu Asp Leu Tyr His His Met Gln Leu Ala Tyr Pro Asn Pro Arg Tyr Gln Gly Ser Val Thr Asn Val Ser Val Leu Ser Ser Ser Gln Ala Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Thr His Ser Ala Pro 625 630 ~ 635 640 Ser Gln Met Ile Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ala Arg Asp Lys Tyr Arg His Ala Arg Glu Met Met Leu Leu Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Arg Pro l~
Ser Ser Ala Met Tyr Pro Ala Ala Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Pro Asn Phe Gln Arg Ala Leu Phe Gln Gln Val Val Gly Ala Cys Lys Pro Cys Ser Asp Pro Asn Leu Ser Val Ala Glu Lys Gly His Tyr Ser Leu His Phe Asp Ala Phe His His Pro Leu Gly Asp Thr Pro Pro Ala Leu Pro Ala Arg Thr Leu Arg Lys Ser Pro Leu His Pro Ile Pro Ala Ser Pro Thr Ser Pro Gln Ser Gly Leu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Leu Ser Glu Ser Asn Phe Gly Hia Ser Ser Glu Ala Pro Pro Arg Thr Asp Thr Met Asp Ser Met Pro 4U Ser Gln Ala Trp Asn Ala Asp Glu Asp Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro Val His Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Ala Val Leu Asp Ser Ile Lys Ala Gln Pro Cys Arg Ser His Ser Ala Pro Gly Cys Val Ile Pro Gln Asp $~
Pro Met Asp Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Pro Tyr His Pro Arg Leu Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Glu WO 99/16874 PC"f/FR98/02093 Pro Ala Leu Glu His Asp Glu Gly Val Leu Leu Arg Glu Glu Thr Glu Arg Pro Arg Gly Leu His Arg Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Ser Ala Lys Glu Glû Gln Ala Arg Met Ala Trp Glu His Gly Arg Gly Glu Gln TGAGGGGCAA CGAGGCGGCT GGGATGCCGC CCTCAGTAAG CAGCTTGCCA ATCACTCCAG
1$ 2796 GTCTGAAAAG CAAGTCCCCC AGCCCCACCC CAGGGAGCCA GAGAGGCTTG CACTCAGGAG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1363 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire IO (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ü i) HYPOTHÉTIQUE: NON
1$
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1363 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Glu Phe Arg Gly Cys Val Lys Met Glu Phe Pro Gly Gly Asn Asp Asn Tyr Leu Thr Ile Thr Gly Pro Ser His Pro Phe Leu Ser Gly Ala Glu Thr Phe His Thr Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Phe Glu Ile Pro Pro Ile Ser Leu Asp Ser Asp Pro Ser Leu Ala Val Ser Asp Val Val Gly His Phe Asp Asp Leu Ala Asp Pro Ser Ser Ser Gln Asp Gly Ser Phe 4S Ser Ala Gln Tyr Gly Val Gln Thr Leu Asp Met Pro Val Gly Met Thr His Gly Leu Met Glu Gln Gly Gly Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Thr $O 1010 1015 1020 Met Asp Leu Asp His Ser Ile Gly Thr Gln Tyr Ser Ala Asn Pro Pro WO 99/16$74 PCT/FR98/02093 Val Thr Ile Asp Val Pro Met Thr Asp Met Thr Ser Gly Leu Met Gly $ 1045 1050 1055 1~
His Ser Gln Leu Thr Thr Ile Asp Gln Ser Glu Leu Ser Ser Gln Leu Gly Leu Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Pro Pro Ala Gln Ser Pro iS GAA GAT CGT CTT TCA ACC ACC CCT TCA CCT ACT AGT TCA CTT CAC GAA 576 Glu Asp Arg Leu Ser Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Ser Leu His Glu 20 Asp Gly Val Glu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Pro Ser Gln Lys Thr Val Val Val Glu Ala Gly Lys Lys Gln Lys Ala Pro Lys Lys Arg Lys Lys Lys Asp Pro Asn Glu Pro Gln Lys Pro Val Ser Ala Tyr Ala Leu Phe Phe Arg Asp Thr Gln Ala Ala Ile Lys Gly Gln Asn Pro Asn Ala Thr Phe Gly Glu Val Ser Lys Ile Val Ala Ser Met Trp Asp Ser Leu Gly 4U Glu Glu Gln Lps Gln Val Tyr Lys Arg Lys Thr Glu Ala Ala Lys Lys Glu Tyr Leu Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Gln Glu Cys Gln SU
Ala Thr Val Glu Thr Val Glu Leu Asp Pro Ala Pro Pro Ser Gln Thr Pro Ser Pro Pro Pro Met Ala Thr Val Asp Pro Ala Ser Pro Ala Pro SO
Ala Ser Ile Glu Pro Pro Ala Leu Ser Pro Ser Ile Val Val Asn Ser Thr Leu Ser Ser Tyr Val Ala Asn Gln Ala Ser Ser Gly Ala Gly Gly Gln Pro Asn Ile Thr Lys Leu Ile Ile Thr Lys Gln Met Leu Pro Ser Ser Ile Thr Met Ser Gln Gly Gly Met Val Thr Val Ile Pro Ala Thr Val Val Thr Ser Arg Gly Leu Gln Leu Gly Gln Thr Ser Thr Ala Thr Ile Gln Pro Ser Gln Gln Ala Gln Ile Val Thr Arg Ser Val Leu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Met Gln Leu Pro Pro Pro Arg Val Gln Pro Gly Ile
pendant 3 J Ours.
Transformation de la levure par une banque d'ADNc.
La banque d'ADNc utilisée est une banque commerciale (Clontech) constituée à
20 partir d'ARNm d'un cerveau humain normal (homme de 37 ans décédé à la suite d'un traumatisme cérébral). Les ADNc ont été clonés dans le plasmide pGADlO en aval de la région du DA de GAL4 au site EcoRI. La moyenne de la taille des inserts est de 1,4 kb avec un écart type de 1 kb. La banque a été amplifiée une fois dans E.coli DHSa pour obtenir 1,2x106 clones indépendants dont 80% contiennent un insert.
Pour préserver une bonne représentativité de la banque, il est nécessaire d'avoir un nombre de transformants deux à dix fois plus grand que celui des clones indépendants WO 99/16874 PCT/P'R98/02093 obtenus lors de la construction de la banque. Nous utilisons donc un protocole qui permet d'obtenir une bonne efficacité de transformation (environ 10' transformants/100 ~,g d'ADN).
Les levures YCM79 préalablement transformées par le plasmide pGBT9 contenant une séquence correspondant à une région de PS-I sont cultivées une nuit dans 50 ml de milieu YNB +His +Lys +Ade +Met +Leu +Ura à 28 °C sous agitation. La densité
optique de cette préculture est mesurée pour évaluer le nombre de cellules par ml et permettre le calcul du volume à inoculer dans 250 ml de milieu YPD afm d'obtenir une culture de 10' cellules/ml (environ A~~=0,8) après une nuit à 28 °C
sous agitation.
Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation à 3000 rpm pendant 10 min, lavées deux fois avec 100 ml d'H~O stérile, reprises dans 10 ml de solution I
de transformation. La suspension est centrifugée lOmin à 30001pm et les cellules resuspendues dans 2,5 ml de cette même solution. Une partie de la suspension est prélevée (200 wl): la moitié servira de témoin négatif non transformé, l'autre moitié
sera transformée par un plasmide contrôle dont l'efficacité de transformation est connue. La suspension restante est mélangée à 100 ~.l de banque plasmidique d'ADNc à lmg/ml et 20 ml de solution II. Le mélange est incubé 1 heure à 28 °C
sous agitation puis 20 min à 42 °C avant d'être centrifugé 15 min à
3000 rpm. Le culot cellulaire est lavé une fois à l'eau et deux fois au PBS afm de bien éliminer le PEG qui a un effet toxique sur les levures, puis est repris dans 2,5 ml de PBS
stérile (Na2HP04 50 mM, KCl 10 mM, MgS04 1 mM, pH 7).
250 ml de milieu YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura sont ensemencés par cette suspension et incubés 4 heures à 28 °C sous agitation pour permettre l'expression des protéines hybrides, leur interaction éventuelle et l'expression du gène rapporteur URA3. Cependant, cette étape a pour conséquence de multiplier le nombre de clones positifs. Pour évaluer le taux d' amplification du nombre de colonies, 1 ml de culture est prélevé avant et aprës cette incubation et différentes dilutions sont étalées sur milieu gélosé YNB +His +Lys +Ade +Met +Ura. Après croissance, le nombre de clones Leu+ Trp+ est déterminé pour évaluer la fréquence de transformation avant et après la période d'incubation et le taux d'amplification en est déduit.
Les cellules sont alors centrifugées 10 min à 3000 rpm, lavées deux fois à
l'eau stérile, reprises dans 10 ml d'YNB et étalées sur 10 boîtes de 435 cm2 contenant chacune 200 ml de milieu sélectif YNB +His +Lys +Ade +Met. Les boîtes sont mises à l'étuve à 28 °C pendant 3 jours.
Extraction de l'ADN plasmidique des levures.
Cette technique extrait aussi bien les plasmides que l'ADN génomique contenu dans les levures. Pour isoler les plasmides, il suffit de transformer des bactéries où seul l' ADN plasmidique peut se répliquer et d' analyser chaque clone après minipréparation .Les levures contenant les plasmides sont cultivées sur milieu solide YNB sélectif à 28 °C pendant une nuit. Elles sont ensuite resuspendues dans 200 ml de solution de cassage (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI 100 mM, Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) en présence de billes de verre (450 um de diamètre) et de 200 ml de phénol/chloroforme. Le mélange est agité 15 min sur un vortex puis centrifugé
2 min à 14000 rpm. La phase aqueuse est dialysée iheure sur membrane. Cette solution peut servir à la transformation des bactéries par électroporation.
Révélation de l' activité beta-galactosidase.
Ce test permet de vérifier l'expression du gène rapporteur LacZ codant pour la ~i-galactosidase dans les levures transformées.
Une feuille de nitrocellulose est déposée sur les clones de levures individualisés. La réplique est plongée 3 fois pendant 30 secondes dans de l'azote liquide pour casser les levures et permettre l'accès du substrat à la beta-galactvsidase. La feuille est ensuite posée, colonies vers le haut, sur un papier Whatman imbibé d'une solution de PBS/Xgal préparée extemporanément (100 ~,1 d'une solution de substrat Xgal â
mg/ml en diméthylformamide dans 5 ml de PBS) puis placée à 37 °C, température optimale pow l'activité enzymatique testée.
Le temps d'apparition de la coulew bleue qui révéle l'activité ~i-gal est très variable, de quelque minutes à plusieurs heures. Le test s'effectue en présence d'un témoin positif d'interaction qui vire rapidement au bleu et d'un témoin négatif qui reste blanc.
Test en goutte.
Ce test permet d'analyser le phénotype d'une souche de levure. Une goutte (environ 5 ml) d'une suspension de levwes légèrement trouble est déposée sw différents milieux gélosés sélectifs et non sélectifs, et la croissance des levures est observée après 2 jours d'incubation à 28 °C.
Ségrégation des plasmides.
Il s' agit de tester par une ségrégation plasmidique si le phénotype des levwes transformées est bien lié à la présence des plasmides.
Les levures sont cultivées une nuit sw milieu complet YPD à 28 °C. Ce milieu non sélectif permet la croissance des levwes conservant ou ne conservant pas les plasmides après la division cellulaire. Différentes dilutions de cette culture sont étalées pow obtenir entre 50 et 100 clones par boîte de milieu YPD après une nuit d'incubation à 28 °C. Le phénotype des clones est alors testé par répliques sur velours sw différents milieux sélectifs et la fréquence des cellules ne contenant pas de plasmide peut être estüriée après 2 jours d'incubation à 28 °C.
8) Les méthodes pour le test d'interaction in vitro .
Principe du test.
II s' agit de vérii~er l' interaction entre deux protéines en utilisant une technique biochimique de chromatographie d'affinité. Un extrait cellulaire contenant un des partenaires supposés de la protéine est ajouté à un support où la protéine appât a été
préalablement fixée. Si l'interaction existe entre la protéine et son éventuel partenaire, celui-ci aussi, sera retenu sur le support.
Expression des protéines de fusion chez E.coli .
Les protéines de fusion sont produites dans E.coli BL21(DE3) par l'intermédiaire des vecteurs d'expression pET et pGEX inductible par l'IPTG (Studier, 1991).
Les bactéries BL21(DE3), préalablement transformées par les plasmides recombinants, sont cultivées une nuit sous agitation dans du milieu LB avec l'antibiotique servant à la sélection (ampicilline pour pGEX ou kanamycine pour pET
à IOO~g/ml). 5 ml de cette préculture sont inoculés dans 45 ml de milieu LB+antibiotique afin d'obtenir une culture à A.soo=0,6 après 1 heure d'agitation à 37 °C. La production des protéines est alors induite par addition de 0,1 mM d'IPTG et les bactéries sont remises à 37 °C sous agitation entre 1 heure et 4 heures. Les cellules exprimant les protéines sont récoltées par centrifugation à 6000 rpm pendant S min. Les culots peuvent être gardés à -20 °C.
Extraction et analyse des protéines produites chez la bactérie.
Les culots bactériens contenant les protéines de fusion sont resuspendus dans 5 ml de TE (TrisHCl 50 mM pH 8, EDTA 2 mM). Les cellules sont lysées par du lysozyme 0,1 mg/ml final et 1% Triton X-100. Elles sont incubées 15 min à 30 °C
avant d'être placées dans la glace pour être soumises aux ultra-sons jusqu'à ce que la suspension bactérienne devienne fluide. Le lysat bactérien est centrifugé 15 min à 10000 rpm à 4 °C. Le surnageant contenant la protéine de fusion solubilisée peut être conservé à -20 °C.
A cette étape, les différentes fractions obtenues sont analysées par électrophorèse sur gel dénaturant (SDS PAGE). 60 lsl de la suspension bactérienne avant la centrifugation (fraction totale), 60 ~,1 de surnageant (fraction soluble) ainsi que 60 ~1 du culot resuspendu dans 5 ml de TE (fraction insoluble) sont prélevés. Les protéines contenues dans les différentes fractions sont dénaturées 10 min à 95 °C
en présence de 1/4 de volume de bleu de dépôt 4xL (TrisHCl 0,2 M pH 6,8, SDS 5%, glycérol 5%, 2-mercaptoethanol 0,5%, bleu de bromophénol) et chargées sur un gel de SDS
5 polyacrylamide 12% où elles sont séparées en fonction de leur masse moléculaire par electrophorèse. Après migration à 125 volts/cm, les protéines sont détectées par coloration du gel au bleu de Coomassie.
Solubilisation des protéines.
Lors de l'expression d'un gène exogène dans E.coli peuvent apparaïtre des agrégats 10 de la protéine exogène formant des corps d'inclusion. La protéine recombinante est alors facile à purifier par centrifugation mais elle est souvent difficile à
solubiliser.
Les protéines se trouvant dans les fractions insolubles sont dénaturées par de l'urée 6 M et du DTT 10 mM pendant 10 min à 37 °C puis renaturées par dialyse dans trois tampon successifs pendant au moins 6 heures chacun (TrisHCl 5 mM pH 8 / urée 2 15 M; TrisHCl 5 mM, pH 8 / urée 1 M; TrisHCl 5 mM, pH 8). Après 15 min de centrifugation à 10000 rpm, environ 5 à 10% de la protéine se trouve dans le surnageant qui peut être conservé à -20 °C.
Chromatographie d'affinité.
Pour que la rétention des protéines s'opère dans de bonnes conditions, la 20 concentration protéique des échantillons doit être supérieure à 40 mg/ml.
Cette concentration peut être estimée par une méthode colorimétrique (réactif de Bradford, par exemple).
200 ~,l de fraction soluble contenant la GST non fusionnée ou la GST-BM
(boucle mutée de la préséniline 1) sont incubés 2 min à 20 °C en présence de 300 ~1 de 25 « résine glutathion ». La fraction non retenue par les billes est prélevée.
La résine est lavée 4 fois par du tampon de lavage (TrisHCl pH 8, 20 mM, NaCI 150 mM, Triton X 100 0,1 %) afin d' éliminer les protéines fixées par adsorption non spécifique. 150 ~1 de résine ayant liée la GST ou la GST-BM sont incubés 1 heure à 4 °C
sous agitation avec 600 ~,1 de fraction soluble contenant STag ou STag-Pep126 . Les billes d'agarose sont ensuite centrifugées 1 min à 3000 rpm et lavées 4 fois par du tampon de lavage après prélèvement de la fraction non retenue.
Un aliquote de chaque fraction (soluble, non retenue et retenue par les billes) est déposée sur gel SDS PAGE après dénaturation à 95 °C en présence de bleu de dépôt et séparées par électrophorèse. Les protéines sont, ensuite, transférées sur membrane de nitrocellulose puis la membrane est colorée au rouge Ponceau (20 ~,g/ml) pour vérifier que le transfert des protéines a bien été réalisé.
Pour pouvoir détecter spécifiquement les protéines fusionnées avec le S-Tag, la membrane de nitrocellulose est saturée avec 1 % de gélatine dans du TBST
(TrisHCl 10 mM pH 8, NaCI 150 mM, 0,1 % Tween20) pendant 15 min et incubée 15 min avec la protéine S liée à la phosphatase alcaline. Après 4 lavages avec le TBST, l'activité
de la phosphatase alcaline est révélée par addition d'un tampon PA 1X
contenant du NBT et du BCIP selon la méthode Novagen.
9) Les méthodes d'ezpression des protéines recombinantes en cellules mammifères.
Construction d'un vecteur d'expression en cellules mammifères Pour l' expression en cellules mammifères, les séquences ID N° 1 et ID
N° 2 ont été
sousclonées par des méthodes classiques dans un vecteur sous le contrôle d'un promoteur viral fort (CMV).
Transfection de cellules La méthode établie pour les cellules COS 1 ou les cellules CHO, consiste à
utiliser un lipofectant dans un ratio de 1 pour 8 (poids/poids) par-rapport à l'ADN et un peptide synthétique (Hl) au même ratio afin d'optimiser la compaction de l'ADN et l'efficacité de transfection. Cette méthode repose notamment sur la neutralisation des S charges des phosphates de l'ADN par les charges positives du lipofectant.
Les cellules COS 1 sont cultivées en incubateur à 37 °C, 9S% d'humidité
et S % de CO~ dans le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contenant 4.S g/1 glucose (Gibco-BRL) supplementé avec 3 % de L-Glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine et 10 % de Sérum de Veau Foetal.
10 La veille de la transfection, les cellules sont ensemencées à une densité
de 2.S 106 cellules par boite de 100 mm. Le jour de la transfection legs cellules sont rincées 2 fois par du PBS (Phosphate Buffer Saline) et une fois en OptiMEM (composition brevetée; Gibco-BRL) pour une habituation d' au moins 1 S minutes en incubateur.
Par équivalent-boite de 100 mm, 8 ~g d'ADN plasmidique au total sont ajoutés à
1S ~1 d'OptiMEM et 64 ~g de peptide synthétique (H1). Aprés avoir vortexé
vigoureusement pendant 10 secondes, la lipofectamine (32 ~1, soit 64 ~,g) diluée dans 300 ~l d'OptiMEM est ajoutée au mélange précédent, aprés S minutes d'attente.
L'ensemble est une nouvelle fois vortexé vigoureusement puis laissé 30 minutes reposer. Cinq millilitres d'OptiMEM sont ajoutés par tube et le mélange vortexé est 20 placé sur les cellules (dont on a au préalable aspiré le milieu). Les cellules sont alors placées en incubateur pendant 4 heures, au terme desquelles le mélange est remplacé
par du milieu complet.
Lyse des cellules et dosage des protéines Les cellules sont le plus souvent lysées 48 heures après la transfection {au maximum 2S habituel d'expression). Le tampon de lyse contient 10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM
d'EDTA, 1 % de Triton X100, 1 % de NP40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (CompleteC~, Boehringer-Mannheim). Pour chaque plaque, après un rinçage au PBS, 800 p,l du tampon froid sont ajoutés. Les lysats subissent alors une sonication suivie d'une agitation au barreau magnétique à 4 °C pendant une nuit. Une centrifugation de 30 minutes à 15000 x g sépare le culot du surnageant.
Les protéines solubles sont alors dosées selon le kit BCA (Pierce) afin de pouvoir normaliser les expériences suivantes.
ï.mmunotransfert Les échantillons (lysats de cellules) sont dénaturés dans un volume égal de tampon de dépôt (125 mM Tris pH 6.8, 4% mlv SDS, 20 % glycérol, 0.02 % Bromophénol Blue, 50 mM Dithiothreitol) à 95 °C pendant 5 minutes. Pour l'analyse de l'expression des présénilines, les échantillons sont dénaturés en présence de 8 M urée et à 37 °C afin d'éviter l'agrégation propre aux présénilines à 95 °C.
Les échantillons sont déposés sur des gels Tris-Glycine (Novex), avec un pourcentage d'acrylamide différent selon le poids moléculaire à discriminer. Un marqueur de poids moléculaire est également déposé (Broad Range, BioRad). La migration a lieu pendant environ 2 heures à 100 volts constants dans du tampon SDS 1 X final (Novex). Le gel est ensuite transféré sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF
(tampon de transfert 1 X final (Novex) avec 10 % de méthanol) pendant 2 heures à
150 mA constants.
Après transfert, la membrane est bloquée pendant 2 heures à température ambiante dans 50 ml de PBS-T (PBS avec 0.5 % Tween) contenant 2 % de lait écrémé
(Merck). L'anticorps primaire (dilué à la concentration optimale de l'ordre du 1/1000e au 1/SOOOe, dans du PBS-T avec ou sans 2 % de lait écrémé) est laissé
sur une nuit à 4 °C. Après un bref rinçage en PBS-T, la membrane est incubée 45 minutes en présence du deuxième anticorps (Ig G anti-souris ou anti-lapin selon le cas, couplé à la peroxydase de raifort) dilué au 1/SOOOe dans un tampon dit «
ECL »
(Tris 20 mM, NaCI 150 mM, Tween 0.1 %).
La membrane est alors rincée 4 fois 15 minutes dans le tampon «ECL». Elle peut être révélée par le réactif ECL (Amersham) constitué de 2 tampons à mélanger extemporanément en volume égal. Différentes expositions d'un film photographique (Hyperfilm ECL ; Amersham) sont effectuées, suivies d'un développement.
EXEMPLES
Exemple 1: Isolement de partenaires spécifiques de PS 1 par criblage de banque de fusion d'ADNc de cerveau Dans le but d'isoler des partenaires spécifiques de la protéine PS l, une banque d'ADNc de cerveau humain a été criblée par la technique du double-hybride. Une banque d'ADNc fusionnés avec le DA de GAL4 a été utilisée et différentes protéines appâts ont été construites en fusionnant les régions hydrophiles de PS-I avec le DLA
15 de GAL4.
1.1 Construction des vecteurs permettant l'expression de protéines de fusion entre le DLA de GAL4 et les régions hydrophiles de PS 1.
Cinq protéines de fusion ont été réalisées grâce au vecteur pGBT9 dans lequel ont été
introduites les séquences correspondant à différentes régions hydrophiles de 20 dans le même cadre de lecture que la séquence du DLA de GAL4. Il a été
choisi d'identifier des protéines interagissant avec la région N-terminale (Nt, codons 1 à
81 ), la grande boucle (BL6, codons 263 à 407), la grande boucle avec la mutation L286V (BM), une région plus courte de la grande boucle (BR, codons 290 à 376) et enfin la partie C-terminale de la protéine (Ct, codons 421 à 467).
25 Les fragments d'ADN correspondant à ces différentes régions ont été obtenus par PCR à partir de la séquence entière de l'ADNc de PS 1. Les différents oligonucléotides utilisés ont permis l'introduction des sites EcoRI et SaII
aux extrémités de chaque séqueace amplifiée. Ainsi, les fragments de PCR ont pu être insérés entre les sites EcoRI et SaII du multisite de clonage de pGBT9 en aval et en phase avec la séquence du DLA de GAL4. Les différentes constructions obtenues, pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR et pGBT-Ct, ont été vérifiées par 5 séquençage de l'ADN. Cette vérification a montré que les fragments ne présentaient aucune mutation générée par la PCR et qu'ils étaient bien dans le même cadre ouvert de lecture que celui de la séquence du DLA de GAL4.
1.2 Obtention des souches de levures exprimant les protéines de fusion entre le DLA
de GAL4 et les régions hydrophiles de PS 1.
10 Comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents est un événement moins fréquent que sa transformation par un seul plasmide, une souche de levure préalablement transformée par le vecteur codant pour la protéine appât a été
utilisée, afin d'avoir la meilleure efficacité possible lors du criblage de la banque d' ADNc.
15 Pour cela, la souche de levure YCM 79 a été transformée par chacun des plasmides pGBT-Nt, pGBT-BL6, pGBT-BM, pGBT-BR et pGBT-Ct. Les levures contenant ces plasmides ont été sélectionnées pour leur phénotype Trp+ sur milieu ne contenant pas de tryptophane et respectivement appelées yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt. La présence de ces diff~ents plasmides dans chaque souche a été vérifiée en effectuant une PCR
20 directement sur les levures, à l'aide d'oligonucléotides complémentaires des séquences DLA et tADHI situées en 5' et 3' de l'insert. La taille des fragments de PCR obtenus permet de distinguer les différentes souches à l'exception des souches yBL6 et yBM.
1.3 Tests d'activité transactivatrice et d'interaction avec le DA de GAL4 des 25 protéines de fusion contenant les régions hydrophiles de PS 1.
Si une des protéines de fusion présente une activité transactivatrice ou si elle interagit avec le DA de GAL4, elle ne peut pas être utilisée comme appât dans le système double hybride car elle donne systématiquement une réponse positive en dehors de toute interaction protéine-protéine.
Le premier test consiste, donc, à vérifier que les régions hydrophiles de PS-I
ne possèdent pas d'activité transactivatrice lorsqu'elles sont fusionnées au DLA
de GAL4, c' est à dire capables d' induire, à elles seules, la transcription des gènes rapporteurs. Ce type d'activité peut, par exemple, être lié à la présence d'un domaine acide dans la protéine de fusion.
Pour ce test, l'expression des gènes rapporteurs LacZ et URA3 ont été
contrôlés directement sur les souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt.
Pour le deuxiéme test qui consiste à contrôler l'absence d'interactïon entre les protéines de fusion et le DA de GAL4, les souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt de phénotype Trp+ Leu- ont été transformées par le plasmide pGAD424 (équivalent au pGADlO) qui code pour le DA de GAL4. Les levures ont été sélectionnées sur un milieu sans tryptophane ni leucine et l'expression des gènes rapporteurs LacZ
et URA3 permettant de contrôler l'interaction a été testée sur les clones obtenus.
Dans tous les cas, les résultats des tests de l'activité ~i-galactosidase ainsi que ceux des tests en goutte sur milieu sélectif sans uracile se sont révélés négatifs.
Les protéines de fusions contenant les parties hydrophiles de PS-I ne présentent donc pas de propriété transactivatrice intrinsèque et n'interagissent pas avec le domaine d'activation de GAL4. Elles peuvent donc être utilisées comme protéines appâts pour le criblage de la banque.
1.4 Transformation des différentes souches de levure par la banque de fusion d' ADNc.
Le criblage de la banque de fusion permet d'identifier des clones exprimant des peptides fusionnés au DA de GAL4 interagissant avec la protéine appât. Si cette interaction existe, elle doit permettre la reconstitution d'ùn transactivateur fonctionnel capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs URA3 et ~acZ
dans la souche contenant la protéine appât.
Pour que le criblage soit représentatif, il est nécessaire que chaque plasmide indépendant constituant la banque soit présent dans, au moins, un clone de levure apr~ transformation. Pour cela, un protocole permettant théoriquement d'obtenir un nombre de transformants supérieur au nombre de plasmides indépendants de la banque a été utilisé (c~ matériels et méthodes).
Les 5 souches yNt, yBL6, yBM, yBR et yCt de phénotype His-, Lys-, Ade-, Met-, Ura , Leu-, ont été transformées successivement par 100~g d'ADN plasmidique de la banque de fusion et les cellules transformées ont été sélectionnées sur un milieu YNB
+His +Lys +Ade +Met.
A l'issue de la première sélection, nous avons obtenu 32 clones ayant un phénotype Ura+ avec la souche yNt, 450 clones Ura+ avec yBL6, 128 avec yBM, 250 avec yBR
et 67 avec yCt. Un test d'activité (i-galactosidase a été effectué sur ces transformants afin de vérifier l'expression du deuxième gène rapporteur LacZ. Au total 6 clones présentaient le double phénotype Ura+, /3-gal+; 1 clone pour la souche yNt, 1 clone pour yBL6, 2 clones pour chacune des souches yBM et yBR, aucun clone pour yCt.
Les clones sont respectivement nommés yNt.A, yBL6.B, yBM.C, yBM.D.
EXEMPLE 2 : Isolement des plasmides de la banque.
Afin d'identifier les protéines pouvant interagir avec la boucle mutée ou la boucle réduite de PS 1, les plasmides contenus dans les levures yBM.C et yBM.D ont été
extraits. Les plasmides présents dans les préparations d'ADN ont été utilisés pour transformer des bactéries par électroporation.
Les plasmides, extraits des clones bactériens obtenus, ont été digérés par différentes enzymes. Cette analyse a mis en évidence 5 profils de restriction différents.
Les digestions des plasmides extraits des levures yBM.C et yBM.D présentent un profil commun correspondant au plasmide pGBT-BM ef deux profils différents correspondant au plasmide pGAD 10 contenant un insert de 2900pb correspondant à
la séquence ID N° 1 (pGAD-C étant issu de la souche yBM.C) et un insert de 1400pb correspondant à la séquence ID N° 2 (pGAD-D étant issu de la souche yBM.D).
2.1 Contrôle des plasmides isolés par transformation de différentes souches de levure.
Lors de la transformation des levures par les plasmides de la banque de cerveau, il est possible que plusieurs plasmides différents soient introduits dans une même cellule.
Afln de vérifier que les résultats d'interaction sont bien dûs à la présence des plasmides isolés et non à des plasmides surnuméraires, nous avons de nouveau testé
les protéines de fusion issues du criblage de la banque contre les différentes régions hydrophiles de PS-I dans la souche YCM 79 mais aussi dans les souches HF7 C et PCY 2.
HF7 C possède deux gènes rapporteurs HIS3 et LacZ . Le gène LacZ a un environnement promoteur différent de celui existant chez la souche YCM 79, ce qui permet de contrôler que l' obtention de clones ~i-gal+ n' est pas liée à un environnement promoteur spécifique mais bien à une interaction entre les protéines testées. PCY 2 présente l'avantage de ne posséder qu'un seul gène rapporteur LacZ
qui est exprimé plus fortement que dans les deux autres souches lorsque le transactivateur GAL4 est fonctionnel.
Nous avons transformé les trois souches de levure YCM 79, HF7 C et PCY 2 par les différents couples de plasmides pGBT-X/pGAD-Y (X correspondant à Nt, BL6, BM, BR ou Ct; Y correspondant à C ou D), pGBT9/pGAD424 (témoin d' interaction négatif) et pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65 (témoin d'interaction positif) (Russo et al., 1995). Nous avons testé l'auxotrophie et l'activité p-gal sur 3 à S clones issus de chaque transformation. Les résultats des boites sont présentés dans la figure 2.
Compte tenu de la différence de sensibilité des tests, l'interaction est confirmée quand les levures YCM 79 et HF7 C transformées se développent sur les milieux sélectifs sans uracile ou sans histidine, c'est à dire qu'elles expriment, de manière sûre, au moins un de leur gène rapporteur.
L'intensité de la réponse (colonies plus ou moins bleues, plus ou moins développées) est supposée être proportionnelle au taux d' expression des gènes rapporteurs.
Les variations de ce taux peuvent s' expliquer de différentes manières. Un faible taux peut résulter d'une faible interaction entre les protéines reconstituant le transactivateur GAL4. Il peut, aussi, être dû à l'intervention d'une troisième protéine qui déstabiliserait la formation du complexe, ou bien à une instabilité des protéines de fusion dans la levure, ou encore à l'état des levures. Les levures peuvent être dans un état de faible activité transcriptionnelle lié, par exemple, à un probléme de toxicité
des protéines exogènes.
Les protéines de fusions de la banque de cerveau qui ont été isolées n'interagissent pas avec la parle N-terminale et avec le C-terminal de PS 1. Par contre, elles semblent toutes interagir avec la région hydrophile BL6, la région hydrophile mutée (BM), ainsi que la forme réduite de cette région (BR).
2.2 Tests d'interaction des protéines de fusion de la banque avec des protéines ne contenant pas la boucle de PS 1.
Ce test permet de déterminer si les protéines de fusion issues de la banque interagissent de façon non spécifique par leur structure, leur charge, leur hydrophobicité avec les protéines appâts (faux positifs de type III) ou avec le DLA de GAL4 (faux positifs de type II).
Nous avons transformé les souches YCM 79, HF7 C et PCY 2 par les couples de plasmides: pGBT9/pGAD-Y (Y correspondant à C ou D), pGBT-LAM/ pGAD-Y, pGBT9/pGAD424 (témoin négatif] et pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65 (témoin positif). Le pGBT9 code uniquement pour le DLA de GAL4 alors que le pGBT-LAM fourni par Clontech code pour une protéine de fusion entre le DLA de GAL4 et la lamine qui interagit de façon non spécifique avec les régions hydrophobes d'autres protéines.
Il en résulte qu'aucune des levures ainsi transformée n'était capable d'exprimer leurs gènes rapporteurs. Ainsi, les levures YCM 79 présentaient le phénotype Ura-, ~i-gal-, 5 les levures HF7 C étaient toutes His-, (3-gal- et les levures PCY 2, ~i-gal-.
Ces résultats suggèrent que les protéines de fusion de la banque ainsi isolées, interagissent spécifiquement avec la région hydrophile BL6 de PS-I et ne se lient pas avec la lamine ou le DLA de GAL4.
2.3 Test d'interaction sur des levures transformées par le vecteur pLex 9 contenant la 10 région codant pour la boucle de PS 1.
Ce test permet de s' assurer que l' interaction des protéines n' est pas due à
une structure adoptée par lcs différents fragments de BL6 uniquement lorsqu'ils sont fusionnés au DLA de GAL4.
Pour vérifier cela, les fragments BL6 et BM ont été fusionnés à un autre DLA, celui 15 du répresseur bactérien LexA. Deux constructions plasmidiques supplémentaires (pLex-BS et pLex-BM) ont été réalisée, où les séquences de la boucle hydrophile BL6 et de la forme mutée ont été fusionnées au gène de LexA au niveau des sites EcoRI/SaII du plasmide pLex9.
Ensuite la souche de levure L40 dans laquelle l'expression des génes rapporteurs 20 HIS3 et LacZ est induite par la fixation du complexe DLA-LexA/DA-GAL4 sur le site opérateur de LexA a été transformée. L'interaction avec les couples de plasmides a été testée : pLex-BL6/pGAD-Y (Y pour C ou D), pLex-BM/pGAD-Y, pLex-RAS/pGAD-RAF (témoin d'interaction positif) (Vojtek et al., 1993) et pLex-RAS/pGAD424, pLex-BL6/pGAD424, pLex-BL6/pGAD-RAF, pLex-25 BM/pGAD424, pLex-BM/pGAD-RAF (témoins d'interaction négatifj.
Les résultats des tests en goutte sur milieux sélectifs sans histidine et des tests de l'activité ~i-gal se sont révélés positifs pour les souches contenant le plasmide pLex-BL6 quel que soit le plasmide pGAD-Y testé. Il en est de même pour les souches contenant pLex-BM quel que soit le plasmide pGAD-Y testé. Ce test montre que l'interaction obtenue n'est pas liée à une conformation particulibre qu'adopterait la région BL6 de PS-I lorsqu'elle est fusionnée avec le domaine de liaison à
l'ADN de GAL4.
EXEMPLE 3 : Identification des inserts des plasmides issus du criblage.
3. I Séquençage des inserts des plasmides pGAD-C et pGAD-D.
Les inserts des plasmides pGAD-C et pGAD-D ont été entièrement séquencés. Nous avons commencé le séquençage en utilisant les oligonucléotides complémentaires du DA de GAL4 et du tADH 1 afin de connaître la séquence du début et de la fin de chaque insert. Puis, à partir de l'extrémité de chaque séquence, nous avons constitué
des oligonucléotides de synthèse qui nous ont permis d'avancer dans Ies séquences sur les deux brins. De cette façon, nous avons séquencé totalement les 1400 pb de l'insert D correspondant à la séquence SEQ ID N°2. Par contre, pour l'insert C de 2900 pb (séquence SEQ ID N° 1 ), il a été nécessaire d' établir une carte de restriction puis d'effectuer ua sous clonage de différents fragments afin d'obtenir la totalité de la séquence.
L'insert D présente une phase ouverte de lecture sur la totalité de sa séquence (Seq ID
N°2 ). En revanche, l'insert C contient un codon stop en fln de séquence (Seq ID
N° 1 ).
Leur séquence peptidique présente un profil plutôt hydrophile ce qui est en conformité avec le choix de la méthode de criblage qui s'applique plutôt à des protéines hydrophiles.
3.2 Comparaison des séquences Cette comparaison doit permettre de savoir si les inserts codent pour un domaine peptidique dont la fonction est connue.
Les séquences nucléiques et peptidiques des inserts ont été comparées avec des séquences répertoriées dans les banques de données « Gen Bank » et « EMBL »
(European Molecular Biology Lab). Aucune similitude significative n'a été
trouvée entre les inserts et les gènes (ou les protéines) enregistrés dans ces banques.
Les séquences des inserts ont aussi été comparées entre elles. Elles ne présentent aucune similitude.
De plus, l'existence de motifs peptidiques susceptibles d'apporter des informations 10 sur la fonction des peptides codés par les insert a été recherché. Quelques sites potentiels de glycosylation, de phosphorylation et de myristylation ont été
trouvés mais qui ne permettent pas de formuler d'hypothèse quant à une éventuelle fonction des peptides.
3.3 Expression des ARNm correspondant aux peptides sélectionnés dans différents I S tissus humains.
Afin de conforter (idée que l'interaction entre ces peptides et PS I existe bien in vivo, il a été verifié que l' expression des ARNm des peptides isolés de la banque se situe dans les mêmes tissus que l'expression de l'ARNm de PS 1. L'expression dans des tissus spécifiques, des gènes contenant les séquences isolées a été recherchée et le 20 taux d' expression des ARNm correspondant aux insert C et D dans différents tissus humains a été analysé par Northern blot.
La sonde radioactive préparée à partir de l'insert C (séquence ID N°I) a permis d'hybrider un ARNm de 9,Skb exprimé spécifiquement dans le cerveau et plus particulièrement dans le cortex cérébral, le lobe frontal et le lobe temporal (c~ Fig3).
25 La taille de cet ARNm suggère que la protéine traduite est de grande taille.
EXEMPLE 4 : Test d'interaction in vitro .
Ce test permet de savoir que les interactions ne sont pas dépendantes du contexte levure. La reconstitution du transactivateur fonctionnel GAL4 n'est pas toujours due à une interaction directe entre les deux protéines, mais peut aussi être le résultat de la formation d'un complexe protéique entre les protéines de fusion et une ou plusieurs protéines endogénes de la levure. Ainsi, les interactions n' existeraient qu' en présence de protéines intermédiaires provenant de la levure et n'auraient pas de réalité en dehors de ce contexte.
Il a été choisi de confirmer les interactions entre la région hydrophile BL6 de PS l et les peptides isolés respectivement appelés PepC et PepD dans un système acellulaire.
Les protéines sont produites dans E.coli BL21 (DE3) afin d'en obtenir de grande quantité.Les 2 peptides isolés, ont été fusionnés â des peptides tag permettant leur détection et leur fixation sur des supports. Pour cela, il a été choisi de fusionner la protéine GST, qui se lie au glutathion, aux différentes formes de la région BL6 et le peptide S-Tag, reconnu spécifiquement par la protéine S, aux peptides isolés (cf.
matériel et méthode pour le principe du test).
4.1 Production d'une protéine de fusion entre le S-Tag et les peptides isolés lors du criblage de la banque d' ADNc.
Afin de construire les protéines de fusion entre le S-Tag et les deux peptides PepC et PepD. Les différents fragments EcoRI/EcoRI issus des plasmides pGAD-C et pGAD-D ont été insérés dans le même cadre de lecture que la séquence de S-Tag du vecteur pET-29a.
A ce stade, un plasmide (pET-D) a été obtenu contenant l'insert correspondant au PepD. Le séquençage partiel de ce plasmide a montré que l'insertion a été
réalisée dans la phase de lecture souhaitée.
Ce plasmide a permis l'obtention d'une protéine de 52kDa correspondant à la protéine de fusion STag-PepD. La protéine STag-PepD est produite dans les bactéries BL21 (DE3) aprés induction à l'IPTG.
4.2 Production d'une protéine de fusion entre la GST et la boucle hydrophile de PS 1.
Pour fusionner la GST avec l'une des trois formes de Ia région hydrophile BL6 de PS
1, le vecteur pGEX-4T1 a été utilisé dans lequel les fragments EcoRI/SaII
provenant des plasmides pGBT-BL6, pGBT-BM et pGBT-BR ont été introduits.
Le plasmide pGEX-BM correspondant à la boucle mutée de PS-I a été obtenu. Le séquençage a montré que l'insertion a bien été réalisée dans le cadre de Lecture de la séquence GST.
Ce plasmide a permis la production de la protéine de fusion GST-BM de 42kDa dans les bactéries BL21 (DE3) après induction à l'IPTG.
4.3 Solubilisation de la protéine de fusion GST-BM.
Après la lyse des bactéries, la protéine GST-BM reste entièrement dans la fraction 1 S insoluble alors que le peptide STag ainsi que la protéine STag-PepD et la GST se trouvent en partie dans la fraction soluble.
La solubilisation des protéines de fusion est absolument nécessaire pour réaliser la chromatographie d' affinité. Dans un premier temps, Ia protéine GST-BM a été
fixée de manière spécifique sur une résine de glutathion couplée de façon covalente à des billes d'agarose afin de pouvoir tester, ensuite, l'interaction de GST-BM avec les partenaires peptidiques de PS 1 fusionné au STag (cf. Matériels et méthodes).
Si les protéines ne sont pas solubilisées, elles sédimentent avec les billes en absence de toute liaison spécifique avec celles-ci.
Après solubilisation de la protéine de fusion GST-BM, le test est réalisé
selon les conditions décrites au paragraphe 8 de la section matériels et méthodes.
EXEMPLE 5: Expression des partenaires spécifiques des PS-1 en cellules mammifères.
5 5.1 Construction des vecteurs d'expression appropriés.
Ce test permet de vérifier si Ies interactions protéiques révélées en levure sont aussi détectables dans le contexte de cellules mammiféres et avec Ia protéine PS 1 complote insérée dans son environnement membranaire. Les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID
N°2, des partenaires, ont été sousclonées dans un vecteur d'expression de cellules 10 mammifères pCDNA3 portant une séquence additionnelle correspondant à
l'épitope myc en 5'terminale et un site de restriction EcoRI (Fig. 4) permettant le sousclonage en phase des séquences des partenaires.
Le fragment de restriction EcoRI de pGAD-D de 1400 bp a été isolé et souscloné
en phase dans le site EcoRI du vecteur d' expression. Les constructions portant l' ADNc 15 dans l'orientation correcte ont été choisies par analyse de restriction enzymatique.
En ce qui concerne le clone C, le fragment EcoRI( 1 )-HindIII(391 )de pGAD-C a d'abord été isolé. Un second fragment HindIII(392)-MscI(2892) (ce dernier site à
bout franc se trouvant au sein du vecteur pGADlO en aval de la région codante du clone C) a ensuite été isolé par digestion partielle. Les fragments EcoRI( 1 }-20 HindIII(391) et HindIII(392)-MscI(2892) ont été mis en Iigation ensemble avec le vecteur d' expression digéré avec EcoRI et EcoRV, ce dernier site étant à bout franc.
Les constructions correctes portant l'intégralité de la séquence codante de C
ont été
identifiées par analyse de restriction.
Ces constructions permettent de générer des protéines fusion portant l'épitope myc et 25 les peptides correspondant respectivement aux sequences ID N° 1 et ID N° 2.
5.2 Expression dans des cellules de mammifères Ces constructions ont été transfectées en cellules COS 1 par des méthodes standard.
Aprés Iyse cellulaire, les échantillons sont analysés par immunotransfert et révélation avec l'anticorps anti-myc. L'expression des partenaires a pu être détectée par immunotransfert en utilisant l'anticorps anti-Myc 9E10 (fig 5). Nous avons pu détecter une bande très intense de 120 kDa comme attendu pour pepC, démontrant une forte expression (piste C). Pour D, l'intensité de la bande détectée n'était pas 5 toujours constante. Par contre, l'expression en cellules CHO a pu être détectée. Dans ce type cellulaire, D est peut-être un peu plus stable et apparaît comme une protéine migrant vers 80 kDa (piste D).
Les deux protéines ont donc pu être exprimées et détectées en cellules mammifères.
LISTE DE SÉQUENCES
S (1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER
(B) RUE: 20 avenue Raymon Aron (C) VILLE: Antony (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 92165 (G) TLPHONE: 01.55.71.69.22 (H) TLCOPIE: 01.55.71.72.91 () TITRE DE L' INVENTION: Acides nucleiques codant pour des proteines capables d'interagir avec les presenilines.
( i) NOMBRE DE SQUENCES: 2 (iv) FORME DCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEMB D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
3O (i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SEQUENCB l:
(A) LONGUEUR: 2892 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ü i) HYPOTHÉTIQUE: NON
40 (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
4$ (B) EMPLACEMENT:1..2736 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Arg Met Ile Pro Ile Phe His Asp Met Met Asp Trp Glu Gln Arg Lys Asa Gly Asn Phe Lys Gln Val Glu Ala Glu Leu Ile Asp Lys Leu Asp S
Ser Met Val Ser Glu Gly Lys Gly Asp Glu Ser Tyr Arg Glu Leu Phe Ser Leu Leu Thr Gln Leu Phe Gly Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Lys 1S Val Glu Gln Glu Thr Trp Arg Glu Thr Gly Ile Ser Phe Val Thr Ser Val Thr Arg Leu Met Glu Arg Leu Leu Asp Tyr Arg Asp Cys Met Lys Gly Glu Glu Thr Glu Asn Lys Lys Ile Gly Cys Thr Val Asn Leu Met Asn Phe Tyr Lys Ser Glu Ile Asn Lys Glu Glu Met Tyr Ile Arg Tyr Ile His Lys Leu Cys Asp Met His Leu Gln Ala Glu Asn Tyr Thr Glu 3S Ala Ala Phe Thr Leu Leu.Leu Tyr Cys Glu Leu Leu Gln Txp Glu Asp Arg Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Tyr Pro Ser Gln Thr Glu Trp Gln Arg Lys Glu Gly Leu Cys Arg Lys Ile Ile His Tyr Phe Asn Lys Gly Lys Ser Trp Glu Phe Gly Ile Pro Leu Cys Arg Glu Leu Ala Cys Gln SO TAC GAG AGC CTC TAT GAT TAC CAG AGC CTC AGC TGG ATT CGG.p,AA ATG 672 Tyr Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Gln Ser Leu Ser Txp Ile Arg Lys Met Glu Ala Ser Tyr Tyr Asp Asn Ile Met Glu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Glu Phe Phe Arg Val Gly Phe Tyr Gly Arg Lys Phe Pro Phe Phe Leu Arg Asn Lys Glu Tyr Val Cys Arg Gly His Asp Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Phe Gln Gln Arg Met Leu Ser Glu Phe Pro Gln Ala Val Ala Met Gln His Pro Asn His Pro Asp Asp Ala Ile Leu Gln Cys Asp Ala Gln Tyr Leu Gln Ile Tyr Ala Val Thr Pro Ile Pro Asp Tyr Val Asp Val Leu Gln Met Asp Arg Val Pro Asp Arg Val Lys Ser Phe Tyr Arg Val Asn Asn Val Arg Lys Phe Arg Tyr Asp Arg Pro Phe His Lys Gly Pro Lys Asp Lys Glu Asn Glu Phe Lys Ser Leu Txp Ile Glu Arg Thr Thr Leu Thr Leu Thr His Ser Leu Pro Gly Ile Ser Arg Trp Phe Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Val Glu Val Ser Pro Leu Glu Asn Ala Ile Gln Val Val Glu Asn Lys Asn Gln Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Gln Tyr S0 Gln His Lys Gln Val His Gly Asn Ile Asn Leu Leu Ser Met Cys Leu Asn Gly Val Ile Asp Ala Ala Val Asn Gly Gly Ile Ala Arg Tyr Gln 5 Glu Ala Phe Phe Asp Lys Asp Tyr Ile Asn Lys His Pro Gly Asp Ala Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Glu Leu Met Gln Glu Gln Val His Val 1~ 465 470 475 480 Leu Gly Val Gly Leu Ala Val His Glu Lys Phe Val His Pro Glu Met Arg Pro Leu His Lys Lys Leu Ile Asp Gln Phe Gln Met Met Arg Ala Ser Leu Tyr His Glu Phe Pro Gly Leu Asp Lys Leu Ser Pro Ala Cys Ser Gly Thr Ser Thr Pro Arg Gly Asn Val Leu Ala Ser His Ser Pro Met Ser Pro Glu Ser Ile Lys Met Thr His Arg His Ser Pro Met Asn 3~ 545 550 555 560 Leu Met Gly Thr Gly Arg His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser His Ala Ser Ser Glu Ala Gly Asn Met Val Met Leu Gly Aap Gly Ser Met Gly Asp Ala Pro Glu Asp Leu Tyr His His Met Gln Leu Ala Tyr Pro Asn Pro Arg Tyr Gln Gly Ser Val Thr Asn Val Ser Val Leu Ser Ser Ser Gln Ala Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Thr His Ser Ala Pro 625 630 ~ 635 640 Ser Gln Met Ile Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ala Arg Asp Lys Tyr Arg His Ala Arg Glu Met Met Leu Leu Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Arg Pro l~
Ser Ser Ala Met Tyr Pro Ala Ala Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Pro Asn Phe Gln Arg Ala Leu Phe Gln Gln Val Val Gly Ala Cys Lys Pro Cys Ser Asp Pro Asn Leu Ser Val Ala Glu Lys Gly His Tyr Ser Leu His Phe Asp Ala Phe His His Pro Leu Gly Asp Thr Pro Pro Ala Leu Pro Ala Arg Thr Leu Arg Lys Ser Pro Leu His Pro Ile Pro Ala Ser Pro Thr Ser Pro Gln Ser Gly Leu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Leu Ser Glu Ser Asn Phe Gly Hia Ser Ser Glu Ala Pro Pro Arg Thr Asp Thr Met Asp Ser Met Pro 4U Ser Gln Ala Trp Asn Ala Asp Glu Asp Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro Val His Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Ala Val Leu Asp Ser Ile Lys Ala Gln Pro Cys Arg Ser His Ser Ala Pro Gly Cys Val Ile Pro Gln Asp $~
Pro Met Asp Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Pro Tyr His Pro Arg Leu Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Glu WO 99/16874 PC"f/FR98/02093 Pro Ala Leu Glu His Asp Glu Gly Val Leu Leu Arg Glu Glu Thr Glu Arg Pro Arg Gly Leu His Arg Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Ser Ala Lys Glu Glû Gln Ala Arg Met Ala Trp Glu His Gly Arg Gly Glu Gln TGAGGGGCAA CGAGGCGGCT GGGATGCCGC CCTCAGTAAG CAGCTTGCCA ATCACTCCAG
1$ 2796 GTCTGAAAAG CAAGTCCCCC AGCCCCACCC CAGGGAGCCA GAGAGGCTTG CACTCAGGAG
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1363 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire IO (ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ü i) HYPOTHÉTIQUE: NON
1$
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1363 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Glu Phe Arg Gly Cys Val Lys Met Glu Phe Pro Gly Gly Asn Asp Asn Tyr Leu Thr Ile Thr Gly Pro Ser His Pro Phe Leu Ser Gly Ala Glu Thr Phe His Thr Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Phe Glu Ile Pro Pro Ile Ser Leu Asp Ser Asp Pro Ser Leu Ala Val Ser Asp Val Val Gly His Phe Asp Asp Leu Ala Asp Pro Ser Ser Ser Gln Asp Gly Ser Phe 4S Ser Ala Gln Tyr Gly Val Gln Thr Leu Asp Met Pro Val Gly Met Thr His Gly Leu Met Glu Gln Gly Gly Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Thr $O 1010 1015 1020 Met Asp Leu Asp His Ser Ile Gly Thr Gln Tyr Ser Ala Asn Pro Pro WO 99/16$74 PCT/FR98/02093 Val Thr Ile Asp Val Pro Met Thr Asp Met Thr Ser Gly Leu Met Gly $ 1045 1050 1055 1~
His Ser Gln Leu Thr Thr Ile Asp Gln Ser Glu Leu Ser Ser Gln Leu Gly Leu Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Pro Pro Ala Gln Ser Pro iS GAA GAT CGT CTT TCA ACC ACC CCT TCA CCT ACT AGT TCA CTT CAC GAA 576 Glu Asp Arg Leu Ser Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Ser Leu His Glu 20 Asp Gly Val Glu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Pro Ser Gln Lys Thr Val Val Val Glu Ala Gly Lys Lys Gln Lys Ala Pro Lys Lys Arg Lys Lys Lys Asp Pro Asn Glu Pro Gln Lys Pro Val Ser Ala Tyr Ala Leu Phe Phe Arg Asp Thr Gln Ala Ala Ile Lys Gly Gln Asn Pro Asn Ala Thr Phe Gly Glu Val Ser Lys Ile Val Ala Ser Met Trp Asp Ser Leu Gly 4U Glu Glu Gln Lps Gln Val Tyr Lys Arg Lys Thr Glu Ala Ala Lys Lys Glu Tyr Leu Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Gln Glu Cys Gln SU
Ala Thr Val Glu Thr Val Glu Leu Asp Pro Ala Pro Pro Ser Gln Thr Pro Ser Pro Pro Pro Met Ala Thr Val Asp Pro Ala Ser Pro Ala Pro SO
Ala Ser Ile Glu Pro Pro Ala Leu Ser Pro Ser Ile Val Val Asn Ser Thr Leu Ser Ser Tyr Val Ala Asn Gln Ala Ser Ser Gly Ala Gly Gly Gln Pro Asn Ile Thr Lys Leu Ile Ile Thr Lys Gln Met Leu Pro Ser Ser Ile Thr Met Ser Gln Gly Gly Met Val Thr Val Ile Pro Ala Thr Val Val Thr Ser Arg Gly Leu Gln Leu Gly Gln Thr Ser Thr Ala Thr Ile Gln Pro Ser Gln Gln Ala Gln Ile Val Thr Arg Ser Val Leu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Met Gln Leu Pro Pro Pro Arg Val Gln Pro Gly Ile
Claims (27)
1. Séquence nucléotidique comprenant tout ou partie de la séquence telle que définie dans la séquence SEQ ID No1 et codant pour une protéine caractérisée en ce qu'elle est capable d'interagir avec les présénilines.
2. Séquence nucléotidique comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID No2 ou de ses dérivées et codant pour une protéine caractérisée en ce qu'elle est capable d'interagir avec les présénilines.
3. Polypeptides comprenant tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi la séquence SEQ ID No1 telle que définie dans la revendication 1 ou la séquence SEQ
ID No2 ou de ses dérivés définie dans la revendication 2 et caractérisés en ce qu'ils sont capables d'intéragir avec les présénilines.
ID No2 ou de ses dérivés définie dans la revendication 2 et caractérisés en ce qu'ils sont capables d'intéragir avec les présénilines.
4. Polypeptides selon la revendication 3 caractérisés en ce qu'il sont capables d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS-1.
5. Polypeptides selon la revendication 4 caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir avec la séquence d'amino-acides 310-463 de la grande boucle de la préséniline PS-1
6. Polypeptides selon la revendication 3 caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir avec la grande boucle de la préséniline PS-2
7. Utilisation d'un polypeptide selon les revendications 3 à 6 pour l'obtention d'un médicament destiné à ralentir, stimuler ou moduler l'activité des présénilines.
8. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 3 à
caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit
caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit
9. Cellule hôte pour la production de polypeptide selon l'une des revendications 3 à
6, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2.
6, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2.
10. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon l'une des revendications 1 ou 2.
11. Sonde nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2 ou l'ARNm correspondant
12. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 3 à 6.
13. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une séquence choisie parmi les séquences peptidiques présentées en SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2 ou leurs dérivées.
14. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 12 ou 13 caractérisé en ce qu'il possède la faculté d'inhiber et/ ou de révéler l'interaction entre les présénilines et un polypeptide selon l'une des revendications 3 à 6.
15. Procédé de mise en évidence ou d'isolement de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre les présenilines et les polypeptides tels que définis dans les revendication 3 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant en polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où
celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
16. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 3 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 15.
17. Utilisation d'un ligand selon la revendication 16 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des affections neurologiques.
18. Virus recombinant defectif comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 3 à 6.
19. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2.
20. Vecteur selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
21. Vecteur selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
22. Vecteur selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication.
23. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 18 à 22.
24. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un polypeptide selon l'une des revendications 3 à 6.
25. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une des revendications 12 à 14, et/ou un oligonucléotide antisens selon la revendication 10 et/ou un composé préparé
selon la revendication 15.
selon la revendication 15.
26. Composition selon l'une des revendications 23 à 25 destinée à moduler ralentir ou inhiber l'activité des présénilines ou de leurs formes mutées.
27. Composition selon l'une des revendications 23 à 25 destinée au traitement des maladies neurodégénératives.
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