JP2003012548A - 医薬組成物 - Google Patents

医薬組成物

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JP2003012548A JP2001195471A JP2001195471A JP2003012548A JP 2003012548 A JP2003012548 A JP 2003012548A JP 2001195471 A JP2001195471 A JP 2001195471A JP 2001195471 A JP2001195471 A JP 2001195471A JP 2003012548 A JP2003012548 A JP 2003012548A
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泰一 片山
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孝幸 眞部
Kazunori Imaizumi
和則 今泉
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Taisho Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２ｍＲ
ＮＡエキソン５との結合の阻害しうる阻害剤；神経細胞
死抑制剤；及びプレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠
損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治
療又は予防に有用な医薬組成物を提供すること。 【解決手段】ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２
ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害する化合物を含有し
た、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子と
の結合の阻害剤；該阻害剤を含有した神経細胞死抑制
剤；該阻害剤又は該神経細胞死抑制剤を含有した医薬組
成物；プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプラ
イシングバリアントの産生に起因する脳障害の治療又は
予防用の薬剤の製造のための、該阻害剤若しくは該神経
細胞死抑制剤の使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＭＧ−Ｉタンパ
ク質とプレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５との結合を
阻害しうる阻害剤、神経細胞死を抑制することができる
神経細胞死抑制剤、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン
５欠損型スプライシングバリアントの産生に起因する疾
患の治療又は予防に有用な医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】神経変性疾患の１つであるアルツハイマ
ー病（ＡＤ）は、９０％を超えるＡＤ患者の疾患が孤発
性アルツハイマー病（ｓＡＤ）に分類される。ｓＡＤ患
者の大脳皮質及び海馬ＣＡ１領域のそれぞれのアポトー
シス性錐体細胞に、プレセニリン−２のバリアントがコ
ードする異常タンパク質（ＰＳ２Ｖ）が存在することが
知られている [サトウ(Sato, N.)ら, J. Biol. Chem.,
276, 2108-2114 (2001)]。
【０００３】ＰＳ２Ｖは、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−
ＳＨ培養細胞において低酸素刺激により誘導され、酸化
ストレス及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞での新たなタンパク質
合成に依存することが示されている [サトウ(Sato, N.)
ら, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)]。
【０００４】前記ＰＳ２Ｖにより、小胞体（ＥＲ）スト
レス応答性分子シャペロンであるグルコース調節タンパ
ク質（ＧＲＰ７８）が減少し、ＰＳ２Ｖ発現細胞におい
てβ−アミロイドタンパク質の産生が増加することが知
られている [サトウ(Sato, N.)ら, J. Biol. Chem., 27
6, 2108-2114 (2001)]。
【０００５】しかしながら、ＰＳ２ＶがｓＡＤにおける
ニューロン死の重要な因子の１つである可能性は示唆さ
れているものの、ＰＳ２Ｖの生成、疾患発症におけるメ
カニズムの詳細が十分に知られていないのが現状であ
る。また、前記ＰＳ２Ｖの生成に起因する疾患の有効な
治療法が求められているのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＨＭＧ−Ｉ
タンパク質とプレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５との
結合を阻害しうる阻害剤、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレ
セニリン−２ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害し、プ
レセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を
抑制し、それにより神経細胞死を抑制することができる
神経細胞死抑制剤、神経細胞死を抑制することができ、
プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシン
グバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害の治療
又は予防に有用な医薬組成物を提供することを目的とす
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、
〔１〕 ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２ｍＲ
ＮＡエキソン５との結合を阻害する化合物を有効成分と
して含有してなる、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリ
ン−２ｍＲＮＡとの間の結合の阻害剤、〔２〕 前記
〔１〕記載の阻害剤を有効成分として含有してなる神経
細胞死抑制剤、〔３〕 前記〔１〕記載の阻害剤又は前
記〔２〕記載の神経細胞死抑制剤を有効成分として含有
してなる医薬組成物、並びに〔４〕 プレセニリン−２
ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産
生に起因する脳障害の治療又は予防用の薬剤の製造のた
めの、前記〔１〕記載の阻害剤若しくは前記〔２〕記載
の神経細胞死抑制剤の使用、に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の阻害剤は、ＨＭＧ−Ｉタ
ンパク質とプレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５との間
の結合を阻害する化合物を有効成分として含有すること
に１つの特徴がある。本発明の阻害剤は、前記化合物を
含有しているため、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリ
ン−２ｍＲＮＡとの間の結合を阻害することができると
いう優れた効果を発揮する。また、本発明の阻害剤によ
れば、前記プレセニリン−２ｍＲＮＡのスプライシング
異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型スプライ
シング異常を抑制することができるという優れた効果を
発揮する。さらに、本発明の阻害剤は、プレセニリン−
２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制できるた
め、さらに神経細胞死を抑制することができるという優
れた効果を発揮する。
【０００９】プレセニリン−２遺伝子は、アルツハイマ
ー病における原因遺伝子の１つとして考えられている遺
伝子である。前記プレセニリン−２遺伝子にコードされ
るタンパク質は、小胞体ゴルジ体に存在する膜タンパク
質であって、アミロイド代謝又は沈着に関係するタンパ
ク質である。前記プレセニリン−２遺伝子は、１２のエ
キソンから構成され、このうち、１０のエキソンがタン
パク質をコードする [例えば、レビ−ラハド(Levy-Laha
d)ら, Genomics, 34, 198-204, (1996);レビ−ラハド
ら, Science, 269, 973-977 (1995); ロゲフ(Rogaev)
ら, Nature, 376, 775-778 (1995) 等を参照のこと] 。
【００１０】なお、本明細書において、「プレセニリン
−２遺伝子」とは、プレセニリン−２タンパク質をコー
ドするｍＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡ）のいずれをも含むことを意味する。なお、プレセ
ニリン−２遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、例え
ば、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション
番号：ＸＭ００２１２７、ＸＭ００２１２８、ＸＰ００
２１２７等に記載されている。
【００１１】本発明で用いられる「ＨＭＧ−Ｉタンパク
質とプレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５との間の結合
を阻害する化合物」は、例えば、特定部位において、該
結合を特異的に拮抗し、それにより、該結合を完全に阻
害する化合物又は特定部位において、該結合を特異的に
拮抗し、それにより、該結合の結合強度を減少させる化
合物のいずれでもよい。
【００１２】前記「特定部位」としては、具体的には、
例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる領
域、配列番号：２に示される塩基配列からなる領域、
配列番号：１に示される塩基配列と配列番号：２に示
される塩基配列とを含有した領域；前記〜それぞ
れに対応するＤＮＡ上における連続した配列からなる領
域等が挙げられる。
【００１３】また、本発明においては、前記「特定部
位」には、（ｉ）ＨＭＧ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列
において、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺
伝子との間の結合に関与する連続した配列からなる領
域；（ii）ＨＭＧ−Ｉタンパク質中に存在するアミノ酸
残基であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリ
ン−２遺伝子との間の結合に関与する複数のアミノ酸残
基から形成される空間的な領域をも含まれる。
【００１４】前記「結合に関与するアミノ酸残基」とし
ては、例えば、他のアミノ酸残基に置換された場合、得
られたタンパク質のプレセニリン−２遺伝子への結合能
を消失させる残基等が挙げられる。
【００１５】前記配列番号：１に示される塩基配列及び
配列番号：２に示される塩基配列は、プレセニリン−２
遺伝子のｍＲＮＡに存在する配列であり、ＨＭＧ−Ｉタ
ンパク質との結合に重要であることが、本発明者らによ
り見出された塩基配列であり、本発明は、かかる本発明
者らの知見に基づく。
【００１６】本発明においては、前記配列番号：１又は
２は、前記配列番号：１又は２において、少なくとも１
残基の変異を有する配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタン
パク質との結合能を呈する配列及びそれに対応するＤＮ
Ａ配列であってもよく、前記配列番号：１若しくは配列
番号：２の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは９
５％以上の配列同一性を有する配列であって、かつＨＭ
Ｇ−Ｉタンパク質との結合能を呈する配列であってもよ
い。
【００１７】前記化合物は、低分子化合物であっても、
高分子化合物であってもよい。前記化合物としては、例
えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ等の核酸；有機合成化合物等が挙
げられる。前記核酸は、１本鎖でも２本鎖であってもよ
く、直鎖状であっても環状であってもよい。
【００１８】前記化合物としては、例えば、ＨＭＧ−Ｉ
タンパク質中に存在するアミノ酸配列であって、かつＨ
ＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との結合
に関与するアミノ酸配列からなる領域をブロックする化
合物（例えば、核酸、核酸アナログ等）；ＨＭＧ−Ｉタ
ンパク質中に存在するアミノ酸残基であって、かつＨＭ
Ｇ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との結合に
関与する複数のアミノ酸残基から形成される空間的な領
域をブロックする化合物（例えば、該空間的な領域に適
合する有機合成化合物等）；プレセニリン−２ｍＲＮＡ
エキソン５中に存在する塩基配列からなる領域であっ
て、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝
子とが会合する領域をブロックする化合物（例えば、核
酸、核酸アナログ等）等が挙げられる。
【００１９】また、本発明においては、前記配列番号：
１に示される塩基配列及び／又は配列番号：２に示され
る塩基配列を介して、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニ
リン−２遺伝子とが結合することを阻害しうる化合物も
本発明の範囲に含まれる。
【００２０】なお、本明細書において、「配列同一性」
とは、配列番号：１又は２に示される塩基配列からなる
核酸分子と比較対象の核酸分子との間の対応残基の同一
性をいう。前記「配列同一性」には、２’−Ｏ−メチル
誘導体、脱アミノ誘導体（例えば、イノシン等）、アデ
ノシン誘導体（例えば、イソペンテニルアデニン、トレ
オニノカルボニルアデニン等）、含硫誘導体（４−チオ
ウリジン、２−チオピリミジン誘導体）等の修飾塩基等
を介して、配列番号：１又は２に示される塩基配列の残
基に類似する場合をも含むことを意図する。前記「配列
同一性」は、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最
適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較
することにより決定されうる。配列同一性の数値（パー
センテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基
を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象
の配列領域内の塩基の総数で、前記適合部位の数を割、
得られた数値に１００をかけることにより、算出されう
る。最適なアラインメント及びホモロジーを得るための
アルゴリズムとしては、例えば、スミス(Smith) らの局
所ホモロジーアルゴリズム[Add. APL. Math., 2, 482
(1981)]、ニードルマン(Needleman) らのホモロジーア
ラインメントアルゴリズム[J. Mol. Biol, 48,443 (197
0)]、パールソン(Pearson) らの相同性検索法[Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 85, 2444 (1988)] 等が挙げられ
る。より具体的には、ダイナミックプログラミング法、
ギャップペナルテイ法、Smith-Watermanアルゴリズム、
Good-Kanehisa アルゴリズム、BLAST アルゴリズム、FA
STA アルゴリズム等が挙げられる。
【００２１】前記化合物としては、具体的には、（Ａ）
配列番号：１に示される塩基配列及び／又は配列番号：
２に示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパ
ク質と結合するＲＮＡ分子が挙げられる。前記（Ａ）の
ＲＮＡ分子によれば、前記（ｉ）又は（ii）のいずれか
の領域をブロックすることができる。
【００２２】前記（Ａ）のＲＮＡ分子としては、具体的
には、例えば、（ａ）配列番号：３、４、５、６若しく
は７のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつＨＭ
Ｇ−Ｉタンパク質と結合しうるＲＮＡ分子等が挙げられ
る。
【００２３】また、配列番号：１に示される塩基配列を
含有した核酸、配列番号：２に示される塩基配列を含有
した核酸、及び配列番号：１に示される塩基配列と配列
番号：２に示される塩基配列とを含有した核酸からなる
群より選ばれた１種とＨＭＧ−Ｉとの間の結合親和性と
同等の結合親和性を呈するものであれば、前記（Ａ）の
ＲＮＡ分子から得られる核酸誘導体も本発明の範囲に含
まれる。
【００２４】すなわち、本発明においては、前記配列番
号：１又は２は、前記配列番号：１又は２において、少
なくとも１残基の変異を有する配列であって、かつＨＭ
Ｇ−Ｉタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対
応するＤＮＡ配列であってもよく、前記配列番号：１又
は２は、前記配列番号：１若しくは配列番号：２の塩基
配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の配列
同一性を有する配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク
質との結合能を呈する配列及びそれに対応するＤＮＡ配
列であってもよく、かかる配列を有する核酸も本発明の
範囲に含まれる。
【００２５】前記結合親和性は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質
との結合を、サウスウエスタン解析、ゲルシフトアッセ
イ、共鳴プラズモン相互作用解析等の、タンパク質−核
酸間相互作用の解析に使用される慣用の手法により評価
されうる。
【００２６】具体的には、核酸誘導体としては、例え
ば、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列に対応する
ＤＮＡ配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列
に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパ
ク質と結合するＤＮＡ分子、（Ｃ）前記（Ａ）のＲＮＡ
分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアン
チセンス分子、（Ｄ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は
（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、か
つＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、
（Ｅ）前記（Ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
等が挙げられる。
【００２７】前記（Ｂ）のＤＮＡ分子によれば、プレセ
ニリン−２ｍＲＮＡエキソン５中における領域であっ
て、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニン−２遺伝子とが
会合する領域をブロックすることが期待される。ここ
で、前記（Ｂ）において、「配列番号：１に示される塩
基配列に対応するＤＮＡ配列」又は「配列番号：２に示
される塩基配列に対応するＤＮＡ配列」とは、配列番
号：１又は配列番号：２に示される配列の逆転写産物の
相補鎖を意味する。前記（Ｂ）のＤＮＡ分子としては、
具体的には、例えば、（ｂ）配列番号：３、４、５、６
若しくは７のいずれかに示される塩基配列に対応するＤ
ＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合し
うるＤＮＡ分子が挙げられる。
【００２８】前記（Ｃ）において、前記（Ａ）のＲＮＡ
分子に相補的な分子（アンチセンス分子）によれば、プ
レセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５中における領域であ
って、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニン−２遺伝子と
が会合する領域をブロックすることが期待される。一
方、前記（Ｂ）のＤＮＡ分子に相補的なアンチセンス分
子によれば、前記（ｉ）又は（ii）の領域をブロックす
ることが期待される。前記（Ｃ）に示されるアンチセン
ス分子としては、前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）の
ＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子が挙
げられる。
【００２９】前記（Ｄ）において、アナログ分子として
は、前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子に
おいて、リン酸ジエステル結合における酸素原子がイオ
ウ原子で置換されたチオリン酸ジエステル結合を有する
オリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、又は、リン酸ジエ
ステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置
換されたオリゴヌクレオチド等の生体内でオリゴヌクレ
オチドが分解を受けにくくするために改変されたオリゴ
ヌクレオチド等が挙げられる。また、前記アナログ分子
は、いわゆるペプチド核酸といわれる核酸であってもよ
い。前記アナログ分子としては、具体的には、配列番
号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メチル
オリゴＲＮＡ、該配列番号：２７に示される塩基配列を
有する４−チオウリジン含有ＲＮＡ、該配列番号：２７
に示される塩基配列を有する２−チオピリミジン含有Ｒ
ＮＡ等が挙げられる。これらのアナログ分子は、例え
ば、生体内における安定性に優れる点が特に有利であ
る。
【００３０】前記（Ｄ）において、前記（Ａ）のＲＮＡ
分子のアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と
結合するアナログ分子によれば、前記（ｉ）又は（ii）
の領域をブロックすることが期待される。また、前記
（Ｂ）のＤＮＡ分子のアナログであって、かつＨＭＧ−
Ｉタンパク質と結合するアナログ分子によれば、プレセ
ニリン−２ｍＲＮＡエキソン５中における領域であっ
て、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニン−２遺伝子とが
会合する領域をブロックすることが期待される。前記
（Ｄ）に示されるアナログ分子としては、具体的には、
例えば、前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分
子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタン
パク質と結合するアナログ分子が挙げられる。
【００３１】前記（Ｅ）において、アナログ分子として
は、前記（Ｃ）のアンチセンス分子において、リン酸ジ
エステル結合における酸素原子がイオウ原子で置換され
たチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチ
ド（Ｓ−オリゴ）；リン酸ジエステル結合を電荷をもた
ないメチルホスフェート基で置換されたオリゴヌクレオ
チド等の生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにく
くするために改変したオリゴヌクレオチド等が挙げられ
る。また、前記アナログ分子の場合、いわゆるペプチド
核酸といわれる核酸であってもよい。具体的には、
（ｅ）前記（ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子が
挙げられる。
【００３２】本発明の阻害剤に用いられる化合物は、核
酸又は核酸誘導体を用いる場合、慣用の遺伝子組換え技
術、核酸合成法、部位特異的変異導入法により得られう
る。例えば、核酸又は核酸誘導体は、遺伝子工学で一般
的に用いられる核酸合成法に従い、例えば、ＤＮＡ合成
装置を用いて直接合成してもよく、これらの核酸又は核
酸誘導体（特に、変異体）を含む核酸又はその一部を合
成した後、ＰＣＲ法又はクローニングベクター等を用い
て核酸を増幅してもよい。さらに、ＤＮＡ分子の場合、
これらの方法により得られたＤＮＡ分子を、制限酵素等
により切断し、ついで、ＤＮＡリガーゼ等を用いて適切
なベクター等に連結し、得られた組換えベクターを適切
な宿主に導入して、得られた形質転換体から核酸を製造
してもよい。また、さらに細胞内でより安定な核酸誘導
体を得るために、前記核酸の塩基、糖、リン酸部分を化
学修飾を施してもよい。
【００３３】前記部位特異的変異導入法としては、例え
ば、ギャップド・デュプレックス(gapped duplex) 法
[例えば、Nucleic Acids Research, 12, 9441-9456(198
4) 等を参照のこと] 、クンケル(Kunkel)法 [例えば、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA,82,488-492(1985)等を参照
のこと] 、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる
方法等が挙げられる。
【００３４】前記核酸合成法としては、リン酸トリエス
テル法、ホスホルアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法等
が挙げられる。
【００３５】本発明の阻害剤の薬理評価は、例えば、被
検物質（薬理評価対象物）の存在下において、前記
（Ａ）の核酸、より具体的には、配列番号：４に示され
る塩基配列を有する核酸とＨＭＧ−Ｉタンパク質との結
合を検出すること又は該結合の結合強度（例えば、結合
親和性等）を測定することにより行なわれうる。
【００３６】すなわち、被検物質の存在下に、前記
（Ａ）の核酸、より具体的には、配列番号：４に示され
る塩基配列を有する核酸とＨＭＧ−Ｉタンパク質とを接
触させる工程を行ない、Ｉ）被検物質の存在下におい
て、該核酸と該ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合が検出さ
れない場合、又はII）被検物質の存在下における該核酸
と該ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合の結合強度ａが、被
検物質の非存在下における該核酸と該ＨＭＧ−Ｉタンパ
ク質との結合の結合強度ｂよりも小さい場合、該被検物
質が、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５とＨＭＧ−
Ｉタンパク質との間の結合に対する阻害剤であることの
指標となる。また、前記被検物質について、結合親和性
を調べる。前記結合及び結合強度（例えば、結合親和性
等）は、例えば、前記サウスウエスタン解析、ゲルシフ
トアッセイ、共鳴プラズモン相互作用解析等の、タンパ
ク質−核酸間相互作用の解析に使用される慣用の手法に
より評価できる。
【００３７】具体的には、前記結合及び結合強度（例え
ば、結合親和性等）は、被検物質の存在下において、例
えば、適切な支持体上に前記（Ａ）の核酸、より具体的
には、配列番号：４に示される塩基配列を有する核酸又
はＨＭＧ−Ｉタンパク質を固定化されたマトリックスを
用い、該マトリックスに固定した物質に対応する物質を
接触させ、質量の変化、蛍光の変化等を指標として、例
えば、前記共鳴プラズモン相互作用解析等により測定す
ることができる。
【００３８】なお、前記ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、例え
ば、適切な細胞を、通常の酸素条件下に培養し、つい
で、低酸素条件下に培養し、それにより細胞内で発現さ
せうる。
【００３９】通常の酸素条件としては、用いる細胞に応
じて適宜設定できるが、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の
場合、５％ＣＯ2 下、３７℃での培養等の条件等が挙げ
られる。低酸素条件としては、例えば、低酸素圧（８ｔ
ｏｒｒ）の条件が挙げられる。具体的には、例えば、低
酸素圧（８ｔｏｒｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素
チャンバーを備えたインキュベーターを用い、３７℃で
低酸素条件下に２１時間、培養物を維持することによ
り、細胞に低酸素刺激を与えることができる。
【００４０】前記細胞としては、例えば、神経細胞、グ
リア細胞、星状細胞等の中枢神経系細胞、線維芽細胞等
が挙げられ、より具体的には、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ
細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）等が挙げられる。
【００４１】また、必要により、慣用のタンパク質精製
手法〔塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフ
ィー等〕により精製してもよい。
【００４２】本発明の阻害剤においては、有効成分が核
酸又は核酸誘導体である場合、使用目的に応じて、核酸
又は核酸誘導体を、適宜、細胞への導入に適したベクタ
ーリポソーム、金属粒子、正電荷ポリマー等に保持せし
めてもよい。
【００４３】前記ベクターとしては、例えば、無毒化し
たヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノ随伴ウイルスベクター、無毒化したレトロウ
イルスベクター等が挙げられる。
【００４４】前記リポソームとしては、ＨＶＪ−リポソ
ーム、正電荷リポソーム等が挙げられる。
【００４５】本発明の阻害剤における有効成分量は、使
用目的等に応じて、結合阻害作用を発揮する範囲で適宜
設定されうる。例えば、有効成分が、０．０１〜１００
ｍｇ好ましくは、３〜１００ｍｇであることが望まし
い。
【００４６】本発明の阻害剤は、プレセニリン−２エキ
ソン５欠損型スプライシング異常を抑制し、それによ
り、神経細胞死を抑制することができるため、該阻害剤
により、神経細胞死抑制剤が提供されうる。かかる神経
細胞死抑制剤も本発明の範囲に含まれる。
【００４７】本発明の神経細胞死抑制剤は、前記阻害剤
を有効成分として含有することを１つの大きな特徴とす
る。したがって、神経細胞死を抑制することができると
いう優れた効果を発揮する。
【００４８】本発明の神経細胞死抑制剤における有効成
分の含有量は、投与対象の個体の体重、年齢、投与目的
により適宜設定することができる。
【００４９】また、本発明の神経細胞死抑制剤において
は、投与量は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与
対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適
宜選択される。前記投与量は、例えば、ＲＮＡ分子を含
有する場合、例えば、有効成分が、０．０１〜１００ｍ
ｇ、好ましくは、３〜１００ｍｇであることが望まし
い。
【００５０】本発明の神経細胞死抑制剤の投与方法とし
ては、直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法等が挙げら
れる。
【００５１】前記ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場
合、投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投
与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により
適宜選択され、例えば、静脈注射、鼻粘膜吸入等が挙げ
られる。
【００５２】例えば、核酸又は核酸誘導体を含有した阻
害剤を有効成分として神経細胞死抑制剤を血液内投与す
る場合、一般には１日あたり、有効成分量として、０．
０１〜１００ｍｇ、好ましくは３〜１００ｍｇであるこ
とが望ましい。
【００５３】また、本発明の神経細胞死抑制剤には、神
経細胞等への導入を容易にしうる物質、通常の薬理学的
に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝
剤、溶解補助剤、等張剤等を含有してもよい。
【００５４】本発明の神経細胞死抑制剤の薬理評価は、
前記阻害剤における薬理評価と共に以下に示す手法によ
り行ないうる。すなわち、被検物質を導入したＳＫ−Ｎ
−ＳＨ細胞〔被検細胞〕と導入していないＳＫ−Ｎ−Ｓ
Ｈ細胞〔対照細胞〕とを、それぞれ低酸素条件〔低酸素
圧（８ｔｏｒｒ）の条件〕下で培養し、被検細胞におけ
る神経細胞死が、対照細胞における神経細胞死よりも抑
制される場合、前記被検物質が、神経細胞死抑制剤であ
ることの指標となる。かかる神経細胞死の抑制は、ＭＴ
Ｔ法 [モッスマン(Mossman,T.)ら, J. Immunol. Method
s, 65, 55-59(1985)] により確認できる。前記低酸素条
件として、具体的には、例えば、低酸素圧（８ｔｏｒ
ｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバーを備え
たインキュベーターを用い、３７℃で低酸素下に２１時
間、培養物を曝露することにより、細胞に低酸素刺激を
与える条件が挙げられる。
【００５５】本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、
神経細胞死を抑制することができ、プレセニリン−２ｍ
ＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エ
キソン５欠損型スプライシング異常を抑制することがで
きるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤によ
り、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライ
シングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害の
治療又は予防に有用な医薬組成物が提供されうる。かか
る医薬組成物も本発明に含まれる。また、本発明の阻害
剤及び神経細胞死抑制剤は、プレセニリン−２ｍＲＮＡ
エキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因
する脳障害の治療又は予防用の薬剤の製造に使用されう
る。
【００５６】本発明の医薬組成物は、前記阻害剤又は前
記神経細胞死抑制剤を有効成分として含有することに１
つの特徴がある。本発明の医薬組成物は、スプライシン
グ異常を抑制する作用、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキ
ソン５欠損スプライシングバリアントの産生を抑制する
作用等を有する。したがって、本発明の医薬組成物は、
プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシン
グバリアントの産生に起因する脳障害の治療又は予防へ
の応用が期待される。
【００５７】本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患
としては、例えば、脳組織においてＰＳ２Ｖ誘導に起因
する脳障害等が挙げられる。
【００５８】前記脳障害としては、虚血性脳疾患、神経
変性疾患等が挙げられる。より具体的には、脳血管性痴
呆、パーキンソン症候群、アルツハイマー病等が挙げら
れる。
【００５９】本発明の医薬組成物の投与量は、投与目的
（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体
重、有効成分の種類等により適宜選択される。前記投与
量は、例えば、ＲＮＡ分子を含有する場合、有効成分量
として、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは３〜１００
ｍｇであることが望ましい。
【００６０】本発明の医薬組成物は、有効成分が患部の
細胞又は目的とする組織の細胞内に取り込まれるような
剤形であればよく、単独で、もしくは、慣用の担体と混
合して、非経口投与、局所投与で投与される。
【００６１】投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種
類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類
等により適宜選択され、例えば、静脈注射及び鼻粘膜吸
入等が挙げられる。
【００６２】医薬組成物が、例えば、核酸又は核酸誘導
体を含有するものであり、血液内投与する場合、一般に
は１日あたり、有効成分量として、３〜１００ｍｇを１
日１回から数回投与することができる。
【００６３】また、本発明の医薬組成物は、疾患部位の
周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤
（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むこ
とも可能であり、あるいはオスモチックポンプ等を用い
て患部に連続的に徐々に投与することもできる。
【００６４】本発明の医薬組成物は、必要に応じ、疾患
部位への導入を容易にしうる物質、各種の担体、助剤、
安定剤、潤滑剤、その他一般に使用される添加剤、例え
ば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン
酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タル
ク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落下生油、オリーブ
油、カカオバター、エチレングリコール等をさらに含有
してもよい。
【００６５】本発明の医薬組成物の薬理評価は、前記阻
害剤及び神経細胞死と同様の評価方法により行なわれう
る。また、対象となる疾患に応じて、慣用の薬理評価を
行なうこともできる。
【００６６】本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、
神経細胞死を抑制することができ、プレセニリン−２ｍ
ＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エ
キソン５欠損型スプライシング異常を抑制することがで
きるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤によ
り、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライ
シングバリアントの産生に起因する疾患、例えば、脳障
害の治療又は予防方法が提供されうる。かかる治療又は
予防方法も本発明の範囲に含まれる。
【００６７】本発明の治療又は予防方法は、プレセニリ
ン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアン
トの産生に起因する疾患、例えば、脳障害の個体に、治
療上有効量の本発明の阻害剤又は本発明の神経細胞死抑
制剤を投与することを１つの特徴とする。本発明の治療
又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制
剤を投与するため、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン
５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患
の治療又は予防が期待される。
【００６８】「治療上有効量」とは、神経細胞死を抑制
することができ、プレセニリン−２ｍＲＮＡのスプライ
シング異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型ス
プライシング異常を抑制することができる量を意味す
る。
【００６９】個体への阻害剤又は神経細胞死抑制剤の投
与は、例えば、静脈注射及び鼻粘膜吸入等により、１日
あたり、阻害剤又は神経細胞死抑制剤の有効成分量とし
て、３〜１００ｍｇを１日１回から数回投与することに
より行なわれうる。
【００７０】本発明の治療又は予防方法の効果は、対象
となる疾患の病理学的特徴等の発現の抑制を指標として
評価されうる。
【００７１】
【実施例】実験例１ 細胞培養、低酸素刺激及び一過性
トランスフェクション サトウらの文献 [サトウ(Sato N)ら、J. Biol. Chem.,
276, 2108-2114, (2001)] に従い、以下のように、細胞
培養及び低酸素刺激を行なった。
【００７２】ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、
１０％ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ〔ギブコ ビー
・アール・エル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）社製〕中におい
て、５％ＣＯ2 、３７℃で培養した。前記細胞が１７
６．６ｃｍ2 培養皿にてコンフルエントに達したとき、
培養物中の血清含有α−ＭＥＭを、無血清αＭＥＭと交
換した。培地交換後の培養物を、さらに４時間培養し
た。
【００７３】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞に
ついては、それぞれ１０％ウシ胎仔血清を含有したダル
ベッコ最小必須培地〔ギブコ ビー・アール・エル社
製〕中において、５％ＣＯ2 、３７℃で培養した。前記
細胞のそれぞれが１７６．６ｃｍ2 培養皿にてコンフル
エントに達したとき、培養物中の血清含有ダルベッコ最
小必須培地を、無血清ダルベッコ最小必須培地と交換し
た。培地交換後の培養物を、さらに４時間培養した。
【００７４】低酸素刺激を与える場合、低酸素圧（８ｔ
ｏｒｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバーを
備えたインキュベーターを用い、得られた培養物を３７
℃で低酸素下に２１時間曝露した。
【００７５】種々の構築物の一過性トランスフェクショ
ンを、リポフェクタミン２０００（ＬｅｐｏｆｅｃｔＡ
ＭＩＮＥTM ２０００）〔ギブコ ビー・アール・エル
社製〕を用いて行なった。
【００７６】実験例２ 全ＲＮＡの調製及びＲＴ−ＰＣ
Ｒ サトウらの文献 [サトウ(Sato N)ら、J. Neurochem., 7
2, 2498-2505, (1999)] に従い、以下のように、種々の
ストレス下の神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨＥＫ
−２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞それぞれ由来の全ＲＮ
Ａの調製、並びにＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【００７７】ＲＮｅａｓｙトータルＲＮＡキット〔キア
ゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用い、製造者の説明書に
従い、酸素正常状態、低酸素曝露又はＨＭＧ−Ｉの過剰
発現時におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨＥＫ−２９３
Ｔ細胞のそれぞれから全ＲＮＡを抽出、精製した。
【００７８】ついで、得られた全ＲＮＡと、マウスモロ
ニー白血病ウイルス逆転写酵素〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）社製〕とを用いて、４２℃で１時間逆転写反応を
行なった。ついで、得られた反応物を鋳型として、ネス
ティッドＰＣＲを行なった。ＰＣＲのサーマルプロファ
イルは、９５℃３０秒−６０℃３０秒−７２℃１分（最
終サイクルにおいては２分）を１サイクルとした３０サ
イクルである。１次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５１
〔5'-attcagacctctctgcggcc-3'（配列番号：９）〕とプ
ライマーｐｓ２３１〔5'-aagcgggagccaaagtctgg-3'（配
列番号：１０）〕とを用いた。２次ＰＣＲには、プライ
マーｐｓ２５２〔5'-gttcgtggtgcttccagagg-3'（配列番
号：１１）〕とプライマーｐｓ２３３〔5'-ggaccactctg
ggaggtaca-3'（配列番号：１２）〕とを用いた。
【００７９】得られた産物を、５％ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化
した。
【００８０】実験例３ 核抽出液の調製 核抽出液を、シュレイバー(Shreiber)らの方法の改良方
法〔ヨネダ(Yoneda, Y.)ら、Neuroscience, 90, 519-53
3 (1999)] に従い、以下のように調製した。
【００８１】なお、使用した緩衝液及びその他の溶液
は、いずれも、使用前に、その都度、孔径２２０ｎｍの
Ｓｔｅｒｉｔｏｐ〔ミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）社
製〕により濾過して滅菌した。
【００８２】各細胞構造物のホモジナイズについては、
特に断りのないかぎり、１０ｍＭＫＣｌと１ｍＭ ＥＤ
ＴＡと１ｍＭ ＥＧＴＡと５ｍＭ ジチオトレイトール
（ＤＴＴ）と１ｍＭ （ｐ−アミジノフェニル）メタン
スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とを含有する１０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）５０容量〔３
１５μｌ／プレート〕中２℃で行なった。
【００８３】ついで、得られたホモジネートに１０％
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を添加して終濃度を０．６％
とした。得られた混合物を１５０００ｒｐｍで５分間遠
心分離した。ついで、得られたペレットを、４００ｍＭ
ＫＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ ＥＧＴＡと１ｍ
Ｍ ＤＴＴと１ｍＭ ＰＭＳＦとを含有した２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０容量〔０．１ｍｌ〕
中に懸濁し、３０分間、氷冷した。氷冷後の懸濁物を、
１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清
を、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイ、ゲルシフトアッセ
イ及びスーパーシフトアッセイのための核抽出液として
用いた。なお、前記核抽出液は、使用まで、−８０℃で
保存した。
【００８４】実験例４ サイトゾルフラクション及び核
フラクションの調製 核フラクションを、マナベ(Manabe)らの文献 [マナベ(M
anabe)ら, Neuroscience, 100, 453-463, (2000)] に従
い、以下のように調製した。
【００８５】１０ｍＭ ＫＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡと１
ｍＭ ＥＧＴＡと５ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＰＭＳＦと
を含有した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ７．９）〔３１５μｌ／プレート〕中２℃で脳構造物
をホモジナイズした。得られたホモジネートに、１０％
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を添加して終濃度を０．６
％とした。得られた混合物を、１５０００ｒｐｍで５分
間遠心分離して、ペレット〔核フラクション（ＮＰ−４
０不溶性）〕と上清〔サイトゾルフラクション（ＮＰ−
４０可溶性）〕とを得た。また、前記ペレットを、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡと１ｍＭ ＥＧＴＡとＰＭＳＦとを含有し
た５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）〔５０μ
ｌ〕中に懸濁し、核フラクション（ＮＰ−４０不溶性）
とした。
【００８６】実験例５ ＤＮＡ構築物の調製 図２３に示す各オリゴヌクレオチドを慣用の方法により
合成した。２４マー又は６０マーの塩基長を有する２種
の相補的なオリゴヌクレオチドを用いてアニーリングを
行ない、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１（配列番号：１３〜２
３）の各二本鎖ＤＮＡ断片を得た。なお、図中、各オリ
ゴヌクレオチドにおいて、ＰＳ２のエキソン５の各断片
を下線を付し、太字で示す。
【００８７】得られた二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ
ベクターにそれぞれ組み込み、ＤＮＡ構築物を得た。Ｄ
ＮＡシークエンサー３７３Ａ型〔アプライドバイオシス
テム（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製〕を
用いて、前記二本鎖ＤＮＡ断片のそれぞれについて配列
解析を行なった。
【００８８】実験例６ ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブの調
製 実験例５で得られたＤＮＡ構築物を、ＥｃｏＲＩを用い
て直鎖状にし、それにより鋳型ＤＮＡを得た。ついで、
前記鋳型ＤＮＡを、［α−35Ｓ］標識ＵＴＰ（６２．５
μＣｉ）又は［α−32Ｐ］標識ＵＴＰ（５０μＣｉ）と
０．２５ｍＭＵＴＰと０．５ｍＭ ＡＴＰと０．５ｍＭ
ＣＴＰと０．５ｍＭ ＧＴＰとＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ用緩衝液と２０ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ〔プロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕と４０単位のＲＮアーゼ
インヒビター（東洋紡社製）とを含有した転写用緩衝液
中３７℃で１時間インキュベートすることにより、イン
ビトロ転写を行ない、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブ（ＲＮ
ＡプローブＮｏ１〜１１）を得た。
【００８９】実験例７ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイ タンパク質量５μｇ相当量の核抽出液を、１０μｇのｔ
ＲＮＡと各35Ｓ−標識ＲＮＡプローブ（１μｇ）ととも
に、インキュベーション緩衝液〔６０ｍＭ ＫＣｌと４
ｍＭ ＭｇＣｌ2 と１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ ＥＧＴ
Ａと１ｍＭ ＤＴＴと１０％グリセロールと１ｍＭ Ｐ
ＭＳＦとを含有した１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ７．９）〕中２５℃で３０分間インキュベー
トした（全容量２５μｌ）。
【００９０】ついで、得られた反応物に、ＵＶ照射器
（２５４ｎｍ、６０Ｗ）下、１５分間室温で紫外線（Ｕ
Ｖ）照射した。その後、ＵＶ照射後の反応物に１０μｇ
のＲＮアーゼＡを添加し、２５℃で３０分間インキュベ
ーションして、前記反応物中のプローブを消化した。
【００９１】得られた産物を、１０％ グリセロールと
２％ ＳＤＳと０．０１％ ブロモフェノールブルーと
５％ ２−メルカプトエタノールとを含有した１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）と体積比１：
４で混合して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理
を行なった。ＳＤＳ処理した溶液を、０．１％のＳＤＳ
を含有する１０〜２０％グラジェントポリアクリルアミ
ドゲル又は１５％ポリアクリルアミドゲル上、１５ｍＡ
／プレートの一定電流で２時間、室温での電気泳動に供
した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、イメージン
グプレートに曝した。
【００９２】実験例８ ノーザンブロットアッセイ ノーザンブロットアッセイを、前記サトウらの文献 [サ
トウ(Sato N)ら、J. Biol. Chem., 276, 2108-2114, (2
001)] に記載の方法に従って、下記のように行なった。
すなわち、全ＲＮＡの２０μｇ相当量を、ホルムアルデ
ヒド−ホルムアミドゲルを用いて電気泳動し、得られた
ゲルをナイロンフィルターにブロットした。ついで、前
記ナイロンフィルターに転写されたＲＮＡと標識ヒトＨ
ＭＧ−ＩｃＤＮＡとをハイブリダイズさせた。なお、前
記標識ヒトＨＭＧ−Ｉ ｃＤＮＡを、Ｒａｎｄｏｍ−Ｌ
ａｂｅｌｉｎｇキット（宝酒造社製）を用いて標識して
作製した。
【００９３】実験例９ イムノブロットアッセイ イムノブロットアッセイを、前記マナベ(Manabe)らの文
献 [マナベ(Manabe)ら, Neuroscience, 100, 453-463,
(2000)] の記載に従って、下記のように行なった。すな
わち、核抽出液、全ライセート、サイトゾルフラクショ
ン及び核フラクションについて、タンパク質量を測定し
た。ついで、核抽出液、全ライセート、サイトゾルフラ
クション及び核フラクションの各アリコートと、緩衝液
〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロー
ル、２％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０
１％ ブロモフェノールブルー、５％ メルカプトエタ
ノール、（ｐＨ６．８）〕とを体積比１：４で混合し
た。得られた混合液を１００℃で１０分間煮沸した。一
定量の各アリコート（核抽出液においては２５μｇタン
パク質相当量、全ライセートとサイトゾルフラクション
と核フラクションとにおいては５０μｇタンパク質相当
量）を、０．１％ ＳＤＳを含有した１５％ ポリアク
リルアミドゲル上、１５ｍＡ／プレートの一定電流で２
時間、室温で電気泳動した。電気泳動後のゲルを、１０
０％ メタノールにより活性化させたポリビニリデンジ
フルオリド（ＰＶＤＦ）膜にブロットした。ブロット後
のＰＶＤＦ膜を、５％ スキムミルクを含有した０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳでブロックした。つ
いで、ＰＶＤＦ膜を、１％スキムミルクを含有した０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳに希釈した抗ＨＭ
Ｇ−Ｉ／Ｙ抗体と反応させた。アルカリホスファターゼ
結合抗ヤギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体と反応さ
せた。免疫反応性を、１００ｍＭ ＮａＣｌと５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 と６６．７％ ４−ニトロブルーテトラゾリ
ウムクロリド（ＮＴＢ）と３３．３％ Ｘ−ホスフェー
ト／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ
ート（ＢＣＩＰ）とを含有した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）中で可視化した。
【００９４】実験例１０ 免疫沈降 免疫沈降を、前記サトウらの文献 [サトウ(Sato N)ら、
J. Biol. Chem., 276,2108-2114, (2001)] に記載の条
件に従って、下記のように行なった。
【００９５】酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の
核抽出液又は低酸素曝露したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の
核抽出液を、抗ＨＭＧ−Ｉ抗体（サンタクルツバイオテ
クノロジー社製）とともに４℃で８時間インキュベート
した。得られた産物をプロテイン−Ｇアガロース〔ファ
ルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ）社製〕と混合し、４℃で１時間維持した。得られ
た混合物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得ら
れた沈殿物をＰＢＳに懸濁した。さらに、得られた懸濁
物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた
沈殿物を、Ｍｉｌｉ−Ｑ水に懸濁した。この懸濁液を、
ＳＤＳ処理し、得られた溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
した。得られたゲルについて、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮ
Ｐに対する抗体を用い、イムノブロットアッセイを行な
った。
【００９６】また、前記抗ＨＭＧ−Ｉ抗体の代わりに、
抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体（サンタクルツバイオ
テクノロジー社製）を用いて免疫沈降を行ない、前記Ｕ
１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰに対する抗体の代わりに、ＨＭ
Ｇ−Ｉ／Ｙに対する抗体〔抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体；サン
タクルツバイオテクノロジー社製〕を用いてイムノブロ
ットアッセイを行なった。
【００９７】実験例１１ 免疫細胞化学 免疫細胞化学的検査をＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞で行なった。
すなわち、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態に維持す
るか、あるいは、該細胞を低酸素条件下に２１時間曝露
した。ついで、得られた細胞を、４％パラホルムアルデ
ヒド中に室温で２時間固定し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ
−Ｘ１００中で少なくとも５分間透過させた。固定及び
透過させた細胞をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄細胞を、
抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体及び抗ＳＣ３５抗体〔シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）社製〕と４℃で１２時間免疫反応させた。細
胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ヤギＩｇＧ抗
体及びＣｙ３結合抗マウスＩｇＧ抗体とともに室温で２
時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質を、コ
ンピューターに接続した顕微鏡下で４８８ｎｍ励起フィ
ルターを用いて観察した。
【００９８】実験例１２ 免疫組織化学 免疫組織化学法を、前記サトウらの文献 [サトウ(Sato
N)ら、J. Biol. Chem., 276, 2108-2114, (2001)] に記
載の改良イムノペルオキシダーゼ法を用いて行なった。
すなわち、対照又はｓＡＤの脳切片を室温で２時間固定
し、ついで、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ免疫組織化学の処理を行な
った。抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体又は抗ＳＳＭＡＧ抗体を
１：１０００の希釈律で使用した。ビオチニル化抗ヤギ
抗体又はビオチニル化抗ウサギＩｇＧ〔ベクタスタチン
エライト（ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅ）社製〕を
二次抗体として使用した。免疫反応性を、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ７．６）中０．０５％ＤＡＢ及び０．０１
％過酸化水素で可視化した。
【００９９】実験例１３ スーパーシフトアッセイ ５μｇタンパク質相当量の核抽出物を、１μｇの抗ＨＭ
Ｇ−Ｉ／Ｙ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社
製）又は０．５〜２．０μｇの抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲ
ＮＰ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）とと
もに４℃で８時間インキュベートし、前処理を行なっ
た。得られた前処理産物を、インキュベーション緩衝液
〔組成：６０ｍＭ ＫＣｌと４ｍＭ ＭｇＣｌ2 と１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡと１ｍＭ ＥＧＴＡと１ｍＭ ＤＴＴと１
０％グリセロールと１ｍＭ ＰＭＳＦとを含有した１２
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）〕中
２μｇ若しくは１０μｇのｔＲＮＡとともにインキュベ
ートした。ついで、32Ｐ標識ＲＮＡプローブ〔１μｇ、
図４に示されるＮｏ．５プローブ〕を添加して、２５℃
で３０分間インキュベーションした（全容量５０μ
ｌ）。
【０１００】得られた反応物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓと
０．３８Ｍグリシンと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した緩
衝液（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル
上、１１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気
泳動することにより、結合プローブと遊離プローブとを
分離した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、ついで
Ｘ線フィルムに曝した。
【０１０１】実施例１ 孤発性アルツハイマー病患者脳
及び培養細胞中におけるＰＳ２Ｖの発現 （１）孤発性アルツハイマー病患者の脳におけるＰＳ２
Ｖの発現 孤発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）脳由来の全ＲＮＡ又
は年齢がマッチした対照脳由来の全ＲＮＡを、ＲＴ−Ｐ
ＣＲでアッセイした。
【０１０２】ｓＡＤ脳及び対照脳のそれぞれから、アン
ウォー(Anwar R.)ら [アンウォー(Anwar R.)ら, J. Neu
rochem., 66, 1774-1777 (1996)]記載の方法に従い、ｍ
ＲＮＡを単離した。
【０１０３】ついで、得られたｍＲＮＡと、マウスモロ
ニー白血病ウイルス逆転写酵素〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）社製〕とを用いて、逆転写反応を行なった。ＰＣ
Ｒにおけるサーマルプロファイルは、変性：９５℃、２
分／９５℃、３０秒、アニーリング：６０℃、３０秒、
伸長：７２℃、１分を１サイクルとする３０サイクルで
ある。また、１次プライマーとして、前記プライマーｐ
ｓ２５１とｐｓ２３１とを用い、２次プライマーとし
て、プライマーｐｓ２５２とｐｓ２３３とを用いた。
【０１０４】得られた反応物を５％ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動した。増幅産物を臭化エチジウム染色
により可視化した。その結果を図１に示す。
【０１０５】図１の左パネルのレーン１と、サトウ(Sat
o)らの文献 [サトウ(Sato)ら、J. Neurochem., 72, 249
8-2505 (1999)]とに示されるように、対照脳において
は、全長ＰＳ２が主要なＲＴ−ＰＣＲ産物として検出さ
れることがわかる。一方、図１の左パネルのレーン２に
示されるように、ｓＡＤ脳においては、全長ＰＳ２に加
え、より短鎖の産物が検出されることがわかる。ダイレ
クトシークエンシングの結果、前記短鎖の産物は、ＰＳ
２遺伝子のエキソン５が欠失したバリアント（以下、Ｐ
Ｓ２Ｖという）であることが示される。
【０１０６】（２）培養細胞におけるＰＳ２Ｖの発現 ｓＡＤのモデルのように、培養細胞において、ＰＳ２Ｖ
の生成を効率よく再現するために、前記と同様の実験に
よりあらゆる種類のストレス下における種々の細胞株由
来の全ＲＮＡについて、ＰＳ２Ｖの発現を測定した。そ
の結果を図１の右パネルに示す。
【０１０７】図１の右パネルのレーン１〜３に示される
ように、酸素正常状態に曝露した種々の細胞株、すなわ
ちＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びＳＫ−Ｎ−
ＳＨ細胞において、全長ＰＳ２のみが検出されることが
わかる。また、図１の右パネルのレーン４及び５に示さ
れるように、同様の結果が低酸素条件に曝露したＨｅＬ
ａ細胞及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において見られる。
【０１０８】しかしながら、低酸素条件に曝露したＳＫ
−Ｎ−ＳＨ細胞〔図１、右パネルのレーン６；サトウ(S
ato)ら、J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999) 〕並び
にｓＡＤ脳においては、ＰＳ２と、ダイレクトシークエ
ンシングによりＰＳ２Ｖであることが確認された短鎖の
産物とが検出されることがわかる。
【０１０９】一方、検出可能なＰＳ２Ｖは、他のストレ
スであるツニカマイシン（図１、右パネルのレーン
７）、β−アミロイド（図１、右パネルのレーン８）及
び過酸化水素 [サトウ(Sato)ら、J. Neurochem., 72, 2
498-2505 (1999)]においては観察されなかった。
【０１１０】ついで、ＰＳ２Ｖタンパク質に対する抗体
（抗ＳＳＭＡＧ抗体）を用いて、免疫組織化学的染色法
により、ＰＳ２Ｖの局在を調べた。結果を図２に示す。
【０１１１】図２及びサトウらの文献 [サトウ(Sato N)
ら、J. Biol. Chem., 276, 2108-2114, (2001)] に示さ
れるように、ＰＳ２Ｖに対する免疫反応性が、ｓＡＤ脳
組織の海馬ＣＡ１領域の錐体細胞層及び側頭皮質の錐体
細胞層に観察される。したがって、ｓＡＤ脳組織の海馬
ＣＡ１領域の錐体細胞層及び側頭皮質の錐体細胞層にお
いて、ＰＳ２Ｖが局在することがわかる。
【０１１２】実施例２ 低酸素曝露細胞におけるＰＳ２
ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合因子の検出 低酸素曝露細胞におけるＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合
因子を検出するため、図４に示す種々の35Ｓ−標識ｐｒ
ｅ−ｍＲＮＡプローブ（ＲＮＡプローブ）を調製した。
図３に示されるストラテジーにより、図４に示す種々の
プローブを用いる独自のｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイ
を構築した。結果を図５に示す。
【０１１３】その結果、Ｎｏ．０の35Ｓ−標識プローブ
を用いたｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイにより、図５、
レーン１に示されるように、酸素正常状態の神経芽細胞
腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においては、黒矢
印で示した分子量（約２０ｋＤａ）の位置にシグナルが
検出されず、低酸素条件に２１時間曝露した神経芽細胞
腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においては、図
５、レーン２に示されるように、黒矢印で示した分子量
（約２０ｋＤａ）の位置にシグナルが検出された。した
がって、低酸素曝露神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由
来の核抽出液において、ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合
活性を呈する因子が存在することがわかる。ｐｒｅ−ｍ
ＲＮＡ結合アッセイに使用する前における核抽出液の加
熱により、ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合活性がほぼ完
全に消失するため、この結合活性がタンパク質由来であ
り、核酸、脂質等の他の因子由来ではないという可能性
が高い。
【０１１４】また、図５のレーン３〜１２に示されるよ
うに、低酸素条件に曝露されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来
の核抽出液中に見出されたＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結
合活性を呈する因子は、ＰＳ２エキソン５の３’部位に
結合することがわかる。
【０１１５】さらに、低酸素条件に曝露されたＳＫ−Ｎ
−ＳＨ細胞由来の核抽出液中に見出された前記因子とＮ
ｏ．０プローブとの結合に対する非標識のＮｏ．１〜５
の各プローブの影響を、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイ
により調べた。結果を図６に示す。
【０１１６】図６に示されるように、低酸素曝露ＳＫ−
Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中に見出された前記因子と
Ｎｏ．０プローブとの結合は、Ｎｏ．５の35Ｓ−非標識
プローブの添加により阻害されるが、他の非標識プロー
ブ（Ｎｏ．１〜４）では阻害されないことがわかる。
【０１１７】さらに、刺激後の異なる時点で得た核抽出
液におけるＮｏ．５プローブに対する結合活性の誘導に
おける酸素正常状態及び低酸素の影響を調べた。その結
果、酸素正常状態曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出
液においては、使用した条件下のＮｏ．５プローブにつ
いて顕著な結合活性は認められなかった。しかしなが
ら、刺激後１６〜２１時間の間の核抽出液では低酸素に
よる結合活性の増強が認められ、少なくとも２４時間持
続することが示された。
【０１１８】本実施例における全ての実験は、別の細胞
培養物を用いて、少なくとも４回繰り返され、同様の結
果が得られた。したがって、低酸素により誘導される結
合活性は、Ｎｏ．５プローブに特異的であることが示唆
される。
【０１１９】実施例３ ヒトＰＳ２エキソン５結合タン
パク質の精製及び同定 実施例２におけるＮｏ．５プローブへの結合活性を有す
る因子を精製するため、被検フラクションを、ｐｒｅ−
ｍＲＮＡ結合性反応物に加え、Ｎｏ．５のプローブに対
する結合活性の増加を測定することによりアッセイし
た。
【０１２０】精製手順の概略を図７に示す。図７に示さ
れた（Ｉ）〜（Ｖ）の各フラクションを、銀染色（図
８）及びＲＮＡ結合アッセイ（図９）によりアッセイし
た。
【０１２１】実施例１と同様に低酸素条件に曝露したＳ
Ｋ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液（図９、レーン１）
を、６０％飽和硫酸アンモニウムで分画し、上清とし
て、Ｎｏ．５ ＲＮＡプローブへの結合活性を有するフ
ラクション〔フラクション（II）、図７（II）〕を得
た。なお、前記フラクション（II）の銀染色の結果を図
８、レーン２に示し、ＲＮＡ結合アッセイの結果を図
９、レーン２に示す。
【０１２２】前記フラクション（II）を、それぞれ５Ｌ
の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
中、４℃で４時間、２回透析し、それにより、硫酸アン
モニウムを除去した。得られた透析物を、ＤＥＡＥカラ
ム〔ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ）社製〕による陰イオン交換クロマトグラ
フィーに供し、その後、カラムを１０ｍｌの５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。つ
いで、１Ｍ ＮａＣｌを含有した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌを用いて溶出を行
ない、Ｎｏ．５ＲＮＡプローブへの強い結合活性を有す
るフラクション〔フラクション(III) 、図７(III) 〕を
得た。なお、前記フラクション(III) について、銀染色
の結果を図８、レーン３に示し、ＲＮＡ結合アッセイの
結果を図９、レーン３に示す。
【０１２３】前記フラクション(III) を、５Ｌの５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して、
４℃で４時間、２回透析した。ついで、得られた透析物
を、５’−アミノ−２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（5'
-aucuucuugguggugcucuacaaguaccgcugcuacaaggugaggccc
u -3' 配列番号：２４）結合ＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ〔ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕アフィニティーカラムに供し
た。前記アフィニティーカラムを、前記インキュベーシ
ョン緩衝液１０ｍｌで洗浄し、１Ｍ ＮａＣｌを含有し
たインキュベーション緩衝液１５ｍｌを用いて溶出し
て、Ｎｏ．５ ＲＮＡプローブへの結合活性を有するフ
ラクション〔フラクション（IV）、図７（IV）〕を得た
（図９、レーン４）。フラクション（IV）について、銀
染色の結果を図８、レーン４に示し、ＲＮＡ結合アッセ
イの結果を図９、レーン４に示す。
【０１２４】銀染色の結果より、図８、レーン４に示す
ように、完全には精製されていないことがわかった。
【０１２５】ついで、前記フラクション（IV）を、５Ｌ
のＭｉｌｉ−Ｑ水に対して、４℃で４時間、２回透析し
た。得られた透析物を完全に凍結乾燥した後、０．１％
ＴＦＡを含有したＭｉｌｉ−Ｑ水に再溶解した。
【０１２６】得られた溶液を、Ｗａｔｅｒｓ ５Ｃ１８
−ＭＳ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを用いた逆相
クロマトグラフィーに供した。すなわち、０．１％ＴＦ
Ａを含有したＭｉｌｉ−Ｑ水でカラムを洗浄した。その
後、０〜１００％のリニアグラジェントアセトニトリル
の０．１％ ＴＦＡ含有Ｍｉｌｉ−Ｑ水溶液２５ｍｌ、
続いて０．１％ ＴＦＡ含有１００％アセトニトリル５
ｍｌを用いて溶出を行なった。
【０１２７】その結果、２０〜２５％アセトニトリルで
溶出された単一ピークのフラクション〔フラクション
（Ｖ）、図７（Ｖ）〕を得た。かかるフラクションは、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色により、図８、レーン５に
示されるように、黒矢印で示した分子量の位置において
単一のバンドを示した。しかしながら、最終フラクショ
ンの結合活性は、先のステップ〔図７（IV）〕のものと
比較して劇的に低下した。結合反応溶液におけるアセト
ニトリルの最終濃度を３０％とすることにより、もとの
フラクション中のプローブＮｏ．５に対する結合活性が
ほぼ完全に消失したため、最終フラクションの結合活性
の減少は、逆相クロマトグラフィー用溶離緩衝液に含ま
れるアセトニトリルに依存することがわかる。
【０１２８】得られたフラクションを、０．１％ ＳＤ
Ｓを含有した１２％ポリアクリルアミドゲルで、１５ｍ
Ａ／プレートの一定電流にて２時間、室温で電気泳動し
て分離した。その後、分離されたタンパク質バンドを含
むゲル断片を切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化
を行なった。溶出したペプチド断片を、ＴＳＫゲルＯＤ
Ｓ−８０Ｔｓ ＱＡカラム（２．０ｍｍ×２５０ｍｍ、
東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにより分離した。つい
で、分離されたペプチド断片を、自動タンパク質シーク
エンサー（ＨＰ Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）により解析した。得ら
れたペプチド配列情報をデータベースの検索に使用し
た。
【０１２９】最終フラクション中の単一バンドについて
ペプチド配列解析を行ない、１７個のアミノ酸配列を得
た。得られたペプチド配列を、配列データベースの既知
のタンパク質と比較した結果、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−Ｓ
Ｈ細胞由来の核抽出液中のＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結
合性タンパク質は、ＨＭＧ−Ｉに完全にマッチした（ジ
ーンバンクアクセッション番号Ｐ１７０９６）。
【０１３０】実施例４ ＨＭＧ−Ｉの結合活性の評価 実施例３の結果に基づき、ＨＭＧ−Ｉが、実際に結合活
性を有する物質であることを確認するため、ＨＭＧ−Ｉ
タンパク質に対する抗体と、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ
細胞由来の核抽出液又は酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−ＳＨ
細胞由来の核抽出液とを用いて、実験例１３に従い、下
記のように、スーパーシフトアッセイを行なった。
【０１３１】すなわち、５μｇタンパク質相当量の核抽
出液を、０．５〜２．０μｇの抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体
〔サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒ
ｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕とともに、４
℃で８時間インキュベートし、前処理を行なった。前処
理した核抽出液を、インキュベーション緩衝液中１０μ
ｇのｔＲＮＡとともにインキュベートし、ついで、得ら
れた産物に、全容量５０μｌの32Ｐ標識ＲＮＡプローブ
〔１μｇ、図４に示されるＮｏ．５プローブ〕を添加し
て、２５℃で３０分間インキュベーションした。結合プ
ローブと遊離プローブとを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓと０．
３８Ｍグリシンと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した緩衝液
（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル上、１
１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気泳動す
ることにより分離した。ゲルを固定し、乾燥した。つい
で、乾燥ゲルを、Ｘ線フィルムに曝して、オートラジオ
グラフィーを行なった。
【０１３２】その結果、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
由来の核抽出液を用いた場合、図１０、右パネルのレー
ン１及び２に示すように、酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−Ｓ
Ｈ細胞由来の核抽出液を用いた場合よりも強い結合活性
が見られた。また、この結合活性の増加は、図１０、右
パネルのレーン３〜５に示すように、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ
抗体での前処理により、抗体濃度依存的にスーパーシフ
トされることがわかる。しかしながら、図１０、左パネ
ルに示すように、対照実験としての酸素正常状態のＳＫ
−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液では、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗
体の添加による顕著な効果は観察されなかった。
【０１３３】これらの結果により、プローブＮｏ．５に
対する結合活性を有する低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
由来物質は、ＨＭＧ−Ｉであることが示される。
【０１３４】また、ＨＭＧ−Ｉタンパク質の低酸素曝露
細胞におけるプローブＮｏ．５に対する結合活性は、ｐ
ｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイではＵＶ照射に依存しない
ことが示される。
【０１３５】実施例５ ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合
部位の決定 本発明者らは、図４のプローブＮｏ．５のＰＳ２エキソ
ン５の３’末端における２回繰り返した類似配列（反復
配列）に着目し、ＨＭＧ−Ｉタンパク質がこれらの反復
配列に結合することを予想した。そこで、プローブＮ
ｏ．５の誘導体として、図１１に示した６種のＲＮＡプ
ローブ（プローブＮｏ．６〜１１）を調製し、得られた
プローブを用いて、前記実験例７に従い、ｐｒｅ−ｍＲ
ＮＡ結合アッセイを行なった。その結果を図１２に示
す。なお、前記反復配列は、図１１のプローブＮｏ．５
中における下線部の配列であり、それぞれ配列番号：１
及び２に示される。
【０１３６】図１２のレーン１に示すように、プローブ
Ｎｏ．５に対する結合活性は、酸素正常状態曝露ＳＫ−
Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において検出できなかっ
た。一方、プローブＮｏ．５に対する結合活性は、図５
及び図６と同様、図１２のレーン２に示すように、低酸
素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液を用いること
により、黒矢印で示した分子量の位置において強く増加
することがわかる。
【０１３７】しかしながら、低酸素曝露によるこの結合
活性の増大は、図１２のレーン３に示すように、配列番
号：１及び２の配列を欠いたプローブ（図１１のプロー
ブＮｏ．６）を使用することにより消失した。一方、低
酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において、
配列番号：１及び２のそれぞれを直接結合させた配列を
含むプローブＮｏ．７（図１１）を使用することによ
り、結合が強く上昇した（図１２、レーン４）。また、
配列番号：１及び２の配列において、それぞれのＣをＡ
に置換された配列を含むプローブＮｏ．８（図１１）を
用いた場合、図１２のレーン５に示すように、ほとんど
の部分で完全に結合活性が消失した。さらに、配列番
号：１又は２のいずれか一方を結合アッセイに使用し、
結合活性を観察すると（図１２、レーン６及び８）、両
配列を有するプローブＮｏ．１０に対する結合活性が最
も強かった（図１２、レーン７）。これらの結果は、配
列番号：１又は２のいずれか又は両方が、ＰＳ２ ｐｒ
ｅ−ｍＲＮＡに対するＨＭＧ−Ｉタンパク質の結合活性
に必要であることを意味する。
【０１３８】図１２は、配列番号：１又は２のいずれか
又は両方が、ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するＨＭＧ
−Ｉの結合活性に必要であることを示す。前記配列番
号：１及び配列番号：２の配列をデータベースの他の遺
伝子と比較するために相同性を調べたところ、前記配列
番号：１及び２は、これまでのところ、ＰＳ２のエキソ
ン５に特有の配列であることが示される。
【０１３９】以上の結果は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質
が一本鎖ＲＮＡに結合することを示し、ＨＭＧ−Ｉタン
パク質が、 gcucuacaag （配列番号：１）及び／又はgc
ugcuacaag （配列番号：２）を含有した配列からなる部
位を認識し、結合することを示す。
【０１４０】実施例６ ＨＭＧ−Ｉ ｍＲＮＡ及び免疫
反応性ＨＭＧ−Ｉタンパク質の発現に対する低酸素の影
響 結合活性の増加がＨＭＧ−Ｉの発現の増加に依存するか
否かを調べるため、ＨＭＧ−ＩのｍＲＮＡ及びタンパク
質の発現レベルについて、酸素正常状態の場合と低酸素
曝露した場合とを比較した。
【０１４１】図１３の上部左パネルに示されるように、
ノーザンブロット解析により、ＨＭＧ−ＩのｍＲＮＡレ
ベルは、神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞においてＰＳ
２Ｖを発現する条件である低酸素曝露により劇的に増加
することがわかる。しかしながら、ＰＳ２Ｖを誘導しな
い低酸素曝露ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を用いた場合（図１
３、上部中央パネル）又はＰＳ２Ｖを誘導しないツニカ
マイシン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いた場合（図１
３、上部中央パネル）では、ストレス下での顕著な増加
は見られないことがわかる。
【０１４２】その結果、図１４、左パネルにおける上側
の矢印に示されるように、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用い
たイムノブロット解析により、免疫反応性ＨＭＧ−Ｉタ
ンパク質は、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出液に
おいて、酸素正常状態条件下の細胞の場合よりも多く発
現することがわかる。しかしながら、図１４の左パネル
における下側の矢印に示されるように、免疫反応性ＨＭ
ＧＹタンパク質は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液
において低酸素ストレスによる影響を受けないことがわ
かる。図１４の右パネルに示されるように、低酸素曝露
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞では、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体によ
る顕著な免疫反応性が見られないことがわかる。
【０１４３】低酸素曝露ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びツニ
カマイシン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いる実験により
示された結果は、低酸素により初期事象としてＨＭＧ−
Ｉ／Ｙ ｍＲＮＡの定常状態の細胞レベルが増加し、そ
れに伴ってＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質が増加するという
先の報告 [ジー(Ji, Y. S.) ら、Circ. Res., 83, 295-
304, (1998)]と矛盾する。この明白な矛盾は、各細胞株
の相違を反映しているのかもしれない。
【０１４４】実施例７ ＨＭＧ−Ｉタンパク質の細胞レ
ベルでの局在 細胞下の局在を調べるため、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養物
を低酸素条件に２１時間曝露し、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体
と抗ＳＣ３５抗体とを用いて免疫蛍光顕微鏡によりＨＭ
Ｇ−Ｉタンパク質を検出した。なお、前記抗ＳＣ３５抗
体は、スプライシングの必須因子であるＳＣ３５タンパ
ク質に対する抗体である。本実施例においては、前記抗
ＳＣ３５抗体を、スプライシング因子存在点であるスペ
ックルのマーカーとして使用して、免疫細胞化学的検査
を行なった。
【０１４５】免疫細胞化学的検査を行なった結果、酸素
正常状態下の細胞では、図１５の酸素正常状態の図に示
されるように、ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、主に核に局在
し、弱く、散在的な免疫反応が、核スペックルのみに存
在する免疫反応性ＳＣ３５タンパク質と共−局在するこ
となく細胞質において得られることがわかる。
【０１４６】しかしながら、ＳＣ３５が共−局在する核
スペックルにおいて、より強い免疫反応性が得られ、細
胞質の免疫反応性は、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に
おいて、酸素正常状態の細胞よりも低下した。したがっ
て、ＨＭＧ−Ｉタンパク質がＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におい
て低酸素刺激により誘導されるだけでなく、細胞質から
核に蓄積され、ＨＭＧ−Ｉの発現とＰＳ２Ｖの誘導との
間に相関関係があると考えられる。
【０１４７】実施例８ イン・ビボにおけるＰＳ２遺伝
子のエキソン５スキッピングへのＨＭＧ−Ｉ及びＨＭＧ
Ｙの一過性トランスフェクションの効果 前記サトウ(Sato)らの文献 [サトウ(Sato)ら、J. Neuro
chem., 72, 2498-2505(1999)]に記載の方法に従い、孤
発性アルツハイマー病の脳及び低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−Ｓ
Ｈ細胞のそれぞれから、エキソン５を欠損した選択的ス
プライシング型のＰＳ２遺伝子を得た。
【０１４８】ＰＳ２遺伝子のエキソン５欠損を伴う選択
的スプライシングがＨＭＧ−Ｉ／Ｙにより起こるか否か
を調べるため、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ培養細胞及びＨＥＫ−２
９３Ｔ培養細胞におけるＰＳ２Ｖの誘導に対するＨＭＧ
−Ｉの一過性発現の効果を調べた。イムノブロット解析
の結果を図１６に示し、ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１７に
示す。
【０１４９】図１６に示すように、ＨＭＧ−Ｉトランス
フェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液及びＨＭＧ
−ＩトランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞由来の核抽
出液のそれぞれにおいて、これらのｍｏｃｋトランスフ
ェクト細胞由来の核抽出液よりも、より強い免疫反応性
ＨＭＧ−Ｉタンパク質の発現が見出された。さらに、図
１７のレーン１に示すように、ｍｏｃｋトランスフェク
トＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲア
ッセイにおいて、全長ＰＳ２遺伝子が対応する分子量の
位置において主要転写産物（図１７中、ＰＳ２）として
検出されることがわかる。対照的に、ＨＭＧ−Ｉトラン
スフェクト細胞由来の全ＲＮＡを用いた場合、ＲＴ−Ｐ
ＣＲアッセイにより、図１７のレーン２及びレーン３に
示されるように、全長ＰＳ２である主転写産物（図１７
中、ＰＳ２）だけでなく、ＨＭＧ−Ｉ量依存的に、より
短鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物（図１７中、ＰＳ２Ｖ）も検出
されることがわかる。
【０１５０】異常ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ダイレクトシー
クエンス解析により、エキソン５を欠くＰＳ２のオルタ
ナティブスプライシング産物であることが示される。そ
れに対し、図１７のレーン４及びレーン５に示すよう
に、ＨＭＧ−Ｙの一過性トランスフェクションにより、
ＰＳ２Ｖの弱い誘導が、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において見
られるが、ＨＭＧＹタンパク質は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
由来核抽出液において低酸素により誘導されない。さら
に、図１７に示すように、ＰＳ２Ｖが低酸素により誘導
されない細胞株（図２）であるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に
おいて、ＨＭＧ−Ｉの過剰発現によりＰＳ２Ｖが検出さ
れる。
【０１５１】スプライシングの必須因子の１つであるＵ
１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰは、通常、５’スプライシング
部位に結合することが知られている。したがって、ＨＭ
Ｇ−Ｉは、Ｕ１ｓｎＲＮＰのｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合
を阻害しうることが予想される。そこで、ＳＫ−Ｎ−Ｓ
Ｈ細胞由来の核抽出液におけるＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮ
Ｐのｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合活性に対するＨＭＧ−Ｉ
の効果を調べた。
【０１５２】Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰに対する抗体
〔抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体（サンタクルツバイ
オテクノロジー社製）〕を用い、実験例１３に従い、下
記のように、スーパーシフトアッセイを行なった。
【０１５３】すなわち、５μｇタンパク質相当量の核抽
出物を、１μｇの抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体（サンタクルツ
バイオテクノロジー社製）とともに４℃で８時間インキ
ュベートし、前処理を行なった。得られた前処理産物
を、インキュベーション緩衝液〔組成：６０ｍＭ ＫＣ
ｌと４ｍＭ ＭｇＣｌ2 と１ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭＥ
ＧＴＡと１ｍＭ ＤＴＴと１０％グリセロールと１ｍＭ
ＰＭＳＦとを含有した１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ７．９）〕中２μｇのｔＲＮＡとともに
インキュベートした。ついで、32Ｐ標識ＲＮＡプローブ
〔１μｇ、図４に示されるＮｏ．５プローブ〕を添加し
て、２５℃で３０分間インキュベーションした（全容量
５０μｌ）。得られた反応物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓと
０．３８Ｍグリシンと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した緩
衝液（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル
上、１１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気
泳動することにより、結合プローブと遊離プローブとを
分離した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、ついで
Ｘ線フィルムに曝した。その結果を図１８に示す。
【０１５４】図１８の左パネルに示すように、Ｍｏｃｋ
トランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液に
おけるプローブＮｏ．１２に対する結合活性は、抗Ｕ１
（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体による前処理によって抗体濃
度依存的にスーパーシフトすることがわかる。また、図
１８の左パネルのレーン１、右パネルのレーン１に示す
ように、ＨＭＧ−ＩトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細
胞由来の核抽出液では、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞
由来の核抽出液よりも強い結合活性が見られる。しかし
ながら、これらの結合活性は、図１８、レーン２〜４、
右パネルに示されるように、ＨＭＧ−Ｉトランスフェク
トＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出液では、抗Ｕ１（７０Ｋ）
ｓｎＲＮＰ抗体の添加による影響を受けないことがわか
る。すなわち、これらの結果により、ＨＭＧ−Ｉは、ｐ
ｒｅ−ｍＲＮＡに対するＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの結
合活性を阻害することが示される。
【０１５５】さらに、ＨＭＧ−Ｉによるｐｒｅ−ｍＲＮ
Ａに対するＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの結合活性の阻害
を調べた結果を図１９に示す。
【０１５６】図１９に示されるように、ＨＭＧ−Ｉは、
低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において
は、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰと直接結合するが、酸素
正常状態曝露細胞由来の核抽出液においては、Ｕ１（７
０Ｋ）ｓｎＲＮＰと結合しないことがわかる。
【０１５７】ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞でのＨＭＧ−Ｉ一過性
トランスフェクションは、ＰＳ２Ｖの発現を誘導した
（図１７）。さらに、低酸素曝露によりＰＳ２Ｖが発現
されない細胞株であるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（図２）で
のＨＭＧ−Ｉの過剰発現により、検出可能なＰＳ２Ｖが
観察された（図１７）。したがって、ＰＳ２Ｖは、細胞
でＨＭＧ−Ｉ過剰発現させるだけで誘導されるといえ
る。低酸素刺激よりもＨＭＧ−Ｉ発現の増加がＰＳ２Ｖ
の誘導に必要であることが示唆される。
【０１５８】Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰは、スプライシ
ングの必須因子であり、５’スプライシング部位を認識
し、該５’スプライシング部位に結合する。Ｕ１（７０
Ｋ）ｓｎＲＮＰ認識配列及びＨＭＧ−Ｉ認識配列は、Ｎ
ｏ．５プローブ上で互いに近接している。Ｕ１（７０
Ｋ）ｓｎＲＮＰのＰＳ２ｍＲＮＡへの結合活性は、ＨＭ
Ｇ−ＩトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来の核抽出液
においてインビトロで阻害された（図１８）。
【０１５９】さらに、ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、低酸素
曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においてＵ１
（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰと結合した（図１９）。本実施例
で観察されたＨＭＧ−Ｉと及びＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮ
Ｐの会合は、ＳＦ２／ＡＳＦとＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮ
Ｐとの結合を阻害した後、その結果としてＵ１（７０
Ｋ）ｓｎＲＮＰのｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合活性を抑制
すると思われる。
【０１６０】また、ＨＭＧ−Ｉが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ又
は図２０に示すような他のスプライシング因子へのＵ１
（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの結合を阻害することによって、
Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ
に対する作用を抑制する可能性が示される。
【０１６１】実施例９ ｓＡＤ脳におけるＨＭＧ−Ｉ／
Ｙタンパク質の発現 本当にＨＭＧ−Ｉタンパク質が、ＰＳ２のエキソン５を
欠く選択的スプライシングを誘導するならば、対照脳よ
りもｓＡＤ脳においてより強いＨＭＧ−Ｉの発現が観察
されるはずであることが考えられる。そこで、イムノブ
ロットアッセイにより、対照脳におけるＨＭＧ−Ｉの発
現レベルをｓＡＤ脳における場合と比較した。その結果
を図２１に示す。
【０１６２】図２１の左パネル及び右パネルに示すよう
に、ＨＭＧ−Ｉタンパク質及びＹタンパク質はともに、
年齢がマッチした対照と比べると増加しており、３名の
異なるｓＡＤ患者の海馬由来の全ライセート及び核フラ
クションにおいて発現することがわかる。しかしなが
ら、図２１の中央図に示されるように、海馬のサイトゾ
ルフラクションでは、ｓＡＤ患者と対照との間に顕著な
差はみられないことがわかる。
【０１６３】海馬のＨＭＧ−Ｉ／Ｙ発現領域を特定する
ため、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いて免疫組織化学解析
を行なった。その結果を図２２に示す。図２２に示すよ
うに、ｓＡＤ脳の海馬ＣＡ１領域の錐体細胞層におい
て、対照よりも強い免疫反応性の発現が認められる。
【０１６４】免疫組織化学的解析において、免疫反応性
ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質は、対照脳の海馬由来の核フ
ラクションにおいて検出されたが（図２１）、対照脳の
海馬ＣＡ１領域ではＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質は、ほと
んど検出されなかった（図２２）。これは、ＨＭＧ−Ｉ
／Ｙが対照の海馬の多孔層から分子層にわたって発現し
たためであり、ｓＡＤ脳との比較において違いはなかっ
た。
【０１６５】ｓＡＤの海馬核フラクションでは、ＨＭＧ
−Ｉタンパク質及びＹタンパク質の両方について対照よ
りも強い発現が観察されたが、サイトゾルフラクション
では観察されなかった（図２１）。また、免疫組織学的
検査により、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質は、ｓＡＤ脳の
海馬ＣＡ１領域の錐体細胞において検出された（図２
２）。これらの結果は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質が、
ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合し、ｓＡＤの脳及び細
胞株においてＰＳ遺伝子のエキソン５を欠くスプライシ
ングバリアントを実際に誘導する可能性を示す。
【０１６６】実施例１０ 前記サトウらの文献に従い、神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−Ｓ
Ｈ細胞の全ＲＮＡの調製及びＲＴ−ＰＣＲを行ない、配
列番号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メ
チルオリゴＲＮＡによるプレセニリン−２ｍＲＮＡエキ
ソン５欠損スプライシングバリアントの産生抑制効果に
ついて、以下のように検討した。
【０１６７】神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を１０％
ウシ胎仔血清を含有したダルベッコ最小必須培地〔ギブ
コ ビー・アール・エル社製〕８ｍｌに播種し、各５、
１０、１５μｇの２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列
番号：２７）（それぞれ１５、２０、４５μｌ）を、リ
ポフェクチンによりトランスフェクションした。
【０１６８】前記細胞を5 ％ＣＯ2 、３７℃条件下にて
１６時間培養した。培養１２時間後に培地を交換した。
その後、得られた細胞を低酸素チャンバー（酸素圧８ｔ
ｏｒｒ）中において、さらに２１時間培養した。
【０１６９】ついで、前記と同様に、ＲＮｅａｓｙトー
タルＲＮＡキット〔キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を
用い、全ＲＮＡを抽出、精製した。
【０１７０】得られた全ＲＮＡと、マウスモロニー白血
病ウイルス逆転写酵素〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社
製〕とを用いて、４２℃で１時間逆転写反応を行なっ
た。得られた反応物を鋳型として、１次ＰＣＲを行な
い、さらに得られたＰＣＲ産物を鋳型として２次ＰＣＲ
を行なった。
【０１７１】ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃
３０秒−６０℃３０秒−７２℃１分（最終サイクルにお
いては７２℃２分）を１サイクルとした３０サイクルで
ある。１次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５１（配列番
号：９）とプライマーｐｓ２３１（配列番号：１０）と
を用いた。２次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５２（配
列番号：１１）とプライマーｐｓ２３３（配列番号：１
２）とを用いた。
【０１７２】得られた産物を、５％ポリアクリルアミド
ゲル（ＴＢＥ）を用いて電気泳動し、臭化エチジウム染
色により可視化した。
【０１７３】なお、対照として、２’−Ｏ−メチルオリ
ゴＲＮＡを導入しない神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
由来のＲＮＡを用いた。結果を第２５図に示す。
【０１７４】第２５図に示されるように、２’−Ｏ−メ
チルオリゴＲＮＡを導入ない場合に比べ、導入した場
合、プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライ
シングバリアント（図中、ＰＳ２Ｖ）の産生が抑制され
ることがわかった。
【０１７５】実施例１１ 本発明の医薬組成物〔前記配列番号：２４に示される配
列に存在するＨＭＧ−Ｉタンパク質結合領域のみを含む
配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番
号：２７）〕を導入したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔被検細
胞〕と導入していないＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔対照細胞〕
とを、それぞれ低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の加湿雰囲気下
に維持した低酸素チャンバーを備えたインキュベーター
を用い、３７℃で低酸素下に２１時間、培養し、ＭＴＴ
法 [モッスマン(Mossman,T.)ら, J. Immunol. Methods,
65, 55-59(1985)] により、細胞死を調べる。
【０１７６】被検細胞における神経細胞死が、対照細胞
における神経細胞死よりも抑制されることにより、神経
細胞死抑制効果を有することがわかる。
【０１７７】配列表フリーテキスト 配列番号：１は、結合領域の配列を示す。
【０１７８】配列番号：２は、結合領域の配列を示す。
【０１７９】配列番号：３は、ＲＮＡプローブＮｏ．５
の配列を示す。
【０１８０】配列番号：４は、ＲＮＡプローブＮｏ．７
の配列を示す。
【０１８１】配列番号：５は、ＲＮＡプローブＮｏ．９
の配列を示す。
【０１８２】配列番号：６は、ＲＮＡプローブＮｏ．１
０の配列を示す。
【０１８３】配列番号：７は、ＲＮＡプローブＮｏ．１
１の配列を示す。
【０１８４】配列番号：８は、ＲＮＡプローブＮｏ．８
の配列を示す。
【０１８５】配列番号：９は、プライマーｐｓ２５１の
配列を示す。
【０１８６】配列番号：１０は、プライマーｐｓ２３１
の配列を示す。
【０１８７】配列番号：１１は、プライマーｐｓ２５２
の配列を示す。
【０１８８】配列番号：１２は、プライマーｐｓ２３３
の配列を示す。
【０１８９】配列番号：１３は、ＤＮＡプローブＮｏ．
１の配列を示す。
【０１９０】配列番号：１４は、ＤＮＡプローブＮｏ．
２の配列を示す。
【０１９１】配列番号：１５は、ＤＮＡプローブＮｏ．
３の配列を示す。
【０１９２】配列番号：１６は、ＤＮＡプローブＮｏ．
４の配列を示す。
【０１９３】配列番号：１７は、ＤＮＡプローブＮｏ．
５の配列を示す。
【０１９４】配列番号：１８は、ＤＮＡプローブＮｏ．
６の配列を示す。
【０１９５】配列番号：１９は、ＤＮＡプローブＮｏ．
７の配列を示す。
【０１９６】配列番号：２０は、ＤＮＡプローブＮｏ．
８の配列を示す。
【０１９７】配列番号：２１は、ＤＮＡプローブＮｏ．
９の配列を示す。
【０１９８】配列番号：２２は、ＤＮＡプローブＮｏ．
１０の配列を示す。
【０１９９】配列番号：２３は、ＤＮＡプローブＮｏ．
１１の配列を示す。
【０２００】配列番号：２４は、アフィニティカラムの
リガンドとして用いた５’−アミノ−２’−Ｏ−メチル
オリゴＲＮＡの配列を示す。
【０２０１】配列番号：２５は、ＲＮＡプローブＮｏ．
６の配列を示す。
【０２０２】配列番号：２６は、ＲＮＡプローブＮｏ．
１２の配列を示す。
【０２０３】配列番号：２７は、配列番号：２４中に存
在するＨＭＧ−Ｉタンパク質結合領域の配列に対応する
２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの配列を示す。
【０２０４】
【発明の効果】本発明の阻害剤によれば、ＨＭＧ−Ｉタ
ンパク質とプレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５との結
合を阻害することができ、それにより、スプライシング
異常に起因する疾患、特に該神経変性疾患を治療及び／
又は予防することが可能になるという優れた効果を奏す
る。また、本発明の神経細胞死抑制剤によれば、プレセ
ニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制
し、それにより神経細胞死を抑制することができるとい
う優れた効果を奏する。さらに本発明の医薬組成物によ
れば、神経細胞死を抑制することでき、プレセニリン−
２ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの
産生に起因する疾患、特に脳障害の治療又は予防に有用
である。
【０２０５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <110> Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Pharmaceutical composition <130> M-13-003 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for binding region. <400> 1 gcucuacaag 10
【０２０６】 <210> 2 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for binding region. <400> 2 gcugcuacaa g 11
【０２０７】 <210> 3 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 5 . <400> 3 ugguggugcu cuacaaguac cgcugcuaca aggugaggcc cu 42
【０２０８】 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 7 . <400> 4 gcucuacaag gcugcuacaa g 21
【０２０９】 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 9 . <400> 5 ugguggugcu cuacaagua 19
【０２１０】 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 1 0. <400> 6 gcucuacaag uaccgcugcu acaag 25
【０２１１】 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 1 1. <400> 7 ccgcugcuac aaggugaggc ccu 23
【０２１２】 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 8 . <400> 8 gcucuaaaag uaccgcugcu aaaag 25
【０２１３】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA primer ps25 1. <400> 9 attcagacct ctctgcggcc 20
【０２１４】 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA primer ps23 1. <400> 10 aagcgggagc caaagtctgg 20
【０２１５】 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA primer ps25 2. <400> 11 gttcgtggtg cttccagagg 20
【０２１６】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA primer ps23 3. <400> 12 ggaccactct gggaggtaca 20
【０２１７】 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 1 . <400> 13 tctggatcct gccttctccc tcagcatcta cacgacattc actgaggaca cgaattcaga 60
【０２１８】 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 2 . <400> 14 tctggatcct gaggacacac cctcggtggg ccagcgcctc ctcaactccg tgaattcaga 60
【０２１９】 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 3 . <400> 15 tctggatccc aactccgtgc tgaacaccct catcatgatc agcgtcatcg tgaattcaga 60
【０２２０】 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 4 . <400> 16 ctcggatcct gatcagcgtc atcgtggtta tgaccatctt cttggtggtg cgaattcgag 60
【０２２１】 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 5 . <400> 17 tctggatcct ggtggtgctc tacaagtacc gctgctacaa ggtgaggccc tgaattcaga 60
【０２２２】 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 6 . <400> 18 gatccgacca tcttcttggt ggtg 24
【０２２３】 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 7 . <400> 19 gatccgctct acaaggctgc tacaagg 27
【０２２４】 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 8 . <400> 20 gatccgctct aaaagtaccg ctgctaaaag g 31
【０２２５】 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 9 . <400> 21 tctggatcct ggtggtgctc tacaagtaga attcaga 37
【０２２６】 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 1 0. <400> 22 tctggatccg ctctacaagt accgctgcta caaggaattc aga 43
【０２２７】 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for DNA probe No. 1 1. <400> 23 tctggatccc cgctgctaca aggtgaggcc ctgaattcag a 41
【０２２８】 <210> 24 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for 5'-amino-2'-O-m ethyl oligo RNA which is used as ligand for affinity column. <400> 24 aucuucuugg uggugcucua caaguaccgc ugcuacaagg ugaggcccu 49
【０２２９】 <210> 25 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 6 . <400> 25 gaccaucuuc uugguggu 18
【０２３０】 <210> 26 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for RNA probe No. 1 2. <400> 26 ugguggugcu cuacaaguac cgcugcuaca aggugaggcc cuggcccugc ccuccagcca 60 cgcuucucuc cg 72
【０２３１】 <210> 27 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sequence for 2'-O-methyl oli go RNA corresponding to a sequence of HMG-I protein binding region which is present in SEQ ID NO: 24. <400> 27 gcucuacaag uaccgcugcu acaag 25
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｓＡＤの脳及び培養細胞株におけるＰ
Ｓ２Ｖの発現を示す図である。左パネルは、代表的なｓ
ＡＤ脳又は年齢がマッチした対照脳由来の増幅産物をポ
リアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色
により可視化した結果である。右パネルは、正常酸素状
態、低酸素曝露、ツニカマイシン（ＴＭ）、β−アミロ
イドの各ストレス下の種々の細胞由来の全ＲＮＡをＲＴ
−ＰＣＲに供し、得られたＰＣＲ産物をポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化
した結果である。図中、黒矢印は、ＰＳ２（上部）及び
ＰＳ２Ｖ（下部）に対応する分子量点を示す。これらの
実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り
返し、同様の結果を得たものである。
【図２】図２は、ｓＡＤ脳及び対照脳のそれぞれにおけ
るＰＳ２Ｖの免疫組織化学検出を行なった結果を示す図
である。厚さ１０μｍの対照及びｓＡＤの脳切片を作製
し、続いて抗ＳＳＭＡＧ抗体を用いるＰＳ２Ｖの免疫組
織化学的検出をおこなった。これらの結果は、少なくと
も３種の異なる対照及びＡＤの脳を解析し、同様の結果
を得たものである。
【図３】図３は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法の概略を
示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、酸素正常状態又
は低酸素刺激の２１時間後に回収した後、核抽出液を調
製し、続いてＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ断片の各プロー
ブと結合反応させる。反応液に紫外（ＵＶ）光を照射し
た後、ＲＮアーゼＡを用いてプローブを消化し、続いて
ＳＤＳ処理を行なう。ＳＤＳ処理した試料を、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥアッセイにより分離した後、Ｂａｓ用イメージ
ングプレートを用いて結合陽性バンドを検出する。
【図４】図４は、ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブの
概略図である。図中、結合実験法のためのＰＳ２ ｐｒ
ｅ−ｍＲＮＡ断片の６種のプローブを概略的に示す。枠
で囲んだ領域及び下線部は、それぞれエキソン及びイン
トロンを表す。全てのプローブは、インビトロ転写によ
り標識される。
【図５】図５は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法の結果を
示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は
低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収した。各
放射性標識プローブを用いるｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験
法により、回収した細胞由来の核抽出液を解析した。次
いで、濃度勾配（１０〜２０％）ポリアクリルアミドゲ
ル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｂａｓ用イメージ
ングプレートに曝した。これらの実験は、別個の細胞培
養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得
たものである。
【図６】図６は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法の結果を
示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は
低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収した。核
抽出液を各35Ｓ−非標識コールドプローブとともに結合
条件下で前インキュベートした。前インキュベートした
反応液を用いるｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法を、各35Ｓ
−標識ホットプローブの添加により開始し、次いで、１
５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
した後、Ｂａｓ用イメージングプレートに曝した。これ
らの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回
繰り返し、同様の結果を得たものである。
【図７】図７は、低酸素ストレス下のヒト神経芽細胞腫
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出液由来のＮｏ．５プローブ結
合活性を有するフラクションの精製プロフィールを示
す。精製方法はイタリック体で示す。個々のフラクショ
ンをローマ数字で示す。
【図８】図８は、図７に示される各精製段階におけるタ
ンパク質（２５μｌ／フラクション）を１５％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ及び銀染色により解析した結果を示す図であ
る。図中、Ｍは、分子量（ｋＤａ）マーカーを示す。
【図９】図９は、35Ｓ−標識Ｎｏ．５プローブと各精製
段階におけるフラクション（１５μｌ／フラクション）
との結合活性を示す図である。
【図１０】図１０は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対す
る抗体を用いたスーパーシフトアッセイの結果を示す図
である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態（左図）又
は低酸素（右図）の刺激の２１時間後に回収した。放射
能標識したＮｏ．５プローブと反応させる前に、ＨＭＧ
−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体の存在下又は非存在下
で、通常のバッファー中で核抽出液をインキュベートし
た。次いで、試料をゲル遅延電気泳動及びオートラジオ
グラフィーに供した。これらの実験は、別個の細胞培養
物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得
た。
【図１１】図１１は、ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡの７種
類の構造を示す図である。図中、エキソンを大文字で示
し、イントロンを小文字で示す。２個の類似配列を太字
で示し、下線を付す。
【図１２】図１２は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質のＰＳ２
ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおける結合部位を調べた結果を示す
図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は低酸
素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収する。各放射
能標識プローブを用いるｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法に
より、回収した細胞由来の核抽出液を解析する。次い
で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｂａｓ用イメージン
グプレートに曝す。図中、黒矢印は、対応する分子量点
を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少
なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
【図１３】図１３は、培養細胞におけるＨＭＧ−Ｉ ｍ
ＲＮＡ（図中、ＨＭＧＩ ｍＲＮＡ）及び該ｍＲＮＡに
対応するタンパク質の発現に対する種々のストレスの影
響をノーザンブロット解析により調べた結果を示す図で
ある。左パネル及び中央パネルは、酸素正常状態又は低
酸素に曝露した後、曝露の２１時間後に回収した細胞株
について解析した結果を示す。右パネルは、ツニカマイ
シン処理し、２４時間後に回収したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
について解析した結果を示す。全ＲＮＡをホルムアルデ
ヒド−ホルムアミドゲル電気泳動し、放射能標識したＨ
ＭＧ−Ｉ ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット
アッセイに供す。図中、分子量点を黒矢印で示す。
【図１４】図１４は、培養細胞におけるＨＭＧ−Ｉ ｍ
ＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに対応するタンパク質の発現に対
する種々のストレスの影響をウエスタンブロット解析に
より調べた結果を示す図である。各細胞株を、酸素正常
状態又は低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収
する。得られた核抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＭＧ
−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体を用いてイムノブロッ
トアッセイに供す。図中、黒矢印は、ＨＭＧ−Ｉ（上
部、図中、「ＨＭＧＩ」）及びＨＭＧ−Ｙ（下部、図
中、「ＨＭＧＹ」）タンパク質の対応する分子量点を示
す。
【図１５】図１５は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞における免疫
反応性ＨＭＧ−Ｉタンパク質の細胞下局在に対する低酸
素の影響を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正
常状態又は低酸素に２１時間曝露する。細胞を、一次免
疫反応のために抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ（図中、「ＨＭＧＩ／
Ｙ」）抗体及び抗ＳＣ３５抗体で免疫染色した後、ＦＩ
ＴＣ結合二次抗体及びＣｙ３結合二次抗体で染色する。
これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも
４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
【図１６】図１６は、培養細胞におけるＰＳ２遺伝子の
エキソン５スキッピングに対するＨＭＧ−Ｉ又はＨＭＧ
−Ｙの一過性発現の効果を調べた結果を示す図である。
各細胞株にｍｏｃｋ又はＨＭＧ−Ｉのトランスフェクシ
ョンを行った後、トランスフェクションの２４時間後に
回収した。核抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＨＭＧ−
Ｉ／Ｙに対する抗体を用いてイムノブロットアッセイに
供した。黒矢印は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質（図中、「Ｈ
ＭＧＩ」）の対応する分子量点を示す。これらの実験
は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返
し、同様の結果を得たものである。
【図１７】図１７は、培養細胞におけるＰＳ２遺伝子の
エキソン５スキッピングに対するＨＭＧ−Ｉ又はＨＭＧ
−Ｙの一過性発現の効果を調べた結果を示す図である。
各細胞株に、異なる量のｍｏｃｋ、ＨＭＧ−Ｉ（図中、
「ＨＭＧＩ」）又はＨＭＧ−Ｙ（図中、「ＨＭＧＹ」）
のトランスフェクションを行った後、トランスフェクシ
ョンの２４時間後に回収した。回収した細胞由来の全Ｒ
ＮＡを、文献 [サトウ(Sato)ら、J. Neurochem., 72, 2
498-2505 (1999)]の方法によりＲＴ−ＰＣＲに供した。
増幅産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エ
チジウム染色により可視化した。黒矢印は、ＰＳ２（上
部）及びＰＳ２Ｖ（下部）の対応する分子量点を示す。
これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも
４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
【図１８】図１８は、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのＰＳ
２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合に対するＨＭＧ−Ｉ（図
中、「ＨＭＧＩ」）の効果を調べた結果を示す図であ
る。回収した細胞由来の核抽出液を、上部パネルに示し
たＮｏ．１２のプローブ（32Ｐ標識）と反応させる前
に、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体の存在下又
は非存在下で、通常のバッファー中でインキュベートし
た。次いで、試料をゲル遅延電気泳動及びオートラジオ
グラフィーに供した。図中、黒矢印は、遊離、結合及び
スーパーシフトしたプローブを示す。また、図中Ａｂ
は、抗Ｕ１ ｓｎＲＮＰ抗体を示す。これらの実験は、
別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同
様の結果を得たものである。
【図１９】図１９は、ＨＭＧ−Ｉ／ＹとＵ１（７０Ｋ）
ｓｎＲＮＰとの相互作用を示す図である。上部パネル
は、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体を用いてイムノブ
ロットアッセイを行なった結果を示す。酸素正常状態又
は低酸素に曝露したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を刺激の２４時
間後に回収した後、核抽出液を調製した。核抽出液を抗
ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体（図中、「抗ＨＭＧＩ／Ｙ抗体」）
により免疫沈降させた後、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ
抗体を用いてイムノブロットアッセイを行なった。下部
パネルは、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いてイムノブロッ
トアッセイを行なった結果を示す。核抽出液を抗Ｕ１
（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体により免疫沈降させた後、抗
ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いてイムノブロットアッセイを
行なった。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて
少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得たものであ
る。
【図２０】図２０は、ＰＳ２ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上の異
常スプライシング機構の仮説の概略図である。
【図２１】図２１は、ｓＡＤ脳におけるＨＭＧ−Ｉ／Ｙ
タンパク質の発現をウエスタンブロット解析により調べ
た結果を示す図である。全ライセート、サイトゾルフラ
クション及び核フラクションを、３例の異なるｓＡＤ脳
及び年齢がマッチした対照の海馬から調製した。これら
のフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＨＭＧ−Ｉ／
Ｙタンパク質に対する抗体を用いるイムノブロットアッ
セイに供した。黒矢印は、ＨＭＧ−Ｉ（上部、図中、
「ＨＭＧＩ」）及びＨＭＧ−Ｙ（下部、図中、「ＨＭＧ
Ｙ」）タンパク質の対応する分子量点を示す。
【図２２】図２２は、ｓＡＤ脳におけるＨＭＧ−Ｉ／Ｙ
タンパク質の発現を免疫組織化学により調べた結果を示
す図である。少なくとも３種の異なる対照及びＡＤの脳
を解析し、常に同様の結果を得たものである。厚さ１０
μｍの対照及びｓＡＤの脳切片を作製し、続いて免疫反
応性ＨＭＧ−Ｉ／Ｙの免疫組織化学的検出をおこなっ
た。少なくとも３種の異なる対照及びＡＤの脳を解析
し、常に同様の結果を得たものである。
【図２３】図２３は、合成された各オリゴヌクレオチド
を示す図である。慣用の方法によりした。２４マー又は
６０マーの塩基長を有する２種の相補的なオリゴヌクレ
オチドを用いてアニーリングを行ない、Ｎｏ．１〜Ｎ
ｏ．１１の各二本鎖ＤＮＡを得た。なお、図中、各オリ
ゴヌクレオチドにおいて、ＰＳ２のエキソン５の各断片
を下線を付し、太字で示す。
【図２４】図２４は、２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡに
よるプレセニリン−２遺伝子エキソン５欠損スプライシ
ングバリアントの産生抑制効果を調べた結果を示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 25/16 25/16 25/28 25/28 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 池田 陽子 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 片山 泰一 大阪府池田市鉢塚３丁目５−11 (72)発明者 眞部 孝幸 大阪府茨木市郡５丁目14−12 キャピタル グレース502 (72)発明者 今泉 和則 奈良県生駒市高山町8916−５，Ｂ−304 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 CA11 CA20 HA17 HA20 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZB21 ZC41 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZB21 ZC41

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−
    ２ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害する化合物を有効
    成分として含有してなる、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレ
    セニリン−２遺伝子との間の結合の阻害剤。
  2. 【請求項２】 該化合物が、（Ａ）配列番号：１に示さ
    れる塩基配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配
    列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＲＮ
    Ａ分子、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列に対応
    するＤＮＡ配列及び／又は配列番号：２に示される塩基
    配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタ
    ンパク質と結合するＤＮＡ分子、（Ｃ）前記（Ａ）のＲ
    ＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的な
    アンチセンス分子、（Ｄ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は
    （Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、か
    つＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
    （Ｅ）前記（Ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
    からなる群より選択された１種である、請求項１記載の
    阻害剤。
  3. 【請求項３】 該化合物が、（ａ）配列番号：３、４、
    ５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列を含有
    し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＲＮＡ分
    子、（ｂ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいず
    れかに示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有
    し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＤＮＡ分
    子、（ｃ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ
    分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、（ｄ）前
    記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれ
    かのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結
    合するアナログ分子、及び（ｅ）前記（ｃ）のアンチセ
    ンス分子のアナログ分子、からなる群より選択された１
    種である、請求項２記載の阻害剤。
  4. 【請求項４】 該化合物が、配列番号：２７に示される
    塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子で
    ある、請求項１又は２記載の阻害剤。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４いずれか１項に記載の阻害
    剤を有効成分として含有してなる神経細胞死抑制剤。
  6. 【請求項６】 請求項１〜４いずれか１項に記載の阻害
    剤又は請求項５記載の神経細胞死抑制剤を有効成分とし
    て含有してなる医薬組成物。
  7. 【請求項７】 スプライシング異常を抑制する作用を有
    する、請求項６記載の医薬組成物。
  8. 【請求項８】 プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠
    損スプライシングバリアントの産生を抑制する作用を有
    する、請求項６又は７記載の医薬組成物。
  9. 【請求項９】 プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５欠
    損スプライシングバリアントの産生に起因する脳障害を
    治療又は予防しうる、請求項６〜８いずれか１項に記載
    の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 該脳障害が、虚血性脳疾患又は神経変
    性疾患である、請求項９記載の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 該脳障害が、脳血管性痴呆、パーキン
    ソン症候群及びアルツハイマー病からなる群より選ばれ
    た疾患である、請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】 プレセニリン−２ｍＲＮＡエキソン５
    欠損スプライシングバリアントの産生に起因する脳障害
    の治療又は予防用の薬剤の製造のための、請求項１〜４
    いずれか１項に記載の阻害剤若しくは請求項５記載の神
    経細胞死抑制剤の使用。
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