KR20040028796A

KR20040028796A - 의약 조성물

Info

Publication number: KR20040028796A
Application number: KR10-2003-7017002A
Authority: KR
Inventors: 도야마마사야; 가따야마다이이찌; 마나베다까유끼; 이마이즈미가즈노리; 이께다요꼬
Original assignee: 다이쇼 세이야꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2004-04-03
Also published as: JP2003012548A; EP1413314A4; JP4000313B2; AU2002346223B2; JPWO2003002146A1; WO2003002146A1; CA2451850A1; US20050065102A1; CN1592637A; EP1413314A1

Abstract

본 발명은 뇌장해, 신경변성 질환 등의 질환데 대한 보다 효율적이고, 지속성이 높은 치료 또는 예방에 유용한 수단을 제공하는 것이다. 본 발명은 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해할 수 있는 저해제, 신경세포사를 억제할 수 있는 신경세포사 억제제, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손형 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방에 유용한 의약 조성물, 이 질환의 치료 또는 예방 방법 및 이 저해제의 사용에 관한 것이다.

Description

의약 조성물{MEDICINAL COMPOSITIONS}

신경변성 질환의 하나인 알츠하이머병 (AD) 은 90 % 를 넘는 AD 환자의 질환이 고발성 알츠하이머병 (sAD) 으로 분류된다. sAD 환자의 대뇌 피질 및 해마 (CA1) 영역의 각각의 아포토시스성 추체 세포에, 프레세닐린-2 유전자의 변이체가 코드하는 이상 (異常) 단백질 (PS2V) 이 존재하는 것으로 알려져 있다 [사토 (Sato, N.) 외, J. Biol. Chem., 276, 2108-2114 (2001)].

PS2V 는 인간 신경아세포종 SK-N-SH 배양 세포에 있어서 저산소 자극에 의해 유도되고, 산화 스트레스 및 SK-N-SH 세포에서의 새로운 단백질 합성에 의존하는 것으로 나타나 있다 [사토 (Sato, N.) 외, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)].

상기 PS2V 에 의해, 소포체 (ER) 스트레스 응답성 분자 샤프롱인 글루코스 조절 단백질 (GRP 78) 이 감소하고, PS2V 발현 세포에서 β-아미로이드 단백질의생성이 증가하는 것으로 알려져 있다 [사토 (Sato, N.) 외, J. Biol. Chem., 276, 2108-2114 (2001)].

그러나 현재로서는, PS2V 가 sAD 에서의 뉴론사의 중요 인자의 하나일 가능성은 시사되고 있으나, PS2V 의 생성, 질환 발증에서의 상세한 메카니즘이 충분히 알려져 있지 않다. 또한 현재로서는, 상기 PS2V 의 생성에 기인하는 질환의 유효한 치료법이 요망되고 있다.

발명의 개시

본 발명은 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해할 수 있는 저해제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하고, 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제하고, 이에 의하여 신경세포사를 억제할 수 있는 신경세포사 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 게다가 본 발명은 세포사, 특히 신경세포사를 억제하는 것, 세포에 대한 도입 효율이 우수한 것, 생체 내에서의 안정성이 우수한 것 및 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 특히 뇌장해, 신경변성 질환 등의 치료 또는 예방의 적어도 하나를 달성할 수 있는 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환 특히 뇌장해, 신경변성 질환 등의 치료 또는 예방을 더욱 효율적 지속적으로 행할 수 있는, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉 본 발명은,

[1] HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유하여 이루어지는, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합의 저해제,

[2] 이 화합물이,

(A) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 RNA 분자,

(B) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 DNA 분자,

(C) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(D) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인, 상기 [1] 에 기재된 저해제,

[3] 이 화합물이.

(a) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 RNA 분자,

(b) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 DNA 분자,

(e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인, 상기 [2] 에 기재된 저해제,

[4] 이 화합물이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 분자인, 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 저해제,

[5] HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유한, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합의 저해제를 유효 성분으로 함유하여 이루어지는 신경세포사 억제제,

[6] 이 화합물이,

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인, 상기 [5] 에 기재된 신경세포사 억제제,

[7] 이 화합물이.

(e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인, 상기 [6] 에 기재된 신경세포사 억제제,

[8] 이 화합물이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 분자인, 상기 [5] 또는 [6] 에 기재된 신경세포사 억제제,

[9] HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유한, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합의 저해제, 또는

이 저해제를 유효 성분으로 함유한 신경세포사 억제제,

를 유효 성분으로 함유하여 이루어지는 의약 조성물,

[10] 이 화합물이,

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인, 상기 [9] 에 기재된 의약 조성물,

[11] 이 화합물이,

(e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인, 상기 [10] 에 기재된 의약 조성물,

[12] 이 화합물이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 분자인, 상기 [9] 또는 [1] 에 기재된 의약 조성물,

[13] 스플라이싱 이상을 억제하는 작용을 갖는, 상기 [9] ~ [12] 의 어느 한 항에 기재된 의약 조성물,

[14] 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성을 억제하는 작용을 갖는, 상기 [9] ~ [13] 의 어느 한 항에 기재된 의약 조성물,

[15] 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 뇌장해 또는 신경변성 질환을 치료 또는 예방할 수 있는, 상기 [9] ~ [14] 의 어느 한 항에 기재된 의약 조성물,

[16] 이 뇌장해가, 허혈성 뇌질환 또는 뇌신경변성 질환인, 상기 [15] 에 기재된 의약 조성물,

[17] 이 뇌장해가, 뇌혈관성 치매, 파킨슨 증후군 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택된 질환인, 상기 [16] 에 기재된 의약 조성물,

[18] 이 신경변성 질환이, 근위축성 측색 경화증인, 상기 [15] 에 기재된 의약 조성물,

[19] 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 개체에 투여하고, 이에 의해 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 상기 [1] ~ [4] 중 어느 한 항에 기재된 저해제 또는 상기 [5] ~ [8] 중 어느 한 항에 기재된 신경세포사 억제제의 사용, 그리고

[20] 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 개체에, 상기 [1] ~ [4] 중 어느 한 항에 기재된 저해제 또는 상기 [5] ~ [8] 의 어느 1 항에 기재된 신경세포사 억제제를 치료상 유효량 투여하는 것을 특징으로 하는, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방 방법,

에 관한다.

본 발명은 HMG-I 단백질과 프레세닐린(presenilin)-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해할 수 있는 저해제, 신경세포사를 억제할 수 있는 신경세포사 억제제, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손형 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방에 유용한 의약 조성물, 이 질환의 치료 또는 예방 방법 및 이 저해제의 사용에 관한 것이다.

도 1 은, sAD 의 뇌 및 배양 세포주에서의 PS2V 의 발현을 나타내는 도면이다. 좌 패널은 대표적인 sAD 뇌 또는 연령이 매치된 대조 뇌 유래의 증폭 산물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화한 결과이다. 우 패널은 정상 산소 상태, 저산소 노출, 투니카마이신 (TM), β-아미로이드의 각 스트레스 하의 각종 세포 유래의 전체 RNA 를 RT-PCR 에 제공하고, 얻어진 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화한 결과이다. 도면 중에서 흑색 화살표는 PS2 (상부) 및 PS2V (하부) 에 대응하는 분자량점을 나타낸다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하고, 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 2 는, sAD 의 뇌 및 대조 뇌의 각각에서의 PS2V 의 면역 조직 화학 검출을 실시한 결과를 나타낸 도면이다. 두께 10 ㎛ 의 대조 및 sAD 의 뇌 절편을 만들고, 이어서 항 SSMAG 항체를 사용하는 PS2V 의 면역 조직 화학적 검출을 실시하였다. 이들 결과는 적어도 3 종의 상이한 대조 및 AD 의 뇌를 해석하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 3 은, pre-mRNA 결합 실험법의 개략을 나타낸 도면이다. SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태 또는 저산소 자극 21 시간 후에 회수한 후 핵 추출액을 조제하고, 이어서 PS2 pre-mRNA 단편의 각 프로브와 결합 반응시켰다. 반응액에 자외 (UV) 광을 조사한 후 RN-아제 A 를 사용하여 프로브를 소화시키고, 계속하여 SDS 처리를 실시하였다. SDS 처리한 시료를, SDS-PAGE 어세이에 의해 분리한 후 Bas 용 이메징 플레이트를 사용하여 결합 양성 밴드를 검출하였다.

도 4 는, PS2 pre-mRNA 프로브의 개략도이다. 도면 중에서 결합 실험법을 위한 PS2 pre-mRNA 단편의 6 종의 프로브를 개략적으로 나타내었다. 사각형 속의 영역 및 하선부는 각각 엑손 및 인트론을 나타낸다. 모든 프로브는 시험관내 전사에 의해 표지되었다.

도 5 는, PS2 pre-mRNA 결합 실험법의 결과를 나타낸 도면이다. SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태 또는 저산소에 노출시킨 후, 자극 21 시간 후에 회수하였다. 각 방사성 표지 프로브를 사용하는 pre-mRNA 결합 실험법에 의해, 회수한 세포 유래의 핵 추출액을 해석하였다. 이어서, 농도 구배 (10 ~ 20 %) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 에 넣은 후 Bas 용 이메징 플레이트에 노출시켰다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 6 은, pre-mRNA 결합 실험법의 결과를 나타낸 도면이다. SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태 또는 저산소에 노출시킨 후 자극 21 시간 후에 회수하였다. 핵 추출액을 각³⁵S-비표지 콜드 프로브와 함께 결합 조건 하에서 예비 인큐베이트하였다. 예비 인큐베이트 반응액을 사용하는 pre-mRNA 결합 실험법을 각³⁵S-표지 콜드 프로브의 첨가에 의해 개시하고, 이어서 15 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 에 넣은 후 Bas 용 이메징 플레이트에 노출시켰다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 7 은, 저산소 스트레스 하의 인간 신경아세포종 SK-N-S H 세포 핵 추출액 유래의 No.5 프로브 결합 활성을 갖는 분획의 정제 프로필을 나타낸다. 정제방법은 이탤릭체로 표시하였다. 각각의 분획을 로마 숫자로 표시하였다.

도 8 은, 도 7 에 나타낸 각 정제단계에서의 단백질 (25 ㎕/분획) 을 15 % SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중에서 M 은 분자량 (kDa) 마커를 나타낸다.

도 9 는,³⁵S-표지 No.5 프로브와 각 정제단계에서의 분획 (15 ㎕/분획) 의 결합 활성을 나타내는 도면이다.

도 10 은, HMG-I/Y 단백질에 대한 항체를 사용한 수퍼 시프트 어세이의 결과를 나타내는 도면이다. SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태 (좌측 도) 또는 저산소 (우측 도) 의 자극 21 시간 후에 회수하였다. 방사능 표시한 No.5 프로브와 반응시키기 전에 HMG-I/Y 단백질에 대한 항체의 존재 하 또는 비존재 하에서 통상의 버퍼 중에서 핵 추출액을 인큐베이트하였다. 이어서 시료를 겔 지연 전기영동 및 오토 라디오 그래피에 제공하였다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻었다.

도 11 은, PS2 pre-mRNA 의 7 종류의 구조를 나타내는 도면이다. 도면 중에서 엑손을 대문자로 표시하고, 인트론을 소문자로 표시하였다. 2 개의 유사 서열을 굵은 문자로 표시하고 밑줄을 그었다.

도 12 는 HMG-I 단백질의 PS2 pre-mRNA 에서의 결합 부위를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태 또는 저산소에 노출시킨 후 자극 21 시간 후에 회수하였다. 각 방사능 표지 프로브를 사용하는 pre-mRNA 결합 실험법에 의해, 회수한 세포 유래의 핵 추출액을 해석하였다. 이어서 SDS-PAGE 에 넣은 후 Bas 용 이메징 플레이트에 노출시켰다. 도면 중에서 흑색 화살표는 대응하는 분자량점을 나타낸다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 13 은, 배양 세포에서의 HMG-I mRNA (도면 중 HMG I mRNA) 및 mRNA 에 대응하는 단백질의 발현에 대한 각종 스트레스의 영향을 노던 블롯 해석에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 좌 패널 및 중앙 패널은 산소 정상 상태 또는 저산소에 노출시킨 후, 노출 21 시간 후에 회수하였다. 세포주에 대해 해석한결과를 나타낸다. 우 패널은 투니카마이신 처리하고, 24 시간 후에 회수한 SK-N-SH 세포에 대해 해석한 결과를 나타낸다. 전체 RNA 를 포름알데히드-포름아미드 겔 전기영동하고, 방사능 표시한 HMG-I cDNA 프로브를 사용한 노던 블롯 어세이에 제공하였다. 도면 중에서 분자량점을 흑색 화살표로 나타낸다.

도 14 는, 배양 세포에서의 HMG-I mRNA 및 mRNA 에 대응하는 단백질의 발현에 대한 각종 스트레스의 영향을 웨스턴 블롯 해석에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 각 세포주를 산소 정상 상태 또는 저산소에 노출시킨 후 자극 21 시간 후에 회수하였다. 얻어진 핵 추출액을 SDS-PAGE 및 HMG-I/Y 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 어세이에 제공한다. 도면 중에서 흑색 화살표는 HMG-I (상부, 도면 중「HMG I」) 및 HMG-Y (하부, 도면 중「HMG Y」) 단백질의 대응하는 분자량점을 나타낸다.

도 15 는, SK-N-SH 세포에서의 면역 반응성 HMG-I 단백질의 세포하 국재에 대한 저산소의 영향을 나타내는 도면이다. SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태 또는 저산소에 21 시간 노출하였다. 세포를 일차 면역 반응을 위해 항 HMG-I/Y (도면 중「HMG I/Y」) 항체 및 항 SC35 항체에 의해 면역 염색한 후, FITC 결합 이차 항체 및 Cy3 결합 이차 항체에 의해 염색하였다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 16 은, 배양 세포에서의 PS2 유전자의 엑손 5 스키핑에 대한 HMG-I 또는 HMG-Y 의 일과성 발현의 효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 각 세포주에 mock 또는 HMG-I 의 트랜스펙션을 실시한 후, 트랜스펙션의 24 시간 후에 회수하였다. 핵 추출액을 SDS-PAGE, 및 HMG-I/Y 에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 어세이에 제공하였다. 흑색 화살표는 HMG-I 단백질 (도면 중「HMG I」) 의 대응하는 분자량점을 나타낸다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 17 은, 배양 세포에서의 PS2 유전자의 엑손 5 스키핑에 대한 HMG-I 또는 HMG-Y 의 일과성 발현 효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 각 세포주에 상이한 양의 mock, HMG-I (도면 중「HMG I」) 또는 HMG-Y (도면 중「HMG Y」) 의 트랜스펙션을 실시한 후, 트랜스펙션의 24 시간 후에 회수하였다. 회수한 세포 유래의 전체 RNA 를, 문헌 [사토 (Sato) 외, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)] 의 방법에 의해 RT-PCR 에 제공하였다. 증폭 산물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화하였다. 흑색 화살표는 PS2 (상부) 및 PS2V (하부) 의 대응하는 분자량점을 나타낸다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 18 은, U1 (70K) snRNP 의 PS2 pre-mRNA 로의 결합에 대한 HMG-I (도면 중「HMG I」) 의 효과를 조사한 결과를 나타낸 도면이다. 회수한 세포 유래의 핵 추출액을 상부 패널에 나타낸 No.12 의 프로브 (³²P 표지) 와 반응시키기 전에, HMG-I/Y 단백질에 대한 항체의 존재 하 또는 비존재 하에서 통상의 버퍼 내에서 인큐베이트하였다. 이어서 시료를 겔 지연 전기영동 및 오토 라디오 그래피에 제공하였다. 도면 중에서 흑색 화살표는 유리, 결합 및 수퍼 시프트한 프로브를나타낸다. 또한 도면 중에서 Ab 는 항 U1 snRNP 항체를 나타낸다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 19 는, HMG-I/Y 와 U1 (70K) snRNP 의 상호 작용을 나타낸 도면이다. 상부 패널은 항 U1 (70K) snRNP 항체를 사용하여 면역 블롯 어세이를 실시한 결과를 나타낸다. 산소 정상 상태 또는 저산소에 노출시킨 SK-N-SH 세포를 자극 24 시간 후에 회수한 후, 핵 추출액을 조제하였다. 핵 추출액을 항 HMG-I/Y 항체 (도면 중「항 HMG I/Y 항체」) 에 의해 면역 침강시킨 후, 항 U1 (70K) snRNP 항체를 사용하여 면역 블롯 어세이를 실시하였다. 하부 패널은 항 HMG-I/Y 항체를 사용하여 면역 블롯 어세이를 실시한 결과를 나타낸다. 핵 추출액을 항 U1 (70K) snRNP 항체에 의해 면역 침강시킨 후 항 HMG-I/Y 항체를 사용하여 면역 블롯 어세이를 실시하였다. 이들 실험은 별개의 세포 배양물을 사용하여 적어도 3 회 반복하여 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 20 은 PS2 mRNA 상의 이상 스플라이싱 기구의 가설 개략도이다.

도 21 은, sAD 뇌에서의 HMG-I/Y 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 해석에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 전체 라이세이트, 시토졸 분획 및 이 분획을 3 예의 상이한 sAD 뇌 및 연령이 매치된 대조 해마로부터 조제하였다. 이들 분획을 SDS-PAGE, 및 HMG-I/Y 단백질에 대한 항체를 사용하는 면역 블롯 어세이에 제공하였다. 흑색 화살표는 HMG-I (상부, 도면 중「HMG I」) 및 HMG-Y (하부, 도면 중「HMG Y」) 단백질의 대응하는 분자량점을 나타낸다.

도 22 는, sAD 뇌에서의 HMG-I/Y 단백질의 발현을 면역 조직 화학에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 적어도 3 종의 상이한 대조 및 AD 의 뇌를 해석하고, 항상 동일한 결과를 얻은 것이다. 두께 10 ㎛ 의 대조 및 sAD 의 뇌 절편을 만들고, 계속하여 면역 반응성 HMG-I/Y 의 면역 조직 화학적 검출을 실시하였다. 적어도 3 종의 상이한 대조 및 AD 의 뇌를 해석하여 항상 동일한 결과를 얻은 것이다.

도 23 은, 합성된 각 올리고 뉴클레오티드를 나타내는 도면이다. 관용적인 방법에 의해 실시하였다. 24 머 또는 60 머의 염기 길이를 갖는 2 종의 상보적인 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 어닐링하고, No.1 ~ No.11 의 각 2 본쇄 DNA 를 얻었다. 또한 도면 중에서 각 올리고 누클레이티드에서 PS2 의 엑손 5 의 각 단편을 밑줄을 긋고 굵은 문자로 나타내었다.

도 24 는, 2'-O-메틸올리고 RNA 에 의한 프레세닐린-2 유전자 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성 억제 효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 25 는, 시험관내에서의 저산소 유도 HMG-I 결합에서의 2'-O-메틸올리고 RNA 의 영향을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중에서 레인 1 의「N」은 정상 산소 조건, 레인 2 는「H」는 저산소 조건을 나타낸다. 또한 2'-O-메틸올리고 RNA 의 사용량은, 레인 3 에 대해서는 0.5 ㎍, 레인 4 에 대해서는 5 ㎍, 레인 5 에 대해서는 50 ㎍, 레인 6 에 대해서는 500 ㎍ 이다.

도 26 은, 세포 내에서의 2'-O-메틸올리고 RNA 의 주입, 안정성 및 도입 효율을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 패널 A 에서 패널 a 는 SK-N-SH 세포의 각 획분에서의 2'-O-메틸올리고 RNA 의 주입량을 나타내고, 패널 b 는 SK-N-SH 세포에 대한 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 의 도입 효율을 나타낸다. 패널 B 는 SK-N-SH 세포에 대한 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 의 도입 후, 48 시간 시점에서의 2'-O-메틸올리고 RNA 의 안정성을 조사한 결과를 나타낸다.

도 27 은, HMG-I 의 DNA 인식 모티프를 결정하기 위한 합성 DNA 의 서열을 나타내는 도면이다. 최상단은 HMG-I 인식 모티프의 콘센서스 서열을 나타낸다.

도 28 은 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 중의 HMG-I 의 DNA 결합에서의 2'-O-메틸올리고 RNA 의 작용을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 패널 A 는 겔 시프트 어세이의 결과를 나타내고, 패널 B 는 패널 A 를 수치화한 데이터를 나타낸다.

도 29 는, 세포사에 대한 2'-O-메틸올리고 RNA 의 작용을 조사한 결과를 나타낸다. 패널 A 는 저산소 조건과 투니카마이신에 의해 유도된 세포사에 대해 조사한 결과, 패널 B 는 HMG-I 의 일과성 발현과 투니카마이신에 의해 유도된 세포사에 대해 조사한 결과이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 저해제는 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 간의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것에 하나의 특징이 있다. 본 발명의 저해제는 상기 화합물을 함유하기 때문에, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 간의 결합을 저해할 수 있다는 우수한 효과를 발휘한다. 또한 본 발명의 저해제에 의하면, 상기 프레세닐린-2 mRNA 의 스플라이싱 이상, 특히 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제할 수 있다는 우수한 효과를 발휘한다. 추가로 본 발명의 저해제는 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제할 수 있기 때문에, 신경세포사를 더욱 억제할 수 있다는 우수한 효과를 발휘한다.

프레세닐린-2 유전자는 알츠하이머병에서의 원인 유전자의 하나로 보이는 유전자이다. 상기 프레세닐린-2 유전자에 코드되는 단백질은, 소포체 골지체에 존재하는 막 단백질로서, 아미로이드 대사 또는 침착에 관계되는 단백질이다. 상기 프레세닐린-2 유전자는 12 의 엑손으로 구성되고, 이 중에서 10 의 엑손이 단백질을 코드한다 [예를 들어 레비 라하드 (Levy-Lahad) 외, Genomics, 34, 198-204, (1996) ; 레비 라하드 외, Science, 269, 973-977 (1995) ; 로게프 (Rogaev) 외, Nature, 376, 775-778 (1995) 등을 참조할 것].

또한 본 명세서에서「프레세닐린-2 유전자」란, 프레세닐린-2 단백질을 코드하는 mRNA, DNA (예를 들어 게놈 DNA, cDNA) 모두를 포함하는 것을 의미한다. 또한 프레세닐린-2 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 예를 들어 진방크 (GenBank) 의 억세션 번호: XM002127, XM002128, XP002127 등에 기재되어 있다.

본 발명에서 사용되는「HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 간의 결합을 저해하는 화합물」은, 예를 들어 특정 부위에서 이 결합을 특이하게 길항하고, 이로써 이 결합을 완전하게 저해하는 화합물, 또는 특정 부위에서 이 결합을 특이하게 길항하고, 이에 의해 이 결합의 결합 강도를 감소시키는 화합물의 어느 것이어도 된다.

상기「특정 부위」로는, 구체적으로는 예를 들어 ① 서열번호 1 에 나타나는 염기서열로 이루어지는 영역, ② 서열번호 2 에 나타나는 염기서열로 이루어지는 영역, ③ 서열번호 1 에 나타나는 염기서열과 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유한 영역; ④ 상기 ① ~ ③ 각각에 대응하는 DNA 상에서의 연속된 서열로 이루어지는 영역 등을 들 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기「특정 부위」에는, (ⅰ) HMG-I 단백질의 아미노산 서열에서 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합에 관여하는 연속된 서열로 이루어지는 영역; (ⅱ) HMG-I 단백질에 존재하는 아미노산 잔기로서, 또한 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간에 관여하는 복수의 아미노산 잔기로 형성되는 공간적인 영역까지 포함된다.

상기「결합에 관여하는 아미노산 잔기」로는, 예를 들어 다른 아미노산 잔기로 치환된 경우, 얻어진 단백질의 프레세닐린-2 유전자에 대한 결합능을 소실케 하는 잔기 등을 들 수 있다.

상기 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및 서열번호 2 에 나타나는 염기서열은 프레세닐린-2 유전자의 mRNA 에 존재하는 서열이고, HMG-I단백질과의 결합에 중요하다는 점이 본 발명자들에 의해 발견된 염기서열로서, 본 발명은 이러한 본 발명자들의 식견에 기초한다.

본 발명에서는 상기 서열번호 1 또는 2 는 상기 서열번호 1 또는 2 에서 적어도 1 잔기의 변이를 갖는 서열이고, 또한 HMG-I 단백질과의 결합능을 나타내는 서열 및 이것에 대응하는 DNA 서열일 수도 있고, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 적어도 90 %, 바람직하게는 95 % 이상의 서열 동일성을 갖는 서열이며, 또한 HMG-I단백질과의 결합능을 나타내는 서열일 수도 있다.

상기 화합물은 저분자 화합물일 수도 있고, 고분자 화합물일 수도 있다. 상기 화합물로는 예를 들어 RNA, DNA 등의 핵산; 유기 합성 화합물 등을 들 수 있다. 상기 핵산은 1 본쇄일 수도 있고 2 본쇄일 수도 있으며, 직쇄 형상일 수도 있고 환 형상일 수도 있다.

상기 화합물로는 예를 들어 HMG-I 단백질 중에 존재하는 아미노산 서열이고, 또한 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자의 결합에 관여하는 아미노산 서열로 이루어지는 영역을 블록하는 화합물 (예를 들어 핵산, 핵산 아날로그 등) ; HMG-I 단백질 중에 존재하는 아미노산 잔기이고, 또한 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자의 결합에 관여하는 복수의 아미노산 잔기로 형성되는 공간적인 영역을 블록하는 화합물 (예를 들어 이 공간적인 영역에 적합한 유기 합성 화합물 등); 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 중에 존재하는 염기서열로 이루어지는 영역이고, 또한 HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자가 회합하는 영역을 블록하는 화합물 (예를 들어 핵산, 핵산 아날로그 등) 등을 들 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 통해, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자가 결합하는 것을 저해할 수 있는 화합물도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 명세서에서,「서열 동일성」이란 서열번호 1 또는 2 에 나타나는 염기서열로 이루어지는 핵산 분자와 비교대상의 핵산 분자 간의 대응 잔기의 동일성을 말한다. 상기「서열 동일성」에는 2'-O-메틸 유도체, 탈아미노 유도체 (예를 들어 이노신 등), 아데노신 유도체 (예를 들어 이소펜테닐아데닌, 트레오니노카르보닐아데닌 등), 황 함유 유도체 (4-티오우리딘, 2-티오피리미딘 유도체) 등의 수식 염기 등을 통해, 서열번호 1 또는 2 에 나타나는 염기서열의 잔기와 유사한 경우도 포함하는 것을 의미한다. 상기「서열 동일성」은 비교대상인 염기서열의 영역에 걸쳐 최적 상태로 얼라인먼트된 2 개의 염기서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 서열 동일성의 수치 (퍼센테이지) 는 양쪽의 서열에 존재하는 동일한 핵산 염기를 결정하여 적합 부위의 수를 결정하고, 이어서 비교대상인 서열영역 내의 염기의 총 수로 상기 적합 부위의 수를 나누고, 얻어진 수치에 100 을 곱함으로써 산출될 수 있다. 최적 얼라인먼트 및 호몰로지를 얻기 위한 알고리즘은 예를 들어 스미스 (Smith) 외의 국소 호몰로지 알고리즘 [Add. APL. Math., 2, 482 (1981)], 니들만 (Needleman) 외의 호몰로지 얼라인먼트 알고리즘 [J. Mol. Biol, 48, 443 (1970)], 퍼슨 (Pearson) 외의 상동성 검색법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444 (1988)] 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 다이나믹 프로그래밍법, 갭 패널티법, Smith-Waterman 알고리즘, Good-Kanehisa 알고리즘, BLAST 알고리즘, FASTA 알고리즘 등을 들 수 있다.

상기 화합물로는 구체적으로는, (A) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 RNA 분자를 들 수 있다. 상기 (A) 의 RNA 분자에 의하면 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ) 의 어느 한 영역을 블록할 수 있다.

상기 (A) 의 RNA 로는 구체적으로는, 예를 들어 (a) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 RNA 분자 등을 들 수 있다.

또한 서열번호 1 에 나타나는 염기서열을 함유한 핵산, 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유한 핵산, 및 서열번호 1 에 나타나는 염기서열과 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유한 핵산으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종과 HMG-I 단백질 간의 결합 친화성 면에서 동등한 결합 친화성을 나타내는 것이면, 상기 (A) 의 RNA 분자로부터 얻어지는 핵산 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.

즉, 본 발명에서는 상기 서열번호 1 또는 2 는 상기 서열번호 1 또는 2 에서 적어도 1 잔기의 변이를 갖는 서열이고, 또한 HMG-I 단백질과의 결합능을 나타내는 서열 및 이에 대응하는 DNA 서열이어도 되며, 상기 서열번호 1 또는 2 는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 염기서열과 적어도 90 %, 바람직하게는 95 % 이상의 서열 동일성을 갖는 서열이고, 또한 HMG-I 단백질과의 결합능을 나타내는 서열 및 이에 대응하는 DNA 서열일 수도 있고, 이러한 서열을 갖는 핵산도 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 결합 친화성은 HMG-I 단백질과의 결합을 사우스웨스턴 해석, 겔 시프트 어세이, 공명 플라스몬 상호 작용 해석 등의, 단백질-핵산 간 상호 작용의 해석에 사용되는 관용적 수법에 의해 평가될 수 있다.

구체적으로는 핵산 및 핵산 유도체로는 예를 들어,

(D) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자,

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

등을 들 수 있다.

상기 (B) 의 DNA 분자에 의하면, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 중에서의 영역이고, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자가 회합하는 영역을 블록하는 것이 기대된다. 여기에서 상기 (B) 에서「서열번호 1 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열」또는 「서열번호 2 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열」이란, 서열번호 1 또는 서열번호 2 에 나타나는 서열의 역전사 산물의 상보 쇄를 의미한다. 상기 (B) 의 DNA 분자로는, 구체적으로는 예를 들어 (b) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열 (u 가 t 로 변환된 것) 을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 DNA 분자를 들 수 있다.

상기 (C) 에서, 상기 (A) 의 RNA 분자에 상보적인 분자 (안티센스 분자) 에 의하면, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 중에서의 영역이고, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자가 회합하는 영역을 블록하는 것이 기대된다. 한편 상기(B) 의 DNA 분자에 상보적인 안티센스 분자에 의하면, 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ) 의 영역을 블록하는 것이 기대된다. 상기 (C) 에 나타낸 안티센스 분자로는, 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자를 들 수 있다.

상기 (D) 에서, 아날로그 분자로는, 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자에서, 인산 디에스테르 결합에서의 산소원자가 황원자에 의해 치환된 티오인산 디에스테르 결합을 갖는 올리고 뉴클레오티드 (S-올리고), 또는 인산 디에스테르 결합을 전하를 갖지 않는 메틸포스페이트기에 의해 치환된 올리고 뉴클레오티드 등의 생체 내에서 올리고 뉴클레오티드가 분해 되기 어렵게 되도록 개질된 올리고 뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한 상기 아날로그 분자는 이른바 펩티드 핵산이라고 하는 핵산일 수도 있다. 상기 아날로그 분자로는, 구체적으로는 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA, 이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 4-티오우리딘 함유 RNA, 이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2-티오피리미딘 함유 RNA 등을 들 수 있다. 이들 아날로그 분자는 예를 들어 생체 내에서의 안정성이 우수한 점이 특히 유리하다.

상기 (D) 에서, 상기 (A) 의 RNA 분자의 아날로그이고, 그리고 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자에 의하면, 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ) 의 영역을 블록하는 것이 기대된다. 또한 상기 (B) 의 DNA 분자의 아날로그로서, 그리고 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자에 의하면, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 중에서의 영역으로서, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자가 회합하는 영역을 블록하는 것이 기대된다. 상기 (D) 에 나타나는 아날로그 분자로는, 구체적으로는 예를 들어 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그로서, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자를 들 수 있다.

상기 (E) 에서, 아날로그 분자로는 상기 (C) 의 안티센스 분자에서, 인산 디에스테르 결합에서의 산소원자가 황원자에 의해 치환된 티오인산 디에스테르 결합을 갖는 올리고 뉴클레오티드 (S-올리고) ; 인산 디에스테르 결합을 전하를 갖지 않는 메틸포스페이트기에 의해 치환된 올리고 뉴클레오티드 등의 생체 내에서, 올리고 뉴클레오티드가 분해되기 어렵게 되도록 개질된 올리고 뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한 상기 아날로그 분자의 경우, 이른 바 펩티드 핵산이라는 핵산일 수도 있다. 구체적으로는 (e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자를 들 수 있다.

본 발명의 저해제에 사용되는 화합물은, 핵산 또는 핵산 유도체를 사용하는 경우, 관용의 유전자 재조합 기술, 핵산 합성법, 부위 특이적 변이도입법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어 핵산 또는 핵산 유도체는 유전자공학에서 일반적으로 사용되는 핵산 합성법에 따라서, 예를 들어 DNA 합성장치를 사용하여 직접 합성할 수도 있고, 이들 핵산 또는 핵산 유도체 (특히 변이체) 를 함유하는 핵산 또는 그 일부를 합성한 후, PCR 법 또는 클로닝 벡터 등을 사용하여 핵산을 증폭시킬 수도 있다. 추가로 DNA 분자의 경우, 이들 방법에 의해 얻어진 DNA 분자를 제한효소 등에 의해 절단하고, 이어서 DNA 리가제 등을 사용하여 적절한 벡터 등에 연결하고, 얻어진 재조합 벡터를 적절한 숙주에 도입하고, 얻어진 형질전환체로부터 핵산을 제조할 수도 있다. 또한 추가로 세포 내에서 더욱 안정된 핵산 유도체를 얻기 위해, 상기 핵산의 염기, 당, 인산 부분을 화학수식해도 된다.

상기 부위 특이적 변이 도입법으로는, 예를 들어 갭ㆍ듀플렉스 (gapped duplex) 법 [예를 들어 Nucleic Acids Research, 12, 9441-9456 (1984) 등을 참조할 것], 쿤켈 (Kunkel) 법 [예를 들어 Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82, 488-492 (1985) 등을 참조할 것], 변이 도입용 프라이머를 사용한 PCR 에 의한 방법 등을 들 수 있다.

상기 핵산 합성법으로는 인산 트리에스테르법, 포스포르아미다이트법, H-포스포네이트법 등을 들 수 있다.

본 발명의 저해제의 약리 평가는, 예를 들어 피검 물질 (약리 평가 대상물) 의 존재 하에서 상기 (A) 의 핵산, 보다 구체적으로는 서열번호 4 에 나타나는 염기서열을 갖는 핵산과 HMG-I 단백질의 결합을 검출하는 것 또는 이 결합의 결합 강도 (예를 들어 결합 친화성 등) 를 측정함으로써 실시할 수 있다.

즉, 피검 물질의 존재 하에서, 상기 (A) 의 핵산, 보다 구체적으로는 서열번호 4 에 나타나는 염기서열을 갖는 핵산과 HMG-I 단백질을 접촉시키는 공정을 실시하고, Ⅰ) 피검 물질의 존재 하에서, 이 핵산과 이 HMG-I 단백질의 결합이 검출되지 않는 경우, 또는 Ⅱ) 피검 물질의 존재 하에서의 이 핵산과 이 HMG-I 단백질의 결합의 결합 강도 (a) 가 피검 물질의 비존재 하에서의 이 핵산과 이 HMG-I 단백질의 결합의 결합 강도 (b) 보다도 작은 경우, 이 피검 물질이 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 와 HMG-I 단백질 간의 결합에 대한 저해제인 것의 지표가 된다. 또한 상기 피검 물질에 대해 결합 친화성을 조사한다. 상기 결합 및 결합 강도 (예를 들어, 결합 친화성 등) 는 예를 들어 상기 사우스 웨스턴 해석, 겔 시프트 어세이, 공명 플라스몬 상호 작용 해석 등의, 단백질-핵산 간 상호 작용의 해석에 사용되는 관용적인 수법에 의해 평가할 수 있다.

구체적으로는 상기 결합 및 결합 강도 (예를 들어 결합 친화성 등) 는, 피검 물질의 존재 하에서 예를 들어 적절한 지지체 상에 상기 (A) 의 핵산, 보다 구체적으로는 서열번호 4 에 나타나는 염기서열을 갖는 핵산 또는 HMG-I 단백질을 고정화된 매트릭스를 사용하고, 이 매트릭스에 고정된 물질에 대응하는 물질을 접촉시키고, 질량의 변화, 형광의 변화 등을 지표로 하여, 예를 들어 상기 공명 플라즈몬 상호 작용 해석 등에 의해 측정할 수 있다.

또한 상기 HMG-I 단백질은 예를 들어 적절한 세포를 통상의 산소 조건 하에서 배양하고, 이어서 저산소 조건 하에서 배양하고, 이에 의해 세포 내에 발현시킬 수 있다.

통상의 산소 조건으로는, 사용하는 세포에 따라 적절히 설정할 수 있는데, 예를 들어 SK-N-SH 세포의 경우, 5 % CO₂하, 37 ℃ 에서의 배양 등의 조건 등을 들 수 있다. 저산소 조건으로는 예를 들어 저산소압 (8 torr) 의 조건을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들어 저산소압 (8 torr) 의 가습 분위기 하로 유지한 저산소 챔버를 구비한 인큐베이터를 사용하고, 37 ℃ 에서 저산소 조건 하에 21 시간 배양물을 유지시킴으로써 세포에 저산소 자극을 줄 수 있다.

상기 세포로는 예를 들어 신경세포, 글리아 세포, 별 형상 세포 등의 중추신경계 세포, 섬유아세포 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 예를 들어 SK-N-SH 세포 (ATCC HTB-11) 등을 들 수 있다.

또한 필요에 따라서 관용적인 단백질 정제수법 [염석, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 흡착 칼럼 크로마토그래피 등] 에 의해 정제할 수도 있다.

본 발명의 저해제에서는, 유효 성분이 핵산 또는 핵산 유도체인 경우, 사용 목적에 따라서 핵산 또는 핵산 유도체를 세포에 대한 도입에 적합한 벡터 리포솜, 금속입자, 정전하 폴리머 등에 적절히 유지시킬 수도 있다.

상기 벡터로는, 예를 들어 무독화된 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 무독화된 레트로 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

상기 리포솜으로는 HVJ-리포솜, 정전하 리포솜 등을 들 수 있다.

본 발명의 저해제에서의 유효 성분량은, 사용 목적 등에 따라서 결합 저해 작용을 발휘하는 범위에서 적절히 설정될 수 있다. 유효 성분이 0.01 ~ 100 ㎎ 바람직하게는 3 ~ 100 ㎎ 인 것이 바람직하다.

본 발명의 저해제는 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제하고, 이에 의해 신경세포사를 억제할 수 있으므로, 이 저해제에 의해 신경세포사 억제제를 제공할 수 있다. 이러한 신경세포사 억제제도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 신경세포사 억제제는 상기 저해제를 유효 성분으로 함유하는 것을 하나의 커다란 특징으로 한다. 따라서 신경세포사를 억제할 수 있다는 우수한 효과를 발휘한다.

본 발명의 신경세포사 억제제에서의 유효 성분의 함유량은, 투여 대상 개체의 체중, 연령, 투여 목적에 따라서 적절히 설정할 수 있다.

또한 본 발명의 신경세포사 억제제에서는, 투여량은 투여 목적 (예를 들어 질환의 종류), 투여 대상 개체의 연령 및 체중, 유효 성분의 종류 등에 따라서 적절히 선택된다. 상기 투여량은 예를 들어 RNA 분자를 함유하는 경우, 예를 들어 유효 성분이 0.01 ~ 100 ㎎, 바람직하게는 3 ~ 100 ㎎ 인 것이 바람직하다.

본 발명의 신경세포사 억제제의 투여 방법으로는 직접 체내에 투여하는 생체 내 법 등을 들 수 있다.

상기 생체내 법에 의해 투여하는 경우, 투여 형태는 투여 목적 (예를 들어 질환의 종류), 투여 대상 개체의 연령 및 체중, 유효 성분의 종류에 따라서 적절히 선택되는데, 예를 들어 정맥주사, 비점막 흡입 등을 들 수 있다.

예를 들어 핵산 또는 핵산 유도체를 함유한 저해제를 유효 성분으로 신경세포사 억제제를 혈액 내 투여하는 경우, 일반적으로는 1 일당 유효 성분량으로 0.01 ~ 100 ㎎, 바람직하게는 3 ~ 100 ㎎ 인 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 신경세포사 억제제에는 신경세포 등에 대한 도입을 용이하게 할 수 있는 물질, 통상의 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 부형제, 결합제, 안정제, 완충제, 용해보조제, 등장제 등을 함유할 수도 있다.

본 발명의 신경세포사 억제제의 약리 평가는, 상기 저해제에서의 약리 평가와 함께 아래에 나타내는 수법에 의해 실시할 수 있다. 즉 피검 물질 (신경세포사 억제제의 후보) 을 도입한 SK-N-SH 세포 [피검 세포] 와 도입되지 않은 SK-N-SH 세포 [대조 세포] 에 대해 각각 저산소 조건 [저산소압 (8 torr) 의 조건 등] 하에서 투니카마이신 등에 의해 야기되는 신경세포사를 조사함하여 약리 평가를 실시할 수 있다. 여기에서 피검 세포에서의 신경세포사가, 대조 세포에서의 신경세포사보다도 억제될 경우, 상기 피검 물질이 신경세포사 억제제인 것의 지표가 된다. 또한 HMG-I 를 일과성 발현시키고, 또한 피검 물질 (신경세포사 억제제의 후보) 을 도입한 SK-N-SH 세포 [피검 세포] 와, HMG-I 를 일과성 발현시키는 SK-N-SH 세포 [대조 세포] 에 대해 투니카마이신 등에 의해 야기되는 신경세포사를 조사하여 약리 평가를 실시할 수 있다. 여기에서 피검 세포에서의 신경세포사가, 대조 세포에서의 신경세포사보다도 억제될 경우, 상기 피검 물질이 신경세포사 억제제인 것의 지표가 된다.

이러한 신경세포사의 억제에 대해 MTT 법 [모스만 (Mossman, T.] 외, J. Immunol. Methods, 65, 55-59 (1985)] 에 의해 확인할 수도 있고, 관용의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨 어세이 (MTS 어세이라고 함) 를 실시하여 세포의 생존율을 측정하고, 피검 세포와 대조 세포를 비교하여 확인할 수도 있다.

상기 저산소 조건으로서, 구체적으로는 예를 들어 저산소압 (8 torr) 의 가습 분위기 하로 유지한 저산소 챔버를 구비한 인큐베이터를 사용하고, 37℃ 에서저산소 하에 21 시간 배양물을 노출시킴으로써 세포에 저산소 자극을 주는 조건을 들 수 있다.

본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제는, 신경세포사를 억제할 수 있고, 프레세닐린-2 mRNA 의 스플라이싱 이상, 특히 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제에 의해 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 특히 뇌장해 또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에 유용한 의약 조성물을 제공할 수 있다. 이러한 의약 조성물도 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제는 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 특히 뇌장해 또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방용의 의약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 상기 저해제 또는 상기 신경세포사 억제제를 유효 성분으로 함유하는 것에 하나의 특징이 있다. 본 발명의 의약 조성물은 스플라이싱 이상을 억제하는 작용, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성을 억제하는 작용 등을 갖는다. 따라서 본 발명의 의약 조성물은 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 특히 뇌장해 또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에 대한 응용이 기대된다.

본 발명의 의약 조성물의 적용 대상이 되는 질환으로는, 예를 들어 뇌조직에서의 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 뇌장해, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 신경변성 질환 등을 들 수 있다.

상기 뇌장해로는 허혈성 뇌질환, 뇌신경변성 질환 등을 들 수 있다. 더욱 구체적으로는 뇌혈관성 치매, 파킨슨 증후군, 알츠하이머병 등을 들 수 있다.

상기 신경변성 질환으로는 근위축성 측색 경화증 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 투여 목적 (예를 들어 질환의 종류), 투여 대상 개체의 연령 및 체중, 유효 성분의 종류 등에 따라서 적절히 선택된다. 상기 투여량은 예를 들어 RNA 분자를 함유하는 경우, 유효 성분량으로 0.01 ~ 100 ㎎, 바람직하게는 3 ~ 100 ㎎ 인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은, 유효 성분이 환부의 세포 또는 목적하는 조직의 세포 내에 들어가는 제형이면 되고, 단독 또는 관용의 담체와 혼합하여 비경구 투여, 국소 투여에 의해 투여된다.

투여 형태는 투여 목적 (예를 들어 질환의 종류), 투여 대상 개체의 연령 또는 체중, 유효 성분의 종류 등에 따라서 적절히 선택되고, 예를 들어 정맥주사 및 비점막 흡입 등을 들 수 있다.

의약 조성물이, 예를 들어 핵산 또는 핵산 유도체를 함유하는 것으로, 혈액 내 투여되는 경우, 일반적으로는 1 일당 유효 성분량으로 3 ~ 100 ㎎ 을 1 일 1 회 내지 수 회 투여할 수 있다.

또한 본 발명의 의약 조성물은, 질환 부위의 주위에 유전자를 존재하기 쉽도록 하기 위해 서방성의 제제 (미니 펠릿 제제 등) 를 조제하여 환부 가까이에 매립할 수도 있고, 또는 오스모틱 펌프 등을 사용하여 환부에 연속적으로 서서히 투여할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 필요에 따라서 질환 부위에 쉽게 도입할 수 있는 물질, 각종 담체, 보조제, 안정제, 윤활제, 기타 일반적으로 사용되는 첨가제, 예를 들어 젖당, 시트르산, 타르타르산, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 백도토, 자당, 콘스타치, 탤크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 낙화생유, 올리브유, 카카오버터, 에틸렌글리콜 등을 추가로 함유할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물의 약리 평가는, 상기 저해제 및 신경세포사와 동일한 평가 방법에 의해 실시될 수 있다. 또한 대상이 되는 질환에 따라서 관용의 약리 평가를 실시할 수도 있다.

본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제는 신경세포사를 억제할 수 있고, 프레세닐린-2 mRNA 의 스플라이싱 이상, 특히 프레세닐린- 엑손 5 결손 스플라이싱 이상을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제에 의해 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 예를 들어 뇌장해 또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공할 수 있다. 이러한 치료 또는 예방 방법도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 치료 또는 예방 방법은, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 예를 들어 뇌장해의 개체 또는 신경변성 질환의 개체에 치료상 유효량의 본 발명의 저해제 또는 본 발명의 신경세포사 억제제를 투여하는 것을 하나의 특징으로 한다. 본 발명의 치료 또는 예방 방법에 의하면, 상기 저해제 또는 신경세포사 억제제를 투여하므로, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방이 기대된다.

또한 본 발명의 치료 또는 예방 방법에 따르면, 상기 저해제 또는 신경세포사 억제제를 투여하기 때문에, 신경세포사의 억제작용을 더욱 효율적이고 더욱 지속적으로 발휘시킬 수 있다는 우수한 효과를 발휘한다. 따라서 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방을 더욱 효율적이고 더욱 지속적으로 실시할 수 있다는 우수한 효과를 발휘한다. 또한 본 발명의 치료 또는 예방 방법에 의하면, 상기 저해제 또는 신경세포사 억제제를 투여하기 때문에, HMG-I 가 DNA 결합 부위에서 DNA 와 결합함으로써 발휘되는 HMG-I 본래의 기능을 저해하지 않고, RNA 결합 부위를 저해한다는 우수한 효과를 발휘한다. 따라서 본 발명의 치료 또는 예방 방법에 의하면 HMG-I 와 DNA 의 결합에 기초하는 본래의 기능을 손실시킴에 따른 영향을 발생시키지 않는다는 우수한 효과를 발휘한다.

「치료상 유효량」이란 신경세포사를 억제할 수 있고, 프레세닐린-2 mRNA 의 스플라이싱 이상, 특히 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제할 수 있는 양을 의미한다.

개체에 대한 저해제 또는 신경세포사 억제제의 투여는, 예를 들어 정맥주사 및 비점막 투입 등에 의해, 1 일당 저해제 또는 신경세포사 억제제의 유효 성분량으로 3 ~ 100 ㎎ 을 1 일 1 회 내지 수 회 투여함으로써 실시할 수 있다.

본 발명의 치료 또는 예방 방법의 효과는, 대상이 되는 질환의 병리학적 특징 등의 발현 억제를 지표로 하여 평가할 수 있다. 예를 들어 뇌허혈의 모델로서, 특별히 한정되지 않으나, 선천적으로 Willis 동맥륜의 형성이 불완전한 동물의 양측 총경동맥을 일과성으로 폐색하고, 이어서 재개통시킴으로써 얻어지는 지발성 신경세포사의 모델 동물; 중대뇌 동맥을 영구 또는 일과성으로 폐색시켜 얻어지는 국소 뇌허혈 모델 동물 등을 사용하여, 이 모델에 상기 저해제 또는 신경억제제를 투여하고 증상의 개선 등을 조사함으로써, 본 발명의 치료 또는 예방 방법의 효과를 평가할 수 있다. 추가로 마우스에 대해 장기적으로 알루미늄이나 철들을 부하시켜 얻어지는 화학적 저산소 모델 동물; 나이를 먹음에 따라서 발생되는 미소관 경색 저산소를 반영하는 노령 마우스 등의 모델 동물에게, 상기 저해제 또는 신경억제제를 투여하고 증상의 개선 등을 조사함으로써, 본 발명의 치료 또는 예방 방법의 효과를 평가할 수도 있다.

또한, 본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제는, 신경세포사를 억제할 수 있고, 프레세닐린-2 mRNA 의 스플라이싱 이상, 특히 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 저해제 및 신경세포사 억제제에 의해 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 개체에 투여하고, 그럼으로써 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 제조할 수 있다. 따라서 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 개체에 투여하고, 그럼으로써 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 저해제 또는 신경세포사 억제제의 사용도 본 발명에포함된다.

실험예 1세포 배양, 저산소 자극 및 일과성 트랜스펙션

사토 외의 문헌 [사토 (Sato N) 외, J. Biol. Chem,. 276. 2108-2114, (2001)] 에 따라서 아래와 같이 세포 배양 및 저산소 자극을 실시하였다.

인간 신경아세포종 SK-N-SH 세포를, 10 % 소태아 혈청을 함유한 αMEM [기브코 비ㆍ알ㆍ엘 (GIBCO BRL) 사 제조] 중에서 5 % CO₂, 37 ℃ 에서 배양하였다. 상기 세포가 176.6 ㎠ 의 배양 접시에서 컨플루엔트에 달했을 때, 배양물 중의 혈청 함유 α-MEM 을 무혈청 αMEM 과 교환하였다. 배지 교환 후의 배양물을 추가로 4 시간 배양하였다.

HEK-293T 세포 및 HeLa 세포에 대해서는 각각 10 % 소태아 혈청을 함유한 달베코 최소 필수 배지 [기브코 비ㆍ알ㆍ엘사 제조] 중에서 5 % CO₂, 37 ℃ 에서 배양하였다. 상기 각각의 세포가 176.6 ㎠ 의 배양 접시에서 컨플루엔트에 달했을 때, 배양물 중의 혈청 함유 달베코 최소 필수 배지를 무혈청 달베코 최소 필수 배지와 교환하였다. 배지 교환 후의 배양물을 추가로 4 시간 배양하였다.

저산소 자극을 준 경우, 저산소압 (8 torr) 의 가습 분위기 하로 유지한 저산소 챔버를 구비한 인큐베이터를 사용하여, 얻어진 배양물을 37 ℃ 에서 저산소 하에 21 시간 노출시켰다.

여러 구축물의 일과성 트랜스펙션을, 리포펙타민 2000 (LepofectAMINE^TM2000) [기브코 비ㆍ알ㆍ엘사 제조] 을 사용하여 실시하였다.

또한 올리고 RNA 의 일과성 트랜스펙션을 올리고펙타민 (OligofectAmine) [기브코 비ㆍ알ㆍ엘사 제조] 을 사용하여 실시하였다.

실험예 2전체 RNA 의 조제 및 RT-PCR

사토 외의 문헌 [사토 (Sato N) 외, J. Neurochem., 72. 2498-2505, (1999)] 에 따라서, 아래와 같이 각종 스트레스 하의 신경아세포종 SK-N-SH 세포, HEK-293T 세포 및 HeLa 세포에서 각각 유래된 전체 RNA 의 조제, 그리고 RT-PCR 을 실시하였다.

RNeasy 토탈 RNA 키트 [퀴아겐 (Qiagen) 사 제조] 를 사용하여 제조자의 설명서에 따라서 산소 정상 상태, 저산소 노출 또는 HMG-I 의 과잉 발현 시에서의 SK-N-SH 세포 및 HEK-293T 세포의 각각으로부터 전체 RNA 를 추출, 정제하였다.

이어서, 얻어진 전체 RNA 와, 마우스 몰로니 백혈병 바이러스 역전사 효소 [프로메가 (Promega) 사 제조] 를 사용하여 42 ℃ 에서 1 시간 역전사 반응을 실시하였다. 이어서, 얻어진 반응물을 주형으로 하여 네스티드 PCR 을 실시하였다. PCR 의 서멀프로파일은 95 ℃ 30 초- 60 ℃ 30 초 - 72 ℃ 1 분 (최종 사이클에서는 2 분) 을 1 사이클로 한 30 사이클이다. 1 차 PCR 에는 프라이머 ps251 [5'-attcagacctctctgcggcc-3' (서열번호 9)] 과 프라이머 ps231 [5'-aagcgggagccaaagtctgg-3' (서열번호 10)] 을 사용하였다. 2 차 PCR 에는 프라이머 ps252 [5'-gttcgtggtgcttccagagg-3' (서열번호 11)] 와 프라이머 ps233 [5'-ggaccactctgggaggtaca-3' (서열번호 12)] 을 사용하였다.

얻어진 산물을 5 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고, 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화하였다.

실험예 3핵 추출액의 조제

핵 추출액을, 슈레이버 (Shreiber) 위의 방법의 개량방법 [요네다 (Yoneda, Y.) 외, Neuroscience, 90, 519-533 (1999)] 에 따라서 아래와 같이 조제하였다.

또한 사용한 완충액 및 기타 용액은, 모두 사용 전에 그 때마다 구멍 직경 220 ㎚ 의 Steritop [밀리포어 (Milipore) 사 제조] 에 의해 여과 멸균하였다.

각 세포 구조물의 호모디나이즈에 대해서는, 특별한 언급이 없는 한 10 mM KCl 과 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 5 mM 디티오트레이톨 (DTT) 과 1 mM (p-아미디노페닐) 메탄술포닐플루오리드 (PMSF) 를 함유하는 10 mM HEPES-NaOH (pH 7.9) 50 용량 [315 ㎕/플레이트] 중에서 2 ℃ 에서 실시하였다.

이어서, 얻어진 호모디네이트에 10 % Nonidet P-40 을 첨가하여 종농도를 0.6 % 로 하였다. 얻어진 혼합물을 15000 rpm 으로 5 분간 원심분리시켰다. 이어서, 얻어진 펠릿을 400 mM KCl 과 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 1 mM DTT 와 1 mM PMSF 를 함유한 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 10 용량 [0.1 ㎖] 중에 현탁시키고, 30 분간 빙랭시켰다. 빙랭 후의 현탁물을 15000 rpm 으로 5 분간 원심분리하였다. 얻어진 상청을 pre-mRNA 결합 어세이, 겔 시프트 어세이 및 수퍼 시프트 어세이를 위한 핵 추출액으로서 사용하였다. 또한 상기 핵 추출액은 사용까지 -80 ℃ 에서 보존하였다.

실험예 4시토졸 분획 및 핵 분획의 조제

핵 분획을, 마나베 (Manabe) 외의 문헌 [마나베 (Manabe) 외, Neuroscience, 100, 453-463, (2000)] 에 따라서 아래와 같이 조제하였다.

10 mM KCl 과 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 5 mM DTT 와 1 mM PMSF 를 함유한 10 mM HEPES-NaOH 완충액 (pH 7.9) [315 ㎕/플레이트] 중에서 2 ℃ 에서 뇌 구조물을 호모디나이즈하였다. 얻어진 호모디네이트에 10 % Nonidet P-40 을 첨가하여 종농도를 0.6 % 로 조제하였다. 얻어진 혼합물을 15000 rpm 으로 5 분간 원심분리하여 펠릿 [핵 분획 (NP-40 불용성)] 과 상청 [시토졸 분획 (NP-40 가용성)] 을 얻었다. 또한 상기 펠릿을 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 PMSF 를 함유한 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) [50 ㎕] 중에서 현탁시키고, 핵 분획 (NP-40 불용성) 으로 하였다.

실험예 5DNA 구축물의 조제

도 23 에 나타내는 각 올리고 뉴클레오티드를 관용의 방법에 의해 합성하였다. 24 머 또는 60 머의 염기 길이를 갖는 2 종의 상보적인 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 어닐링하고, No.1 ~ No.11 (서열번호 13 ~ 23) 의 각 2 본쇄 DNA 단편을 얻었다. 또한 도면 중에서, 각 올리고 뉴클레오티드에서 PS2 의 엑손 5 의 각 단편에 밑줄을 긋고 굵은 문자로 나타낸다.

얻어진 2 본쇄 DNA 단편을 각각 pc DNA3 (+) 벡터에 삽입하여 DNA 구축물을 얻었다. DNA 시퀀서 373A 형 [어플라이드 바이오 시스템 (Applied biosystem) 사 제조] 을 사용하여 상기 2 본쇄 DNA 단편의 각각에 대해 서열 해석하였다.

실시예 6pre-mRNA 프로브의 조제

실험예 5 에서 얻어진 DNA 구축물을 EcoRI 를 사용하여 직쇄 형상으로 하고, 이것에 의해 주형 DNA 를 얻었다. 이어서 상기 주형 DNA 를 [α-³⁵S] 표지 UTP (62.5 μCi) 또는 [α-³⁵P] 표지 UTP (50 μCi) 와 0.25 mM UTP 와 0.5 mM ATP 와 0.5 mM CTP 와 0.5 mM GTP 와 T7 RNA 폴리메라아제용 완충액과 20 U 의 T7 RNA 폴리메라아제 [프로메가 (Promega) 사 제조] 와 40 단위의 RN 아젤라인 히비터 (토요보사 제조) 를 함유한 전사용 완충액 중에서 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써 시험관내 전사하고, pre-mRNA 프로브 (RNA 프로브 No1 ~ 11) 를 얻었다.

실험예 7pre-mRNA 결합 어세이

단백질량 5 ㎍ 상당량의 핵 추출액을 10 ㎍ 의 tRNA 와 각³⁵S-표지 RNA 프로브 (1 ㎍) 와 함께, 인큐베이션 완충액 [60 mM KCl 과 4 mM MgCl₂와 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 1 mM DTT 와 10 % 글리세롤과 1 mM PMSF 를 함유한 12 mM HEPES-NaOH 완충액 (pH 7.9)] 중에서 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다 (전체 용량 25 ㎕).

이어서, 얻어진 반응물에 UV 조사기 (254 ㎚, 60W) 하에서 15 분간 실온에서 자외선 (UV) 조사하였다. 그 후 UV 조사 후의 반응물에 10 ㎍ 의 RN 아제 A 를 첨가하고, 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하여 상기 반응물 중의 프로브를 소화시켰다.

얻어진 산물을, 10 % 글리세롤과 2 % SDS 와 0.01 % 브로모페놀 블루와 5 %2-메르캅토에탄올을 함유한 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 6.8) 과 체적비 1:4 로 혼합하여, 도데실 황산 나트륨 (SDS) 를 처리하였다. SDS 처리된 용액을 0.1 % 의 SDS 를 함유하는 10 ~ 20 % 의 글라젠트 폴리아크릴아미드 겔 또는 15 % 폴리아크릴아미드 겔 상, 15 ㎃/플레이트의 일정 전류로 2 시간, 실온에서의 전기영동에 제공하였다. 전기영동 후의 겔을 고정, 건조시켜 이메징 플레이트에 노출시켰다.

실험예 8노던 블롯 어세이

노던 블롯 어세이를 상기 사토 외의 문헌 [사토 (Sato N) 외, J. Biol. Chem., 276, 2108-2114 (2001)] 에 기재된 방법에 따라서 아래와 같이 실시하였다. 즉 전체 RNA 의 20 ㎍ 상당량을 포름알데히드-포름아미드 겔을 사용하여 전기영동하고, 얻어진 겔을 나일론 필터에 플롯하였다. 이어서, 상기 나일론 필터에 전사된 RNA 와 표지 인간 HMG-I cDNA 를 하이브리다이즈시켰다. 또한 상기 표지 인간 HMG-I cDNA 를 Random-Labeling 키트 (타카라 주조사 제조) 를 사용하여 표지하여 제작하였다.

실험예 9면역 블롯 어세이

면역 블롯 어세이를, 상기 마나베 (Manabe) 외의 문헌 [마나베 (Manabe) 외, Neuroscience, 100, 453-463, (2000)] 의 기재에 따라서 아래와 같이 실시하였다. 즉 핵 추출액, 전체 라이세이트, 시토졸 분획 및 핵 분획에 대해 단백질량을 측정하였다. 이어서 핵 추출액, 전체 라이세이트, 시토졸 분획 및 핵 분획의 각 알러쿼트 (aliquot) 와, 완충액 [10 mM Tris-HCl, 10 % 글리세롤, 2 % 도데실 황산나트륨 (SDS), 0.01 % 브로모페놀 블루, 5 % 메르캅토에탄올, (pH 6.8)] 을 체적비 1:4 로 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 100 ℃ 에서 10 분간 끓였다. 일정량의 각 알러쿼트 (핵 추출액에서는 25 ㎍ 단백질 상당량, 전체 라이세이트와 시토졸 분획과 핵 분획에서는 50 ㎍ 단백질 상당량) 를, 0.1 % SDS 를 함유한 15 % 폴리아크릴아미드 겔 상, 15 ㎃/플레이트의 일정 전류로 2 시간, 실온에서 전기영동시켰다. 전기영동 후의 겔을 100 % 메탄올에 의해 활성화시킨 폴리비닐리덴디플루오리드 (PVDF) 막에 플롯시켰다. 플롯 후의 PVDF 막을 5 % 스킴 밀크를 함유한 0.05 % Tween-20 함유 PBS 로 플롯시켰다. 이어서, PVDF 막을, 1 % 스킴 밀크를 함유한 0.05 % Tween-20 함유 PBS 에 희석시킨 항 HMG-I/Y 항체와 반응시켰다. 알칼리포스파타제 결합 항염소 면역 글로블린G (IgG) 항체와 반응시켰다. 면역 반응성을, 100 mM NaCl 과 5 mM MgCl₂과 66.7 % 4-니트로블루 테트라졸륨클로리드 (NTB) 와 33.3 % X-포스페이트/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 (BCIP) 를 함유한 100 mM Tris-HCl 완충액 (pH 9.5) 중에서 가시화하였다.

실험예 10면역 침강

면역 침강을 상기 사토 외의 문헌 [사토 (Sato N) 외, J. Biol. Chem,. 276. 2108-2114, (2001)] 에 기재된 조건에 따라서 아래와 같이 실시하였다.

산소 정상 상태의 SK-N-SH 세포에서 유래하는 핵 추출액 또는 저산소 노출된 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액을, 항 HMG-I 항체 (산타쿠르즈 바이오테크놀로지사 제조) 와 함께 4 ℃ 에서 8 시간 인큐베이트하였다. 얻어진 산물을 프로테인-G아갈로스 [파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech) 사 제조] 와 혼합하고, 4 ℃ 에서 1 시간 유지하였다. 얻어진 혼합물을 3000 rpm 으로 5 분간 원심분리하고, 얻어진 침전물을 PBS 에 현탁시켰다. 추가로 얻어진 현탁물을 3000 rpm 으로 5 분간 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 Mili-Q 수에 현탁시켰다. 이 현탁액을 SDS 처리하고, 얻어진 용액을 SDS-PAGE 에 넣었다. 얻어진 겔에 대해 U1 (70K) snRNP 에 대한 항체를 사용하고, 면역 블롯 어세이하였다.

또한 상기 항 HMG-I 항체 대신에, 항 U1 (70K) snRNP 항체 (산타쿠르즈 바이오테크놀로지사 제조) 를 사용하여 면역 침강을 실시하고, 상기 U1 (70K) snRNP 에 대한 항체 대신에 HMG-I/Y 에 대한 항체 [항 HMG-I/Y 항체; 산타쿠르즈 바이오테크놀로지사 제조] 를 사용하여 면역 블롯 어세이를 실시하였다.

실험예 11면역 세포화학

면역 세포 화학적 검사를 SK-N-SH 세포로 실시하였다. 즉 SK-N-SH 세포를 산소 정상 상태로 유지하거나, 또는 이 세포를 저산소 조건 하에서 21 시간 노출시켰다. 이어서, 얻어진 세포를 4 % 파라포름알데히드 중에서 실온에서 2 시간 고정시키고, 0.3 % Triton-X 100 중에서 적어도 5 분간 투과시켰다. 고정 및 투과시킨 세포를 PBS 로 3 회 세정하였다. 세정된 세포를 항 HMG-I/Y 항체 및 항 SC 35 항체 [시그마 (Sigma) 사 제조] 와 4 ℃ 에서 12 시간 면역 반응시켰다. 세포를 PBS 로 3 회 세정하고, FITC 결합 항염소 IgG 항체 및 Cy 3 결합 항마우스 IgG 항체와 함께 실온에서 2 시간 인큐베이트하였다. 면역 반응성 단백질을 컴퓨터에 접속시킨 현미경 하에서 488 ㎚ 여기 필터를 사용하여 관찰하였다.

실험예 12면역 조직 화학

면역 조직 화학법을, 상기 사토 외의 문헌 [사토 (Sato N) 외, J. Biol. Chem,. 276. 2108-2114, (2001)] 에 기재된 개량된 면역 퍼옥시다아제법을 사용하여 실시하였다. 즉 대조 또는 sAD 의 뇌 절편을 실온에서 2 시간 고정시키고, 이어서 HMG-I/Y 면역 조직 화학의 처리를 실시하였다. 항 HMG-I/Y 항체 또는 항 SSMAG 항체를 1:1000 의 희석률로 사용하였다. 비오티닐화 항염소 항체 또는 비오티닐화 항토끼 IgG [벡타스타틴엘라이트 (Vectastain Elite) 사 제조] 를 이차 항체로 사용하였다. 면역 반응성을, 50 mM Tris (pH 7.6) 중에서 0.05 % DAB 및 0.01 % 과산화 수소로 가시화하였다.

실험예 13수퍼 시프트 어세이

5 ㎍ 단백질 상당량의 핵 추출액을, 1 ㎍ 의 항 HMG-I/Y 항체 (산타쿠르즈 바이오테크놀로지사 제조) 또는 0.5 ~ 2.0 ㎍ 의 항 U1 (70 K) snRNP 항체 (산타쿠르즈 바이오테크놀로지사 제조) 와 함께 4 ℃ 에서 8 시간 인큐베이트하고 전처리하였다. 얻어진 전처리 산물을 인큐베이션 완충액 [조성: 60 mM KCl 과 4 mM MgCl₂와 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 1 mM DTT 와 10 % 글리세롤과 1 mM PMSF 를 함유한 12 mM HEPES-NaOH 완충액 (pH 7.9)] 중에서 2 ㎍ 또는 10 ㎍ 의 tRNA 와 함께 인큐베이트하였다. 이어서,³²P 표지 RNA 프로브 [1 ㎍, 도 4 에 나타낸 No.5 프로브] 를 첨가하여 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다 (전체 용량 50㎕).

얻어진 반응물을 50 mM Tris 와 0.38 M 글리신과 2 mM EDTA 를 함유한 완충액 (pH 8.5) 중에서 4 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 11 V/㎝ 의 일정 전압으로 1.5 시간, 4 ℃ 에서 전기영동함으로써 결합 프로브와 유리 프로브를 분리시켰다. 전기영동 후의 겔을 고정, 건조시키고, 이어서 X 선 필름에 노출시켰다.

실시예 1고발성 알츠하이머병 환자 뇌 및 배양 세포 중에서의 PS2V 의 발현

(1) 고발성 알츠하이머병 환자의 뇌에서의 PS2V 의 발현

고발성 알츠하이머병 (sAD) 뇌 유래의 전체 RNA 또는 연령이 매치된 대조 뇌 유래의 전체 RNA 를 RT-PCR 에 의해 어세이하였다.

sAD 뇌 및 대조 뇌의 각각으로부터 안워 (Anwar R.) 외 [안워 (Anwar R) 외, J. Neurochem, 66, 1774-1777 (1996)] 에 의해 기재된 방법에 따라서 mRNA 를 단리하였다.

이어서, 얻어진 mRNA 와, 마우스 몰로니 백혈병 바이러스 역전사 효소 [프로메가 (Promega) 사 제조] 를 사용하여 역전사 반응을 실시하였다. PCR 에서의 서멀 프로파일은 변성: 95 ℃, 2 분/95 ℃, 30 초, 어닐링: 60 ℃, 30 초, 신장: 72 ℃, 1 분을 1 사이클로 하는 30 사이클이다. 또한 1 차 프라이머로서 상기 프라이머 ps251 과 ps231 을 사용하고, 2 차 프라이머로서 프라이머 ps252 와 233 을 사용하였다.

얻어진 반응물을 5 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 증폭 산물을 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화하였다. 그 결과를 도 1 에 나타낸다.

도 1 의 좌 패널의 레인 1 과, 사토 (Sato) 외의 문헌 [사토 (Sato) 외, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)] 에 나타나는 바와 같이, 대조 뇌에서는 전체 길이 PS2 가 주요 RT-PCR 산물로서 검출되는 것을 알 수 있다. 한편 도 1 의 좌 패널의 레인 2 에 나타나는 바와 같이, sAD 뇌에서는 전체 길이 PS2 에 추가하여 보다 단쇄의 산물이 검출되는 것을 알 수 있다. 다이렉트 시퀀싱 결과, 상기 단쇄의 산물은 PS2 유전자의 엑손 5 가 결실된 변이체 (이하 PS2V 라고 함) 인 것이 나타내어진다.

(2) 배양 세포에서의 PS2V 의 발현

sAD 의 모델과 같이, 배양 세포에서 PS2V 의 생성을 효율적으로 재현하기 위해, 상기와 동일한 실험에 의해 모든 종류의 스트레스 하에서의 각종 세포주 유래의 전체 RNA 에 대해 PS2V 의 발현을 측정하였다. 그 결과를 도 1 의 우 패널에 나타낸다.

도 1 의 우 패널의 레인 1 ~ 3 에 나타나는 바와 같이, 산소 정상 상태에 노출된 각종 세포주, 즉 HeLa 세포, HEK-293T 세포 및 SK-N-SH 세포에서 전체 길이 PS2 만이 검출되는 것을 알 수 있다. 또한 도 1 의 우 패널의 레인 4 및 5 에 나타나는 바와 같이, 동일한 결과를 저산소 조건에 노출된 HeLa 세포 및 HEK-293T 세포에서 볼 수 있다.

그러나 저산소 조건에 노출된 SK-N-SH 세포 [도 1, 우 패널의 레인 6; 사토 (Sato) 외, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)] 그리고 sAD 뇌에서는 PS2 와,다이렉트 시퀀싱에 의해 PS2V 인 것이 확인된 단쇄의 산물이 검출되는 것을 알 수 있다.

한편 검출 가능한 PS2V 는 다른 스트레스인 투니카마이신 (도 1, 우 패널의 레인 7), β-아미로이드 (도 1, 우 패널의 레인8) 및 과산화 수소 [사토 (Sato) 외, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)] 에서는 관찰되지 않았다.

이어서 PS2V 단백질에 대한 항체 (항 SSMAG 항체) 를 사용하여, 면역 조직 화학적 염색법에 의해 PS2V 의 국재를 조사하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다.

도 2 및 사토 외의 문헌 [사토 (Sato) 외, J. Biol. Chem., 276, 2108-2114 (2001)] 에서와 같이, PS2V 에 대한 면역 반응성이 sAD 뇌 조직의 해마 CA1 영역의 추체 세포층 및 측두피질의 추체 세포층에서 관찰된다. 따라서 sAD 뇌 조직의 해마 CA1 영역의 추체 세포층 및 측두피질의 추체 세포층에 PS2V 가 국재하는 것을 알 수 있다.

실시예 2저산소 노출 세포에서의 PS2 pre-mRNA 결합인자의 검출

저산소 노출 세포에서의 PS2 pre-mRNA 결합인자를 검출하기 위해, 도 4 에 나타내는 각종³⁶S-표지 pre-mRNA 프로브 (RNA 프로브) 를 조제하였다. 도 3 에 나타낸 스트래티지 (stratege)에 의해 도 4 에 나타내는 각종 프로브를 사용하는 독자적인 pre-mRNA 결합 어세이를 구축하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.

그 결과, No.0 의³⁵S-표지 프로브를 사용한 pre-mRNA 결합 어세이에 의해, 도 5 의 레인 1 에 나타나는 바와 같이, 산소 정상 상태의 신경아세포종 SK-N-SH세포 유래의 핵 추출액에서는 흑색 화살표로 나타낸 분자량 (약 20 kDa) 의 위치에 시그널이 검출되지 않고, 저산소 조건에 21 시간 노출된 신경아세포종 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서는, 도 5 의 레인 2 에 나타나는 바와 같이 흑색 화살표로 나타낸 분자량 (약 20 kDa) 의 위치에 시그널이 검출되었다. 따라서 저산소 노출 신경아세포종 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서, PS2 pre-mRNA 결합 활성을 나타내는 인자가 존재하는 것을 알 수 있다. pre-mRNA 결합 어세이에 사용하기 전에서의 핵 추출액의 가열에 의해 PS2 pre-mRNA 결합 활성이 거의 완전히 소실되므로, 이 결합 활성이 단백질 유래이고, 핵산, 지질 등의 기타 유래 인자가 아닐 가능성이 높다.

또한 도 5 의 레인 3 ~ 12 에 나타나는 바와 같이, 저산소 조건에 노출된 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 중에서 발견된 PS2 pre-mRNA 결합 활성을 나타내는 인자는 PS2 엑손 5 의 3' 부위에 결합하는 것을 알 수 있다.

추가로 저산소 조건에 노출된 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 중에서 발견된 상기 인자와 No.0 프로브의 결합에 대한 비표지의 No.1 ~ 5 의 각 프로브의 영향을 pre-mRNA 결합 어세이에 의해 조사하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다.

도 6 에 나타낸 바와 같이, 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 중에서 발견된 상기 인자와 No.0 프로브의 결합은, No.5 의³⁵S-비표지 프로브의 첨가에 의해 저해되나, 다른 비표지 프로브 (No.1 ~ 4) 에서는 저해되지 않는 것을 알 수 있다.

추가로 자극 후의 상이한 시점에서 얻은 핵 추출액에서의 No.5 프로브에 대한 결합 활성의 유도에서의 산소 정상 상태 및 저산소의 영향을 조사하였다. 그 결과, 산소 정상 상태 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서는, 사용한 조건 하의 No.5 프로브에 대해 현저한 결합 활성은 확인되지 않았다. 그러나 자극 후 16 ~ 21 시간 동안의 핵 추출액에서는 저산소에 의한 결합 활성의 증강이 확인되고, 적어도 24 시간 지속되는 것으로 나타내어졌다.

본 실시형태에서의 모든 실험은 별도의 세포 배양물을 사용하여 적어도 4 회 반복하고, 동일한 결과가 얻어졌다. 따라서 저산소에 의해 유도되는 결합 활성은 No.5 프로브에 특이적이라는 것이 시사된다.

실시예 3인간 PS2 엑손 5 결합 단백질의 정제 및 동정

실시예 2 에서의 No.5 프로브에 대한 결합 활성을 갖는 인자를 정제하기 위해, 피검 분획을 pre-mRNA 결합성 반응물에 첨가하고, No.5 의 프로브에 대한 결합 활성의 증가를 측정함으로써 어세이하였다.

개략적인 정제 순서를 도 7 에 나타낸다. 도 7 에 나타내어진 (Ⅰ) ~ (Ⅴ) 의 각 분획을 은 염색 (도 8) 및 RNA 결합 어세이 (도 9) 에 의해 어세이하였다.

실시예 1 과 동일하게 저산소 조건에 노출된 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 (도 9, 레인 1) 을 60 % 포화 황산 암모늄으로 분획하고, 상청으로서 No.5 RNA 프로브에 대한 결합 활성을 갖는 분획 [분획 (Ⅱ), 도 7 (Ⅱ)] 을 얻었다. 또한 상기 분획 (Ⅱ) 의 은 염색 결과를 도 8 의 레인 2 에 나타내고, RNA 결합 어세이의 결과를 도 9 의 레인 2 에 나타낸다.

상기 분획 (Ⅱ) 을 각각 5 ℓ의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 중에서 4 ℃ 에서 4 시간, 2 회 투석하고, 이에 의해 황산 암모늄을 제거하였다. 얻어진 투석물을 DEAE 칼럼 {파마시아 바이오테크 (Pharmacia biotech) 사 제조] 에 의한 음이온 교환 크로마토그래피에 넣고, 그 후 칼럼을 10 ㎖ 의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 으로 세정하였다. 이어서, 1 M NaCl 을 함유한 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 10 ㎖ 를 사용하여 용출시키고, No.5 RNA 프로브에 대한 강한 결합 활성을 갖는 분획 [분획 (Ⅲ), 도 7 (Ⅲ)] 을 얻었다. 또한 상기 분획 (Ⅲ) 에 대해서, 은 염색의 결과를 도 8 의 레인 3 에 나타내고, RNA 결합 어세이의 결과를 도 9 의 레인 3 에 나타낸다.

상기 분획 (Ⅲ) 을 5 ℓ의 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 에 대해 4 ℃ 에서 4 시간, 2 회 투석하였다. 이어서, 얻어진 투석물을, 5'-아미노-2'-O-메틸올리고 RNA (5'-aucuucuugguggugcucuacaaguaccgcugcuacaaggugaggcccu-3' 서열번호 24) 결합 CNBr 활성화 세파로스 4B [파마시아 바이오테크 (Pharmacia biotech) 사 제조] 어피니티 칼럼에 넣었다. 상기 어퍼니티 칼럼을 상기 인큐베이션 완충액 10 ㎖ 로 세정하고, 1 M NaCl 을 함유한 인큐베이션 완충액 15 ㎖ 를 사용하여 용출시켜, No.5 RNA 프로브에 대한 결합 활성을 갖는 분획 [분획 (Ⅳ), 도 7 (Ⅳ)] 을 얻었다 (도 9 의 레인 4). 분획 (Ⅳ) 에 대해 은 염색의 결과를 도 8 의 레인 4 에 나타내고, RNA 결합 어세이의 결과를 도 9 의 레인 4 에 나타낸다.

은 염색의 결과로부터, 도 8 의 레인 4 에 나타나는 바와 같이 완전하게는정제되어 있지 않은 것을 알 수 있었다.

이어서, 상기 분획 (Ⅳ) 을 5 ℓ의 Mili-Q 수에 대해 4 ℃ 에서 4 시간, 2 회 투석하였다. 얻어진 투석물을 완전히 동결 건조시킨 후, 0.1 % TFA 를 함유한 Mili-Q 수에 재용해시켰다.

얻어진 용액을 Waters 5C18-MS (4.6 ㎜ ×150 ㎜) 칼럼을 사용한 역상 크로마토그래피에 제공하였다. 즉 0.1 % TFA 를 함유한 Mili-Q 수로 칼럼을 세정하였다. 그 후 0 ~ 100 % 의 리니어 글라젠트 아세토니트릴의 0.1 % TFA 함유 Mili-Q 수용액 25 ㎖, 이어서 0.1 % TFA 함유 100 % 아세트니트릴 5 ㎖ 를 사용하여 용출하였다.

그 결과 20 ~ 25 % 아세토니트릴로 용출된 단일 피크의 분획 [분획 (Ⅴ), 도 7 (V)] 을 얻었다. 이러한 분획은 SDS-PAGE 후의 은 염색에 의해 도 8, 레인 5 에 나타나는 바와 같이, 흑색 화살표로 나타낸 분자량의 위치에 있어서 단일한 밴드를 나타내었다. 그러나 최종 분획의 결합 활성은 앞서의 스텝 [도 7 (Ⅳ)] 의 것과 비교하여 극적으로 저하되었다. 결합 반응 용액에서의 아세토니트릴의 최종 농도를 30 % 로 함으로써, 원래의 분획 중의 프로브 No.5 에 대한 결합 활성이 거의 완전히 소실되었기 때문에, 최종 분획의 결합 활성의 감소는 역상 크로마토그래피용 용리 완충액에 함유되는 아세토니트릴에 의존하는 것을 알 수 있다.

얻어진 분획을 0.1 % SDS 를 함유한 12 % 폴리아크릴아미드 겔로, 15 ㎃/플레이트의 일정 전류로 2 시간, 실온에서 전기영동하여 분리시켰다. 그 후 분리된 단백질 밴드를 포함하는 겔 단편을 잘라내고, 트립신을 사용하여 겔 내에서 소화시켰다. 용출된 펩티드 단편을 TSK 겔 ODS-80Ts QA 칼럼 (2.0 ㎜ ×250 ㎜, 토소사 제조) 을 사용한 HPLC 에 의해 분리시켰다. 이어서 분리된 펩티드 단편을 자동 단백질 시퀀서 (HP G1005A Protein Sequencing System) 에 의해 해석하였다. 얻어진 펩티드 서열 정보를 데이터 베이스의 검색에 사용하였다.

최종 분획 중의 단일 밴드에 대해 펩티드 서열을 해석하여 17 개의 아미노 산 서열을 얻었다. 얻어진 펩티드 서열을, 서열 데이터 베이스의 기존에 알려진 단백질과 비교한 결과, 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 중의 PS2 pre-mRNA 결합성 단백질은 HMG-I 에 완전히 매치되었다 (진 뱅크 억세션 번호 P 17096).

실시예 4HMG-I 의 결합 활성의 평가

실시예 3 의 결과에 기초하여, HMG-I 가 실제로 결합 활성을 갖는 물질인 것을 확인하기 위해, HMG-I 단백질에 대한 항체와, 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 또는 산소 정상 상태의 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액을 사용하여, 실험예 13 에 따라서 아래와 같이 수퍼 시프트 어세이를 실시하였다.

즉 5 ㎍ 단백질 상당량의 핵 추출액을 0.5 ~ 2.0 ㎍ 의 항 HMG-I/Y 항체 [산타쿠르즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology) 사 제조] 와 함께, 4 ℃ 에서 8 시간 인큐베이트하여 전처리하였다. 전처리한 핵 추출액을 인큐베이션 완충액 중에서 10 ㎍ 의 tRNA 와 함께 인큐베이트하고, 이어서, 얻어진 산물에 전체 용량 50 ㎕ 의³²P 표지 RNA 프로브 [1 ㎍, 도 4 에 나타낸 No.5 프로브] 를 첨가하여 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 결합 프로브와 유리 프로브를 50 mM Tris 와 0.38 M 글리신과 2 mM EDTA 를 함유한 완충액 (pH 8.5) 중에서, 4 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서, 11 V/㎝ 의 일정 전압에 의하여 1.5 시간, 4 ℃ 에서 전기영동함으로써 분리하였다. 겔을 고정시키고 건조시켰다. 이어서, 건조 겔을 X 선 필름에 노출시켜 오토 라디오 그래피를 실시하였다.

그 결과 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액을 사용한 경우, 도 10 의 우 패널의 레인 1 및 2 에 나타나는 바와 같이, 산소 정상 상태의 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액을 사용한 경우보다도 강한 결합 활성이 보였다. 또한 이 결합 활성의 증가는 도 10 의 우 패널의 레인 3 ~ 5 에 나타나는 바와 같이, 항 HMG-I/Y 항체에 의한 전처리에 의해 항체 농도 의존적으로 수퍼 시프트되는 것을 알 수 있다. 그러나 도 10 의 좌 패널에 나타내는 바와 같이, 대조 실험으로서의 산소 정상 상태의 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서는 HMG-I/Y 항체의 첨가에 의한 현저한 효과는 관찰되지 않았다.

이들 결과에 의해 프로브 No.5 에 대한 결합 활성을 갖는 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래 물질은 HMG-I 인 것으로 나타난다.

또한 HMG-I 단백질의 저산소 노출 세포에서의 프로브 No.5 에 대한 결합 활성은 pre-mRNA 결합 어세이에서는 UV 조사에 의존하지 않는 것으로 나타난다.

실시예 5PS2 pre-mRNA 결합 부위의 결정

본 발명자들은, 도 4 의 프로브 No.5 의 PS2 엑손 5 의 3' 말단에서의 2 회 반복된 유사 서열 (반복 서열) 에 착안하여, HMG-I 단백질이 이들 반복 서열에 결합되는 것을 예상하였다. 따라서 프로브 No.5 의 유도체로서 도 11 에 나타낸 6 종의 RNA 프로브 (프로브 No.6 ~ 11) 를 조제하고, 얻어진 프로브를 사용하여 상기 실험예 7 에 따라서 pre-mRNA 결합을 어세이하였다. 그 결과를 도 12 에 나타낸다. 또한 상기 반복 서열은 도 11 의 프로브 No.5 중에서의 밑줄친 부분의 서열로서, 각각을 서열번호 1 및 2 에 나타내어진다.

도 12 의 레인 1 에 나타나는 바와 같이, 프로브 No.5 에 대한 결합 활성은 산소 정상 상태 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서 검출할 수 없었다. 한편, 프로브 No.5 에 대한 결합 활성은, 도 5 및 도 6 과 동일하게 도 12 의 레인 2 에 나타나는 바와 같이, 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액을 사용함으로써 흑색 화살표로 나타낸 분자량의 위치에서 강하게 증가하는 것을 알 수 있다.

그러나 저산소 노출에 의한 이 결합 활성의 증대는, 도 12 의 레인 3 에 나타나는 바와 같이 서열번호 1 및 2 의 서열을 결여한 프로브 (도 11 의 프로브 No.6) 를 사용함으로써 소실되었다. 한편 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서, 서열번호 1 및 2 의 각각을 직접 결합시킨 서열을 함유하는 프로브 No.7 (도 11) 을 사용함으로써 결합이 강하게 상승되었다 (도 12, 레인 4). 또한 서열번호 1 및 2 의 서열에서 각각의 C 를 A 에 치환된 서열을 포함하는 프로브 No.8 (도 11) 을 사용한 경우, 도 12 의 레인 5 에 나타나는 바와 같이 대개의 부분에서 완전히 결합 활성이 소실되었다. 그리고 서열번호 1 또는 2 의 어느 하나를 결합 어세이에 사용하여 결합 활성을 관찰하면 (도 12, 레인 6 또는 8), 양 서열을 갖는 프로브 No.10 에 대한 결합 활성이 가장 강하였다 (도 12, 레인 7).이들 결과는 서열번호 1 또는 2 의 어느 하나 또는 양자가 PS2 pre-mRNA 에 대한 HMG-I 단백질의 결합 활성에 필요하다는 것을 의미한다.

도 12 는, 서열번호 1 또는 2 의 어느 하나 또는 모두가 PS2 pre-mRNA 에 대한 HMG-I 의 결합 활성에 필요하다는 것을 나타낸다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 의 서열을 데이터 베이스 외의 유전자와 비교하기 위해 상동성을 조사한 결과, 상기 서열번호 1 및 2 는 지금까지의 결과 PS2 의 엑손 5 에 특유의 서열인 것으로 나타난다.

이상의 결과는, HMG-I/Y 단백질이 1 본쇄 RNA 에 결합하는 것을 나타내고, HMG-I 단백질이 gcucuacaag (서열번호 1) 및/또는 gcugcuacaag (서열번호 2) 를 함유한 서열로 이루어지는 부위를 인식하고 결합하는 것을 나타낸다.

실시예 6HMG-I mRNA 및 면역 반응성 HMG-I 단백질의 발현에 대한 저산소의 영향

결합 활성의 증가가 HMG-I 의 발현 증가에 의존하는지의 여부를 조사하기 위해, HMG-I 의 mRNA 및 단백질의 발현 레벨에 대해 산소 정상 상태의 경우와 저산소 노출된 경우를 비교하였다.

도 13 의 상부 좌 패널에 나타난 바와 같이, 노던 블롯 해석에 의해 HMG-I 의 mRNA 레벨은 신경아세포종 SK-N-SH 세포에서 PS2V 를 발현하는 조건인 저산소 노출에 의해 극적으로 증가하는 것을 알 수 있다. 그러나 PS2V 를 유도하지 않는 저산소 노출 HEK-293T 세포를 사용한 경우 (도 13, 상부 중앙 페널) 또는 PS2V 를 유도하지 않는 투니카마이신 처리 SK-N-SH 세포를 사용한 경우 (도 13, 상부 중앙 패널) 에서는 스트레스 하에서의 현저한 증가를 볼 수 없는 것을 알 수 있다.

그 결과, 도 14 에서 좌 패널에서의 상측 화살표로 나타낸 바와 같이, 항 HMG-I/Y 항체를 사용한 면역 블롯 해석에 의해, 면역 반응성 HMG-I 단백질은 저산소 노출 SK-N-SH 세포 추출액에서 산소 정상 상태 조건 하의 세포인 경우보다도 많이 발현되는 것을 알 수 있다. 그러나 도 14 의 좌 패널에서의 하측 화살표로 나타낸 바와 같이, 면역 반응성 HMGY 단백질은 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서 저산소 스트레스에 의한 영향을 받지 않는 것을 알 수 있다. 도 14 의 우 패널에 나타난 바와 같이, 저산소 노출 HEK-293T 세포에서는 항 HMG-I/Y 항체에 의한 현저한 면역 반응성을 볼 수 없는 것을 알 수 있다.

저산소 노출 HEK-293T 세포 및 투니카마이신 처리 SK-N-SH 세포를 사용하는 실험에 의해 나타난 결과는, 저산소에 의해 초기 사상 (事象) 으로서 HMG-I/Y mRNA 의 정상 상태의 세포 레벨이 증가되고, 이에 수반하여 HMG-I/Y 단백질이 증가된다는 앞서의 보고 [지 (Ji, Y. S.) 외, Circ. Res., 83, 295-304 (1998)] 와 모순된다. 이 명백한 모순은 각 세포주의 상이함을 반영하는 것일 지도 모른다.

실시예 7HMG-I 단백질의 세포 레벨에서의 국재

세포 하의 국재를 조사하기 위해, SK-N-SH 세포 배양물을 저산소 조건에 21 시간 노출시키고, 항 HMG-I/Y 항체와 항 SC 35 항체를 사용하여 면역 형광 현미경에 의해 HMG-I 단백질을 검출하였다. 또한, 항 SC 35 항체는 스플라이싱의 필수 인자인 SC 35 단백질에 대한 항체이다. 본 실시예에서는 상기 항 SC 35 항체를, 스플라이싱 인자의 존재점인 스펙클의 마커로 사용하여 면역 세포 화학적 검사를 실시하였다.

면역 세포 화학적 검사를 실시한 결과, 산소 정상 상태 하의 세포에서는, 도 15 의 산소 정상 상태의 도면에 나타난 바와 같이, HMG-I 단백질은 주로 핵에 국재하여 약하고, 산재적인 면역 반응이 핵 스펙클에만 존재하는 면역 반응성 SC 35 단백질과 공(共)-국재하지 않고 세포질에서 얻어지는 것을 알 수 있다.

그러나, SC 35 가 공-국재하는 핵 스펙클에 있어서, 보다 강한 면역 반응성이 얻어지고, 세포질의 면역 반응성은 저산소 노출 SK-N-SH 세포에서 산소 정상 상태의 세포보다도 저하되었다. 따라서 HMG-I 단백질이 SK-N-SH 세포에서 저산소 자극에 의해 유도될 뿐만 아니라, 세포질로부터 핵에 축적되고, HMG-I 의 발현과 PS2V 의 유도 간에 상관관계가 있는 것으로 보인다.

실시예 8인ㆍ비보에서의 PS2 유전자의 엑손 5 스키핑에 대한 HMG-I 및 HMGY 의 일과성 트랜스펙션의 효과

상기 사토 (Sato) 외의 문헌 [사토 (Sato) 외, J. Neurochem., 72, 2498-2505 (1999)] 에 기재된 방법에 따라서 고발성 알츠하이머병의 뇌 및 저산소 노출 SK-N-SH 세포의 각각으로부터 엑손 5 를 결손시킨 선택적 스플라이싱형의 PS2 유전자를 얻었다.

PS2 유전자의 엑손 5 결손을 수반하는 선택적 스플라이싱이 HMG-I/Y 에 의해 일어나는지의 여부를 조사하기 위해, SK-N-SH 배양 세포 및 HEK-293T 배양 세포에서의 PS2V 의 유도에 대한 HMG-I 의 일과성 발현의 효과를 조사하였다. 면역 블롯 해석의 결과를 도 16 에 나타내고, RT-PCR 의 결과를 도 17 에 나타낸다.

도 16 에 나타낸 바와 같이, HMG-I 트랜스펙션 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 및 HMG-I 트랜스펙트 HEK-293T 배양 세포 유래의 핵 추출액의 각각에서, 이들 mock 트랜스펙트 세포 유래의 핵 추출액보다도, 더욱 강한 면역 반응성 HMG-I 단백질의 발현이 발견되었다. 또한 도 17 의 레인 1 에 나타나는 바와 같이, mock 트랜스펙트 SK-N-SH 세포 유래의 전체 RNA 의 RT-PCR 어세이에서 전체 길이 PS2 유전자가 대응하는 분자량의 위치에서 주요 전사 산물 (도 17 중, PS2) 로서 검출되는 것을 알 수 있다. 대조적으로 HMG-I 트랜스펙트 세포 유래의 전체 RNA 를 사용할 경우, RT-PCR 어세이에 의해 도 17 의 레인 2 및 레인 3 에 나타나는 바와 같이, 전체 길이 PS2 인 주전사 산물 (도 17 중, PS2) 뿐만 아니라 HMG-I 양 의존적으로 더욱 단쇄의 RT-PCR 산물 (도 17 중, PS2V) 도 검출되는 것을 알 수 있다.

이상 RT-PCR 산물은 다이렉트 시퀀스 해석에 의해, 엑손 5 를 결여하는 PS2 의 얼터너티브 스플라이싱 산물인 것이 나타나 있다. 이에 대해 도 17 의 레인 4 및 레인 5 에 나타나는 바와 같이, HMG-Y 의 일과성 프랜스펙션에 의해 PS2V 의 약한 유도가 SK-N-SH 세포에서 보이나, HMGY 단백질은 SK-N-SH 세포 유래 핵 추출액에서 저산소에 의해 유도되지 않는다. 추가로 도 17 에 나타내는 바와 같이, PS2V 가 저산소에 의해 유도되지 않는 세포주 (도 2) 인 HEK-293T 세포에서 HMG-I 의 과잉 발현에 의해 PS2V 가 검출된다.

스플라이싱의 필수 인자의 하나인 U1 (70K) snRNP 는 통상적으로 5' 스플라이싱 부위에 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서 HMG-I 는 Ui snRNP 의 pre-mRNA 에 대한 결합을 저해할 수 있는 것이 예상된다. 따라서 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서의 U1 (70K) snRNP 의 pre-mRNA 에 대한 결합 활성에 대한 HMG-I 의 효과를 조사하였다.

U1 (70K) snRNP 에 대한 항체 [항 U1 (70K) snRNP 항체 (산타쿠루즈 바이오테크놀로지사 제조)] 를 사용하여, 실험예 13 에 따라서 아래와 같이 수퍼 시프트 어세이를 실시하였다.

즉 5 ㎍ 단백질 상당량의 핵 추출액을 1 ㎍ 의 항 HMG-I/Y 항체 (산타쿠르즈 바이오테크놀로지사 제조) 와 함께 4 ℃ 에서 8 시간 인큐베이트하고 전처리하였다. 얻어진 전처리 산물을 인큐베이션 완충액 [조성: 60 mM KCl 과 4 mM MgCl₂와 1 mM EDTA 와 1 mM EGTA 와 1 mM DTT 와 10 % 글리세롤과 1 mM PMSF 를 함유한 12 mM HEPES-NaOH 완충액 (pH 7.9)] 중에서 2 ㎍ 의 tRNA 와 함께 인큐베이트하였다. 이어서³²P 표지 RNA 프로브 [1 ㎍, 도 4 에 나타낸 No.5 프로브] 를 첨가하여 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다 (전체 용량 50 ㎕). 얻어진 반응물을 50 mM Tris 와 0.38 M 글리신과 2 mM EDTA 를 함유한 완충액 (pH 8.5) 중에서, 4 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 11 V/㎝ 의 일정 전압에 의하여 1.5 시간, 4 ℃ 에서 전기영동함으로써 결합 프로브와 유리 프로브를 분리하였다. 전기영동 후의 겔을 고정, 건조시키고, 이어서 X 선 필름에 노출시켰다. 그 결과를 도 18 에 나타낸다.

도 18 의 좌 패널에 나타내는 바와 같이, Mock 트랜스펙트 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서의 프로브 No.12 에 대한 결합 활성은, 항 U1 (70K) snRNP 항체에 의한 전처리에 의해 항체 농도 의존적으로 수퍼 시프트하는 것을 알 수 있다. 또한 도 18 의 좌 패널의 레인 1, 우 패널의 레인 1 에 나타나는 바와 같이, HMG-I 트랜스펙트 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서는, Mock 트랜스펙트 세포 유래의 핵 추출액보다도 강한 결합 활성이 보여진다.

그러나 이들 결합 활성은, 도 18, 레인 2 ~ 4, 우 패널에 나타나는 바와 같이 HMG-I 트랜스펙트 SK-N-SH 세포 핵 추출액에서는, 항 U1 (70K) snRNP 항체의 첨가에 의한 영향을 받지 않는 것을 알 수 있다. 즉 이들 결과에 의해 HMG-I 는 pre-mRNA 에 대한 U1 (70K) snRNP 의 결합 활성을 저해하는 것이 나타내어진다.

또한, HMG-I 에 의한 pre-mRNA 에 대한 U1 (70K) snRNP 의 결합 활성의 저해를 조사한 결과를 도 19 에 나타낸다.

도 19 에 나타낸 바와 같이, HMG-I 는 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서는 U1 (70K) snRNP 와 직접 결합하나, 산소 정상 상태 노출 세포 유래의 핵 추출액에서는 U1 (70K) snRNP 와 결합하지 않는 것을 알 수 있다.

SK-N-SH 세포에서의 HMG-I 일과성 트랜스펙션은 PS2V 의 발현을 유도하였다 (도 17). 추가로 저산소 노출에 의해 PS2V 가 발현되지 않은 세포주인 HEK-293T 세포 (도 2) 에서의 HMG-I 의 과잉 발현에 의해, 검출 가능한 PS2V 가 관찰되었다 (도 17). 따라서 PS2V 는 세포에 의해 HMG-I 를 과잉 발현시키는 것만으로도 유도된다고 할 수 있다. 저산소 자극보다도 HMG-I 발현의 증가가 PS2V 의 유도에 필요하다는 것이 시사된다.

U1 (70K) snRNP 는 스플라이싱의 필수 인자로서, 5' 스플라이싱 부위를 인식하여 이 5' 스플라이싱 부위에 결합한다. U1 (70K) snRNP 인식서열 및 HMG-I 인식 서열은 No.5 프로브 상에서 서로 근접하고 있다. U1 (70K) snRNP 의 PS2 mRNA 에 대한 결합 활성은 HMG-I 트랜스펙트 SK-N-SH 유래의 핵 추출액에 의해 시험관내 저해된다 (도 18).

또한 HMG-I 단백질은, 저산소 노출 SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액에서 U1 (70K) snRNP 와 결합하였다 (도 19). 본 실시예에서 관찰된 HMG-I 와 및 U1 (70K) snRNP 의 회합은, SF2/ASF 와 U1 (70K) snRNP 의 결합을 저해한 후, 그 결과로서 U1 (70K) snRNP 의 pre-mRNA 에 대한 결합 활성을 억제하는 것으로 생각된다.

또한 HMG-I 가 pre-mRNA 또는 도 20 에 나타내는 바와 같은 다른 스플라이싱 인자에 대한 U1 (70K) snRNP 의 결합을 저해함에 따라 U1 (70K) snRNP 의 PS2 pre-mRNA 에 대한 작용을 억제할 가능성이 보인다.

실시예 9sAD 뇌에서의 HMG-I/Y 단백질의 발현

실제로 HMG-I 단백질이 PS2 의 엑손 5 가 결여된 선택적 스플라이싱을 유도한다면, 당연히 대조 뇌보다도 sAD 뇌에서 더욱 강한 HMG-I 의 발현이 관찰될 것으로 생각된다. 따라서 면역 블롯 어세이에 의해 대조 뇌에서의 HMG-I 의 발현 레벨을 sAD 뇌에서의 경우와 비교하였다. 그 결과를 도 21 에 나타낸다.

도 21 의 좌 패널 및 우 패널에 나타내는 바와 같이, HMG-I 단백질 및 Y 단백질은 모두 연령이 매치된 대조와 비교하면 증가되어 있고, 3 명의 상이한 sAD 환자의 해마 유래의 전체 라이세이트 및 핵 분획에서 발현하는 것을 알 수 있다. 그러나 도 21 의 중앙 도에 나타난 바와 같이, 해마의 시토졸 분획에서는 sAD 환자와 대조 간에 현저한 차가 보이지 않는 것을 알 수 있다.

해마의 HMG-I/Y 발현 영역을 특정하기 위해, 항 HMG-I/Y 항체를 사용하여 면역 조직 화학 해석을 실시하였다. 그 결과를 도 22 에 나타낸다. 도 22 에 나타내는 바와 같이, sAD 뇌의 해마 CA1 영역의 추체 세포층에서 대조보다도 강한 면역 반응성의 발현이 확인된다.

면역 조직 화학적 해석에서, 면역 반응성 HMG-I/Y 단백직은, 대조 뇌의 해마 유래의 핵 분획에서 검출되었으나 (도 21), 대조 뇌의 해마 CA1 영역에서는 HMG-I/Y 단백질은 거의 검출되지 않았다 (도 22). 이것은 HMG-I/Y 가 대조 해마의 다공층부터 분자층에 걸쳐 발현되었기 때문으로, sAD 뇌와의 비교에서 차이는 없었다.

sAD 의 해마 핵 분획에서는 HMG-I 단백질 및 Y 단백질의 양자에 대해 대조보다도 강한 발현이 관찰되었으나, 시토졸 분획에서는 관찰되지 않았다 (도 21). 또한 면역 조직학적 검사에 의해, HMG-I/Y 단백질은 sAD 뇌의 해마 CA1 영역의 추체 세포에서 검출되었다 (도 22). 이들 결과는 HMG-I/Y 단백질이 PS2 pre-mRNA 에 결합하고, sAD 의 뇌 및 세포주에서 PS 유전자의 엑손 5 가 결여된 스플라이싱 변이체를 실제로 유도할 가능성을 나타낸다.

실시예 10

상기 사토 외의 문헌에 따라서 신경아세포종 SK-N-SH 세포의 전체 RNA 의 조제 및 RT-PCR 을 실시하고, 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 에 의한 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성 억제효과에 대해 아래와 같이 검토하였다.

신경아세포종 SK-N-SH 세포를 10 % 소태아 혈청을 함유한 달베코 최소 필수 배지 [기브코 비ㆍ알ㆍ엘사 제조] 8 ㎖ 에 파종하고, 각 0, 10, 15 ㎍ 의 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) (각각 0 ㎕, 20 ㎕, 45 ㎕) 를 올리고펙타민을 사용하여 트랜스펙션하였다. 올리고펙타민만 (각각 0 ㎕, 20 ㎕, 45 ㎕) 을 사용한 경우에는 현저한 변화가 확인되지 않았다.

상기 세포를 5 % CO₂, 37 ℃ 조건 하에서 16 시간 배양하였다. 배양 12 시간 후에 배지를 교환하였다. 그 후 얻어진 세포를 저산소 챔버 (산소압 8 torr) 중에서 추가로 21 시간 배양하였다.

이어서, 상기와 동일하게 RNeasy 토탈 RNA 키트 [퀴아겐 (Qiagen) 사 제조] 를 사용하여 전체 RNA 를 추출, 정제하였다.

얻어진 전체 RNA 와, 마우스 몰로니 백혈병 바이러스 역전사 효소 [프로메가 (Promega) 사 제조] 를 이용하여 42 ℃ 에서 1 시간 역전사 반응을 실시하였다. 얻어진 반응물을 주형으로 하여 1 차 PCR 을 실시하고, 얻어진 PCR 산물을 주형으로 하여 2 차 PCR 을 추가로 실시하였다.

PCR 의 서멀 프로파일은 95 ℃ 30 초-60 ℃ 30 초-72 ℃ 1 분 (최종 사이클에서는 72 ℃ 2 분) 을 1 사이클로 한 30 사이클이다. 1 차 PCR 에는 프라이머 ps251 (서열번호 9) 과 프라이머 ps231 (서열번호 10) 을 사용하였다. 2 차 PCR 에는 프라이머 ps252 (서열번호 11) 와 프라이머 ps233 (서열번호 12) 을 사용하였다.

얻어진 산물을 5 % 폴리아크릴아미드 겔 (TBE) 을 사용하여 전기영동하고, 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화하였다.

또한 대조로서 2'-O-메틸올리고 RNA 를 도입하지 않은 신경아세포종 SK-N-SH 세포 유래의 RNA 를 사용하였다. 결과를 도 24 에 나타낸다.

도 24 에 나타낸 바와 같이, 2'-O-메틸올리고 RNA 를 도입하지 않은 경우에 비해, 도입한 경우에는 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체 (도면 중 PS2V) 의 생성이 억제되는 것을 알 수 있다.

실시예 11

시험관 내에서, PS2 pre-mRNA 에 대한 저산소 유도된 HMG-I 의 결합에서의 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 의 영향을 조사하였다.

정상 산소 조건 또는 저산소 조건에서, SK-N-SH 세포를 5 % CO₂, 37 ℃ 조건 하에서 21 시간 배양하였다. 얻어진 세포로부터 핵 추출액을 조제하였다. 그 후 얻어진 핵 추출액과,³²P 표지 RNA 프로브 No.5 와, 각종 사용량의 2'-O-메틸올리고 RNA (레인 3, 0.5 ㎍ 레인 4, 5 ㎍ 레인 5, 50 ㎍ 레인 6, 500 ㎍) 를 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 결합 프로브와 유리 프로브를 50 mM Tris 와 0.38 M 글리신과 2 mM EDTA 를 함유한 완충액 (pH 8.5) 중에서, 4 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 11 V/㎝ 의 일정 전압에 의하여 1.5 시간, 4 ℃ 에서 전기영동함으로써 분리하였다. 그 후 전기영동 후의 겔을 고정, 건조시켰다. 이어서건조 겔을 X 선 필름에 노출시켜 오토 라디오 그래피를 실시하였다. 결과를 도 25 에 나타낸다.

도 25 의 레인 1 및 레인 2 에 나타나는 바와 같이, 서열번호 3 에 나타나는 서열을 갖는 RNA 프로브 No.5 에 대한 HMG-I 결합은, 산소 정상 조건에서 배양된 SK-N-SH 세포에 비해 저산소 조건 하에서 배양된 SK-N-SH 세포의 핵 추출액에서 증가하였다. 이들 결합의 증가는, 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 의 첨가에 의해 용량 의존적으로 저해되었기 때문에, 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 가 HMG-I 와 PS2 pre-mRNA 상의 표적 부위의 저산소 유도된 결합 활성을 저해하는 것을 알 수 있다.

실시예 12

³²P 표지한 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 를 올리고펙타민을 사용하여 SK-N-SH 세포에 도입하였다. 이어서, 전체 용해물, 핵 획분, 및 시토졸 획분의 각각을 추출하였다. 그 후 전체 용해물, 핵 획분, 및 시토졸 획분의 각각에서의 방사활성을 측정함으로써, SK-N-SH 세포 중에서의 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 의 안정성과, 이 SK-N-SH 세포에 대한 2'-O-메틸올리고 RNA 의 도입 효율을 조사하였다. 결과를 도 26 의 패널 A 에 나타낸다.

도 26 의 패널 A 의 a 에 나타난 바와 같이, 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 는 소실되지 않고, SK-N-SH 세포에 유도되어 용량 의존적으로 핵에 송달되는 것을 알 수 있었다. 또한 도 26 의 패널 A 의 b 에 나타낸 바와 같이, SK-N-SH 세포에 대한 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 의 도입 효율은 20 ㎍/10 ㎝ 디쉬의 2'-O-메틸올리고 RNA 를 사용한 경우 비율이 가장 높아졌다.

그러나 도 26 의 패널 A 로부터 주입량은 약 15 ㎍/10 ㎝ 디쉬의 2'-O-메틸올리고 RNA 로 추정되므로, 이후의 세포 도입 시의 최고 용량을 15 ㎍/10 ㎝ 디쉬로 설정하였다.

또한 SK-N-SH 세포에 대한 2'-O-메틸올리고 RNA 의 도입 후 48 시간이 지난 시점에서, 핵에서의 도입된 2'-O-메틸올리고 RNA 의 안정성을 조사하였다. 그 결과를 도 26 의 패널 B 에 나타낸다.

도 26 의 패널 B 에 나타내는 바와 같이, 도입 후 48 시간 후에도 2'-O-메틸올리고 RNA 는 오리지널 분획 중에 존재하고 있던 분자량과 거의 동등한 점, 즉 이 2'-O-메틸올리고 RNA 는 48 시간 후에도 핵 내에 들어가 분해되지 않고 안정되어 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 13

SK-N-SH 세포 유래의 핵 추출액 중의 HMG-I 의 DNA 결합에서의 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 의 작용을 조사하였다.

처음에, 시험관내 DNA 선별 어세이에 의해, HMG-I 인식 모티프의 염기서열을 결정하였다. 시험관내 DNA 선별 어세이 순서는 아래와 같다. 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' (서열번호 67) 와, 5'-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' (서열번호 68) 를 프라이머로 사용하고, [94 ℃ 1 분-53 ℃ 1 분-72 ℃ 1 분] 을 1 사이클로 한 7 사이클의 PCR 에 의해 31 뉴클레오티드의 랜덤한 서열 (16 클론의 다이렉트 시퀀스에 의해 20.7 % A, 22.7 % C, 31.5 % T,25.1 % G) 을 함유하는 합성 DNA [5'-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N₃₁) TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3'] 를 증폭시켰다.

얻어진 산물을, 인큐베이션 완충액 [60 mM KCl 과 4 mM MgCl₂과 1 mM 과 EDTA 와 1 mM EGTA 와 1 mM DTT 와 10 % 글리세롤과 1 mM PMSF 를 함유한 12 mM HEPES-NaOH (pH 7.9)] 중에서 대장균 발현 재조합 HMG-I (rHMG-I 로 표기함) 와 함께 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다.

얻어진 반응 용액에 대해, HMG-I 에 대한 항체를 사용한 면역 침강을 실시하고, 면역 침강한 산물을 주형으로 하여 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' (서열번호 67) 와, 5'-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' (서열번호 68) 를 프라이머로 사용하고, [94 ℃ 1 분-53 ℃ 1 분-72 ℃ 1 분] 을 1 사이클로 한 7 사이클의 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 pGEM-T 벡터 (프로메가사 제조) 에 클론화하고 다이렉트 시퀀스를 해석하였다.

그 결과, 도 27 의 최상단에 나타낸 콘센서스 서열이 HMG-I 인식 모티프인 것이 시사되었다.

이어서, 상기 HMG-I 인식 모티프를 함유하는³²P-표지 DNA 프로브 [gcgG(A)GT(A)A(T)ATTTcgc (서열번호 66)] 와 HMG-I 의 결합에서의 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 의 작용을 조사하였다.

핵 추출액의 단백질 함유량을 측정한 후, 상기 인큐베이션 완충액에, 5 ㎍단백질 상당량의 추출액과, 1 ㎍ 폴리 dIdC 와, 각 농도의 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 를 첨가하고, 이어서 1 ㎍ 의³²P 표지 DNA 프로브 [gcgG(A)GT(A)A(T)ATTTcgc (서열번호 : 66)] 를 첨가하여 전체 50 ㎕ 로 하고, 추가로 25 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다.

그 후 50 mM 트리스와 0.38 M 글리신과 2 mM EDTA 를 함유하는 완충액 중에서 11 V/㎝ 정상 전압, 4 ℃, 1.5 시간에서의 4 % 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결합 프로브와 유리 프로브를 분리하였다. 영동 후의 겔을 건조시키고, 오토 라디오 그래피에 의해 해석하였다.

그 결과, 도 28 의 패널 A 및 패널 B 의 각각의 레인 1 및 레인 2 에 나타나는 바와 같이, SK-N-SH 세포에서의 HMG-I 의 과잉 발현에 의해 상기 HMG-I 인식 모티프를 함유하는³²P -표지 DNA 프로브와 HMG-I 의 결합은 극적으로 상승하였다.

그러나 도 28 의 패널 A 및 패널 B 의 각각의 레인 3 및 4 에 나타나는 바와 같이, 상기 DNA 프로브에 대한 HMG-I 의 결합 활성의 상승에 관해 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 에 의한 현저한 영향은 관찰되지 않았다.

따라서 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 의 저해작용은, RNA 에 대한 HMG-I 의 결합에 특이적이나, DNA 에 대한 HMG-I 의 결합에는 특이적이지 않은 것이 아닌 것으로 나타났다.

실시예 14

2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 를 도입한 SK-N-SH 세포 [피검 세포] 와도입되지 않은 SK-N-SH 세포 [대조 세포] 를 각각 저산소압 (8 torr) 의 가습 분위기 하에 유지한 저산소 챔버를 구비한 인큐베이터를 사용하고, 37 ℃ 에서 저산소 조건 하 또는 정상 산소 조건 하에서 21 시간 배양하고, 이어서 2 μM 투니카마이신의 존재 또는 비존재 하에서 10 시간 배양하였다.

그 후 프로메가사 제조 상품명: Cell Titer 96^RAQueous One Solution Proliferation Assay 를 사용하고, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨 어세이 (MTS 어세이라고 함) 를 실시함으로써 세포의 생존율을 해석하였다.

그 결과 도 29 의 패널 A 의 레인 4 ~ 7 에 나타나는 바와 같이, 저산소 자극과 투니카마이신에 의해 유도된 세포사는, 상기 2'-O-메틸올리고 RNA 의 도입에 의해 용량 의존적으로 완화되는 것을 알 수 있었다.

또한 HMG-I 를 일과성 발현하고, 또한 2'-O-메틸올리고 RNA (서열번호 27) 가 도입된 SK-N-SH 세포 [피검 세포] 와, HMG-I 를 일과성 발현하는 SK-N-SH 세포와, SK-N-SH 세포를, 각각 2 μM 투니카마이신의 존재 또는 비존재 하에서 10 시간 배양시켰다.

그 후, MTS 어세이를 상기와 동일하게 실시하여 세포의 생존율을 해석하였다.

그 결과, 도 29 의 패널 B 의 레인 4 ~ 7 에 나타나는 바와 같이, HMG-I 의 일과성 발현과 투니카마이신에 의해 유도된 세포사는, 상기 2'-O-메틸올리고 RNA의 도입에 의해 용량 의존적으로 현저하게 완화된 것을 알 수 있었다.

서열표 프리 텍스트

서열번호 1 은 결합영역의 서열을 나타낸다.

서열번호 2 는 결합영역의 서열을 나타낸다.

서열번호 3 은 RNA 프로브 No.5 의 서열을 나타낸다.

서열번호 4 는 RNA 프로브 No.7 의 서열을 나타낸다.

서열번호 5 는 RNA 프로브 No.9 의 서열을 나타낸다.

서열번호 6 은 RNA 프로브 No.10 의 서열을 나타낸다.

서열번호 7 은 RNA 프로브 No.11 의 서열을 나타낸다.

서열번호 8 은 RNA 프로브 No.8 의 서열을 나타낸다.

서열번호 9 는 프라이머 ps251 의 서열을 나타낸다.

서열번호 10 은 프라이머 ps231 의 서열을 나타낸다.

서열번호 11 은 프라이머 ps252 의 서열을 나타낸다.

서열번호 12 는 프라이머 ps233 의 서열을 나타낸다.

서열번호 13 은 DNA 프로브 No.1 의 서열을 나타낸다.

서열번호 14 는 DNA 프로브 No.2 의 서열을 나타낸다.

서열번호 15 는 DNA 프로브 No.3 의 서열을 나타낸다.

서열번호 16 은 DNA 프로브 No.4 의 서열을 나타낸다.

서열번호 17 은 DNA 프로브 No.5 의 서열을 나타낸다.

서열번호 18 은 DNA 프로브 No.6 의 서열을 나타낸다.

서열번호 19 는 DNA 프로브 No.7 의 서열을 나타낸다.

서열번호 20 은 DNA 프로브 No.8 의 서열을 나타낸다.

서열번호 21 은 DNA 프로브 No.9 의 서열을 나타낸다.

서열번호 22 는 DNA 프로브 No.10 의 서열을 나타낸다.

서열번호 23 은 DNA 프로브 No.11 의 서열을 나타낸다.

서열번호 24 는 어피니티 칼럼의 리간드로 사용한 5'-아미노-2'-O-메틸올리고 RNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 25 는 RNA 프로브 No.6 의 서열을 나타낸다.

서열번호 26 은 RNA 프로브 No.12 의 서열을 나타낸다.

서열번호 27 은 서열번호 24 중에 존재하는 HMG-I 단백질 결합 영역의 서열에 대응하는 2'-O-메틸올리고 RNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 28 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 29 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 30 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 31 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 32 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 33 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 34 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 35 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 36 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 37 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 38 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 39 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 40 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 41 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 42 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 43 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 44 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 45 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 46 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 47 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 48 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 49 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 50 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 51 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 52 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 53 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 54 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 55 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 56 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 57 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 58 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 59 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 60 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 61 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 62 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 63 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 64 는 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 65 는 시험관내 DNA 선별 어세이에 사용된 합성 DNA 의 서열을 나타낸다. n 은 G 또는 A 또는 T 또는 C 를 나타낸다.

서열번호 66 은 HMG-I 인식 모티프를 함유한 합성 DNA 의 서열을 나타낸다.

서열번호 67 은 시험관내 DNA 선별 어세이에 사용된 프라이머의 서열을 나타낸다.

서열번호 68 은 시험관내 DNA 선별 어세이에 사용된 프라이머의 서열을 나타낸다.

본 발명의 저해제에 의하면, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해할 수 있는 저해제를 제공할 수 있고, 이에 의하여 스플라이싱 이상에 기인하는 질환, 특히 뇌장해 또는 신경변성 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있게 되는 우수한 효과를 얻는다. 또한 본 발명의 신경세포사 억제제에 의하면, 프레세닐린-2 엑손 5 결손형 스플라이싱 이상을 억제하고, 이에 의하여 신경세포사를 억제할 수 있는 우수한 효과를 얻는다. 게다가 본 발명의 의약 조성물에 의하면, 신경세포사를 억제할 수 있어 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 특히 뇌장해 또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방을 실시할 수 있는 우수한 효과를 얻는다. 또한 본 발명의 치료 또는 예방 방법에 의하면, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환, 특히 뇌장해 또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방을 더욱 효율적 지속적으로 실시할 수 있는 우수한 효과를 얻는다.

Claims

HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유하여 이루어지는, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합의 저해제.
제 1 항에 있어서, 이 화합물이,

(A) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 RNA 분자,

(B) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 DNA 분자,

(C) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(D) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인 저해제.
제 2 항에 있어서, 이 화합물이.

(a) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 RNA 분자,

(b) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 DNA 분자,

(c) 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(d) 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인 저해제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

이 화합물이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 분자인 저해제.
HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유한, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합의 저해제를 유효 성분으로 함유하여 이루어지는 신경세포사 억제제.
제 5 항에 있어서, 이 화합물이,

(A) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 RNA 분자,

(B) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 DNA 분자,

(C) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(D) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인 신경세포사 억제제.
제 6 항에 있어서, 이 화합물이,

(a) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 RNA 분자,

(b) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 DNA 분자,

(c) 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(d) 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인 신경세포사 억제제.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 이 화합물이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 분자인 신경세포사 억제제.
HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 의 결합을 저해하는 화합물을 유효 성분으로 함유한, HMG-I 단백질과 프레세닐린-2 유전자 간의 결합의 저해제, 또는 이 저해제를 유효 성분으로 함유한 신경세포사 억제제를 유효 성분으로 함유하여 이루어지는 의약 조성물.
제 9 항에 있어서, 이 화합물이,

(A) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 RNA 분자,

(B) 서열번호 1 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열 및/또는 서열번호 2 에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 DNA 분자,

(C) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(D) 상기 (A) 의 RNA 분자 또는 (B) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(E) 상기 (C) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인 의약 조성물.
제 10 항에 있어서, 이 화합물이,

(a) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 RNA 분자,

(b) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7 의 어느 하나에 나타나는 염기서열에 대응하는 DNA 서열을 함유하고, 또한 HMG-I 단백질과 결합할 수 있는 DNA 분자,

(c) 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나에 상보적인 안티센스 분자,

(d) 상기 (a) 의 RNA 분자 또는 (b) 의 DNA 분자의 어느 하나의 아날로그이고, 또한 HMG-I 단백질과 결합하는 아날로그 분자, 및

(e) 상기 (c) 의 안티센스 분자의 아날로그 분자,

로 이루어지는 군에서 선택된 1 종인 의약 조성물.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 이 화합물이 서열번호 27 에 나타나는 염기서열을 갖는 2'-O-메틸올리고 RNA 분자인 의약 조성물.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 스플라이싱 이상을 억제하는 작용을 갖는 의약 조성물.
제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성을 억제하는 작용을 갖는 의약 조성물.
제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 뇌장해 또는 신경변성 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 의약 조성물.
제 15 항에 있어서, 이 뇌장해가, 허혈성 뇌질환 또는 뇌신경변성 질환인 의약 조성물.
제 16 항에 있어서, 이 뇌장해가, 뇌혈관성 치매, 파킨슨 증후군 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택된 질환인 의약 조성물.
제 15 항에 있어서, 이 신경변성 질환이, 근위축성 측색 경화증인 의약 조성물.
프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 개체에 투여하고, 이에 의해 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 저해제 또는 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 신경세포사 억제제의 용도.
프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 개체에, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 저해제 또는 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 신경세포사 억제제를 치료상 유효량 투여하는 것을 특징으로 하는, 프레세닐린-2 mRNA 엑손 5 결손 스플라이싱 변이체의 생성에 기인하는 질환의 치료 또는 예방 방법.