CN1592637A

CN1592637A - 药物组合物

Info

Publication number: CN1592637A
Application number: CNA028127374A
Authority: CN
Inventors: 远山正弥; 片山泰一; 真部孝幸; 今泉和则; 池田阳子
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2005-03-09
Also published as: US20050065102A1; AU2002346223B2; EP1413314A4; CA2451850A1; JPWO2003002146A1; JP4000313B2; WO2003002146A1; EP1413314A1; KR20040028796A; JP2003012548A

Abstract

本发明提供对脑障碍、神经变性性疾病等疾病更有效、持续性高的治疗或预防的有效手段。本发明涉及可阻碍HMG－I蛋白与早老素－2mRNA外显子5结合的阻碍剂、可抑制神经细胞死亡的神经细胞死亡抑制剂、对治疗或预防因早老素－2mRNA外显子5缺损型剪接变异体的产生而引起的疾病有效的药物组合物、该疾病的治疗或预防方法以及该阻碍剂的用途。

Description

药物组合物

技术领域

本发明涉及可阻碍HMG-I蛋白与早老素-2 mRNA外显子5结合的阻碍剂、可抑制神经细胞死亡的神经细胞死亡抑制剂、对因早老素-2mRNA外显子5缺损型剪接变异体的产生而引起的疾病的治疗或预防有效的药物组合物、该疾病的治疗或预防方法以及该阻碍剂的用途。

背景技术

神经变性性疾病之一的阿尔茨海默氏病(AD)中，超过90％的AD患者的疾病被分类为散发性阿尔茨海默氏病(sAD)。已知分别在sAD患者的大脑皮质和海马CA1区的细胞凋亡性锥体细胞中，存在早老素-2基因的变异体编码的异常蛋白(PS2V)[Sato，N.等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114(2001)]。

PS2V显示在人成神经细胞瘤SK-N-SH培养细胞中受低氧刺激诱导，与氧应激和SK-N-SH细胞中新蛋白质的合成具有相关性[Sato，N.等，J.Neurochem.，72，2498-2505(1999)]。

已知上述PS2V使内质网(ER)应激应答性陪伴分子葡萄糖调控蛋白(GRP78)减少，在PS2V表达细胞中β-淀粉样蛋白增加[Sato，N.等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114(2001)]。

虽然PS2V显示了在sAD中为神经元死亡的重要因子之一的可能性，但目前对于PS2V的生成、在疾病危象中的详细机理仍不十分清楚。现在正在寻求由上述PS2V的生成而引起的疾病的有效治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供可阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的阻碍剂。本发明的目的还在于：提供阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合、抑制早老素-2外显子5缺损型剪接异常、由此可抑制神经细胞死亡的神经细胞死亡抑制剂。本发明的目的进一步在于提供至少可实现下述目标之一的药物组合物：抑制细胞死亡、特别是神经细胞死亡；向细胞的导入效率高；生物体内稳定性优异；以及治疗或预防由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病、特别是脑障碍、神经变性性疾病等。另外本发明的目的还在于：提供由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病的治疗或预防方法，该方法可更有效、持续地治疗或预防由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病，特别是脑障碍、神经变性性疾病等。

即，本发明涉及：

[1]HMG-I蛋白与早老素-2基因之间结合的阻碍剂，所述阻碍剂含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的化合物作为有效成分；

[2]上述[1]的阻碍剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(A)含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.2所示的碱基序列，且与HMG-I蛋白结合的RNA分子，

(B)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列所对应的DNA序列和/或SEQID NO.2所示碱基序列所对应的DNA序列，且与HMG-I蛋白结合的DNA分子，

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子，

(D)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一类似且与HMG-I蛋白结合的类似分子，以及

(E)上述(C)反义分子的类似分子；

[3]上述[2]的阻碍剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(a)含有SEQ ID NO.3、4、5、6或7其中之一所示的碱基序列，且可与HMG-I蛋白结合的RNA分子，

(b)含有SEQ ID NO.3、4、5、6或7其中之一所示碱基序列所对应的DNA序列，且可与HMG-I蛋白结合的DNA分子，

(c)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子，

(d)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一类似且与HMG-I蛋白结合的类似分子；以及

(e)上述(c)反义分子的类似分子；

[4]上述[1]或[2]的阻碍剂，其中所述化合物为具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA分子；

[5]神经细胞死亡抑制剂，所述抑制剂由含有HMG-I蛋白与早老素-2基因之间的结合阻碍剂作为有效成分而构成，所述阻碍剂含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的化合物作为有效成分；

[6]上述[5]的神经细胞死亡抑制剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子，

(E)上述(C)反义分子的类似分子；

[7]上述[6]的神经细胞死亡抑制剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(c)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子，

(e)上述(c)反义分子的类似分子；

[8]上述[5]或[6]的神经细胞死亡抑制剂，其中所述化合物为具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA分子；

[9]药物组合物，所述药物组合物由含有HMG-I蛋白与早老素-2基因之间的结合阻碍剂或含该阻碍剂作为有效成分的神经细胞死亡抑制剂作为有效成分而构成，所述阻碍剂含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的化合物作为有效成分；

[10]上述[9]的药物组合物，其中所述化合物选自下述的一种：

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子，

(E)上述(C)反义分子的类似分子；

[11]上述[10]的药物组合物，其中所述化合物选自下述的一种：

(c)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子，

(e)上述(c)反义分子的类似分子；

[12]上述[9]或[10]的药物组合物，其中所述化合物为具有SEQ IDNO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA分子；

[13]上述[9]-[12]中任一项的药物组合物，所述药物组合物具有抑制剪接异常的作用；

[14]上述[9]-[13]中任一项的药物组合物，所述药物组合物具有抑制早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生的作用；

[15]上述[9]-[14]中任一项的药物组合物，所述药物组合物可治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的脑障碍或神经变性性疾病；

[16]上述[15]的药物组合物，其中所述脑障碍为缺血性脑病或脑神经变性性疾病；

[17]上述[16]的药物组合物，其中所述脑障碍为选自脑血管性痴呆、帕金森氏综合征以及阿尔茨海默氏病的疾病；

[18]上述[15]的药物组合物，其中所述神经变性性疾病为肌萎缩性侧索硬化；

[19]上述[1]-[4]中任一项的阻碍剂或[5]-[8]中任一项的神经细胞死亡抑制剂在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物通过对由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病的个体给药来治疗或预防由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病；以及

[20]由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病的治疗或预防方法，其特征在于：将治疗上有效量的上述[1]-[4]中任一项的阻碍剂或上述[5]-[8]中任一项的神经细胞死亡抑制剂给予由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病的个体。

附图简述

图1显示sAD的脑和培养细胞株中PS2V的表达。左图是将来自典型的sAD脑或年龄相近的对照脑的扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，经溴化乙锭染色得到的可观察的结果。右图是将正常氧状态、低氧暴露、衣霉素(TM)、β-淀粉样蛋白各应激下的各种细胞的总RNA进行RT-PCR，将得到的PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，经溴化乙锭染色得到的可观察的结果。图中，黑色箭头指示PS2(上部)和PS2V(下部)对应的分子量点。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图2显示对sAD脑和对照脑中的PS2V进行免疫组织化学检测的结果。制备10μm厚度的对照和sAD脑切片，然后使用抗SSMAG抗体进行PS2V免疫组织化学检测。上述结果是对至少3种不同的对照和AD脑进行分析，得到的同样的结果。

图3表示前mRNA结合实验法的概略图。将SK-N-SH细胞置于正常氧状态或低氧刺激21小时，然后回收，制备核提取液，然后使PS2前mRNA片断与各探针结合反应。用紫外(UV)光照射反应液，然后用RNA酶A消化探针，进行SDS处理。将SDS处理后的试样通过SDS-PAGE分析进行分离，用Bas用影像板检测结合阳性条带。

图4是PS2前mRNA探针的略图。图中概略地表示了用于结合实验法的PS2前mRNA片断的6种探针。方框围住的区和横线分别表示外显子和内含子。所有探针均通过体外转录进行标记。

图5显示前mRNA结合实验法的结果。将SK-N-SH细胞置于正常氧状态或低氧暴露后刺激21小时，然后回收。使用各放射性标记探针进行前mRNA结合实验法，对回收的细胞的核提取液进行分析。然后在浓度梯度(10～20％)聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，在Bas用影像板上曝光。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图6显示前mRNA结合实验法的结果。将SK-N-SH细胞置于正常氧状态或低氧暴露后刺激21小时，然后回收。在可结合条件下，将核提取液与各35S-未标记冷探针一起进行预温育。添加各35S-标记热探针，使采用预温育反应液的前mRNA结合实验法启动，接着在15％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，然后在Bas用影像板上曝光。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图7表示低氧应激下人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞核提取液中与No.5探针具结合活性的级分的纯化流程图。纯化方法用斜体字表示。用罗马数字表示各个级分。

图8显示将图7所示的各纯化阶段的蛋白质(25μl/级分)通过15％SDS-PAGE和银染色进行分析的结果。图中，M表示分子量(kDa)。

图9显示35S-标记No.5探针与各纯化阶段的级分(15μl/级分)的结合活性。

图10显示使用抗HMG-I/Y蛋白抗体进行超迁移分析的结果。将SK-N-SH细胞处于正常氧状态(左图)或低氧(右图)刺激21小时，然后回收。在与放射性标记的No.5探针反应之前，在抗HMG-I/Y蛋白抗体存在或不存在下，在通常的缓冲液中温育核提取液。接着将试样进行凝胶延迟电泳和放射自显影。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图11表示PS2前mRNA的7种结构。图中，用大写字母表示外显子，用小写字母表示内含子。用粗字体表示2个相似序列，并标下划线。

图12表示HMG-I蛋白在PS2前mRNA中的结合位点的研究结果。将SK-N-SH细胞置于正常氧状态或低氧暴露后刺激21小时，然后回收。使用各放射性标记探针进行前mRNA结合实验法，对回收的细胞的核提取液进行分析。接着，进行SDS-PAGE，然后在Bas影像板上曝光。图中，黑色箭头指示对应的分子量点。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图13显示通过RNA印迹分析研究各种应激对培养细胞中HMG-ImRNA(图中标为HMGI mRNA)和该mRNA对应的蛋白质的表达的影响结果。左图和中图显示对正常氧状态或低氧暴露21小时后回收的细胞株的分析结果。右图显示对经衣霉素处理24小时后回收的SK-N-SH细胞分析的结果。将总RNA进行甲醛-甲酰胺凝胶电泳，使用放射性标记的HMG-I cDNA探针进行RNA印迹分析。图中，用黑色箭头指示分子量点。

图14显示通过蛋白质印迹分析研究各种应激对于培养细胞中HMG-I mRNA和该mRNA对应的蛋白质的表达的影响结果。将各细胞株处于正常氧状态、或低氧暴露刺激21小时，然后回收细胞株。用SDS-PAGE和抗HMG-I/Y蛋白抗体对得到的核提取液进行免疫印迹分析。图中，黑色箭头指示HMG-I(上部、图中标为HMGI)和HMG-Y(下部、图中标为HMGY)蛋白对应的分子量点。

图15显示低氧对于SK-N-SH细胞中免疫反应性HMG-I蛋白在细胞水平的存在区域的影响。将SK-N-SH细胞置于正常氧状态或低氧下暴露21小时。用抗HMG-I/Y(图中标为“HMGI/Y”)抗体和抗SC35抗体对细胞进行免疫染色，进行初次免疫反应，然后用FITC结合二次抗体和Cy3结合二次抗体染色。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图16显示HMG-I或HMG-Y的瞬时表达对于培养细胞中PS2基因的外显子5跳过效果的研究结果。对各细胞株进行模拟或HMG-I转染，转染24小时后回收细胞株。用SDS-PAGE和抗HMG-I/Y抗体，对得到的核提取液进行免疫印迹分析。黑色箭头指示HMG-I蛋白(图中标为“HMGI”)对应的分子量点。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图17显示HMG-I或HMG-Y的瞬时表达对于培养细胞中PS2基因的外显子5跳过效果的研究结果。对各细胞株进行不同量的模拟、HMG-I(图中标为“HMGI”)或HMG-Y(图中标为“HMGY”)转染，转染24小时后回收细胞株。按照文献[Sato等，J.Neurochem.，72，2498-2505(1999)]的方法，对回收的细胞的总RNA进行RT-PCR。将扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，通过溴化乙锭染色使其可观察。黑色箭头指示PS2(上部)和PS2V(下部)对应的分子量点。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图18显示HMG-I(图中标为“HMGI”)对U1(70K)snRNP与PS2前mRNA结合效果的研究结果。在使回收的细胞的核提取液与上侧图所示的NO.12探针(³²P标记)反应之前，在抗HMG-I/Y蛋白抗体存在或不存在下，在通常的缓冲液中温育核提取液。接着，将试样进行凝胶延迟电泳和放射自显影。图中，黑色箭头指示游离、结合和超迁移的探针。另外，图中Ab表示抗U1 snRNP抗体。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图19显示HMG-I/Y与U1(70K)snRNP的相互作用。上侧图显示使用抗U1(70K)snRNP抗体进行免疫印迹分析的结果。将处于正常氧状态或低氧暴露的SK-N-SH细胞刺激24小时后回收，制备核提取液。用抗HMG-I/Y抗体(图中标为“抗HMGI/Y抗体”)使核提取液免疫沉降，然后用抗U1(70K)snRNP抗体进行免疫印迹分析。下侧图显示使用抗HMG-I/Y抗体进行免疫印迹分析的结果。用抗U1(70K)snRNP抗体使核提取液免疫沉降，然后用抗HMG-I/Y抗体进行免疫印迹分析。上述实验采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。

图20表示PS2前mRNA上异常剪接机理假说的概略图。

图21显示通过蛋白质印迹分析研究sAD脑中HMG-I/Y蛋白的表达的结果。从3例不同的sAD脑以及年龄相近的对照海马制备全溶胞产物、胞质溶胶级分和核级分。将这些级分使用SDS-PAGE和抗HMG-I/Y蛋白抗体进行免疫印迹分析。黑色箭头指示HMG-I(上部、图中标为“HMGI”)和HMG-Y(下部、图中标为“HMGY”)蛋白对应的分子量点。

图22显示通过组织免疫化学研究sAD脑中HMG-I/Y蛋白的表达的结果。对至少3种不同的对照和AD脑进行分析，均得到同样的结果。制备10μm厚度的对照和sAD脑切片，进行免疫反应性HMG-I/Y的免疫组织化学检测。对至少3种不同的对照和AD脑进行分析，均得到同样的结果。

图23表示合成的各寡核苷酸。按照常用方法进行合成。使用具有24个或60个核苷酸长度的2种互补的寡核苷酸进行退火，得到NO.1～NO.11的双链DNA。图中，用下划线标出各寡核苷酸中PS2外显子5的各个片断，用粗体字表示。

图24显示2’-O-甲基寡RNA抑制早老素-2基因外显子5缺损剪接变异体的产生的效果的研究结果。

图25显示2’-O-甲基寡RNA对体外低氧诱导HMG-I的结合性的影响的研究结果。图中，泳道1的“N”表示正常氧状态，泳道2的“H”表示低氧条件。另外，对于2’-O-甲基寡RNA的用量，泳道3为0.5μg、泳道4为5μg、泳道5为50μg、泳道6为500μg。

图26显示研究细胞内2’-O-甲基寡RNA的摄入、稳定性和导入效率的结果。A中的图a表示SK-N-SH细胞各级分中2’-O-甲基寡RNA的摄入量。图b表示上述2’-O-甲基寡RNA向SK-N-SH细胞的导入效率。B显示上述2’-O-甲基寡RNA导入SK-N-SH细胞后48小时时，2’-O-甲基寡RNA的稳定性的研究结果。

图27表示用于确定HMG-I的DNA识别基序的合成DNA序列。最上一行表示HMG-I识别基序的共有序列。

图28显示2’-O-甲基寡RNA对于SK-N-SH细胞的核提取液中HMG-I与DNA结合的作用的研究结果。图A显示凝胶移位分析的结果，图B表示图A量化的数据。

图29表示2’-O-甲基寡RNA对细胞死亡的作用的研究结果。图A表示低氧条件和衣霉素诱导的细胞死亡的研究结果，图B表示对HMG-I的瞬时表达和衣霉素诱导的细胞死亡的研究结果。

实施发明的最佳方案

本发明的阻碍剂的一个特征是：含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5之间结合的化合物作为有效成分。由于本发明的阻碍剂含有上述化合物，因而发挥了可阻碍HMG-I蛋白与早老素-2 mRNA之间结合这样优异的效果。另外，本发明的阻碍剂还发挥了可抑制上述早老素-2 mRNA的剪接异常、特别是早老素-2外显子5缺损型剪接异常这样优异的效果。本发明的阻碍剂由于可抑制早老素-2外显子5缺损型剪接异常，因而进一步发挥了可抑制神经细胞死亡的优异效果。

早老素-2基因被认为是阿尔茨海默氏病的病因基因之一。上述早老素-2基因编码的蛋白是存在于内质网高尔基体中的膜蛋白，是与淀粉样代谢或沉淀有关的蛋白质。上述早老素-2基因由12个外显子构成，其中10个外显子编码蛋白质[例如可参照Levy-Lahad等，Genomics，34，198-204，(1996)；Levy-Lahad等，Science，269，973-977(1995)；Rogaev等，Nature，376，775-778(1995)等]。

本说明书中，“早老素-2基因”是指包含编码早老素-2蛋白的mRNA、DNA(例如基因组DNA、cDNA)其中之一。早老素-2基因的碱基序列和氨基酸序列在例如GenBank检索号XM002127、XM002128、XP002127等中有记载。

本发明中使用的“阻碍HMG-I蛋白与早老素-2 mRNA外显子5之间结合的化合物”例如可以是在特定位点特异性地拮抗该结合，由此完全阻碍该结合的化合物；或者在特定位点特异性地拮抗该结合，由此使该结合的结合强度降低的化合物。

上述“特定位点”具体有例如：①由SEQ ID NO.1所示碱基序列构成的区、②由SEQ ID NO.2所示碱基序列构成的区、③含有SEQ IDNO.1所示碱基序列和SEQ ID NO.2所示碱基序列的区、④由上述①～③分别对应的DNA上的连续的序列构成的区等。

另外，本发明中，所述“特定位点”中也包含：(i)HMG-I蛋白的氨基酸序列中，由与HMG-I蛋白和早老素-2基因之间结合有关的连续的序列构成的区；(ii)由存在于HMG-I蛋白中、且与HMG-I蛋白和早老素-2基因之间结合有关的多个氨基酸残基形成的立体结构区。

上述“与结合有关的氨基酸残基”可以是例如当被其他氨基酸残基置换时，可使得到的蛋白质与早老素-2基因的结合能力消失的残基等。

上述SEQ ID NO.1所示的碱基序列和SEQ ID NO.2所示的碱基序列是存在于早老素-2基因的mRNA中的序列，本发明人发现所述碱基序列对于与HMG-I蛋白的结合是很重要的。本发明基于本发明人的上述发现而完成。

本发明中，上述SEQ ID NO.1或2可以是上述SEQ ID NO.1或2中具有至少1个残基的突变、且显示与HMG-I蛋白的结合能力的序列以及他们所对应的DNA序列；也可以是与上述SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的碱基序列具有至少90％、优选95％以上的序列相同性、且显示与HMG-I蛋白的结合能力的序列。

上述化合物可以是低分子化合物，也可以是高分子化合物。上述化合物例如有RNA、DNA等核酸；有机合成化合物等。上述核酸可以是单链也可以是双链，可以是直链也可以是环状。

上述化合物例如有：阻断由存在于HMG-I蛋白中、且与HMG-I蛋白和早老素-2基因的结合有关的氨基酸序列构成的区的化合物(例如核酸、核酸类似物等)；阻断由存在于HMG-I蛋白中、且与HMG-I蛋白和早老素-2基因的结合有关的多个氨基酸残基形成的立体结构区的化合物(例如适合该立体结构区的有机合成化合物等)；阻断由存在于早老素-2 mRNA外显子5中的碱基序列构成、且是HMG-I蛋白和早老素-2基因汇合的区的化合物(例如核酸、核酸类似物等)。

另外本发明中，经由上述SEQ ID NO.1所示的碱基序列和/或SEQID NO.2所示的碱基序列，可阻碍HMG-I蛋白和早老素-2基因结合的化合物也包括在本发明的范围内。

本说明书中，“序列相同性”是指由SEQ ID NO.1或2所示的碱基序列构成的核酸分子与比较对象的核酸分子之间对应残基的相同性。上述“序列相同性”中，也包含经由2’-O-甲基衍生物、脱氨基衍生物(例如肌苷等)、腺苷衍生物(例如异戊烯基腺嘌呤、苏氨酰基羰基腺嘌呤等)、含硫衍生物(4-硫代尿苷、2-硫代嘧啶衍生物)等修饰碱基等，与SEQ ID NO.1或2所示碱基序列类似的残基的情况。上述“序列相同性”可在整个比较对象的碱基序列的区内，通过将最佳状态下比对的2个碱基序列进行比较来确定。序列相同性的数值(百分比)可如下计算：确定两个序列中存在的相同的核酸碱基，确定对应位点的数量，接着将上述对应位点的数量用比较对象的序列区内碱基的总数除，将得到的数值乘以100。用于获得最佳比对和同源性的算法有：例如Smith等人的局部同源性算法[Add.APL.Math.，2，482(1981)]、Needleman等人的同源性比对算法[J.Mol.Biol，48，443(1970)]、Pearson等人的同源性检索法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444(1988)]等。更具体地说，有动态编程法、空位处罚法、Smith-Waterman算法、Good-Kanehisa算法、BLAST算法、FASTA算法等。

上述化合物具体有：(A)含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.2所示的碱基序列、且与HMG-I蛋白结合的RNA分子。上述(A)RNA分子可以阻断上述(i)或(ii)的任一区。

上述(A)RNA分子具体有例如：(a)含有SEQ ID NO.3、4、5、6或7其中之一所示的碱基序列、且可与HMG-I蛋白结合的RNA分子等。

在选自含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的核酸、含有SEQ ID NO.2所示碱基序列的核酸以及含有SEQ ID NO.1所示碱基序列和SEQ IDNO.2所示碱基序列的核酸中的一种核酸与HMG-I之间的结合亲和性的点中，只要是显示同等的结合亲和性，由上述(A)RNA分子得到的核酸衍生物也包含在本发明的范围内。

即，本发明中，上述SEQ ID NO.1或2可以是上述SEQ ID NO.1或2中具有至少1个残基的突变、且显示与HMG-I蛋白结合的能力的序列，以及对应的DNA序列；上述SEQ ID NO.1或2也可以是与上述SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的碱基序列具有至少90％、优选95％以上的序列相同性、且显示与HMG-I蛋白结合的能力的序列，以及对应的DNA序列。具有所述序列的核酸也包含在本发明的范围之内。

上述结合亲和性可通过DNA-蛋白质印迹分析、凝胶移位分析、等离子共振相互作用分析等蛋白质-核酸间相互作用分析时常用的方法来评价与HMG-I蛋白的结合。

具体来说，作为核酸和核酸衍生物，例如有：

(B)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列所对应的DNA序列和/或SEQID NO.2所示碱基序列所对应的DNA序列，且与HMG-I蛋白结合的DNA分子；

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(E)上述(C)反义分子的类似分子等。

上述(B)DNA分子有望阻断早老素-2 mRNA外显子5中HMG-I蛋白与早老素-2基因汇合的区。这里，上述(B)中，“SEQ ID NO.1所示碱基序列所对应的DNA序列”或“SEQ ID NO.2所示碱基序列所对应的DNA序列”是指SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的反转录产物的互补链。上述(B)DNA分子具体有：例如(b)含有SEQ ID NO.3、4、5、6或7其中之一所示碱基序列所对应的DNA序列(u变为t的序列)，且可与HMG-I蛋白结合的DNA分子。

上述(C)中，与上述(A)RNA分子互补的分子(反义分子)有望阻断早老素-2 mRNA外显子5中HMG-I蛋白与早老素-2基因汇合的区。另一方面，与上述(B)DNA分子互补的反义分子有望阻断上述(i)或(ii)的区。上述(C)所示的反义分子包括与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子。

上述(D)中，类似分子有：在上述(A)RNA分子或(B)DNA分子中，具有磷酸二酯键上的氧原子被硫原子取代的硫代磷酸二酯键的寡核苷酸(S-寡核苷酸)；或者为了使含磷酸二酯键被不带电荷的甲基磷酸基取代的寡核苷酸等在生物体内难以被分解，而进行了修饰的寡核苷酸等。另外，上述类似分子也可以是被称为肽核酸的核酸。上述类似分子具体有：具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA、具有SEQID NO.27所示碱基序列的含4-硫代尿苷RNA、具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的含2-硫代嘧啶RNA等。这些类似分子具有例如生物体内稳定性优异的优点。

上述(D)中，为上述(A)RNA的类似物、且与HMG-I蛋白结合的类似分子有望阻断上述(i)或(ii)的区。另外，为上述(B)DNA分子的类似物、且与HMG-I蛋白结合的类似分子有望阻断早老素-2 mRNA外显子5中HMG-I蛋白与早老素-2基因汇合的区。上述(D)所示的类似分子具体有：例如上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一的类似物、且与HMG-I蛋白结合的类似分子。

上述(E)中，类似分子有：上述(C)反义分子中，具有磷酸二酯键上的氧原子被硫原子取代的硫代磷酸二酯键的寡核苷酸(S-寡核苷酸)；或者为了使磷酸二酯键被不带电荷的甲基磷酸基取代的寡核苷酸等难以在生物体内被分解，而进行了修饰的寡核苷酸等。另外，上述类似分子也可以是被称为肽核酸的核酸。具体来说，有(e)上述(c)反义分子的类似分子。

本发明的阻碍剂中使用的化合物为核酸或核酸衍生物时，可通过常规基因重组技术、核酸合成方法、定点诱变导入法获得。例如核酸或核酸衍生物可以按照基因工程中常用的核酸合成方法，例如可以使用DNA合成装置直接合成，也可以在合成了包含这些核酸或核酸衍生物(特别是突变异体)的核酸或其一部分后，采用PCR法或克隆载体等来扩增核酸。所述化合物为DNA分子时，可以将通过这些方法得到的DNA分子用限制酶等切割，接着用DNA连接酶等连接到适当的载体等，将得到的重组载体导入适当的宿主中，由得到的转化体制备核酸。另外，为了获得在细胞内更稳定的核酸衍生物，可以对上述核酸的碱基、糖、磷酸部分进行化学改性。

上述定点诱变导入法例如有缺口双链体法[例如参照Nucleic AcidsResearch，12，9441-9456(1984)等]、定位诱变(Kunkel)法[例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492(1985)等]、使用突变导入用引物的PCR方法等。

上述核酸合成方法有磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法、H-磷酸法等。

关于本发明的阻碍剂的药理评价，例如可以在受试物质(药理评价对象物质)存在下，通过测定上述(A)的核酸、更具体地说、具有SEQ IDNO.4所示碱基序列的核酸与HMG-I蛋白的结合，或测定该结合的结合强度(例如结合亲和性等)来进行。

即，在受试物质存在下，进行使上述(A)核酸，更具体地说，具有SEQ ID NO.4所示碱基序列的核酸与HMG-I蛋白接触的步骤，I)在受试物质存在下，未检出该核酸与该HMG-I蛋白的结合时，或II)受试物质存在下该核酸与该HMG-I蛋白结合的结合强度a小于受试物质不存在下该核酸与该HMG-I蛋白结合的结合强度b时，该受试物质则为早老素-2 mRNA外显子5和HMG-I蛋白之间的结合阻碍剂。另外，对上述受试物质研究其结合亲和性。上述结合以及结合强度(例如结合亲和性等)可通过例如上述DNA-蛋白质印迹分析、凝胶移位分析、等离子共振相互作用分析等蛋白质-核酸之间相互作用的分析中常用的方法进行评价。

具体来说，上述结合以及结合强度(例如结合亲和性等)可如下测定：在受试物质存在下，例如采用将上述(A)核酸、更具体地说、具有SEQ ID NO.4所示碱基序列的核酸或HMG-I蛋白固定在适当的支持物上的基质，使其与固定于该基质上的物质所对应的物质接触，以质量的变化、荧光的变化等作为指标，通过例如等离子共振相互作用分析等进行测定。

上述HMG-I蛋白可如下获得：例如将适当的细胞在通常的氧条件下培养，接着在低氧条件下培养，由此使其在细胞内表达。

通常的氧条件可以根据所使用的细胞适当决定，例如为SK-N-SH细胞时，可以是5％CO₂、在37℃培养等条件。低氧条件可以是例如低氧压(8托)的条件。具体来说，采用设置了低氧罐的培养箱，所述低氧罐在加湿气氛下维持低氧压(8托)，通过在37℃低氧条件下维持培养物21小时，可以给与细胞低氧刺激。

上述细胞有例如神经细胞、神经胶质细胞、星形细胞等中枢神经系统细胞，成纤维细胞等。更具体地，例如有SK-N-SH细胞(ATCCHTB-11)等。

另外，可以根据需要，通过常用的蛋白质纯化方法[盐析、离子交换层析、亲和层析、吸附柱层析等]进行纯化。

本发明的阻碍剂中，当有效成分为核酸或核酸衍生物时，可以根据使用目的，将核酸或核酸衍生物适当地保持在适合导入细胞的载体脂质体、金属粒子、正电荷聚合物等中。

上述载体例如可以是无毒处理的疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒随伴载体、无毒处理的反转录病毒载体等。

上述脂质体有HVJ-脂质体、正电荷脂质体等。

本发明的阻碍剂中，有效成分量可以根据使用目的，在发挥结合阻碍作用的范围内适当设定。例如有效成分为0.01～100mg，优选3～100mg。

本发明的阻碍剂抑制早老素-2外显子5缺损型剪接异常，由此可抑制神经细胞死亡，因此，由该阻碍剂可以提供神经细胞死亡抑制剂。所述神经细胞死亡抑制剂也包含在本发明的范围内。

本发明的神经细胞死亡抑制剂的一个大的特征是含有上述阻碍剂作为有效成分。因此，能够发挥可抑制神经细胞死亡的优异效果。

本发明的神经细胞死亡抑制剂中，有效成分的含量可以根据给药对象个体的体重、年龄、给药目的进行适当设定。

本发明的神经细胞死亡抑制剂中，给药量可以根据给药目的(例如疾病的种类)、给药对象个体的年龄和体重、有效成分的种类等适当选择。例如含有RNA分子的情况下，上述给药量例如可以是有效成分为0.01～100mg，优选3～100mg。

本发明的神经细胞死亡抑制剂的给药方法有直接导入体内的体内法。

通过上述体内法给药时，可根据给药目的(例如疾病的种类)、给药对象个体的年龄和体重、有效成分的种类等适当选择给药途径。例如有静脉注射、鼻粘膜吸入等。

例如，将含有核酸或核酸衍生物的阻碍剂作为有效成分的神经细胞死亡抑制剂进行血液内给药时，通常每天给予的有效成分量为0.01～100mg，优选3～100mg。

另外，本发明的神经细胞死亡抑制剂可以含有便于导入神经细胞等的物质；通常药理学可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、助溶剂、等张剂等。

本发明的神经细胞死亡抑制剂的药理评价可与上述阻碍剂的药理评价一样，通过下述方法进行。即，对于导入了受试物质(神经细胞死亡抑制剂候选药物)的SK-N-SH细胞[被检细胞]和未导入的SK-N-SH细胞[对照细胞]，通过分别研究在低氧条件[低氧压(8托)条件等]下，由衣霉素等引发的神经细胞死亡，进行药理评价。评价指标为：如果被检细胞中的神经细胞死亡与对照细胞中的神经细胞死亡相比受到抑制，则上述受试物质为神经细胞死亡抑制剂。另外，对于瞬时表达HMG-I、且导入了受试物质(神经细胞死亡抑制剂候选药物)的SK-N-SH细胞[被检细胞]和瞬时表达HMG-I的SK-N-SH细胞[对照细胞]，通过研究衣霉素等引起的神经细胞死亡，进行药理评价。评价指标为：如果被检细胞中的神经细胞死亡与对照细胞中的神经细胞死亡相比受到抑制，则上述受试物质为神经细胞死亡抑制剂。

关于对所述神经细胞死亡的抑制，可通过MTT法[Mossman，T.等，J.Immunol.Methods，65，55-59(1985)]判断，也可以进行常用的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓测定(称为MTS测定)，测定细胞的存活率，通过比较被检细胞和对照细胞来判断。

上述低氧条件具体有：例如使用设有在加湿气氛下维持低氧压(8托)的低氧罐的培养箱，通过在37℃使培养物低氧下暴露21小时，给予细胞低氧刺激。

本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂可以抑制神经细胞死亡，可以抑制早老素-2 mRNA的剪接异常、特别是早老素-2外显子5缺损型剪接异常，因此通过本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂，可以提供对治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病、特别是脑障碍或神经变性性疾病有效的药物组合物。所述药物组合物也包含在本发明中。另外，本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂可用于制备治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病、特别是脑障碍或神经变性性疾病的药物组合物。

本发明的药物组合物的特征之一是含有上述阻碍剂或上述神经细胞死亡抑制剂作为有效成分。本发明的药物组合物具有抑制剪接异常的作用、抑制早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生的作用等。因此，本发明的药物组合物有望应用于治疗或预防由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病、特别是脑障碍或神经变性性疾病。

本发明的药物组合物适用的疾病对象例如有：脑组织中由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的脑障碍、由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的神经变性性疾病等。

上述脑障碍有缺血性脑病、脑神经变性性疾病等。更具体地说，有脑血管性痴呆、帕金森氏综合征、阿尔茨海默氏病等。

上述神经变性性疾病有肌萎缩性侧索硬化等。

本发明的药物组合物的给药量可根据给药目的(例如疾病的种类)、给药对象个体的年龄和体重、有效成分的种类等适当选择。例如含有RNA分子的情况下，上述给药量可以是有效成分为0.01～100mg，优选3～100mg。

本发明的药物组合物只要是有效成分可被摄取到患者的细胞或目标组织细胞内的剂型即可，可以单独或与常用的载体混合，以非口服给药、局部给药的形式给予。

给药途径可根据给药目的(例如疾病的种类)、给药对象个体的年龄和体重、有效成分的种类等适当选择。例如有静脉注射、鼻粘膜吸入等。

药物组合物例如含有核酸或核酸衍生物、血液内给药时，通常可以将3～100mg有效成分量分为每天一次或多次给予。

另外，为了使基因易存在于患病部位周围，可以将本发明的药物组合物制备成缓释性制剂(小丸制剂等)、植入患部附近，或用渗透泵等连续而缓慢地给予患部。

根据需要，本发明的药物组合物还可含有可使药物方便地导入患病部位的物质，各种载体，助剂，稳定剂，润滑剂，其他通常使用的添加剂如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、高岭土、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇等。

本发明的药物组合物的药理评价可按照与上述阻碍剂和神经细胞死亡同样的评价方法进行。还可根据对象疾病进行常用的药理评价。

本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂可以抑制神经细胞死亡、可以抑制早老素-2 mRNA的剪接异常、特别是早老素-2外显子5缺损型剪接异常，因此，通过本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂，可以提供由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病、例如脑障碍或神经变性性疾病的治疗或预防方法。所述治疗或预防方法也包含在本发明范围之内。

本发明的治疗或预防方法的一个特征是：对由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病、例如脑障碍的个体或神经变性性疾病的个体，给予治疗上有效量的本发明阻碍剂或本发明的神经细胞死亡抑制剂。本发明的治疗方法或预防方法是给予上述阻碍剂或神经细胞死亡抑制剂，因此有望治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病。

另外，本发明的治疗或预防方法是给予上述阻碍剂或神经细胞死亡抑制剂，因此能够取得可更有效、更持续地发挥神经细胞死亡抑制作用的优异的效果。因此，能够取得可更有效、更持续地进行由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病的治疗或预防的优异的效果。本发明的治疗或预防方法是给予上述阻碍剂或神经细胞死亡抑制剂，因此不损害因HMG-I在DNA结合位点与DNA结合而发挥的HMG-I原有的机能，并发挥阻碍RNA结合位点这样优异的效果。因而，本发明的治疗或预防方法不会有使HMG-I与DNA结合的原有机能受损而导致的影响。

“治疗上有效量”是指可抑制神经细胞死亡、可抑制早老素-2mRNA的剪接异常、特别是早老素-2外显子5缺损型剪接异常的量。

对个体给予阻碍剂或神经细胞死亡抑制剂，例如可以通过静脉注射和鼻粘膜吸入等，将3～100mg日剂量阻碍剂或神经细胞死亡抑制剂的有效成分量按照每天1次至数次给予。

本发明的治疗或预防方法的效果可以以对象疾病的病理学特征等的表达抑制作为指标来评价。例如对于脑缺血模型并无特别限定，可使用使先天性Willis动脉环形成不全的动物的两侧总颈动脉一过性闭塞、再使其导通而获得的迟发性神经细胞死亡模型动物；使中大脑动脉永久性或一过性闭塞而获得的局部脑缺血模型动物等，对所述模型给予上述阻碍剂或神经抑制剂，通过研究症状改善情况来评价本发明的治疗或预防方法的效果。还可对小鼠因长期添加铝或铁等而得到的化学性低氧模型动物、因年龄增大而产生的微管梗塞性低氧症状的大龄小鼠等模型动物给予上述阻碍剂或神经抑制剂，通过研究症状改善情况来评价本发明的治疗或预防方法的效果。

本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂可抑制神经细胞死亡，可抑制早老素-2 mRNA的剪接异常、特别是早老素-2外显子5缺损型剪接异常，因此，可以制备药物组合物，该组合物通过将本发明的阻碍剂和神经细胞死亡抑制剂给予由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病的个体，治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病。因此，用于制备给予由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病的个体、由此治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病的药物组合物的本发明的阻碍剂或神经细胞死亡抑制剂的用途也包含在本发明之内。

实验例1 细胞培养、低氧刺激以及瞬时转染

根据Sato等人的文献[Sato N等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114(2001)]，如下进行细胞培养和低氧刺激。

将人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞在含10％胎牛血清的αMEM(GIBCO BRL)中、在5％CO₂、37℃下培养。上述细胞在176.6cm²培养皿中汇合时，将培养物中含血清α-MEM更换为无血清αMEM。将更换了培养基的培养物再培养4小时。

分别将HEK-293T细胞和HeLa细胞在含10％胎牛血清的Dulbecco极限培养基(GIBCO BRL)中、在5％CO₂、37℃下培养。上述细胞分别在176.6cm²培养皿中汇合时，将培养物中含血清的Dulbecco极限培养基更换为无血清Dulbecco极限培养基。将更换了培养基的培养物再培养4小时。

给与低氧刺激时，使用设有在加湿气氛下维持低氧压(8托)的低氧罐的培养箱，将得到的培养物在37℃低氧下暴露21小时。

采用脂转染试剂2000(LepofectAMINE^TM 2000)(GIBCO BRL)进行各种构建物的瞬时转染。

另外，使用OligofectAmine(GIBCO BRL)进行寡RNA的瞬时转染。

实验例2 总RNA的制备和RT-PCR

根据Sato等人的文献[Sato N等，J.Neurochem.，72，2498-2505，(1999)]，如下分别制备各种应激下的成神经细胞瘤SK-N-SH细胞、HEK-293T细胞和HeLa细胞的总RNA、并进行RT-PCR。

使用RNeasy总RNA试剂盒(Qiagen)，按照厂家的使用说明书，分别由正常氧状态、低氧暴露或HMG-I过量表达时的SK-N-SH细胞和HEK-293T细胞中提取并纯化总RNA。

接着，使用得到的总RNA和小鼠莫洛尼氏白血病病毒反转录酶(Promega)，在42℃进行1小时反转录反应。然后以得到的反应物作为模板，进行嵌套式PCR。PCR的简要流程是：以95℃30秒-60℃30秒-72℃1分钟(终循环为2分钟)为一个循环，共30个循环。第一次PCR中使用了引物ps251[5’-attcagacctctctgcggcc-3’(SEQ ID NO.9)]和引物ps231[5’-aagcgggagccaaagtctgg-3’(SEQ ID NO.10)]。第二次PCR中使用了引物ps252[5’-gttcgtggtgcttccagagg-3’(SEQ ID NO.11)]和引物ps233[5’-ggaccactctgggaggtaca-3’(SEQ ID NO.12)]。

将得到的产物在5％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，通过溴化乙锭染色使其可观察。

实验例3 核提取液的制备

根据Shreiber等人的方法而改良的方法[Yoneda，Y.等，Neuroscience，90，519-533(1999)]，如下制备核提取液。

所用缓冲液和其它溶液在每次使用前，均经孔径220nm的Steritop(Milipore)过滤并灭菌。

如无特别说明，对各细胞结构物质的匀浆均在含有10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM二硫苏糖醇(DTT)和1mM(对脒基苯基)甲磺酰氟(PMSF)的50容量[315μl/板]10mM HEPES-NaOH(pH7.9)中、在2℃下进行。

接着，向得到的匀浆物中添加10％乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，使终浓度为0.6％。将得到的混合物以15000rpm离心5分钟。接着，将得到的沉淀悬浮于含有400mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT和1mM PMSF的10容量[0.1ml]20mM Tris-HCl(pH 7.5)中，冰冷却30分钟。将冰冷却后的悬浮物以15000rpm离心5分钟。将得到的上清作为核提取液用于前mRNA结合分析、凝胶移位分析和超迁移分析。上述核提取液在使用前，在-80℃保存。

实验例4 胞质溶胶级分和核级分的制备

根据Manabe等人的文献[Manabe等，Neurosicence，100，453-463，(2000)]，如下制备核级分。

在含有10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT和1mMPMSF的10mM HEPES-NaOH(pH 7.9)[315μl/板]中、在2℃下将脑结构物质匀浆。向得到的匀浆中添加10％Nonidet P-40，使终浓度为0.6％。将得到的混合物以15000rpm离心5分钟。得到沉淀[核级分(NP-40不溶性)]和上清[胞质溶胶级分(NP-40可溶性)]。另外将上述沉淀悬浮于含有1mM EDTA、1mM EGTA和PMSF的50mM Tris-HCl(pH 7.5)[50μl]中，以此作为核级分(NP-40不溶性)。

实验例5 DNA构建物的制备

按照常用方法合成图23所示的各种寡核苷酸。使用具有24个和60个核苷酸长的2种互补的寡核苷酸进行退火，得到NO.1～NO.11(SEQ ID NO.13～23)的双链DNA片段。图中，在各寡核苷酸中，将PS2的外显子5的各片段标下划线，以粗体字表示。

将得到的双链DNA片段分别整合到pcDNA3(+)载体，得到DNA构建物。使用DNA测序仪373A型(Applied biosustem)，分别对上述双链DNA片段进行序列分析。

实验例6 前ZmRNA探针的制备

将实验例5得到的DNA构建物用EcoRI酶切成直链状，由此得到模板DNA。接着将上述模板DNA在含有[α-³⁵S]标记UTP(62.5μCi)或[α-³²P]标记UTP(50μCi)、0.25mM UTP、0.5mM ATP、0.5mM CTP、0.5mM GTP、T7 RNA聚合酶缓冲液、20U T7 RNA聚合酶(Promega)和40单位RNA酶抑制剂(东洋纺)的转录用缓冲液中、在37℃温育1小时，进行体外转录，得到前mRNA探针(RNA探针No.1～11)。

实验例7 前mRNA的结合分析

将相当于5μg蛋白质的核提取液与10μg tRNA和各种³⁵S-标记RNA探针(1μg)一起，在温育缓冲液[含有60mM KCl、4mM MgCl₂、1mMEDTA、1mM EGTA、1mM DTT、10％甘油和1mM PMSF的12mMHEPES-NaOH缓冲液(pH 7.9)]中、在25℃下温育30分钟(总容量为25μl)。

接着，在室温、UV照射仪(254nm、60W)下，对得到的反应物照射紫外线(UV)15分钟。之后向UV照射后的反应物中添加10μg RNA酶A，在25℃温育30分钟，消化上述反应物中的探针。

将得到的产物与含有10％甘油、2％SDS、0.01％溴酚兰、5％2-巯基乙醇的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)按照1∶4体积混合，进行十二烷基硫酸钠(SDS)处理。将SDS处理后的溶液在含有0.1％SDS的10～20％梯度聚丙烯酰胺凝胶或15％聚丙烯酰胺凝胶上，以15mA/板的一定电流、在室温下电泳2小时。将电泳后的凝胶固定、干燥、在影像板上曝光。

实验例8 RNA印迹分析

按照上述Sato等人的文献[Sato N等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114，(2001]记载的方法，如下进行RNA印迹分析。即，使用甲醛-甲酰胺凝胶对相当于20μg的总RNA进行电泳，将得到的凝胶转印在尼龙滤膜上。接着，使转录在上述尼龙滤膜上的RNA和标记人HMG-I cDNA杂交。上述标记人HMG-I cDNA是使用随机标记试剂盒(宝酒造)进行标记而制备的。

实验例9 免疫印迹分析

根据上述Manabe等人的文献[Manabe等，Neuroscience，100，453-463，(2000)]的记载，如下进行免疫印迹分析。即，对核提取液、全溶胞产物、胞质溶胶级分和核级分进行蛋白质质量测定。接着，将核提取液、全溶胞产物、胞质溶胶级分和核级分的各等分与缓冲液[10mMTris-HCl、10％甘油、2％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.01％溴酚兰、5％巯基乙醇(pH 6.8)]按照1∶4体积混合。将得到的混和液在100℃煮沸10分钟。将一定量的各等分(核提取液中为相当于25μg蛋白质的量，在细胞全溶胞产物、胞质溶胶级分和核级分中为相当于50μg蛋白质的量)在含有0.1％SDS的15％聚丙烯酰胺凝胶上，以15mA/板的一定电流、在室温下电泳2小时。将电泳后的凝胶转印在由100％甲醇活化的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将转印后的PVDF膜用含有5％脱脂乳的含0.05％吐温-20 PBS封闭。接着，使PVDF膜与用含有1％脱脂乳的含0.05％吐温-20 PBS稀释的抗HMG-I/Y抗体反应。再使其与碱性磷酸酶结合抗山羊免疫球蛋白G(IgG)抗体反应。在含有100mM NaCl、5mM MgCl₂、66.7％氯化4-硝基蓝四唑鎓(NTB)、33.3％X-磷酸/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.5)中使免疫反应性可观察。

实验例10 免疫沉降

根据上述Sato等人的文献[Sato，N.等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114，(2001)]记载的条件，如下进行免疫沉降。

将正常氧状态的SK-N-SH细胞的核提取液或低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液与抗HMG-I抗体(santa Cruz Biotechnology)一起，在4℃下温育8小时。将得到的产物与蛋白-G琼脂糖[Pharmacia Biotech]混合，在4℃维持1小时。将得到的混合物用3000rpm离心5分钟，将得到的沉淀物悬浮于PBS。再将得到的悬浮物用3000rpm离心5分钟。将得到的沉淀物悬浮于Mili-Q水。将该悬浮液进行SDS处理，将得到的溶液进行SDS-PAGE。使用抗U1(70K)snRNP抗体，对得到的凝胶进行免疫印迹分析。

另外，使用抗U1(70K)snRNP抗体(santa Cruz Biotechnology)取代上述抗HMG-I抗体进行免疫沉降，使用对HMG-I/Y的抗体[抗HMG-I/Y抗体；santa Cruz Biotechnology]取代上述U1(70K)snRNP抗体进行免疫印迹分析。

实验例11 免疫细胞化学

用SK-N-SH细胞进行免疫细胞化学性检查。即，将SK-N-SH细胞维持在正常氧状态，或将该细胞在低氧条件下暴露21小时。接着将得到的细胞在4％低聚甲醛中、在室温下固定2小时，使其在0.3％Triton-X100中渗透至少5分钟。将固定并渗透了的细胞用PBS洗涤3次。在4℃下使洗净的细胞与抗HMG-I/Y抗体和抗SC35抗体(Sigma)进行免疫反应12小时。将细胞用PBS洗涤3次，与FITC结合抗山羊IgG抗体和Cy3结合抗小鼠IgG抗体一起在室温下温育2小时。在连接了计算机的显微镜下，用488nm激发滤片观察免疫反应性蛋白。

实验例12 免疫组织化学

采用上述Sato等人的文献[Sato N等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114，(2001)]记载的改良免疫过氧化物酶法进行免疫组织化学方法。即，将对照或sAD脑切片在室温下固定2小时，接着进行HMG-I/Y免疫组织化学处理。抗HMG-I/Y抗体或抗SSMAG抗体按照1∶1000的稀释率稀释使用。将生物素化抗山羊抗体或生物素化抗兔IgG(Vectastain Elite)作为二次抗体使用。在50mM Tris(pH 7.6)中，用0.05％DAB和0.01％过氧化氢使免疫反应性可观察。

实验例13 超迁移分析

将相当于5μg蛋白质的核提取液与1μg抗HMG-I/Y抗体(santaCruz Biotechnology)或0.5～2.0μg的抗U1(70K)snRNP抗体(santa CruzBiotechnology)一起，在4℃下温育8小时，进行预处理。在温育缓冲液[组成：含有60mM KCl、4mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、10％甘油和1mM PMSF的12mM HEPES-NaOH缓冲液(pH7.9)]中，将得到的预处理产物与2μg或10μg tRNA一起温育。接着添加³²P标记RNA探针[1μg、图4所示的No.5探针]，在25℃温育30分钟(总容量为50μl)。

将得到的反应物在含有50mM Tris和0.38M甘氨酸和2mM EDTA的缓冲液(pH 8.5)中、在4％聚丙烯酰胺凝胶上、以11V/cm的一定电压、在4℃电泳1.5小时，从而使结合探针和游离探针分离。将电泳后的凝胶固定并干燥，然后在X射线底片上曝光。

实施例1 散发性阿尔茨海默氏病患者脑和培养细胞中PS2V的表达

(1)散发性阿尔茨海默氏病患者脑中PS2V的表达

将来自散发性阿尔茨海默氏病(sAD)脑的总RNA或来自相当年龄的对照脑的总RNA通过RT-PCR进行分析。

根据Anwar R.等人[Anwar R.等，J.Neurochem.，66，1774-1777(1996)]记载的方法，分别从sAD脑及对照脑中分离mRNA。

接着，使用得到的mRNA和小鼠莫洛尼氏白血病病毒反转录酶(Promega)进行反转录反应。PCR的简要流程是：变性：95℃2分钟/95℃30秒、退火：60℃30秒、延长：72℃1分钟，以此为一个循环，共30个循环。第一次引物使用上述引物ps251和ps231，第二次引物使用引物ps252和ps233。

将得到的反应物在5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。通过溴化乙锭染色使扩增产物可观察。其结果如图1所示。

如图1的左图泳道1和Sato等人的文献[Sato等，J.Neurochem.，72，2498-2505(1999)]所示，可知对照脑中，检测出作为主要的RT-PCR产物的全长PS2。另一方面，如图1的左图泳道2所示，可知sAD脑中，除全长PS2外，还检测出更短链的产物。定向测序的结果显示：上述短链产物为缺失PS2基因的外显子5的变异体(以下称为PS2V)。

(2)培养细胞中PS2V的表达

如sAD模型，培养细胞中，为了有效地再现PS2V的生成，通过与上述相同的实验，对所有种类应激下的各种细胞株的总RNA进行了PS2V表达的测定。结果如图1的右图所示。

如图1右图中泳道1～3所示，可知在暴露于正常氧状态下的各种细胞株，即Hela细胞、HEK-293T细胞和SK-N-SH细胞中，只检出了全长PS2。另外如图1右图中泳道4和5所示，在暴露于低氧条件下的Hela细胞和HEK-293T细胞中可见同样结果。

不过，可知在暴露于低氧条件下的SK-N-SH细胞[图1、右图泳道6；Sato等，J.Neurochem.，72，2498-2505(1999)]以及sAD脑中，检出了PS2以及通过定向测序确定为PS2V的短链产物。

另一方面，在衣霉素(图1、右图泳道7)、β-淀粉样蛋白(图1、右图泳道8)和过氧化氢[Sato等，J.Neurochem.，72，2498-2505(1999)]等其它应激下，未观察到可检出的PS2V。

接着，使用对PS2V蛋白的抗体(抗SSMAG抗体)，通过免疫组织化学染色法研究PS2V的存在区域。结果如图2所示。

如图2和Sato等人的文献[Sato N等，J.Biol.Chem.，276，2108-2114，(2001)]所示，在sAD脑组织海马CA1区的锥体细胞层和一侧大脑皮质的锥体细胞层中观察到对PS2V的免疫反应性。因此可知PS2V存在于sAD脑组织海马CA1区的锥体细胞层和一侧大脑皮质的锥体细胞层中。

实施例2 低氧暴露细胞中PS2前mRNA结合因子的检出

为了检出低氧暴露细胞中PS2前mRNA结合因子，制备了图4所示的各种35S-标记前mRNA探针(RNA探针)。根据图3所示的方案，建立使用图4所示的各种探针的独自的前mRNA结合分析。结果如图5所示。

结果如图5泳道1所示，使用No.0³⁵S-标记探针进行前mRNA结合分析，得知：在正常氧状态的成神经细胞瘤SK-N-SH细胞的核提取液中，在黑色箭头指示的分子量(约20kDa)的位置未检出信号；如图5泳道2所示，在暴露于低氧条件下21小时的成神经细胞瘤SK-N-SH细胞的核提取液中，在黑色箭头指示的分子量(约20kDa)的位置检出信号。因此，可知在低氧暴露成神经细胞瘤SK-N-SH细胞的核提取液中，存在显示PS2前mRNA结合活性的因子。如果在用于前mRNA结合分析之前加热核提取液，则PS2前mRNA结合活性几乎完全消失，因此该结合活性来自蛋白质，而不是来自核酸、脂质等其它因子的可能性高。

另外，如图5泳道3～12所示，得知在暴露于低氧条件下的SK-N-SH细胞的核提取液中发现的、显示PS2前mRNA结合活性的因子结合到PS2外显子5的3’位点。

进一步通过PS2前mRNA结合分析，研究未标记的No.1～5各探针对于暴露于低氧条件下的SK-N-SH细胞的核提取液中发现的上述因子与No.0探针结合的影响。结果如图6所示。

如图6所示，得知：低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液中发现的上述因子与No.0探针的结合，因添加No.535S-未标记探针而受到阻碍，但不受其它未标记探针(No.1～4)的阻碍。

进一步研究了刺激后不同时刻得到的核提取液中，正常氧状态和低氧对于诱导与No.5探针的结合活性的影响。结果，在正常氧状态暴露下的SK-N-SH细胞的核提取液中，未发现在所用条件下对No.5探针的显著的结合活性。但是，在刺激后16-21小时之间的核提取液中，显示了低氧导致的结合活性增强，并持续了至少24小时。

本实施例中所有的实验均采用不同的细胞培养物，至少重复4次，得到了同样的结果。因此，显示了低氧诱导的结合活性对于No.5探针具有特异性。

实施例3 人PS2外显子5结合蛋白的纯化和鉴定

为了纯化实施例2中与No.5探针具有结合活性的因子，将受试级分加入到前mRNA结合性反应物中，通过测定对No.5探针结合活性的增加来进行分析。

概略的纯化步骤如图7所示。通过银染色(图8)和RNA结合分析(图9)，来分析图7所示的(I)～(V)各级分。

与实施例1同样地，将暴露于低氧条件下的SK-N-SH细胞的核提取液(图9、泳道1)用60％饱和硫酸铵分层，得到与No.5 RNA探针具结合活性的级分[级分(II)、图7(II)]作为上清。上述级分(II)的银染色结果如图8泳道2所示，RNA结合分析结果如图9泳道2所示。

分别将上述级分(II)在5L 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，在4℃下透析2次，每次4小时，由此除去硫酸铵。将得到的透析物过DEAE柱(Pharmacia Biotech)进行阴离子交换层析，之后用10ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤柱。然后用10ml含有1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行洗脱，得到与No.5 RNA探针具强结合活性的级分[级分(III)、图7(III)]。上述级分(III)的银染色结果如图8泳道3所示，RNA结合分析结果如图9泳道3所示。

将上述级分(III)用5L 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，在4℃下透析2次，每次4小时。将得到的透析物过5’-氨基-2’-O-甲基寡RNA(5’-aucuucuugguggugcucuacaaguaccgcugcuacaaggugaggcccu-3’SEQ IDNo.24)结合CNBr活化琼脂糖4B[Pharmacia Biotech]亲和柱。将上述亲和柱用10ml上述温育缓冲液洗涤，用15ml含有1M NaCl的温育缓冲液洗脱，得到与No.5 RNA探针具结合活性的级分[级分(IV)、图7(IV)](图9泳道4)。上述级分(IV)的银染色结果如图8泳道4所示，RNA结合分析结果如图9泳道4所示。

如图8泳道4所示，通过银染色结果可知尚未被完全纯化。

接着，将上述级分(IV)用5L Mili-Q水，在4℃下透析2次，每次4小时。将得到的透析物完全冷冻干燥后，重新溶解于含0.1％TFA的Mili-Q水中。

将得到的溶液进行使用Waters 5C18-MS(4.6×150mm)柱的反相层析。即，用含0.1％TFA的Mili-Q水洗涤柱。之后，用25ml 1～100％线性梯度乙腈的含0.1％TFA Mili-Q水溶液、再用5ml含0.1％TFA的100％乙腈进行洗脱。

结果得到用20～25％乙腈洗脱的单一峰的级分[级分(V)、图7(V)]。上述级分经SDS-PAGE后，进行银染色，如图8泳道5所示，在黑色箭头指示的分子量位置显示单一条带。但是，与前一步骤[图7(IV)]的级分比较，终级分的结合活性急剧降低。结合反应溶液中乙腈的终浓度为30％，则原有级分与探针No.5的结合活性几乎完全消失，由此可知：终级分结合活性的降低与反相层析用洗脱分离缓冲液中所含的乙腈有相关关系。

将得到的级分在含0.1％SDS的12％聚丙烯酰胺凝胶上，以15mA/板的一定电流，在室温下电泳2小时进行分离。之后，切下含分离的蛋白质条带的凝胶片段，用胰蛋白酶进行凝胶内消化。将洗脱出来的肽片段通过使用TSK凝胶ODS-80Ts QA柱(2.0mm×250mm、Toso)的HPLC进行分离。接着将分离的肽片段通过自动蛋白质分析仪(HPG1005A蛋白质分析系统)进行分析。将得到的肽序列信息用于数据库的检索。

对终级分中的单一条带进行肽序列分析，得到17个氨基酸的序列。将得到的肽序列与序列数据库中已知的蛋白质比较，结果表明：低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液中的PS2前mRNA结合性蛋白与HMG-I完全一致(GenBank检索号P17096)。

实施例4 HMG-I的结合活性的评价

根据实施例3的结果，为了确定HMG-I是实际具结合活性的物质，按照实验例13，使用抗HMG-I蛋白抗体、低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液或正常氧状态的SK-N-SH细胞的核提取液，如下进行超迁移分析。

即，将相当于5μg蛋白质的量的核提取液与0.5～2.0μg的抗HMG-I/Y抗体(santa Cruz Biotechnology)一起，在4℃下温育8小时，进行预处理。在温育缓冲液中，将预处理的核提取液与10μg tRNA一起温育，接着向得到的产物中添加总容量为50μl的³²P标记RNA探针[1μg、图4所示的No.5探针]，在25℃温育30分钟。在含有50mM Tris、0.38M甘氨酸和2mM EDTA的缓冲液(pH 8.5)中，在4％聚丙烯酰胺凝胶上，以11V/cm的一定电压，在4℃电泳1.5小时，从而使结合探针和游离探针分离。将凝胶固定并干燥，将干燥凝胶在X射线底片上曝光，进行放射自显影。

结果，使用低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液时，如图10右图泳道1和2所示，比使用正常氧状态的SKN-SH细胞的核提取液时具有更强的结合活性。另外如图10右图泳道3～5所示，得知：通过用抗HMG-I/Y抗体进行预处理，该结合活性的增加与抗体浓度相关、并出现了超迁移。但是，如图10左图所示，在作为对照实验的正常氧状态的K-N-SH细胞的核提取液中，未观察到因添加HMG-I/Y抗体而产生的显著效果。

上述结果显示与探针No.5具结合活性、低氧暴露的SK-N-SH细胞的物质为HMG-I。

另外显示：在前mRNA结合分析中，低氧暴露的细胞中HMG-I蛋白与探针No.5的结合活性并不依赖于UV照射。

实施例5 PS2前mRNA结合位点的确定

本发明人着眼于图4的探针No.5中PS2外显子5的3’末端的2次重复的相似序列(重复序列)，猜测HMG-I蛋白与这些重复序列结合。因此，制备了图11所示的6种RNA探针(探针No.6～11)作为探针No.5的衍生物，使用得到的探针，按照上述实验例7进行前mRNA结合分析。结果如图12所示。上述重复序列是图11探针No.5中带下划线的序列，分别标示为SEQ ID No.1和2。

如图12泳道1所示，在暴露于正常氧状态的SK-N-SH细胞的核提取液中未检出与探针No.5的结合活性。另一方面，与图5和图6同样，如图12泳道2所示，可知：通过使用低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液，在黑色箭头指示的分子量位置，与探针No.5的结合活性强烈增强。

但是，如图12泳道3所示，低氧暴露导致的结合活性的增强因使用缺失SEQ ID No.1和2序列的探针(图11的探针No.6)而消失。另一方面，在低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液中，由于使用探针No.7(图11)，使结合强烈提高(图12泳道4)，所述探针No.7含有SEQ ID No.1和2直接连接的序列。另外，使用探针No.8(图11)时，如图12泳道5所示，在几乎所有部分，结合活性完全消失，所述探针No.8含有SEQ IDNo.1和2中A分别取代C的序列。进一步将SEQ ID No.1和2其中之一用于结合分析，观察结合活性(图12泳道6和8)，则与具两个序列的探针No.10的结合活性最强(图12泳道7)。这些结果意味着SEQ IDNo.1和2其中之一或两者在PS2前mRNA与HMG-I蛋白的结合活性中是必需的。

图12显示SEQ ID No.1和2其中之一或两者在PS2前mRNA与HMG-I蛋白的结合活性中是必需的。为了将上述SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2的序列与数据库中其它基因比较而进行的同源性研究中，显示上述SEQ ID No.1和2是至今首次发现的PS2外显子5所特有的序列。

上述结果显示HMG-I/Y蛋白与单链RNA结合，HMG-I蛋白识别由含有gcucuacaag(SEQ ID No.1)和/或gcugcuacaag(SEQ ID No.2)的序列构成的位点，并与其结合。

实施例6 低氧对HMG-I mRNA和免疫反应性HMG-I蛋白的表达的影响

为了研究结合活性的增加是否依赖于HMG-I表达的增加，对在正常氧状态时和低氧暴露时HMG-I mRNA和蛋白质的表达水平进行了比较。

如图13的左上图所示，通过RNA印迹分析，得知HMG-I与mRNA结合的水平随在成神经细胞瘤SK-N-SH细胞中表达PS2V的条件—低氧暴露而急剧增加。但是，使用不诱导PS2V的低氧暴露HEK-293T细胞时(图13上中图)，或使用不诱导PS2V的衣霉素处理的SK-N-SH细胞时(图13上右图)，可知未见应激下的显著增加。

结果，如图14左图上部的箭头所示，通过使用抗HMG-I/Y抗体的免疫印迹分析，得知免疫反应性HMG-I蛋白在低氧暴露SK-N-SH细胞核提取液中，比在正常氧状态条件下的细胞中较多表达。但是，如图14左图下部的箭头所示，可知免疫反应性HMGY蛋白在SK-N-SH细胞的核提取液中不受低氧应激的影响。如图14右图所示，可知在低氧暴露HEK-293T细胞中，未见抗HMG-I/Y抗体导致的显著的免疫反应性。

使用低氧暴露HEK-293T细胞和衣霉素处理的SK-N-SH细胞的实验显示的结果与以前的报道互相矛盾，以前的报道称：作为初期事件，低氧使HMG-I/Y mRNA在稳定状态的细胞水平中增加，与此相随HMG-I/Y蛋白也增加[Ji，Y.S.等，Circ.Res.，83，295-304，(1998)]互相矛盾。这种显然的矛盾或许反映了各细胞株的差异。

实施例7 HMG-I蛋白在细胞水平的存在

为了研究在细胞水平的存在，将SK-N-SH细胞培养物在低氧条件下暴露21小时，使用抗HMG-I/Y抗体和抗SC35抗体，用免疫荧光显微镜检测HMG-I蛋白。上述抗SC35抗体是抗剪接必需因子SC35蛋白的抗体。本实施例中，将上述抗SC35抗体作为剪接因子存在点的标志，进行免疫细胞化学检查。

正常氧状态下的细胞中免疫细胞化学检查的结果如图15正常氧状态的图所示，可知HMG-I蛋白并不与主要存在于核中、微弱且散在的免疫反应只存在于核斑点的免疫反应性SC35蛋白共同存在，而是可在细胞质中得到。

但本实验在SC35存在的核斑点中获得了更强的免疫反应性，低氧暴露SK-N-SH细胞中的细胞质免疫反应性比在正常氧状态的细胞中还低。由此可见，HMG-I蛋白在SK-N-SH细胞中不仅受低氧刺激诱导，还被从细胞质中积累到核中，可以认为HMG-I的表达与诱导PS2V之间存在相关关系。

实施例8 HMG-I和HMGY的瞬时转染对于体内跳过PS2基因外显子5的效果

根据上述Sato等人的文献[Sato等，J.Neurochem.，72，2498-2505(1999)]中记载的方法，分别从散发性阿尔茨海默氏病的脑和低氧暴露SK-N-SH细胞中获得了缺损外显子5的选择性剪接型PS2基因。

为了研究伴随PS2基因外显子5缺损的选择性剪接是否由HMG-I/Y引起，研究了HMG-I的瞬时表达对于诱导SK-N-SH培养细胞和HEK-293T培养细胞中PS2V的效果。免疫印迹分析结果如图16所示，RT-PCR结果如图17所示。

如图16所示，发现：在HMG-I转染SK-N-SH细胞的核提取液和HMG-I转染HEK-293T细胞的核提取液中，与模拟转染细胞的核提取液相比，有更强的免疫反应性HMG-I蛋白的表达。进一步如图17泳道1所示，可知：在模拟转染SK-N-SH细胞的总RNA的RT-PCR分析中，在全长PS2基因对应的分子量位置上检出了主要转录产物(图17中的PS2)。与此对照，如图17泳道2和泳道3所示，使用HMG-I转染细胞的总RNA时，通过RT-PCR分析可知：不仅检出了主要转录产物全长PS2(图17中的PS2)，也检出了与HMG-I量相关的、更短链的RT-PCR产物(图17中的PS2V)。

经定向测序分析表明，异常RT-PCR产物为缺失外显子5的PS2的可变剪接产物。与此相对，如图17泳道4和泳道5所示，在SK-N-SH细胞中可见HMG-Y的瞬时转染对PS2V的微弱诱导，而在SK-N-SH细胞的核提取液中，HMGY蛋白不受低氧的诱导。如图17所示，在PS2V不受低氧诱导的细胞株(图2)HEK-293T细胞中，PS2V因HMG-I的过量表达而被检出。

已知剪接的必需因子之一U1(70K)snRNP通常结合于5’剪接位点。因此，可以预见HMG-I能够阻碍U1 snRNP与前mRNA的结合。因此，研究了HMG-I对SK-N-SH细胞的核提取液中的U1(70K)snRNP与前mRNA的结合活性的效果。

按照实验例13，使用对U1(70K)snRNP的抗体[抗U1(70K)snRNP抗体(santa Cruz Biotechnology)]，如下进行超迁移分析。

即，将相当于5μg蛋白质的量的核提取液与1μg抗HMG-I/Y抗体(santa Cruz Biotechnology)一起，在4℃下温育8小时，进行预处理。在温育缓冲液[组成：含有60mM KCl、4mM MgCl₂、1mM EDTA、1mMEGTA、1mM DTT、10％甘油和1mM PMSF的12mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 7.9)]中，将得到的预处理产物与2μg tRNA一起温育。接着添加³²P标记RNA探针[1μg、图4所示的No.5探针]，在25℃温育30分钟(总容量为50μl)。将得到的反应物在含有50mM Tris、0.38M甘氨酸和2mM EDTA的缓冲液(pH 8.5)中，在4％聚丙烯酰胺凝胶上，以11V/cm的一定电压，在4℃电泳1.5小时，从而使结合探针和游离探针分离。将电泳后的凝胶固定并干燥，然后在X射线底片上曝光。结果如图18所示。

如图18左图所示，可知模拟转染SK-N-SH细胞的核提取液中，通过抗U1(70K)snRNP抗体进行的预处理，与探针No.12的结合活性产生抗体浓度相关性超迁移。另外，如图18的左图泳道1、右图泳道1所示，在HMG-I转染SK-N-SH细胞的核提取液中，可见比模拟转染细胞的核提取液更强的结合活性。

但是，如图18右图泳道2～4所示，可知HMG-I转染SK-N-SH细胞的核提取液中，这些结合活性并不受添加抗U1(70K)snRNP抗体的影响。即，这些结果显示：HMG-I阻碍U1(70K)snRNP与前mRNA的结合活性。

进一步研究HMG-I对U1(70K)snRNP与前mRNA的结合活性的阻碍，结果如图19所示。

如图19所示，可知在低氧暴露的SK-N-SH细胞的核提取液中，HMG-I与U1(70K)snRNP直接结合，但在正常氧状态暴露的细胞的核提取液中，HMG-I不与U1(70K)snRNP结合。

HMG-I的瞬时转染诱导了SK-N-SH细胞中PS2V的表达(图17)。在PS2V不表达的细胞株HEK-293T细胞(图2)中，因低氧暴露而使HMG-I过量表达，由此得以观察到了可检出的PS2V(图17)。因此，可以说PS2V只受在细胞中HMG-I过量表达的诱导。表明低氧刺激使HMG-I表达增加，这是诱导PS2V所必需的。

U1(70K)snRNP是剪接的必需因子，识别5’剪接位点，与该5’剪接位点结合。U1(70K)snRNP识别序列和HMG-I识别序列在No.5探针上互相临近。在HMG-I转染SK-N-SH细胞的核提取液中，U1(70K)snRNP与PS2 mRNA的结合活性在体外受到阻碍(图18)。

在低氧暴露SK-N-SH细胞的核提取液中，HMG-I蛋白与U1(70K)snRNP结合(图19)。本实施例中观察到的HMG-I与U1(70K)snRNP的结合阻碍了SF2/ASF与U1(70K)snRNP的结合，可以想见结果抑制了U1(70K)snRNP与前mRNA的结合活性。

另外，HMG-I通过阻碍U1(70K)snRNP与前mRNA或图20所示的其它剪接因子的结合，显示了抑制U1(70K)snRNP对PS2前mRNA作用的可能性。

实施例9 sAD脑中HMG-I/Y蛋白的表达

可以想见：如果HMG-I蛋白真的诱导缺失PS2外显子5的选择性剪接，则应该观察到sAD脑比对照脑中更强的HMG-I的表达。因此，通过免疫印迹分析，比较了对照脑和sAD脑中HMG-I的表达水平。结果如图21所示。

如图21的左图和右图所示，可知HMG-I蛋白和Y蛋白均比年龄相当的对照有所增加，在来自3名不同的sAD患者的海马的全溶胞产物和核级分中表达。但是，如图21的中图所示，可知海马的胞质溶胶级分中，sAD患者与对照之间并未见显著差异。

为了确定海马的HMG-I/Y表达区，使用抗HMG-I/Y抗体进行了免疫组织化学分析。结果如图22所示。如图22所示，在sAD脑的海马CA1区的锥体细胞层中，证实存在比对照更强的免疫反应性表达。

免疫组织化学分析中，在来自对照脑的海马的核级分中检出了免疫反应性HMG-I/Y蛋白(图21)，但在对照脑的海马CA1区几乎未检出HMG-I/Y蛋白(图22)。这是由于HMG-I/Y在对照的海马腔隙层到分子层中均有表达，这与sAD脑并无不同。

在sAD的海马核级分中，观察到HMG-I蛋白和Y蛋白两者均比对照强表达，但在胞质溶胶级分中未观察到(图21)。另外通过免疫组织化学检查，在sAD脑的海马CA1区锥体细胞中检出了HMG-I/Y蛋白(图22)。这些结果显示了HMG-I/Y蛋白与PS2前mRNA结合，在sAD脑和细胞株中实际诱导缺失PS基因外显子5的剪接变异体的可能性。

实施例10

根据上述Sato等人的文献，进行成神经细胞瘤SK-N-SH细胞总RNA的制备和RT-PCR，如下探讨了具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA对早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生的抑制效果。

将成神经细胞瘤SK-N-SH细胞接种于8ml含10％胎牛血清的Dulbecco极限培养基(GIBCO BRL)，用Oligofectamine使各为0、10、15μg的2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID NO.27)(分别为0μl、20μl、45μl)转染。只使用Oligofectamine(分别为0μl、20μl、45μl)时，则未见显著变化。

将上述细胞在5％CO₂、37℃条件下培养16小时。培养12小时后更换培养基。之后再在低氧罐(氧压为8托)中将得到的细胞培养21小时。

接着与上述同样，使用RNeasy总RNA试剂盒(Qiagen)提取总RNA并纯化。

使用得到的总RNA和小鼠莫洛尼氏白血病病毒反转录酶(Promega)，在42℃进行反转录反应1小时。以得到的反应物为模板，进行第一次PCR，再以得到的PCR产物为模板进行第二次PCR。

PCR的简要流程是：以95℃30秒-60℃30秒-72℃1分钟(最后的循环为72℃2分钟)为一个循环，共30个循环。第一次PCR中使用引物ps251(SEQ ID NO.9)和引物ps231(SEQ ID NO.10)。第二次PCR中使用引物ps252(SEQ ID NO.11)和引物ps233(SEQ ID NO.12)。

将得到的产物用5％聚丙烯酰胺凝胶(TBE)进行电泳，通过溴化乙锭染色使其可观察。

使用来自未导入2’-O-甲基寡RNA的成神经细胞瘤SK-N-SH细胞的RNA作为对照。结果如图24所示。

如图24所示，可知：与未导入2’-O-甲基寡RNA的情形相比，导入了2’-O-甲基寡RNA时，抑制了早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体(图中的PS2V)的产生。

实施例11

研究了2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID NO.27)对体外低氧诱导的HMG-I与PS2前mRNA的结合的影响。

在正常氧条件或低氧条件下，将SK-N-SH细胞在5％CO₂、37℃条件下培养21小时。由得到的细胞中制备核提取液。之后，将得到的核提取液、³²P标记RNA探针No.5和各种用量的2’-O-甲基寡RNA(泳道3为0.5μg；泳道4为5μg；泳道5为50μg；泳道6为500μg)在25℃温育30分钟。在含有50mM Tris、0.38M甘氨酸和2mM EDTA的缓冲液(pH 8.5)中，在4％聚丙烯酰胺凝胶上，以11V/cm的一定电压，在4℃电泳1.5小时，从而使结合探针和游离探针分离。将电泳后的凝胶固定并干燥，将干燥凝胶在X射线底片上曝光，进行放射自显影。

结果如图25所示。

如图25泳道1和泳道2所示，与在正常氧条件下培养的SK-N-SH细胞相比，在低氧条件下培养的SK-N-SH细胞的核提取液中，HMG-I与具有SEQ ID NO.3所示序列的RNA探针No.5的结合增加。这些结合的增加因上述2’-O-甲基寡RNA的添加而受到用量相关性阻碍，因此表明：上述2’-O-甲基寡RNA阻碍低氧诱导的HMG-I与PS2前mRNA目标位点的结合活性。

实施例12

使用Oligofectamine，将³²P标记的2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID NO.27)导入SK-N-SH细胞。接着分别提取全溶胞产物、核级分和胞质溶胶级分。之后通过分别测定全溶胞产物、核级分和胞质溶胶级分的放射活性，研究SK-N-SH细胞中2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID NO.27)的稳定性、2’-O-甲基寡RNA向该SK-N-SH细胞的导入效率。结果如26图A所示。

如图26图Aa所示，可知上述2’-O-甲基寡RNA没有消失，而是被导入SK-N-SH细胞，并用量相关性地被送达核内。另外，如图26图Ab所示，按照20μg/10cm皿使用2’-O-甲基寡RNA时，上述2’-O-甲基寡RNA向SK-N-SH细胞导入的效率最高。

不过，由图26图A推定2’-O-甲基寡RNA的摄入量为约15μg/10cm皿，因此今后导入细胞时的最高用量设定为15μg/10cm皿。

进一步研究了2’-O-甲基寡RNA向SK-N-SH细胞导入48小时时，导入核内的2’-O-甲基寡RNA的稳定性。结果如图26图B所示。

如图26图B所示，即使在导入后的48小时，2’-O-甲基寡RNA与在原有级分中存在的分子量几乎相同，这表明：该2’-O-甲基寡RNA在48小时后在核内也未分解，是稳定的。

实施例13

研究了2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID NO.27)对SK-N-SH细胞的核提取液中HMG-I与DNA结合的作用。

首先通过体外DNA选别分析来确定HMG-I识别基序的碱基序列。体外DNA选别分析顺序如下。使用5’-GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3’(SEQID NO.67)和5’-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3’(SEQ ID NO.68)作为引物，以[94℃1分钟-53℃1分钟-72℃1分钟]为1个循环、共进行7个循环的PCR，扩增含有31个核苷酸的随机序列(经16个克隆的定向测序，确定其中包含20.7％的A、22.7％的C、31.5％的T、25.1％的G)的合成DNA[5’-GGTGATCAGATTCTGATCCA(N₃₁)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3’]。

在温育缓冲液[含有60mM KCl、4mM MgCl₂、1mM EDTA、1mMEGTA、1mM DTT、10％甘油和1mM PMSF的12mM HEPES-NaOH(pH7.9)]中，将得到的产物与在大肠杆菌中表达的重组HMG-I(标示为rHMG-I)一起，在25℃温育30分钟。

对得到的反应溶液进行使用抗HMG-I抗体的免疫沉降，以免疫沉降的产物为模板，使用5’-GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3’(SEQID NO.67)和5’-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3’(SEQ ID NO.68)作为引物，进行以[94℃1分钟-53℃1分钟-72℃1分钟]为1个循环、共7个循环的PCR。将得到的PCR产物在pGEM-T载体(Promega)中克隆，进行定向测序分析。

结果表明：图27的最上部表示的共有序列为HMG-I识别基序。

接着，研究2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID No.27)对含有上述HMG-I识别基序的³²P-标记DNA探针[gcgG(A)GT(A)A(T)ATTTcgc(SEQ IDNo.66)]与HMG-I的结合的作用。

测定了核提取液的蛋白质含量后，向上述温育缓冲液中添加相当于5μg蛋白质的量的提取液、1μg聚dIdC、各种浓度的2’-O-甲基寡RNA(SEQ ID No.27)，接着添加1μg³²P-标记DNA探针[gcgG(A)GT(A)A(T)ATTTcgc(SEQ ID No.66)]，使总量为50μl，再在25℃温育30分钟。

之后，在含有50mM Tris、0.38M甘氨酸和2mM EDTA的缓冲液中，在4％聚丙烯酰胺凝胶上，以11V/cm的一定电压，在4℃电泳1.5小时，从而使结合探针和游离探针分离。使电泳后的凝胶干燥，通过放射自显影进行分析。

结果如图28图A和图B的各自泳道1和泳道2所示，通过HMG-I在SK-N-SH细胞中的过量表达，含有上述HMG-I识别基序的³²P-标记DNA探针与HMG-I的结合急剧上升。

但是，如图28图A和图B的各自泳道3和泳道4所示，未观察到上述2’-O-甲基寡RNA对于HMG-I与上述DNA探针的结合活性上升的显著影响。

因此表明：上述2’-O-甲基寡RNA的阻碍作用对HMG-I与RNA的结合是特异性的，但对HMG-I与DNA的结合不具特异性。

实施例14

分别使用在设有加湿气氛下维持低氧压(8托)的低氧罐的培养箱，在37℃低氧条件下或正常氧条件下，将导入了2’-O-甲基寡RNA(SEQID No.27)的SK-N-SH细胞[被检细胞]和未导入2’-O-甲基寡RNA的SK-N-SH细胞[对照细胞]培养21小时，接着在2μM衣霉素存在或不存在下培养10小时。

之后，使用Promega公司制造的商品名为Cell Titer 96R AQueousOne Solution Proliferation Assay，进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓测定(称为MTS测定)，分析细胞的存活率。

结果如图29图A泳道4～7所示，证实通过导入上述2’-O-甲基寡RNA，可用量相关性地显著缓和由低氧刺激和衣霉素诱导的细胞死亡。

另外，分别将瞬时表达HMG-I、且导入了2’-O-甲基寡RNA(SEQ IDNo.27)的SK-N-SH细胞[被检细胞]、瞬时表达HMG-I的SK-N-SH细胞和SK-N-SH细胞在2μM衣霉素存在或不存在下培养10小时。

之后，与上述同样地进行MTS测定，分析细胞的存活率。

结果如图29图B泳道4～7所示，证实通过导入上述2’-O-甲基寡RNA，可用量相关性地缓和由HMG-I的瞬时表达和衣霉素诱导的细胞死亡。

序列表独立文本

SEQ ID No.1表示结合区的序列。

SEQ ID No.2表示结合区的序列。

SEQ ID No.3表示RNA探针No.5的序列。

SEQ ID No.4表示RNA探针No.7的序列。

SEQ ID No.5表示RNA探针No.9的序列。

SEQ ID No.6表示RNA探针No.10的序列。

SEQ ID No.7表示RNA探针No.11的序列。

SEQ ID No.8表示RNA探针No.8的序列。

SEQ ID No.9表示引物ps251的序列。

SEQ ID No.10表示引物ps231的序列。

SEQ ID No.11表示引物ps252的序列。

SEQ ID No.12表示引物ps233的序列。

SEQ ID No.13表示DNA探针No.1的序列。

SEQ ID No.14表示DNA探针No.2的序列。

SEQ ID No.15表示DNA探针No.3的序列。

SEQ ID No.16表示DNA探针No.4的序列。

SEQ ID No.17表示DNA探针No.5的序列。

SEQ ID No.18表示DNA探针No.6的序列。

SEQ ID No.19表示DNA探针No.7的序列。

SEQ ID No.20表示DNA探针No.8的序列。

SEQ ID No.21表示DNA探针No.9的序列。

SEQ ID No.22表示DNA探针No.10的序列。

SEQ ID No.23表示DNA探针No.11的序列。

SEQ ID No.24表示作为亲和柱的配体使用的5’-氨基-2’-O-甲基寡RNA序列。

SEQ ID No.25表示RNA探针No.6的序列。

SEQ ID No.26表示RNA探针No.12的序列。

SEQ ID No.27表示SEQ ID No.24中存在的HMG-I蛋白结合区序列所对应的2’-O-甲基寡RNA序列。

SEQ ID No.28表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.29表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.30表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.31表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.32表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.33表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.34表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.35表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.36表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.37表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.38表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.39表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.40表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.41表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.42表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.43表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.44表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.45表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.46表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.47表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.48表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.49表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.50表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.51表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.52表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.53表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.54表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.55表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.56表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.57表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.58表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.59表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.60表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.61表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.62表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.63表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.64表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.65表示用于体外DNA选别分析的合成DNA序列。n表示G或A或T或C。

SEQ ID No.66表示含有HMG-I识别基序的合成DNA序列。

SEQ ID No.67表示用于体外DNA选别分析的引物序列。

SEQ ID No.68表示用于体外DNA选别分析的引物序列。

工业可利用性

本发明的阻碍剂可阻碍HMG-I蛋白与早老素-2 mRNA外显子5的结合，由此可在治疗和/或预防由剪接异常引起的疾病、特别是脑障碍或神经变性性疾病上发挥优异效果。另外本发明的神经细胞死亡抑制剂抑制早老素-2外显子5缺损型剪接异常，由此可发挥抑制神经细胞死亡的优异效果。本发明的药物组合物还可抑制神经细胞死亡，在治疗或预防由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病、特别是脑障碍或神经变性性疾病上发挥优异效果。本发明的治疗或预防方法在可更有效、持续地进行由早老素-2 mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而导致的疾病、特别是脑障碍或神经变性性疾病的治疗或预防方面发挥优异效果。

序列表

<110>科学技术振兴事业团(Japan Science and Technology Corporation)

<110>大正制药株式会社(TAISHO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)

<120>药物组合物

<130>02-032-PCT

<140>

<141>

<150>JP 2001-195471

<151>2001-06-27

<160>68

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>10

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：结合区序列

<400>1

gcucuacaag 10

<210>2

<211>11

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：结合区序列

<400>2

gcugcuacaa g 11

<210>3

<211>42

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.5的序列

<400>3

ugguggugcu cuacaaguac cgcugcuaca aggugaggcc cu 42

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.7的序列

<400>4

gcucuacaag gcugcuacaa g 21

<210>5

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.9的序列

<400>5

ugguggugcu cuacaagua 19

<210>6

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.10的序列

<400>6

gcucuacaag uaccgcugcu acaag 25

<210>7

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.11的序列

<400>7

ccgcugcuac aaggugaggc ccu 23

<210>8

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.8的序列

<400>8

gcucuaaaag uaccgcugcu aaaag 25

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物ps251的序列

<400>9

attcagacct ctctgcggcc 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物ps231的序列

<400>10

aagcgggagc caaagtctgg 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物ps252的序列

<400>11

gttcgtggtg cttccagagg 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物ps233的序列

<400>12

ggaccactct gggaggtaca 20

<210>13

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.1的序列

<400>13

tctggatcct gccttctccc tcagcatcta cacgacattc actgaggaca cgaattcaga 60

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.2的序列

<400>14

tctggatcct gaggacacac cctcggtggg ccagcgcctc ctcaactccg tgaattcaga 60

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.3的序列

<400>15

tctggatccc aactccgtgc tgaacaccct catcatgatc agcgtcatcg tgaattcaga 60

<210>16

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.4的序列

<400>16

ctcggatcct gatcagcgtc atcgtggtta tgaccatctt cttggtggtg cgaattcgag 60

<210>17

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.5的序列

<400>17

tctggatcct ggtggtgctc tacaagtacc gctgctacaa ggtgaggccc tgaattcaga 60

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.6的序列

<400>18

gatccgacca tcttcttggt ggtg 24

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.7的序列

<400>19

gatccgctct acaaggctgc tacaagg 27

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.8的序列

<400>20

gatccgctct aaaagtaccg ctgctaaaag g 31

<210>21

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.9的序列

<400>21

tctggatcct ggtggtgctc tacaagtaga attcaga 37

<210>22

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.10的序列

<400>22

tctggatccg ctctacaagt accgctgcta caaggaattc aga 43

<210>23

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：DNA探针No.11的序列

<400>23

tctggatccc cgctgctaca aggtgaggcc ctgaattcag a 41

<210>24

<211>49

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：5’-氨基-2’-O-甲基寡RNA序列

<400>24

aucuucuugg uggugcucua caaguaccgc ugcuacaagg ugaggcccu 49

<210>25

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.6的序列

<400>25

gaccaucuuc uugguggu 18

<210>26

<211>72

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：RNA探针No.12的序列

<400>26

ugguggugcu cuacaaguac cgcugcuaca aggugaggcc cuggcccugc ccuccagcca 60

cgcuucucuc cg 72

<210>27

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：SEQ ID No.24中存在的HMG-I蛋白结合区的序列对应的2’-O-甲基寡RNA序列

<400>27

gcucuacaag uaccgcugcu acaag 25

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>28

ggttcattct gcggtatggt tatctg 26

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>29

atctgtaatt ccatggtggc tactggaact a 31

<210>30

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>30

gtggaggctg ccgcgagtta tcacagtata g 31

<210>31

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>31

acctaggtta ttctgcggta tggttatctg 30

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>32

gggtgcctag ctccggaaca tggttattga 30

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>33

cgttctcttt cggaaacggt ttttgagcac g 31

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>34

tgaggcatga aggtaattac tgcatattga 30

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>35

ggccgcgtgt agatattggg atttggtgtg 30

<210>36

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>36

cgttctcttt cggaaatttt tgagcacg 28

<210>37

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>37

tgaccaagta aatccgtccc tcactagtga a 31

<210>38

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>38

gccatgtttt tagataattg tgcttaggcg t 31

<210>39

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>39

tctgaggcat gaaggtaatt actgcatcat t 31

<210>40

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>40

tatccagtgg ataattcccc aatgttatct 30

<210>41

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>41

cgttccgacc aatgggttcg gataatacgt t 31

<210>42

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>42

cttctgcggt ataaggtggg ttggtgtgct c 31

<210>43

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>43

gaggtgtcag gcgacaccta aaaattcacg c 31

<210>44

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>44

atatcctgcc aaaaatttgt tctcggggct ga 32

<210>45

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>45

tgtttcgcgt aaagtattac gttgctcttt t 31

<210>46

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>46

gtcgggcctg tattttggtt gctattttga a 31

<210>47

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>47

gcgagtcggg cctgtatttt ggttgctatt t 31

<210>48

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>48

ttgaattagg gtgctatatt tttgcatttt ga 32

<210>49

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>49

gtcgggcctg tattttggtt gctattttga a 31

<210>50

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>50

gcgagtcggg cctgtatttt ggttgctatt t 31

<210>51

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>51

ccactttgaa ttagggtgct atatttttgc at 32

<210>52

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>52

gtggataaat tccccaatgt tatcttatga a 31

<210>53

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>53

ctttgaatta gggtgctata tttttgcatt tt 32

<210>54

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>54

cgtgtttcgc cagaaccgca ctagagcaat ttgaa 35

<210>55

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>55

ctttgaatta gggtgctata tggtttgcat ttt 33

<210>56

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>56

gtggataaat tccccaatgt tatcttatga a 31

<210>57

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>57

ggtgccgata cgtaactcac cgcattcttg g 31

<210>58

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>58

cgttccgacc aatgggttcg gataatacgt t 31

<210>59

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>59

ggtgccgata cgtaactcac cgcattttgg c 31

<210>60

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>60

ggtgccgata cgtaatcacc gcattcttgg c 31

<210>61

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>61

cactttgaat tagggtgcta tatgttttgc a 31

<210>62

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>62

ttgaattagg gtgctatatg ttttgcattt t 31

<210>63

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>63

cgttctcttt cggaaacggt ttttgagcac g 31

<210>64

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>64

aggttcgtgc acccggacca cagttttttc a 31

<210>65

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于体外DNA选别分析的合成DNA序列

<220>

<223>n为g或a或t或c

<400>65

ggtgatcaga ttctgatcca nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntgaagcttg 60

gatccgtcgc 70

<210>66

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：含有HMG-I识别基序的合成DNA序列

<400>66

gcgrgwwatt tcgc 14

<210>67

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于体外DNA选别分析的引物序列

<400>67

gtaatacgac tcactatagg gtgatcagat tctgatcca 39

<210>68

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于体外DNA选别分析的引物序列

<400>68

gcgacggatc caagcttca 19

Claims

1.HMG-I蛋白与早老素-2基因之间的结合阻碍剂，所述阻碍剂含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的化合物作为有效成分。

2.权利要求1的阻碍剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(A)含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.2所示的碱基序列，且与HMG-I蛋白结合的RNA分子；

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(E)上述(C)反义分子的类似分子。

3.权利要求2的阻碍剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(a)含有SEQ ID NO.3、4、5、6或7其中之一所示的碱基序列，且可与HMG-I蛋白结合的RNA分子；

(b)含有SEQ ID NO.3、4、5、6或7其中之一所示碱基序列所对应的DNA序列，且可与HMG-I蛋白结合的DNA分子；

(c)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(e)上述(c)反义分子的类似分子。

4.权利要求1或2的阻碍剂，其中所述化合物为具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA分子。

5.神经细胞死亡抑制剂，所述抑制剂由含有HMG-I蛋白与早老素-2基因之间的结合阻碍剂作为有效成分而构成，所述阻碍剂含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的化合物作为有效成分。

6.权利要求5的神经细胞死亡抑制剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(E)上述(C)反义分子的类似分子。

7.权利要求6的神经细胞死亡抑制剂，其中所述化合物选自下述的一种：

(c)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(e)上述(c)反义分子的类似分子。

8.权利要求5或6的神经细胞死亡抑制剂，其中所述化合物为具有SEQ ID NO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA分子。

9.药物组合物，所述药物组合物由含有HMG-I蛋白与早老素-2基因之间的结合阻碍剂、或含该阻碍剂作为有效成分的神经细胞死亡抑制剂作为有效成分而构成，所述阻碍剂含有阻碍HMG-I蛋白与早老素-2mRNA外显子5结合的化合物作为有效成分。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述化合物选自下述的一种：

(C)与上述(A)RNA分子或(B)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(E)上述(C)反义分子的类似分子。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述化合物选自下述的一种：

(c)与上述(a)RNA分子或(b)DNA分子其中之一互补的反义分子；

(e)上述(c)反义分子的类似分子。

12.权利要求9或10的药物组合物，其中所述化合物为具有SEQ IDNO.27所示碱基序列的2’-O-甲基寡RNA分子。

13.权利要求9-12中任一项的药物组合物，所述药物组合物具有抑制剪接异常的作用。

14.权利要求9-13中任一项的药物组合物，所述药物组合物具有抑制早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生的作用。

15.权利要求9-14中任一项的药物组合物，所述药物组合物可治疗或预防由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的脑障碍或神经变性性疾病。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述脑障碍为缺血性脑病或脑神经变性性疾病。

17.权利要求16的药物组合物，其中所述脑障碍为选自脑血管性痴呆、帕金森氏综合征以及阿尔茨海默氏病的疾病。

18.权利要求15的药物组合物，其中所述神经变性性疾病为肌萎缩性侧索硬化。

19.权利要求1-4中任一项的阻碍剂或权利要求5-8中任一项的神经细胞死亡抑制剂在制备药物组合物中的用途，该药物组合物通过对由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病的个体给药来治疗或预防由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病。

20.由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生而引起的疾病的治疗或预防方法，其特征在于：将治疗上有效量的权利要求1-4中任一项的阻碍剂或权利要求5-8中任一项的神经细胞死亡抑制剂给予由早老素-2mRNA外显子5缺损剪接变异体的产生引起的疾病的个体。