JP2000506375A - アルツハイマー病に関連する核酸およびタンパク質、ならびにその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、プレセニリンと相互作用するいくつかのヒト遺伝子の同定、単離、配列決定、および特徴付けを記載する。これらの遺伝子の変異は、家族性アルツハイマー病を導き得る。これらのプレセニリン相互作用タンパク質遺伝子は、変異体プレセニリンによって影響された場合、アルツハイマー病の発症を導く経路に関与し得る。さらに、プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子における変異は、プレセニリンに欠陥がない場合でさえ、アルツハイマー病の原因となり得る。プレセニリン相互作用タンパク質を含むかまたはそれに由来する核酸およびタンパク質は、アルツハイマー病のスクリーニングおよび診断、アルツハイマー病の処置のための治療薬の同定および開発、ならびにアルツハイマー病のモデルとして有用な細胞株およびトランスジェニック動物の産生に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 アルツハイマー病に関連する核酸およびタンパク質、ならびにその使用 発明の分野 本発明は、一般的にアルツハイマー病に関連する神経学的および生理学的機能 障害の分野に関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病に関連する遺 伝子の同定、単離、およびクローニング、ならびにそれらの対応する転写物およ びタンパク質産物に関する。本発明はまた、これらの遺伝子の正常および変異体 の対立遺伝子のキャリアを検出および診断する方法、アルツハイマー病を検出お よび診断する方法、本発明の遺伝子およびタンパク質と関連または相互作用する 他の遺伝子およびタンパク質を同定する方法、アルツハイマー病の可能性のある 治療薬をスクリーニングする方法、アルツハイマー病の処置法、ならびにアルツ ハイマー病に有用でありそうな治療法のスクリーニングおよび評価に有用な細胞 株および動物モデル、に関する。 発明の背景 アルツハイマー病(AD)はヒト中枢神経系の変性障害であり、中年から老年期に おける進行性の記憶障害ならびに認識力および知能の低下によって特徴付けられ る(Katzman、1986)。この疾患は一群の神経病理学的な特徴を伴い、その中で主 要なものは、細胞外アミロイドまたは老人斑の存在、およびニューロンにおける 神経原線維変化である。この疾患の病因は複雑であるが、いくつかの家族では、 この疾患は、常染色体の優性形質として遺伝するようである。連鎖研究は、ADの 発症に関連する３つの遺伝子を同定した：β-アミロイド前駆体タンパク質(APP) (Chartier-Harlinら、1991；Goateら、1991；Murrellら、1991；Karlinskyら、1 992；Mullanら、1992)、プレセニリン-1(PS-1)(Sherrington，1995)、およびプ レセニリン-2(PS-2)(Rogaev，1995,およびLevy-Lahad，1995)。 プレセニリンは、マルチスパニング(multi-spanning)膜タンパク質であり、実 質的な詳細は、PCT公開第WO96/34099号に記載されており、この開示全体は本明 細書中で参考として援用する。プレセニリンの機能は知られていないが、早期発 症、攻撃的、家族性アルツハイマー病(FAD)の発症と強く関連する多数の常染色 体優性プレセニリン変異が、同定されている。 本開示は、プレセニリンと相互作用するいくつかのヒト遺伝子(ここでの変異 がFADを導き得る)の、同定、単離、配列決定、および特徴付けを記載する。これ らのプレセニリン相互作用タンパク質遺伝子は、変異体プレセニリンによって影 響を受ける場合、アルツハイマー病の発症を導く経路に関与し得る。さらに、プ レセニリン相互作用タンパク質遺伝子における変異は、プレセニリンに欠陥がな い場合でさえ、アルツハイマー病の原因となり得る。 発明の要旨 本発明は、本明細書中で「プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子」または「PS 相互作用タンパク質遺伝子」と称される、いくつかのヒト遺伝子の同定、単離、 配列決定、および特徴付けに、部分的に基づいている。これらの遺伝子の産物は 、インビボで、ヒトプレセニリン-1タンパク質と相互作用すると考えられており 、それゆえ、アルツハイマー病において影響を受ける生化学的経路と関係する。 従って、これらの遺伝子の各々は、アルツハイマー病の処置のための新しい治療 的標的を示す。さらに、PS相互作用タンパク質核酸、PS相互作用タンパク質およ びペプチド、PS相互作用タンパク質に対する抗体、PS相互作用タンパク質核酸で 形質転換された細胞、およびPS相互作用タンパク質核酸で変更されたトランスジ ェニック動物の全てが、本明細書中に記載のように、アルツハイマー病および関 連する疾患の診断、治療、および継続的研究のための種々の有用性を有する。 従って、本発明の目的の１つは、PS相互作用タンパク質のPS相互作用ドメイン を少なくともコードする単離された核酸を提供することである。これらのPS相互 作用タンパク質としては、26Sプロテアソームの哺乳動物S5aサブユニット、GT24 タンパク質、p0071タンパク質、Rab11タンパク質、レチノイドＸレセプター-β 、細胞質シャペロニン、ならびにクローンY2H35、Y2H171、およびY2H41として本 明細書中で同定されるいくつかの配列が挙げられる。好ましいヌクレオチドおよ びアミノ酸配列が、本明細書中に提供される。本発明の別の目的は、これらのPS 相 互作用タンパク質遺伝子のためのプローブおよびプライマーを提供すること、な らびにこれらの遺伝子の小さな抗原決定基をコードする核酸を提供することであ る。従って、好ましい実施態様は、開示された配列から選択される少なくとも10 、15、または20の連続したヌクレオチドの配列を含む。 本明細書中に開示され、そして実施可能にされた核酸配列および抗体を用いて 、ヒトPS相互作用タンパク質および遺伝子の対立遺伝子改変体または異種特異的 ホモログを同定する方法が提供される。この方法は、核酸ハイブリダイゼーショ ンもしくは増幅技術、免疫化学技術、または当該分野において公知の任意の他の 技術を用いて実施され得る。対立遺伝子改変体は、アルツハイマー病の原因とな り得るPS相互作用タンパク質遺伝子の他の正常ヒト対立遺伝子ならびに変異体対 立遺伝子を含み得る。異種特異的ホモログは、他の哺乳動物種(例えば、マウス 、ラット、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類)由来であり得るか、または無脊椎 動物種(例えば、DrosophilaまたはC.elegans)由来であり得る。従って、本発明 の別の目的は、開示された配列の対立遺伝子改変体または異種特異的改変体をコ ードする核酸、ならびにそれらによってコードされる対立遺伝子タンパク質また は異種特異的タンパク質を提供することである。 本発明の別の目的は、上記の核酸のいずれかを含むベクター(特に、発現ベク ター)を提供することである。本発明のさらなる目的は、PS相互作用タンパク質 核酸配列が、外因性調節領域に作動可能に連結し、変更されたパターンの発現を 生じるか、または外因性コード領域に作動可能に連結し、融合タンパク質を生じ るベクターを提供することである。逆に、別の目的は、PS相互作用タンパク質調 節領域が、標準マーカー遺伝子を含む外因性コード領域に作動可能に連結し、PS 相互作用タンパク質遺伝子の調節が、治療薬のためのアッセイにおいて研究され そして使用され得る構築物を産生する核酸を提供することである。 本発明の別の目的は、本発明の上記核酸のいずれかで形質転換されている宿主 細胞およびトランスジェニック動物を提供することである。宿主細胞は、原核生 物細胞または真核生物細胞であり得、特に、トランスジェニック動物モデルの産 生に有用な、配偶子、接合体、胎児細胞、または幹細胞であり得る。 特に好ましい実施態様において、本発明は、アルツハイマー病のための非ヒト 動物モデルを提供する。ここで、この動物またはその祖先のゲノムは、以下の改 変のうち１つを導入された少なくとも１つの組換え構築物によって改変されてい る：(１)異種特異的正常ＰＳ相互作用タンパク質の少なくとも機能的ドメインを コードするヌクレオチド配列の挿入、(２)異種特異的変異体PS相互作用タンパク 質の少なくとも機能的ドメインをコードするヌクレオチド配列の挿入、(３)異種 特異的変異体PS相互作用タンパク質の同種ホモログの少なくとも機能的ドメイン をコードするヌクレオチド配列の挿入、および(４)内因性PS相互作用タンパク質 遺伝子の不活化。好ましいトランスジェニック動物モデルは、ラット、マウス、 ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非 ヒト霊長類であるが、無脊椎動物もまた、特定の有用性のために意図される。 本発明の別の目的は、本発明の核酸を用いてPS相互作用タンパク質の機能ドメ インを少なくとも産生するための方法を提供することである。さらに、本発明は また、免疫原として用いられる短いペプチド配列を含む、このようなタンパク質 の実質的に純粋な調製物を提供する。従って、本発明は、開示された配列および そうでなければ使用可能な配列からの少なくとも10または15の連続するアミノ酸 残基を含むペプチドを提供する。本発明はさらに、PS相互作用タンパク質のPS相 互作用ドメインを少なくとも含むペプチドの実質的に純粋な調製物、ならびにこ のタンパク質全体の実質的に純粋な調製物を提供する。 本明細書中で使用可能な実質的に純粋なペプチドおよびタンパク質を用いて、 本発明はまた、PS相互作用タンパク質に選択的に結合する抗体を産生する方法、 ならびにこれらの抗体を産生する細胞株を提供する。 本発明の別の目的は、アルツハイマー病および関連する疾患の処置に有用性を 有し得る化合物を同定する方法を提供することである。これらの方法は、PS相互 作用タンパク質遺伝子の発現を調整し得る化合物を同定する方法、PS相互作用タ ンパク質に選択的に結合し得る化合物を同定する方法、およびPS相互作用タンパ ク質の活性を調整し得る化合物を同定する方法を包含する。これらの方法は、イ ンビトロまたはインビボで行われ得、そして本発明の形質転換された細胞株およ びトランスジェニック動物モデルを使用し得る。本方法はまた、本発明の方法に よって同定された化合物を、ヒト被験体においてさらに試験する、臨床試験の一 部であり得る。 本発明の別の目的は、被験体が、変異体PS相互作用タンパク質遺伝子を有する かどうか決定することによって、遺伝形態のアルツハイマー病について診断また はスクリーニングする方法を提供することである。変異体PS相互作用遺伝子は、 直接ヌクレオチド配列決定、プローブ特異的ハイブリダイゼーション、制限酵素 消化およびマッピング、PCRマッピング、リガーゼ媒介PCR検出、RNase保護、電 気泳動移動度シフト検出、または化学的ミスマッチ切断を含むアッセイによって 検出され得る。あるいは、変異体形態のPS相互作用タンパク質は、イムノアッセ イ、プロテアーゼアッセイ、または電気泳動移動度アッセイを含むアッセイによ って検出され得る。 本発明の目的はまた、本明細書中に開示されそして使用可能にされたPS相互作 用タンパク質が関与する生化学的経路における異常より生じる、アルツハイマー 病および関連する疾患の処置に用い得る薬学的調製物を提供することである。従 って、本発明はまた、実質的に純粋なPS相互作用タンパク質、PS相互作用タンパ ク質を作動可能にコードする発現ベクター、PS相互作用タンパク質アンチセンス 配列を作動可能にコードする発現ベクター、変異体PS相互作用タンパク質に選択 的に結合する抗体、または変異体PS相互作用タンパク質の抗原決定基を含む薬学 的調製物を提供する。これらの薬学的調製物は、アルツハイマー病または関連す る疾患の原因となる変異体PS相互作用タンパク質遺伝子を有する患者を処置する ために用いられ得る。 本発明のこれらおよび他の目的は、以下の明細書および添付の請求の範囲によ りさらに十分に記載される。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 本発明の種々の実施態様の概説、ならびに本発明の作製および使用するにおい て使用される種々の要素および構成成分の理解を容易にするために、記載および 添付の請求の範囲において使用される特定の用語について以下の定義が提供され る： プレセニリン。本明細書中でさらなる修飾なしに用いられる場合、用語「プレ セニリン」は、プレセニリン−1(PS1)および/またはプレセニリン-2(PS2)遺伝子/ タンパク質を意味する。特に、修飾されない用語「プレセニリン」は、哺乳動物PS 1および/またはPS2遺伝子/タンパク質、そして好ましくは、PCT公開第WO96/3409 9に記載および開示されるようなヒトPS1および/またはPS2遺伝子/タンパク質を 意味する。 正常。本明細書中で遺伝子に関して用いられる場合、用語「正常」は、正常タン パク質をコードする遺伝子をいう。本明細書中でタンパク質に関して用いられる 場合、用語「正常」は、その通常のまたは正常な生理学的役割を演じ、そして病原 性症状または状態に関連しないかまたはその原因となることのないタンパク質を 意味する。それゆえ、本明細書中で用いられる場合、用語「正常」は、本質的に、 句「野生型」の通常の意味と同義である。任意の所定の遺伝子または対応するタン パク質について、多数の正常対立遺伝子改変体が存在し得、そのいずれもが病原 性症状または状態の発達に関連しない。このような正常対立遺伝子改変体は、１ つ以上のヌクレオチド置換が、コードされるアミノ酸配列の変化をもたらさない 改変体を包含するが、それらに限定されない。 変異体。本明細書中で遺伝子に関して用いられる場合、用語「変異体」は、変異 体タンパク質をコードする遺伝子をいう。本明細書中でタンパク質に関して用い られる場合、用語「変異体」は、その通常のまたは正常な生理学的役割を演じず、 そして病原性症状または状態に関連するか、またはその原因となるタンパク質を 意味する。それゆえ、本明細書中で用いられる場合、用語「変異体」は、用語「機 能不全」、「病原性」、「疾患原因」および「有害」と、本質的に同義である。本発明 のプレセニリンおよびプレセニリン相互作用タンパク質遺伝子およびタンパク質 に関して、用語「変異体」は、１つ以上のヌクレオチド/アミノ酸置換、挿入およ び/または欠失を有する遺伝子／タンパク質をいう。ここで、それらは、代表的 には、ヒトにおいて発現された場合に、アルツハイマほ病および／またはその他 の関連する遺伝性表現型(例えば、脳出血、精神遅滞、精神分裂病、精神病、お よび鬱病)の徴候の発達を導く。この定義は、生来存在する種々の変異を包含す ると理解され、それらには本明細書中で開示される変異、ならびにヒトの介入に よ り産生される合成または組換え変異が包含されるが、それらに限定されない。こ れらの遺伝子に適用される場合、用語「変異体」は、遺伝子コードの縮重に起因し て、本明細書中で開示されるかまたはそうでなければ実施可能にされる正常配列 と同一のタンパク質をコードする配列改変体を包含することは意図されない；ま た、異なるタンパク質をコードするが、正常タンパク質と機能的に等価であるタ ンパク質をコードする配列改変体を包含することも意図されない。 実質的に純粋。タンパク質(抗体を含む)または他の調製物に関して本明細書中 で用いられる場合、用語「実質的に純粋」は、調製物が、その意図される使用のた めに実用的および適切である程度に、他の物質を本質的に含まないことを意味す る。特に、タンパク質調製物は、それが例えば、抗体の生成、配列決定、または 薬学的調製物の生産において有用であるように、他の生物学的構成成分を十分に 含まない場合、実質的に純粋である。当該分野において周知の技術により、実質 的に純粋なタンパク質またはペプチドは、本明細書中に開示される核酸およびア ミノ酸配列に照らして産生され得る。特に、本明細書中に開示される核酸および アミノ酸配列に照らして、当業者は、HPLCまたはイムノアフィニティークロマト グラフィーまたは電気泳動的分離を含む周知の方法の適用または連続的適用によ り、任意の一般的に実施可能な純度のタンパク質またはペプチドを得ることがで きる。好ましくは、必ずしも必要ではないが、「実質的に純粋」な調製物は、少な くとも60重量％(乾燥重量)の目的の化合物を含む。より好ましくは、調製物は、 少なくとも75重量％または90重量％、そして最も好ましくは、少なくとも99重量 ％が目的の化合物である。純度は、任意の適切な方法(例えば、カラムクロマト グラフィー、ゲル電気泳動、またはHPLC分析)によって、測定され得る。タンパ ク質(抗体を含む)に関して、調製物が２つ以上の異なる目的の化合物(例えば、 本発明の２つ以上の異なる抗体、免疫原、機能的ドメイン、または他のポリペプ チド)を含む場合、「実質的に純粋」な調製物は、好ましくは、全ての目的の化合 物の総重量(乾燥重量)が、総乾燥重量の少なくとも60％である調製物である。同 様に、２つ以上の目的の化合物を含むそのような調製物については、目的の化合 物の総重量が、調製物の総乾燥質量の少なくとも75％、より好ましくは少なくと も90％、そして最も好ましくは少なくとも99％であることが好ましい。最後に、 目的のタンパク質が１つ以上の他のタンパク質(例えば、血清アルブミン)または 化合物(例えば、希釈剤、賦形剤、塩、多糖、糖、脂質)と、投与、安定性、貯蔵 などの目的のために混合される場合、そのような他のタンパク質または化合物は 、調製物の純度の計算において無視され得る。 単離された核酸。本明細書中で用いられる場合、「単離された核酸」は、それが 由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて直ぐに連続する(一方が5'末端にあ りそして一方が3'末端にある)配列から単離または分離されたポリヌクレオチド 配列を含む、リボ核酸、デオキシリボ核酸、または核酸アナログである。それゆ え、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイ ルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換え核酸 ；あるいは、他の配列とは独立した、分離した分子(例えば、PCRまたは制限エン ドヌクレアーゼ処理によって産生されたcDNAまたはゲノムDNAフラグメント)とし て存在する組換え核酸を包含する。この用語はまた、さらなるポリペプチド配列 をコードする、および/または外因性の調節エレメントを含むハイブリッド遺伝 子の一部である組換えDNAも包含する。 実質的に同一な配列。本明細書中で用いられる場合、「実質的に同一」なアミノ 酸配列は、保存的アミノ酸置換、例えば、１つのアミノ酸の別の同じクラスのア ミノ酸での置換(例えば、バリンの代わりにグリシン、アルギニンの代わりにリ ジンなど)でのみ異なるか、またはタンパク質の機能(例えば、本明細書中に記載 のようにアッセイされる)を破壊しないアミノ酸配列の位置に配置される、１つ 以上の非保存的置換、欠失、または挿入でのみ異なるアミノ酸配列である。好ま しくは、そのような配列は、少なくとも85％、より好ましくは90％、そして最も 好ましくは95％、アミノ酸レベルで、それが比較されるタンパク質またはペプチ ドの配列と同一である。核酸については、比較配列の長さは、一般的に、少なく とも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少 なくとも75ヌクレオチド、そして最も好ましくは110ヌクレオチドである。「実質 的に同一」な核酸配列は、上記で定義されるようなアミノ酸配列に実質的に同一 なアミノ酸配列をコードする。 形質転換された細胞。本明細書中で用いられる場合、「形質転換された細胞」 は、その中へ(または、その祖先の中へ)、組換えDNA技術を用いて、目的の核酸 分子が導入された細胞である。目的の核酸は、代表的には、ペプチドまたはタン パク質をコードする。形質転換された細胞は、目的の配列を発現し得るか、また はその配列を増殖させるためのみに使用され得る。用語「形質転換された」は、本 明細書中で、外因性の核酸を導入する任意の方法(形質転換、トランスフェクシ ョン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒 介性トランスフェクションなどを包含するが、これらに限定されない)を包含す るように用いられ得る。 作動可能に連結された。本明細書中で用いられる場合、コード配列および調節 領域は、それらが調節領域の影響下または制御下で、コード配列の発現または転 写をもたらすように共有結合される場合、それらは「作動可能に連結された」とい われる。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つ のDNA配列は、プロモーターの機能の誘導がコード配列の転写をもたらす場合、 および２つのDNA配列間の結合の性質が、(１)フレームシフト変異の導入をもた らさない、(２)コード配列の転写を指向させる調節領域の能力を干渉しない、ま たは(３)タンパク質に翻訳される対応するRNA転写物の能力を干渉しない場合、 作動可能に連結されたといわれる。従って、調節領域は、調節領域が、DNA配列 の転写をもたらし得、その結果生じた転写物が所望のタンパク質またはポリペプ チドに翻訳され得る場合、コード配列に作動可能に連結される。 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件。ストリンジェントなハイブ リダイゼーション条件は、当業者によって理解される当該分野の用語である。任 意の所定の核酸配列について、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件 は、核酸配列のその相補的な配列へのハイブリダイゼーションを可能にし、そし て実質的に異なる配列へのハイブリダイゼーションを可能にしない、温度、カオ トロピック(chaotrophic)酸、緩衝液、およびイオン強度の条件である。「ストリ ンジェント」な条件を構成する正確な条件は、核酸配列の性質、配列の長さ、お よびその配列のサブセットの他の非同一配列内の出現頻度に依存する。ハイブリ ダイゼーション条件を、非特異的ハイブリダイゼーションが生じるストリンジェ ンシーのレベルから、特異的ハイブリダイゼーションのみが観察されるレベル まで変動させることによって、当業者は、過度の実験なしに、所定の配列が相補 的な配列とのみハイブリダイズすることを可能にする条件を決定し得る。このよ うなストリンジェンシー条件の適切な範囲は、KrauseおよびAaronson(1991)に記 載されている。ハイブリダイゼーション条件は、配列の長さおよび一般性に依存 して、20℃〜65℃の温度および５×〜0.1×SSCのイオン強度を包含し得る。高度 にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、40℃〜42℃程度の低い温 度(ホルムアミドのような変性剤が含まれる場合)、または0.1×SSC程度の低いイ オン強度における60℃〜65℃までの温度を包含し得る。しかし、これらの範囲は 、例示的のみであって、標的配列の性質、および可能な将来の技術的開発に依存 して、必要以上にストリンジェントであり得る。ストリンジェント未満の条件が 、任意の所定の配列と実質的に類似する、対立遺伝子的のまたは相同な核酸配列 を単離するために用いられる。 選択的に結合する。抗体に関して本明細書中で用いられる場合、抗体が目的の 標的を認識および結合するが、目的の標的を含むサンプル(例えば、生物学的サ ンプル)中の他の分子を実質的に認識および結合しない場合、抗体は標的に「選択 的に結合する」といわれる。すなわち、抗体は、標的を含む生物学的サンプル中 に合理的に存在する本質的に全ての分子から標的を区別するに十分な特異性でそ の標的に結合しなければならない。 II．プレセニリンおよびプレセニリン相互作用タンパク質 本発明は、部分的に、変異される場合、アルツハイマー病の発達に関連する、 哺乳動物遺伝子のファミリーの発見に基づいている。プレセニリン-1(PS1)およ びプレセニリン-2(PS-2)と称するこれらの遺伝子の発見、ならびにこれらの遺伝 子、そのタンパク質産物、変異体、無脊椎動物ホモログ、および可能な機能的役 割の特徴付けは、PCT公開第WO96/34099号に記載されている。本発明はさらに、 部分的に、プレセニリンと生理学的条件下で相互作用し、そして、それゆえ、ア ルツハイマー病において変化されている生化学的経路に関与すると考えられてい る一群のタンパク質の発見に基づいている。これらのタンパク質は、本明細書中 で、プレセニリン相互作用(PS相互作用)タンパク質といわれる。プレセニリン中 の変異はアルツハイマー病の原因であることが知られているので、本明細書中に 開示および記載されるPS相互作用遺伝子およびタンパク質の各々は、アルツハイ マー病における治療的介入のための新規な標的を提示する。すなわち、これらの タンパク質の、プレセニリンとの相互作用の調節、またはこれらのPS相互作用タ ンパク質の少なくともPS相互作用ドメインと、プレセニリンの少なくとも相互作 用ドメインとの相互作用の調節は、プレセニリンの活性および/もしくは利用可 能性を調節するか、またはPS相互作用の活性および/もしくは利用可能性を調節 する手段を提供する。さらに、変異体プレセニリンの、１つ以上のこれらのPS相 互作用タンパク質との相互作用における異常がアルツハイマー病の原因であるの で、１つ以上のこれらのPS相互作用タンパク質における変異はまた、アルツハイ マー病の原因でありそうである。それゆえ、本明細書中に開示および記載される PS相互作用遺伝子およびタンパク質の各々は、プレセニリンにおける変異に依存 しない病因を有する家族性および/または散発性アルツハイマー病の形態の診断 のための新規な標的を提示する。最後に、以下でより十分に記載されるように、 本明細書中に記載および開示されるPS相互作用遺伝子およびタンパク質は、プレ セニリンおよびPS相互作用タンパク質の相互作用に影響する化合物についての新 しいアッセイ、またはアルツハイマー病の病因に関与する生化学的経路の他のメ ンバーについてのアッセイ、ならびにそのようなアッセイにおける使用のための 新たな細胞株およびトランスジェニック動物モデルを提供する。 １．プレセニリンプロセシング PCT公開第WO96/34099号において記載されるおよび/または実施可能にされる抗体 およびタンパク質結合アッセイを用いて、正常および変異体の両方のプレセニリ ンのプロセシングおよびタンパク質-タンパク質相互作用を研究した。プレセニ リン中の変異はその細胞内プロセシング（例えば、エンドタンパク質分解的切断 (endoproteolytic cleavage)、ユビキチン化、およびクリアランス)ならびにヒ ト脳において発現される他のタンパク質とのその細胞内相互作用の両方における 変化に導くようであることが見出された。下記のように、プレセニリンのプロセ シングおよび相互作用、そして特に変異体プレセニリンのプロセシングおよび相 互作用における変化の知見は、アルツハイマ-病および関連障害のための新たな 診断および治療標的を提供する。 ウエスタンブロット分析は、正常プレセニリンがタンパク質分解的切断を受け て、特徴的なＮおよびＣ末端フラグメントを生じることを示唆する。上記のよう に、正常プレセニリンタンパク質は、mRNAスプライス改変、電気泳動条件などに 部分的に依存して、47〜51kDaの予想される分子量を有する。しかし、ウエスタ ンブロットの分析は、正常プレセニリンタンパク質がタンパク質分解的切断を受 けて、約35kDaのＮ末端フラグメントおよび約18kDaのＣ末端フラグメントを生じ ることを示唆する。特に、PS1特異的Ｎ末端残基１〜25を認識する抗体(「14.2」) を使用する、野生型天然ヒト線維芽細胞、コントロール被験体由来のヒト新皮質 脳組織、ならびに非トランスジェニックおよびPS1トランスジェニックマウス由 来の新皮質脳組織由来の溶解物を有するウエスタンブロットは、約35kDaの強い 免疫反応性バンド、および、より長い露光の後、約45kDaのより弱いバンド(これ はおそらく完全長PS1タンパク質を表す)の存在を明らかにする。PS1のTM6→7ル ープの先端における残基304〜318に指向される抗体(「520」)、およびPS1のＣ末端 における残基457〜467に指向される抗体(「4627」)の両方は、約18kDaの同一の強 いバンドを認識する。抗体520はまた、14.2により検出されるPS1バンドと一致す る45kDaの弱いバンドを認識する。PS1トランスフェクトヒト胚腎臓細胞(HEK293) 由来の主要なＣ末端フラグメントの配列決定は、主なエンドタンパク質分解的切 断がTM6→7ループの近位部分におけるM298の付近で、おそらくプロテアソーム以 外の酵素により生じることを示した。これらの観察は、エンドタンパク質分解的 切断事象が、PS1のエキソン９と10との連結部の付近で生じることを示唆する。 これらの細胞における完全長PS1は、プロテアソームによって迅速に(t_1/2＜60分 )変換される。 プレセニリンタンパク質における変異がそのタンパク質分解的切断の変化を生 じるかどうかを決定するために、正常被験体およびPS1変異を有する被験体由来 の線維芽細胞および新皮質脳ホモジネートの溶解物を含有するウエスタンブロッ トを、PS1特異的抗体Ab 14.2を用いて研究した。線維芽細胞においては、PS1変 異のヘテロ接合型キャリア由来の溶解物を正常ホモ接合型と比較した場合、タン パク質バンドの相対的強度における明らかな差異は存在しなかった。対照的に、 PS1変異キャリアと正常との間で、PS1 A246EまたはC410Y変異(これらはそれぞれ 、TM6およびTM7に位置する)のいずれかの、ADに冒されたヘテロ接合型キャリア 由来の経時的新皮質のホモジネートにおいて、差異が存在するようであった。ヘ テロ接合体において、約45kDaの強い免疫反応性のバンドが検出され、これは最 初は完全長PS1タンパク質に対応するように見えた。しかし、さらなる分析は、 このバンドがオルタナティブプロセシングされたプレセニリン産物を表すことを 明らかにした。この変異体プロセシングPS1に対応する同様のバンドは、いくつ かの晩発性(late-onset)AD患者由来新皮質ホモジネートにおいて観察された。こ れらのデータは、(１)早発性(early-onset)ADに関連するいくつかの病原性PS1変 異は、プレセニリンがエンドタンパク質分解的およびプロテアソーム経路を介し てプロセスされる様式を変化させること、ならびに(２)プレセニリンタンパク質 、および脳におけるプレセニリンのプロセシングの変化はまた、晩発性および散 発性ADに関連付けられることを示唆する。 ２．プレセニリン相互作用タンパク質 インビボにおいてプレセニリンに結合し得る、またはそうでなければプレセニ リンと相互作用し得るタンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッドシス テムを、下記(実施例１)のように使用した。特に、TM6→7ループドメインにおけ る変異はADの原因であることが知られているので、酵母ツーハイブリッドシステ ムを、正常および変異体プレセニリンTM6→7ループドメインと相互作用し得る細 胞性タンパク質を同定するために使用した。酵母ツーハイブリッド研究をまた、 Ｃ末端18kDaエンドタンパク質分解的切断フラグメントに対応するcDNA、およびT MI→2管腔内ループドメイン(これもまた、FAD関連Y115Hミスセンス変異の部位で ある)に対応するcDNAを用いて行った。簡潔に記載すると、TM6→7ループ(すなわ ち、PS1の残基266〜409)をコードするcDNA配列を、pAS2-1酵母発現プラスミドベ クター(Clontech)中のGAL4 DNA結合ドメインにインフレームで連結した。次いで 、このプラスミドを、S．cerevisiae Y190株中に、GAL4活性化ドメインを有する pACT2酵母発現ベクター(Clontech)中に連結されたヒト脳cDNAのライブラリー とともに同時形質転換した。適切な選択および再スクリーニングの後、正常プレ セニリンTM6→7ドメインと相互作用したペプチドをコードするヒト脳cDNAを有す る多数のクローンを回収し、そして配列決定した。これらのプレセニリン相互作 用がTM6→7ループ内のAD関連変異により修飾されるかどうかを決定するために、 酵母ツーハイブリッドシステムを、L286V、L392V、およびエキソン10スプライシ ング変異体を含むTM6→7ループペプチドを用いて、再度使用した。これらの変異 体構築物を、脳cDNA：GAL4活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするた めの「餌(bait)」として使用した場合、全てではないがいくつかの、正常プレセニ リンと相互作用する脳cDNA配列が回収された。さらに、変異体プレセニリンとは 相互作用するが、正常プレセニリンとは相互作用しないいくつかの新たなクロー ンが同定された。最高のプレセニリン親和性を有するPS相互作用タンパク質に対 応するクローンは、実施例および以下に記載される。 PS相互作用タンパク質、特に正常または変異体プレセニリンのいずれかと選択 的に相互作用するPS相互作用タンパク質は、有用な医薬品の同定のための新たな 標的、危険にある個体の同定における診断ツールのための新たな標的、形質転換 された細胞株およびトランスジェニック動物モデルの作製のための新たな配列、 ならびにアルツハイマー病における治療的介入のための新たな基礎を提供する。 特に、ADの発症は、変異体プレセニリンタンパク質と、本明細書中に記載の方法 を使用して同定されるようなPS相互作用タンパク質との間の異常な相互作用に関 連し得る。これらの変化は、正常PS1について存在する相互作用を増加もしくは 減少させ得、または新規な変異特異的PS相互作用タンパク質との相互作用を引き 起こし得る。しかし、さらに、異常な相互作用は、変異体形態のPS相互作用タン パク質への正常プレセニリン結合から生じ得、それゆえ、PS相互作用タンパク質 における変異はまた、ADの原因であり得る。 Ａ．26SプロテアソームのS5aサブユニット ２つの重複するクローンが、あるいは抗分泌因子(antisecretory factor)(「AS F」)または26Sプロテアソームの多ユビキチン鎖結合S5aサブユニット(multiubiqu itin chain-binding S5a subunit)(「S5a」)として知られるヒトタンパク質の一部 を表すとして同定された。これらのクローン(これらは、一緒に、S5aの残基70〜 377を含む)は、正常プレセニリンTM6→7ループドメインとは相互作用するが、試 験した２つのTM6→7ループドメイン変異体(L286V、L392V)とは弱く相互作用する ことが示された。PS1：S5a相互作用は共免疫沈降研究により確認され、そして免 疫細胞化学学的研究は、S5aおよびPS1が、ADにより代表的に冒されている脳細胞 における連続的細胞内区画において発現されていることを示した。 PS1とプロテアソームとの間の相互作用は、いくつかの可能な機構を介して、 アルツハイマー病(AD)の病原に関連し得る。第１に、大部分の哺乳動物は、非常 に低レベルのPS1ホロタンパク質(holoprotein)を維持するようである。これの留 意すべき例外は、PSIΔ290-319スプライシング変異(これは、エンドタンパク質 分解的に切断されない、そしてそれゆえ容易に検出可能な、変異体ホロタンパク 質を生じる)を発現する細胞である。Δ290-319スプライシング変異の場合少なく とも、変異体PS1ホロタンパク質の存在、または35kDaＮ末端フラグメントもしく は18kDaＣ末端フラグメントの非存在または減少は、ADを引き起こすに十分であ るようである。それゆえ、変異体PS1ホロタンパク質の代謝回転における非常に 微細な変化でさえ、顕著な病態生理学的影響を有し得ることが可能である。従っ て、哺乳動物CNSにおけるPS1：S5a相互作用を混乱させるプレセニリンまたはS5a のいずれかにおける変異は、プレセニリンホロタンパク質を異常にプロセスさせ 得、そしてADを引き起こし得る。それゆえ、プレセニリンタンパク質分解経路の 調節は、変異体ホロタンパク質の除去を増強するために治療的に適用され得る。 PS1と26SプロテアソームのS5aサブユニットとの間の潜在的なインビボでの関 係を評価するために、PS1代謝に対するプロテアソームインヒビターの効果が研 究された。新生児ラット海馬の短期間器官型培養物および結腸(CaCo2)細胞の癌 腫(これらは、高レベルのPS1およびPS2の両方を発現する)は、特異的な可逆的プ ロテアソームインヒビターであるN-アセチル-ロイシニル-ロイシニル-ノルロイ シニル-H(LLnL)(Rockら、1994)、または特異的な不可逆的プロテアソームインヒ ビターであるラクタシスチン(lactacystin)(Fenteanyら、1995)のいずれかを投 与された。両方の薬剤は、PS1ホロタンパク質の定常状態レベルの増大を引き起 こした。両方の薬剤はまた、海馬の切片でのパルスチェイス実験において、PS1 ホロタンパク質の半減期を約15分から約35分へ延長した。上記のように、PS1ホ ロタンパク質は、正常細胞において急速に動き出す(turnover)ようである。しか し、代謝ラベリングの４時間後でさえ、プロテアソームインヒビターは35kDaN- 末端PS1フラグメントのレベルに影響せず、新規な種の出現も生じない。これら の研究は、PS1ホロタンパク質の大多数が、いくつかの他の完全な膜タンパク質( 例えば、Sec61およびCFTR)と類似の様式で、急速なプロテアソーム依存性経路を 介して直接的に異化されることを意味する。他方では、約35kDaおよび約18kDaの 末端フラグメントがプロテアソームインヒビターの存在下でなお産生されるので 、このPS1のエンドタンパク分解的切断はおそらく、プロテアソーム経路により 媒介されない。それゆえ、少なくとも２つのタンパク分解性経路がPS1ホロタン パク質に作用するようである。 別の可能性は、変異体PS1:S5a相互作用が、S5aの機能または細胞性調節を改変 し得ることである。この可能性に取り組むために、S5aレベルが、非AD神経学的 コントロール(n=8)、散発性のAD(n=8)、およびPS1関連性FAD(n=4)からの死後の 側頭新皮質に由来する溶解物のウエスタンブロッティングにより試験された。非 AD脳の大多数において、ポリクローナル抗S5a抗体が約50kDaの分子量を有するS5 a種を検出した。これは、組換えHis₆-S5aまたはmyc-S5aトランスフェクト細胞の 抽出物を用いた抗体の前吸収により阻害され得た。これらのコントロールケース のサブセットにおいて、さらなるS5a反応バンドが約34kDaで観察された。対照的 に、散発性の遅発性ADを伴う全ての患者由来の組織において、優勢なS5a反応種 が約40kDaで観察され、これはコントロール組織において見られなかった。起源 、およびこの変化した電気泳動移動度の機能的重要性は不明であるが、ADがプレ セニリンに関連性であるかまたは散発性であるかに関わらず、S5aプロセシング がAD脳において変化することを示す。 従って、プレセニリン-プロテアソーム相互作用は、いくつかの点において重 要であるようである。第一に、正常プレセニリンTM6→7ループドメインがS5aタ ンパク質と相互作用すること、変異プレセニリンTM6→7ループドメインがS5aタ ンパク質と相互作用しない(または、非常に弱く相互作用する)こと、TM6→7ルー プドメインに変異を有するプレセニリンが異なって切断されそして多ユビキチン 化(multiubiquitinated)されるようであること、プロテアソームが種々のタンパ ク質(特に、多ユビキチン化されたタンパク質)の切断およびクリアランスに関与 することが既知であること、プロテアソーム活性の阻害がプレセニリンホロタン パク質の切断を阻害すること、およびS5aプロセシングがAD脳において変化する ことという事実は全て、(1)S5aサブユニットおよび26Sプロテアソームがプレセ ニリンの正常なプロセシングに関与し、そしてこの正常な相互作用を破壊する変 異がTM6→7ループドメイン変異体において観察される異常なプロセシングを担い 得ること；または(2)プレセニリン-プロテアソーム相互作用が、PS1、S5a、また はその両方の活性をプロテアソーム媒介性プレセニリンプロセシングに関与して または関与せずに調節し得ること；または(3)正常な性質の調節が、誤って折り 畳まれたまたは変異体の膜タンパク質(例えば、APP、Notch、またはプリオンタ ンパク質)の小胞体およびゴルジ体を介する輸送のプロテアソーム媒介性分解の 機能、ならびに誤って折り畳まれた、変異体の、またはユビキチン化した細胞質 タンパク質(タウのような構造タンパク質、およびNFkBのような短命のプロテア ソームでプロセスされるシグナル伝達分子を含む)のプロテアソーム媒介性分解 の機能を制御すること、を示唆する。従って、不完全なプロテアソームの機能は 、異常に代謝されるこれらのタンパク質(特に、βAPP、タウ、プリオン)を選択 的に引き起こし得る。後者は、神経毒性のアミロイド形成的プロテアーゼ抵抗性 誘導体(例えば、AβおよびPrPsc)の蓄積、神経細線維タングル(tangle)の蓄積、 および不完全な細胞内シグナル伝達機能を導く。これらの仮説の支持において、 高ユビキチン化(hyperubiquitinated)されリン酸化されたタウおよび他の微小管 関連タンパク質のクリアリングができないことは、アルツハイマー病の顕著な特 徴であることに注目すべきである(KosikおよびGreenberg、1994)。このことは、 TM6→7ループドメイン変異体、プレセニリン-プロテアソーム相互作用、タウ-プ ロテアソーム相互作用、およびAD脳におけるタウタンパク質の神経細線維タング ルの間の潜在的な関連性を示唆する。最後に、プロテアソームは、APPを分解し 得、そしてアルツハイマー病に関連するAβペプチドと結合し得ることが既知で ある。このことは、TM6→7ループドメイン変異体、プレセニリン-プロテアソー ム相互作用、APP-プロテアソーム相互作用、およびAD脳に特徴的なアミロイドプ ラーク の間の潜在的な関連性を示唆する。さらに、プロテアソームインヒビター(例え ば、LLnLおよびラクタシスチン)は、細胞内未成熟N-グリコシル化βAPPの増加お よび非常に多量なAβ₄₂アイソフォームの培地への分泌を伴って、βAPP代謝にお ける重篤な障害を引き起こす(Klafkiら、1996)。 それゆえ、プレセニリンプロセシングおよびプレセニリン-プロテアソーム相 互作用は、ADにおける診断ならびに治療的処置のための明白な標的である。従っ て、以下に記載するように、アッセイが、プレセニリンのプロテアソーム媒介性 切断に影響するか、変異体プレセニリンの別のエンドタンパク分解的切断および ユビキチン化に影響するか、またはそうでなければプレセニリンもしくはプロテ アソームのS5aサブユニットのプロセシングおよび輸送に影響する、薬物のため に今や提供され得る。さらに、プレセニリンの正常なプロセシングを破壊する26 Sプロテアソームにおける変異がアルツハイマー病の原因であるようなので、さ らなる診断的アッセイがプロテアソームのS5aまたは他のサブユニットにおける 変異を検出するために提供される。最後に、プロテアソームの少なくとも機能的 ドメインをコードする正常または変異体の配列の導入により改変されている、さ らなる形質転換された細胞株およびトランスジェニックモデルが今や提供され得 る。生物学的組織および液体におけるS5aの異常な電気泳動的形態の出現が、散 発性形態のADを伴う被験体における病態活性の診断およびモニタリングのための 臨床的試験として使用され得る。 Ｂ．GT24：「アルマジロ」反復を有するタンパク質 GT24と称される別のPS相互作用タンパク質が、PS1_266-409ドメインを酵母のツ ーハイブリッド系およびヒト成人脳cDNAライブラリーにおいて餌(bait)として使 用して得たいくつかの重複(over−lapping)クローンから同定した。引き続いて 、６つの約3.8kbのサイズのより長いGT24クローンが、従来のcDNAライブラリー のスクリーニングにより得られた。現在までに得られた最も長いGT24クローン( 受託番号U81004)内のオープンリーディングフレームは、GT24が、独特のN-末端 、およびそのC-末端にていくつかのアルマジロ(arm)反復タンパク質とかなりの 相同性を有する少なくとも1040のアミノ酸のタンパク質であることを示唆する。 従っ て、例えば、GT24の残基440〜862(受託番号U81004からの番号付け)は、マウスp1 20タンパク質(受託番号Z17804)の残基440〜854と32〜56％の同一性(p=1.2e^-133) を有し、そしてGT24の残基367〜815はD.melanogasterアルマジロセグメントの極 性タンパク質(受託番号P18824)の残基245〜465と26〜42％の同一性(p=0.0017)を 有する。GT24遺伝子は、アノニマスマイクロサテライトマーカーD5S748およびネ コ鳴き症候群遺伝子座の近くの染色体5p15にマップされる。 GT24の独特の5'配列のノーザンブロットへのハイブリダイゼーションは、GT24 遺伝子がヒト脳のいくつかの領域およびいくつかの非神経学的組織(例えば、心 臓)において、約3.9と5.0kbとの間のサイズで変化するある範囲の転写物として 発現されることを明らかにする。さらに、４ヶ月齢マウスの脳における、GT24の 5'末端に由来する289bpの単一コピーフラグメントを使用するインサイチュハイ ブリダイゼーション研究は、GT24の転写が、PS1の転写と非常に類似し、歯状お よび海馬のニューロンにおいて、散在する新皮質のニューロンにおいて、ならび に小脳のプルキンエ細胞において強い発現を伴うことを明らかにする。E13日目 のマウス胚において、GT24は低レベルで広範に発現されるが、原節および神経管 においてはいくらかより高いレベルで発現される。GT24とPS1との間の生理学的 インビボ相互作用は、野生型ヒトPS1 cDNA、GT24の残基484〜1040をコードするc -mycタグ化cDNA(C-末端arm反復を含む)、またはその両方で一過性にトランスフ ェクトされたHEK293細胞における同時免疫沈降研究により支持される。細胞溶解 物は抗PS1抗体で免疫沈降され、次いでイムノブロッティングによりmyc-GT24タ ンパク質の存在について研究される。PS1/myc-GT24の２重にトランスフェクトさ れた細胞において、免疫沈降物は、myc-GT24コントロールと同時に移動する分子 量約60kDaの強力な抗myc反応性バンドを含んだ。myc-GT24のみでトランスフェク トされた細胞において、非常に弱いバンドが長い曝露の後に検出され、これはお そらくmyc-GT24の低レベルの内因性PS1との相互作用を反映する。PS1単独でトラ ンスフェクトされた細胞または免疫前血清(pre-immune serum)で免疫沈降した任 意のトランスフェクト細胞においては、myc反応性バンドは検出されなかった。 まとめると、これらの観察は、観察されたPS1:GT24相互作用が生理学的に関連し ていることを強く示唆する。 PS1のTM6-TM7ループにおける変異がPS1:GT24相互作用に影響し得る否かを調査 するために、本発明者らは、GT24のC-末端残基499〜1040の野生型および変異体P S1_266-409との酵母ツーハイブリッド相互作用を直接的に比較するために定量的 な液体β-ガラクトシダーゼアッセイを用いた。これらの研究は、GT24_499-1040 のL286V変異体PS1ドメインとの相互作用が、対応する野生型PS1ドメインとの相 互作用と有意に異ならないことを明らかにした。対照的に、GT24_499-1040のL392 V変異体PS1構築物との相互作用の顕著な減少が存在する。L286V変異の効果の不 在およびL392V変異での効果の存在は、いくつかの変異がPS1:GT24結合に作用し 得るが、他のものはGT24結合に対するPS1応答を調節し得ることを示唆し得る。 PS1:GT24相互作用は、いくつかの機能を支持し得た。GT24のarm反復モチーフ が、多様な機能を有するいくつかのタンパク質(β-カテニンおよびその無脊椎動 物ホモログ(armadillo)、プラコグロビン、p120、大腸腺腫(APC)遺伝子、酵母の RNAポリメラーゼ１のサプレッサー(SRP1)、およびsmGDSを含む)において検出さ れている。例えば、β-カテニン、p120、およびプラコグロビンは、細胞内接着 において重要な役割を果たす。β-カテニン/armadilloは、細胞運命の特定化の 間のwingless/Wntシグナルの形質導入に関与し、そしてβ-カテニンおよびp120 は、他のレセプター媒介性シグナル形質導入事象(PDGF、EGF、CSF-1、およびNGF のような栄養性因子に対する応答を含む)における役割を果たし得る。 PS1:GT24相互作用が、栄養性因子についての細胞内シグナル伝達経路の一部で あるか、または細胞-細胞接着に関与する場合、相互作用の破壊は、PS関連性FAD 脳における神経変性プロセスおよびPS1またはPS2でトランスフェクトされた細胞 のアポトーシスに対する感受性の増加に関与する(Wolozinら、1996)。これは、 少なくとも１つのarmタンパク質(smGDS)が、細胞内G-タンパク質におけるGDP/GT P変換を剌激すること(Kikuchiら、1992；Borguskiら、1993)、およびβAPPおよ びPS2の両方の変異体形態がヘテロ三量体GTP/GDPタンパク質に関与する機構を介 するプログラム細胞死の経路を活性化すると考えられること(Wolozinら、1996； Okamotoら、1995；Yamatsujiら、1996)に注目のこと。 PS1とGT24との間の相互作用はまた、約E13.5日における欠陥のある尾側胚の原 節生成(somitogenesis)、短い尾、および致命的な脳出血のような(Wongら、199 6)、マウスにおけるホモ接合型PS1ノックアウトに関連したいくつかの発生表現 型に関与し得る。PAX1およびNotchにおけるヌル変異と関連する表現型に対する これらの骨格表現型の類似、およびNotch/lin12上のsel12における変異の見かけ 上の抑制効果が媒介するC．elegansにおけるシグナリングは、PSタンパク質がNo ．tchシグナリング経路において機能することを示唆する。さらに、Wnt-3a遺伝 子のノックアウトについてのホモ接合型マウス(Takadaら、1994)、およびWnt-3a 遺伝子における自然発生変異「痕跡尾」またはvtについてのホモ接合型マウス(Gre coら、1996)は、尾側原節形成および尾芽形成を欠損した骨格表現型を有する。W nt-3aノックアウトは、12.5日目までに、胚致死性である。これらの表現型は、 マウスPS1遺伝子のホモ接合型ノックアウトにおける表現型と類似している(Wong ら、1996)。GT24がPS1に結合し、胚原節において発現し、そしてWingless/Wnt経 路における下流シグナリングにおいて使用される他のタンパク質のアルマジロ反 復モチーフ(armadillo repeat motif)を含むという観察は、PS1がGT24-Wingless /Wnt経路における下流エレメントであることを示唆する。これは、直接GT24-PS1 相互作用に影響するか、またはその相互作用経路の上流または下流成分に影響す る、薬剤についてのバイオアッセイを作製するために利用され得、そして、それ ゆえ、プレセニリン変異の影響をモニターするために使用され得る。例えば、正 常または変異体プレセニリンでトランスフェクトした細胞は、可溶性Wnt-3aタン パク質(または、Wnt−1のような他のWntタンパク質)に曝露され得、そしてWingl ess/Wntシグナリング経路に特異的である変化について、または細胞アッセイ(例 えば、細胞内イオンレベル、Aβプロセッシング、アポトーシス、など)について 本明細書中で記載される任意の他の変化についてアッセイされ得る。 従って、GT24タンパク質はまた、ADにおける診断のならびに治療的介入につい ての新しい標的を示す。例えば、GT24タンパク質における変異はまた、アルツハ イマー病の原因であり得るので、さらなる診断アッセイがこれらの配列の変異を 検出するために提供される。同様に、GT24タンパク質は、少なくとも機能的なド メイン、特に、プレセニリンと相互作用する機能的なドメイン(例えば、70〜377 残基)をコードする正常核酸または変異体核酸の導入により変化されている、さ らなる形質転換された細胞株およびトランスジェニックモデルが、今や提供され 得る。このような形質転換された細胞およびトランスジェニック体は、プレセニ リン-GT24相互作用を調節する化合物についてのアッセイにおける有用性を有す る。 Ｃ．p0071：「アルマジロ」反復を有するタンパク質 野生型PS1_266-409「餌」を用いた最初のスクリーニングで単離された別の独立し たクローンはまた、C末端arm反復を有するペプチドをコードする(クローンY2H25 、受託番号U81005)。Y2H25クローンに対応するより長いcDNA配列が、GenBankに よりヒトタンパク質p0071(受託番号X81889)として寄託されており、そして本明 細書中で配列番号５として複写される。クローンY2H25は、本質的に配列番号５ の核酸位置1682〜1994に対応する。Y2H25/0071 ORFの推定配列とGT24推定配列と の比較は、それらが、47％の完全長アミノ酸配列の同一性を有し、およびGT24の 残基346〜862とp0071の残基509〜1022との間で70％の同一性を有する関連タンパ ク質であることを確認した。このことは、PS1が、タンパク質を含む新規のクラ スのarm反復と相互作用することを示唆する。GT24の独特な5'末端とのノーザン ブロットにおいて得られる幅広い約4.5kbのハイブリダイゼーションシグナルは 、GT24のオルタナティブスプライシング/ポリアデニル化のいずれか、あるいは 、可能性は低いが、p0071よりもGT24に対して高度のN末端相同性を有するこのフ ァミリーのさらなるメンバーの存在を反映し得る。これらの配列で形質転換され た細胞、またはこれらの配列を含むトランスジェニック動物は、ADの動物モデル として、ならびに正常および変異体プレセニリンの作用を調節する化合物のスク リーニングにおける使用のために、さらなる有用性を有する。 Ｄ．Rab 11 本明細書中で配列番号５として開示される１つのクローン(Y2H9)は、正常型PS 1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定され、そして公知の遺伝 子Rab11に対応するようであり、受託番号X56740およびX53l43を通して入手可能 である。Rab11は、ER/ゴルジにおけるタンパク質/ベジクル輸送に関与すると考 えられている。βAPPおよびNotchのような膜タンパク質のプロセシングに対する 可能性のある関連が、毒性Aβペプチド(特に神経毒性Aβ_1-42(43)イソ型)の過剰 産生を生じることに注意のこと(Scheunerら、1995)。 Ｅ．レチノイドＸレセプター-β 本明細書中で配列番号６として開示される１つのクローン(Y2H23b)は、正常型 PSITM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定され、そしてレチノイ ドＸレセプター-β、核内レセプターコレギュレーター、またはMHCクラス1制御 エレメントとして様々に知られる公知の遺伝子に対応するようであり、そして受 託番号M84820、X63522およびM81766を通して入手可能である。この遺伝子は、細 胞内シグナリングに関与していると考えられ、C．elegans se112およびNotch/li n-12(転写アクチベーター)により媒介される細胞内シグナリング機能に対する可 能性のある関係を示唆する。 Ｆ．細胞質シャペロニン 本明細書中で配列番号８として開示される１つのクローン(Y2H27)は、正常型P S1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定され、そして公知の遺 伝子、TCP-1を含む細胞質シャペロニンに対応するようであり、受託番号U17104 およびX74801を通して入手可能である。 Ｇ．クローンY2H35 本明細書中で配列番号７として開示される１つのクローン(Y2H35)は、正常型P S1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定され、そして未知の機 能のタンパク質をコードする配列に対応するようであり、受託番号R12984を通し て入手可能であるが、これは、酵母配列における進化的な保存を示す。 Ｈ．クローンY2H171 本明細書中で配列番号９として開示される１つのクローン(Y2H171)は、正常型 PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定され、そして公知の発 現される反復配列に対応するようであり、受託番号D55326を通して入手可能であ る。 Ｉ．クローンY2H41 PS1およびPS2のTM6→7ループドメインならびにPS1の変異体ループドメインと 強度に相互作用する１つのクローン(Y2H41)が同定された。配列番号１０として 開示される配列は、未知の機能のEST(受託番号T64843)と強度な相同性を示す。 III．好ましい実施態様 本明細書中に開示および記載される発見に部分的に基づいて、本発明の以下の 好ましい実施態様を提供する。 １．単離された核酸 １つの一連の実施態様において、本発明は、本明細書中に開示されるプレセニ リン相互作用タンパク質の少なくともPS相互作用ドメインをコードする核酸配列 に対応または関連する、単離された核酸を提供する。以下でより十分に記載され るように、開示されそして可能にされる配列は、ヒトおよび他の哺乳動物種由来 の正常配列、ヒトおよび他の哺乳動物種由来の変異体配列、DrosophilaおよびC. elegansのような非哺乳動物種由来の相同配列、プローブおよびPCRプライマーと して有用なこれらの配列のサブセット、PS相互作用タンパク質のフラグメントを コードするかまたは特定の構造ドメインもしくは多型領域に対応するこれらの配 列のサブセット、PS相互作用タンパク質遺伝子のフラグメントに対応する相補配 列またはアンチセンス配列、PS相互作用タンパク質コード領域が外因性調節領域 に作動可能に連結されている配列、および発現のマーカーとして、精製のための「 タグ」として、またはPS相互作用タンパク質の一部がPS相互作用タンパク質と相 互作用する他のタンパク質についてのスクリーニングおよびアッセイにおいて有 用な、他のタンパク質に融合されている融合タンパク質をコードする配列を含む 。 従って、第１の一連の実施態様において、少なくともPS相互作用タンパク質の 正常または変異体バージョンのPS相互作用タンパク質をコードする、単離された 核酸配列を提供する。このような核酸配列の例は、本明細書中で配列番号１、３ 、 および5〜10として開示される。さらに、本明細書中で開示されるPS相互作用タ ンパク質のPS相互作用ドメインの配列を考慮すれば、当業者は、明らかに完全な PS相互作用タンパク質をコードする完全なゲノム配列または完全なcDNA配列を得 ることが可能である。従って、例えば、酵母ツーハイブリッド系(実施例１)を用 いて得られたGT24タンパク質の最初のクローンに基づいて、配列番号３として開 示されるより大きいGT24クローンは、当該分野において公知の標準的な方法によ り得られた。開示された配列をコードする各々の遺伝子の完全長cDNAクローンま たは完全長ゲノムクローンは、同様にして当業者により得られ得る。従って、本 発明は、本発明のPS相互作用タンパク質遺伝子に対応する完全長ゲノム配列なら びに完全長cDNA配列を提供する。あるいは、本発明の核酸は、組換え遺伝子また は「ミニジーン」を包含し得、ここでPS相互作用タンパク質遺伝子の全てのまたは いくつかのイントロンは除去されているか、または、イントロンおよびエキソン の種々の組合せ、ならびに局所的なシス作用性調節エレメントは、増殖または発 現の構築物またはベクターにおいて操作されている。組換えPS相互作用タンパク 質遺伝子のサイズを減少させるために、cDNA遺伝子を使用し得るか、またはイン トロンおよび非翻訳エキソンの種々の組合せをDNA構築物から除去し得る。これ らの実施態様におけるこれらのおよび多くの改変は今や、本明細書中に提供され るPS相互作用タンパク質遺伝子の同定および記載によって可能になる。 開示されるPS相互作用タンパク質配列および遺伝子配列に加えて、当業者は、 今や、開示される配列の対立遺伝子であるPS相互作用タンパク質遺伝子もしくは cDNA、または異種特異的ホモログであるPS相互作用タンパク質遺伝子もしくはcD NAを表す核酸を同定しそして単離することが可能である。従って、本発明は、こ れらの対立遺伝子およびホモログ、ならびにこれらの配列由来の種々の上記の組 換え構築物に対応する単離された核酸を、当該分野で周知の手段によって提供す る。簡潔には、当業者は、今や、ゲノムまたはcDNAの調製物(個々の生物(例えば 、ヒトのAD患者またはそれらの家族の一員)ならびに細菌、ウイルス、酵母、ま たは他のゲノムもしくはcDNAのライブラリーから調製したサンプルを含む)を、 対立遺伝子配列または相同配列を同定するためのプローブまたはPCRプライマー を使用してスクリーニングし得る。ADまたは他の疾患の発症に寄与し得るPS相互 作 用タンパク質における変異を同定することが望ましく、病原性でないPS相互作用 タンパク質における多型を同定することが望ましく、そしてADの研究および可能 性のある治療のためのスクリーニングに使用し得る種々の動物モデルの作製もま た望ましいので、さらなるPS相互作用タンパク質配列が、ヒト核酸の他の調製物 またはライブラリーから、および動物(ラット、マウス、ハムスター、モルモッ ト、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよび非ヒト霊長類を含む)由来 の調製物またはライブラリーから単離されることが、特に意図される。さらに、 酵母または無脊椎動物種(C．elegansおよび他の線虫、ならびにDrosophilaおよ び他の昆虫を含む)由来のPS相互作用タンパク質ホモログは、薬物のスクリーニ ングに特に有用性を有し得る。 標準的なハイブリダイゼーションスクリーニングまたはPCR技術を、比較的短 いPS相互作用タンパク質遺伝子配列を使用して(例えば、PCT公開番号WO 96/3409 9において開示されるmPS1遺伝子の同定において使用されたように)、このような 対立遺伝子配列および相同配列を同定および/または単離するために使用し得る 。配列は、標的配列の性質、使用する方法、および必要とされる特異性に依存し て、８個以下のヌクレオチドを含み得る。将来の技術発展により、より短い配列 の有利な使用ですら可能になるかもしれない。現在の技術では、９〜50ヌクレオ チド、および好ましくは約18〜24の配列が好ましい。これらの配列は、本明細書 中で開示された配列から選択され得るか、または本明細書中で可能になった他の 対立遺伝子ホモログまたは異種特異的ホモログから由来し得る。mRNAをプローブ するかまたはcDNAライブラリーをスクリーニングする場合、コード配列(イント ロンよりはむしろ)由来のプローブおよびプライマーを好ましくは使用し、そし てオルタナティブスプライシング改変体において削除される配列は、代表的には 、これらの改変体を同定することが特に所望されない限り、避ける。PS相互作用 タンパク質遺伝子の対立遺伝子改変体は、本明細書中で規定されるように、スト リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、開示された配列とハイブリダ イズすると予想され得るが、一方で、より低いストリンジェントを使用して異種 特異的ホモログを同定し得る。 別の一連の実施態様において、本発明は、PS相互作用タンパク質配列またはそ れらの相補物のサブセットを含む単離された核酸を提供する。上記のように、こ のような配列は、PS相互作用タンパク質遺伝子の対立遺伝子改変体および相同改 変体の同定および単離におけるプローブおよびPCRプライマーとしての有用性を 有する。PS相互作用タンパク質の多型領域に対応するサブ配列はまた、以下に記 載するように、診断目的のための個体のスクリーニングおよび/または遺伝子型 決定における特別な有用性を有する。さらに、また以下に記載するように、この ようなサブセットは、(１)融合タンパク質に含ませるためのPS相互作用タンパク 質のフラグメント、(２)結合研究に使用するためのPS相互作用タンパク質の機能 的ドメインを含むフラグメント、(３)PS相互作用タンパク質に対する抗体を生じ させるための免疫原として使用され得るPS相互作用タンパク質のフラグメント、 および(４)競合的インヒビターとして、またはPS相互作用タンパク質模倣物とし て作用して、PS相互作用タンパク質の生理学的機能を阻害または模倣し得るPS相 互作用タンパク質のフラグメント、をコードするために有用性を有する。最終的 に、このようなサブセットは、PS相互作用タンパク質遺伝子またはPS相互作用タ ンパク質mRNA転写物に生理学的条件下でハイブリダイズして、これらの配列の転 写または翻訳を阻害し得る相補的配列またはアンチセンス配列をコードまたは示 し得る。それゆえ、意図される使用に依存して、本発明は、8〜10ヌクレオチド( 例えば、PCRプライマーとしての使用のため)から、PS相互作用タンパク質のゲノ ムDNAまたはcDNAのほぼ完全長のサイズまで変化する長さを有し得るPS相互作用 タンパク質遺伝子の核酸サブ配列を提供する。従って、本発明は、本明細書中で 開示されたかさもなければ可能にしたように、PS相互作用タンパク質遺伝子の少 なくとも8〜10個、好ましくは15個、そしてより好ましくは少なくとも20個の連 続するヌクレオチドまたはその相補物に対応する配列を含む、単離された核酸を 提供する。しかし、上記のように、異なる技術ではより短い配列が有用であり得 る。 別の一連の実施態様において、本発明は、イントロンを有するかもしくは有さ ずに、または上記のように組換え操作されたかもしくはされずに、PS相互作用タ ンパク質のコード配列が、内因性または外因性の５'および/または３'調節領域 に作動可能に連結されている核酸を提供する。本明細書の開示および標準的な遺 伝子技術(例えば、PCR伸長、標的化遺伝子ウォーキング)を使用すれば、当業者 には、現在、開示されたPS相互作用タンパク質遺伝子のいずれかの５'および/ま たは３'内因性調節領域をクローン化することは可能である。同様に、これらの 内因性調節領域の対立遺伝子改変体、ならびに他の哺乳動物のホモログ由来の内 因性調節領域は、同様に過度の実験を要することなく可能でなる。あるいは、外 因性調節領域(すなわち、異なる同種遺伝子由来の調節領域または異種特異的調 節領域)は、発現を駆動するために、PS相互作用タンパク質のコード配列に作動 可能に連結され得る。適切な５'調節領域には、プロモーターエレメントが含ま れ、そしてまた、オペレーター配列またはエンハンサー配列、リボソーム結合配 列、RNAキャップ形成配列などのようなさらなるエレメントも含まれ得る。調節 領域は、原核生物細胞または真核生物細胞、それらのウイルス、およびそれらの 組合せの遺伝子の発現を制御する配列から選択され得る。このような調節領域と して、lac系、trp系、tac系、およびtrc系；λファージの主要なオペレーター領 域およびプロモーター領域；fdコートタンパク質の制御領域；SV40の初期および 後期プロモーター；ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウ イルス、およびシミアンウイルス由来のプロモーター；3-ホスホグリセレートキ ナーゼプロモーター；酵母の酸ホスファターゼプロモーター；酵母のα-交配因 子；ニューロンまたは他の細胞型において発現する他の真核生物遺伝子のプロモ ーターエレメント；およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されな い。特に、これらの核酸で形質転換された細胞において、PS相互作用タンパク質 遺伝子の制御された発現および/または操作可能な発現を可能にする誘導性また は抑制性の調節エレメント(例えば、β-ガラクトシダーゼプロモーター)を選択 し得る。あるいは、PS相互作用タンパク質のコード領域を、多細胞生物における 組織特異的発現を提供する調節エレメントと作動可能に連結し得る。このような 構築物は、適切な組織においてのみPS相互作用タンパク質遺伝子の発現を引き起 こすトランスジェニック生物の作製に特に有用である。適切な調節領域の選択は 、当業者の能力および裁量の範囲内であり、そして多くのこのような調節領域の 組換え体の使用は、現在当該分野で確立されている。 別の一連の実施態様において、本発明は、融合タンパク質の形態でPS相互作用 タンパク質の全部または一部をコードする単離された核酸を提供する。これらの 実施態様において、核酸調節領域(内因性または外因性)は、第２のコード領域に インフレームで共有結合されている第１のコード領域に作動可能に連結される。 第２のコード領域は随意に、一つ以上のさらなるコード領域に共有結合され得、 そして、最後のコード領域は、終止コドン、および随意に、適切な３'調節領域( 例えば、ポリアデニル化シグナル)に連結される。融合タンパク質のPS相互作用 タンパク質配列は、第１、第２、または任意のさらなるコード領域を示し得る。 PS相互作用タンパク質配列は、保存的ドメインまたは非保存的ドメインであり得 、そして融合物の任意のコード領域に配置され得る。融合物の非PS相互作用タン パク質配列は、実施者の要求および裁量に従って選択され得るが、本発明によっ て制限されない。有用な非PS相互作用タンパク質配列としては、例えば、得られ る融合タンパク質の同定または精製を補助するために使用され得る抗原決定基ま たはポリHisタグのような短い配列の「タグ」が挙げられる。あるいは、非PS相互 作用タンパク質のコード領域は、タンパク質の同定および精製を補助し得るか、 または以下に記載のようなアッセイにおいて有用であり得る、酵素または結合タ ンパク質のような大きなタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードし得 る。特に意図される融合タンパク質としては、プレセニリン相互作用タンパク質 の単離および精製に有用であるポリHisおよびGST(グルタチオンS-トランスフェ ラーゼ)の融合物、および以下に記載の、PS相互作用タンパク質と結合または相 互作用する他のタンパク質を同定するためのアッセイにおいて有用である酵母の ツーハイブリッド融合物が挙げられる。 別の一連の実施態様において、本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺 伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）が、PS相互作用タンパク 質遺伝子の５'調節領域に作動可能に連結され、その結果、マーカー遺伝子の発 現が、その調節配列の制御下にある、組換えDNA構築物の形態の単離された核酸 を提供する。本明細書中で可能にされる、ヒトおよび他の噛乳動物種由来の調節 領域を含む、PS相互作用タンパク質調節領域を使用すると、当業者には、現在、 このような構築物を作成することが可能である。以下でより十分に議論するよう に、このような単離された核酸は、直接的または間接的に、PS相互作用タンパク 質の発現に差別的に影響し得る化合物の同定に有用である、細胞、細胞株、また はトランスジェニック動物の作製に使用され得る。 最終的に、本発明の単離された核酸は、ベクターに含まれる場合、上記の任意 の配列を含む。適切なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド 、エピソームなどを含む全ての型のクローニングベクターおよび発現ベクターな らびに組込みベクターが挙げられる。ベクターはまた、これらで首尾よく形質転 換された細胞の同定に有用である、種々のマーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐 性遺伝子または感受性遺伝子)を含み得る。さらに、ベクターは、本発明の核酸 が作動可能に連結されている調節配列を含み得、そして/またはそのベクター中 に適切に連結される場合、本発明の核酸が融合タンパク質として発現されるよう にコード領域もまた含み得る。このようなベクターはまた、酵母「ツーハイブリ ッド」、バキュロウイルス、およびファージディスプレー系における使用のため のベクターを含み得る。ベクターは、特定の用途のために必要とされるかまたは 所望されるような、原核生物、真核生物、またはウイルスの発現のために有用で あるように選択され得る。例えば、SV40プロモーターを有するワクシニアウイル スベクターもしくはシミアンウイルスベクター(例えば、pSV2)、または単純ヘル ペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルスは、培養中またはインビボでのニューロ ンを含む哺乳動物細胞のトランスフェクションに有用であり得る。そして、バキ ュロウイルスベクターは、昆虫細胞(例えば、チョウの細胞)のトランスフェクシ ョンに使用され得る。非常に多様な異なるベクターは、現在市販されており、そ うでなければ当該分野で公知であり、そして適切なベクターの選択は、当業者の 能力および裁量の範囲内である。 ２．実質的に純粋なタンパク質 本発明は、PS相互作用タンパク質、PS相互作用タンパク質のフラグメント、お よびPS相互作用タンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質の実質 的に純粋な調製物を提供する。タンパク質、フラグメント、および融合物は、本 明細書中に記載されるように、正常PS相互作用タンパク質および変異体PS相互作 用タンパク質に対する抗体の生成、PS相互作用タンパク質に結合するタンパク質 (プレセリンとは別のもの)の同定、ならびに診断方法および治療方法において有 用性を有する。それゆえ、意図される用途に依存して、本発明は、完全なPS相互 作用タンパク質のサブ配列であり、そして完全なPS相互作用タンパク質に対して 、４〜10アミノ酸(例えば、免疫原としての使用のため)または10〜100アミノ酸( 例えば、結合アッセイにおける使用のため)で変化する長さを有し得るアミノ酸 配列を含む、実質的に純粋なタンパク質またはペプチドを提供する。従って、本 発明は、本明細書中に記載するかそうでなければ可能とされるように、PS相互作 用タンパク質の少なくとも４〜５個、好ましくは６〜10個、そしてより好ましく は少なくとも50または100個の連続するアミノ酸に対応する配列を含む、実質的 に純粋なタンパク質またはペプチドを提供する。 本発明のタンパク質またはペプチドは、そのタンパク質配列によって明らかに される特性に基づいて選択される、任意の種々の方法によって単離および精製さ れ得る。例えば、PS相互作用タンパク質は、PS相互作用タンパク質が通常高度に 発現される細胞から単離され得る。あるいは、PS相互作用タンパク質、融合タン パク質、またはそれらのフラグメントは、以下の発現ベクターを用いて形質転換 またはトランスフェクトされた細胞から精製され得る：例えば、pPbacおよびpMb acベクター(Stratagene，La Jolla，CA)のようなバキュロウイルス系；pYESHIS Xpresベクター(Invitrogen，San Diego，CA)のような酵母発現系；一定の構成的 発現を有するpcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)または誘導可能であるLacSwit ch(Stratagene，La Jolla，CA)のような真核生物発現系；またはpKK233-3(Clont ech，Palo Alto，CA)のような原核生物発現ベクター。タンパク質またはフラグ メントが、組換え細胞(例えば、真核生物細胞)の小胞体または原形質膜内に組み 込まれる場合、タンパク質は膜画分から精製され得る。あるいは、タンパク質が 組換え細胞(例えば、原核生物細胞)内の封入体に凝集する場合、タンパク質は、 溶解細胞全体または可溶化された封入体から精製され得る。 精製を、標準的なタンパク質精製手順を使用して達成し得る。タンパク質精製 手順としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC、イオン交換HPLC、サイズ排除HPLC)、高 性能クロマトフォーカシングクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ フィー、免疫沈降、または免疫アフィニティー精製が挙げられるが、これらに限 定されない。ゲル電気泳動(例えば、PAGE、SDS-PAGE)もまた、その分子量、電荷 特性、および疎水性に基づいてタンパク質またはペプチドを単離するために、使 用され得る。 PS相互作用タンパク質またはそのフラグメントはまた、抗原決定基またはポリ Hisタグ(例えば、QIAexpressベクター、QIAGEN Corp.，Chatsworth，CA)、また はより大きなタンパク質(例えば、pGEX-27ベクター(Amrad，USA)を使用するGST またはGreen Lanternベクター(GIBCO/BRL．Gaithersburg，MD)を使用する緑色蛍 光タンパク質)のような別のペプチドに融合した所望のPS相互作用タンパク質配 列を含む融合タンパク質を作製することによって、簡便に精製され得る。融合タ ンパク質は、原核生物細胞または真核生物細胞から発現および回収され得、そし て融合ベクター配列に基づく任意の標準的な方法によって精製され得る。例えば 、融合タンパク質は、融合物の非PS相互作用タンパク質部分に対する抗体を用い て免疫アフィニティーまたは免疫沈降によって、または、ポリHisタグの場合は 、ニッケルカラムに対する親和性結合によって精製され得る。次いで、所望のPS 相互作用タンパク質またはフラグメントは、融合タンパク質の酵素的切断によっ てこの融合タンパク質からさらに精製され得る。タンパク質の精製のためにこの ような融合構築物を調製および使用する方法は、当該分野で周知であり、そして いくつかのキットが、この目的のために市販されている。本発明の開示に照らせ ば、今や、PS相互作用タンパク質とのこのような融合構築物を使用することが可 能である。 ３．PS相互作用タンパク質に対する抗体 本発明はまた、PS相互作用タンパク質またはそのフラグメントに選択的に結合 する抗体およびこのような抗体の作製方法を提供する。特に重要なことは、PS相 互作用タンパク質のPS相互作用ドメインを同定すること、およびアルツハイマー 病に関連するPS相互作用タンパク質の変異体形態を同定する方法によって、本発 明は、PS相互作用タンパク質の正常形態および変異体(すなわち、病原性)形態に 選択的に結合し、それゆえこれらを同定および/または識別する抗体およびその ような抗体の作製方法を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、PS相互作用タン パク質の免疫アフィニティー精製、PS相互作用タンパク質を発現する細胞または 組織を同定するためのウェスタンブロッティング、およびこのタンパク質の細胞 下位位置(subceller location)を確証するための免疫細胞化学または免疫蛍光技 術のための研究室用試薬としての有用性を有する。さらに、下記のように、本発 明の抗体は、ADに関連するPS相互作用タンパク質対立遺伝子の保有者を同定する ための診断手段として、またはインビボでPS相互作用タンパク質の病原性形態に 選択的に結合して、これを阻害するための治療手段として使用され得る。 本発明の抗体は、本発明のPS相互作用タンパク質の全体を使用して、またはこ のタンパク質に特徴的であり、そしてこのタンパク質と他の宿主タンパク質とを 実質的に区別する任意のPS相互作用タンパク質エピトープを使用して作製され得 る。もちろん、当該分野で公知である、抗原決定基を選択する任意の方法が、使 用され得る。このようなエピトープは、例えば、PS相互作用タンパク質配列由来 の４〜10アミノ酸残基の配列と、関連する宿主由来のタンパク質配列のコンピュ ーターデータベースとを比較することによって同定され得る。さらに、１または それ以上可能性のあるエピトープを含む、より大きなフラグメント(例えば、８ 〜20残基、または好ましくは９〜15残基)もまた使用し得る。PS相互作用ドメイ ン(下記の酵母ツーハイブリッドアッセイにより同定)に対する抗体は、診断的お よび治療的の両方に最大の有用性を有すると期待される。一方で、高度に保存さ れたドメインに対する抗体は、PS相互作用タンパク質の精製または同定に最大の 有用性を有すると期待される。 PS相互作用タンパク質免疫原調製物は、粗製抽出物(例えば、このタンパク質 を高発現する細胞の溶解物または膜画分)から、天然もしくは組換え的にそれら を発現する細胞から実質的に精製されたタンパク質もしくはペプチドから、また は短い免疫原については、化学的ペプチド合成によって生成され得る。免疫原は また、非PS相互作用タンパク質領域がそのアジュバント特性について選択される 、融合タンパク質の形態であり得る。本明細書で使用される場合、PS相互作用タ ンパク質免疫原は、本明細書中で開示されるかさもなければ可能にされるように 、PS相互作用タンパク質の少なくとも４〜８個、そして好ましくは少なくとも９ 〜 15個の連続するアミノ酸残基を含むペプチドを含有する調製物として定義される 。もちろん、より少ない残基の配列もまた、意図される用途および将来の技術的 発展に依存して、有用性を有し得る。それゆえ、PS相互作用タンパク質に対する 抗体を生成するために使用されるPS相互作用タンパク質由来の任意の配列は、PS 相互作用タンパク質免疫原と見なされるべきである。 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得る か、またはFabフラグメント、F(ab')₂、および単鎖抗体フラグメントを含む、抗 体のフラグメントであり得る。さらに、本発明の方法によって有用な抗体を同定 した後、上記で列記した任意の抗体フラグメント、ならびにPS相互作用タンパク 質に対する非ヒト抗体に基づくヒト化抗体を含む、組換え抗体が生成され得る。 本開示および本明細書中で可能になった他のPS相互作用タンパク質の特徴付けに 照らして、当業者は、当該分野で周知の任意の種々の標準的な手段によって上記 の抗体を生成し得る。抗体技術の概観については、Antibody Engineering: A Pr actical Guide ，Borrebaek編、W．H．Freeman & Company，NY(1992)，またはAnt ibody Engineering ，第２版、Borrebaek編、Oxford University Press，Oxford( 1995)を参照のこと。 一般的な事として、適切なキャリア中のPS相互作用タンパク質免疫原で、マウ ス、ウサギ、ヤギ、または他の適切な動物をまず免疫することによって、ポリク ローナル抗体を生成し得る。調製物の免疫原性を増加させるために、免疫原をキ ャリアタンパク質にカップリングさせ得るか、またはアジュバント(例えば、Fre undアジュバント)と混合し得る。必要ではないが、追加免疫注射が推奨される。 体液性応答を発達させるに適切な期間の後(好ましくは数週間後)、動物から採血 し、そして血清を精製して免疫グロブリン成分を単離し得る。 同様に、一般的な事として、適切なキャリア中のPS相互作用タンパク質免疫原 を、マウス、ウサギ、ヤギ、または他の適切な動物にまず注射することによって モノクローナル抗PS相互作用タンパク質抗体を生成し得る。上記のように、キャ リアタンパク質またはアジュバントを利用し得、そして追加免疫注射(例えば、 ８〜10週間にわたって１または２週間おきに)が推奨される。体液性応答を発達 させた後、動物を屠殺し、そして脾臓を取り出し、そして例えば、リン酸緩衝化 生理食塩水(PBS)中に再懸濁する。牌細胞を、リンパ球の供給源として供する。 このリンパ球のいくつかは適切な特異性の抗体を産生している。次いでこれらの 細胞を、不死化細胞株(例えば、ミエローマ)と融合し、そして融合産物を、HAT のような選択薬剤の存在下で多数の組織培養ウェルに播種する。ウェルを連続的 にスクリーニングし、そして再播種する。各時点で、有用な抗体を産生する細胞 を選択する。代表的には、いくつかのスクリーニング手順および再播種手順を、 90％を越えるウェルが、抗体産生についてポジティブである単一クローンを含む まで実施する。このようなクローンによって産生されるモノクローナル抗体を、 プロテインＡセファロースを使用するアフィニティークロマトグラフィーのよう な標準的な方法、イオン交換クロマトグラフィー、またはこれらの技術の改変ま たは組合せによって精製し得る。 本発明の抗体を、診断的使用および/または治療的使用のために、他の化合物 または物質で標識または結合体化し得る。例えば、本発明の抗体を、画像化もし くは治療のために放射性核種、蛍光化合物、もしくは酵素と、または特定の組織 位置にリポソーム中に含まれる化合物を標的化するためのリポソームと、カップ リングし得る。 ４．形質転換された細胞株 本発明はまた、原核生物および真核生物の両方の細胞または細胞株を提供する 。これらの細胞は、本発明の核酸のクローン増殖および/またはそれらにコード されるタンパク質またはペプチドの発現を引き起こすように、本発明の核酸で形 質転換またはトランスフェクトされている。このような細胞または細胞株は、本 発明の核酸およびタンパク質の増殖および生成の両方において有用性を有し、本 明細書中でさらに記載されるように、診断アッセイおよび治療アッセイのための モデル系としても有用性を有する。特に、PS相互作用タンパク質配列ならびにプ レセニリン配列で同時形質転換された細胞は、ADにおいて影響され得る生化学的 経路のモデルとして改善された有用性を有することが期待される。例えば、酵母 ツーハイブリッド融合構築物中のPS相互作用配列およびプレセニリンの相互作用 ドメインで同時形質転換された細胞は、これらドメイン間の相互作用を増強する か または阻害する化合物についてのスクリーニングにおいて有用性を有する。同様 に、異種特異的プレセニリンで形質転換された細胞については、同様に異種特異 的なPS相互作用タンパク質での同時形質転換、またはPS相互作用タンパク質の同 様に異種特異的なPS相互作用ドメインを導入するための同時形質転換および相同 組換え(例えば、非ヒト内因性PS相互作用タンパク質の「ヒト化」)は、プレセニリ ンとPS相互作用タンパク質との相互作用を研究するための、より良好なモデル系 を生じる。PS相互作用配列のみで形質転換された細胞は、もちろん、ADの病因に おけるこれらタンパク質の役割を研究するためのそれら固有の有用性を有し、そ してプレセニリン同時形質転換された細胞の前駆体としてもまた有用性を有する 。 本明細書で使用される用語「形質転換された細胞」は、形質転換、トランスフェ クション、感染、または他の手段のいずれかにより本発明の任意の核酸が導入さ れた、任意の細胞または任意の細胞の子孫を含むことが意図される。適切なベク ターを作製する方法、それらのベクターで細胞を形質転換する方法、および形質 転換体を同定する方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書では簡潔に概 説されるのみである(例えば、Sambrookら、(1989)Molecular Cloning: Laborat ory Manual ，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har bor，NewYorkを参照のこと)。 本発明の形質転換された細胞の作製に有用な原核生物細胞としては、細菌属Es cherichia(例えば、E．coli)、Pseudomonas(例えば、P．aeruginosa)、およびBa cillus(例えば、B．subtillus、B．stearothermophilus)のメンバー、ならびに 当該分野で周知であり、そしてしばしば使用されている他の多くものが挙げられ る。原核生物細胞は、本発明のタンパク質またはペプチド(例えば、正常PS相互 作用タンパク質または変異体PS相互作用タンパク質、PS相互作用タンパク質のフ ラグメント、PS相互作用タンパク質の融合タンパク質)の大量生産に特に有用で ある。細菌細胞(例えば、E ．coll)を、例えば、T7 RNAポリメラーゼ/プロモータ ー系、λバクテリオファージ調節配列、またはM13ファージmGPI-2を有するプラ スミドを含む、種々の発現ベクター系と共に使用し得る。細菌宿主はまた、例え ば、lacZ、trpE、マルトース結合タンパク質、ポリHisタグ、またはグルタチオ ン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を生じる融合タンパク質ベクターで形 質転換され得る。これらの全て、および多くの他の原核生物発現系は、当該分野 で周知であり、そして、広範に市販されている(例えば、GST融合物については、 pGEX-27(Amrad，USA))。 本発明の形質転換された細胞の作製に有用な真核生物の細胞および細胞株とし ては、哺乳動物の細胞および細胞株(例えば、PC12、COS、CHO、線維芽細胞、ミ エローマ、神経芽細胞腫、ハイブリドーマ、ヒト胚腎293、卵母細胞、胚幹細胞) 、昆虫細胞株(例えば、pPbacまたはpMbac(Stratagene，La Jolla，CA)のような バキュロウイルスベクターを使用する)、酵母(例えば、pYESHIS(Invitrogen，CA )のような酵母発現ベクターを使用する)、および真菌が挙げられる。真核生物細 胞は、PS相互作用タンパク質またはその機能的フラグメントが機能を果たすこと 、および/または正常タンパク質または変異体タンパク質のいずれかに関連する 細胞内相互作用を受けることが必要である実施態様に特に有用である。従って、 例えば、形質転換された真核生物細胞は、PS相互作用タンパク質の機能または相 互作用のモデルとしての使用に好ましく、そして候補の治療剤をスクリーニング するためのアッセイは、好ましくは、形質転換された真核生物細胞を使用する。 真核生物細胞における発現を達成するために、人工的なプロモーターエレメン トの調節下で、PS相互作用タンパク質ヌクレオチド配列の誘導性(例えば、LacSw itch発現ベクター、Stratagene，La Jolla，CA)、または同系(cognate)(例えば 、pcDNA3ベクター、Invitrogen，Chatsworth，CA)発現を可能にする、広範な種 々のベクターが開発されており、そして市販されている。このようなプロモータ ーエレメントは、しばしばCMVまたはSV40ウイルス遺伝子由来であるが、真核生 物細胞において活性な他の強いプロモーターエレメントもまた、PS相互作用タン パク質ヌクレオチド配列の転写を誘導するために使用され得る。代表的には、こ れらのベクターはまた、外因性ウイルス遺伝子配列由来でもあり得るかまたは他 の真核生物遺伝子由来でもあり得る、人工的なポリアデニル化配列および３'UTR を含む。さらに、いくつかの構築物において、人工的で、非コードの、スプライ ス可能なイントロンおよびエキソンを、目的のヌクレオチド配列の発現を増強す るためにベクター中に含ませる。これらの発現系は、通常、商業的供給源から市 販され、そしてpcDNA3およびpZeoSV(Invitrogen，San Diego，CA)のようなベク タ ーによって代表される。構成的にまたは特定の外因性刺激(例えば、テトラサイ クリンの使用中止またはIPTGへの曝露)への曝露後のいずれかで、多かれ少なか れ任意の所望の細胞型における任意の所望のPS相互作用タンパク質転写物の発現 を可能にする、無数の市販の発現ベクターおよび注文設計された発現ベクターが 、商業的供給源から入手可能である。 ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リン酸ストロンチウム トランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、エレクトロポ レーション、リポフェクション(例えば、Dosperリポソームトランスフェクショ ン試薬、Boehringer Mannheim，Germany)、マイクロインジェクション、マイク ロビーズでの弾道挿入(ballisticinsertion)、プロトプラスト融合を含むがこれ らに限定されない当該分野で周知の種々の方法によって、またはウイルスベクタ ーまたはファージベクターについては、組換えウイルスもしくはファージでの感 染により、レシピエント細胞または「宿主」細胞に導入し得る。 ５．トランスジェニック動物モデル 本発明はまた、アルツハイマーの研究のため、候補の薬学的化合物のスクリー ニングのため、外植した哺乳動物CNS細胞培養物(例えば、ニューロン、グリア、 器官型、または混合した細胞の培養物)の作製のため、および潜在的な治療的介 入の評価のための、変異体もしくは野生型のPS相互作用タンパク質配列が発現さ れるか、またはPS相互作用タンパク質遺伝子が不活化されている(例えば、「ノッ クアウト」欠失)、トランスジェニック非ヒト動物モデルの作製を提供する。本発 明より前に、アルツハイマー病についての部分的な動物モデルが、血小板由来増 殖因子βレセプタープロモーターエレメントの調節下で、ミニ遺伝子としてヒト アミロイド前駆体タンパク質遺伝子の変異形態を挿入し、そして過剰発現させる ことによって存在した(Gamesら、1995)。この変異体(βAPP₇₁₇Val→Ile)は、高 いコピー数でこのトランスジーンをを有するトランスジェニック動物の脳におい て、シナプス病理学およびアミロイドβペプチドの沈着の出現を引き起こす。ト ランスジェニック動物の脳におけるこれらの変化は、ヒトADに見られる変化と非 常に類似している(Gamesら、1995)。しかし、このような動物が痴呆になるかど うか はまだ明らかでないが、現在はマウスにおいてADの少なくともいくつかの局面を 再現することは可能であるという一般的な総意が存在する。さらに、プレセニリ ン遺伝子が、遺伝子操作されているトランスジェニック動物モデルは、PCT公開W 096/34099に開示されている。これらのトランスジェニック動物モデルは、変化 したAβ産生および変化した海馬依存性記憧機能を有することが示されている。 本発明の動物モデルにおける使用に適切な動物種として、ラット、マウス、ハ ムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒ ト霊長類(例えばアカゲザル、チンパンジー)が挙げられるが、これらに限定され ない。最初の研究のためには、トランスジェニック齧歯類(例えばマウス)が、維 持が比較的容易であるため、および短い寿命のために好ましい。しかし、トラン スジェニック酵母または無脊椎動物(例えば線虫、昆虫)は、これらがさらにより 迅速かつ安価なスクリーニングを可能とするために、いくつかの研究のために好 ましくあり得る。例えば、迅速な発生および容易に評価される表現型(例えば、 数日後の異常な外陰または目の発達)を起こす変異体PS相互作用タンパク質ホモ ログ(または哺乳動物PS相互作用タンパク質トランスジーン)を有する無脊椎動物 は、変異体遺伝子の効果をブロックする薬物のスクリーニングとして使用され得 る。このような無脊椎動物は、より大きな脊椎動物よりマススクリーニングにつ いてはるかに迅速かつ効率的に試験し得る。一旦誘導化合物がこのようなスクリ ーニングによって見出されると、それらは、齧歯類のような高等動物において試 験され得る。究極的に、トランスジェニック非ヒト霊長類は、それらのヒトに対 するより高い類似性およびそれらのより高い認識能力のために、より長期の研究 のために好ましくあり得る。 本明細書中に開示されるかさもなければ可能とされる核酸を使用すれば、現在 、アルツハイマー病のためのトランスジェニック動物モデルの作製のためのいく つかの利用可能なアプローチが存在する。従って、可能になった動物モデルとし ては、以下が挙げられる。(１)外因性もしくは内因性のプロモーターエレメント のいずれかの調節下でのさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子もしくは大き なゲノムフラグメントのいずれかとして、正常なヒトPS相互作用タンパク質遺伝 子が動物のゲノム中に組換えにより導入されている動物；相同組換えもしくは遺 伝 子標的化によって、正常ヒトPS相互作用タンパク質遺伝子の少なくとも１つの機 能的ドメインをコードする配列が動物の相同なPS相互作用タンパク質遺伝子の１ コピーもしくは両方のコピーと組換えにより置換されている動物；および/また は動物の相同なPS相互作用タンパク質遺伝子の１つの１コピーもしくは両方のコ ピーが、相同組換えもしくは遺伝子標的化による、ヒトホモログをコードする配 列の部分的置換によって、組換えにより「ヒト化」されている動物。これらの動物 は、トランスジェニック手順の効果、およびヒトPS相互作用タンパク質遺伝子ま たはヒト化PS相互作用タンパク質遺伝子の導入または置換の効果を評価するため に有用である。(２)外因性もしくは内因性プロモーターエレメントのいずれかの 調節下でのさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子もしくは大きなゲノムフラ グメントのいずれかとして、変異体(すなわち病原性)ヒトPS相互作用タンパク質 遺伝子の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする配列が動物のゲノム中に 組換えにより導入されている動物；変異体ヒトPS相互作用タンパク質遺伝子の少 なくとも１つの機能的ドメインをコードする配列が、相同組換えもしくは遺伝子 標的化によって動物の相同なPS相互作用タンパク質遺伝子の１コピーもしくは両 方のコピーと組換えにより置換されている動物；および/または動物の相同なPS 相互作用タンパク質遺伝子の１つの１コピーまたは両方のコピーが、相同組換え もしくは遺伝子標的化による変異体ヒトホモログをコードする配列の部分的な置 換によって、組換えにより「ヒト化」されている動物。これらの動物は、生化学的 、生理学的、および/または挙動的レベルのいずれかで、アルツハイマー病また はPS相互作用タンパク質遺伝子の変異に関連する他の疾患の病原である、１つ以 上の対立遺伝子を有するヒトの、いくつかまたは全ての特徴を示すモデルとして 有用である。(３)外因性または内因性のプロモーターエレメントのいずれかの調 節下でのさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子または大きなゲノムフラグメ ントのいずれかとして、その動物のPS相互作用タンパク質遺伝子の１つの変異体 バージョンの少なくとも機能的ドメインをコードする配列(例えば、ヒトPS相互 作用タンパク質の病原性変異の１つに対応するかもしくは類似する特異的変異を 有する)が、動物のゲノム中に組換えにより導入されている動物；および/または 相同組換えもしくは遺伝子標的化によって、その動物のPS相互作用タンパク質 遺伝子の１つの変異体バージョンの少なくとも１つの機能的ドメインをコードす る配列(例えば、ヒトPS相互作用タンパク質の病原性変異の１つに対応するかも しくは類似する特異的変異を有する)が、動物の相同なPS相互作用タンパク質遺 伝子の１コピーもしくは両方のコピーと、組換えにより置換されている動物。こ れらの動物はまた、生化学的、生理学的、および/または挙動的レベルのいずれ かで、アルツハイマー病の病原である１つ以上の対立遺伝子を有するヒトの、い くつかまたは全ての特徴を示すモデルとして有用である。(４)この動物のPS相互 作用タンパク質遺伝子の１つの１コピーもしくは両方のコピーが、相同組換えも しくは遺伝子標的化によって部分的または完全に欠失しているか、あるいは外因 性配列(例えば、停止コドン、lox p部位)の相同組換えもしくは遺伝子標的化に よる挿入または置換によって不活化されている、「ノックアウト」動物。このよう な動物は、PS相互作用タンパク質遺伝子発現の損失が有し得る効果を研究するた め、機能の損失が変異体形態の連続的な発現に好ましいかどうかを評価するため 、およびADまたは他の疾患の処置として変異体PS相互作用タンパク質を置換する かまたはADを引き起こす他の遺伝子(例えば、PSLPS2、APPまたはApoE)の効果に 介入するように他の遺伝子が補充され得るかどうかを試験するための、モデルと して有用である。例えば、正常PS相互作用タンパク質遺伝子は、変異体プレセニ リンまたはAPP遺伝子の作用が実際にADとして発現されるのに必要であり得、そ れゆえ、トランスジェニックPS相互作用タンパク質動物モデルは、このような複 遺伝子性相互作用の解明に有用であり得る。 １つ以上のPS相互作用タンパク質の発現が変化したトランスジェニック動物モ デルに加えて、本発明はまた、１つ以上のプレセニリン、APP、またはApoEが変 化したトランスジェニック動物モデルの産生を提供する。プレセニリン、App、 およびApoEをコードする核酸は当該分野において公知であり、これらの配列を有 するトランスジェニック動物の産生方法もまた公知である(例えば、PCT公開WO96 /34099；Gamesら、1995を参照のこと)。実際、非ヒト動物は、それらのPS相互作 用タンパク質配列においてのみならず、それらのプレセニリン、APP、および/ま たはApoEホモログの配列においてもヒトと異なるので、１つ以上のPS相互作用タ ンパク質のための組換え配列に加えて少なくとも１つのプレセニリン、APP、お よび/またはApoE遺伝子の組換え正常または変異体ヒト配列を有するトランスジ ェニック体が産生され得ることが特に意図される。このような同時形質転換され た動物モデルは、ヒト分子生物学のより多いエレメントを有し、従って、ヒト疾 患のより良好なモデルであると期待される。従って、本発明に従って、１つ以上 のPS相互作用タンパク質、またはこれらのタンパク質の相互作用ドメインについ ての正常もしくは変異体配列を有するトランスジェニック動物モデルが産生され 得る。これらの動物は、それらが種々の正常もしくは変異体プレセニリン、APP 、またはApoE配列を有する動物と交配されて、同時形質転換された動物モデルを 産生し得るという点での利用性を有する。さらに、以下に詳述のように、PS相互 作用遺伝子における変異は、プレセニリンそれ自身における変異のように、アル ツハイマー病および/または他の障害(例えば、他の認識障害、知能障害、神経学 的障害、心理学的障害(例えば、脳出血、精神分裂病、鬱病、精神遅滞、および てんかん))を引き起こし得ることが予想される。従って、任意のプレセニリン、 APP、またはApoE配列での形質転換なしに、PS相互作用タンパク質に対応する正 常または変異体配列を有するトランスジェニック動物モデルは、このような障害 の研究におけるそれら自身の有用性を有する。 以下に詳述するように、PS相互作用タンパク質またはPS相互作用タンパク質の ドメインで形質転換されたトランスジェニック動物モデルのための好ましい選択 には、実施例１で同定および記載され、そして配列番号１〜12で開示されたクロ ーンに対応する正常または変異体配列で形質転換されたものが挙げられる。正常 または変異体PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するこれらのクローンは、以 下の実施例１およびPCT公開WO96/34099に記載の方法に従って同定された。これ らのクローン、これらのクローンを含む長い核酸配列、ならびに本発明の本方法 および他の方法によって同定された他のクローン(例えば、対立遺伝子改変体お よびスプライス改変体またはこれらのクローンの異種特異的ホモログ)は、本発 明に従って使用されて、プレセニリン、APP、および/またはApoE配列との同時形 質転換体を有するか有さない動物モデルを作製し、それは、アルツハイマー病お よび/または他の認識障害、知能障害、神経学的障害、もしくは心理学的障害の 研究における利用性を有する。 従って、本明細書中で開示されたか、そうでなければ可能とされる核酸を使用 して、ここで、当業者は、変化したPS相互作用タンパク質発現を有する以下の任 意の型のトランスジェニック動物モデルを作製し得る：(１)内因性または外因性 プロモーターエレメントのいずれかの調節下のさらなる遺伝子として、およびミ ニ遺伝子または巨大ゲノムフラグメントとして、正常ヒトPS相互作用タンパク質 遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が動物のゲノムに組換え導 入されている動物；正常ヒトPS相互作用タンパク質遺伝子の少なくとも機能的ド メインをコードする配列が、相同組換えまたは遺伝子標的化によって動物の相同 的PS相互作用タンパク質遺伝子の１つまたは両方を組換え置換されている動物； および/または動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝子の１つの１コピーまた は両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子標的化によってヒトホモログをコー ドする配列の置換によって組換え的に「ヒト化」されている動物。これらの動物は 、ヒトPS相互作用タンパク質ならびにヒトプレセニリンタンパク質を発現するト ランスジェニックモデルを提供するのに特に有用である。それらはまた、トラン スジェニック手順の効率およびヒトまたはヒト化PS相互作用タンパク質遺伝子の 導入および置換の効果を評価するのに有用である。(２)外因性または内因性プロ モーターエレメントの調節下のさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子または 巨大ゲノムフラグメントとして、変異体(すなわち、病原性)ヒトPS相互作用タン パク質遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が、動物のゲノムに 組換え導入されている動物；変異体ヒトPS相互作用タンパク質遺伝子の少なくと も機能的ドメインをコードする配列が、相同組換えまたは遺伝子標的化によって 動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝子の１コピーまたは両方のコピーを組換 え置換されている動物；および/または動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝 子の１つの１コピーまたは両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子標的化によ って変異体ヒトホモログをコードする配列の部分的置換によって組換え的に「ヒ ト化」されている動物。これらの動物は、アルツハイマー病またはPS相互作用遺 伝子における変異に関連する他の疾患に病原性である１つ以上の対立遺伝子を保 有するヒトのいくつかまたは全ての特徴を、生化学的、生理学的および/または 挙動レベルのいずれかで表示するモデルとして有用である。(３)外因性または内 因 性プロモーターエレメントの調節下のさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子 または巨大ゲノムフラグメントとして、１つのこの動物のPS相互作用タンパク質 遺伝子の変異体バージョンの少なくとも機能的ドメインをコードする配列(例え ば、ヒトPS相互作用タンパク質の病原性変異の１つに対応するか類似する特異的 変異を有する)が、動物のゲノムに組換え導入されている動物；および/または相 同組換えまたは遺伝子標的化によって、１つのこの動物のPS相互作用タンパク質 遺伝子の変異体バージョンの少なくとも機能的ドメインをコードする配列(例え ば、ヒトPS相互作用タンパク質の病原性変異の１つに対応するか類似する特異的 変異を有する)が、動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝子の１コピーまたは 両方のコピーを組換え置換されている動物。これらの動物はまた、アルツハイマ ー病に病原性である１つ以上の対立遺伝子を保有するヒトのいくつかまたは全て の特徴を、生化学的、生理学的および/または挙動レベルのいずれかで表示する モデルとして有用である。(４)この動物のPS相互作用タンパク質遺伝子の１つの １コピーまたは両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子標的化によって部分的 にまたは完全に欠失されているか、または外因性配列(例えば、停止コドン、lox p部位)の相同組換えまたは遺伝子標的化による挿入または置換によって不活化さ れている「ノックアウト」動物。このような動物は、PS相互作用タンパク質遺伝子 発現の損失が有し得る効果を研究するため、機能の損失が連続的な発現に好まし いかどうかを評価するため、およびADまたは他の障害のための処置として他の遺 伝子がPS相互作用タンパク質を置換するかまたはADを引き起こす他の遺伝子(例 えば、APPまたはApoE)の効果に介入するように補充され得るかどうかを試験する ための、有用なモデルである。例えば、正常PS相互作用タンパク質は、変異体PS 1，PS2、またはAPP遺伝子の作用が実際にADとして発現されるのに必要であり得 、従って、トランスジェニックPS相互作用タンパク質動物モデルは、このような 複遺伝子性相互作用を解明するのに有用であり得る。 いくつかの好ましい実施態様において、PS相互作用タンパク質のPS相互作用ド メインのみが相同組換えによって動物のゲノムに導入されているトランスジェニ ック動物モデルが産生される。従って、例えば、好ましい実施態様は、PS相互作 用タンパク質のPS相互作用ドメインが、ヒトPS相互作用タンパク質由来の配列で の相同組換えによって「ヒト化」されたトランスジェニック動物を含む。次いで 、これらの動物は、正常または変異体プレセニリン配列が導入されたトランスジ ェニックと交配され得る。ヒトプレセニリンおよびヒトPS相互作用タンパク質配 列の両方を有するこれらの動物の子孫は、アルツハイマー病のための改善された 動物モデルを提供する。 動物モデル(例えば、トランスジェニックマウス)を作製するために、正常もし くは変異体PS相互作用遺伝子(例えば、正常または変異体のS5a、GT24、p0071、R ab11など)、またはPS相互作用遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする 正常または変異体バージョンの組換え核酸(例えば、酵母の２-ハイブリッド系に おいて得られるPS相互作用ドメイン)を、卵母細胞マイクロインジェクションの 標準的な技術、または胚幹細胞へのトランスフェクションもしくはマイクロイン ジェクションを使用して、生殖系列または幹細胞に挿入し得る。これらまたは同 様のプロセスによって作製された動物を、トランスジェニックという。同様に、 内因性プレセニリンまたはPS相互作用タンパク質遺伝子を不活化または置換する ことが所望される場合、胚幹細胞を使用する相同組換えが用いられ得る。これら または同様の手順によって作製された動物を、「ノックアウト」(不活化)または「 ノックイン」(置換)モデルという。 卵母細胞注入のために、本発明の組換えDNA構築物の１つ以上のコピーが、受 精直後の卵母細胞の前核に挿入され得る。次いで、この卵母細胞が、偽妊娠した 養母に再移植される。この生産動物を、挿入された組換えトランスジーン配列の 存在について、DNA(例えば、子孫マウスの尾静脈由来)分析を使用して成分をス クリーニングする。トランスジーンは、YAC、BAC、PAC、もしくは他の染色体DNA フラグメントとして注入された完全なゲノム配列、天然プロモーターもしくは異 種プロモーターのいずれかを有するcDNA、または全コード領域および最適な発現 に必要であることが見出されている他のエレメントを含むミニ遺伝子のいずれか であり得る。 初期胚のレトロウイルス感染もまた、本発明の組換えDNA構築物を挿入するた めに行われ得る。この方法において、トランスジーン(例えば、正常または変異 体のS5a、GT24、p0071、Rab11配列など)を、キメラ(そのいくつかは、生殖系列 への伝達を導く)を作製するために発達の初期段階の間に、直接、胚(例えば、マ ウスまたは非ヒト霊長類の胚)を感染させるために使用されるレトロウイルスベ クター中に挿入する。 幹細胞を使用する相同組換えは、希少な相同組換え事象を同定するための遺伝 子移入細胞のスクリーニングを可能にする。一旦同定されると、これらは胚盤胞 の注入によってキメラを作製するために使用され得、そして得られる動物の割合 は、組換え系列からの生殖系列伝達を示す。この方法論は、遺伝子の不活化が所 望される場合に特に有用である。例えば、マウスにおけるS5a遺伝子の不活化は 、選択可能なマーカーに隣接するS5aコード領域由来の配列を含むDNAフラグメン トを設計することによって達成され得る。相同組換えは、コード領域の中央のマ ーカー配列の挿入を導き、S5a遺伝子の不活化および/または内部配列の欠失を引 き起こす。次いで、個々のクローンのDNA分析を使用して、相同組換え事象を認 識し得る。 トランスジェニック動物の作製技術、ならびに相同組換えまたは遺伝子標的化 の技術は、現在、広範に受け入れられそして実施されている。例えば、マウス胚 の操作の実験マニュアルは、入手可能であり、トランスジェニックマウスの作製 のための標準的な実験技術(Hoganら、1986)に詳細に記載されている。トランス ジーンを作製するために、目的の標的配列(例えば、正常または変異体のプレセ ニリン配列、正常または変異体のPS相互作用タンパク質配列)は、代表的には、 その配列からのRNAの発現を調節するいくつかのプロモーターエレメントの下流 に位置するクローン化部位に連結される。コード配列の下流には、代表的には人 工的なポリアデニル化配列が存在する。遺伝性のヒト神経変性性疾患の局面を模 倣する動物を首尾よく作製するために使用されてきたトランスジェニックモデル において、最も成功的なプロモーターエレメントは、血小板由来増殖因子レセプ ターβ遺伝子サブユニットプロモーターおよびハムスタープリオンタンパク質遺 伝子プロモーターであるが、中枢神経系細胞における発現を導く他のプロモータ ーエレメントもまた有用である。トランスジーンを作製するための別のアプロー チは、トランスジーンの発現を駆動するための内因性のプレセニリンまたはPS相 互作用タンパク質遺伝子プロモーターおよび調節配列の使用である。最終的に、 所望の遺伝子全体ならびにその適切な調節配列を含むYACのような大きなゲノムD NAフラグメントを使用して、トランスジーンを作製することが可能である。この ような構築物は、トランスジェニックマウスにおけるヒトAPP発現を駆動するた めに首尾よく使用されてきた(Lambら、1993)。 動物モデルはまた、相同組換えによって内因性配列を変化させるために、内因 性プレセニリン遺伝子またはPS相互作用タンパク質遺伝子を標的化することによ り作製され得る。これらの標的化事象は、内因性配列を除去(ノックアウト)する 効果、または内因性配列を変化させて、ヒトの疾患に関連するアミノ酸の変化ま たはそうでなければ他の障害配列(例えば、元の動物の配列よりもヒトの配列に 似ている配列)を生じる(ノックイン動物モデル)という効果を有し得る。多数の ベクターが、これを達成するために利用可能であり、そして標的化されるべきマ ウスおよび他の動物のゲノムについてのゲノムDNAの適切な供給源は、GenomeSys tems Inc．(St．Louis，Missouri，USA)のような会社から市販されている。これ らの標的化ベクター構築物の代表的な特徴は、２〜４kbのゲノムDNAが、選択可 能なマーカー(例えば、「ネオマイシンカセット」と呼ばれるネオマイシン耐性遺 伝子自身のプロモーターエレメント下の細菌性ネオマイシン耐性遺伝子)の５’ 側に連結されていることである。次いで、目的の遺伝子由来の第２のDNAフラグ メントを、ネオマイシンカセットの下流であるが第２の選択可能なマーカー(例 えば、チミジンキナーゼ)の上流に連結する。ベクターに含まれる配列のいずれ か１つによる内因性配列の相同置換によって、変異体配列が標的化される動物の 生殖系列に導入され得るように、DNAフラグメントは選択される。あるいは、ネ オマイシンカセットを取り囲むベクターの左のアームと右のアームの間に通常存 在する配列の欠失を引き起こすために、配列は選択され得る。前者はノックイン として知られ、後者はノックアウトとして知られる。さらに、特に、神経変性性 疾患に関連する遺伝子を含む遺伝子の標的化されたノックアウトのために、無数 のモデル系が作製された(例えば、Zhengら、1995によるマウスAPP遺伝子の標的 化された欠失；Buelerら、1996による成人発症性ヒトCNS変性に関連するマウス プリオン遺伝子の標的化された欠失)。 最終的に、トランスジェニック動物(変異もしくは不活化したプレセニリン遺 伝子または変異もしくは不活化したPS相互作用タンパク質遺伝子を有する動物を 含む)の等価物は、配偶子の化学的変異誘発またはＸ線変異誘発とその後の受精 を使用して作製され得る。本明細書中に開示されるかまたはそうでなければ可能 とされる単離された核酸を使用して、当業者は、得られた子孫を、例えば、変異 体を検出するための直接的配列決定RFLP、PCR、もしくはハイブリダイゼーショ ン分析、または用量により１つの対立遺伝子の欠失を実証するためのサザンブロ ッティングによって、より迅速にスクリーニングし得る。 ６．PS相互作用タンパク質発現に影響を与える薬物についてのアッセイ 別の一連の実施態様において、本発明は、PS相互作用遺伝子およびタンパク質 (例えば、S5aまたはGT24)の発現を誘導または阻害し得る低分子または他の化合 物を同定するためのアッセイを提供する。このアッセイを、非形質転換細胞、不 死化細胞株、もしくは組換え細胞株を使用してインビトロで実施し得るか、また は本明細書中で可能になったトランスジェニック動物モデルを使用してインビボ で実施し得る。 詳細には、本アッセイは、増大または減少したmRNA発現(例えば、本明細書中 に開示されそして可能にされる核酸プローブを用いて)、PS相互作用タンパク質 の増大または減少したレベル(例えば、本明細書中に開示されそして可能にされ る抗PS相互作用タンパク質抗体を用いて)、または組換え構築物においてPS相互 作用タンパク質5'調節領域に作動可能に連結されたマーカー遺伝子(例えば、β- ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ)の増大または減少した発現のレベルに 基づくS5a、GT24、p0071、Rab11、または他のPS相互作用遺伝子もしくはタンパ ク質の増大または減少した発現の存在を検出し得る。 従って、例えば、特定のPS相互作用タンパク質を発現することが知られる細胞 を培養し得、そして１つ以上の試験化合物の培養培地に添加し得る。化合物がPS 相互作用タンパク質発現を誘導または阻害するに十分な時間(例えば、０〜72時 間)を経た後、発現レベルにおける確立されたベースラインからのいかなる変化 も、上記および当該分野で周知の任意の技術を使用して検出し得る。特に好まし い実施態様において、細胞は、ヒト神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、またはハイ ブリドーマ細胞株のような不死化細胞株由来である。本明細書中で開示されそし て可能になった核酸プローブおよび/または抗体を使用して、PS相互作用タンパ ク質の発現における変化の検出、従って、PS相互作用タンパク質発現のインデュ ーサーまたはリプレッサーとしての化合物の同定は、日常的な実験しか必要とし ない。 特に好ましい実施態様において、レポーター遺伝子(例えば、β−ガラクトシ ダーゼ、グリーン蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラ ーゼ)がPS相互作用タンパク質遺伝子の5'調節領域に作動可能に連結される組換 えアッセイが用いられる。好ましいベクターは、Green Lantern 1ベクター(GIBC O/BRL，Gaithersburg，MD)およびGreat EScAPe pSEAPベクター(Clontech，Palo Alto)である。PS相互作用タンパク質調節領域は、これらの遺伝子由来のコード 領域の本開示に照らして、当業者により容易に単離およびクローン化され得る。 レポーター遺伝子および調節領域は、レポーター遺伝子の転写および翻訳がPS相 互作用タンパク質調節エレメントの制御下で進行し得るように、インフレーム( または３つの可能なリーディングフレームの各々)で結合される。次いで、組換 え構築物は、任意の適切な細胞株に導入され得るが、哺乳動物細胞株が好ましく 、そしてヒト細胞が最も好ましい。形質転換された細胞は培養において増殖され 、そしてレポーター遺伝子の発現のベースラインレベルの樹立の後に、試験化合 物が培地中に添加され得る。レポーター遺伝子の発現の検出の容易さは、PS相互 作用タンパク質遺伝子のインデューサーおよびリプレッサーの同定のための迅速 な、高スループットアッセイを提供する。 この方法により同定された化合物は、インビボでのPS相互作用タンパク質遺伝 子の発現の改変における潜在的利用性を有する。これらの化合物は、本明細書中 に開示されそして可能にされた動物モデルにおいて、最も強力なインビボ効率を 有するこれらの化合物を同定するためにさらに試験され得る。さらに、PS相互作 用タンパク質への結合活性を有する小分子に関して本明細書中に記載されるよう に、これらの分子は、例えば、化合物を経時的改変、分子モデリング、および合 理的薬物設計において用いられる他の日常手順に曝すことによる医薬品のさらな る開発のために「リード化合物」として作用し得る。 ７．PS相互作用タンパク質結合能力を有する化合物の同定 本開示に照らして、当業者はPS相互作用タンパク質に結合するまたはそうでな ければ直接相互作用するタンパク質および他の化合物の同定に有用である、新し いスクリーニング方法論を行うことを可能にし得る。タンパク質および化合物は 、インビボでPS相互作用タンパク質と相互作用し、従って、薬学的および治療的 介入のための新たな標的を提供する内因性細胞成分、ならびにPS相互作用タンパ ク質結合能力を有し得、従って、薬学的薬剤についての候補であり得る、組換え 、合成、およびそうでなければ内因性の化合物を含む。従って、一連の実施例に おいて、細胞溶解物または組織ホモジェネート(例えば、ヒト脳ホモジネート、 リンパ球溶解物)を、正常または変異体PS相互作用タンパク質の１つに結合する タンパク質または他の化合物についてスクリーニングし得る。あるいは、任意の 種々の内因性化合物(天然に存在するおよび/または合成の両方(例えば、低分子 またはペプチドのライブラリー))は、PS相互作用タンパク質結合能力についてス クリーニングされ得る。低分子はこの意味で特に好ましい。なぜなら、それらは 経口投与後により容易に吸収され、より少ない潜在的抗原決定基を有し、そして /あるいは核酸またはタンパク質のようなより大きい分子よりも、血液脳関門を より横断しそうであるからである。本発明の方法は、それらを用いて、(正常形 態よりはむしろ)PS相互作用タンパク質の変異体形態に選択的または優先的に結 合し、従って、PS相互作用タンパク質における変異によって生じるADの患者(cas e)の処置において特定の有用性を有し得る分子を同定し得る点で特に有用である 。 一旦上記の方法によって同定されると、次いで、候補化合物は薬学的投与また は試験のために十分な量で(例えば、μgまたはmgまたはより大きい量)で生産さ れ得、そして薬学的に受容可能なキャリア(例えば、Remington's Pharmaceutica l Sciences ，Gennaro，A.編，Mack Pub.，1990を参照のこと)中に処方され得る 。次いで、これらの候補化合物は、本発明の形質転換された細胞、本発明のトラ ンスジェニック動物モデル、動物モデルまたはヒト患者由来の細胞株、またはア ルツハイマー患者に投与され得る。本明細書中に記載されそして実施可能にされ た動物モデルは、それらの治療効力について正常または変異体PS相互作用タンパ ク 質に結合する候補化合物をさらに試験するのに特に有用である。 さらに、一旦上記の方法によって同定されると、候補化合物は、新たな医薬の 設計および開発において「リード化合物」としても作用し得る。例えば、当該分野 で周知であるように、低分子の連続的な改変(例えば、ペプチドについてのアミ ノ酸残基置換；ペプチドまたは非ペプチド化合物での官能基置換)は、新たな医 薬の開発のための、医薬産業における標準的なアプローチである。一般に、この ような開発は、所望の医薬の活性(例えば、PS相互作用タンパク質結合能力また はブロック能力)のうちの少なくともいくつかを有することが示されている「リー ド化合物」から進行する。特に、目的の少なくともいくつかの活性(例えば、PS相 互作用タンパク質活性の調節)を有する１以上の化合物が同定されている場合、 分子の構造的比較は、保存されているはずであるリード化合物の部分、および新 たな候補化合物の設計において変化され得る部分を示唆することによって、当業 者に大いに情報を与え得る。従って、本発明は、順次に改変され得、アルツハイ マー病の処置における使用のための新たな候補化合物を生成するリード化合物を 同定する手段も提供する。次いで、これらの新たな化合物は、PS相互作用タンパ ク質への結合/およびまたはPS相互作用タンパク質ブロック活性について(例えば 、上記の結合アッセイにおいて)、および治療効力について(例えば、本明細書に 記載の動物モデルにおいて)の両方で試験され得る。この手順は、所望の治療活 性および/または効力を有する化合物が同定されるまで、反復され得る。 この一連の実施態様の各々において、アッセイを行って、「PS相互作用タンパ ク質成分」といくつかの他の部分との間の結合を検出する。特に有用なのは、連 続的なアッセイであり、ここで、化合物は、結合アッセイにおいて、PS相互作用 タンパク質のPS相互作用タンパク質ドメインの正常形態のみまたは変異体形態の みに結合する能力について試験される。このような化合物は、以下により完全に 記載するように、最大の治療的有用性を有すると予測される。これらのアッセイ における「PS相互作用タンパク質成分」は、PS相互作用タンパク質の完全に正常な 形態または変異体形態(例えば、S5a、GT24、p0071、Rab11など)であり得るが、 そうである必要はない。むしろ、PS相互作用タンパク質の特定の機能的ドメイン 、特に上記のようなPS相互作用ドメインは、別々の分子としてまたは融合タンパ ク 質の一部としてのいずれかで用いられ得る。例えば、これらの機能的ドメインと 相互作用するタンパク質または化合物を単離するために、融合構築物および/ま たはこれらの領域に対応する合成ペプチドを用いてスクリーニングを行い得る。 従って、S5aについて、配列番号２の70〜377アミノ酸におおよそ対応する配列( クローンY2H29およびクローンY2H31に含まれる、実施例１を参照のこと)、配列 番号２の206〜377アミノ酸におおよそ対応する配列(これは、タンパク質-タンパ ク質相互作用モチーフを含む、Ferrellら、1996を参照のこと)、または目的の他 の任意のS5aドメインを含むGST-融合ペプチドが作製され得る。同様に、GT24に ついて、配列番号４の440〜815アミノ酸におおよそ対応する配列(アルマジロ反 復セグメントの一部を含む)を含む、GST-、または他の融合ペプチドが産生され 得る。明らかに、融合タンパク質およびPS相互作用タンパク質機能的ドメインの 種々の組合せが可能であって、そしてこれらは例に過ぎない。さらに、例えば、 基材上でのドメインの固定(例えば、スルフヒドリル反応を用いて)を容易にする 、反応性基またはアミノ酸残基(例えば、システイン)を機能的ドメインに導入す ることによって、アッセイを補助し得るように、機能的ドメインを変化し得る。 従って、例えば、ドメインの固定を容易にするためのさらなるＣ末端システイン 残基を含有するS5aのPS相互作用ドメインが合成され得る。このようなペプチド は、アフィニティークロマトグラフィー(Sulfo−link；Pierce)のためのアフィ ニティー基材を作製して、マイクロ配列決定のための結合タンパク質を単離する ために使用される。同様に、改変された残基を用いて、他の機能的ドメインまた は抗原性フラグメントを作製し得る(例えば、実施例４を参照のこと)。 これらの方法によって同定されるタンパク質または他の化合物は、当該分野で 公知の任意の標準的方法によって、精製および特徴付けされ得る。タンパク質は 、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、2D PAGE)またはクロマトグラフィー(例 えば、HPLC)技術を用いて精製および分離され得、次いで、マイクロ配列決定さ れ得る。ブロックされたＮ末端を有するタンパク質については、特定の結合タン パク質の切断(例えば、CNBrおよび/またはトリプシンによる)を用いて、ペプチ ドフラグメントを放出させ得る。HPLCによるさらなる精製/特徴付け、ならびに 従来法によるミクロ配列決定および/または質量分析は、このようなブロックさ れ たタンパク質の内部配列データを提供する。非タンパク質化合物については、標 準的有機化学分析技術(例えば、IR、NMRおよび質量分析；官能基分析；Ｘ線結晶 解析)を用いて、それらの構造および正体(identity)を決定し得る。 細胞溶解物、組織ホモジネート、または低分子ライブラリーを、候補PS相互作 用タンパク質−結合分子についてスクリ-ニングする方法は、当該分野で周知で あり、そして本開示に照らして、今や、それを用いて、正常または変異体PS相互 作用タンパク質成分に結合する、あるいは非特異的尺度(例えば、細胞内Ca²⁺、G TP/GDP比の変化)によって、または特異的尺度(例えば、Aβペプチド産生の変化 またはディファレンシアルディスプレイ、2Dゲル電気泳動、ディファレンシアル ハイブリダイゼーション、またはSAGE方法によってモニターされ得る、他の下流 遺伝子の発現の変化)によって定義される、PS相互作用タンパク質活性を調節す る化合物を同定し得る。好ましい方法は、以下の技術の変形を含む：(１)アフィ ニティークロマトグラフィーによる直接的抽出；(２)免疫沈降によるPS相互作用 タンパク質成分および結合タンパク質または他の化合物の同時単離；(３)Biomol ecular Interaction Assay(BIAcore)；ならびに(４)酵母ツーハイブリッドシス テム。これらおよび他のものを、以下に別々に議論する。 Ａ．アフィニティークロマトグラフィー 本開示に照らして、当該分野で周知の種々のアフィニティー結合技術を用いて 、本明細書において開示されたまたは実施可能にされたPS相互作用タンパク質に 結合するタンパク質または他の化合物を単離し得る。一般に、PS相互作用タンパ ク質成分は、基材(例えば、カラムまたはフィルター)上に固定化され得、そして 試験化合物(単数または複数)を含む溶液を、結合に許容性の条件下でPS相互作用 タンパク質、融合体またはフラグメントと接触させる。次いで、基材を溶液で洗 浄して、結合していないまたは弱く結合した分子を除去する。次いで、第２の洗 浄により、固定化された正常または変異体PS相互作用タンパク質成分に強力に結 合するこれらの化合物を溶出させ得る。あるいは、試験化合物を固定化し得、そ して１つ以上のPS相互作用タンパク質成分を含有する溶液を、カラム、フィルタ ーまたは他の基材と接触させ得る。PS相互作用タンパク質成分が試験化合物に結 合 する能力は、上記のように測定され得るか、またはPS相互作用タンパク質成分の 標識形態(例えば、放射性標識されたまたは化学発色性の機能的ドメイン)を用い て、基材−固定化化合物(単数または複数)への結合をより迅速に評価し得る。 Ｂ．免疫共沈 PS相互作用タンパク質成分およびそれらの関連タンパク質または他の化合物の 単離のための、別の十分に特徴付けられた技術は、抗体を用いる直接的免疫沈降 に関する。この手順は、例えば、多くのシナプス小胞関連タンパク質を単離する ために首尾よく用いられている(PhizickyおよびFields，1994)。従って、正常ま たは変異体、遊離または膜結合のいずれかのPS相互作用タンパク質成分を、結合 に許容性の条件下で候補化合物(単数または複数)と溶液中で混合し得、そしてPS 相互作用タンパク質成分を免疫沈降させ得る。次いで、PS相互作用タンパク質成 分と免疫共沈するタンパク質または他の化合物を、上記のような標準的な技術に よって同定し得る。免疫沈降のための一般的技術は、例えば、HarlowおよびLane (1988)，Antibodies ：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NYに見出され得る。 このアッセイにおいて使用される抗体は、本明細書において記載されそして実 施可能にされるように、ポリクーナルまたはモノクローナルであり得、そして種 々の抗体フラグメント(例えば、Fab、F(ab')₂)および単鎖抗体などを含む。 Ｃ．Biomolecular Interaction Assay 結合タンパク質の検出および単離のための別の有用な方法は、Pharmacia Bios ensorによって開発され、そして製造者のプロトコルに記載されている(LKB Pha rmacia,スウェーデン)Biomolecular Interaction Assay、すなわち「BIAcore」シ ステムである。本開示に照らして、当業者は、今や、このシステム、または実質 的な等価物を使用して、PS相互作用タンパク質結合能力を有するタンパク質また は他の化合物を同定し得る。BIAcoreシステムは、アフィニティー精製抗GST抗体 を用いて、GST融合タンパク質をセンサーチップ上に固定化する。明らかに、他 の融合タンパク質および対応する抗体は、置換され得る。センサーは、屈折率の 変化を検出する光学的現象である表面プラズモン共鳴を利用する。目的の組織の ホモジネートを固定化融合タンパク質に通し、そしてタンパク質−タンパク質相 互作用を屈折率の変化として記録する。このシステムを用いて、結合の反応速度 を測定し得、そして全ての観察された結合が生理学的関連であるか否かを評価し 得る。 Ｄ．酵母ツーハイブリッドシステム 酵母「ツーハイブリッド」システムは、２つの物理的に分離可能な、機能的ドメ インからなる転写因子を利用する(PhizickyおよびFleld，1994)。最も一般に使 用されるのは、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインよりなる酵母GAL4転 写アクチベーターである。２つの異なるクローニングベクターを用いて、潜在的 な結合タンパク質をコードする遺伝子に対するGAL4ドメインの別々の融合体を生 じさせる。融合タンパク質を同時発現させ、核に標的化し、そしてもし相互作用 が起これば、レポーター遺伝子(例えば、lacZ)の活性化により検出可能な表現型 を生じる。例えば、Clontech Matchmaker System-2を、PS相互作用タンパク質-G AL4結合性ドメイン融合クローンを用いて、clontech脳cDNA GAL4活性化ドメイン 融合ライブラリーとともに用い得る(Clontech，Palo Alto，CA)。本明細書にお ける開示に照らして、当業者は、今や、PS相互作用タンパク質の正常または変異 体機能的ドメインのいずれかを含む融合体を含む、種々のPS相互作用タンパク質 融合体を生産し、そしてPS相互作用タンパク質結合タンパク質を同定するために このような融合ライブセリーをスクリーニングすることが実施可能である。 Ｅ．他の方法 これらの核酸の変異体形態および正常形態の両方、ならびにそれらの対応する タンパク質を含むヌクレオチド配列およびタンパク質産物を、上記技術とともに 用いて、他の相互作用性タンパク質を単離し、そしてその発現が正常PS相互作用 タンパク質配列の過剰発現によって、正常PS相互作用タンパク質配列の過小発現 によって、または変異体PS相互作用タンパク質配列の発現によって変化される他 の遺伝子を同定し得る。これらの他の相互作用性タンパク質の同定、およびその 発現レベルがADにおいて変化している他の遺伝子の同定により、その臨床的また は病理学的形態においてこの疾患の病状に対して直接的関連を有する他の遺伝子 標的が同定される。詳細には、それ自体がアルツハイマー病を引き起こす他の変 異の部位であり得る、あるいはこの疾患のための潜在的処置としてそれ自体が治 療的に標的化され得る(例えば、それらの発現レベルを正常まで低下させるため 、またはそれらの過剰発現の影響を薬理学的にブロックするために)、他の遺伝 子が同定される。詳細には、これらの技術は、PCRに基づくおよび/またはハイブ リダイゼーションに基づく方法に依存して、２つの条件(変異体PS相互作用タン パク質配列を発現する同一細胞型と比較しての、正常PS相互作用タンパク質を発 現する細胞株)の間でディファレンシャルに発現される遺伝子を同定する。これ らの技術は、ディファレンシャルディスプレイ、遺伝子発現の連続的分析(SAGE) 、およびタンパク質2D−ゲルの質量分析、およびサブトラクティブハイブリダイ ゼーションを含む(Nowak，1995およびKahn，1995に概説される)。 当業者に明白なように、正常または変異体PS相互作用タンパク質成分に結合す る分子を同定するための、個々のタンパク質または他の化合物、あるいはタンパ ク質または他の化合物の大きなライブラリー(例えば、Stratagene，La Jolla,CA からのファージディスプレイライブラリーおよびクローニングシステム)をスク リーニングする多数の他の方法が存在する。これらの方法の全ては、正常または 変異体PS相互作用タンパク質、融合体、またはフラグメントを試験化合物と混合 し、結合させ(もしあれば)、そして結合複合体についてアッセイする工程を包含 する。全てのこのような方法が、今や、実質的に純粋なPS相互作用タンパク質、 実質的に純粋なPS相互作用機能的ドメインフラグメント、PS相互作用タンパク質 融合タンパク質、PS相互作用タンパク質抗体、およびそれらを作製および使用す る方法の本開示によって、実施可能にされる。 ８．PS相互作用タンパク質の相互作用崩壊 プレゼニリンとの、または他のタンパク質とのPS相互作用タンパク質の特定の 相互作用を崩壊させる能力は、潜在的に大きな治療的価値があり、そしてADの病 因学の理解および治療のためのさらなる標的の同定において重要である。PS相互 作用タンパク質の相互作用を崩壊させる化合物を同定するために使用する方法は 、正常または変異体PS相互作用タンパク質のいずれかが関与する相互作用にも同 じように適用され得る。 PS相互作用タンパク質の相互作用を崩壊させ得る化合物についてのアッセイは 、当該分野に周知の任意の種々の方法により実施され得る。本質的には、このよ うなアッセイはPS相互作用タンパク質に対して結合活性を有するタンパク質およ び化合物の同定のためのこれらのアッセイと平行する。従って、一旦PS相互作用 タンパク質への結合活性を有する化合物が任意の方法により同定されると、相互 作用を崩壊させる化合物を同定するための候補化合物の存在下で、その方法また は等価な方法が実施され得る。従って、例えば、アッセイは、(1)アフィニティ クロマトグラフィー；(2)免疫沈降；(3)Biomolecular Interaction Assay(BIAco re)；または(4)酵母ツーハイブリッドシステムを含む方法を用い得る。このよう なアッセイは、精製された正常または変異体PS相互作用タンパク質のいずれか、 および/または正常もしくは変異体の精製された結合タンパク質のいずれか(例え ば、正常または変異体プレシニリン)を用いて開発され得る。 アフィニティ方法については、PS相互作用タンパク質またはその結合パートナ ーのいずれかがマトリックス(例えば、カラム中)に固定され得、次いで対応物タ ンパク質(例えば、プレセニリンまたは別の結合パートナーがマトリックスに固 定される場合はPS相互作用タンパク質；もしくはPS相互作用タンパク質がマトリ ックスに固定される場合はプレセニリンまたは他の結合パートナー)は候補化合 物(単数または複数)の添加前または後のいずれかに、固定されたタンパク質/化 合物に曝される。候補化合物の崩壊効果の非存在下では、PS相互作用タンパク質 とその結合パートナーとの間の相互作用は、対応物タンパク質が固定したタンパ ク質に結合することを生じる。相互作用を崩壊させる任意の化合物は、マトリッ クスからの対応物タンパク質の放出を生じる。マトリックスからの対応物タンパ ク質の放出は、当該分野に公知の方法を用いて測定され得る。 酵母ツーハイブリッドシステムにより検出され得るPS相互作用タンパク質の相 互作用について、これらのアッセイはまた、相互作用を崩壊させる化合物を同定 するために用いられ得る。簡潔には、PS相互作用タンパク質およびその結合パー トナー(または各々の適切な構造ドメイン）は、そのシステムの融合タンパク質 に用いられ、そして細胞はレポーター遺伝子の発現における候補化合物の効果を 決定するために候補化合物に曝露される。レポーター遺伝子の適切な選択により 、このような系は、化合物の巨大ライブラリーの高スループットスクリーニング (例えば、培地中に存在する抗生物質に耐性を与えるレポーター遺伝子を用いる こと、または最少培地中で増殖する栄養要求株をレスキューするレポーター遺伝 子を用いることによる)のために容易に適用され得る。 これらのアッセイは、多数の異なるタイプの化合物を、PS相互作用タンパク質 の相互作用におけるそれらの崩壊効果についてスクリーニングするために使用さ れ得る。例えば、化合物は合成分子のライブラリーに属し得るか、または相互作 用を崩壊させるように特異的に設計され得る。化合物はまた、いずれかのタンパ ク質の相互作用ドメインに対応するペプチドであり得る。このタイプのアッセイ は、あるPS相互作用タンパク質改変体と所定の結合パートナーとの間の特異的な 相互作用を崩壊させる化合物を同定するために使用され得る。さらに、PS相互作 用タンパク質のすべての相互作用を崩壊させる化合物が同定され得る。例えば、 PS相互作用タンパク質の折り畳みを特異的に崩壊させる化合物は、PS相互作用タ ンパク質と他のタンパク質との間の全ての相互作用を崩壊させることが予想され る。あるいは、このタイプの崩壊アッセイは、異なるPS相互作用タンパク質の相 互作用のある範囲のみを崩壊させる、またはPS相互作用タンパク質の相互作用の １つのみを崩壊させる化合物を同定するために使用され得る。 ９．PS相互作用タンパク質活性を調節する化合物を同定する方法 別の一連の実施態様において、本発明は、正常および変異体PS相互作用の活性 を調節する能力を有する化合物を同定する方法を提供する。この一連の実施態様 に関して用いられる、用語「活性」は、遺伝子およびタンパク質発現、PS相互作用 タンパク質の翻訳後プロセシング、トラフィッキングおよび局在化、ならびに任 意の機能的活性(例えば、酵素、レセプター−エフェクター、結合、チャンネル の)、ならびに任意のこれらの下流影響を広く含む。アルツハイマー病は、長形 態のAβペプチドの生産の増大、アミロイド斑および神経細線維もつれの出現、 認識機能の低下、およびアポトーシス細胞死に関連することが知られている。従 って、本発明の形質転換された細胞およびトランスジェニック動物モデル、正常 もしくは変異体PS相互作用タンパク質遺伝子を有する被験体または天然に存在す る正常もしくは変異体PS相互作用タンパク質を有する動物もしくはヒトの被験体 から得られた細胞を用いて、今や、正常または変異体のPS相互作用タンパク質の 発現の１つ以上のこれらの機能的特徴または表現型の出現における変化を検出す ることによって、候補医薬および処置を、それらの治療的効果についてスクリー ニングすることが可能である。 従って、本発明は、細胞をインビボまたはインビトロで候補化合物と接触させ 、そして正常または変異体PS相互作用タンパク質活性に関連したマーカーの変化 についてアッセイすることによって、PS相互作用タンパク質活性を調節するタン パク質、低分子、または他の化合物をスクリーニングまたはアッセイする方法を 提供する。PS相互作用タンパク質活性に関連したマーカーは、PS相互作用タンパ ク質発現に関連する、任意の測定可能な生物学的、生理学的、組織学的、および /または挙動的特徴であり得る。特に、有用なマーカーは、それらの正常な対応 物から、少なくとも１つの変異体プレセニリンまたは変異体PS相互作用タンパク 質遺伝子を有する細胞、組織、動物、または個体を区別する、任意の測定可能な 生物学的、生理学的、組織学的、および/または挙動的特徴を含む。さらに、マ ーカーは、任意のプレセニリンまたはPS相互作用タンパク質活性の特異的または 非特異的尺度であり得る。PS相互作用タンパク質特異的尺度は、本発明の核酸プ ローブまたは抗体を使用し得る、PS相互作用タンパク質発現の尺度(例えば、PS 相互作用タンパク質mRNAまたはタンパク質レベル)を含む。非特異的尺度は、cyt osensor microphysiometer(Molecular Devices Inc.,United States)のようなデ バイスでモニターされ得る、pH、細胞内カルシウム、サイクリックAMPレベル、G TP/GDP比、ホスファチジルイノシトール活性、タンパク質リン酸化などのような 細胞生理学の変化を含む。その変異体形態または正常形態におけるPS相互作用タ ンパク質活性の活性化または阻害はまた、アルツハイマー病に至るPS相互作用タ ンパク質経路に特異的な他の遺伝子(例えば、プレセニリン)の発現の変化を検討 することによってモニターされ得る。これらは、ディファレンシャルディスプレ イ、 ディファレンシャルハイブリダイゼーション、およびSAGE(遺伝子発現の連続的 分析)のようなこのような技術によって、ならびに細胞溶解物の二次元ゲル電気 泳動によって、アッセイされ得る。各場合において、ディファレンシャルに発現 される遺伝子は、候補化合物の適用の前後の同一の研究の点検によって確認され 得る。さらに、他所で記載するように、その発現が候補化合物の投与によって調 節される特定の遺伝子は、クローニング、ヌクレオチド配列決定、アミノ酸配列 決定、または質量分析によって確認され得る(Nowak，1995に概説される)。 一般に、細胞を候補化合物と接触させ、そして適切な期間の後(例えば、培養 細胞のほとんどの生化学的尺度については０〜72時間)、プレセニリンまたはPS 相互作用タンパク質活性のマーカーをアッセイし、そしてベースライン測定値と 比較し得る。ベースライン測定は、細胞と候補化合物との接触の前に行われ得、 または他の実験によって確立されたかもしくは当該分野で公知の外部ベースライ ンであり得る。細胞は、本発明の形質転換された細胞であり得るか、または動物 もしくは個体由来の外植片であり得る。特に、細胞は、プレセニリンまたはPS相 互作用タンパク質変異のキャリア(例えば、アルツハイマー病を有するヒト被験 体)または本発明の動物モデル(例えば、変異体プレセニリンまたはPS相互作用タ ンパク質遺伝子を有するトランスジェニック線虫またはマウス)由来の外植片で あり得る。Aβ経路に対するプレセニリンまたはPS相互作用タンパク質変異の効 果を増大させるためには、増加したＡβ産生を有するトランスジェニック細胞ま たは動物が使用され得る。好ましい細胞は、ニューロン細胞、神経膠細胞または 混合細胞の培養物のような神経組織；および培養線維芽細胞、肝臓、腎臓、脾臓 、または骨髄由来の細胞を含む。細胞は、インビトロにおいて培養物中の候補化 合物と接触され得るか、またはインビボにおいて生存動物もしくはヒト被験体に 投与され得る。生存動物またはヒト被験体については、試験化合物を経口または 化合物に適切な任意の非経口経路によって投与し得る。ヒト被験体の臨床試験に ついては、測定は数ヶ月または数年の間定期的に(例えば、毎日、毎週、または 毎月)行い得る。 特定の遺伝子において変異を有するほとんどの個体はその遺伝子座についてヘ テロ接合型である(すなわち、１つの正常および１つの変異体対立遺伝子を有す る)ので、化合物を正常および変異体のプレセニリンまたはPS相互作用タンパク 質活性を調節するそれらの能力について試験し得る。従って、例えば、正常プレ セニリンまたはPS相互作用タンパク質の機能を増強する化合物は、アルツハイマ ー病または関連する障害の処置において有用性を有し得る。あるいは、ヘテロ接 合型個体における遺伝子の正常および変異体コピーの両方の活性の抑制は、関連 疾患の進行よりも低い重篤度の臨床的結果を有し得るので、全ての形態のプレセ ニリン、PS相互作用タンパク質、またはそれらの相互作用物を不活化または抑制 する化合物を同定することが所望され得る。しかし、好ましくは、正常プレセニ リンまたはPS相互作用タンパク質の対応物の機能を破壊することなく、それらの タンパク質の活性を選択的または特異的に不活化または抑制する化合物が同定さ れる。 本発明のPS相互作用タンパク質の遺伝子およびタンパク質、PS相互作用タンパ ク質の核酸プローブおよび抗体、ならびにPS相互作用タンパク質で形質転換され た細胞およびトランスジェニック動物の本明細書中における同定、特徴付け、お よび開示に照らして、当業者は、今や、候補化合物によってプレセニリンおよび /またはPS相互作用タンパク質活性の調節を検出する非常に多様なアッセイを行 うことが実施可能である。特に好ましいそして意図される実施態様は、以下にい くぶん詳しく議論される。 Ａ．PS相互作用タンパク質発現 一連の実施態様において、PS相互作用タンパク質発現の特異的な測定が、プレ セニリン活性に影響を与えるそれらの能力について候補化合物をスクリーニング するために使用される。従って、本明細書において開示された、そして実施可能 にされたPS相互作用タンパク質の核酸および抗体を用いて、mRNAレベルまたはタ ンパク質レベルを、PS相互作用タンパク質活性を調節する候補化合物の能力につ いてマーカーとして使用し得る。このようなプローブおよび抗体の、遺伝子およ びタンパク質発現を測定するための使用は当該分野で周知であり、そして本明細 書中の他所で議論される。特に目的とするのは、PS相互作用タンパク質の異なる 変異体(例えば、変異体および正常体)の相対的レベルを変化させ得る化合物の同 定であり得る。 Ｂ．細胞内局在化 別の一連の実施態様において、PS相互作用タンパク質のトラフィッキングおよ び細胞内局在化に対するこれらの効果に基づいて、PS相互作用タンパク質の活性 を調節するそれらの能力について、化合物をスクリーニングし得る。プレセニリ ンおよびいくつかのPS相互作用タンパク質(例えば、S5a)は免疫細胞化学的に、 小胞体およびゴルジ装置と会合する膜構造に局在化することが観察されている。 従って、変異体および正常のプレセニリンまたはPS相互作用タンパク質の局在化 の差異は、アルツハイマー病および関連する疾患の病因に寄与し得る。従ってこ れらのタンパク質の局在化に影響し得る化合物は、潜在的治療剤として同定され 得る。当該分野で公知の標準的技術を用いて、プレセニリンおよびPS相互作用タ ンパク質の局在化を検出し得る。一般に、これらの技術は、本発明の抗体、特に １つ以上の変異体PS相互作用タンパク質に選択的に結合するが、正常タンパク質 には選択的に結合しない抗体を使用する。当該分野で周知のように、このような 抗体は、これらのタンパク質の細胞内位置を可視化することを補助するために、 任意の種々の技術(例えば、蛍光または放射性タグ、標識二次抗体、アビジン− ビオチンなど)によって標識され得る。当該分野で公知のように、PS相互作用タ ンパク質は、これらの構造のマーカーに対する抗体(例えば、ゴルジに対するTGN 38、ゴルジ後輸送小胞に対するトランスフェリンレセプター、リソソームに対す るLAMP2)を用いて、特定の構造に同時に局在化(co−localize)され得る。異なる 細胞内膜結合オルガネラ(例えば、リソソーム、シナプトソーム、ゴルジ)につい ての富化された細胞溶解物由来の精製画分のウェスタンブロットもまた使用され 得る。 Ｂ．イオン調節/代謝 別の一連の実施態様において、化合物を、細胞内Ca²⁺、Na⁺またはK⁺レベル、 あるいは代謝における測定に基づいて、プレセニリンまたはPS相互作用タンパク 質の活性を調節するそれらの能力についてスクリーニングし得る。上記のように 、 プレセニリンはイオンレセプターまたはイオンチャンネルとして作用し得る、あ るいはそれと相互作用し得る膜会合タンパク質である。従って、インビボまたは インビトロのいずれかでプレセニリンおよびPS相互作用タンパク質関連のカルシ ウムまたは他のイオン代謝を調節するそれらの能力について、例えば、パッチク ランプ、電位クランプまたは細胞内イオンレベルまたは膜貫通電位に感受性の蛍 光色素を用いて、イオンチャンネルフラックスおよび/または膜貫通電位および/ または電流フラックスの測定によって、化合物をスクリーニングし得る。イオン チャンネルまたはレセプター機能はまた、サイクリックAMP、cGMPチロシンキナ ーゼ、リン酸、細胞内Ca²⁺レベルの増加などのようなセカンドメッセンジャーの 活性化の測定によってアッセイされ得る。また、組換えにより作製されたタンパ ク質を人工膜系中に再構築して、イオンチャンネルコンダクタンスを研究し得、 そして従って、このようなアッセイで使用される「細胞」は人工膜または細胞を含 み得る。イオン調節または代謝の変化についてのアッセイは、内因性正常または 変異体のプレセニリンおよびPS相互作用タンパク質を発現する培養細胞について 行われ得る。このような研究を、正常形態または変異体形態の、プレセニリンも しくはPS相互作用タンパク質の１つを、またはプレセニリンもしくはPS相互作用 タンパク質の１つの機能的ドメインを発現し得るベクターでトランスフェクトさ れた細胞について行い得る。さらに、このようなアッセイにおいて測定されたシ グナルを増強させるために、細胞をイオンチャンネルタンパク質をコードする遺 伝子で同時トランスフェクトし得る。例えば、Xenopus卵母細胞またはラット腎 臓(HEK293)細胞を、ラット脳Na⁺β1サブユニット、ウサギ骨格筋Ca²⁺β1サブユ ニット、またはラット心臓K⁺β1サブユニットをコードする配列で同時トランス フェクトし得る。プレセニリンまたはPS相互作用タンパク質媒介性イオンチャン ネル活性の変化は、例えば、卵母細胞における2-微小電極電気クランプ記録によ って、HEK293細胞における全細胞パッチクランプ記録によって、もしくは等価の 手段によって測定され得る。 Ｃ．アポトーシスまたは細胞死 別の一連の実施態様において、化合物を、プレセニリンまたはPS相互作用タン パク質関連アポトーシスもしくは細胞死におけるそれらの効果に基づき、プレセ ニリンまたはPS相互作用タンパク質の活性を調節するそれらの能力についてスク リーニングし得る。従って、例えば、アポトーシスまたは細胞死のベースライン 率を、培養物中の細胞について確立し得るか、または特定の年齢におけるニュー ロン損失のベースライン度を、動物モデルまたはヒト被験体について、死後に確 立し得、そしてアポトーシスまたは細胞死を抑制するまたは阻害する候補化合物 の能力を測定し得る。細胞死は標準的な顕微鏡技術(例えば、光学顕微鏡)によっ て測定され得、あるいはアポトーシスは、ヌクレオソームラダーを生じる特徴的 な核形態またはDNAフラグメント化パターンによって、より特異的に測定され得 る(例えば、Gavrieliら，1992；Jacobsonら，1993；Vitoら，1996を参照のこと) 。TUNELも、脳における細胞死を評価するために用いられ得る(例えば、Lassmann ら，1995を参照のこと)。好ましい実施態様において、化合物を、本発明のトラ ンスジェニック動物モデルにおけるニューロン損失を抑制または阻害するそれら の能力について、スクリーニングする。例えば、変異体ヒト、変異体マウス、ま たはヒト化変異体プレセニリンもしくはPS相互作用タンパク質遺伝子を有するト ランスジェニックマウスを使用して、アルツハイマー病に関連する神経変性を遅 延または停止し得る化合物を同定または評価し得る。変異体APP遺伝子を有する 同様のトランスジェニックマウスモデルが、Gamesら(1995)によって最近報告さ れている。 Ｄ．Aβペプチド産生 別の一連の実施態様において、化合物を、APPプロセシングのプレセニリン関 連またはPS相互作用タンパク質関連変化を調節するそれらの能力について、スク リーニングし得る。APPプロセシングにおける差違から生じたいくつかのイソ型 で、Aβペプチドを産生する。Aβペプチドは、散在性および老人性斑において、 およびADを有する被験体の血管において、進行性に沈積するβAPPの39〜43アミ ノ酸の誘導体である。ヒト脳において、AβペプチドはＮおよびＣ末端の両方に おいて不均質である。しかし、いくつかの観察は、完全長形態および、残基42ま たは43で終結する長テールAβペプチドのＮ末端短縮型(すなわち、Aβ1-42/43お よびAβx-42/43)の両方が、残基40で終結するペプチドよりも、ADにおいてより 重要な役割を有することを示唆する。従って、Aβ1-42/43およびABx-42/43は、 老人性斑および散在性斑の両方の初期かつ突出した特徴であるが、残基40で終結 するペプチド(すなわち、Aβ1-40およびAf3x-40)は、成熟斑のサブセットおよび アミロイド性血管に優勢に関連する(例えば、Iwatsuboら，1995；Gravinaら，19 95；Tamaokaら，1995；Podlisnyら，1995を参照のこと)。さらに、長テールイソ 型は、原線維形成に対してより大きい傾向を有し、そしてAβ1-40ペプチドより も神経毒性であると考えられる(Pikeら，1993；Hilbichら，1991)。最後に、βA PP遺伝子のコドン717におけるミスセンス変異は初期発症FADに関連し、冒された 変異キャリアの脳において、冒されたキャリアおよび前症候性キャリアの両方の 末梢細胞および血漿において、ならびにβAPP₇₁₇変異体cDNAでトランスフェクト された細胞株において、長テールAβの過剰産生を生じる(Tamaokaら，1994;Suzu kiら，1994)。 従って、一連の実施態様において、本発明は、正常もしくは変異体プレセニリ ン遺伝子および/または正常もしくは変異体PS相互作用タンパク質遺伝子を発現 する細胞またはトランスジェニック動物における、Aβペプチドの長イソ型の産 生の増大をブロックまたは阻害するそれらの能力について、候補化合物をスクリ ーニングする方法を提供する。特に、本発明は、脳細胞または線維芽細胞のよう な培養哺乳動物細胞が、本明細書に開示された方法に従って形質転換された、あ るいは哺歯類または非ヒト霊長類のようなトランスジェニック動物が、本明細書 に開示される方法によって生産されて、比較的高レベルの正常もしくは変異体プ レセニリンまたはPS相互作用タンパク質を発現する、このような方法を提供する 。任意に、このような細胞またはトランスジェニック動物はまた、βAPPタンパ ク質の正常または変異体形態を比較的高レベルで発現させるように形質転換され 得る。 この一連の実施態様において、候補化合物を細胞株またはトランスジェニック 動物に投与し(例えば、培養物中の細胞の培地に添加することによって；あるい は動物に経口または非経口投与することによって)、そして適切な期間(例えば、 培養物中の細胞については０〜72時間、動物モデルについては数日または数カ 月)の後、生物学的サンプル(例えば、培養物中の細胞由来の細胞培養上清または 細胞溶解物；動物由来の組織ホモジネートまたは血漿)を収集し、そしてAβペプ チドの長イソ型のレベルについて試験する。絶対的な意味(例えば、nMol/ml)に おいてまたは相対的意味(例えば、短Aβイソ型に対する長イソ型の比）において 、ペプチドのレベルを決定し得る。Aβイソ型は、当該分野で公知の任意の手段( 例えば、電気泳動分離および配列決定)によって検出され得るが、好ましくは、 長イソ型に対して特異的な抗体を使用して、Aβ1-42/43またはAf3x-42/43ペプチ ドの絶対的または相対的レベルを測定する。これらの長Aβイソ型の絶対的また は相対的レベルを低下させる(特に、本発明のトランスジェニック動物モデルに おいて)候補医薬または治療は、アルツハイマー病、あるいはプレセニリンもし くはPS相互作用タンパク質における変異によって、またはAPP代謝における他の 異常によって引き起こされる他の障害の処置において治療的有用性を有するよう である。 Ｅ．微小管関連タンパク質のリン酸化 別の一連の実施態様において、候補化合物を、tauのような微小管関連タンパ ク質(MAP)のリン酸化レベルに対する化合物の効果を評価することによって、プ レセニリンまたはPS相互作用タンパク質活性を調節するそれらの能力についてス クリーニングし得る。アルツハイマー病の犠牲者の脳におけるtauおよび他のMAP の異常リン酸化は、当該分野において周知である。従って、MAPの異常リン酸化 を防止するまたは阻害する化合物は、ADのようなプレセニリンまたはPS相互作用 タンパク質関連疾患を治療することにおいて有用性を有し得る。上記のように、 正常または変異体動物または被験体由来の細胞、あるいは本発明の形質転換され た細胞株および動物モデルを使用し得る。好ましいアッセイは、変異体ヒトまた はヒト化変異体プレセニリンまたはPS相互作用タンパク質遺伝子で形質転換され た細胞株または動物モデルを使用する。これらの細胞におけるMAPのベースライ ンリン酸化状態を確立し得、次いで、候補化合物を変異体に関連する過剰リン酸 化を防止、阻害または中和するそれらの能力について試験し得る。MAPのリン酸 化状態は、当該分野で公知の任意の標準的方法によって測定され得るが、好まし くは、リン酸化されたまたはリン酸化されていないエピトープに選択的に結合す る抗体が使用される。tauタンパク質のリン酸化エピトープに対するこのような 抗体は、当該分野において公知である(例えば、ALZ50)。 10．アルツハイマー病についてのスクリーニングおよび診断 Ａ．一般的診断方法 本明細書中で開示されまたは実施可能なPS相互作用遺伝子および遺伝子産物、 ならびにPS相互作用タンパク質由来のプローブ、プライマーおよび抗体は、アル ツハイマー病に関連する対立遺伝子のキャリアのスクリーニング、アルツハイマ ー病の罹患者の診断、ならびに関連する早老性および老人性の痴呆症、精神分裂 病および鬱病のような精神医学的疾患、ならびに脳卒中および脳溢血のような神 経学的疾患(これらの全ては、PS1またはPS2の遺伝子またはAPP遺伝子における変 異を有する症候的ヒト被験体において多かれ少なかれ見られる)のスクリーニン グおよび診断において有用である。アルツハイマー病の危険がある個体(例えば 、家系に存在するADを有する個体)、あるいは危険があることが以前には知られ ていない個体を、種々の技術によって変異体プレセニリン遺伝子またはタンパク 質の存在を検出するためのプローブを用いて日常的にスクリーニングすることが できる。これらの病気の遺伝の症例の診断は、正常なプレセニリンまたはPS相互 作用タンパク質活性の欠損または増加、および/または変異体PS相互作用タンパ ク質によって付与された新しい特定の活性の存在を検出するように設計された機 能的アッセイを含む、本明細書中で開示されそして実施可能な核酸(ゲノム配列 およびmRNA/cDNA配列を含む)、タンパク質、および/または抗体に基づく方法に よって達成することができる。好ましくは、本明細書中で開示されまたは実施可 能であるように、本方法および産物は、ヒトの核酸、タンパク質、または抗体に 基づく。しかし、当業者に明らかなように、ヒト、マウス、C ．elegans、およびDrosophila のような広い種においてさえ、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列 の大きな割合の有意の進化的保存は、当業者に、ヒトまたは他の動物被験体に向 けられた適用についてさえ、有用な核酸、タンパク質、および抗体を産生するた めにPS相互作用タンパク質の非ヒトホモログを使用することを可能とする。従っ て、 本発明の範囲を限定することなく説明を簡単にするために、以下の記載は、PS相 互作用タンパク質および遺伝子のヒトホモログの使用に焦点を当てる。しかしな がら、他の種からの相同配列は、多くの目的のためには同等であることが理解さ れる。 当業者によって認識されるように、本発明の診断方法の選択は、テストすべき 利用可能な生物学的サンプルの性質および必要とされる情報の性質によって影響 される。もちろん、アルツハイマー病は、主として、脳の疾患であるが、脳バイ オプシーは、特に日常的なスクリーニングでは、浸襲的かつ高価な手順である。 それ故、有意なレベルでプレセニリンまたはPS相互作用タンパク質を発現する他 の組織は、サンプルの供給源として好ましくあり得る。 Ｂ．タンパク質に基づくスクリーニングおよび診断 診断アッセイがPS相互作用タンパク質に基づくべき場合、種々のアプローチが 可能である。例えば、診断は、正常タンパク質と変異体タンパク質との電気泳動 移動度における差異をモニターすることによって達成し得る。このようなアプロ ーチは、荷電置換が存在する変異体、あるいは挿入、欠失、または置換の結果得 られたタンパク質の電気泳動移動が有意に変化した変異体を同定するにおいて特 に有用である。あるいは、診断は、正常タンパク質と変異体タンパク質とのタン パク質分解切断パターンの差異、種々のアミノ酸残基のモル比の差異に基づくも のであり得、あるいは遺伝子産物の変化した機能を示す機能的アッセイによるも のであり得る。 好ましい実施態様において、タンパク質に基づく診断は、正常および変異体PS 相互作用タンパク質に結合する抗体の能力の差異を使用する。このような診断テ ストは、正常タンパク質に結合するが変異体タンパク質には結合しない、あるい はその逆である抗体を使用し得る。特に、複数のモノクローナル抗体の各々が、 変異体エピトープに結合し得るアッセイが用いられ得る。テスト被験体から得ら れるサンプルにおける抗変異体抗体の結合のレベル(例えば、放射性標識、ELISA 、または化学ルミネセンスにより可視化される)が、コントロールサンプルへの 結合のレベルと比較され得る。あるいは、正常タンパク質には結合するが変異体 タ ンパク質には結合しない抗体を使用することができ、そして抗体結合のレベルの 減少を用いて、ホモ接合の正常個体を、変異したヘテロ接合体またはホモ接合体 から区別することができる。このような抗体診断は、神経線維の絡みおよびアミ ロイド斑のようなこれらの病気に関連する神経病理学的構造体を含む、生前また は死後に得られるCNS組織のバイオプシーサンプルを用いるインサイチュ免疫組 織化学のために使用し得るか、あるいは脳脊髄液のような液体サンプル、あるい は白血球のような末梢組織を用いて使用し得る。 Ｃ．核酸に基づくスクリーニングおよび診断 診断アッセイがサンプルからの核酸に基づく場合、アッセイは、mRNA、cDNA、 またはゲノムDNAに基づくことができる。サンプルからのmRNAを使用する場合、 多くの考慮が、供給源組織およびオルタナティブスプライシングの可能性に関し てなされる。すなわち、適切な組織供給源が選択されず、またはそれが入手可能 でなければ、転写物の発現はほとんどまたは全くなく、そしてオルタナティブス プライシングの結果、いくつかの情報が失われるか、あるいは解釈が困難となる 。mRNA、cDNA、またはゲノムDNAのいずれをアッセイするかにかかわらず、当該 分野で周知の標準的な方法を用いて、インサイチュまたはインビトロのいずれか で特定の配列の存在を検出することができる(例えば、Sambrookら，(1989)Molec ular Cloning: A Laboratory Manual ，第２版，Cold Spring Harbor Press，Col d Spring Harbor，NYを参照のこと)。しかしながら、一般的には、有核細胞を持 つ任意の組織を調べることができる。 診断のために用いられるゲノムDNAは、血液、組織生検、手術検体、または剖 検材料に存在するもののような身体細胞から得ることができる。DNAを単離し、 そして特異的配列の検出に直接使用するか、あるいは分析に先立って、ポリメラ ーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅することができる。同様に、RNAまたはcDNAはま た、PCR増幅と共にまたはそれなしで用いることができる。特異的な核酸配列を 検出するに、直接的ヌクレオチド配列決定、特異的オリゴヌクレオチドを用いる ハイブリダイゼーション、制限酵素消化およびマッピング、PCRマッピング、RNa seプロテクション、化学的ミスマッチ切断、リガーゼ媒介検出、および種々の他 の方法が使用できる。特定の配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドを化学的 に合成し、放射性または非放射性標識(例えば、ビオチンタグ、エチジウムブロ ミド)し、そして(例えば、ドットブロットまたは電気泳動後にゲルからの転写に より)膜または他の固体支持体に固定化された、あるいは溶液中の個々のサンプ ルにハイブリダイズさせることができる。次いで、標的配列の存在または不存在 を、オートラジオグラフィー、フルオロメトリー、または比色法のような方法を 用いて可視化することができる。これらの手順は、高密度でシリコンチップに固 定化された既知配列の縮重した短いオリゴヌクレオチドを用いて自動化できる。 (１)適切なプローブおよびプライマー ハイブリダイゼーション、RNaseプロテクション、リガーゼ媒介検出、PCR増幅 、または本明細書中に記載されそして当該分野で周知の任意の他の標準的な方法 のいずれにせよ、本明細書中で開示されまたは実施可能なPS相互作用タンパク質 配列の種々のサブ配列は、プローブおよび/またはプライマーとして有用である 。これらの配列またはサブ配列は、正常な配列および有害な変異体配列の両方を 含む。一般に、有用な配列は、イントロン、エキソン、またはイントロン/エキ ソン境界からの、少なくとも８〜９、より好ましくは１０〜５０、そして最も好 ましくは１８〜２４の連続するヌクレオチドを含む。標的配列、必要な特異性、 および将来の技術開発に応じて、より短い配列もまた有用性を有し得る。従って 、PS相互作用タンパク質配列を単離し、クローン化し、増幅し、同定し、または 操作するのに使用される任意のPS相互作用タンパク質由来の配列は、適切なプロ ーブまたはプライマーとみなすことができる。有用と特に考えられるのは、疾患 原因の変異が存在することが知られているPS相互作用タンパク質遺伝子のヌクレ オチド位置を含む配列、あるいはこれらの位置に隣接する配列である。 (２)ハイブリダイゼーションスクリーニング 正常または変異体PS相互作用タンパク質関連核酸配列のインサイチュ検出には 、標準的な技術によって組織のサンプルを調製することができ、次いで、１つ以 上の前記のプローブ、好ましくは検出を容易とするために標識されたプローブと 接 触させ、そして核酸ハイブリダイゼーションのためのアッセイを、プローブと高 度にまたは完全に相補的な配列との間でのみハイブリダイゼーションを可能とす るストリンジェントな条件下で行う。現在までに検出されたPS1およびPS2の変異 のほとんどは、１つのヌクレオチド置換よりなるので、高いストリンジェンシィ ーのハイブリダイゼーション条件が、多くの変異体配列から正常配列を区別する のに必要である。被験体の親のPS相互作用タンパク質遺伝子型が知られている場 合、それに従ってプローブを選択することができる。あるいは、種々の変異体に 対するプローブを、連続的または組み合わせて使用することができる。PS相互作 用タンパク質に変異を有するほとんどの個体はヘテロ接合性であるので、正常配 列に対するプローブも使用することができ、そしてホモ接合の正常個体を、結合 の量(例えば、放射能シグナルの強度により)によって変異体ヘテロ接合体から区 別することができる。別の変形において、競台結合アッセイを使用することがで きる。この場合、正常および変異体の両方のプローブを使用するが、１つのみを 標識する。 (３)制限マッピング 配列の変化をまた用いて、適切な酵素消化、続いてのゲル−ブロットハイブリ ダイゼーションの使用によって明らかにされる偶発的な制限酵素認識部位が生成 または破壊され得る。部位を有するDNA断片(正常または変異体)は、サイズおけ るその増加または減少によって、あるいは対応する制限断片数の増加または減少 によって検出される。このような制限断片長多型分析(RFLP)、または制限マッピ ングは、ゲノムDNA、mRNAまたはcDNAを用いて使用することができる。PS相互作 用タンパク質配列は、制限に先立って前記のプライマーを用いるPCRによって増 幅することができ、この場合、PCR産物の長さは、特定の制限部位の存在または 非存在を示すことができ、および/または増幅後に制限に供し得る。制限断片は 、任意の便宜な手段によって可視化することができる(例えば、エチジウムブロ ミドの存在下におけるUV光下)。 (４)PCRマッピング 別の一連の実施態様において、一塩基置換変異を、異なるPCR産物の長さまた はPCRにおける産生に基づいて検出することができる。従って、変異体部位にま たがる、あるいは好ましくは変異部位に3'末端を有するプライマーを使用して、 被験体からのゲノムDNA、mRNA、またはcDNAのサンプルを増幅することができる 。変異部位におけるミスマッチは、ポリメラーゼ反応を促進し、それにより、正 常な被験体と、ヘテロ接合および/またはホモ接合の変異体との間で異なる産物 プロフィールが得られる、正常プライマーまたは変異体プライマーの能力を変更 することが予測できる。正常遺伝子および変異体遺伝子のPCR産物は、異なって 分離され、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動、および標識プロ ーブ、エチジウムブロミド等を用いた可視化のような標準的な技術によって検出 できる。変異部位の可能な非特異的プライミングまたは読み通しのため、ならび に変異体対立遺伝子のキャリアのほとんどがヘテロ接合であるとの事実のため、 この技術の効果は低いかもしれない。 (５)電気泳動移動度 DNA配列差異に基づく遺伝子テストはまた、ゲルにおけるDNA、mRNA、またはcD NAの断片の電気泳動移動度の変化の検出によって達成することができる。例えば 、小さな配列の欠失および挿入は、一本鎖または二本鎖のDNAの高分解能ゲル電 気泳動によって、あるいは非変性ゲル電気泳動におけるDNAヘテロ二重鎖の移動 パターンの変化として可視化することができる。PS相互作用タンパク質遺伝子に おける変異または多型はまた、mRNAまたは一本鎖DNAの二次構造に関連した一本 鎖コンフォメーション多型(SSCP)による移動度シフトを利用する方法によって検 出することができる。 (６)ミスマッチの化学的切断 PS相互作用タンパク質の変異はまた、ミスマッチの化学的切断(CCM)方法を使 用することによって検出できる(例えば、SaleebaおよびCotton，1993,およびそ の中での引用文献を参照のこと)。この技術では、プローブ(約１kbまで)は、被 験体から得たゲノムDNA、cDNA、またはmRNAのサンプルと混合され得る。サンプ ルおよびプローブを混合し、そして(もしあれば)ヘテロ二重鎖の形成を可能とす る条件に供する。好ましくは、プローブおよびサンプル核酸は共に二本鎖である か、あるいはプローブおよびサンプルを一緒にPCR増幅して、全ての可能なミス マッチヘテロ二重鎖の生成を確実にし得る。ミスマッチＴ残基は四酸化オスミウ ムに対して反応性であり、ミスマッチＣ残基はヒドロキシルアミンに対して反応 性である。各ミスマッチＡにはミスマッチＴが伴い、そして各ミスマッチＧには ミスマッチＣが伴うので、プローブとサンプルとの間の任意のヌクレオチド差異 (小さい挿入または欠失を含む)は、少なくとも１つの反応性ヘテロ二重鎖の形成 に至る。いずれかのミスマッチ部位を修飾するための四酸化オスミウムおよび/ またはヒドロキシルアミンでの処理の後、混合物を、例えば、ピペリジンとの反 応によっていずれかの修飾されたミスマッチ部位での化学的切断に付す。次いで 、混合物をゲル電気泳動のような標準的な技術によって分析して、プローブとサ ンプルとの間のミスマッチを示す切断産物を検出し得る。 (７)他の方法 本明細書中で開示され、そしてそうでなければ実施可能な配列に基づいて、PS 相互作用タンパク質変異を検出する種々の他の方法は、当業者に明らかである。 これらのいずれも本発明に従って使用され得る。これらは、限定されるものでは ないが、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ(S1またはリガーゼ媒介)、連結PC R、変性グラジエントゲル電気泳動(DGGE；例えば、FischerおよびLerman，1983 を参照のこと)、SSCPと組み合わせた制限エンドヌクレアーゼフィンガープリン ティング(REF-SSCP；例えば、LiuおよびSommer，1995を参照のこと)等を含む。 Ｄ．他のスクリーニングおよび診断 遺伝の場合には、一次事象として、および非遺伝の場合には病気状態による二 次事象として、プレセニリン、PS相互作用タンパク質、APP、またはプレセニリ ン、PS相互作用タンパク質、もしくはAPPと反応するタンパク質の異常プロセシ ングが起こり得る。これは、身体組織または体液(例えば、CSFまたは血液)にお ける異常なリン酸化、グリコシル化、グリケーション、アミド化またはタンパク 質分解の切断産物として検出され得る。 診断はまた、転写、翻訳、および翻訳後修飾およびプロセシングの変化、なら びに脳および末梢細胞における遺伝子産物の細胞内および細胞外のトラフィッキ ングにおける変化の観察によって行うことができる。このような変化は、メッセ ンジャーRNAおよび/またはタンパク質の量の変化、リン酸化状態の変化、異常な 細胞内位置/分布、異常な細胞外分布等を含む。このようなアッセイは、(例えば 、PS相互作用タンパク質特異的および非特異的ヌクレオチドプローブを用いる) ノーザンブロット、(例えば、グリコシル化およびリン酸化のイソ形態を含む種 々の翻訳後修飾状態を含む、PS相互作用タンパク質またはPS相互作用の機能的ド メインに対して特異的に惹起される抗体を用いる)ウェスタンブロットおよび酵 素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を含む。これらのアッセイは、末梢組織(例えば 、血球、血漿、培養または他の線維芽細胞組織等)、ならびに生前または死後に 得られたCNS組織のバイオプシー、および脳脊髄液で行うことができる。このよ うなアッセイはまた、(メッセンジャーRNAおよびタンパク質を、特定の細胞より 小さい(subcellular)区画および/または神経線維の絡みおよびアミロイド斑のよ うなこれらの疾患に関連した神経病理学構造体内で局在化するための)インサイ チュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学を含む。 Ｅ．スクリーニングおよび診断キット 本発明によれば、前記の診断スクリーニングに必要な試薬を含む診断キットも また提供される。例えば、１つ以上の変異体エピトープに対して特異的な抗体ま たは抗体の組を含むキットが提供され得る。これらの抗体は、特に、結合の可視 化を容易にするいずれかの標準的な手段によって標識され得る。あるいは、前記 のように、オリゴヌクレオチドプローブまたはPCRプライマーが、正常もしくは 変異体のプレセリンおよび/またはPS相互作用タンパク質ヌクレオチド配列の検 出および/または増幅のために存在するキットが提供され得る。さらに、このよ うなプローブは、特異的なハイブリダイゼーションの、より容易な検出のために 標識され得る。前記の種々の診断の実施態様に最適なものとして、このようなキ ットにおけるオリゴヌクレオチドプローブまたは抗体は基材に固定化され得、そ して適切なコントロールを提供し得る。 １１．処置の方法 本発明は、今や、PS相互作用タンパク質の変異によって引き起こされるか、あ るいは引き起こされ得る疾患における治療的介入のための基礎を提供する。上記 のように、hPS1およびhPS2遺伝子における変異は、初期発症型のアルツハイマー 病の発症と関連付けられてきた。従って、本発明は、特に、アルツハイマー病と 診断されたか、あるいはその発症の危険がある被験体の処置に指向する。 本発明のいずれかの特定の理論に拘束されることなく、プレセニリンにおける アルツハイマー病関連の変異の影響は、新規機能の獲得、または正常機能の加速 であるようであり、これは、脳におけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)のＡ βペプチドへの異常なプロセシング、異常なリン酸化ホメオスタシス、および/ または異常なアポトーシスを直接的または間接的に引き起こす。このような機能 の獲得または機能モデルの加速のモデルは、徴候の成人発症およびアルツハイマ ー病の優性遺伝と一致する。それにもかかわらず、プレセニリンにおける変異が 、これらの結果を引き起こし得るメカニズムは依然不明である。 本発明は、PS相互作用タンパク質の組を同定することにより、プレセニリン関 連ADの病因に介入するための新規治療標的を提供する。さらに、プレセニリンに おける変異はADを引き起こし得るので、PS相互作用タンパク質における変異もま たADを引き起こし得るようである。PS相互作用タンパク質S5aが、散発性ADを患 う脳、ならびにプレセニリン関連ADを患う脳において代わりにプロセスされると いう事実は、このPS相互作用タンパク質が、プレセニリンの変異に依存しないAD の病因に関与することを少なくとも示唆する。他のPS相互作用タンパク質もまた 、非プレセニリン関連ADに関与し得るようである。 ADなどのPS相互作用タンパク質関連疾患を処置するための治療は、以下に基づ くことができる：(１)正常なPS相互作用タンパク質の投与、(２)変異体遺伝子を 補うかまたはそれを置換するための正常なPS相互作用タンパク質遺伝子での遺伝 子療法、(３)変異体PS相互作用タンパク質遺伝子に対するアンチセンス配列に基 づくかまたは変異体遺伝子を「ノックアウトする」遺伝子療法、(４)PS相互作用タ ンパク質変異体の有害効果をブロックまたは矯正するタンパク質をコードする配 列に基づく遺伝子療法、(５)正常および/または変異体PS相互作用タンパク質に 対する抗体に基づく免疫療法、あるいは(６)PS相互作用タンパク質の発現を変更 させるか、PS相互作用タンパク質と他のタンパク質またはリガンドとの間の相互 作用を変更するか、あるいはそうでなければ変異体タンパク質の構造を変化させ ることによってか、それらの代謝クリアランスを増強することによってか、ある いはそれらの機能を阻害することによって変異体プレセニリンまたはPS相互作用 タンパク質の異常な機能をブロックする低分子(薬物)。 Ａ．タンパク質療法 アルツハイマー病、またはPS相互作用タンパク質変異に起因する他の障害の処 置は、変異体タンパク質を正常なタンパク質で置き換えること、変異体タンパク 質の機能を調節すること、あるいは過剰の正常タンパク質を提供して変異体タン パク質のいずれかの異常な機能の効果を低下させることによって行い得る。 これを達成するために、本明細書に記載されそして実施可能なように、このタ ンパク質を発現し得る培養細胞系からの大量の実質的に純粋なPS相互作用タンパ ク質を得ることが必要である。次いで、タンパク質の患部脳領域または他の組織 への送達は、例えば、標的細胞へのリポソーム媒介タンパク質送達を含む適切な パッケージングまたは投与系を用いて達成され得る。 Ｂ．遺伝子療法 １連の実施態様において、PS相互作用遺伝子の正常コピーを患者に導入して、 １つ以上の異なる患部細胞型において正常なタンパク質を首尾よくコードする遺 伝子療法が使用し得る。遺伝子は、それが取り込まれ、効果的な機能を提供する のに、十分なタンパク質をコードし得る形態でそのような細胞に送達されなけれ ばならない。従って、組換え遺伝子は、強力なプロモーターに作動可能に連結さ れ、その結果、変異体タンパク質を補うかまたはそれ以上に競合する高レベル発 現を提供するのが好ましい。上記のように、組換え構築物は、内因性または外因 性の調節エレメント、誘導性または抑制性の調節エレメント、あるいは組織特異 的な調節エレメントを含有し得る。 別の１連の実施態様において、遺伝子療法を用いて、組換え構築物による相同 組換えにより変異体遺伝子を置換し得る。組換え構築物は、標的化PS相互作用タ ンパク質遺伝子の正常コピーを含有し得、この場合、欠陥はインサイチュで矯正 されるか、あるいは変異体遺伝子の機能をなくす停止コドン、ミスセンス変異、 または欠失を導入する「ノックアウト」構築物を含有し得る。この点に関して、こ のような構築物は、ヘテロ接合個体における標的化遺伝子の正常および変異体コ ピーの両方をノックアウトし得るが、遺伝子機能の全喪失は、疾患状態の継続し た進行よりも個体に対して有害性が低いであろうことに注意すべきである。 別の１連の実施態様において、アンチセンス遺伝子療法を使用し得る。アンチ センス療法は、遺伝子発現の配列特異的抑制がmRNAまたはDNAと相補的アンチセ ンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションによって達成し得るという事実に 基づく。次いで、ハイブリッド二重鎖の形成は、遺伝子の転写および/または標 的mRNAのプロセシング、輸送、翻訳および/または安定性を妨害し得る。アンチ センスストラテジーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオ リゴヌクレオチドアナログ(例えば、ホスホロチオエート骨格を持つアナログ)の 投与、あるいはアンチセンスRNA発現ベクターでのトランスフェクションを含む 種々のアプローチを使用し得る。さらに、このようなベクターは、外因性または 内因性の調節領域、誘導性または抑制性の調節エレメント、あるいは組織特異的 調節エレメントを含み得る。 別の１連の実施態様において、遺伝子療法を用いて、変異体プレセニリンまた はPS相互作用タンパク質遺伝子によって引き起こされる異常な機能をブロックす るか、またはそうでなければ矯正するタンパク質またはペプチドをコードする組 換え構築物を導入し得る。１つの実施態様において、組換え遺伝子は、別の細胞 タンパク質または他の細胞リガンド(例えば、変異体プレセニリン)と異常に相互 作用することが判明しているPS相互作用のドメインに対応するペプチドをコード し得る。従って、例えば、もし変異体PS1 TM6→7ドメインがPS相互作用タンパク 質と相互作用するが、対応する正常TM6→7ドメインがこの相互作用を受けないこ とが見出されているならば、遺伝子療法を用いて、変異体プレセニリンタンパク 質と競合し得、そして異常な相互作用を阻害またはブロックし得る過剰の変異体 TM6→7ドメインを提供し得る。あるいは、変異体プレセニリンと相互作用するが 、正常プレセニリンとは相互作用しないPS相互作用タンパク質のPS相互作用ドメ イン部分をコードし、組換え構築物により発現させて、異常な相互作用と競合さ せ、それにより、それを阻害またはブロックし得る。 特に感染ならびに安定な組込みおよび発現の高効率のために、レトロウイルス ベクターが、体細胞の遺伝子療法で使用され得る。完全長のPS相互作用タンパク 質遺伝子、これらのタンパク質の機能的ドメインをコードするサブ配列、または 前記の他の治療ペプチドのいずれかを、レトロウイルスベクターにクローン化し 得、そして内因性プロモーター、レトロウイルスの長末端反復、または目的の標 的細胞型(例えば、ニューロン)に特異的なプロモーターから発現を駆動し得る。 使用し得る他のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス 、ウシ乳頭腫ウイルス、またはエプスタインバーウイルスなどのヘルペスウイル スを含む。 Ｃ．免疫療法 免疫療法もまた、アルツハイマー病に可能である。抗体を正常または変異体PS 相互作用タンパク質(またはその部分)に対して惹起させ、そして患者に投与して 、異常な相互作用(例えば、変異体プレセニリンとの)に結合するか、またはそれ をブロックして、その有害効果を妨げ得る。同時に、正常なタンパク質産物の発 現を刺激することができる。あるいは、変異体または野生型のPS相互作用タンパ ク質とそれらの相互作用パートナーとの間の特異的複合体に対して抗体を惹起さ せる。 さらなるアプローチは、所望の抗原に対する内因性の抗体産生を刺激すること である。投与は、１回の免疫原性調製物またはワクチン免疫化の形態であり得る 。PS相互作用タンパク質あるいは他の抗原を、タンパク質に適合する薬学的に受 容可能なキャリアまたは賦形剤と混合することができる。免疫原性組成物および ワクチンは、さらに、乳化剤またはアジュバントなどの補助物質を含有し、有効 性を増強させることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射また は 筋肉内注射によって、非経口的に投与することができる。 Ｄ．低分子療法 本明細書中で記載されそして実施可能となるように、本発明は、アルツハイマ ー病、またはプレセニリンまたはPS相互作用タンパク質における変異によって引 き起こされた他の障害の処置で有用であり得る低分子または他の化合物を同定す る多数の方法を提供する。従って、例えば、本発明は、正常または変異体PS相互 作用タンパク質に結合するタンパク質(プレセニリンは別として)を同定する方法 を提供する。本発明はまた、変異体プレセニリンおよび/またはPS相互作用タン パク質とこのような他の結合タンパク質または他の細胞成分との間の異常な相互 作用を破壊するのに使用できる低分子を同定する方法を提供する。 実施例 実施例１．ツーハイブリッド酵母システムによるPS相互作用タンパク質の単離 プレセニリンタンパク質と相互作用するタンパク質を同定するために、市販の 酵母ツーハイブリッドキット(Clontech，Palo Alto，CA由来の「Matchmaker Syst em 2」)を用いて、プレセニリンの機能性ドメインと相互作用するクローンについ て脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。プレセニリンのTM6→７ループド メインが重要な機能性ドメインである可能性から考えて、正常なPS1タンパク質 の残基266〜409、または正常なPS2タンパク質の残基272〜390のいずれかをコー ドする部分的cDNA配列を、pAS2-1融合タンパク質発現ベクター(Clontech)のEcoR IおよびBamHI部位にインフレームで連結した。得られた融合タンパク質は、PS1 タンパク質のTM6→７ループまたはPS2タンパク質のTM6→７ループのいずれかに インフレームで結合したGAL4 DNA結合ドメインを含有する。「Matchmaker System 2」酵母ツーハイブリッドキット(Clontech，Palo Alto，CA)の改変リチウムアセ テートプロトコルを用いて、これらの発現プラスミドを、GAL4活性化ドメインを 有するpACT2酵母融合タンパク質発現ベクター(Clontech)に連結したヒト脳cDNA のライブラリーとともにS.cerevisiae株Y190に同時形質転換した。TM6→７ルー プドメインと相互作用するヒト脳cDNAを有する酵母クローンを、ヒスチジン欠失 SD最小培地にプレートすることによってHis-抵抗性について、そして呈色選択に よりβgal+活性化について選択した。次いで、His+βgal+クローンを、10μg/ml シクロヘキサミドにおける培養によってpAS2-1「餌」構築物からパージし、PS相互 作用タンパク質をコードするヒト脳cDNAの未知の「捕捉された」挿入物を、PCRに よって単離し、そして配列決定した。600万の最初の形質転換体の内、陽性コロ ニーの選択に関する製造業者のプロトコルに従って実行した、His-選択の後に20 ０の陽性クローンを、そしてβgal+呈色選択の後に42のクローンを取得した。こ れらの42のクローンの内、同一遺伝子を示すいくつかの独立したクローンが存在 していた。 プレセニリンにおける変異が、変異体タンパク質と１つ以上の他の細胞タンパ ク質との間の新規相互作用によって媒介される新規ではあるが毒性の機能の獲得 (すなわち、機能変異の優性獲得)を介してADを引き起こす可能性に取り組むため に、pACT2発現ベクター(Clontech)中にクローン化したヒト脳cDNAライブラリー を、上記および製造業者のプロトコルに従って変異体TM6→７ループドメイン配 列を用いて再びスクリーニングした。詳細には、変異L286V、L392VおよびΔ290- 319を有するPS1 TM6→７ループドメインの残基260〜409に対応する変異体プレセ ニリン配列を、pAS2-1ベクター(Clontech)のGAL4 DNA結合ドメインにインフレー ムで連結し、そしてpACTベクター(Clontech)のヒト脳cDNA:GAL4活性化ドメイン ライブラリーをスクリーニングするために用いた。酵母を同時形質転換し、陽性 コロニーを選択し、そして「捕獲」した配列を回収し、そして上記のように配列決 定した。正常TM6→７ループドメインで回収した同一のいくつかの配列に加えて 、正常細胞質タンパク質との変異体プレセニリンの異常な相互作用を反映するい くつかの新規配列を取得した。 これらのPS相互作用タンパク質に対応する回収し、そして配列決定したクロー ンを、NCBI e-メールサーバーを介してBL:ASTNアルゴリズムを用いて公の配列デ ータベースと比較した。これらのクローンの内のいくつかの記載は以下のようで ある： 抗分泌因子/プロテアソームS5aサブユニット。抗分泌因子(「ASF」)または26Sプ ロテアソーム多ユビキチン鎖結合S5aサブユニット(「S5a」)として二者択一的に同 定されたタンパク質のC-末端フラグメントに対応する２つの重なり合うクローン (Y2H29およびY2H31)を同定した(Johanssonら、1995；Ferrellら、1996)。S5aサ ブユニットの完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アクセス番号U51007の 下で公のデータベースを介して入手可能であり、そして配列番号１および配列番 号２として本明細書中に再現されている。Y2H29およびY2H31クローンのヌクレオ チド配列は、配列番号１のヌクレオチド351〜1330および配列番号２のアミノ酸 残基70〜377を含む。従って、完全なS5aサブユニットの残基70〜377は、このタ ンパク質のPS相互作用ドメインを含む。S5aの残基206〜377は、タンパク質-タン パク質相互作用に関して重要な特定のモチーフを含有する(Ferrellら、1996)。 Y187酵母細胞を適切な野生型または変異体(L286V，L392V、またはΔ290-319)c DNA(pACT2のGAL4-DNA結合ドメインにインフレームで連結している)で形質転換す ることにより、PS1-S5aサブユニット相互作用を野生型および変異体PS1 TM6→7 ループ(残基260-409)の両方について直接再テストした。Δ290-319変異体融合構 築物は、あらゆるS5a「標的配列」の非存在下で自律性βgal活性化を示し、従って さらに分析され得なかった。対照的に、L286VおよびL392V変異体構築物の両方は 、S5a構築物と特異的に相互作用した。しかし、定量アッセイは、これらの相互 作用が野生型PS1_260-409配列を含むものより弱く、そして相互作用の程度がFAD の発症年齢と粗く相関することを示した。βgal活性化における差異は、変異体P S1_260-409構築物mRNAまたは融合タンパク質の不安定性に起因しない。なぜなら 形質転換された酵母の溶解物のウェスタンブロットは、変異体または野生型融合 タンパク質の等価量を示したからである。 S5aの推定機能のうちの１つは、多ユビキチン化したタンパク質を結合するこ とであるので、S.cerevisiaeにおいて観察されたPS1:S5a相互作用は、PS1_{260-40 9} 構築物の酵母依存性ユビキチン化によるか、または直接的相互作用により生じ 得る。前者は、分解経路、PS1とS5aとの間の機能的かつおそらく相反的な相互作 用、またはその両方を反映する。PS1:S5a相互作用が、L286VおよびL392V変異の 存在により増大するよりむしろ減少したという事実により、そしてこれらの変異 体のいずれもが、PS1_260-409ループにおけるユビキチン化部位(すなわち、K265 、K311、K314、またはK395)に影響しないという事実により、直接的相互作用が 支持される。 この可能性をさらに試験するために、本発明者らは、完全長S5aおよびPS1_{260-40 9} ループに対応する組換えHisタグ化融合タンパク質の直接的相互作用を調べた。 部分的に精製された組換えHisタグ化PS1_260-409ループおよびHisタグ化S5aタン パク質および適切なコントロールを、リン酸緩衝化生理食塩水中で混合した。次 いで、この混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供し、そして溶出物を、 SDS-PAGEおよび抗Hisタグモノクローナル抗体(Quiagen)を用いたウェスタンブロ ッティングにより試験した。粗PS1_260-409ループ調製物単独において、PS1_{260-4 09} ループは、35分で広いピークとしてサイズ排除カラムから溶出した。粗S5a調 製物単独において、S5aは25分で溶出した。しかし、粗PS1_260-409ループおよびS 5a調製物を混合した場合、PS1_260-409の溶出がより高い分子量複合体へ著しくシ フトした。同じ画分におけるS5aおよびPS1_260-409の同時溶出を、SDS-PAGEおよ び抗Hisタグ抗体を用いた画分のウェスタンブロッティングにより試験した。こ れらの結果は、ユビキチン非依存性相互作用と一致し、従っておそらく機能的相 互作用と一致する。 GT24 およびp120/プラコグロビンファミリーに対する相同性を有する関連遺伝 子 。正常なPS1 TM6→7ループドメインと相互作用し、そして少なくとも１つの新 規な遺伝子を示すと思われる、５つの重複クローン(Y2H6、Y2H10b、Y2H17h2、Y2 H24、およびY2H25)を得た。Y2H24クローンもまた、変異体PS1 TM6→7ループドメ インと相互作用することを見出した。１を超えるメンバーの遺伝子ファミリーが 単離されたと思われる(これは、異なるプレセニリンと異なって相互作用する遺 伝子ファミリーを示唆する)ことに留意のこと。これらのクローンに対応するほ とんど完全な利用可能なcDNAをGT24と呼び、そして配列番号３として本明細書中 に開示し、そして受託番号U81004としてGenBankに寄託した。オープンリーディ ングフレームは、GT24が独特のN末端およびそのＣ末端においていくつかのアル マジロ(armadillo)(arm)反復タンパク質とかなりの相同性を有する少なくとも10 40アミノ酸のタンパク質であることを示唆する。GT24の推定アミノ酸配列を、本 明細書中で配列番号４として開示する。従って、例えば、GT24の残基440-862は 、マウスp120タンパク質(受託番号Z17804)の残基440-854に対して32〜56％の同 一性(p=1.2e^-133)を有し、そしてGT24の残基367-815は、D.melanogasterアルマ ジロセグメント極性タンパク質(受託番号p18824)の残基245-465に対して26〜42 ％の 同一性(P=0.0017)を有する。GT24遺伝子は、アノニマス(anonymous)マクロサテ ライトマーカーD5S748およびネコ鳴き症候群遺伝子座付近の染色体5p15にマップ される。この配列はまた、未知の機能の２つのヒトESTの一部(すなわち、受託番 号F08730のヌクレオチド2701-3018および受託番号T18858のヌクレオチド2974-33 48)とほぼ同一である。これらのクローンはまた、他の部分的cDNAおよびgDNA配 列(例えば、H17245、T06654、T77214、H24294、M62015、T87427、およびG04019) と低い程度の相同性を示す。p0071 遺伝子。野生型PS1_266-409「餌」での最初のスクリーニングにおいて単離 されたさらなるHis^-、βgal⁺クローンは、GT24(標的クローンY2H25；受託番号U8 1005)と類似のヌクレオチド配列を有し、そしてまたＣ末端arm反復を有するペプ チドをコードすると予想された。Y2H25クローンに密接に対応するより長いcDNA 配列は、ヒトタンパク質p0071(受託番号X81889)としてGenBankに寄託されている 。p0071のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を、本明細書中に配列 番号５および６として再現する。p0071 ORFの予想配列とGT24の予想配列との比 較により、それらは、47％の全アミノ酸同一性を有し、そしてGT24の残基346-86 2とp0071の残基509-1022(Y2H25 cDNAによりコードされる残基を含む)との間で７ ０％の同一性を有する関連したタンパク質であることが確認された。後者の結果 は、PS1がarm反復含有タンパク質の新規のクラスと相互作用することを強く示唆 する。GT24の独特の5'末端を用いたノーザンブロットで得られた広い約４kbのハ イブリダイゼーションシグナルは、GT24のオルタナティブスプライシング/ポリ アデニル化、またはp0071より高い程度のGT24に対するＮ末端相同性を有するこ のファミリーのさらなるメンバーの存在のいずれかを反映し得る。 Rab11 遺伝子。このクローン(Y2H9)(本明細書中に配列番号７として開示された )を、正常PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定した。これ は、受託番号X56740およびX53143により利用可能な既知の遺伝子Rab11に対応す ると思われる。Rab11は、小胞体/ゴルジ体におけるタンパク質/ベシクル輸送に 関与すると考えられる。毒性Aβペプチド(特に、神経毒性Aβ_1-42(43)アイソフ ォーム)の得られた過剰産生での膜タンパク質（例えば、βAPPおよびNotch)のプ ロセシングに対する潜在的な関係(Scheunerら、1995)に留意のこと。レチノイドＸレセプター-β遺伝子。このクローン(Y2H23b)(本明細書中に配列 番号８として開示される)を、正常PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するも のとして同定した。これは、レチノイドＸレセプター-β、核レセプターコレギ ュレーターまたはMHCクラスI調節エレメントとして多様に知られており、そして 受託番号M84820、X63522、およM481766により入手可能な既知の遺伝子に対応す ると思われる。この遺伝子は、細胞内シグナルに関与すると考えられ、これはC. elegans sel12とNotch/lin−12(転写アクチベーター)により媒介される細胞内シ グル伝達機能への潜在的な関係を示唆する。 細胞質シャペロニン遺伝子。このクローン(Y2H27)(本明細書中に配列番号９と して開示される)を、正常PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして 同定した。これは、受託番号U17104およびX74801により利用可能な既知遺伝子で あるTCP-1を含む細胞質シャペロニンに対応すると思われる。 未知遺伝子(Y2H35)。このクローン(Y2H35)(本明細書中に配列番号10として開 示される)を、正常PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定し た。これは、酵母による保存を示す、受託番号R12984により利用可能な未知機能 の既知遺伝子に対応すると思われる。 未知遺伝子(Y2H171)。このクローン(Y2H171)(本明細書中に配列番号11として 開示される)を、正常PS1TM6→7ループドメインと相互作用するものとして同定し た。これは、受託番号D55326により利用可能な既知の発現反復配列に対応すると 思われる。 未知遺伝子(Y2H41)。PS1およびPS2の両方のTM6→7ループドメイン、ならびにP S1の変異体ループドメインと強く反応するこのクローン(Y2H41)を同定した。配 列番号12に開示される配列は、未知機能のEST(受託番号T64843)と強く相同性を 示す。 実施例２ アフィニティークロマトグラフィーによるプレセニリン結合タンパク 質の単離 プレセニリンの生化学的機能に関与し得るタンパク質を同定するために、PS− 相互作用タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した。 実施例３に記載したように調製したPS1 TM6→７ループを含有するGST−融合タン パク質を用いて、生理食塩水中で、ポリトロン(Polytron)により脳組織をホモジ ナイズすることによって調製したヒト脳抽出物をプローブした。グルタチオン− Sepharoseビーズとのインキュベーションにより内因性GST−結合成分の脳ホモジ ネートを予め清澄化(pre-clearing)することによって、非特異的結合を排除した 。次いで、これらのGSTを含まないホモジネートを、GST-PS融合タンパク質と共 にインキュベートして、機能的結合タンパク質との所望の複合体を作製した。次 いで、これらの複合体を、アフィニティーグルタチオン−Sepharoseビーズを用 いて回収した。リン酸緩衝化生理食塩水で十分に洗浄した後に、SDS-ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE；トリス-トリシン勾配ゲル４〜20％)によって 、単離したタンパク質の収集物を分離した。50〜60kDの範囲のいくつかの弱いバ ンドに加えて、２つの主要なバンドが、約14kDおよび20kDで観察された。 同じアプローチを、PS相互作用タンパク質に対して結合活性を有するタンパク 質を同定し、それによりADの病因をさらに解明するために、そしてADおよび関連 疾患における介入のためのさらなる治療標的を同定するために今や使用し得る。 実施例３ 真核生物および原核生物発現ベクター系 真核生物および原核生物発現系での使用に適した構築物を、PS1ヌクレオチド ｃDNA配列インサートの異なるクラスを用いて作製した。第１のクラス(完全長構 築物という)においては、全PS1 cDNA配列を、正しい配向で発現プラスミドに挿 入し、これは、天然の5'UTRおよび3'UTRの両配列ならびに全オープンリーディン グフレームを含む。このオープンリーディングフレームはヌクレオチド配列カセ ットを有し、このヌクレオチド配列カセットは、野生型オープンリーディングフ レームが発現系に含まれることを可能とするか、あるいは、単一変異、または二 重変異の組合せをオープンリーディングフレームに挿入することができる。これ を、酵素NarIおよびPflmIを用いて野生型オープンリーディングフレームから制 限フラグメントを除去し、そして逆転写酵素PCRによって生成した類似のフラグ メントでそれを置換し、そしてM146L変異またはH163R変異のいずれかをコードす るヌクレオチド配列を保有させることによって達成した。酵素PflmIおよびNcoI での 切断によって、オープンリーディングフレームについての野生型正常ヌクレオチ ド配列から第２の制限フラグメントを除去し、そしてA246E変異、A260V変異、A2 85V変異、L286V変異、L392V変異、またはC410Y変異をコードするヌクレオチド配 列を有する制限フラグメントで置換した。タンデムに、M146LまたはH163R変異の いずれかと、残りの変異のうちの１つとの組合せを有する第３の改変体を、前者 の変異の１つを有するNarI-PflmIフラグメント、および後者の変異の１つを有す るPflmI-NcoIフラグメントを連結することによって作製した。 完全長野生型または変異体cDNA配列から5'UTR、および3'UTR配列の一部を除去 することによって、第２のクラスのcDNAインサート(切断型構築物という)を構築 した。5'UTR配列を、KpnI制限部位(GGTAC/C)および小配列(GCCACC)を含有する合 成オリゴヌクレオチドで置換して、PS1 ORFの始まりのATG付近にKozak開始部位 を作製した。3'UTRを、5'末端に人工EcoRI部位を有するオリゴヌクレオチドで置 換した。次いで、上記の変異体配列を上記のNarI-PflmIおよびPslmI-NcoI部位に 挿入することによって、この構築物の変異体改変体を作製した。 真核生物発現については、制限消化によってSV60プロモーターカセットを除去 し、そしてpcDNA3(Invitrogen)のCMVプロモーターエレメントで置換した発現ベ クターpZeoSV中に、上記の野生型および変異体配列を有するこれらの種々のcDNA 構築物をクローン化した。原核生物発現については、グルタチオンＳ−トランス フェラーゼ(GST)融合ベクターpGEX-kgを用いて、構築物が作製されている。GST 融合ヌクレオチド配列に付着させたインサートは、正常のオープンリーディング フレームヌクレオチド配列を有するか、または上記の単一および二重変異の組合 せを有する上記の同一のヌクレオチド配列である。これらのGST融合構築物は、 変異体または野生型GST融合タンパク質として原核生物細胞系における部分的ま たは完全長のタンパク質の発現を可能とし、従って、完全長タンパク質の精製、 続くトロンビン消化によるGST融合産物の除去を可能とする。さらなるcDNA構築 物をGST融合ベクターを用いて作製して、野生型ヌクレオチド配列またはA285V変 異、L286V変異、もしくはL392V変異のいずれかを有する変異体配列のいずれかと して、完全長タンパク質のTM6とTM7との間の親水性酸性ループドメインに対応す るアミノ酸配列の産生を可能とする。これは、5'BamHI制限部位(G/GATCC)を有す る5'オリゴヌクレオチドプライマー、および5'EcoRI制限部位(G/AATTC)を有する 3'プライマーを用いて、適切なRNAの供給源から野生型または変異体配列を回収 することによって達成された。これは、pGEX-KGベクター内のBamHIおよびEcoRI 部位における親水性酸性ループドメインに対応する適切な変異体または野生型ヌ クレオチド配列のクローニングを可能とした。 PS相互作用タンパク質遺伝子は、真核生物宿主または原核生物宿主における発 現のための組換え手段により同様に操作され得る。特に、治療用のアッセイ(例 えば、酵母ツーハイブリッド研究)に有用なGSTまたは他の融合タンパク質が作製 され得る。 実施例４ 抗体産生 PS1タンパク質の一部に対応するペプチド抗原を固相技術によって合成し、そ して逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。プレセニリンフラグメ ントのペプチドＣ末端におけるシステイン残基の添加によって可能になったジス ルフィド結合を介して、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に 共有結合させた。このさらなる残基は、タンパク質配列において通常表れず、そ してKLH分子への結合を促進するために含まれたにすぎない。 合計３匹のニュージーランド白ウサギを、フロイントのアジュバントと組み合 わせて各ペプチド抗原についてのペプチド-KLH複合体で免疫化し、続いて、７日 間隔で追加免疫注射した。抗血清を各ペプチドについて収集し、そしてプールし 、そして硫酸アンモニウムを用いてIgGを沈殿させた。次いで、抗体を、適切な ペプチドにカップリングさせたスルホ−連結アガロース(Pierce)でアフィニティ ー精製した。この最終精製は、免疫前または免疫後のいずれかの血清中に存在す る他の抗体の非特異的相互作用を除去するのに必要である。 各抗体の特異性を、３つのテストで確認した。第１に、各々は、脳ホモジネー トのウェスタンブロットにおいてプレセニリン−１について予測された近似のサ イズの単一の支配的バンドを検出した。第２に、各々は、適切な配列を有する組 換え融合タンパク質と交差反応した。第３に、各々は、組換えPS1または免疫化 ペプチドでの予備吸収によって特異的にブロックされ得た。 PS相互作用タンパク質由来のペプチドに対する抗体を類似の手段で産生し得る 。 実施例５．トランスジェニックマウス 一連の野生型および変異体のPS1およびPS2遺伝子を、トランスジェニックマウ スの調製において使用するために構築した。PS1およびPS2の変異体バージョンは 、標準技術を用いてクローン化したcDNAの部位特異的変異誘発により作製した。 cDNAおよびそれらの変異体バージョンを、実施例３に記載の２つのクラスの変 異体および野生型のPS1およびPS2 cDNAを調製するために使用した。「完全長」cDN Aと呼ばれる第１のクラスを、EcoRI(PS1)またはPvuII(PS2)での消化により、ポ リＡ部位の直前の3'非翻訳領域の約200bpを除去することにより調製した。「短縮」 cDNAと呼ばれる第２のクラスを、5'非翻訳領域をATG開始コドンのすぐ5'側に位 置するリボゾーム結合部位(Kozakコンセンサス配列)で置換することにより調製 した。 上記のように調製した種々の完全長および短縮された野生型および変異体のPS 1およびPS2 cDNAを、以下のベクターの１つ以上に導入し、そして生じた構築物 をトランスジェニックマウスの産生のための遺伝子の供給源として用いた。 cos.TET 発現ベクター：このベクターはシリアハムスターPrP遺伝子を含むコス ミドクローンに由来した。これは、scottら(1992)および有siaoら(1995)により 詳細に記載されている。PS1およびPS2 cDNA(完全長または短縮)を、ベクターのS alI部位でこのベクターに挿入した。最終構築物は、挿入cDNAに隣接する20kbの5 '配列を含む。この5'隣接配列は、PrP遺伝子プロモーター、50bpのPrP遺伝子5' 非翻訳領域エクソン、スプライスドナー部位、１kbイントロン、およびPS1また はPS2 cDNAが挿入されたSalI部位のすぐ近辺に位置するスプライスアクセプター 部位を含む。挿入cDNAに隣接する3'配列は、ポリアデニル化シグナルを含むPrP 3'非翻訳領域の約８kbセグメントを含む。この構築物のNotl(ps1)またはFseI(PS 2)での消化は、PrPプロモータ-の制御下の変異体または野生型PS遺伝子を含むフ ラグメントを放出した。放出されたフラグメントをゲル精製し、そしてHsiaoら( 1995)の方法を用いて受精マウス卵の前核に注入した。 血小板由来増殖因子レセプターβ-サブユニット構築物：PScDNAをまた、ヒト 血小板由来増殖因子レセプターβ-サブユニットプロモーター部位の3'末端のSal I(完全長PS1 cDNA)またはHindIII(短縮PS1 cDNA、完全長PS2 cDNA、および短縮P S2 cDNA)と、SV40ポリＡ配列の5'末端のEcoRI部位との間に導入し、そしてカセ ット全体をpZeoSVベクター(Invitrogen，San Diego，CA)にクローン化した。Sca I/BamHI消化により放出したフラグメントをゲル精製し、そしてHsiaoら(1995)の 方法を用いて受精マウス卵の前核に注入した。 ヒトβ-アクチン構築物：PS1およびPS2 cDNAを、pBAcGHのSaII部位に挿入した 。この挿入により生成される構築物は、3.4kbのヒトβ-アクチン5'隣接配列(ヒ トβアクチンプロモーター、スプライスされた78bpのヒトβアクチン5'非翻訳エ キソンおよびイントロン)およびPS1またはPS2挿入物、続いていくつかのイント ロンおよびエキソンならびにポリアデニル化シグナルを含む2.2kbのヒト成長ホ ルモンゲノム配列を含む。SfiIを用いてPS含有フラグメントを放出し、このフラ グメントをゲル精製し、そしてHsiaoら(1995)の方法を用いて受精マウス卵の前 核に注入した。 ホスホグリセリン酸キナーゼ構築物：PS1およびPS2 cDNAをpkJ90ベクターに導 入した。cDNAを、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの下流のKpnI部 位と、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の3'非翻訳領域の上流のXbaI部位 との間に挿入した。PvuII/HindIII(PS1 cDNA)またはPvuII(PS2 cDNA)消化を用い てPS含有フラグメントを放出し、このフラグメントをゲル精製し、そして上記の ように受精マウス卵の前核に注入した。 トランスジェニックマウス海馬におけるＡβの分析：マウスにおける変異体ヒ トPS1トランスジーンの効果を分析するために、初期発症PS1関連アルツハイマー 病の特に重篤な形態と共に観察されるPS1変異(すなわち、M146Lミスセンス変異( Sherringtonら、1995))を使用した。混合FVB-C57BL/6系統バックグラウンドで、 PS1変異体トランスジーンについてヘテロ接合性である動物を、Hsiaoら、1995に より最近記載されたこれらの動物に類似の、同じシリアハムスターPrPプロモー ター下のヒト野生型βAPP₆₉₅ cDNAを有する類似のマウスと交雑した。ヒトＡβ がマウスＡβペプチドよりも凝集体の形成により感受性であると考えられるので 、これらの交雑を行った。 次いで、これらのPS1_M146L×βAPP_WT交雑の子孫を遺伝子型決定し、ヒト野生 型βAPP₆₉₅トランスジーンを含む動物およびまた変異体ヒトPS1_M146Lトランスジ ーンを含む動物の両方を同定した。これらのマウスを２〜３カ月の年齢まで加齢 させて、次いで屠殺し、海馬および新皮質を脳から迅速に解剖し、そして凍結し た。野生型ヒトβAPP₆₉₅トランスジーンのみを有するこれらのマウス同腹仔をま た屠殺し、そしてそれらの海馬および新皮質を同様に解剖し、そして迅速に凍結 した。 次いで、両方の総Ａβペプチド(Ａβ_X-40およびＡβ_X42-(43))の濃度ならびに 残基42または43で終結するＡβペプチド(長テール化(long−tailed)Ａβ42ペプ チド)のサブセットを、ツーサンドイッチELISAを用いて以前記載されたように(T amaokaら、1994；Suzukiら、1994)測定した。これらの結果は、野生型ヒトβAPP₆₉₅ コントロールに比較して、野生型ヒトβAPP₆₉₅および変異体ヒトPS1_M146Lを 有する二重トランスジェニック動物における総Ａβペプチドの少ない増大を確証 的に示した。より印象的には、これらの測定はまた、残基42または43で終結する 長テール化Ａβペプチド(Ａβ₄₂)の量が増大したことを示した。対照的に、野生 型ヒトβAPP₆₉₅トランスジーンのみを有する同腹仔は、定量限界以下の(「BLQ」) 長テール化ペプチド値を有した。 従って、これらの観察は、トランスジェニック動物の構築ｚがヒトアルツハイ マー病のいくつかの生化学的特徴のいくつか(すなわち、Ａβペプチドの過剰産 生および、特に、長テール化イソ型Ａβペプチドの過剰産生)を再現し得ること を確認した。従って、これらの観察は、アルツハイマー病の処置および予防に対 する治療標的の探索において、トランスジェニックモデルが実際に有用であるこ とを証明する。 PS1 トランスジェニックマウスにおける海馬依存性記憶機能の分析：(上記のよ うな)PrPプロモーター下でヒトPS1M_146V変異体トランスジーンを有する14匹のト ランスジェニックC57BL/6×FVBマウスおよび2.5〜3ヶ月齢の12匹の野生型同腹仔 (両方の群を年齢、体重および性別について釣り合わせた)を、変異体トランスジ ーンに起因し得る行動の差異について調査した。さらに、それらの家かごにおけ るマウスの行動の質的観察は、動物のサンプルにおける行動の双峰分布を示さな かった。実験１．探索行動(例えば、運動、立ち上がりによる周囲の走査、および不慣 れな環境の調査のパターン)における微小な差異を試験するために、PS1_M146Vお よび野生型同腹仔の両方を戸外野で試験した(Janusら、1995)。試験の結果は、 マウス運動行動(歩行、休止、壁寄りかかり、立ち上がり、毛づくろい)によって 測定された、新たな環境の探索においてトランスジェニックとコントロールとの 間に有意な差異を示さなかった(F(1,24)＝.98，NS)。従って、Morris水迷路試験 (下記参照)における行動のいかなる差異も、運動能力などにおける差異に起因し 得ない。 実験２．戸外野試験後の１週間、PS1_M146V変異体トランスジェニックマウスお よびそれらの同腹仔を、Morris水迷路において訓練した。この試験において、マ ウスは、水中に隠されたエスケーププラットフォームを見つけるためにプール内 を泳がなければならない。動物は、利用可能な特別迷路空間的手がかりを用いて プラットフォームの位置を学習することによってこの試験を解く(Morris，1990) 。海馬形成がこの形態の学習に関与するという強い証拠が存在するのでこの試験 を選択した。海馬はまた、ヒトにおけるAD神経病理学の主要部位であり、そして 空間学習における欠損(地理的失見当識、目標見失い、遊走など)は、ヒトADの顕 著な初期特徴である。結果として、この試験は、ヒトADにおいて見られるものと 等価な初期変化を検出するようである。Morris試験は３つの相(phase)で行われ る。第１の相(学習獲得相)では、マウスはプラットフォームの空間位置を学習し なければならない。第２の相(探索試行)では、プラットフォームはプールから除 去され、そしてプラットフォームに対するマウスの捜索を記録する。最終相(学 習移動相)では、プラットフォームはプール内の新しい位置に戻され、そしてマ ウスはプラットフォームの新しい空間位置を学習しなければならない。 トランスジェニックおよび野生型マウスは、学習獲得の間にプラットフォーム を見つけるそれらの潜時において異ならず(F(1,24)＝0.81,NS)、両方の群が試行 を通して迅速な学習を示した(F(10,15)＝11.57,p＜0.001)。探索試行相の間、両 方の群からのマウスは、プラットフォームを含有しなかったプールの他の領域よ りもプラットフォームを本来含有していたプールの象限を有意に長く捜索した(F (3,22)＝28.9,p＜0.001)。しかし、野生型コントロールは、プラットフォームの正確 な以前の位置の横断の増大した数に関して統計学的に全く有意ではない(t(2 4)＝1.21,p=0.24)傾向を示した。学習移動試験において、両方の群が、試行の最 初のブロックにおいてプラットフォームの新しい位置を見つけるのに同じ潜時を 示した(t(24)＝1.11,NS)。新しい空間位置を見つけるためのこのような長い潜時 は予測される。なぜなら、マウスは古い空間位置でのプラットフォームを捜索す るのにほとんどの時間を費やしたからである。しかし、学習移動相におけるより 後の試行では、野生型マウスは、PS1_M146V変異体トランスジェニックと比較して 、新しい位置のプラットフォームへのより短い水泳潜時を示した(F(1,24)2.36,p ＝0.14)。この結果は、PS1_M146V変異体トランスジェニックマウスが学習した情 報を新しい状況に移動させることにおいて柔軟性が低く、そして古い位置でのプ ラットフォームの捜索を維持する傾向があったことを示す。 従って、野生型とPS1_M146V変異体トランスジェニックマウスとの間で新しい環 境の自発的な探索および新しい空間情報の獲得において差異は見出されなかった が、PS1_M146V変異体トランスジェニックマウスは、より後の状況下でこの知識を 転換および/または適合させることが損なわれていた。 変異体トランスジェニックマウスの海馬における電気生理学的記録：上記の同 一のC57BL/6×FVB系統バックグラウンド上の５〜６ヶ月齢の同腹仔コントロール およびヒトPS1_M146V変異体トランスジェニックマウスを、海馬における学習およ び記憧の電気生理学的相関として長期増強(LTP)を研究するのに用いた。従来技 術による400μm厚の海馬スライス上で記録を実行した。手短には、ハロタン麻酔 下でマウスを断頭した後に、脳を取り出し、そして海馬を含有する横断切片を１ 分以内に取得した。スライスを、酸素負荷した人工的脳脊髄液中で記録の前の１ 時間室温にて保持した。１回に１枚のスライスを記録チャンバーに移し、ここで それらを酸素負荷した人工脳脊髄液と加湿空気との間の界面で32℃にて維持した 。次いで、スライスを記録チャンバー中でさらに１時間平衡化させた。 細胞外電場記録を、Schaeffer側枝−錐体細胞シナプスで海馬のCA1亜領域にお いて実行した。0.03Hzの周波数および最大応答の30〜50％の強度でのSchaeffer 側枝の刺激によってシナプス応答を誘導した。長期増強を誘導するためのテタヌ スは、10秒の刺激列間インターバル(intertrain interval)で、200ms間持続する 100Hz刺激の５つの刺激列からなる。電場電位をAxopatch 200B増幅器(Axon Inst rument)を用いて記録した。ガラスピペットを1.5mmの外径を有するホウケイ酸ガ ラスから製作し、そして２工程のNarishlgeプラーで引いた。PCLAMP6ソフトウェ ア(Axon Instrument)を用いて486-IBMコンパチブルコンピューター上でデータを 取得した。 シナプス前機能における任意の異常性を試験するために、本発明者らは、対応 パルス促通(paired-pulse facilitation)における差異を調査した。これはシナ プス効力における使用依存性の増大の例であり、そして起点においてシナプス前 であると考えられる。海馬において、２つの刺激が迅速な連続でSchaeffer側枝 に送達される場合、刺激間インターバルが短くなるので対応パルス促進は、二次 刺激に対する増強された樹状突起応答としてそれ自身を表す。３組の野生型/ト ランスジェニックマウスにおいて、本発明者らは、20ms〜１秒の範囲の刺激間イ ンターバルにわたる対応パルス促進においていずれの差異も観察しなかった。こ れらのデータは、PS1_M146V変異体トランスジェニックマウスにおいて、Schaeffe r側枝線維の興奮性および神経伝達物質放出が正常であるようであることを示唆 する。 テタヌス刺激は、コントロール（ｎ＝３）およびPS1_M146V変異体トランスジェ ニックマウス(ｎ＝２)の両方においてシナプス強度における長期持続増大を誘導 した。PS1_M146V変異体トランスジェニックマウスから取得したスライスにおいて 、シナプス強度における長期持続増大は、コントロールマウスから取得したもの よりも30％多かった。 本発明の好ましい実施態様を本明細書中に詳細に記載してきたが、本発明の精神 または添付の請求の範囲の範囲を逸脱することなく、本発明に変化をもたらし得 ることは、当業者に理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ６０／０２１，７００ (32)優先日 平成８年７月12日(1996．7．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０２９，８９５ (32)優先日 平成８年11月８日(1996．11．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０３４，５９０ (32)優先日 平成９年１月２日(1997．1．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 セント ジョージ―ハイスロップ，ピータ ー エイチ. カナダ国 エム５ピー ３ジー３ オンタ リオ，トロント，リッチビュー アベニュ ー 210 (72)発明者 フレイザー，ポール イー. カナダ国 エム６エス ３エル９ オンタ リオ，トロント，ウィンダミア アベニュ ー 611 (72)発明者 ロメンス，ジョアンナ エム. カナダ国 エム５ティー ２エックス４ オンタリオ，トロント，マッコール スト リート 105

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プレセニリン相互作用タンパク質の少なくともプレセニリン相互作用ドメイ ンをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸であって、該プレセニ リン相互作用ドメインが、哺乳動物S5a(配列番号２のほぼ残基70〜377)、GT24( 配列番号４のほぼ残基346〜862)、p0071(配列番号６のほぼ残基509〜1022)、Rab 11(配列番号７)、レチノイドＸレセプター-β(配列番号８)、細胞質シャペロニ ン(配列番号９)、Y2H35(配列番号10)、Y2H171(配列番号11)、およびY2H41(配列 番号12)のプレセニリン相互作用ドメインからなる群より選択される、単離され た核酸。 ２．少なくとも10個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む単離され た核酸であって、該少なくとも10個の連続するヌクレオチドが、配列番号１、配 列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配 列番号11、配列番号12、GenBankアクセス番号F08730、T18858、X81889、X56740 、X53143、M84820、X63522、M81766、U17104、X7480、R12984、D55326、およびT 64843、ならびにこれらの配列のいずれかに相補的な配列からなる群より選択さ れる、単離された核酸。 ３．プレセニリン相互作用タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配 列を含む単離された核酸であって、該プレセニリン相互作用タンパク質が、哺乳 動物S5a、GT24、p0071、Rab1、レチノイドＸレセプター-β、細胞質シャペロニ ン、Y2H35、Y2H171、およびY2H41タンパク質からなる群より選択される、単離さ れた核酸。 ４．ヒトプレセニリン相互作用タンパク質遺伝子の対立遺伝子改変体または異種 特異的ホモログを同定する方法であって、以下の工程： ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ヒトプレセニリン相互 作用タンパク質遺伝子配列にハイブリダイズし得る核酸プローブまたはプライマ ーを選択する工程； 該プローブまたはプライマーを、該改変体またはホモログに対応する核酸を包 含し得る核酸のサンプルと混合する工程； 該改変体またはホモログに対応する該核酸への該プローブまたはプライマーの ハイブリダイゼーションを検出する工程、 を包含する、方法。 ５．前記サンプルが、ヒト、哺乳動物、または無脊椎動物のゲノムDNA、mRNA、 およびcDNAからなる群より選択される核酸のサンプルを含む、請求項４に記載の 方法。 ６．ヒトプレセニリン相互作用タンパク質遺伝子の対立遺伝子改変体または異種 特異的ホモログを同定する方法であって、以下の工程： ヒトプレセニリン相互作用タンパク質に選択的に結合し得る抗体を選択する工 程； 該抗体を、該改変体またはホモログに対応するタンパク質を含有し得るタンパ ク質サンプルと混合する工程； 該抗体の、該改変体またはホモログに対応する該タンパク質への結合を検出す る工程、 を包含する、方法。 ７．ヒトプレセニリン相互作用タンパク質の対立遺伝子改変体または異種特異的 ホモログをコードする、単離された核酸。 ８．請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む組換えベクターを 含む、単離された核酸。 ９．前記ベクターが発現ベクターであり、そして前記プレセニリン相互作用タン パク質ヌクレオチド配列が、調節領域に作動可能に連結されている、請求項８に 記載の単離された核酸。 １０．前記発現ベクターが、哺乳動物S5a、GT24、p0071、Rab11、レチノイドＸ レセプター-β、細胞質シャペロニン、Y2H35、Y2H171、およびY2H41タンパク質 からなる群より選択される、プレセニリン相互作用タンパク質の少なくともプレ セニリン相互作用ドメインをコードする、請求項９に記載の単離された核酸。 １１．プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子の内因性調節領域に対応するヌク レオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む、単離された核酸。 １２．請求項９〜１１のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細 胞、またはその子孫。 １３．アルツハイマー病のための非ヒト動物モデルであって、ここで該動物また はその祖先のゲノムが、少なくとも１つの組換え構築物によって改変されており 、そして該組換え構築物が、(１)異種特異的正常プレセニリン相互作用タンパク 質の少なくとも機能ドメインをコードするヌクレオチド配列の挿入、(２)異種特 異的変異体プレセニリン相互作用タンパク質の少なくとも機能ドメインをコード するヌクレオチド配列の挿入、(３)異種特異的変異体プレセニリン相互作用タン パク質の同種ホモログの少なくとも機能ドメインをコードするヌクレオチド配列 の挿入、および(４)内因性プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子の不活化から なる群より選択される改変を導入されている、非ヒト動物モデル。 １４．前記改変が、哺乳動物S5a、GT24、p0071、Rab11、レチノイドＸレセプタ ー-β、細胞質シャペロニン、Y2H35、Y2H171、およびY2H41タンパク質からなる 群より選択される、正常または変異体ヒトプレセニリン相互作用タンパク質の少 なくとも機能ドメインをコードするヌクレオチド配列の挿入である、請求項１３ に記載の動物。 １５．前記動物が、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、 ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およひ非ヒト霊長類からなる群より選択されるか、 または無脊椎動物である、請求項１４に記載の動物。 １６．プレセニリン相互作用タンパク質の少なくとも機能ドメインを産生する方 法であって、 適切な条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、前記核酸を発現させるこ とによって該少なくとも機能ドメインを産生する工程 を包含する、方法。 １７．哺乳動物S5a、GT24、p0071、Rab11、レチノイドＸレセプター-β、細胞質 シャペロニン、Y2H35、Y2H171、およびY2H41タンパク質からなる群より選択され るタンパク質の実質的に純粋な調製物。 １８．配列番号２、配列番号４、配列番号６、ならびにGenBankアクセス番号F08 730、T18858、X81889、X56740、X53143、M84820、X63522、M81766、U17104、X74 801、R12984、D55326、およびT64843からなる群より選択される少なくとも10個 の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドの実質的に純粋な 調製物。 １９．哺乳動物S5a、GT24、p0071、Rab11、レチノイドＸレセプター-β、細胞質 シャペロニン、Y2H35、Y2H171、およびY2H41タンパク質からなる群より選択され るプレセニリン相互作用タンパク質の少なくともプレセニリン相互作用ドメイン を含む、ポリペプチドの実質的に純粋な調製物。 ２０．哺乳動物S5a、GT24、p0071、Rab11、レチノイドＸレセプター-β、細胞質 シャペロニン、Y2H35、Y2H171、およびY2H41タンパク質からなる群より選択され るプレセニリン相互作用タンパク質の抗原決定基を含む、ポリペプチドの実質的 に純粋な調製物。 ２１．哺乳動物S5a、GT24、p0071、Rab11、レチノイドＸレセプター-β、細胞質 シャペロニン、Y2H35、Y2H171，およびY2H41タンパク質からなる群より選択され るプレセニリン相互作用タンパク質の抗原決定基に選択的に結合する抗体の実質 的に純粋な調製物。 ２２．前記抗体が、変異体プレセニリン相互作用タンパク質の抗原決定基に選択 的に結合し、正常プレセニリン相互作用タンパク質には結合しない、請求項２１ に記載の抗体の実質的に純粋な調製物。 ２３．請求項２１〜２２のいずれかに記載の抗体を産生する細胞株。 ２４．プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子の発現を調整し得る化合物を同定 する方法であって、以下の工程： 細胞を試験候補物と接触させる工程であって、該細胞が、コード領域に作動可 能に連結されているプレセニリン相互作用タンパク質遺伝子の調節領域を含有す る、工程；および 該コード領域の発現の変化を検出する工程、 を含む、方法。 ２５．プレセニリン相互作用タンパク質に選択的に結合し得る化合物を同定する 方法であって、以下の工程： 少なくとも１つのプレセニリン相互作用タンパク質成分を含有する調製物を提 供する工程； 該調製物と、少なくとも１つの候補化合物を含有するサンプルを接触させる工 程；および 該候補化合物への該プレセニリン相互作用タンパク質成分の結合を検出する工 程、 を含む、方法。 ２６．プレセニリン相互作用タンパク質の活性を調整し得る化合物を同定する方 法であって、以下の工程： 正常または変異体プレセニリン相互作用遺伝子を発現する細胞を提供する工程 ； 該細胞と、少なくとも１つの候補化合物を接触させる工程；および 該活性のマーカーにおける変化を検出する工程、 を含む、方法。 ２７．前記マーカーの測定が、発現される変異体プレセニリン相互作用タンパク 質遺伝子を有する細胞と、発現される変異体プレセニリン相互作用タンパク質遺 伝子を含まない以外は同一の細胞との間の差違を示す、請求項２６に記載の方法 。 ２８．被験体が、変異体プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子を有するかどう かを決定する診断方法であって、以下の工程： 該被験体の生物学的サンプルを提供する工程； 該サンプルにおいて、変異体プレセニリン相互作用タンパク質核酸、変異体プ レセニリン相互作用タンパク質、または変異体プレセニリン相互作用タンパク質 活性を検出する工程、 を含む、方法。 ２９．実質的に純粋なプレセニリン相互作用タンパク質および薬学的に受容可能 なキャリアを含む薬学的調製物。 ３０．プレセニリン相互作用タンパク質を作動可能にコードする発現ベクターお よび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的調製物であって、該発現ベクター が、ヒト被験体において、該プレセニリン相互作用タンパク質を発現し得る、薬 学的調製物。 ３１．プレセニリン相互作用タンパク質アンチセンス配列を作動可能にコードす る発現ベクターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的調製物であって 、該発現ベクターが、ヒト被験体において、該プレセニリン相互作用タンパク質 アンチセンス配列を発現し得る、薬学的調製物。 ３２．実質的に純粋な抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的調製 物であって、該抗体が、変異体プレセニリン相互作用タンパク質と選択的に結合 する、薬学的調製物。 ３３．正常プレセニリン相互作用タンパク質に選択的に結合する抗体を本質的に 含まない、請求項３２に記載の薬学的調製物。