JP2001517065A

JP2001517065A - トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法

Info

Publication number: JP2001517065A
Application number: JP50194697A
Authority: JP
Inventors: クレアマッコンローグ，リサ; エイ．スーバート，ピーター
Original assignee: アセナニューロサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2001-10-02
Also published as: WO1996040895A1; CA2221986A1; AU6264996A; EP0832205A1

Abstract

(57)【要約】アルツハイマー病の潜在的な処置を試験するためのトランスジェニック動物モデルの構築を記載する。このモデルは、βアミロイド前駆体タンパク質（APP）の３つすべての形態（APP695、APP751、およびAPP770）、ならびに天然に存在する変異（例えば、アミノ酸717でのLondonおよびIndiana家族性アルツハイマー病（FAD）変異）に基づく種々の点変異、APP遺伝子における推定変異、およびＡβ領域を含むAPPの短縮形態の発現に基づいて、アルツハイマー病において観察される病理と類似した病理によって特徴づけられる。APP遺伝子構築物は、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーター、またはトランスジェニック動物の脳組織において高レベルでＡ＄(b)もしくは変異形態のAPPを発現し得る他のプロモーターを使用して調製される。動物細胞は、トランスジェニック動物から単離され得るか、またはリポフェクションもしくはエレクトロポレーションのような標準的な技術を用いて、同じ構築物を使用して調製され得る。トランスジェニック動物または動物細胞は、APP、βアミロイドペプチドの量、神経病理、および動物の行動変化に対するそれらの効果により測定されるような、アルツハイマー病の病理学的経過を変化させる化合物についてのスクリーニングのために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法発明の背景アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルが、トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病の処置に有用な治療薬をスクリーニングするための方法と共に、記載される。アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の変性性障害であって、Alios Alzheimerによって１９０７年に初めて、認識能力の著しい減退と全般的な痴呆とを示した患者の一人を調べた後に、記載された。（The early story of Alzheimer's Disea se，編者Bickら(Raven Press，New York 1987)）。これは、高齢者における痴呆の主要な病因である。ＡＤ患者は、記憶の欠失および知的機能について困難を有し、進行すると正常な個人として機能し得なくなる。知的技能の欠失と共に、患者は、人格の変化、社会的に不適格な行動、および精神分裂症を示す（A Guide to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders，編者J orm（New York University Press，New York 1987）。ＡＤは、その不可避の神経変性に対する有効な緩和または予防処置がないため、犠牲者および家族の両方を疲弊させる。ＡＤの社会および国家経済への影響は甚大である。２０００年までに、米国における痴呆症の高齢者人口は４１％増加すると予測される。医療システムにとって、ＡＤ患者に対する施設および補助のケアを年間４００億ドルの見積りコストで提供しなければならないことは高価である（Jorm(1987);Fisher，"Alzheimer' s Disease"，New York Times,August 23，1989，page D1，編者Reisberg(The Fr ee Press，New York & London 1983)）。これらの要因は、ＡＤに対する効果的な処置を創出するための行動をとらねばならないことを意味する。巨視的レベルでは、ＡＤ患者の脳は通常小さく、時には１０００ｇ以下となる。微視的レベルでは、ＡＤの組織病理学的特徴として、神経細線維のもつれ（ＮＦＴ）、神経突起（neuritic）プラーク、およびニューロンの変性が挙げられる。ＡＤ患者は、大脳皮質の前頭および側頭部の皮質の神経細胞、海馬のピラミッド状ニューロン、扁桃体の内部、内中部、および皮質核のニューロン、青斑核のノルアドレナリン作動性ニューロン、および基底前脳のコリン作動性システムのニューロンの変性を示す。コリン作動性システムのニューロンの喪失は、ＡＤにおけるコリン作動性シナプス前マーカーの一貫した欠損をもたらす（Fisher(1983) ;Alzhelmer's Disease and Related Disorders，Research and Development編者 Kelly(Charles C．Thomas,Springfield，IL．1984)）。事実、ＡＤは脳の神経病理によって定義される。ＡＤは、皮質、海馬、海馬台、海馬回、および扁桃体における直径２００μｍまでの神経突起プラークに関連する。神経突起プラークの主要な構成成分の１つはアミロイドであって、これはCongo Redで染色される（Fisher(1983);Kelly(19 84)）。Congo Redで染色されるアミロイドプラークは細胞外であり、明視野で桃色または錆色、そして偏光で複屈折する。プラークはポリペプチド線維からなり、多くは血管の周りに存在して、脳内の種々のニューロンへの血液供給を減少させる。遺伝的素因、感染因子、毒素、金属、および頭部外傷などの種々の因子が、いずれもＡＤ神経障害の可能な機構として示唆されている。しかし、入手可能な証拠は、ＡＤに関して明確な型の遺伝的素因があることを強く示す。まず分子分析は、ある種の被ＡＤ家系において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の変異の証拠を提供した（Goateら、Nature 349:704-706(1991);Murrellら、S cience 254:97-99(1991);Chartier-Harlinら、Nature 353:844-846(1991);Mulla nら，Nature Genet．1:345-347(1992)）。ＡＤ初期発症の優勢な形態についてのさらなる遺伝子は、染色体１４および染色体１に存在する（Rogaevら，Nature 3 76:775-778(1995);Levy-Lahadら，Science 269:973-977(1995);Sherringtonら， Nature 375:754-760(1995)）。ＡＤに関連する他の遺伝子座は、染色体１９に存在し、アポリポタンパク質Ｅの変異形態をコードする（Corder，Science 261:92 1-923(1993)）。アミロイドプラークは、ＡＤ患者および４０歳まで生存したダウン症個体において豊富に存在する。ダウン症におけるＡＰＰの過剰発現は、３０歳を越えるダウン症患者におけるＡＤの発症の可能な原因として認識されている（Rumbleら， New England J．Med．320:1446-1452(1989);Mannら，Neurobiol．Aging 10:397- 399(1989)）。プラークはまた、数は少ないが、正常な高齢の脳においても存在する。これらのプラークは、主としてアミロイドβペプチドからなり（Ａβ；文献において時にβ−アミロイドペプチドまたはβペプチドとも称される）（Glen nerおよびWong，Biochem．Biophys．Res．Comm．120:885-890(1984)）、これはまた、脳血管のアミロイド沈着における主要なタンパク質構成成分である。アミロイドは、ベータひだ状シートに配置された線維状物質である。Ａβは、４３アミノ酸までを含む疎水性ペプチドである。そのアミノ酸配列の決定は、ＡＰＰｃＤＮＡ（Kangら，Nature 325:733-735(1987);Goldgaberら，Science 235:877-88 0(1987);Robakisら，Proc．Natl．Acad．Sci．84:4190-4194(1987);Tanziら，Na ture 331:528-530(1988)）およびゲノムＡＰＰＤＮＡ（Lemaireら，Nucl．Acids Res．17:517-522(1989);Yoshikaiら，Gene 87，257-263(1990)）のクローニングを導いた。ＡＰＰｃＤＮＡの多数の形態が同定され、そこには３つの最も多量な形態、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０が含まれる。これらの形態は、単一の前駆体ＲＮＡからオルタネートスプライシングによって生じる。この遺伝子は、１８エクソンを伴う１７５ｋｂ超にまたがる（Yoshikaiら(199 0)）。ＡＰＰは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインを含む。Ａβは、疎水性の膜貫通ドメインのすぐ外側の２８アミノ酸まで、およびこの膜貫通ドメインの１５残基までからなる。従って、Ａβは、脳ならびに心臓、腎臓および脾臓などの他の組織に正常に見出されるＡＰＰに由来する切断産物である。しかし、Ａβ沈着は普通、脳のみにおいて豊富に見出される。ＡＰＰのより大きな形態（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０）は、ＡＰＰ６９５および１つまたは２つのさらなるドメインからなる。ＡＰＰ７５１は、ＡＰＰ６９５の６９５アミノ酸全ておよびさらなる５６アミノ酸からなり、これはセリンプロテアーゼインヒビターのKunitzファミリー（ＫＰＩ）に対して相同性を有する（Tanziら(1988);Weidemannら，Cell 57:115-126(1989);Kitaguchiら，Nature 3 31:530-532(1988);Tanziら，Nature 329:156(1987)）。ＡＰＰ７７０は、ＡＰＰ７５１の７５１アミノ酸全て、および、ニューロン細胞表面抗原ＯＸ−２に相同なさらなる１９アミノ酸ドメインを含む（Weidemannら(1989);Kita guchiら(1988)）。他に注記のない限り、本明細書において指示されるアミノ酸位置は、ＡＰＰ７７０に見られるものとしての位置である。ＡＰＰ６９５およびＡＰＰ７５１における等価な位置のアミノ酸数は、場合によって、ＯＸ−２およびＫＰＩドメインの不存在のために異なっている。慣習上、ＡＰＰの全ての形態のアミノ酸位置はＡＰＰ７７０形態の等価な位置によって指示される。他に注記のない限り、本明細書はこの慣習に従う。他に注記のない限り、本明細書において指示されるＡＰＰおよびＡＰＰフラグメントの全ての形態（Ａβの全ての形態を含む）は、ヒトＡＰＰアミノ酸配列に基づく。ＡＰＰは、リーダー配列の除去および硫酸および糖基の付加によって翻訳後に修飾される。 Van Broeckhavenら，Science 248:1120-1122(1990)は、２つのオランダ人家系において、ＡＰＰ遺伝子が、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ −Ｄ）に密接に関連することを示した。これは、２人のオランダ人患者での、ＡＰＰコード領域における点変異の発見によって確認された（Levyら，Science 24 8:1124-1128(1990)）。この変異は、Ａβの２２位（ＡＰＰ６９５の６１８位、またはＡＰＰ７７０の６９３位）においてグルタミン酸をグルタミンで置換した。さらに、ある種の家系は遺伝的にアルツハイマー病の素因があり（この病態は家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）と称される）、これは全長タンパク質の７１７位でのアミノ酸置換の結果生じる変異による（Goateら(1991);Murrellら(1991 );Chartier-Harlinら(1991)）。これらの変異は家系内で疾患と共分離し、後期発症ＡＤの家系には存在しない。このアミノ酸７１７での変異は、ＡＰＰからのＡβ_1-42形態のＡβ形態の産生を増加させる（Suzukiら，Science 264:1336-134 0(1994)）。他の変異形態は、全長タンパク質の６７０位および６７１位でのアミノ酸の変化を含む（Mullanら(1992)）。アミノ酸６７０および６７１へのこの変異は、ＡＰＰからの全Ａβの産生を増加させる（Citronら，Nature 360:622-6 74(1992)）。ＡＤ研究のための確固とした動物モデルはないが、高齢の非ヒト霊長類は、脳実質組織において、およびある種の間質および皮質管の壁において、Ａβのアミロイドプラークを生じるようである。高齢の霊長類およびイヌは、動物モデルとして役立ち得るが、維持するには高価であり、長期の研究期間を要し、そして発症する病理の範囲が極めて変動し得る。実験モデルとして有用であるに充分なほどＡＤへの類似性を有する自然発生的な動物での変異はない。種々のモデルが提案され、これらではある種のＡＤ様の徴候が、電解、ＡＤ脳サンプルの移植、塩化アルミニウム、カイニン酸またはコリン類縁体によって誘導され得る（Kisnerら，Neurobiol．Aging 7:287-292(198 6);Mistryら，J Med Chem 29:337-343(1986)）。Floodら，Proc．Natl．Acad．S ci．88:3363-3366(1986)は、マウスにおける、Ａβに相同な４つの合成ペプチドの記憶喪失効果を報告した。これらはいずれも、ＡＤとは、共通の徴候、生化学または病因（pathogenesis）を共有しないため、病因（etiology）または処置についての有用な情報を多く与えそうもない。数種のトランスジェニック齧歯類系が作製され、これらは、多様なプロモーターによって制御されるヒトＡＰＰ遺伝子またはヒトＡＰＰ相補性ＤＮＡを発現する。E.coliβ−ガラクトシダーゼに連結したヒトＡＰＰプロモーターを有するトランスジェニックマウス（Wirakら，The EMBO J 10:289-296(1991)）、ならびにヒトAPＰ７５１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックマウス（Quonら，Nature 352:239-241(1991)）またはＡβを含むｃＤＮＡのサブフラグメントを発現するトランスジェニックマウス（Wirakら，Science 253:323-325(1991);Sandhuら，J ．Biol．Chem．266:21331-21334(1991);Kawabataら，Nature 354:476-478(1991) ）が作製されている。異なる研究において得られた結果は、用いられるプロモーターのソースおよびタンパク質コード配列に依存するようである。例えば、Wira kら，Science 253:323-325(1991)は、ある形態のＡβを発現するトランスジェニックマウスにおいて、Ａβに対して調製された抗体と反応性の「アミロイド様」物質の細胞内蓄積が観察されることを見出したが、他の組織病理学的な疾患徴候は見出さなかった。抗体反応性物質が細胞内であることおよび他の徴候がないことは、この特定のトランスジェニック動物がアルツハイマー病の忠実なモデル系でないことを示唆する。その後の研究は、同様な染色が非トランスジェニックのコントロールマウスで見られたことを示し、Wirakら，Scienc e 253:323-325(1991)は、Science 255:143-145(1992)でのコメントにおいて、部分的に撤回された。従って、Wirakらによって見られた染色は、人工産物のようである。 Kawabataら(1991)は、トランスジェニック動物におけるアミロイドプラークの生成、神経細線維のもつれ、および神経細胞死を報告した。これらの研究のそれぞれにおいて、ＡβまたはＡβ含有フラグメントが発現された。Wirakら(1991) がヒトＡＰＰプロモーターを用いたのに対して、Kawabataら(1991)はヒトｔｈｙ −１プロモーターを用いた。しかし、Kawabataら(1991)はその後、Kawabataら， Nature 356:23(1992)およびKawabataら，Nature 356:265(1992)によって撤回された。Quonら(1991)のニューロン特異的エノラーゼプロモーターからＡＰＰ７５１ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックマウスにおいて、合成Ａβに対して調製された抗体と反応性の物質の、まれな小さな細胞外沈着が観察された。この初期のトランスジェニックマウスを記載した報文を考察すると、特徴的なアルツハイマー病状を生じていないことが示される（Marx，Science 255:1200-1202(1992 )を参照）。ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターからＡＰＰ７５１を発現するトランスジェニックマウスが、最近、以下に記載されている：McConlogueら，Neurobiol．Aging 15:S12(1994)，Higginsら，Ann Neurol．35:598-607(1995) ，Muckeら，Brain Res．666:151-167(1994)，Higginsら，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 92:4402-4406(1995)，およびU.S．Patent 5,387,742 to Cordell。Higgi nsら，Ann Neurol．35:598-607(1995)は、Quonら(1991)に記載されたものと同じマウスでの結果を記載する。そのようなマウスは、極初期のＡＤおよび若年ダウン症の症例により典型的であるＡβ沈着を、ごくわずかしか有さない。このトランスジェニックマウスに見られた沈着は、より低い量ではあるが、非トランスジェニックのコントロール動物においても見られた。より進行した障害、例えば高頻度の濃縮プラーク、神経突起ジストロフィー、および著しい神経膠症は、これらのマウスでは見られない（Higginsら，Ann Neurol．35:598-607(1995)）。McC onlogueら(1994)は、これらのマウスではＡβ沈着は見られなかったと報じた。ＡＰＰがニューロン特異的シナプトフィシン（synaptophysin）プロモーターから発現されるトランスジェニックマウスは、上記のＮＳＥＡＰＰマウスからの脳組織におけると等価な低レベルでＡＰＰを発現する。これらのマウスはまた、いかなる脳障害も示さないと報じられた（Higginsら）。酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＡＰＰ構築物を含むトランスジェニックマウスもまた作製されている（PearsonおよびChoi，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10578 -10582(1993);Lambら，Nature Genetics 5:22-30(1993);Buxbaumら，Biochem．B iophys．Res．Comm．197:639-645(1993)）。これらのマウスはヒトＡＰＰゲノム遺伝子全体を含み、ヒトＡＰＰタンパク質を、内因性ＡＰＰと類似のレベルで発現する；ＮＳＥプロモーターを用いるマウスにおいて得られるよりも高レベルの発現である。しかし、これらのマウスのいずれも、ＡＤに類似の病状の証拠を示さない。アルツハイマー病動物モデルは、トランスジェニックモデルを含めて、最近、 Lannfeltら，Behavioural Brain Res．57:207-213(1993),およびFukuchiら，Ann ．N.Y．Acad．Sci．695:217-223(1993)によって総説された。Lannfeltらは、見かけ上のプラークを示す従来のトランスジェニック動物のいずれも、ＡＤに特徴的な神経病理学的変化を示さないことを指摘する。Lannfeltらはまた、従来のトランスジェニック動物モデルの「失敗」の可能性のある理由を議論する。同様に、Fukuchiらは、従来のトランスジェニック動物モデルがＡＤに関連することが公知の特徴の大部分を示さないことを議論する。例えば、Quonらによるトランスジェニックマウスは、Ａβ免疫反応性の沈着を生じると報じられるが、これはチオフラビンＳでごくまれに染色され、Congo Redでは全く染色されず、ＡＤＡβ 沈着の染色パターンと対照的である。従って、本発明の目的は、トランスジェニック技術を用いて構築される、アルツハイマー病の動物モデルを提供することにある。本発明のさらなる目的は、アミロイド前駆体タンパク質の発現におけるある種の遺伝的異常によって特徴付けられる、トランスジェニック動物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病の組織病理に類似の１種またはそれ以上の組織病理を示す、トランスジェニック動物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、脳組織において高レベルで１つまたはそれ以上のＡ β−含有タンパク質を発現する、トランスジェニック動物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、トランスジェニック動物モデルを用いる、アルツハイマー病の処置のための潜在的な薬物をスクリーニングする方法を提供することにある。発明の要約アルツハイマー病の潜在的な処置を試験するための、トランスジェニック動物モデルの構築が記載される。このモデルは、天然のアルツハイマー病において存在する状態への類似性が大きいことによって特徴付けられ、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の３つの主要な形態、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０、またはそのサブフラグメントの１つまたはそれ以上の発現を制御する能力、および、天然の変異に基づく種々の点変異、例えばアミノ酸７１７でのＦＡＤ変異、およびＡＰＰ遺伝子における予想される変異に基づく。ＡＰＰ遺伝子構築物は、ヒト、マウスまたはラット由来の天然のＡＰＰプロモーターを用いて調製される。効果的なプロモーターは、ヒト血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ−Ｂ）遺伝子プロモーター、および、動物への水または食餌に亜鉛などの重金属を添加することによって制御し得る、マウスメタロチオネイン（metall othionine）プロモーターなどの誘導性プロモーターである。構築物のニューロン特異的な発現が、ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーターを用いることによって達成し得る。構築物は、マイクロインジェクションなどの標準的手法を用いて動物の胚、または胚性幹細胞へと導入される。２つの方法によって、細胞培養に基づくモデルも調製され得る。細胞は、トランスジェニック動物から単離され得、または、標準的な細胞トランスフェクション技術をもって、同じ構築物を用いて、確立された細胞培養物から調製され得る。本明細書において開示される構築物は、一般にＡＰＰの３つの形態：ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ７７０のうちの１つのすべてまたは連続する部分、好ましくは本明細書において記載されるＡβ−含有タンパク質をコードする。Ａβ−含有タンパク質の例として、以下のすべてまたは連続する部分を含むタンパク質が挙げられる：ＡＰＰ７７０、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および／または７１７において変異を有するＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および／または７１７において変異を有するＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および／または７１７において変異を有するＡＰＰ６９５、ここで、これらＡβ−含有タンパク質は、それぞれヒトＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４を含む。記載される特定の構築物のいくつかは、以下のタンパク質コード配列を用いる：ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ；構築物中にＯＸ−２ドメインを有さず、ＫＰＩプロテアーゼインヒビタードメインを含むＡＰＰ７５１ｃＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ７５１ｃＤＮＡ；ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ６９５ｃＤＮＡ；それぞれβ−セクレターゼまたはα− セクレターゼ切断部位である、アミノ酸６７１または６８５において短縮型となった（truncated）ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０をコードするように短縮型となったＡＰＰｃＤＮＡ；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０をコードするように短縮型となった、少なくとも１つのイントロンを含むＡＰＰｃＤＮＡ；Ａβ領域（ＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４）およびＡＰＰの残りのカルボキシ末端５６アミノ酸を伴う、ＡＰＰリーダー配列；Ａβ領域およびアミノ酸７１７に変異を加えた残りのカルボキシ末端５６アミノ酸を伴う、ＡＰＰリーダー配列；Ａβ領域を伴う、ＡＰＰリーダー配列；Ａβ領域およびＡＰＰの残りのカルボキシ末端５６アミノ酸；Ａβ領域およびアミノ酸７１７に変異を加えたＡＰＰの残りのカルボキシ末端５６アミノ酸；コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＡＰＰ遺伝子構築物；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを加えた、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＡＰＰ遺伝子構築物；アミノ酸６７１または６８５において短縮型となったコンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＡＰＰ遺伝子構築物；および少なくともＡＰＰのアミノ酸６７２から７２２を含む、ＡＰＰｃＤＮＡ構築物。これらのタンパク質コード配列は、コードされたＡβ関連タンパク質の輸送および分泌を特定するリーダー配列に作動可能に連結される。好ましいリーダー配列は、ＡＰＰリーダー配列である。これらのタンパク質コード配列組合せは、トランスジェニック動物脳組織においてＡβの高度の発現を生じるプロモーターに作動可能に連結される。好ましいプロモーターは、ヒト血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ−Ｂ）遺伝子プロモーターである。さらなる構築物は以下のものを含む：ＰＤＧＦ−Ｂプロモーターによって制御されるヒト酵母人工染色体構築物；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを加えた、ＰＤＧＦ−Ｂプロモーターによって制御されるヒト酵母人工染色体構築物；相同組換えプロセスによって改変された内因性マウスまたはラットＡＰＰ遺伝子であって、相同組換えはマウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞のＡＰＰ遺伝子と、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せ有するヒトＡＰＰｃＤＮＡを保持するベクターとの間で行われ、常在性（resident）齧歯類染色体ＡＰＰ遺伝子において組換え点（組換えの好ましい部位はＡＰＰエクソン９内にある）を越えた配列が、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを有する類似のヒト配列によって置換される。これら構築物は、トランスジェニック動物に導入され、そして異なる構築物を発現する動物の交尾によって結合（combine）され得る。トランスジェニック動物または動物細胞は、動物におけるＡＰＰ、Ａβの量、および動物における神経病理、ならびに行動変化に対する効果により測定されるような、アルツハイマー病の病理学的経過を変化させる化合物についてのスクリーニングのために使用される。図面の簡単な説明図面の囲み（boxed）部分は、構築物のアミノ酸コード部分を示す。描線（fil led）部分は、図面の脚注に示されるようなタンパク質の種々のドメインを示す。線は、５’または３’非翻訳配列、隣接するゲノム配列、またはイントロンである、クローン中の配列を示す。図７および８における構築物の左側の線の中断は、長いＤＮＡ配列の存在を示す。図１ａは、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡコード配列の概略図である。図１ｂは、７１７位において変異を有するＡＰＰ７７０ｃＤＮＡコード配列の概略図である。図２ａは、ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡコード配列の概略図である。図２ｂは、７１７位において変異を有するＡＰＰ７５１ｃＤＮＡコード配列の概略図である。図３ａは、ＡＰＰ６９５コード配列の概略図である。図３ｂは、７１７位において変異を有するＡＰＰ６９５ｃＤＮＡコード配列の概略図である。図４ａは、ＡＰＰのカルボキシ末端部分のコード配列の概略図である。図４ｂは、７１７位において変異を有するＡＰＰのカルボキシ末端部分のコード配列の概略図である。図５は、ＡＰＰのＡβ部分のコード配列の概略図である。図６ａは、ＫＰＩおよびＯＸ−２エクソンのオルタナティブスプライシングを可能にする、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムコード配列の概略図である。図６ｂは、７１７位において変異を有する、ＫＰＩおよびＯＸ−２エクソンのオルタナティブスプライシングを可能にする、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムコード配列の概略図である。図７ａは、ヒトＡＰＰのＹＡＣコード配列の概略図である。図７ｂは、７１７位において変異を有するヒトＡＰＰのＹＡＣコード配列の概略図である。図８ａおよび８ｂは、相同組換えによるマウスＡＰＰ遺伝子の遺伝的改変の概略図であって、相同組換えはマウスＥＳ細胞のマウスＡＰＰ遺伝子と、ヒトＡＰＰｃＤＮＡ（野生型（図８ａ）またはＦＡＤ変異形態（図８ｂ））を保持するベクターとの間で行われ、遺伝子のエクソン９部分を指向する。この組換え事象の結果、常在性（resident）マウス染色体ＡＰＰ遺伝子においてエクソン９にある組換え点を越えた配列が、類似のヒト配列によって置換される。図９は、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＡＰＰ構築物である、ＰＤＡＰＰベクターの概略地図である。図１０は、ＰＤＡＰＰ構築物中に存在するＡＰＰのゲノム領域の図表である。図表に、元のイントロン６、７および８のサイズ、および最終イントロンのサイズを示す。ＰＤＡＰＰ構築物中に存在する、イントロン６および８中の欠失の部位も示す。図１１は、ＡＰＰスプライシングカセットおよびＰＤＡＰＰベクターの構築に用いた、中間体構築物を示す図表である。図１２は、ＰＤＡＰＰ−ｗｔベクター、およびＰＤＡＰＰ−ｗｔベクターの作製に用いたプラスミドを示す図表である。図１３は、ＰＤＡＰＰ−Ｓｗ／Ｈａベクター、およびＰＤＡＰＰ−Ｓｗ／Ｈａベクターの作製に用いたプラスミドおよび中間体構築物を示す図表である。図１４は、ＰＤＡＰＰ６９５_V-Fベクター、およびＰＤＡＰＰ６９５_V-Fベクターの作製に用いたプラスミドおよび中間体構築物を示す図表である。図１５は、ＰＤＡＰＰ７５１_V-Fベクター、およびＰＤＡＰＰ７５１_V-Fベクターの作製に用いたプラスミドおよび中間体構築物を示す図表である。発明の詳細な説明構築物およびトランスジェニック動物および動物細胞は、下記の方法および材料を用いて調製した。材料の入手源制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs（Beverly,MA.）、Promega Biological Research Products（Madison，WI.）、およびStratagene（La Jolla ，CA.）などの一般的な商業的入手源から得られる。放射性物質は、Dupont/NEN またはAmershamなどの一般的な商業的入手源から得られる。部位特異的変異誘発のための注文設計オリゴヌクレオチドは、Bio-Synthesis Inc.，Lewisville，TX などの、そのような材料の商業的提供者数社のいずれからも入手可能である。部位特異的変異誘発を行うためのキットは、Promega Biological Research Products およびStratageneなどの商業的供給者から入手可能である。ＡＰＰｍＲＮＡのＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０形態を含むｃＤＮＡのクローンは、Dr.Dmitry Goldgaber，NIHより直接得た。ＤＮＡのライブラリーは、Strata gene，La Jolla，CA.またはClontech，Palo Alto，CA.などの商業的供給者から入手可能である。ＰＣ１２および３Ｔ３細胞は、ＡＴＣＣから得た（それぞれ、＃ＣＲＬ１７２１および＃ＣＣＬ９２）。さらなるＰＣ１２細胞株を、Harvard Medical SchoolのDr.Charles Marotta、Massachusetts General Hospital、およびMcLean Hospitalから得た。この細胞株に適切な、標準的な細胞培養培地は、G ibco/BRLなどの一般的な商業的入手源から得られる。マウス幹細胞、Ｄ３株はDr .Rolf Kemlerから得た（Doetschmanら，J．Embryol．Exp．Morphol．87:27(1985 )）。ＤＮＡトランスフェクションのためのリポフェクチン、および安定な形質転換体の選択のための薬剤Ｇ４１８は、Gibco/BRLから入手可能である。ＡＰＰｃＤＮＡクローンの定義ｃＤＮＡクローンＡＰＰ６９５は、Kangら（Nature 325:733-735(1987)）によって記載されたｃＤＮＡの形態であり、脳におけるＡＰＰのもっとも優性な形態を表す。ｃＤＮＡクローンＡＰＰ７５１は、Ponteら（Nature 331:525-527(1988 )）によって記載された形態である。この形態はＡＰＰ６９５ｃＤＮＡに対して、１６８ヌクレオチドのインサートを含む。１６８ヌクレオチドのインサートは、ＫＰＩドメインをコードする。ｃＤＮＡクローンＡＰＰ７７０は、Kitaguchi ら（Nature 331:530-532(1988)）によって記載された形態である。この形態はＡＰＰ６９５ｃＤＮＡに対して、２２５ヌクレオチドのインサートを含む。このインサートは、ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡのインサートに存在する１６８ヌクレオチド、および、ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡには見られないさらなる５７ヌクレオチド領域を含む。２２５ヌクレオチドのインサートは、ＫＰＩドメインおよびＯＸ−２ドメインをコードする。３つの形態はすべて、同一の前駆体ＲＮＡ転写産物から、オルタナティブスプライシングによって生じる。１６８ヌクレオチドのインサートは、ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡおよびＡＰＰ７７０ｃＤＮＡの両方に存在する。ＡＰＰ６９５をコードする配列を配列番号：１に示す。この配列は、開始コドンＡＵＧの最初の塩基から始まり、６９５アミノ酸タンパク質をコードする。配列番号：１のヌクレオチド１７８９から１９１７の領域はＡβをコードする。ＡＰＰ６９５のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：２のアミノ酸５９７から６３９がＡβを形成する。ＡＰＰ６９５のアミノ酸構成は、Ａ５７、Ｃ１２、Ｄ４７、Ｅ８５、Ｆ１７、Ｇ３１、Ｈ２５、１２３、Ｋ３８、Ｌ５２、Ｍ２１、Ｎ２８、Ｐ３１、Ｑ３３、Ｒ３３、Ｓ３０、Ｔ４５、Ｖ６２、Ｗ８、Ｙ１７であり、計算上の分子量は７８，６４４．４５となる。これらの配列は、Kangら（1988）から引用した。ＡＰＰ７５１をコードする配列を配列番号：３に示す。この配列は、開始コドンＡＵＧの最初の塩基から始まり、７５１アミノ酸タンパク質をコードする。配列番号：３のヌクレオチド８６６から１０３３は、ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡには見られない。配列番号：３のヌクレオチド１９５７から２０８５の領域はＡβをコードする。ＡＰＰ７５１のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。配列番号：４のアミノ酸２８９から３４５はＡＰＰ６９５には見られない。この５７アミノ酸領域はＫＰＩドメインを含む。配列番号：４のアミノ酸６５３から６９５がＡβを形成する。これらの配列は、Ponteら（1988）から引用した。ＡＰＰ７７０をコードする配列を配列番号：５に示す。この配列は、開始コドンＡＵＧの最初の塩基から始まり、７７０アミノ酸タンパク質をコードする。配列番号：５のヌクレオチド８６６から１０９０は、ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡには見られない。配列番号：５のヌクレオチド１０３４から１０９０は、ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡには見られない。ヌクレオチド２０１４から２１４２の領域はＡβをコードする。ＡＰＰ７７０のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。配列番号：６のアミノ酸２８９から３６４はＡＰＰ６９５には見られない。この７６アミノ酸領域はＫＰＩおよびＯＸ−２ドメインを含む。配列番号：６のアミノ酸３４５から３６４はＡＰＰ７５１には見られない。この２０アミノ酸領域はＯＸ−２ドメインを含む。アミノ酸６７２から７１４がＡβを形成する。ＡＰＰの推定上の膜貫通領域は、アミノ酸７００から７２３に生じる。そうでない旨の記載がない限り、本明細書におけるヌクレオチド位置への言及は、配列番号：５の番号付けを指す。これは、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡに由来する番号付けである。そうでない旨の記載がない限り、本明細書におけるアミノ酸位置への言及は、配列番号：６の番号付けを指す。これは、ＡＰＰ７７０に由来する番号付けである。この番号付け規則に従うと、例えば、アミノ酸７１７位は、ＡＰＰ７７０のアミノ酸７１７、ＡＰＰ７５１のアミノ酸６９８、およびＡＰＰ６９５のアミノ酸６４２を指す。上記の配列は、Kangら（1988）およびKitaguchiら（1988）から引用した。そうでない旨の注記がない限り、本明細書において言及するＡＰＰおよびＡＰＰのフラグメントの全ての形態（Ａβの全ての形態を含む）は、ヒトＡＰＰアミノ酸配列に基づく。例えば、ＡβはヒトＡβを、ＡＰＰはヒトＡＰＰを、ＡＰＰ７７０はヒトＡＰＰ７７０を指す。本明細書において、用語ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写によって実際に調製されたＤＮＡ分子のみならず、コード領域が中断されずにタンパク質をコードする任意のＤＮＡ分子、すなわち、タンパク質をコードする連続したオープンリーディングフレームを有するＤＮＡ分子をも指す。従って、本明細書における用語ｃＤＮＡは、タンパク質コード領域がイントロン配列（またはタンパク質をコードしない任意の他の配列）によって中断されない、タンパク質をコードするＤＮＡ分子を指す便利な手段を提供する。ＡＰＰゲノム遺伝子座（locus）の定義以下の表１に列記したヒトゲノムＤＮＡクローンのファージおよびコスミドクローンの特徴付けは、アルツハイマー遺伝子について少なくとも１００ｋｂの最小サイズを初めて確立した。ＡＰＰ遺伝子には全体で１８エクソンが存在する（ Lemaireら、Nucl.Acid Res 17:517-522(1989);Yoshikaiら(1990);Yoshikaiら、N ucleic Acids Res 102:291-292(1991)）。Yoshikaiら（1990）は、ＡＰＰ遺伝子のエクソン−イントロン境界の配列を記載する。これらの結果を総合すると、アルツハイマー遺伝子の最小サイズが１７５ｋｂであることが示される。表１．アルツハイマーのコスミドおよびラムダクローン表２は、１７のイントロンがＡＰＰコード配列を中断する場所を示す。番号付けは、配列番号：５に示されるＡＰＰ７７０ｃＤＮＡのヌクレオチド位置を指す。エクソン１の開始ヌクレオチドは、最初の転写されるヌクレオチドを表す。これが負であるのは、＋１ヌクレオチドが習慣上ＡＵＧ開始コドンの最初のヌクレオチドだからである（Kangら(1988)）。エクソン１８の終止ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ中で、ポリ（Ａ）テールの前に存在する最後のヌクレオチドを表す（Yosh ikaiら(1990)）。Yoshikaiら(1990)およびYoshikaiら(1991)がエクソン８の位置において誤りを含むことが発見された。Yoshikaiら(1991)のFigure１は、エクソン７およびエクソン８を含むＥｃｏＲＩフラグメントの間にＥｃｏＲＩフラグメントを含む。実際は、この中間のＥｃｏＲＩフラグメントはエクソン８の直後に位置するため、エクソン７を含むＥｃｏＲＩフラグメントおよびエクソン８を含むＥｃｏＲＩフラグメントは互いに隣接している。表２．ＡＰＰ遺伝子配列におけるイントロンの位置ＡＰＰ遺伝子変異特定の家系は、遺伝的にアルツハイマー病にかかりやすく、この状態を家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）と称するが、これは全長タンパク質の７１７位でのアミノ酸置換をもたらす変異による（Goateら(1991);Murrellら(1991);Chartier -Harlinら(1991)）。これらの変異は、家系内で疾患と共に分離（co-segregate ）する。例えば、Murrellら（1991）は、エクソン１７（Murrellらはエクソン１５と呼ぶ）に見いだされる特定の変異を記載したが、この変異では７１７位のバリンがフェニルアラニンによって置換される。他のＦＡＤ変異形態は、全長タンパク質の６７０および６７１位でのアミノ酸の変化を含む（Mullanら(1992)）。この変異の１つの形態においては、６７０位のリジンがアスパラギンによって置換され、６７１位のメチオニンがロイシンによって置換される。この変異の効果は、培養細胞におけるＡβの産生を約７倍増加させることである（Citronら，Nature 360:672-674(1992);Laiら，Science 25 9:514-516(1993)）。６７１位のメチオニンのロイシンによる置換自体もＡβの産生を増加させることが示された。ＡＰＰ中のアミノ酸６６９、６７０および６７１位でのさらなる変異は、ＡＰＰからプロセシングされるＡβの量を減少させることが示された（Citronら，Neuron 14:661-670(1995)）。アミノ酸６９０にＶａｌを有するＡＰＰ構築物は、増加した量のＡβの短縮形態を産生する。全長タンパク質のアミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、または７１７での変異を有するＡＰＰ発現クローンを構築し得る。アミノ酸６７０および６７１でのＬｙｓからＡｓｎへの変異、およびＭｅｔからＬｅｕへの変異は、それぞれ時にスウェーデン型（Swedish）変異と称される。さらなる変異もまた、アミノ酸６６９、６７０、または６７１に導入され得、これらはＡＰＰからプロセシングされるＡβの量を増加または減少させる。任意のＡＰＰクローンまたはトランスジーンにおけるこれらのアミノ酸での変異は、部位特異的変異誘発によって創出され得るか（Vincentら，Genes&Devel．3:334-347(1989)）、または、一旦作られた後、標準的な遺伝子操作技術を用いて他の構築物に組み込まれ得る。アミノ酸７１７でのいくつかの変異は、時にハーディ（Hardy）変異と称される。そのような変異は、野生型のＶａｌ７１７コドンの、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎのコドンへの変換を含み得る。Ｖａｌ７１７の好ましい置換は、Ｐｈｅである。これらの変異は、変異タンパク質を発現する個体をアルツハイマー病を発症させやすくさせる。当該変異は、ＡＰＰの発現および／またはプロセシングに影響し、バランスをアルツハイマー病理の方向へ傾けると考えられる。アミノ酸６６９での変異は、野生型のＶａｌ６６９コドンの、Ｔｒｐのコドンへの変換、またはコドンの欠失を含み得る。アミノ酸６７０での変異は、野生型のＬｙｓ６７０コドンの、ＡｓｎまたはＧｌｕのコドンへの変換、またはコドンの欠失を含み得る。アミノ酸６７１での変異は、野生型のＭｅｔ６７１コドンの、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、またはＩｌｅのコドンへの変換、またはコドンの欠失を含み得る。Ｌｙｓ６７０の好ましい置換はＡｓｎであり、Ｍｅｔ６７１の好ましい置換はＬｅｕである。これらの変異は、変異タンパク質を発現する個体をアルツハイマー病を発症させやすくさせる。アミノ酸６６９，６７０および６７１への列記した他の変異は、ＡＰＰからプロセシングされるＡβの量を減少させることが知られる（Citronら(1995)）。これらの変異は、ＡＰＰのプロセシングに影響し、Ａβ産生の変化をもたらすと考えられる。ＡＰＰの短縮形態もまた、トランスジーン構築物から発現され得る。例えば、ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０をコードするように短縮型となったＡＰＰｃＤＮＡである。ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０をコードするように短縮型となったＡＰＰｃＤＮＡ構築物であって、ＰＤＧＦ−Ｂプロモーターに作動可能に連結したものは、ＰＤＡＰＰｃ１２５と称される。Ａβ−含有タンパク質をコードする核酸構築物トランスジェニック動物において使用するための構築物は、哺乳動物細胞における構築物の発現のためのプロモーター、およびＡＰＰの３つの形態：ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ７７０のうちの１つのすべてまたは連続する部分を含むタンパク質をコードする領域（本明細書に記載の特定のアミノ酸変異を伴った、または伴わない）を含有する。コードされるタンパク質は、Ａβ−含有タンパク質が好ましい。本明細書において、Ａβ−含有タンパク質はＡＰＰの３つの形態：ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ７７０のうちの１つのすべてまたは連続する部分を含むタンパク質（本明細書に記載の特定のアミノ酸変異を伴った、または伴わない）であって、このタンパク質は、ヒトＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４のすべてまたは一部分を含む。好ましいＡβ−含有タンパク質は、ヒトＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４を含む。このようなＡβ−含有タンパク質の好ましい形態は、以下のもののすべてまたは連続する部分を含む：ＡＰＰ７７０、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および／または７１７において変異を有するＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および／または７１７において変異を有するＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および／または７１７において変異を有するＡＰＰ６９５、ここで、これらＡ β−含有タンパク質は、それぞれヒトＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４を含む。上記のＡβ−含有タンパク質の好ましい形態は、以下のものである：ＡＰＰ７７０；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ７７０；ＡＰＰ７５１；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ７５１；ＡＰＰ６９５；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ６９５；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０からなるタンパク質；ＡＰＰのアミノ酸６７０から７７０からなるタンパク質；ＡＰＰのアミノ酸６７２から７７０からなるタンパク質；およびＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４からなるタンパク質。本明細書に開示された構築物において、Ａβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドであり得、ここでｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドは少なくとも１つのＡＰＰイントロン配列を含み、このイントロン配列はスプライシングに十分である。好ましい構築物は、以下のものを含む：ＡＰＰ７７０をコードするＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ７７０をコードするＤＮＡ；ＡＰＰ７７０のアミノ酸６７２から７１４を含むアミノ酸配列をコードするＡＰＰ７７０をコードするＤＮＡのフラグメント；ＡＰＰ７５１をコードするＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ７５１をコードするＤＮＡ；ＡＰＰ７７０のアミノ酸６７２から７１４を含むアミノ酸配列をコードするＡＰＰ７５１をコードするＤＮＡのフラグメント；ＡＰＰ６９５をコードするＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ６９５をコードするＤＮＡ；ＡＰＰ７７０のアミノ酸６７２から７１４を含むアミノ酸配列をコードするＡＰＰ６９５をコードするＤＮＡのフラグメント；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０をコードするように短縮型となったＡＰＰｃＤＮＡ；コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドＡＰＰ遺伝子構築物；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有する、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドＡＰＰ遺伝子構築物；または、アミノ酸６７１または６８５で短縮型となった、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドＡＰＰ遺伝子構築物。このような構築物の好ましい形態は、以下のものである：ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ；ＡＰＰ７７０のアミノ酸６７２から７１４を含むＡＰＰアミノ酸配列をコードするＡＰＰ７７０ｃＤＮＡのフラグメント；ＡＰＰ７５１ｃＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ７５１ｃＤＮＡ；ＡＰＰ７７０のアミノ酸６７２から７１４を含むＡＰＰアミノ酸配列をコードするＡＰＰ７５１ｃＤＮＡのフラグメント；ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡ；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、またはこれらの変異の組合せを有するＡＰＰ６９５ｃＤＮＡ；ＡＰＰ７７０のアミノ酸６７２から７１４を含むＡＰＰアミノ酸配列をコードするＡＰＰ６９５ｃＤＮＡのフラグメント；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０をコードするように短縮型となったＡＰＰｃＤＮＡ；コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドＡＰＰ遺伝子構築物；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７をコードするコドンにおける変異、およびこれらの変異の組合せを有する、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドＡＰＰ遺伝子構築物；および、アミノ酸６７１または６８５で短縮型となった、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドＡＰＰ遺伝子構築物。トランスジーンの構築種々のＡＰＰトランスジーンの構築は、任意の適切な遺伝子操作技術、例えば Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor La boratory，N.Y.，1989）に記載のものを用いて達成し得る。操作または変異されたＡＰＰクローンの領域が、ＡＰＰｃＤＮＡクローン中に存在する便利な制限酵素部位を用いて交換され得る。ＮｒｕＩ部位は（ＡＵＧ開始コドンの最初のヌクレオチドに対して）−５位で始まる。ＫｐｎＩおよびＡｓｐ７１８部位は、いずれも５７位で始まる（これらはイソ制限酵素であり、異なる付着末端を残す）。ＸｃｍＩ部位は８３６位で始まり、８４３位で切断する。ＳｃａＩ部位は１００４位で始まる。ＸｈｏＩ部位は１１３５位で始まる。ＢａｍＨＩ部位は１５５４位で始まる。ＢｇｌＩＩ部位は１９９４位で始まる。ＥｃｏＲＩ部位は２０２０位で始まる。ＳｐｅＩ部位は２５８３位で始まる。別のＥｃｏＲＩ部位は３０７６位で始まる。図１から５に示したヒトＡＰＰ遺伝子配列の種々の部分を有するクローンを、標準的な遺伝子操作技術を用いて、一般的な態様で構築し得る。例えば、これらのクローンは、まず、ＳＶ４０ウイルスからのポリＡ付加シグナルを、２５３塩基対のＢｃｌＩ〜ＢａｍＨＩフラグメント（Reddyら，Science 200:494-502(197 8)）として、ｐＵＣシリーズ由来の改変ベクター中にクローニングすることによって構築し得る。次に、ｃＤＮＡコード配列（ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、またはＡＰＰ６９５）を挿入し得る。挿入されたフラグメントの配向および内容が正しいことは、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび限定された配列決定によって決定し得る。図４および５に示したヒトＡＰＰ遺伝子配列の種々のカルボキシ末端部分を有するクローンは、上述のステップにさらに数ステップを加えて構築し得る。例えば、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡクローン（配列番号：５）をＡｓｐ７１８で消化し得、これはヌクレオチド５７位の後ろを切断する。生じる５’伸長部をクレノウ酵素（Sambrookら，(1989)）を用いて埋めて、ＢｇｌＩＩの認識部位である以下の配列：ＡＧＡＴＣＴのヘキサヌクレオチドに連結する。ＢｇｌＩＩでの切断（これはまた１９９４位の後ろも切断する）および再連結の後で、このタンパク質の翻訳リーディングフレームは保存される。こうしてコードされた短縮型タンパク質は、リーダー配列、その後のＡβに先立つ約６アミノ酸、その後のＡβ、およびＡＰＰの５６末端アミノ酸を含む。図５のクローンは、図４ａのクローンにおける部位特異的変異誘発によって２１３８位のヌクレオチドをＴに変換し、これによって、Ａβの最後のアミノ酸コドンの直後に終止コドンを作ることで創出される。ＡＰＰｃＤＮＡクローンは天然にＮｒｕＩ部位を含み、これは、開始メチオニンコドンから２ヌクレオチド上流を切断する。この部位は、使用する異なるプロモーターを付着させて個々の構築物を完成させるために用い得る。ＡＰＰトランスジーンはまた、ＰＣＲクローニング技術を用いても構築し得る。そのような技術は、トランスジーン中でのＤＮＡフラグメントの正確なカップリングを可能にする。コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡクローン内因性のＡＰＰ発現の結果、前駆体ｍＲＮＡの転写に続いてオルタナティブスプライシングが生じ、ＡＰＰの３つの主要な形態が産生する。このオルタナティブスプライシングは、アルツハイマー病に関与するＡＰＰ発現のパターンを生成するに当たって重要であり得る。また、発現構築物におけるイントロンの存在は、例えば、前駆体ｍＲＮＡをｍＲＮＡプロセシングおよび輸送経路に標的化することによって（Huangら，Nucleic Acids Res．18:937-947(1990)）、発現のレベルおよび性質に影響し得る。従って、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡとを結合した、イントロン配列を含むトランスジーンは、好ましいタイプの構築物である。ＲＮＡスプライシングの機構は、ごく少数の特定かつ周知のコンセンサス配列を要求する。そのような配列は、ＡＰＰゲノムＤＮＡにおいて、Yoshikaiら（19 90）によって同定された。開示されるトランスジーンは、１つまたはそれ以上の完全かつ無傷のイントロン配列を用いて構築し得る。しかし、トランスジーンは、スプライシングを可能にするに効果的な量のイントロン配列を含む、短縮型イントロン配列を用いて構築することが好ましい。一般に、スプライシングドナー部位、スプライシングアクセプター部位、およびスプライシング分岐点配列を保持する短縮型イントロン配列は、効果的な量のイントロンを構成する。任意の短縮型イントロン配列が充分であるかは、下記の方法を用いて、トランスジェニック細胞における正しくスプライシングされたｍＲＮＡの存在について試験することによって、決定し得る。ＡＰＰ遺伝子配列に由来しない他のイントロン配列およびスプライシングシグナルもまた、トランスジーン構築物において用い得る。そのようなイントロン配列は、トランスジーン構築物の発現を増強する。好ましい異種イントロンは、アデノウイルス主要後期領域第１エクソンおよびイントロン接合部、およびＩｇＧ可変領域スプライスアクセプターのハイブリッドである。このハイブリッドイントロンは、例えば、Bothwellら，Cell 24:625-637(1981)に記載のように、アデノウイルス主要後期領域の１６２ｂｐのＰｖｕＩＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（第１エクソンの８ｂｐおよび第１イントロンの１４５ｂｐを含む）と、ＩｇＧ可変領域スプライスアクセプタークローン６の９９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ〜ＰｓｔＩフラグメントとを連結することによって構築し得る。Manleyら，Nucleic Acids Res．18:937-947(1990)に記載のように、同様なスプライスシグナルは、それが付着した構築物の発現を増強することが示されている。異種イントロンは、プロモーターとＡＰＰをコードする領域との間に配置することが好ましい。好ましいＡＰＰコンビネーションｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンは、図６に示されるように、イントロン６、７および８の有効な量を含む。そのようなトランスジーンは、以下のように構築し得る。好ましい構築方法は、実施例５に記載される。クローンのｃＤＮＡ部分を含むプラスミドを、まず、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡクローン中の８６０位のＴａｑＩ部位を、部位特異的変異誘発によってＸｈｏＩ部位に変換することによって構築し得る。生じるプラスミドのＸｈｏＩでの切断は、新しいＸｈｏＩ部位および既に存在する１１３５位のＸｈｏＩ部位で起こり、ＫＰＩおよびＯＸ−２コード配列を放出する。こうして作製されたプラスミドは、ＫＰＩおよびＯＸ−２オルタナティブスプライシングカセットのためのアクセプターとして作用する。オルタナティブスプライシングカセットは、ゲノムＤＮＡが関与する一連のクローニング工程によって創出し得る。まず、エクソン６および隣接する下流のイントロンを含むゲノムクローン中の８６０位のＴａｑＩ部位を、部位特異的変異誘発によってＸｈｏＩ部位に変換し得る。生じるプラスミドのＸｈｏＩでの切断は、新しいＸｈｏＩ部位およびイントロン６または７内のＸｈｏＩ部位で起こる。エクソン６の一部および隣接するイントロン６の少なくとも一部分を含むこのフラグメントは、次にプラスミドベクター中のＸｈｏＩ部位にクローニングし得る。次に、エクソン９および隣接する上流のゲノム配列を含むゲノムクローンを、ＸｈｏＩで切断し、このクローンを１１３５位のＸｈｏＩ部位（Kangら(1987) の番号付けを用いれば９１０位）およびイントロン７または８内のＸｈｏＩ部位で切断する。エクソン９の一部および隣接するイントロン８の少なくとも一部分を含むこのフラグメントは、次に別のプラスミドベクター中のＸｈｏＩ部位にクローニングし得る。これら２つのエクソン／イントロン接合部フラグメントは、次に、それぞれのプラスミドベクターから、ＸｈｏＩ、およびＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩのいずれかでの切断によって放出され、別のプラスミドベクター中のＸｈｏＩ部位に一緒にクローニングし得る。このエクソン／イントロン接合部フラグメントは、ＢａｍＨＩによって切り出されることが好ましい。ＢａｍＨＩ部位を、切り出しの前に、エクソン／イントロン接合部フラグメントのイントロン部分へと導入操作することが最も好ましい。これは、ｃＤＮＡ／ゲノムクローンからの長い余分なイントロン配列の除去を可能にする。２つのエクソン／イントロン接合部フラグメントを一緒にクローニングして得られたＸｈｏＩフラグメントは、上記の切り出し工程においてどちらの酵素を使ったかによって、ＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩで切断し得、そして、ＫＰＩおよびＯＸ−２コード領域をその隣接イントロン配列と共に含む、ゲノム６．８ｋｂＢａｍＨＩセグメントを挿入し得る。このフラグメントは、Kitaguchiら(1988) によって、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡの２１２ｂｐのＴａｑＩ−ＡｖａＩフラグメント（ヌクレオチド８６２〜１０７３）をハイブリダイゼーションプローブとする、１人の正常個体および８人のアルツハイマー病患者からのＢａｍＨＩ消化リンパ球ＤＮＡのサザンブロット分析によって同定された。２２５ｂｐインサートの領域を含むゲノムＤＮＡクローンは、例えば、２１２ｂｐのＴａｑＩ−ＡｖａＩフラグメントをプローブとして、ヒト白血球ＤＮＡライブラリーから単離し得る。ゲノムＤＮＡにおいては、この２２５ｂｐ配列は、１６８ｂｐエクソン（エクソン７）および５７ｂｐエクソン（エクソン８）に、約２．６ｋｂのイントロン（イントロン７）で分離されて、位置する。両方のエクソンとも、イントロン− エクソンコンセンサス配列に挟まれている。エクソン７はＡＰＰ７７０のヌクレオチド８６６から１０３３に、エクソン８はヌクレオチド１０３４から１０９０に相当する。エクソン７は、Kunitz型プロテアーゼインヒビターファミリードメインの高度に保存された領域をコードする。ＸｈｏＩでの切断の後、エクソンおよびイントロン配列を含む、このオルタナティブスプライシングカセットは、次にＸｈｏＩでの切断により切り出されて、上記で構築された改変ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡプラスミド（アクセプタープラスミド）のＸｈｏＩ部位へと挿入され得る。これらのクローニング工程は、コンビネーションｃＤＮＡ／ゲノム発現クローンを生じ、これは、トランスジェニック動物において細胞が、天然のオルタナティブスプライシング機構によるＫＰＩおよびＯＸ−２ドメインの含有を調節することを可能にする。アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７における変異、またはこれらの変異の組合せを有する、類似の遺伝子は、インビトロ変異誘発によって直接構築し得る。アミノ酸７１７における変異はまた、上述のＡＰＰ７７０ｃＤＮＡの変異形態を用いてアクセプタープラスミドを構築することで、作製し得る。プロモーター異なるプロモーター配列を用いて、Ａβ−含有タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を制御し得る。トランスジェニック動物においてＡβ−含有タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節できることは、ＡＤにおける異なるＡＰＰ遺伝子産物の役割を評価するに当たって有用であると考えられる。培養細胞においてＡβ−含有タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節できることは、異なるＡβ−含有遺伝子産物の発現およびプロセシングを評価するに当たって有用であり、細胞培養薬剤スクリーニングの基礎を提供し得ると考えられる。好ましいプロモーターは、ヒト血小板由来成長因子β（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモーターである（Sasaharaら，Cell 64:217-227(1991)）。開示されるＡＰＰ構築物のための好ましいプロモーターは、タンパク質コード配列に作動可能に連結されたとき、開示されるＡＰＰ構築物の１つについての２〜４月齢のトランスジェニック動物の脳組織において、以下の発現産物の１つまたはそれ以上の少なくとも特定のレベルでの発現を仲介するものである。産物およびその発現レベルは、Ａβ_totが、脳組織１ｇ当たり少なくとも３０ｎｇ（６．８pmoles／ｇ）、そして好ましくは脳組織１ｇ当たり少なくとも４０ｎｇ（９．１２pmoles／ｇ）のレベル、Ａβ_1-42が、脳組織１ｇ当たり少なくとも８．５ｎｇ（１．８２pmoles／ｇ）、そして好ましくは脳組織１ｇ当たり少なくとも１１．５ｎｇ（２．５pmoles／ｇ）のレベル、全長ＡＰＰ（ＦＬＡＰＰ）およびＡＰＰαの合計（ＦＬＡＰＰ＋ＡＰＰα）が、脳組織１ｇ当たり少なくとも１５０ pmolesのレベル、ＡＰＰβが、脳組織１ｇ当たり少なくとも４２pmolesのレベル、およびヒトＡβ−含有タンパク質をコードするｍＲＮＡが、トランスジェニック動物の内因性ＡＰＰをコードするｍＲＮＡの場合の少なくとも２倍のレベルである。Ａβ_totは、全ての形態のＡβの合計である。Ａβ_1-42は、Ａβのアミノ酸１から４２（ＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４に相当）を有する形態のＡβである。ＦＬＡＰＰ＋ＡＰＰαは、Ａβ領域の最初の１２アミノ酸（ＡＰＰのアミノ酸６７２から６８４に相当）を含むＡＰＰ形態をいう。従って、ＦＬＡＰＰ＋ＡＰＰαは、ＡＰＰの全長形態およびα−セクレターゼ部位で切断されたＡＰＰの混合物を表す（Eschら，Science 248:1122-1124(1990)）。ＡＰＰβは、β−セクレターゼ部位で切断されたＡＰＰである（Seubertら，Nature 361:260-263(19 93)）。上記の発現レベルは、存在する発現産物の量を指し、上記で用いられた特定の測定単位には限定されないことが意図される。従って、発現レベルは、例えば、組織グラム当たりのモル数で、組織グラム当たりのグラム数で、組織容積当たりのモル数で、および組織容積当たりのグラム数で測定し得る。これらの測定単位の、上記の測定との対応は、公知の変換法によって決定し得る。上記の発現レベルは、全ての脳組織において生じる必要はない。従って、あるプロモーターは、脳組織の少なくとも１つのタイプにおいて上記の発現レベルの少なくとも１つが生じるならば、好ましいとされる。発現が組織特異的である場合、もしも発現レベルが特異的脳組織において充分であれば、そのプロモーターは好ましいとされ、たとえ脳組織全体においての発現レベルが閾値に達しなくてもよく、またそうである必要はないことが理解される。この発現レベルは、脳組織の海馬および／または皮質において観察されることが好ましい。プロモーターは、上記の発現産物の上記のレベルでの発現を、構成的にまたは誘導によって仲介し得る。誘導は、例えば、アクチベーター分子の投与によって、熱によって、または、Ａβ−含有タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターのための転写のタンパク質アクチベーターの発現によって、達成し得る。この目的に適切な多くの誘導発現システムが、当業者には公知である。上記の測定に当たっては、脳組織を以下の方法で調製することが好ましい。トランスジェニック試験動物から脳を切除し、その組織は、特記される場合を除いて、ホモジナイゼーション手順の間を通して氷上で保持する。脳組織は、１０倍容（ｗ／ｖ）の５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中でホモジナイズする。このサンプルを次に室温で２〜４時間、穏やかに混合する。ホモジネートを次に、冷カゼイン緩衝液＃１（０．２５％カゼイン／リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｘプロテアーゼインヒビターカクテル）で１：１０に希釈して、最終０．５Ｍグアニジン濃度とし、氷上で保持する。１００Ｘプロテアーゼインヒビターカクテルは、２ｍｇ／ｍｌアプロチニン、０．５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍｇ／ｍｌロイペプチンから構成される。希釈したホモジネートは次に、Eppendorfマイクロフュージ中で、４℃にて２０分間、１４０００ｒｐｍで遠心する。さらなる希釈が必要な場合は、冷グアニジン緩衝液＃２（グアニジン緩衝液＃１の１部をカゼイン緩衝液＃１の９部へ）でなされ得る。好ましいプロモーターは、上記のレベルでのＡβの発現を仲介するその能力について、以下のアッセイを用いて同定することが好ましい。抗体２６６（Seuber tら，Nature 359:325-327(1992)）を緩衝液（０．２３ｇ／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｈ₂ Ｏ、２６．２ｇ／ＬＮａＨＰＯ₄−７Ｈ₂Ｏ、１ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４に調整）中１０μｇ／ｍｌで溶解して、１００μｌ／ウェルを９６−ウェル免疫アッセイプレート（Costar）上にコートして、一晩結合させる。このプレートを次に、吸引して、０．２５％ヒト血清アルブミン溶液（２５ｇ／Ｌスクロース、１０．８ｇ／ＬＮａ₂ＨＰＯ₄−７Ｈ₂Ｏ、１．０ｇ／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄ −Ｈ₂Ｏ、０．５ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４に調整）で少なくとも１時間ブロッキングする。この２６６コート化プレートを次に、Skatronプレートワッシャーを用いて、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄（１Ｘ）する。Ａβ１−４０標準および脳組織サンプルの１００μｌ／ウェルをプレートに３連で添加し、一晩４℃でインキュベートする。Ａβ１−４０標準は、ＤＭＳＯ中−４０℃で保存した、０．０１５６、０．０３１２、０．０６２５、０．１２５、０．２５０、０．５００、および１．０００μｇ／ｍｌのストック、およびバックグラウンド決定のためのＤＭＳＯのみのコントロールから作られる。Ａβ標準は、個々の標準のグアニジン緩衝液＃３（ＢＳＡ緩衝液の１部をグアニジン緩衝液＃１の９部へ）への１：１００希釈、その後のカゼイン緩衝液＃１への１：１０希釈からなる（注：最終Ａβ濃度範囲は１５．６から１０００ｐｇ／ｍｌ、最終グアニジン濃度は０．５Ｍである）。ＢＳＡ緩衝液は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、免疫グロブリン−フリー）／ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウムからなる。プレートおよびカゼイン緩衝液＃２（０．２５％カゼイン／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ｐＨ７．４）を次に室温（ＲＴ）にする。プレートを次に洗浄緩衝液で洗浄（３Ｘ）する。次に、３Ｄ６−ビオチン（カゼイン緩衝液＃２中で０．５μｇ／ｍｌ）の１００μｌ／ウェルを、各ウェルに添加して、１時間ＲＴにてインキュベートする。モノクローナル抗体３Ｄ６は、ヒツジの抗マウス免疫グロブリンにシステインを介して結合させた、合成ペプチドＤＡＥＦＲＧＧＣ（配列番号：１０）に対して生成させた。この抗体は、分泌されたＡＰＰは認識しないが、Ａβ１位（Ａｓｐ）で始まる種を認識する。３Ｄ６のビオチン化のためには、ＩｇＧの標識のためのPierceのＮＨＳ−ビオチン・プロトコール（cat.#20217X）に従う、ただし、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．５、および２４ｍｇＮＨＳ−ビオチン（ＤＭＳＯ１ｍｌ当たり）を使う。プレートを次に、洗浄緩衝液で再度洗浄（３Ｘ）する。次に、カゼイン緩衝液＃２で１：４０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−アビジン（Vector Labs，cat.#A-2004）の１００μｌ／ウェルを、各ウェルに加え、１時間ＲＴにてインキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で洗浄（４Ｘ）し、次に、ＲＴでのＴＭＢ基質（Slow TMB-ELISA（Pierce cat.#34024)）の１００μｌ／ウェルを、各ウェルに加え、１５分間ＲＴにてインキュベートする。最後に、２ＮＨ₂ＳＯ₄の２５μｌ／ウェルを、各ウエルに加えて酵素反応を停止させ、プレートを、Molecular Devices Vmaxリーダーを用いて４５０ｎｍから６５０ｎｍで読みとる。ヒトＡβ−含有タンパク質をコードするｍＲＮＡおよびトランスジェニック動物の内因性ＡＰＰをコードするｍＲＮＡの相対レベルは、Bordonaroら，Biotech niques 16:428-430(1994)およびRockensteinら，J.Biol.Chem．270:28257-28267 (1995)に記載された態様によって測定することが好ましい。Ａβ_1-42、ＦＬＡＰＰ＋ＡＰＰα、およびＡＰＰβの発現レベルを測定する好ましい方法は、実施例８に記載される。酵母人工染色体図７に示す構築物は、以下のように構築し得る。ヒトゲノムＤＮＡの大きなセグメントは、ある種のベクターにクローニングしたとき、酵母細胞中で自己複製単位として増殖し得る。そのようなベクター上のセグメントは、酵母人工染色体と称される（ＹＡＣ；Burkeら，Science 236:806(1987)）。ヒトＹＡＣライブラリーは２５０,０００塩基対の平均挿入サイズ（１８０,０００から５００,０００塩基対の範囲）で商業的に入手可能である（Clontech，Palo Alto，CA）。アルツハイマー遺伝子のＹＡＣクローンは、このライブラリーをヒトＡＰＰ７７０ｃＤＮＡでスクリーニングすることによって直接的に単離し得る。クローン中に必須の遺伝子領域全てを含むことは、ＰＣＲ分析によって確認し得る。図７ａに示すＹＡＣ−ＡＰＰクローンは、ＹＡＣベクターによってコードされたネオマイシン耐性について選択することによって、胚性幹（ＥＳ）細胞中で確立し得る。ＹＡＣ−ＡＰＰクローンを有するＥＳ細胞を用いて、以下に「トランスジェニックマウス」および「胚性幹細胞法」の見出しのもとで記載した確立された方法によって、トランスジェニックマウスを作製し得る。アミノ酸７１７での変異を有するＹＡＣ−ＡＰＰ遺伝子（図７ｂ）は、アミノ酸７１７での変異に冒された個人からのゲノムＤＮＡを用いたＹＡＣライブラリーの創出によって、産生し得る。そのようなクローンは、上述のように同定しそしてＥＳ細胞中で確立し得る。マウスＡＰＰ遺伝子の遣伝的改変ヒトおよびマウスのアルツハイマータンパク質遺伝子の間のヌクレオチド配列相同性は、約８５％である。Ａβ−コード領域内で、この２つの配列の間には３つのアミノ酸の相違がある。変異してＡＰＰプロセシングを変更し得るアミノ酸Ｌｙｓ６７０、Ｍｅｔ６７１およびＶａｌ７１７は、マウス、ラットおよびヒトの間で保存されている。野生型の齧歯類はアルツハイマー病を発病せず、その中枢神経系（ＣＮＳ）において、ヒトアルツハイマー患者に存在するものに類似の沈着またはプラークも生じない。従って、（齧歯類形態でなく）ヒト形態のＡβ が疾患を生じ得る可能性がある。相同組換え（Capecchi，Science 244:1288-129 2(1989)）を用いて、遺伝子置換により、マウスアルツハイマー遺伝子をインサイチュでヒトＡβをコードする遺伝子に変換し得る。この組換えは、トランスジェニック動物内の全ての細胞に適切な天然のオルタナティブスプライシング機構が最終遺伝子産物の発現に用いられ得るように、ＫＰＩおよびＯＸ−２ドメインから下流の部位、例えばエクソン９に指向される。ヒトｃＤＮＡの野生型（図８ａ）および変異（図８ｂ）形態の両方が、ＡＰＰの野生型または変異形態を発現するトランスジェニックモデルの作製に用いられ得る。組換えベクターは、ヒトＡＰＰｃＤＮＡ（ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１またはＡＰＰ７７０形態）の野生型、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７での変異、またはこれらの変異の組合せからから構築され得る。組換えベクターの切断（例えばエクソン９内のＸｈｏＩ部位での）は、直接隣接する配列内での相同組換えを促進する（Capecchi(1989)）。この事象の結果生じる内因性ＡＰＰ遺伝子は、（この例ではエクソン９内での）組換えの地点までは正常であり、それ以降はヒトｃＤＮＡ配列からなる。トランスフェクションおよびマイクロインジェクションのための構築物の調製マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンを、細菌のプラスミド配列を除去するために適切な酵素、例えばＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断し、このＤＮＡフラグメントをＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動する（Sa mbrookら(1989)）。ＤＮＡバンドをエチジウムブロミド染色で可視化させ、ＡＰＰ発現配列を含むバンドを切り出す。切り出したバンドを次に０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含む透析バッグに入れる。ＤＮＡを透析バッグに電気溶出させ、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、２倍容のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡを１ｍｌの低塩緩衝液（０．２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、および１ｍＭＥＤＴＡ）に再溶解させ、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ^TM カラムで精製する。カラムはまず３ｍｌの高塩緩衝液（１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、および１ｍＭＥＤＴＡ）で初期化させ（primed）、その後５ｍｌの低塩緩衝液で洗浄する。ＤＮＡ溶液をカラムに３回通過させ、カラムのマトリックスにＤＮＡを結合させる。３ｍｌの低塩緩衝液での１回の洗浄の後、ＤＮＡを０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶出させ、２倍容のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡ濃度はＵＶ吸光光度計での２６０ｎｍの吸収によって測定する。マイクロインジェクションのために、ＤＮＡ濃度は、５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、および０．１ｍＭＥＤＴＡ中で３μｇ／ｍｌに調整する。マイクロインジェクション用ＤＮＡの精製のための他の方法はまた、以下に記載されている： Hoganら，Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory，C old Spring Harbor，NY，1986);Palmiterら，Nature 300:611(1982);The Qiagen ologist，Application Protocols，第３版，Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA.により発行;およびSambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold S pring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989）。トランスジェニック動物の構築Ａ．動物入手源トランスジェニック実験に適切な動物は、標準的な商業的入手源、例えばChar les River(Wilmington，MA)，Taconic(Germantown，NY)，およびHarlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)から入手し得る。多くの株が適切であるが、Swiss W ebster(Taconic)雌マウスが胚採取および移植のために好ましい。Ｂ６Ｄ２Ｆ₁(T aconic)雄は、交尾のために使用し得、精管切除したSwiss Webster繁殖用個体は、偽妊娠を刺激するために用い得る。精管切除したマウスおよびラットは供給者から入手し得る。Ｂ．マイクロインジェクション手順齧歯類胚の操作およびＤＮＡのマイクロインジェクションのための手順は、Ho ganら，Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory，Col d Spring Harbor，NY，1986）に詳述されている。その教示は、一般的に知られており、本明細書において援用される。Ｃ．トランスジェニックマウス６週齢の雌マウスで、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Sigma）の５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）、その４８時間後のヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Sigma）の５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）により過剰排卵を誘発させる。ｈＣＧ注射の直後、雌を雄と共存させる。ｈＣＧ注射の２１時間後、交尾した雌をＣＯ₂窒息または頚部脱臼により屠殺して、切り出した卵管から胚を回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma）を含むダルベッコのリン酸緩衝食塩水中に置く。ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で周囲の卵丘細胞を除去する。前核胚を次に洗浄し、インジェクション時まで、５％ＣＯ₂、９５％空気の湿潤雰囲気下の３７．５℃インキュベーター中で、０．５％ＢＳＡを含むアール（Earle）の調整塩溶液（ＥＢＳＳ）中に置く。胚は、２細胞段階で移植し得る。ランダム周期の成熟雌マウスを精管切除した雄と対にする。Swiss Websterまたは他の匹敵する株がこの目的に使用し得る。レシピエントの雌は、ドナーの雌と同時に交尾させる。胚移植の際に、レシピエントの雌は、体重１ｇ当たり０．０１５ｍｌの２．５％アベルチン（avertin）の腹腔内注射で麻酔させる。卵管を、単一の正中線背部の切開によって暴露させる。次に、体壁を通して直接卵管上を切開する。卵巣嚢を次にウオッチメーカー・ピンセットで裂く。移植すべき胚は、移植ピペットのチップ中（約１０〜１２胚）、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝食塩水）中に置く。ピペットのチップを卵管漏斗へと挿入して、胚を移植する。移植後、切開口を２縫合で閉じる。Ｄ．トランスジェニックラットトランスジェニックラット作製の手順は、マウスの場合と同様である（Hammer ら，Cell 63:1099-112(1990)）。３０日齢の雌ラットに、ＰＭＳＧ（０．１ｃｃ）の２０ＩＵを皮下注射し、その４８時間後に各雌を検証した（proven）雄と共存させる。同時に、４０〜８０日齢の雌ラットをケージ内で精管切除した雄と共存させる。これは、胚移植のための養母を提供する。翌朝、雌の膣栓をチェックする。精管切除した雄と交尾した雌は、移植時まで保持する。交尾したドナーの雌を屠殺し（ＣＯ₂窒息）、卵管を除去し、０．５％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝食塩水）中に置き、そして胚を回収した。胚の周囲の卵丘細胞は、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。胚を次に洗浄し、マイクロインジェクション時まで、３７．５℃インキュベーター中で、０．５％ＢＳＡを含むＥＢＳＳ（アールの調整塩溶液）中に置く。胚をインジェクトした後、養母への移植のために、生存した胚をＤＰＢＳに移す。養母は、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔させる。背部正中切開を皮膚を通して行い、卵巣および卵管を卵巣の直上の筋肉層の切開によって暴露させる。卵巣嚢を裂き、胚を移植ピペットへと取り出し、移植ピペットのチップを卵管漏斗へと挿入する。約１０〜１２胚を各ラットの卵管に、卵管漏斗を通して移植する。切開口を次に縫合して閉じ、養母を単独で収容する。Ｅ．胚性幹（ＥＳ）細胞法１．ｃＤＮＡのＥＳ細胞への導入ＥＳ細胞の培養方法およびその後のトランスジェニック動物の作製方法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿、および直接インジェクションなどの多様な方法によるＤＮＡのＥＳ細胞への導入は、Teratocarcinomas a nd Embryonic Stem Cells，A Practical Approach，編者E.J.Robertson，(IRL P ress 1987)に詳述されている。その教示は、一般的に知られており、本明細書において援用される。所望の、トランスジーン含有ＥＳ細胞のクローンの選択は、数種の手段の１つで達成され得る。ランダムな遺伝子組み込みのために、ＡＰＰクローンは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子と共沈させる。トランスフェクションは、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells，A Practical Appro ach，編者E.J.Robertson，(IRL Press 1987)中のLovell-Badge、またはPotterら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7161(1984)に詳述された数種の方法の１つで行い得る。リポフェクションは、市販のキット、例えばＤＯＴＡＰ（Boehringer-Man nheim）またはリポフェクチン（BRL）に提供されている試薬を用いて行い得る。リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿、リポフェクション、直接インジェクション、およびエレクトロポレーションは好ましい方法である。これらの手順において、０．５Ｘ１０⁶ＥＳ細胞が組織培養皿にプレートされ、以下の混合物でトランスフェクトされる：直線化ＡＰＰクローンおよび１ｍｇのｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡ（So uthernおよびBerg，J.Mol.Appl.Gen．l:327-341(1982)）であって、５０ｍｇリポフェクチン（BRL）の存在下に沈殿させ、最終容量１００μｌとしたもの。細胞は選択培地に供され、これは、Ｇ４１８（２００および５００μｇ／ｍｌの間）で補われたＤＭＥＭ中、１０％ウシ胎児血清を含む。Ｇ４１８に耐性の細胞のコロニーは、クローニングリングで単離し、拡大（expanded）させる。薬剤耐性のクローンからＤＮＡを抽出し、ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡプローブを用いるサザンブロットを用いて、ＡＰＰ配列を有するクローンを同定し得る。ＰＣＲ検出法を用いても、目的のクローンを同定し得る。 ES細胞に導入されるＤＮＡ分子はまた、Capecchi(1989)に記載された、相同組換えプロセスによって染色体中へ組み込まれ得る。直接インジェクションは、高効率の組み込みを生じる。所望のクローンは、インジェクトされたＥＳ細胞のプールから調製されたＤＮＡのＰＣＲによって同定し得る。プール内の陽性細胞は、細胞クローニングに続くＰＣＲによって同定し得る（ZimmerおよびGruss，Nat ure 338:150-153(1989)）。エレクトロポレーションによるＤＮＡ導入は、効率がより低く、選択工程を要する。組換え事象の陽性選択（例えばｎｅｏ耐性）、および二重陽性−陰性選択（例えばｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）、およびその後の、ＰＣＲによる所望のクローンの同定の方法は、Joynerら，Nature 338:153-156(1989)およびCapecchi(1989)に記載されている。その教示は、一般的に知られており、本明細書において援用される。２．胚の回収およびＥＳ細胞のインジェクション雄と交尾させた、自然周期または過剰排卵させた雌マウスを用いて、ＥＳ細胞の移入のための胚を採取し得る。マウスを用いる場合、この目的にはＣ５７ＢＬ／６株を使うことが好ましい。適切な齢の胚は、交尾成功後約３．５日に回収する。交尾した雌をＣＯ₂窒息または頚部脱臼により屠殺して、切り出した子宮角から胚を洗出し（flushed）、ＥＳ細胞のインジェクションのための１０％仔ウシ血清を含むダルベッコの改変必須培地中に置く。約１０〜２０ＥＳ細胞を、内径約２０μｍのガラスミクロ針を用いて、胚盤胞へとインジェクトする。３．胚の偽妊娠雌への移植ランダム周期の成熟雌マウスを精管切除した雄と対にする。Swiss Webster、ＩＣＲまたは他のマウス株がこの目的に使用し得る。レシピエントの雌は、ＥＳ細胞含有胚盤胞での移植に要求されるとき交尾後２．５〜３．５日であるように、交尾させる。胚移植の際に、レシピエントの雌は、体重１ｇ当たり０．０１５ｍｌの２．５％アベルチンの腹腔内注射で麻酔させる。卵管直上の体壁を切開することによって、卵巣を暴露させ、卵巣と子宮とを外に出す（externalized）。子宮角に２５ゲージの針で穴を開け、そこを通して胚盤胞を移植する。移植後、卵巣および子宮を体内に押し戻し、切開口を２縫合で閉じる。さらなる移植をすべき場合は、この手順を反対側で繰り返す。トランスジェニックマウスおよびラットの同定、特徴付け、および利用トランスジェニック齧歯類は、そのＤＮＡを分析することにより同定され得る。この目的で、尾のサンプル（１〜２ｃｍ）を、３週齢の動物から除去し得る。これらまたは他のサンプルからのＤＮＡを次に調製し、サザンブロット、ＰＣＲ、またはスロットブロットによって分析してトランスジェニック創始（founder）（Ｆ₀）動物およびその子孫（Ｆ₁およびＦ₂）を検出し得る。Ａ．病理学的研究トランスジーンを有する種々のＦ₀、Ｆ₁およびＦ₂動物を、Ａβ沈着、ＡＰＰまたはＡＰＰ切断産物の発現、ニューロンまたは神経突起異常、および脳における炎症反応の証拠について、免疫組織学により分析し得る。各トランスジェニック系統からのマウスおよびラットの脳を固定しそして切片とする。切片をＡＰＰおよび／またはＡβと反応性の抗体によって染色する。フルオレセイン、ローダミン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはアルカリ性フォスファターゼと結合させた２次抗体を用いて、１次抗体を検出する。これらの方法は、脳の特定領域におけるアミロイドプラークおよび他の病理学的病変の同定を可能にする。９から＞５０μｍサイズの範囲のプラークが、ＡＤ患者の脳の中で、大脳皮質において特徴的に生じるが、扁桃核、線条体および間脳を含む濃灰白質においても観察され得る。切片はまた、アルツハイマーのプラークを診断し得る他の抗体で染色し得、これらの抗体は、ＡＰＰ、Ａｌｚ−５０、タウ、Ａ２Ｂ５、神経フィラメント、シナプトフィシン、ＭＡＰ−２、ユビキチン、補体、ニューロン特異的エノラーゼなどの抗原、およびアルツハイマー病理の特徴である他の抗原を認識する（Wolozinら，Science 232:648(1986);HardyおよびAllsop，Trends in Pharm ．Sci．12:383-388(1991);Selkoe，Ann．Rev.Neurosci．12:463-490(1989);Arai ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2249-2253(1990);Majochaら，Amer.Assoc.Neuro pathology Abs 99:22(1988);Mastersら，Proc.Natl.Acad.Sci．82:4245-4249 (1985);Majochaら，Can J Biochem Cell Biol 63:577-584(1985)）。チオフラビンＳおよびCongo Redでの染色もまた、神経突起プラークおよびＮＦＴ内でのアミロイドの存在およびＡβ沈着の共局在化を分析するために行い得る。Ｂ．ＡＰＰおよびＡβ発現の分析１．ｍＲＮＡメッセンジャーＲＮＡは、トランスジェニック動物の細胞株および組織から、酸グアニジウムチオシアネート−フェノール：クロロホルム抽出法によって単離し（ChomaczynskiおよびSacchi，Anal Biochem 162:156-159(1987)）、発現レベルをノーザンブロット、ＲＮＡｓｅおよびヌクレアーゼ保護アッセイによって決定し得る。２．タンパク質ＡＰＰ、Ａβ、およびＡＰＰの他のフラグメントは、ＡＰＰ細胞質外ドメイン、Ａβ領域、Ａβ_1-42、Ａβ_1-40、ＡＰＰβ、ＦＬＡＰＰ＋ＡＰＰα、およびＡＰＰのＣ−末端に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いて検出され得、またそうされてきた。ヒト配列特異的な多様な抗体、例えば１０Ｄ５および６Ｃ６は、この目的に非常に有用である（Gamesら(1995)）。３．ウエスタンブロット分析タンパク質画分は、組織ホモジネートおよび細胞溶解物から単離され、例えば以下に記載のように、ウエスタンブロット分析に付され得る：Harlowら，Antibo dies:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor，NY，1988);Brownら，J.Neur ochem 40:299-308(1983);およびTate-Ostroffら，Proc Natl Acad Sci 86:745-7 49(1989)。簡単に言うと、タンパク質画分は、Laemmliサンプル緩衝液中で変性させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させる。タンパク質を次に、ニトロセルロースフィルターに、エレクトロブロッティングによって移す。フィルターをブロックし、１次抗体とインキュベートし、そして最後に酵素結合２次抗体と反応させる。その後の適切な発色基質とのインキュベーションは、ＡＰＰ由来タンパク質の位置を明らかにする。Ｃ．病理学的および行動的研究１．病理学的研究免疫組織学およびチオフラビンＳ染色は、本明細書中の他の箇所で記載されるように行われる。インサイチュハイブリダイゼーション：放射能または酵素的に標識された核酸プローブを用いて、ｍＲＮＡをインサイチュで検出し得る。プローブは、細胞の透過を良好にするために、分解または調製して約１００ヌクレオチドの長さとする。固定化またはパラフィン包埋サンプルについての、Chouら，J.Psych.Res.24 :27-50(1990)のハイブリダイゼーション手順を以下に概説するが、同様な手順は凍結材料として切片にしたサンプルでも用い得る。インサイチュハイブリダイゼーションのためのパラフィンスライドは、キシレン中で脱ロウして、段階的な一連のエタノールで再水和させ、最後にリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ですすぐ。切片を、新鮮な４％パラホルムアルデヒド中で後固定する。スライドをＰＢＳで２回５分間洗浄し、パラホルムアルデヒドを除去する。次に切片を、２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液での処理で透過可能にする（permeabilized）。切片を、４％パラホルムアルデヒド中で再固定し、バックグラウンドのプローブ結合を生じるベース分子を、０．１Ｍトリエタノールアミン、０．３Ｍ酢酸無水物溶液で１０分間アセチル化する。スライドをＰＢＳで洗浄し、次に段階的な一連のエタノールで脱水させ、風乾する。切片を、センスプローブをコントロールとして、アンチセンスプローブでハイブリダイズさせる。適切な洗浄の後、結合した放射能プローブをオートラジオグラフィーで検出し、または酵素標識したプローブを適切な発色基質との反応によって検出する。２．行動的研究学習および記憶欠陥を評価するために設定された行動試験が、用いられる。このような試験の例として、モリスの水迷路(Morris，Learn Motivat．12:239-260 (1981))がある。この手順では、動物は、水を満たし、水面直下に水浸した退避プラットフォームを有する循環プールに置かれる。動物が隣接する可視表示に向かって進むことにより見つけられるように、可視マーカーがプラットフォームに置かれる。または、動物は、プラットフォームの位置を示す位置表示が置かれない、より複雑な形態の試験に供される。この形態では、動物は遠くの可視表示との関係でプラットフォームの位置を学ぶ必要があり、参照および作用記憶（work ing memory）の評価に用い得る。水迷路における学習欠陥が、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスで示された。Ａβ−含有タンパク質のトランスジェニック発現の効果を評価するための行動分析の例を、実施例９に記載する。トランスジェニックマウスを試験するために適用される手順は、トランスジェニックラットについても同様である。Ｄ．好ましい特徴開示されたトランスジェニック動物の上記の表現型の特徴は、開示されたトランスジェニック動物のうち動物モデルとして好ましい形態を同定するために用い得る。開示されたトランスジェニック動物のうち動物モデルとして好ましい形態を同定するためにやはり用い得る、さらなる表現型の特徴およびこれらの特徴を測定するためのアッセイは、実施例６に記載される。これらの特徴は、好ましくは、アルツハイマー病において観察される表現型の特徴に類似するものである。開示されたトランスジェニック動物のうち動物モデルとして好ましい形態を同定するためにやはり有用な、ＡＰＰおよびＡβマーカーを、以下に記載する。これらのマーカーまたは表現型の特徴のいずれかまたは全ては、単独でまたは組み合わせて、開示されたトランスジェニック動物の好ましい形態を同定するために用い得る。例えば、脳組織におけるCongo Redで染色され得るプラークの存在は、開示されたトランスジェニック動物を好ましいものと同定し得る表現型の特徴である。好ましいトランスジェニック動物（上述）において存在するある種のＡＰＰ関連タンパク質の発現レベルは、好ましいトランスジェニック動物を同定するための独立した特徴であることが意図される。従って、最も好ましいトランスジェニック動物は、ＡＰＰ関連タンパク質の１つまたはそれ以上について開示した発現レベルを示し、かつ上記の表現型の特徴の１つまたはそれ以上を示す。特に好ましい表現型の特徴（その存在が動物を好ましいトランスジェニック動物と同定させる）は以下のものである：Congo Redで染色され得るアミロイドプラークの存在（Kelly(1984)）、１２月齢までに電子顕微鏡観察によって同定される細胞外アミロイド原線維の存在、および、１２月齢までに電子顕微鏡観察によって同定されるＩ型ジストロフィー性神経突起の存在（シナプスタンパク質およびＡＰＰを含む、球形の神経突起から構成される；Dicksonら，Am J Pathol 132:86- 101(1988);Dicksonら，Acta Nuropath．79:486-493(1990);Masliahら，J Neurop athol Exp Neurol 52:135-142(1993);Masliahら，Acta Neuropathol．87:135-14 2(1994);WangおよびMunoz，J Neuropathol Exp Neurol 54:548-556(1995)）。これらの特徴の検出の例は、実施例６に提示される。トランスジェニック動物は、１４月齢時点で、Congo Redで染色され得るアミロイドプラークを有することが最も好ましい。アルツハイマー病の処置のための化合物のスクリーニングトランスジェニック動物、またはトランスジェニック動物に由来する動物細胞は、標準的な方法論を用いて、アルツハイマー病の処置における潜在的な効果について化合物をスクリーニングするために使用され得る。このようなADスクリーニングアッセイにおいて、化合物は、経時的に、そして種々の投薬量で、動物に投与されるか、またはこれらの動物に由来する細胞の培養培地に導入され、次いで動物または動物細胞は、上記の手順および以下の実施例に記載される手順を用いて、APPの発現またはプロセシングにおける変化、組織病理学、および／または、動物の場合、行動について試験される。一般に、行動試験における任意の改善（トランスジェニック動物において存在するADに特徴的な組織病理の重篤度の減少、および／または処置動物において観察されるAβまたはAPP切断産物のレベルの減少（未処置の動物と比べて））は、アルツハイマー病を処置するために有用な化合物の指標である。 APPおよびAβの種々の形態の発現は、上記および実施例において記載されるように、免疫組織化学および定量的なELISAまたはイムノブロット測定により直接測定され得、そして処置トランスジェニック動物および未処置トランスジェニック動物において比較され得る。現在、２つの形態のAPP産物（APPおよびAβ）が見出されていることが知られている（HaassおよびSelkoe，Cell 75:1039-1042(1 993)）。これらは、時間依存性の様式でADの病原と内因的に関連することが示されている。それゆえ、好ましいアッセイは、トランスジェニックマウスにおける APPおよびAβ発現の年齢関連性変化を比較する。実施例６において記載するように、Aβの増加はPDAPPマウスの加齢の間に示されている。発現測定についての標的は、アルツハイマー病の特定のマーカーの発現または位置の変化に基づいて選択され得る。アッセイ測定についての好ましい標的は、アルツハイマー病を有する個体において増加することが知られているAβマーカーであり、これらは全Aβ（Aβ_tot）、Aβ1-42（Aβ_1-42；アミノ酸1-42を有するAβ）、Aβ_1-40（アミノ酸1-40を有するAβ）、AβN3（pE）（Aβ_N3（pE））；AβX-42（Aβ_X-42；アミノ酸42で終わるAβ形態）；AβX-40（Aβ_X-40；アミノ酸40で終わるAβ形態）；不溶性Aβ（Aβ_insoluble）；および可溶性Aβ（Aβ_soluble ；Kuoら、J．Biol．Chem．271（8）：4077-4081（1996））。Aβ_N3（pE ）は、３位にピログルタミン酸を有する(Saido、Neuron 14:457-466(1995))。A β_X-42はAβ_13-42のようなAβの任意のＣ末端形態をいう。Aβ_insolubleは、Gra vina、J．Biol．Chem．270:7013-7016（1995）に記載のように回収されるAβの形態である。APPβはまた、βセクレターゼ活性の量を評価するために特異的に測定され得る（Seubertら、Nature 361:260-263(1993)）。これらのAβ形態およびそれらのアルツハイマー病との関連のいくつかは、HaassおよびSelkoe（1993 ）により記載されている。Aβ_tot、Aβ1_1-42、およびAβ_X-42の検出および測定を実施例６に記載する。一般的に、Aβの特異的形態は、特異的抗体を用いて下記のように定量的または定性的のいずれかでアッセイされ得る。Aβの形態におけるアミノ酸の位置をいう場合、この位置は、APPのAβ領域に対応する。Aβのアミノ酸１は、APPのアミノ酸672に対応し、そしてAβのアミノ酸42は、APPのアミノ酸714に対応する。アッセイ測定のための標的として好ましいのはまた、APPマーカーである。例えば、分泌されるAPPの異なる形態（APPαおよびAPPβと呼ばれる）はまた、測定され得る（Seubertら、Nature 361:260-263(1993)）。他のAPP形態はまた、アルツハイマー病に影響をおよぼす化合物についての潜在性を評価するアッセイのための標的として作用し得る。これらとしては、FLAPP＋APPα、完全長APP、APP のＣ末端フラグメント（特に、C100（APPの最後の100アミノ酸）およびＣ57〜Ｃ 60（APPの最後の57〜60アミノ酸））、ならびにAβ_1-40に対応する領域を含む任意の形態のAPPが挙げられる。 APP形態はまた、アルツハイマー病に影響をおよぼす化合物についての潜在性を評価するアッセイのための好ましい標的である。APPおよびAPP転写産物の絶対レベル、異なるAPP形態およびそれらの切断産物の相対レベル、ならびにAPPの発現またはプロセシングの局在化は、すべてアルツハイマー病と関連するマーカーであり、潜在的な治療学的化合物での処置の効果を測定するために使用され得る。プラークおよび神経突起組織へのAPPの局在化は、これらのアッセイのための特に好ましい標的である。定量的測定は、多くの標準的なアッセイを用いて達成され得る。例えば、転写産物レベルは、RNase保護を含むRT-PCRおよびハイブリダイゼーション法、ノーザン分析、ならびにＲドット分析を用いて測定され得る。APPおよびAβレベルは、ELISA、ウエスタン分析により、および免疫組織化学的に染色した組織切片の比較によりアッセイされ得る。免疫組織化学的染色はまた、特定の組織および細胞型へのAPPおよびAβの局在化をアッセイするために使用され得る。このようなアッセイは上述されており、そして特定の例は以下に提供される。Ａ．培養細胞を用いるスクリーニングアッセイ。化合物の治療学的潜在性を決定するためのスクリーニングアッセイはまた、開示されるAPP構築物についてのトランスジェニック動物に由来する細胞、および開示される構築物で安定にトランスフェクトされた細胞培養物を用いて行われ得る。例えば、このようなアッセイは、以下の様式で培養細胞に対して行われ得る。細胞培養物は、国際特許出願第94/10569号およびCitronら（1995）に記載される様式で、一般にトランスフェクトされ得る。次いで、得られたトランスジェニック細胞またはトランスフェクト細胞培養物は、Corning 96ウエルプレートにおいて、ダルベッコ最小必須培地プラス10%ウシ胎児血清中、ウェル当たり1.5〜2. 5×10⁴細胞でプレートされ得る。 10%二酸化炭素で平衡化したインキュベーターにおける37℃での一晩のインキュベーション後、培地を除去し、そして試験する化合物を含有する培地で、２時間の前処理の期間に置き換え、そして細胞を上述のようにインキュベートした。処理に使用される化合物の最終濃度で、ジメチルスルホキシドの濃度が0.5%を超えない、好ましくは約0.1%を超えないように、試験する化合物を含むストックを、100%ジメチルスルホキシド中で最初に調製する。前処理期間の終わりに、上述のように、培地を再び除去し、そして試験される化合物を含む新鮮な培地で置き換え、そして細胞をさらに２〜16時間インキュベートする。処理後、プレートをBeckman GPRにおいて、1200rpmで５分間室温で遠心分離して、馴化培地から細胞残査をペレット化させる。各ウェルから、100μL の馴化培地またはその適切な希釈物を、国際特許出願第94/10569号に記載されるように抗体266（Aβのアミノ酸13〜28に対して指向される抗体）で予めコートしたELISAプレート中に移し、そして４℃で一晩保存した。標識抗体6C6（Aβのアミノ酸１〜16に対して指向される）を用いるELISAアッセイを行い得、産生されたAβの量を測定し得る。異なる捕獲および検出抗体もまた使用され得る。化合物の細胞傷害性効果は、Hansenら、J．Immun．Method．119:203-210（198 9）の方法の改変により測定される。組織培養プレートに残存する細胞に、25μ ｌの3,(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）ストック溶液（５mg/mL）を添加して1mg/mLの最終濃度にする。細胞を１時間37℃にてインキュベートし、そして細胞活性を等容量のMTT溶解緩衝液（5 0%ジメチルホルムアミド中の20% w/vドデシル硫酸ナトリウム、pH4.7）の添加により停止する。完全な抽出は、室温での一晩の振とうにより達成される。細胞生存のインディケーターとして、OD_562nmとOD_650nmとの間の差異をMolecular Devi ceのUV_maxマイクロプレートリーダー、または等価物において測定する。 Aβ ELISAの結果は、標準曲線に合わせられ、そしてng/mL Aβとして表される。細胞傷害性を標準化するために、これらの結果はMTT結果で割られ、そして化合物の非存在下で行われるコントロールアッセイからの結果のパーセンテージとして表される。Ｂ．Ａβ毒性アッセイ。Ａβのニューロン細胞に対する毒性に対する潜在的な治療的化合物の効果は、以下の様式で決定され得る。ラット皮質１次細胞培養物：ラット皮質１次細胞培養物を、18日のラット胎児から確立する。皮質組織をトリプシン/EDTA溶液（HBSS中の0.05％トリプシン＋0 .53mM EDTA；GIBCO Laboratories，Grand Island，New York，USA）中で、37℃ で20分間インキュベーションすることによって解離させる。次いで、細胞を血清含有培地（DMEM/FBS：4.5g/Lグルコース、１mMピルビン酸ナトリウム、１mMグルタミン、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含有し、そして1 0％熱不活化ウシ胎児血清（GIBCO Laboratories，Grand Island，New York，USA ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中に再懸濁することによって、トリプシンを不活化する。次いで、細胞を遠心分離によってペレット化し、そしてFBSの代わりに化学的に規定された培地（DMEM/B27:B27補充物を含むDMEM ；GIBCO Laboratories，Grand Island，New York，USA）中に再懸濁する。ポリエチレンイミン（PEI；Sigma Chemical Company，St．Louis，Missouri，USA）でコーティングした6.4mm（96ウェル）のディッシュを、DMEM/FBSで一度リンスし、次いで0.1mLのDMEM/B27中で、ウェルあたり0.75〜1.25×10細胞で播種する。培養物を、37℃で、90％空気/10％CO₂の雰囲気を含有するH₂O飽和インキュベーター中で維持する。細胞の生存能を、位相差顕微鏡によって視覚的に評価し、そしてalamarBlue^TM（Alamar Biosciences，Inc.，Sacramento，California，US A）の還元を測定することによって下記のように定量する。B27補充物による血清の置換により、膠原線維酸性タンパク質およびニューロン特異的エノラーゼに対する免疫細胞化学によって判断されるような（Brewerら、J．Neuro．Sci．Res． 35(5):567-577(1993)）、ほぼ純粋なニューロンの培養物が得られる。この手順を用いて、開示されたトランスジェニック動物由来の細胞培養物もまた調製され得る。本明細書中に引用された全ての刊行物は、参考として本明細書中に援用される。これらの刊行物に含まれる情報（これについて、その刊行物を引用する）は、一般に公知である。実施例１：NIH3T3およびPC12細胞におけるpMTAPP-1の発現。クローンpMTAPP-1は、図１aに示すAPP770発現構築物の１例である。ここで使用されるプロモーターは、メタロチオネイン（metallothionine）プロモーターである。安定な細胞株を、NIH3T3およびPC12細胞株（ATCC #CCL92およびCRL1721 ）をトランスフェクトすることによって得る。500,000のNIH3T3またはPCl2細胞を、100mmディッシュにプレーティングし、そして最終容量100μl中で、50mgのリポフェクチン（Gibco，BRL）の存在下で沈澱させた、５mgのSalIフラグメントと１mgのpSV2neo DNA（SouthernおよびBerg(1982)）との混合物を用いてトランスフェクトした。PC12細胞についてはポリリジンでコーティングしたプレートを用いた。この細胞は通常組織培養ディッシュに良好に接着しない。細胞を、DMEM またはRPMI中に10％ウシ胎児血清を含有し、かつG418を補充した選択培地で増殖させた。500mg/ml（生物学的重量）および250mg/mlのG418を用いて、それぞれ、 NIH3T3およびPC12細胞からコロニーを選択した。トランスフェクションの15日後、G418に耐性の細胞のコロニーをクローニングリングによって単離し、そしてＴフラスコ中で拡大させた。細胞中のAPPc DNAの存在を、MullisおよびFaloona，M ethods Enzymol．155:335-350（1987）（この教示は、一般に公知であり、そして本明細書中に援用される）の手順を用いるPCRによって検出した。各細胞株からの25コロニーにおけるAPPの発現を、免疫染色（Majochaら(1988) ）によって分析した。細胞をサブコンフルエントまで増殖させ、そして４％パラホルムアルデヒド、0.12M NaCl、および20mm Na₃PO₄（pH7.0）を含有する溶液中で固定した。これらを、合成Aβ配列（Mastersら(1985);GlennerおよびWong）に対する１次モノクローナル抗体（Ronald Majocha博士，Massachusetts General Hospital，Boston，MAにより提供された）とともに、続いて一般化された、ビオチンに結合された抗マウス抗体（Jacksonl ImmunoResearch Labs，PA）とともに一晩インキュベートした。次いで、アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP ）（Vector Labs，Burlingame，CA）、および色素原としてのジアミノベンジジン（Majochaら(1985)）を添加することにより、免疫染色を行なった。結果は、p MTAPP-1ベクターが、NIH3T3およびPC12細胞の両方においてAPPを発現していることを示した。実施例２：PC12細胞におけるpEAPP-1の発現。 pEAPP-1は、図１aに示すAPP770発現構築物の１例である。ここで使用されるプロモーターは、25kbのヒトAPP遺伝子プロモーターである。この構築物由来のDNA を、上記のように、PC12細胞にトランスフェクトした。pEAPP-1でトランスフェクトした細胞の特定のクローンは、神経成長因子（NGF）で処理したPC12細胞によって示される分化表現型と、形態学的に類似の分化表現型を示した。PC12細胞は通常、かなり円く、かつ平坦な細胞である。pEAPP-1でトランスフェクトしたこれらの細胞は、神経突起に似た細胞質伸長物（extension）を有する。NGFで処理したPC12細胞は、非常に長い神経突起伸長物を伸ばした。pEAPP-1でトランスフェクトした13のPC12細胞クローンを、選択し、そして繁殖させた。これらの細胞クローンのうちの８クローンは、自発的な分化表現型を示し、クローン1-8、1 -1、および1-4は最も強い表現型を示した。実施例１に記載したようなＡβに対する抗体を用いた、pEAPP-1でトランスフェクトしたPC12細胞の染色により、分化を示すこれらの細胞はまた、APPも発現していることが示された。pMTAPP-1クローンでトランスフェクトしたPC12細胞は、たとえAPP770のcDNAが発現されるとしてもこの表現型を示さなかったので、これらの結果は、ヒトプロモーターからのAPP770の発現が細胞の生理機能に関して新規の特性を有することを示唆する。実施例３：PC12細胞におけるpMTA4の発現。 pMTA4は、図４ａに示される構築物のタイプの１例である。ここで、使用されるプロモーターは、メタロチオネインプロモーターである。この構築物がコードするタンパク質は、図４ａに示したタンパク質とはわずかに異なる。APP770 cDN Aクローンを、Asp718で消化した。これは、57位の後を切断する（Kangら（1987 ）の番号システム）。得られた５'伸長部を、Klenow酵素を用いてフィルインした（Sambrookら(1989)）。同一のDNA調製物をまた、EcoRIで切断した。これもまた、2020位の後を切断する。得られた５'伸長部をKlenow酵素を用いてフィルインした（Sambrookら(1989)）。この分子の自己連結は、このようにコードされた短縮型タンパク質が、リーダー配列、続いてＡβの配列Phe-Arg-Val-Gly-Ser-で始まるＡβの短縮されたバージョン、続いてAPPの56の末端アミノ酸を含む、発現クローンを生じる。この構築物由来のDNAを、上記のように、PC12細胞中にトランスフェクトした。実施例４：MT-1プロモーターの制御下でAPPを発現するトランスジェニックマウスの生成。前核胚に、pMTAPP-1ベクターDNAをマイクロインジェクションすることによって、トランスジェニックマウスを作製した。pMTAPP-1は、図１ａに示す構築物のタイプの１例である。ここで、APP770コード配列はメタロチオネインプロモーターに作動可能に連結されている。マウス胚へのマイクロインジェクションのための手順は、Hoganら（1986）によるManipulating the Mouse Embryoに記載される。この手順の簡単な説明のみを、以下に記載する。マウスを、Taconic Laboratories(German Town，New York)から入手した。Swi ss Webster雌性マウスを、胚の回復（retrieval）および移植のために用いた。B 6D2F₁雄性を交配のために用い、そして精管切除したSwiss webster種畜を用いて、偽妊娠を刺激した。Ａ．胚の回収。雌性マウス（４〜８週齢）に、５IUの妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG;Sigma）、続いて48時間後に５IUのヒト絨毛膜ゴナドトロピン（hCG;Sigma）を用いて過剰排卵を誘導させた。hCG注射の後直ちに、雌を雄とともに入れた。hCGの21時間後に、交配した雌の切除した卵管から胚を、0.5％のウシ血清アルブミン（BSA;S igma）を含有するダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水に回収した。周囲の卵丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（１mg/ml）を用いて除去した。次いで、前核胚を洗浄し、そして７％CO₂、５％O₂、および88％N₂で湿潤雰囲気を含有する37.5℃のインキュベーター内の、0.4％のBSAを含有するEarle平衡塩類溶液（EBSS）中に、インジェクション時まで置いた。Ｂ．マイクロインジェクション。 Elutip-D^TMで精製したSalI DNAを、５mM Tris（pH7.4）および0.1mM EDTA中に、マイクロインジェクションのために３μg/mlの濃度で溶解した。極微針および保持ピペットを、DKIモデル720pipette pullerのFisher凝固チューブ（Fisher）から引っ張った。次いで、保持ピペットを、約70μm（O.D.）で折り、そしてNar ishige microforge（model MF-83）で約30μmのI.D.に口焼きした。ピペットを、Nikon Diaphot顕微鏡に取り付けたNarishige micromanipulatorに装備した。空気を満たしたインジェクションピペットに、保持ピペットに対してチップを折った後に、チップ中をDNA溶液で満たした。胚（30〜40の群）を、マイクロマニピュレーションのためのパラフィンオイル下で100μl滴のEBSS中に置いた。胚を、方向をあわせ、そして保持ピペットで保持した。次いで、インジェクションピペットを、雄の前核中に挿入した（通常大きい方）。ピペットが膜を通り抜けなかった場合、直ちに載物台を軽くたたいて貫通を補助した。次いで、核を注入し、そしてこの注入を、核の膨張によってモニターした。注入後、胚の群をレシピエントの雌に移入するまでEBSS中に置いた。Ｃ．移入。ランダム周期の成体雌性マウスを、精管切除したSwiss Websterの雄とつがわせた。レシピエントの雌をドナーの雌と同時に交配させた。移入時に、雌をアベルチンで麻酔した。卵管を、一回の正中背面切開により露出させた。次いで、卵管の直上の体壁を通るように切開した。次いで、卵巣嚢を、時計用のピンセットを用いて裂いた。移入すべき胚を、DPBS中に、かつ移入ピペットの先端に置いた（約10〜12の胚）。ピペットの先端を卵管漏斗部に挿入し、そして胚を移入した。移入後、切開を２本の縫合糸によって縫合した。Ｄ．トランスジーン組み込みについてのマウスの解析。３週齢以上で、約１cm長の尾のサンプルを、DNA分析のために切除した。尾のサンプルを、0.7mlの５mM Tris（pH8.0）、100mMEDTA、0.5％SDS、および350μg のプロテイナーゼＫの存在下で、55℃で一晩振盪させながらインキュベーションすることによって消化した。消化した材料を、等容量のフェノールで１度抽出し、そして等容量のフェノール：クロロホルム（１：１混合物）で１度抽出した。上清を、70μlの３M酢酸ナトリウム（pH6.0）と混合し、そしてDNAを、等容量の 100％エタノールを添加することによって沈澱させた。DNAを、微量遠心でスピンダウンし、70％エタノールで１度洗浄し、乾燥させ、そして100μlのTE緩衝液（ 10mM Tris(pH8.0)および１mM EDTA）中に溶解した。各サンプルからの10〜20μlのDNAを、BamHIで消化し、１％アガロースゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロース紙上にブロッティングし、そして³²P標識したAPP cDNAフラグメントとハイブリダイズさせた。トランスジェニック動物を、ハイブリダイズしたニトロセルロースフィルターのオートラジオグラフィーによって同定した。このDNAをまた、APP DNAの800bpフラグメントを生成する合成プライマーを用いて行うPCRによって分析した。全部で671の前核胚をマイクロインジェクションし、そのうち73匹の生存した子供、および６匹の死亡した子供が生まれた。DNA分析によって９匹のトランスジェニックマウス（５匹の雌および４匹の雄）が同定され、これらをＦ₁およびＦ₂トランスジェニックを生じさせるために交配した。これらの動物は、上記のように、種々の組織におけるAPPのmRNAおよびタンパク質の発現、ならびに行動性異常および病理学的異常の分析について分析され得る。この構築物を有するトランスジェニックマウスは、トランスジェニックRNAを発現する。実施例５：cDNA/ゲノムコード配列の組み合わせを含むAPP構築物の構築。イントロン６、７、および８を含むcDNA/ゲノムAPP構築物を、エクソン１〜６および9〜18をコードするAPP cDNAと、イントロン６、７、および８、ならびにエクソン７および８をコードするゲノムAPP配列とを組み合わせることによって調製した（図６を参照のこと）。pUCベクター中の都合のよい挿入のための十分に小さなスプライシングカセットを作製するために、イントロン配列中に２つの欠失を作製した。１つの欠失は、イントロン６の143位からエクソン７の始まりの上流に位置するBamHI部位（エクソン７の始まりの前1658bp）までのイントロン６の中に作製した。もう一つの欠失は、イントロン８中の最初のBamHI部位からエクソン９の始まりの前の263bpの部位までのイントロン８の中に作製した。混乱を避けるため、これらの短縮型のAPPイントロン６および８を、本明細書中でイントロンΔ６およびイントロンΔ８という。BamHI部位は、これらの欠失の部位で操作され、その結果、これらはBamHI部位の存在によって印を付けられる。PDAPPと呼ばれるこの構築物において、エクソン７および８ならびにイントロン７は、イントロン７中の唯一のXhoI部位が破壊されたことを除いて、インタクトなゲノム配列である。短縮したイントロンを含むDNAフラグメントは、以下のように生成される：Bam HI部位を、PCR変異誘発によってイントロン６のヌクレオチド中の143bpで操作し（「PCRによる変異誘発」PCR Technology:Current Innovations（GriffithおよびGriffith編、CRC Press，1994）69-83頁）、そして別のBamHI部位を、PCR変異誘発によってエクソン９の始まりの前の263bpで操作した。これらの部位を、それぞれ、エクソン６およびイントロン６、ならびにイントロン８およびエクソン９の接合部を含む別のAPPゲノムDNAクローン中に操作し、改変したAPPゲノムDNA クローンを生じた。全カセットを、以下のようにAPP cDNAクローン中に組み立てた（図11）。エクソン１〜５およびエクソン６の一部を含むAPP cDNAの889bpのBamHI−XcmIフラグメント（配列番号５のヌクレオチド１〜843を含む）を、挿入部位から下流のBam HIおよびXhoI部位を含むベクター中にクローン化してAPP770x-オリゴ-xを作製した。次いで、APP770x-オリゴ-xを、XcmIおよびBamHIで切断した。次いで、２つのフラグメントを、上記のエクソン６およびイントロン６の接合部を含む改変されたAPPゲノムDNAクローンから、XcmIおよびBamHIで切断することにより得た。エクソン６中のXcmIからイントロン６中のXcmIまでの得られた34bpのフラグメント、およびイントロン６中のXcmIからイントロン６の位置143bpで人工的に作製したBamHI部位までの131bpを、３点連結（three-way ligation）工程においてAP P770x-オリゴ-x中に連結してAPP770x-E6オリゴ-xを作製した。フラグメントの方向を、配列決定によって確認した。次いで、APP770x-E6オリゴ-xを、BamHIおよびXhoIで切断した。次いで、イントロン８とエクソン９との接合部を含む改変したAPPゲノムDNAクローン由来の313bpのBamHIおよびXhoIフラグメントを、APP770 x-E6オリゴ-x中に連結してAPP770xE6E9xを作製した。次いで、APP770xE6E9xを、BamHIで切断し、そしてKPIおよびOX-2ドメイン（エクソン７および８）をコードするAPPゲノムDNAの6.8kbのBamHIフラグメントをこの部位に挿入した。このフラグメントは、エクソン７の始まりの上流1658bpのBa mHI部位で開始し、そしてイントロン８中の最初のBamHI部位まで伸長する。この BamHIフラグメントを、APP遺伝子のこの部分をコードするラムダファージゲノムクローンから得た。このクローンは、Stratageneから得られるLambda FIXIIベクター中のヒト胎盤ゲノムライブラリーから入手された。このBamHIフラグメントは本来はXhoIを含んでいた。このXhoI部位は、切断、フィルイン、および再連結によって破壊された。欠失の位置を、図10に図解する。エクソン１〜８および９の一部、ならびにイントロン６、７、および８を含むこのクローンを、「APPスプライシングカセット」と名付けた。APPスプライシングカセットを、NruIおよびXhoIで切り離し、そしてHardy変異を有するAPP cDNAのNruI-XhoI cDNAフラグメントを置き換えるために使用した。APP cDNAのこの変異形態を、部位特異的変異誘発によってヌクレオチド2145位のＧをＴに変換することによって作製した。これにより、コードされるアミノ酸はValからPheに変化する。得られた構築物は、 cDNA/ゲノムAPPの組み合わせ「ミニ遺伝子」である。この構築物を生成するために用いたAPPゲノムクローン由来のAPPエクソン７および８を含む6.8kbのBamHIフラグメントの配列決定により、イントロン７が2.6k bの長さであること、そしてイントロン８中の最初のBamHI部位（APPミニ遺伝子構築物中に操作されたイントロン８中の欠失の上流部位）が、エクソン８の末端より下流の2329bpであることが示された。このことは、Yoshikaiら（1990）およびYoshikaiら（1991）により公表されたAPP遺伝子の制限マップと一致しない。彼らのマップと本発明者らの配列との比較により、Yoshikaiらは彼らの制限マッピングにおいて２つのEcoRIフラグメントの順番を交換したことが示唆される。エクソン８を含む1.60kbのEcoRIフラグメントは実際、1.48kbのEcoRIフラグメントの上流であり、そしてYoshikaiらがイントロン７中にマッピングした1.48kbの EcoRIフラグメントは実際、イントロン８中にある。本発明者らは、ヒトDNAから PCRで生成したフラグメントのサイズ測定によって、エクソン８を含むEcoRIフラグメントに関してこの位置を確認した。このAPPミニ遺伝子は、PDGF-Bプロモーターに作動可能に連結されて哺乳動物細胞におけるAPP cDNA/ゲノム構築物の発現を提供する。PDGFβ鎖の５'隣接配列を、APPミニ遺伝子の始まりのNruI部位の上流に挿入した。このフラグメントは転写開始部位の1.3kb上流（ここに、PDGF-Bプロモーターが存在する）、および５'非翻訳領域の約70bpを含み、AurII部位で終わる（Higginsら（1994））。240 bpのBamHIからBclIまでのフラグメントを有する後期SV40ポリアデニル化シグナルを、APPミニ遺伝子の下流に付加した。PDGF-Bプロモーター、APPスプライシングカセット、Hardy変異、およびSV40ポリアデニル化シグナルを組み合わせたこの構築物を、PDAPP（図９）という。実施例６：PDAPP構築物を含むトランスジェニックマウス。実施例５に記載したPDAPP構築物を用いて、トランスジェニックマウスを生成した。上記の標準的な技術を用いるマイクロインジェクションによって、トランスジェニックマウスを生成した。PDAPP DNAを、２細胞期で胚中にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションの前に、プラスミド配列（pUC）を、SacIおよびNotIの消化によって除去した。７匹の創始（founder）マウスを生成し、そして109系統を広範な分析に用いた。ヘテロ接合体の動物のみを用いた。４世代由来の104匹の動物のサザン分析により、約40コピーのトランスジーンが単一部位に挿入され、そして安定な様式で遺伝されたことが示された。ヒト APPメッセンジャーRNAは、トランスジェニックマウスの数種の組織で産生されたが、脳において特に高レベルに産生された。RNase保護アッセイにより、Quonら（1991）、Muckeら、Brain Res．666:151-167(1994)，McConlogueら、Neurobiol ．Aging 15:S12(1994)、およびHigginsら、Ann Neurol．35:598-607(1994)によって以前に記載されたニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーターに駆動されるAPPトランスジーンを発現するマウス系統においてよりも、109系統の動物の脳において、少なくとも20倍多いAPPの発現が示された。Ａ．APP転写産物およびタンパク質の発現。 RNAを、ChomaczynskiおよびSacchi，Analyt．Biochem．162:156-159(1987)に記載されるように、脳組織から単離し、そしてヒト特異的APPプライマー（5'-CC GATGATGACGAGGACGAT-3'、配列番号７；5'-TGAACACGTGACGAGGCCGA-3'、配列番号８）を用いて、94℃で１分、60℃で40秒、および72℃で50秒の40サイクルを使用して、Wangら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86:9717-9721(1989)に記載されるように、RT-PCRに供した。RT-PCR分析は、トランスジェニック動物の脳におけるヒトAPPの695、751、および770イソ型をコードする転写産物の存在を実証したが、非トランスジェニック同腹子由来の脳におけるその存在を実証しなかった。トランスジェニックマウスRNA由来のヒトAPP RT-PCRバンドの同一性を、サブクローニングおよび配列決定によって確認した。 PDAPPトランスジェニックマウス、NSE-APPトランスジェニックマウス、非トランスジェニックマウス、ならびにADに罹患したヒトおよび罹患していないヒトの脳におけるAPP転写産物の相対的レベルおよびオルタナティブスプライシングを、RNase保護アッセイにおいて比較した（Rockensteinら、J．Biol．Chem．270:2 8257-28267(1995)）。PDAPPマウスは、非トランスジェニックコントロールよりも約５倍高い総APP mRNAレベル、およびほとんどのNSE-APPトランスジェニックマウスよりも少なくとも20倍高いヒトAPP mRNAレベルを発現した。NSEで駆動されるヒトAPP発現は、マウスAPP mRNAのレベルに影響を及ぼさないが、PDAPPトランスジェニックマウスは、マウスAPP転写産物において有意な30％の減少を示した。非トランスジェニックマウスの脳におけるマウスAPP770:751:695 mRNAの相対的発生量は、およそ１：１：35であったが、PDAPPトランスジェニックマウスの脳における対応するヒトAPP mRNAレベルは、５：５：１であった。ホロ-APPの分析を、0.5m MEDTA、10μ ml^-1ロイペプチン、および１mM PMSFを含有する10容量のPBS中での脳のホモジナイゼーションにより行なった。サンプルを、12,000gで10分間スピンし、そしてペレットをRIPA（150mM NaCl、50mM Tr is（pH8.0）、20mM EDTA、1.0％デオキシコール酸塩、1.0％ Triton X-100、0.1 ％ SDS、１mM PMSF、および10μg ml^-1ロイペプチン）中に再懸濁した。サンプル（それぞれ30μgの総タンパク質を含む）を、SDS-PAGEによって分析し、Immob ilon膜に移し、そしてホロ-APP抗体である抗-６（抗Bx 6）（Oltersdorfら、J． Biol．Chem．285:4492-4497(1990)に記載される）、または8E5モノクローナル抗体のいずれかと反応させた。8E5は、ヒトAPPの残基444-692を含む細菌性融合タンパク質に対して調製され（Oltersdorfら（1990））、そしてヒト特異的であり、マウスAPPに対する交差反応性を本質的に示さない。トランスジェニックマウス109系統およびコントロールの同腹子の脳組織における総APP発現（ヒトおよびマウス）の、Ｃ末端APP抗体である抗-６を用いたイムノブロット分析により、トランスジェニックマウスにおいてははるかに高い発現レベルが示された。ホロ-A PPポリクローナル抗体である抗-６またはヒト特異的APPモノクローナル抗体である8E5のいずれかを用いた脳のホモジネートのイムノブロット分析により、内因性マウスAPPレベルまたはADの脳におけるAPPレベルのいずれかよりも、トランスジェニックマウスにおけるヒトAPPの過剰発現が、海馬において少なくとも３倍高いレベルで示された。Ａβのイムノブロット分析のために、９月齢のマウスの脳を、５mlの６MグアニジンHCl、50mM Tris（pH7.5）中でホモジナイズした。ホモジネートを、100,0 00gで15分間遠心分離し、そして上清をH₂Oに対して一晩透析し、１mM PMSFおよび25μg ml^-1ロイペプチンを含むPBSに調整した。この材料を、抗体266樹脂を用いて免疫沈降させ、そしてSeubertら、Nature 359:325-327(1992)によって記載されるように、ヒト特異的Ａβ抗体である6C6を用いてイムノブロットした。このヒト特異的Ａβ抗体（6C6）を用いて、4kDのβアミロイド免疫反応性ペプチドを、トランスジェニック動物の脳から単離した。これは、Ａβの相対的分子量に一致する。脳のＡβレベルは、以前記載されたヒトAPPトランスジェニックマウスにおいてよりも109系統の動物において少なくとも10倍高かった。トランスジェニック動物由来の初期の16日の皮質細胞培養物は、Seubertら（1992）およびM cConlogueら（1994）によって記載されたように、そして実施例８に記載するように、ヒト特異的Ａβ酵素結合免疫吸着アッセイによって培地中に検出されるような、Ａβ1-42の実質的画分（５ng ml^-1の総Ａβ；0.7ng ml^-1のAβ1-42）を含むヒトＡβを構成的に分泌した。従って、109系統の動物はその脳において、ヒトAPP mRNA、ホロ-APP、およびＡβを非常に過剰発現した。Ｂ．PDAPPトランスジェニックマウスの組織病理。 109系統の５世代に相当する、180匹のトランスジェニックおよび160匹の月齢の匹敵する非トランスジェニックの月齢の匹敵するコントロール（４〜20月齢）由来の脳を、組織病理学的に広範に調べた。いくつかのマウスの脳を取り出し、そして48時間アルコール固定液中に入れ、その後パラフィン包埋した（Araiら、 Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87:2249-2253(1990)）。他のマウスを生理食塩水、続いて0.1Mリン酸ナトリウム中の４％パラホルムアルデヒドで灌流した。パラフィンに包埋した脳について、トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウス由来の６μmの冠状縫合（coronal）または側矢状縫合（parasaggital）の切片を、ポリ-L-リジンでコーティングしたスライド上に、互いに近接させて置いた。切片を脱パラフィン処理し、再水和させ、そして0.03％H₂O₂で30分間処理し、その後、１：1,000希釈のＡβ抗体、R1280（Tamaokaら、Proc．Natl．Aca d．Sci．U.S.A．89:1345-1349(1992)）とともに４℃で一晩インキュベーションした。吸着実験のために、10％の水性ジメチルスルホキシド中の合成ヒトＡβ1- 40ペプチド（Gamesら、Neurobiol．Aging 13:569-576(1992)）を、希釈した抗体に添加して最終濃度7.0μMにし、そして37℃で２時間インキュベーションした。希釈物を、切片にアプライし、そして標準抗体溶液と同じ条件下でプロセスした。次いで、ペルオキシダーゼウサギIgGキット（Vector Labs）を、推奨されたように、色素原として3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）とともに使用した。同様に固定したヒトAD脳を、同一条件下で同時にプロセスした。４月齢の前に、明らかなＡβ沈着は検出されなかった。しかし、約４月齢までに、トランスジェニック動物は、海馬、脳梁、および大脳皮質においてヒトＡβ の沈着を示し始めた。これらのＡβプラークは、加齢とともに増加し、そして８月齢までに、30〜200μmの多数の沈着が認められた。動物が、９ヶ月以上加齢した場合、Ａβ染色パターンがADのパターンに類似するまで、プラークの密度が増加した。脈管のアミロイド（AD病理の別の特徴）が、より高齢のマウスで発生した。強い病理はまた、PDAPPベクターから生成された別のトランスジェニック系統（35系統）においても観察された。種々の形態のＡβ沈着が、種々のＡβ抗体（十分に特徴づけられたヒト特異的Ａβ抗体、ならびにＡβ1-42の遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端に特異的な抗体を含む）の使用の結果として明らかに明白であった。抗体9204（Saidoら、J．Biol．Chem．289:15253-15257(1994)に記載される）は、Ａβ1-5に特異的であり、そしてこれを7.0μg ml^-1の濃度で使用した。Ａβ1-42に特異的である抗体277-2を、標準的な免疫化プロトコル（注射あたり500μg）を用いてカチオン化BSA（「Super Carriers」；Pierce）に結合したペプチドシステイン-アミノヘプタン酸-Ａβ33-42で、New Zealand白ウサギを免疫化することによって調製した。特異的な抗体を、アガロースビーズ上に固定化した免疫原に対して、血清からアフィニティー精製した。抗体277-2とインキュベーションする前に、切片を80％蟻酸で、１〜２分間処理した。検出のために、抗体を、ペルオキシダーゼウサギIgGキット（Vector Labs）を用いて反応させた。次いで、生成物を、色素原としてDABを用いて可視化した。次いで、いくつかの切片を、１：500希釈のポリクローナル抗GFAP（Sigma）とともに４℃で一晩インキュベーションした。GFA P抗体を、アルカリ性ホスファターゼ抗ウサギIgGキットおよびアルカリ性ホスファターゼ基質キット１（Vector Labs;製造者の推奨に従って用いた）を使用して反応させた。さらなる切片を、１：40希釈で用いられるF480抗体（Serotec）とともに一晩インキュベーションして、小膠細胞を可視化した。次いで、マウスペルオキシダーゼキット（Vector Labs）を製造者の推奨に従って用いた。いくつかの切片を、標準的な手順（Dicksonら、Acta Neuropath．79:486-493(1990)）を用いて、チオフラビンＳで染色し、そして、最大波長440nmのFITCフィルターを通した紫外線を用いて調べた。連続切片により、多数のプラークが9204および277-2抗体の両方でポジティブに染色されることが実証された。Ａβ沈着の形態は、拡散した不規則なタイプからコアを有する濃縮プラークまでの範囲で変化した。ほぼ球状の、かつ星雲状で不規則な沈着を、Ａβの遊離アミノ末端に対して特異的な抗体9204で標識した。Ａβ沈着に関連する星状細胞の神経膠症は、膠原線維酸性タンパク質（GFAP）およびヒトＡβに対する抗体を用いた２重免疫標識の後に明らかであった。濃縮したＡβのコアおよび「輪（halo）」が、いくつかのプラークで明らかであった。非トランスジェニックの同腹子は、これらの神経病理学的変化を示さなかった。免疫染色は、関連した合成ペプチドで十分に吸着可能であり、そして種々のプロセシング条件（パラホルムアルデヒドを用いた固定およびTrojanowski法を含む）を用いて明らかであった。多数のプラークがチオフラビンＳで染色され、そしていくつかはまた、Bielschowsky銀法を用いて染色され、そしてCongo Redで複屈折し、これらの沈着の真のアミロイドの性質を示した。プラークの大部分は、ADプラークにおいて見出される神経膠症と同様に、GFAP ポジティブ反応性星状細胞に個々に取り囲まれていた。トランスジェニックマウスの新皮質は、アメーバ状の外見、短くなった突起、そしてMac-1抗体での染色によって規定されるような、広く活性化された小膠細胞を含んでいた。リン酸化された神経フィラメントおよびリン酸化されたタウを認識する抗体による染色は、異常なリン酸化が、ADに類似したPDAPPの脳において生じたことを示した。これらのリン酸化は、ADにおいて観察され、そして神経細線維のもつれの形成を妨げると考えられている。ペアードヘリカルフィラメント（PHF）は、未だPDAPPマウスにおいて検出されていないが、異常にリン酸化された神経フィラメントおよびタウの検出は、ADにおけるPHFの形成に関連し、そしてその最初の段階であると考えられる。神経突起病理の明らかな証拠は、従来および共焦点免疫顕微鏡の両方を用いて明らかである。40μmの厚さのビブラトーム（vibratome）の切片を、ポリクローナル抗シナプトフィシン（１：150；Dako）または8E5（7.0μg^-1）と組み合わせたR1280（１：1000）とともに、４℃で一晩インキュベーションした。いくつかの切片を、抗シナプトフィシンまたはモノクローナル抗MAP 2（１：20，Boehrin ger-Mannheim）とともにインキュベーションし、次いで、ヤギ抗ウサギビオチン化抗体（１：100）と反応させ、続いてFITC結合ウマ抗マウスIgG（１：75）およびアビジンＤテキサスレッド（１：100）（Vector Labs）の混合物と反応させた。二重免疫標識切片を、レーザ一共焦点スキャンニングシステムMRC600（Bio-Ra d）を取り付けたZeiss Axiovert 35顕微鏡で調べた。テキサスレッドチャンネルは、R1280またはシナプトフィシン標識の画像を収集し、そしてFITCチャンネルは、シナプトフィシン、8E5、またはMAP 2標識を収集した。厚さ0.5μmの光学ｚ -切片を、Masliahら、J．Neuropath．Exp Neurol．52:619-632(1993)に記載される画像プロセシングおよび貯蔵と同様に、各領域から収集した。多くのＡβプラークが、ヒトAPP特異的抗体および抗シナプトフィシン抗体で検出され得る歪んだ神経突起と密接に関連し、このことは、これらの神経突起が、ADの脳において観察されるように、軸索の芽に部分的に由来することを示唆した。プラークは、またADの脳のように、周囲の神経網を圧縮し、そして歪めていた。シナプスおよび樹状突起の密度もまた、トランスジェニックマウスの海馬歯状回の分子層において減少した。このことは、AD脳におけるシナプス前マーカーであるシナプトフィシン、および樹状突起マーカーであるMAP-2についての免疫染色の減少によって明らかであった（Masliahら、Am．J．Path．138:235-246(19 91)）。細胞外Ａβの存在の確認を、免疫電子顕微鏡法を用いて得た。免疫電子顕微鏡法のために、マウスを、生理食塩水で灌流し、続いてカコジル酸緩衝液中の2.0 ％パラホルムアルデヒドおよび1.0％グルタルアルデヒドで灌流した。40μmの厚さのビブラトーム切片を、R1280抗体とともにインキュベーションし、そしてペルオキシダーゼウサギIgGキット（Vector Labs）を用いて反応させた。次いで、Ａβ沈着を伴う免疫標識した切片を、1.0％アンモニウムテトラオキシド中で固定し、そしてエポン/アラルダイト中に包埋した後、Jeol CX100電子顕微鏡で超薄切片を調べた（Masliahら、Acta Neuropath．81:428-433(1991)）。表３．ADとPDAPPトランスジェニックプラークとの間の超微細構造の類似性および相違。表３および４は、上記の結果の概要を示し、ADとPDAPPマウスとの間の細胞学的および病理学的類似性を示す。調べた全ての特徴について、ペアードヘリカルフィラメントを除いては、PDAPPマウスはADに特徴的な病理を示した。これらの知見は、トランスジェニック（TG）マウスにおけるヒトAPPの産生が、アミロイド沈着のみでなく、ADに関連する複合亜細胞性変性性変化の多くをも引き起こすのに十分であることを示す。表４．アルツハイマー病およびPDAPPマウスにおける病理これらのトランスジェニックマウスの最も顕著な特徴は、そのアルツハイマー様神経病理である。これには、ADの局所的特異性と類似した局所的類似性を伴う、細胞外Ａβ沈着、ジストロフィー性神経突起成分、神経膠症、およびシナプス密度の喪失が含まれる。プラーク密度は、これらのトランスジェニックマウスにおいて、ヒトにおいてそうであるように（Selkoe，Rev．Neurosi．17:489-517(1 994)）、加齢とともに増加し、これは、ADについてもまた提唱されている（Magg ioら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:5462-5466(1992)）ように、そのクリアランスを上回る進行性のＡβ沈着を意味する。PDAPPトランスジェニックマウスは、ADの神経病理におけるAPP発現およびＡβ沈着の第１の強力な新しい証拠を提供する。このようなマウスはまた、薬物をヒトの試験に進める前に、Ａβ産生を低下させ、そして／またはその神経毒性をインビトロで減少させる化合物が、この動物モデルにおいて有益な効果を生じ得るか否かを試験するための、十分に確固としたADモデルを提供する。実施例７：P8GP-BプロモーターからAPPを発現するAPPトランスジーンの構築。 PDAPPトランスジェニックマウスは、３つの主要なヒトAPPイソ型のすべての発現を可能にするスプライシングカセットを含む。ここで発現は、PDGF-Bプロモーターによって駆動され、そしてこれは、家族性のAD変異の部位であるアミノ酸71 7に変異を含む。これらの特性、および上記の他の特性を独立して使用してアルツハイマー病のモデルとして有用なトランスジェニックマウスを産生し得ることが予想される。このような構築物のいくつかの特定の例を、以下に記載する。Ａ．PDAPP-wtの構築。アミノ酸717に対する変異が野生型に置換された、cDNA/ゲノムクローンPDAPP の野生型バージョンを構築した。これは、PDAPPの1448bpのXhoIからSpeIまでのフラグメント（これは、Val717がPheで置換されたHardy変異をコードするAPP cD NA配列の部分を含む）を、野生型APPクローンの1448bpのXhoIからSpeIまでのフラグメントで置換することによって達成された。このフラグメントは配列番号５の1135位〜2588位の領域に対応する。PDAPPのイントロン配列はいずれも、この置換によって置換または除去されていない。この構築物をPDAPP-wtという。PDAP p-wtおよびその構築の概略図を、図12に示す。Ｂ．PDAPP-SwHaの構築。アミノ酸670および671でSwedish変異が導入された、cDNA/ゲノムクローンPDAP Pの別のバージョンを構築した。プラスミドpNSE751._delta3'spl.swは、アミノ酸 670および671でそれぞれ、LysからAsnへ、およびMetからLeuへのSwedish変異を含むヒトAPP751のcDNAを含む。このプラスミド由来の563bpのEcoRIからSpeIまでのフラグメントを、Hardy変異のPhe717を除いてはAPP cDNA配列の同一部分を含む、PDAPPの対応する563bpのEcoRIからSpeIまでの対応するフラグメントで置換した。このフラグメントは、配列番号５の2020位から2588位までの領域に対応する。これは、pNSE._delta3'spl.sw/haをもたらす。これは、アミノ酸670および67 1でのSwedish変異、ならびにアミノ酸717でのHardy変異の両方を含む。次いで、PDAPPの1448bpのXhoIからSpeIまでのフラグメントを、Swedish変異およびHardy変異の両方を含むpNSE752._delta3'spl.sw/haの1448bpのXhoIからSpeI までのフラグメントで置換し、PDAPP-Sw/Haを形成した。PDAPP-Sw/Haおよびその構築の概略図を、図13に示す。Ｃ．PDAPP695_V-Fの構築。 APP695のみをコードするが、Hardy変異、PDGF-Bプロモーター、およびPDAPPのベクター配列を保持する構築物を作製し得る。これは、APP配列のＣ末端部分、およびポリアデニル化、pUC、およびPDGF-Bプロモーター配列を含むPDAPP由来の 6.6kbのXhoIからNruIまでのフラグメントを、ハイブリッドスプライスシグナルおよびAPP配列の残りのＮ末端部分を（APP695 cDNAの911bpのXhoIからNruIまでのフラグメント上に）含むpCK695の1.2kbのXhoIからBclIまでのフラグメントに連結させることにより達成され得る。ハイブリッドスプライスシグナルは上記のものと同一であり、そしてベクターpohCK751（これは、Duganら、J．Biological Chem．270:10982-10989(1995)によって記載される）中にも存在する。pCK695は、pohCK751の単純ヘルペスウイルス複製およびパッケージング配列が除去されていること、ならびにこのプラスミドがAPP751の代わりにAPP695をコードすることを除いては、pohCK751と同一である。このベクター中で、PDGF-BプロモーターはVal717のPheへの変異を含むAPP695 の発現を駆動する。ハイブリッドスプライスシグナルが、発現を潜在的に増強するために含まれる。これに由来するさらなるベクター（任意のスプライスシグナルを欠失するか、または他のスプライスシグナルが付加されてこれと同じ機能を獲得する）が構築され得る。Ｄ．PDAPP751_V-Fの構築。 APP751のみをコードするが、Hardy変異、PDGF-Bプロモーター、およびPDAPP のベクター配列を保持する構築物が作製され得る。これは、APP配列の一部、ポリアデニル化シグナル、pUC、およびPDGF-Bプロモーター配列を含む6.65kbのXho IからKpnIまでのPDAPPのフラグメントを、ヒトAPP751のcDNA配列の残り（配列番号３のヌクレオチド57〜1084）を含む1.0kbのKpnIからXhoIまでのフラグメントに連結して、中間プラスミドPDAPPδsp751_V-Fを作製することによって達成され得る。ヒトAPP751の部分をコードする1.0kbのKpnIからXhoIまでのフラグメントは、プラスミドpoCK751（これは、単純ヘルペスウイルス配列が除去されていることを除いてはpohCK751と同一である）から得られることができる。次いで、スプライシング配列を導入するために、PDAPPの最初のイントロン（これは、イントロンΔ６である）を、PDAPPδsp751_V-F中に挿入してPDAPP751_V-F を作製する。これを達成するために、エクソン２から６、イントロンΔ６、およびエクソン７の一部を含むPDAPPの2,758bpのAsp718からScaIまでのフラグメントを、PDAPPδsp751_V-FのAsp718での完全消化およびScaIでの部分消化により得られる6,736bpのフラグメントに連結する。この6,736bpのフラグメントは、残りのさらなるAPP配列（エクソン１の一部、エクソン７の残り、およびエクソン９から18）、ポリアデニル化シグナル、pUC、およびPDGF-Bプロモーター配列を提供する。得られる構築物をPDAPP751_V-Fという。このベクターにおいて、PDGF-Bプロモーターは、Val717のPheへの変異を含むA PP751の発現を駆動する。１つのスプライスシグナル（イントロン６に由来する）は、発現を潜在的に増強するために含まれる。これに由来するさらなるベクター（任意のスプライスシグナルを欠失するか、または他のスプライスシグナルが付加されてこれと同じ機能を獲得する）が構築され得る。Ｅ．PDAPP770_V-Fの構築。 APP770のみをコードするが、Hardy変異、PDGF-Bプロモーター、およびPDAPP のベクター配列を保持する構築物が作製され得る。これは、APPのエクソン２〜７およびエクソン９の一部を含むPDAPP751_V-FのKpnIからXhoIまでのフラグメントを、エクソン２〜８およびエクソン９の一部を含むAPP770 cDNAのKpnIからXho Iまでのフラグメントと置換することによって達成され得る。このフラグメントは、配列番号５のヌクレオチド57〜1140に対応する。得られる構築物をPDAPP770_V-F という。このベクターにおいて、PDGF-Bプロモーターは、Val717のPheへの変異を含むA PP770の発現を駆動する。PDAPP770_V-Fは、PDAPP751_V-F中に存在するイントロン配列と同じイントロン配列を含む。これに由来するさらなるベクター（スプライスシグナルが付加されて発現の増強を獲得する）が構築され得る。実施例８：PDAPPマウスの脳組織におけるAPP発現産物の発現レベル。実施例６で記載したPDAPPマウスの系統を、種々の齢のマウスの海馬、皮質、および小脳の領域におけるAPPの数種の誘導体のレベルについて調べた。βセクレターゼ部位（APPβ）で切断されたAPP、およびＡβの少なくとも12アミノ酸を含むAPP（FLAPP+APPα；APPαと全長APP(FLAPP)との混合物）のレベルは、評価したすべての齢で、所定の脳の領域内で、ほぼ一定であることが見出された。海馬は、最も高いレベルのすべてのAPP形態を発現した。対照的に、Ａβのグアニジンで抽出可能なレベルは、免疫組織化学的に観察されるアミロイドプラーク沈着を反映する様式で、著しい齢依存性増加を示した。詳細には、海馬におけるＡ βのレベルは、４月齢の動物において見出されるレベルと比較して、８月齢までに17倍、そして１年齢までに106倍増加した。１年齢で、Ａβは海馬中の総タンパク質の約１％を構成する。大脳皮質もまた、加齢に伴うＡβのかなりの増加を示した。対照的に、小脳におけるＡβの平均レベルは、すべての齢の群にわたって、比較的低く、そして変化しなかった。Ａβ_1-42に特異的なELISAを用いる、これらの脳におけるＡβのさらなる分析により、このより長いバージョンは、若い動物の脳に存在するＡβの19pモル/g の27％を構成することが示された；この割合は、12月齢の動物において690pモル /gの97％まで増加した。Ａβ_1-42の選択的沈着およびＡβ沈着の空間的分布は、 PDAPPトランスジェニックマウスにおいて進行中の病理学的プロセスが、ヒトアルツハイマー病状態に類似するというさらなる証拠である。Ａβ含有タンパク質のレベルを、Ａβ、Ａβ_1-42、βセクレターゼ部位で切断されたAPP（Seubertら(1993)）、およびＡβの最初の12アミノ酸を含むAPP（FLA PP+APPα；全長APPとαセクレターゼ切断APPとの混合物(Eschら)）に特異的な抗体で形成されたELISAの使用によって測定した。局所的変化およびＡβの沈着形態の両方における著しい類似性が、マウスモデルとヒトAD状態との間で注目される。この結果はまた、Ａβ沈着の大きさおよび時間的な予言が可能であるため、 PDAPPマウスがＡβへのAPPのプロセシングを阻害するか、またはＡβアミロイドーシスを遅延させる薬剤を試験するための実用的なモデルであることを示す。Ａ．材料および方法。１．脳組織の調製。ヘテロ接合体のトランスジェニック（109系統、Gamesら；Rockensteinら）および非トランスジェニック動物を、Nembutol（0.9％生理食塩水中の１：５溶液）で麻酔し、そして氷冷した0.9％生理食塩水で心臓内に灌流した。脳を取り出し、そして１つの半球を免疫組織化学分析のために調製した。一方、４つの脳の領域（小脳、海馬、視床、および皮質）を、他方の半球から解体し、そしてＡβ およびAPP測定のために用いた。 ELISA用の組織を調製するために、各脳の領域を、電動化乳棒（Kontes）を用いて、10容量の氷冷したグアニジン緩衝液（5.0MグアニジンHCl、50mM Tris-Cl （pH8.0））中でホモジナイズした。ホモジネートを、室温で３〜４時間、Nutat or上で穏やかに混合し、次いで、直接アッセイするか、またはＡβおよびAPPの定量の前に-20℃で保存した。予備的な実験により、分析物がこの保存条件で安定であることが示された。２．Ａβ測定。脳のホモジネートを、氷冷したカゼイン緩衝液（0.25％カゼイン、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、0.05％アジ化ナトリウム、20μg/mlアプロチニン、５mM EDTA（pH8.0）、10μg/mlロイペプチン）でさらに１：10希釈し、グアニジンの最終濃度を0.5Mまで減少させ、その後、遠心分離した（４℃で20分間、16,000× g）。Ａβ標準（１〜40または１〜42アミノ酸）を、最終組成物が0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）の存在下で0.5Mグアニジンを含むように調製した。「総」ＡβサンドイッチELISAは、Ａβに対する２つのモノクローナル抗体（m Ab）からなる。捕獲抗体である266は、Ａβのアミノ酸13〜28に特異的であり（S eubertら（1992））；一方、Ａβのアミノ酸１〜５に特異的な抗体3D6は、ビオチン化され、そしてレポーター抗体として働く。3D6ビオチン化手順は、100mM重炭酸ナトリウム（pH8.5）緩衝液を使用することを除いては、免疫グロブリンのN HSビオチン標識のための製造者（Pierce）のプロトコルを使用する。3D6抗体は、分泌されたAPPまたは全長APPを認識しないが、アスパラギン酸のアミノ末端を有するＡβ種のみを検出する。このアッセイは、約50pg/ml（11.4pM）の感受性の下限を有し、そして１ng/mlまでの濃度で内因性マウスＡβペプチドに対して交差反応性を示さなかった。Ａβ_1-42特異的サンドイッチELISAの構成は、Ａβのアミノ酸33〜42に対して生成されたmAb 21F12を使用する。この抗体は、ELISAまたは競合ラジオイムノアッセイ（RIA）のいずれかにおいて、Ａβ_1-40に0.4％より少ない交差反応性を示す。ビオチン化3D6はまた、このアッセイにおけるレポーター抗体であり、これは約1 25pg/ml（28.4pM）の感受性の下限を有する。 266および21F12 mAbを、96ウェルのイムノアッセイプレート（Costar）中で、 10μg/mlで、室温で一晩コーティングした。次いで、プレートを吸引し、そして室温で少なくとも１時間、PBS緩衝液中の0.25％ヒト血清アルブミンでブロッキングし、次いで、使用するまで４℃で乾燥させて保存した。使用前に、プレートを洗浄緩衝液で再水和させた。サンプルおよび標準をプレートに添加し、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを、アッセイの各工程の間に、洗浄緩衝液（Tris緩衝化生理食塩水、0.05％Tween 20）で少なくとも３回洗浄した。カゼインアッセイ緩衝液（0.25％カゼイン、PBS、0.05％Tween 20（pH7.4））中に0.5μg/mlに希釈したビオチン化した3D6を、室温で１時間、ウェル中でインキュベーションした。カゼインアッセイ緩衝液中に１：4000希釈したAvidin-HRP （Vector，Burlingame，CA）をウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベーションした。比色定量基質（100μl）であるSlow TMB-ELISA（Pierce）を添加し、そして15分間反応させ、その後、酵素反応を、25μlの２N H₂SO₄で停止する。反応生成物を、Molecular Devices Vmaxを用いて定量し、450nmと650nmの吸光度の差異を測定した。３．APPのELISA。２つの異なるAPPアッセイを利用した。１番目のものは、APPαおよび全長形態のAPP（FLAPP+APPα）を認識し、一方、２番目のものは、APPβ（Ａβドメインの前にあるメチオニンで終わるAPP）を認識する（Seubertら（1993））。FLAPP+ APPαおよびAPPβアッセイの両方のための捕獲抗体は、ヒトAPPアミノ酸444〜59 2に対応する、細菌で発現された融合タンパク質に対して惹起されたモノクローナル抗体である8E5である（Gamesら）。FLAPP+APPαアッセイのためのレポーターmAb(2H3)は、Ａβのアミノ酸１〜12に対して生成された。8E5/2H3アッセイについての感受性の下限は、約11ng/ml（150pM）である。APPβアッセイについては、ポリクローナル抗体192をレポーターとして用いた。この抗体は、抗体92と同じ特異性を有する（Seubertら（1993））。すなわち、APPのβセクレターゼ切断部位のカルボキシ末端に対して特異的である。βセクレターゼ8E5/192アッセイについての感受性の下限は、約43ng/ml（600pM）である。両方のAPPアッセイのために、266について上記したように、8E5 mAbを96ウェルCostarプレートにコーティングした。精製した組換え体が分泌したAPPα（APP 751形態）およびAPP596が、それぞれ、FLAPP+APPαおよびAPPβアッセイに使用される参照標準であった。APPを、以前に記載（Eschら）されたように精製し、そしてAPPの濃度をアミノ酸分析によって決定した。５Mグアニジンの脳のホモジネートサンプルを、0.5M NaCl、0.1％NP-40、0.5Mグアニジンの最終緩衝液組成のための試料希釈剤中に１：10希釈した。それぞれのアッセイのためのAPP標準を、サンプルと同じ最終組成の緩衝液中に希釈した。APP標準およびサンプルをプレートに添加し、そして室温で1.5時間インキュベーションした。プレートを、アッセイの各工程の間、洗浄緩衝液で入念に洗浄した。レポーター抗体である 2H3および192を、3D6と同じ手順に従ってビオチン化し、そして室温で１時間、サンプルとともにインキュベーションした。試料緩希釈剤中に１：1000希釈したストレプトアビジン-アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim）を、室温で１時間、ウェル中でインキュベートした。蛍光基質である4-メチル-ウンベリフェリル-ホスフェートを添加し、そしてプレートをCytofluor^TM2350（Millip ore）で365nmの励起および450nmの発光で読みとった。４．モノクローナル抗体の作製。 3D6、21F12、および2H3についての免疫原を、マレイミドヘキサノイル-N-ヒドロキシスクシンイミド（Pierce）を用いてヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Jack son Immunoresearch Labs）に別々に結合した。A/Jマウス（Jackson Laboratori es）に、フロイント完全アジュバント（Sigma）中に乳化した100μgの適切な免疫原の腹腔内注射（IP）をし、そして隔週を基礎として、フロイント不完全アジュバント（Sigma）中の100μgの免疫原の２回の続くIP注射を行った。３回目のブースト後の２〜３週間で、所定の免疫原の最も力価の高いマウスに、PBS中の5 0〜100μgの免疫原を用いて静脈内注射および腹腔内注射をした。注射の３日後、脾臓を取り出し、脾細胞を単離し、そしてSP2/0-Ag14マウスミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマの上清を、以前に記載（Seubertら(1992)）されたように、RIAにより、高親和性のモノクローナル抗体についてスクリーニングした。精製したモノクローナル抗体を、腹水から調製した。５．免疫組織化学。各マウスの１つの脳の半球由来の組織を、４％パラホルムアルデヒドに滴下して固定し（drop-fix）、そして３日間、後固定（post-fix）した。組織を、冠状に沿って（coronally）包埋し、そして40μmの切片をビブラトームを用いて収集した。切片を、-20℃で不凍液中で保存し、その後染色した。皮質の後ろの部分から海馬までの６つごとの切片を、ビオチン化した3D6を用いて、４℃で一晩、免疫染色した。次いで、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼアビジン-ビオチン複合体（Vector）とともにインキュベーションし、そして3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）を色素原として用いて発色させた。Ｂ．結果。１．ＡβおよびAPPアッセイ。 FLAPP+APPαアッセイは、Ａβの最初の12アミノ酸を含む分泌されたAPPを認識する。レポーター抗体（2H3_1-12）は、Ａβのアミノ酸16と17との間に存在する αクリップ部位（alpha clip site）に対して特異的でないので（Eschら）、このアッセイはまた、全長APPをも認識する。混合物を枯渇させるための、全長APP の細胞質テールに対する固定化されたAPP抗体を用いる予備的な実験により、FLA PP+APPαの約30〜40％が全長であることが示唆される。APPβアッセイは、ポリクローナルレポーター抗体192の特異性により、Ａβ領域の直ぐアミノ酸末端でクリップされたAPPのみを認識する（Seubertら(1993)）。Ａβの免疫反応性の特異的な性質を、さらに以下のように特徴づけた。脳（小脳および脳幹を除く）のグアニジンホモジネートを、サイズ排除クロマトグラフィー（Superose 12）に供し、そして得られた画分を総Ａβアッセイを用いて分析した。２、４、および12月齢のトランスジェニックマウスの脳のホモジネートと、非トランスジェニックマウスの脳のホモジネート（これは、12月齢のトランスジェニックマウスにおいて見出されるのとほぼ等しいレベルでＡβ_1-40を添加（spike）されている）との比較を行った。トランスジェニックの脳のホモジネートの溶出プロフィールは、Ａβ免疫反応性のピークの画分が、同じ位置の単一の広範な対称的なピーク（これは、添加されたＡβ_1-40の免疫反応性ピークと一致する）で生じるという点で類似した。次いで、Ａβに対する抗体（Ａβ_13-28 に対するmAb 266）、APPの分泌形態に対する抗体（APP695形態のAPP_444-592に対するmAb 8E5）、APPのカルボキシ末端に対する抗体（APP695形態のAPP_676-695に対するmAb 13G8）、またはヘパリンアガロースを結合した樹脂を用いて、Ａβの免疫反応性を免疫枯渇させることを試みた。266の樹脂のみがＡβ免疫反応性を捕獲し、全長APPまたはAPPのカルボキシ末端フラグメントがＡβの測定に寄与しないことを実証した。Ａβ_1-42ELISAは、Ａβ_1-42を認識するが、Ａβ_1-40を認識しない捕獲抗体を使用する。Ａβアッセイと同様に、Ａβ_1/42アッセイは、同様の免疫枯渇研究によって示されるように、ホモジネート中のＡβ領域を含む全長またはカルボキシ末端形態のAPPによって影響を受けない。２．総ＡβおよびAPPの測定。表５は、齢の関数として、トランスジェニックマウスの海馬、皮質、小脳、および視床における、総Ａβ、FLAPP+APPα、およびAPPβのレベルを示す。各データ点は各齢の群についての平均値を示す。４つの脳の領域すべてにおけるFLAPP+ APPαおよびAPPβの相対的なレベルは、経時的に比較的一定のままである。海馬は、最高レベルのFLAPP+APPαおよびAPPβを発現し、視床、皮質、および小脳がそれぞれ続く。海馬において、FLAPP+APPαのレベルはすべての齢でAPPβよりも約3.5〜4.5倍高い。海馬におけるFLAPP+APPαおよびAPPβアッセイに対するすべての齢の平均値は、それぞれ674（±465）pモル/グラムおよび175（±11）pモル /グラムであった。このことから、脳のAPPのプールは、約50％のAPPα、30％の全長APP、および20％のAPPβからなると見積もられ得る。表５．PDAPPトランスジーン同齢集団動物のデータ脳組織の総ＡβおよびAPP測定（pモル/グラム）。 ND=測定せず APPレベルとは対照的に、Ａβレベルは海馬および皮質において、加齢とともに劇的に増加した。しかし、このような増加はPDAPPトランスジェニックマウスの小脳において全く示されず、そして穏やかな増加のみが視床において認められた（表５）。Ａβの増加は、皮質と比較して海馬においてより高い。このことはまた、3D6の免疫組織化学の結果とも相関する（下記の議論を参照のこと）。４月齢のマウスの皮質レベルと比較して、Ａβレベルは８月齢までに10倍、そして 12月齢で41倍に増加する（12月齢で660±380pモルＡβ/グラム組織）。海馬において観察されたＡβの対応する増加は、８ヶ月の値が４月齢の15倍であり、そして12月齢で106倍まで増加する（12月齢で4,040±1750pモルＡβ/グラム組織）ので、さらにより印象的である。12月齢で、ＡβはPDAPPマウスの海馬中のタンパク質の約１％を構成する。脳のＡβ濃度の劇的な上昇がアミロイド沈着によるか否かを調べるため、本発明者らは次いで、Ａβ測定に使用したマウスと同じマウスの反対の半球を用いて、Ａβ沈着を免疫組織化学的に可視化した。著しく、Ａβプラーク負荷（burden ）およびＡβレベルの平行した増加が存在する。これらの知見は、ELISAによって決定された脳のＡβ濃度の上昇が齢依存的アミロイドーシスによることを強く示す。３．トランスジェニックマウスの脳におけるＡβ_1-42の測定。トランスジェニックマウスの皮質におけるＡβ_1-42の濃度を、種々の齢で評価した。表６に示すように、トランスジェニックマウスの皮質におけるＡβ_1-42であるＡβの割合もまた、加齢とともに増加する。ELISAのデータは、Ａβ_1-42がトランスジェニックマウスにおいて優先的に沈着していること、およびmAb 3D6 の免疫染色によって検出される沈着が主にＡβ_1-42であることを示唆する。表６．トランスジェニックの脳の皮質におけるＡβ_1-42レベル。４．PDAPPトランスジェニックの脳におけるＡβ免疫染色。齢の群の平均Ａβ値を表すＡβ値を有するトランスジェニック動物を、3D6免疫染色のために用いた。Ａβ沈着の進行が、４、８、10、および12月齢の動物において観察される。４月齢で、トランスジェニックの脳は、小さくまばらな斑点状の沈着（直径20μm）を含んだ。これは、海馬、ならびに前頭皮質および帯状束皮質においては、希に観察されるのみであった。８月齢までに、これらの領域は、直径150μmほどの大きさのプラークを形成する多数のチオフラビンポジティブＡβ凝集物を含んだ。10月齢で、多数の大きなＡβ沈着が、前頭皮質および帯状束皮質、ならびに海馬の分子層中のいたるところに見出された。エントリナル皮質からの求心性の（afferents）パーフォラント（perforant）経路を受ける歯状回の外側の分子層は、明らかにＡβ沈着の輪郭を描いた。この一般的なパターンは、１年齢で、より大量のＡβ沈着によって、より顕著であった。Ａβ沈着の解剖学上の局在性は、アルツハイマー病において観察される局在性と著しく類似している。Ｃ．考察。Ａβアミロイドーシスは、アルツハイマー病の確立された診断基準であり（Mi rraら、Neurology 41:479-486(1991)）、そして罹患した被験体において、より高度な皮質領域ならびに脳の海馬形成において一貫して観察される。ＡβアミロイドーシスはADの病因における比較的早期の事象であり、続いて事象の複雑なカスケードを介してニューロンの機能不全および痴呆を導く（Mannら、Neurodegen eration 1:201-215(1992);Morrisら、Neurology 46:707-719(1996)）。APPのプロセシングの種々の経路が記載され（Schenkら、J．Med．Chem．38:4141-4154 (1995)をレビューのこと）、これには、APPの切断がＡβで生じる主要なαセクレターゼ経路（Eschら）、およびAPPの切断がＡβのＮ末端で生じるアミロイド生成（amyloidogenic）経路またはβセクレターゼ経路（Seubertら(1993)）が含まれる。APPのさらなる切断は、Ａβ形態（40位で終わるＡβ形態（Ａβ_1-40）または42位で終わるＡβ形態（Aβ_1-42）の構成的な産生を導く。PDAPPマウスの脳においてこれらの個々の経路から生じた特定のAPP産物を検出するELISAは、AP Pの差別的なプロセシングが、アミロイド形成および沈着の領域特異性または時間特異性に寄与するか否かの決定を可能にする。 PDAPPマウスの脳において観察されるＡβアミロイド沈着は、高度に齢特異的であり、そして領域特異的である。アミロイド沈着は、約７月齢で始まり、そして12月齢までに、アミロイド沈着は、海馬および皮質の吻状の（rostral）領域全体で非常に根深い。アミロイド沈着の齢依存性増加はELISAアッセイによって測定されるように、これらの脳の領域におけるＡβレベルの劇的な上昇とよく相関する。Ａβの増加は、７月齢までに測定可能であり、そして10ヶ月までに、海馬は2180pモル/gのＡβ（これは、細胞骨格タンパク質の濃度に等しく、そしてヒトAD脳の皮質において見出されるレベルに匹敵する（Gravinaら、J．Biol．Ch em．270:7013-7016(1995)））のように測定可能である。小脳（冒されていない脳の領域）におけるＡβレベルは、なお４pモル/gであり（４月齢でのレベルと比較して本質的に変化しない）、組織学的分析によって測定されるアミロイド沈着とまた相関する。これらの結果は、老齢のPDAPPマウスにおいて、脳のＡβレベルがアミロイド負荷を反映し、従って、脳のＡβレベルの直接的免疫アッセイ測定を用いてアミロイドプラーク負荷を減少させる化合物について試験し得ることを示す。 PDAPPマウス、ダウン症候群を患う個体、およびFADの特定の形態を患う個体において、Ａβの過剰産生は、Ａβ沈着においてのみでなく、続く神経病理において、ほぼ間違いなく加速因子である（Citronら、Mannら、Millerら、Archives o f Biochem．Biophys．301:41-52(1993)）。PDAPPマウスにおいて観察されるＡβ 測定と、ADの脳組織について報告されたものとの比較により、いくつかの著しい類似性が示される。例えば、PDAPPマウスにおいて、若齢マウス（２月齢）対老齢マウス（10月齢）からの海馬におけるＡβペプチドの相対的レベルは、ほぼ 100倍である。類似の知見が、ADの脳組織に対するコントロールの脳組織の比較において、Gravinaらによって記載された。PDAPPマウスにおける脳のＡβレベルの上昇は、６〜９月齢の間の齢でかなり顕著である。さらに、このタイムコースは、加速した様式で、ダウン症候群の脳組織（ここではアミロイド沈着は約30年齢で始まり、そして約60年齢まで実質的に増加する（Mann））において観察されるものに類似する。まとめると、上記の結果は測定可能なＡβの再現性のある増加がPDAPPマウスの脳組織において生じ、そしてこの増加がアミロイド沈着の重篤度と相関することを示す。これらの知見は、これらのマウスを用いて、薬理学的にＡβペプチドの産生を減少させるかまたはその沈着に影響を及ぼす薬剤または化合物を同定し得ることを示す。実施例９：PDAPPトランスジェニックマウスにおける行動の差異。アルツハイマー病は、認識欠損（記憶喪失、および記憶機能の障害を含む）により特徴づけられる。開示されるトランスジェニックマウスが類似の欠損を示すか否かを決定するために、トランストランスジェニック（TG）マウスおよび非トランスジェニック（nTG）マウスを、作用記憶および参照記憶を試験するために使用した３つのタイプの迷路装置（Ｙ迷路、放射状アーム迷路（RAM）、および水迷路）における課題正応答率（task performance）について評価した。試験したトランスジェニックマウスは、実施例６に記載したPDAPPマウスに由来する第５世代に相当する。Ｙ迷路および放射状アーム迷路を使用して、作用記憶の１つの機能である自発性変更（alternation）を評価した。Ｙ迷路課題（task）について、マウスをＹ迷路のステムに２回置き、各回とも、アームの１への選択侵入を可能にした。両方のアームへの侵入は、以前に侵入したアームの記憶を必要とする首尾良い変更であり、一方、両方の試行についての同じアームへの侵入は失敗である。偶然正応答率は50%変更であり、すなわち50%のマウスが変更する。放射状アーム迷路課題について、マウスを中心から放射線状にのびる複数のアームを有する迷路の中心に置く。下記の試験において、放射状の８つのアームの迷路を使用した。８つの侵入のみを可能にすることにより、侵入された異なるアームの数を正応答率の測定として、変更正応答率を測定する。異なるアーム侵入の数を、偶然により予測される異なるアーム侵入の数と比較し得る。この偶然は、5.25である（SpetchおよびWilkie、「A program that stimulates random cho ices in radial arm mazes and similar choice situations」Behavior Researc h Methods & Instrumentation 12:377-378（1980））。偶然を上回る正応答率（すなわち、5.25より高い）は、以前に侵入したアームの記憶を必要とする。以下に記載の試験について使用した水迷路は、浸水した台が置かれる水のプールからなる。この隠された台（HP）は、偶然（１回目の試行）によるかまたはタンクから見える位置の手がかりの記憶（その後の試行）によるかのいずれかにより、遊泳するマウスによって見出され得る。被験体マウスを、標準的手順に従って隠された台課題において訓練した。簡単には、マウスを、小さなプール（47cm の直径、20cmの台）で最初に予備訓練し、これによりマウスに、水中での進み方、台がゴールであること、他に逃げ道はないこと、およびプールの側面に沿って留まるマウスの本来の性質に抵抗しなければいけないことを見出すように教育した。次いで、より大きなプールかつより小さな台（71cmのプール、９cmの台）を用いて、隠された台課題において単一の台の位置を見出すようにマウスを訓練した。 HP課題の間、目に見える手がかりをプールの内側に置き（迷路内の手がかり；壁の最上部（これは、水位から38cmの高さであった）で３つの４分円に置かれた、黒い厚紙片（丸、プラス、または水平線））、そして種々の場所の手がかりをプールの外側に見えるようにした（迷路外の手がかり）。特徴づけのコーホート研究に対して評価したマウスを、安楽死前の１週間または２週間の間に、３日間にわたって上記の行動課題に対して試験した。それらのトランスジェニック状態は、試験者に知らせなかった。非トランスジェニック同腹子を比較のために使用した。毎朝、被験体マウスを、上記のようにＹ迷路およびRAMにおいて試験した（run）。次いで、それらを斜面（INP）試験に対する一般的な耐久力について試験した。このために、うね状のプラスチックで作られた 10cm幅の、上部を35度に持ち上げた滑走台にマウスをおいた。次いで、マウスが滑り落ちるまで角度を増加させ、そしてその角度を記録した。これを毎日３回繰り返した。３日間の平均スコアを、Ｙ迷路（０＝反復、１＝変更）、およびRAM （異なるアームの数、および終了時間、10分間の制限）、およびINP（９回の試行すべての平均）について、各マウスについて算定した。一般的な活動はまた、試験の１日目に対して評価した。各マウスをケージの中で観察し、そしてつまみ上げてそのままにした。手の中で冷静なままであったマウスを１とスコアし、活動および反応がだんだんと大きくなるにつれて４までスコアした。毎日の上述の試験に続いて、マウスを上記のように水迷路中で試験した。簡単には、マウスを小さなプール中で、マウスが水から逃れる唯一の手段として、大きな浸水した台に登るように訓練した。次いで、マウスに、４回の試行に６つのブロックを与え、それぞれ大きなプール中の小さな台の位置を学習させた。分析について、各ブロック内の４つの全ての試行を平均した。例外は最初の隠された台ブロックであり、それについて最後の３つの試行のみを平均した。最初の試行は別々に分析した。なぜなら、台の位置が知られ得ず、従って空間学習に関連しない唯一の試行であるからである。従って、非空間因子（例えば、動機および水泳速度）についてのコントロールとして使用する。ブロック間の正応答率の効果を、隠された台課題に対する反復測定として分析した。分散（ANOVA）計算の標準的解析を使用して結果の有意性を評価した。 RAMにおける結果により、全ての年齢にわたってTGはnTGよりも有意に悪く行ったことが示される（グループ効果：P＝0.00006）。終了の時間はまた、TGマウスとnTGマウスとの間で有意に異なった（グループ効果：P＝0.005）。終了時間と選択されたアームの数との間の相関は小さかった（各グループにおいて、R＝-0. 15、p＝0.245）。このことは、RAMにおける首尾一貫した障害は、TGマウスにより行われた課題を完了するために増加された時間により説明されないことを示唆する。Ｙ迷路における結果はまた、TGマウスおよびnTGマウスについて有意に異なった（グループ効果：p＝0.011）。非トランスジェニックマウスに対して行った確認研究により、Ｙ迷路はRAMよりも感度のよい測定ではないことが示される。耐久力（INP）および活動の測定は、TGマウスとnTGマウスとの間の差異を示さない。これらは、大きな差異のみが検出可能な、非常に大まかな測定であると考えられる。しかし、経時的に全てのマウスについて活動スコアが減少した（年齢効果：P＝0.070）。TGは、主に雌TGマウスにおいて、コントロールよりも８%軽く、体重において差異があった（グループ効果：P＝0.0003）。しかしこれは、T GマウスとnTGマウスとの間に、耐久力（上述を参照のこと）または水泳速度（以下を参照のこと）におけるあらゆる差異が存在しないことにより示されるように、結果に対する効果を有さないようである。隠された台課題の結果（これは本実施例において参照記憶の試験と考慮される）は、TGマウスおよびnTGマウスとの間の首尾一貫した差異を示す。ANOVAにより、トランスジェニック状態の効果（グループ効果：P＝0.00016）および試行ブロックの効果（ブロック効果：p＜0.00001）は有意であることが示される。正応答率に対するトランスジェニック状態の効果は、全ての試行ブロックおよび齢にわたるTGマウスによるより遅い正応答率により説明される。試行１の分析により、トランスジェニック状態の効果（グループ効果：p＝0.018）が示され、このことは学習が生じる前の正応答率における差異を示唆する。しかし、共確率変数（co variate）として試行１を伴う共分散解析はなお、TGマウスにおける有意な障害を示した（p＝0.00051）。 TGマウスとnTGマウスとの間のいくつかの物理的差異は、認識の差異よりも水迷路課題において見られる正応答率の差異のいくつかを担い得る可能性があった。しかし、耐久力または活動における有意な差異は観察されなかった（上述を参照のこと）。考えられる別の可能性は、正応答率に対する水泳速度の効果であった。なぜなら、等価な認識の能力を有するより遅い遊泳個体（slower swimmer）は、台に到達するのにより長い時間がかかったからである。このことを試験するために、ビデオ追跡を隠された台課題において使用し、台に到達するまで移動した距離（認識の能力に関連するマウスによりなされた探求の量の測定）、水泳速度（認識の能力に関連しない物理的能力の測定）、および台を見出すのに必要な時間の量（移動した距離および水泳速度の両方の測定値の組合せ）を測定した。これは、ブロック当たり３回の試行を用い、および予備訓練をしないで、上述で報告したよりも加齢したマウスおよび若いマウスにおいて行った。台を見出すために必要とされる時間は、TGマウスはより長い時間がかかり、TGマウスおよびnT Gマウスにおいて有意に異なった（グループ効果：p＜0.0005）。しかし、水泳速度はTGマウスとnTGマウスとの間で有意に異ならなかった（グループ効果：p＝0. 879）。従って、台を見出すために必要とされる時間における差異は、TGマウスとnTGマウスとの間の認識の差異に起因するようである。このことは、台を見出すために移動した距離の測定により確認される。TGマウスは、nTGマウスよりも台に到達する前に有意に多く移動した（グループ効果：p<0.0005）。これらの結果は、水迷路課題において台に到達する時間においてTGマウスとnTGマウスとの間に見出される差異は、認識の能力における差異によることを示唆している。 nTGマウスがTGマウスよりも台の位置のより良好な記憶を保持するか否かを試験するために、隠された台訓練の直後に、台を除去したプローブ試行を行った。ビデオ追跡を使用して、台のない位置の横断に対して、マウスによりなされた以前の台の位置の横断の数を測定した。TGマウスとnTGマウスとの相対的な横断の間で見られる有意な差異が存在した（グループ効果：p＝0.006）。これは、nTG マウスが、TGマウスよりも良好に以前の台の位置を覚えているという証拠である。台に到達するために必要とされる時間におけるTGマウスとnTGマウスとの間に観察される差異は、手がかりの知覚における差異または動機の差異により影響され得る可能性があった。このことを試験するために、TGマウスおよびnTGマウスを水迷路における見える台課題に供した。これらの課題のために、台をプール中に置き、水の上に見えるようにした。３つの異なる台（表面上25mmの黒い台（最も見える）、表面上25mmの灰色の台、および表面上5mmの黒い台（両方とも見えにくい））を試験した。結果により、TGマウスとnTGマウスとの間で最も見える台を見出すための時間における差異はないことが示される（グループ効果：p＝0 .403）。見えにくい台を使用した場合、TGマウスにおける正応答率の大きな減少はなかった。このことは、TGマウスの視力はnTGマウスと同じくらい良好であることを示唆する。これらの結果は、知覚の差異および動機の差異は、上記の水迷路課題における台に到達するための時間に影響しないことを示す。 TGマウスとnTGマウスとの間の正応答率の差異は、４〜８月齢のマウスにおける（水迷路については、２〜12ヶ月）、RAM、Ｙ迷路、および水迷路の認識課題に対して示された。これらの差異の全ては、グループとしてのトランスジェニックマウスにおける認識障害を示し、これと首尾一貫する。種々の課題を組み合わせて、作用記憶および参照記憶を試験した。この両方はアルツハイマー罹病者において観察される認識障害に関係する。アルツハイマー病の試験のためのトランスジェニック動物モデルの作製および試験の改変および変形が、前記の詳細な説明から当業者には明らかである。このような改変および変形は以下の請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スーバート，ピーターエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94080, サウスサンフランシスコ，ノースウッドドライブ 222 【要約の続き】の行動変化に対するそれらの効果により測定されるような、アルツハイマー病の病理学的経過を変化させる化合物についてのスクリーニングのために使用される。

Claims

【特許請求の範囲】１．非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、該トランスジェニック哺乳動物はゲノムに安定に組み込まれた核酸構築物を有し、該構築物は哺乳動物細胞における該構築物の発現のためのプロモーター、およびＡβ−含有タンパク質をコードする領域を含み、該プロモーターは該領域に作動可能に連結され、ここで、該領域はＡβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡを含み、該Ａβ− 含有タンパク質は、以下のもの：ＡＰＰ７７０、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５、およびアミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するＡＰＰ６９５、ここで、該Ａβ−含有タンパク質は、ヒトＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４を含み、ここで、該プロモーターは該構築物の発現を以下のように仲介し：２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも３０ナノグラムのレベルでＡβ_tot が発現される、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも８．５ナノグラムのレベルでＡβ_1-42が発現される、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも１５０ピコモルのレベルでＡＰＰおよびＡＰＰ αの合計が発現される、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも４０ピコモルのレベルでＡＰＰβが発現される、および／または、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織において該トランスジェニック哺乳動物の内因性ＡＰＰをコードするｍＲＮＡの場合の少なくとも２倍のレベルでＡβ−含有タンパク質をコードするｍＲＮＡが発現される、からなる群から選択されるタンパク質のすべてまたは連続する部分からなる、非ヒトトランスジェニック哺乳動物。２．前記Ａβ−含有タンパク質が、以下からなる群から選択される、請求項１に記載の哺乳動物：ＡＰＰ７７０；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ７７０；ＡＰＰ７５１；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ７５１；ＡＰＰ６９５；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ６９５；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０からなるタンパク質；ＡＰＰのアミノ酸６７０から７７０からなるタンパク質；ＡＰＰのアミノ酸６７２から７７０からなるタンパク質；およびＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４からなるタンパク質。３．前記Ａβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡが、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドであり、ここで該ｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドは少なくとも１つのＡＰＰイントロン配列を含み、該イントロン配列はスプライシングに十分である、請求項２に記載の哺乳動物。４．前記プロモーターが、ヒト血小板由来成長因子β鎖遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載の哺乳動物。５．前記領域がさらに、第２のタンパク質をコードするＤＮＡを含み、ここで前記Ａβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡおよび該第２のタンパク質をコードするＤＮＡが、該Ａβ−含有タンパク質と該第２のタンパク質との融合体を含むＡβ−含有融合タンパク質を該領域がコードするように作動可能に連結される、請求項１に記載の哺乳動物。６．前記第２のタンパク質が、シグナルペプチドである、請求項５に記載の哺乳動物。７．胚への前記構築物の導入、代理母への該胚の挿入、および該胚を出産まで発生させることによって作製される、請求項１に記載の哺乳動物。８．前記哺乳動物が齧歯類である、請求項１に記載の哺乳動物。９．異なる構築物を発現するトランスジェニック動物を交尾させることによって作製される、請求項１に記載の哺乳動物。１０．アミノ酸７１７をコードするコドンが、以下からなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異している、請求項１に記載の哺乳動物：Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ。１１．アミノ酸７１７をコードするコドンが、Ｐｈｅをコードするように変異している、請求項１０に記載の哺乳動物。１２．アミノ酸６７０をコードするコドンが、ＡｓｎおよびＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異しているか、またはアミノ酸６７０をコードするコドンが欠失している、および／または、アミノ酸６７１をコードするコドンが、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、およびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異しているか、またはアミノ酸６７１をコードするコドンが欠失している、請求項１に記載の哺乳動物。１３．アミノ酸６７０をコードするコドンが、Ａｓｎをコードするように変異している、および／または、アミノ酸６７１をコードするコドンが、ＬｅｕまたはＴｙｒをコードするように変異している、請求項１２に記載の哺乳動物。１４．前記構築物が、少なくとも１つの有効量のイントロンをさらに含み、ここで、該少なくとも１つの有効量のイントロンがヒトアミロイド前駆体タンパク質をコードする構築物の領域内に位置する、請求項１に記載の哺乳動物。１５．前記イントロンがＡＰＰ遺伝子イントロンである、請求項１４に記載の哺乳動物。１６．前記プロモーターが、前記構築物の発現を以下のように仲介する：２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも３０ナノグラムのレベルでＡβ_totが発現される、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも８．５ナノグラムのレベルでＡβ_1- ₄₂ が発現される、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも１５０ピコモルのレベルでＡＰＰおよびＡＰＰαの合計が発現される、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも４０ピコモルのレベルでＡＰＰβが発現される、および／または、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織において前記トランスジェニック哺乳動物の内因性ＡＰＰをコードするｍＲＮＡの場合の少なくとも２倍のレベルでＡβ−含有タンパク質をコードするｍＲＮＡが発現される、請求項１に記載の哺乳動物。１７．前記哺乳動物の脳組織に、Congo Redで染色され得るアミロイドプラークが存在する、請求項１に記載の哺乳動物。１８．Ａβ−含有タンパク質の発現またはプロセシングに対する影響について化合物を試験するための方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ）被験化合物を非ヒトトランスジェニック哺乳動物または該トランスジェニック哺乳動物由来の哺乳動物細胞へ投与する工程、ここで該トランスジェニック哺乳動物はゲノムに安定に組み込まれた核酸構築物を有し、該構築物は哺乳動物細胞における該構築物の発現のためのプロモーター、およびＡβ−含有タンパク質をコードする領域を含み、該プロモーターは該領域に作動可能に連結され、ここで、該領域はＡβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡを含み、該Ａβ− 含有タンパク質は、以下からなる群から選択されるタンパク質のすべてまたは連続する部分からなり：ＡＰＰ７７０、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５、およびアミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２および７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸において変異を有するＡＰＰ６９５、ここで、該Ａβ−含有タンパク質は、ヒトＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４を含み、ここで、該プロモーターは該構築物の発現を以下のように仲介し：２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも３０ナノグラムのレベルでＡβ_tot が発現される、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも８．５ナノグラムのレベルでＡβ_1-42が発現される、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも１５０ピコモルのレベルでＡＰＰおよびＡＰＰ αの合計が発現される、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織１グラム当たり少なくとも４０ピコモルのレベルでＡＰＰβが発現される、および／または、２〜４月齢の該哺乳動物の脳組織において該トランスジェニック哺乳動物の内因性ＡＰＰをコードするｍＲＮＡの場合の少なくとも２倍のレベルでＡβ−含有タンパク質をコードするｍＲＮＡが発現される工程；および以下のいずれかｂ１）該トランスジェニック哺乳動物、または該トランスジェニック哺乳動物由来の哺乳動物細胞により産生されるＡＰＰマーカーまたはＡβマーカーの量を測定し、そして該測定された量を、化合物が投与されなかったトランスジェニック哺乳動物、またはそれ由来の哺乳動物細胞によって産生されるＡＰＰマーカーまたはＡβマーカーの量と比較する工程、ここで、該ＡＰＰマーカーまたはＡβマーカーの量における変化は、ＡＰＰの発現またはプロセシングが改変されたことを示す工程；またはｂ２）該トランスジェニック動物におけるＡＰＰマーカーまたはＡβマーカーの組織病理を決定し、そして該組織病理を、該化合物が投与されなかったトランスジェニック哺乳動物におけるＡＰＰマーカーまたはＡβマーカーの組織病理と比較する工程、ここで、該ＡＰＰマーカーまたはＡβマーカーの組織病理における変化は、ＡＰＰの発現またはプロセシングが改変されたことを示す工程。１９．前記Ａβ−含有タンパク質が、以下からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法：ＡＰＰ７７０；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ７７０；ＡＰＰ７５１；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ７５１；ＡＰＰ６９５；アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２、７１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードするコドンにおいて変異を有するＡＰＰ６９５；ＡＰＰのアミノ酸６４６から７７０からなるタンパク質；ＡＰＰのアミノ酸６７０から７７０からなるタンパク質；ＡＰＰのアミノ酸６７２から７７０からなるタンパク質；およびＡＰＰのアミノ酸６７２から７１４からなるタンパク質。２０．前記Ａβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡが、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドであり、ここで該ｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドは少なくとも１つのＡＰＰイントロン配列を含み、該イントロン配列はスプライシングに十分である、請求項１９に記載の方法。２１．前記プロモーターが、ヒト血小板由来成長因子β鎖遺伝子のプロモーターである、請求項１８に記載の方法。２２．前記領域がさらに、第２のタンパク質をコードするＤＮＡを含み、ここで該領域が前記Ａβ−含有タンパク質と該第２のタンパク質との融合体を含むＡβ −含有融合タンパク質をコードするように、該Ａβ−含有タンパク質をコードするＤＮＡおよび該第２のタンパク質をコードするＤＮＡが作動可能に連結される、請求項１８に記載の方法。２３．前記第２のタンパク質が、シグナルペプチドである、請求項２２に記載の方法。２４．前記Ａβマーカーが、Aβ_tot、Aβ_1-42、Aβ_1-40、Aβ_N3(pE)、Aβ_X-42、 Aβ_X-40、Aβ_insoluble、Aβ_solubleからなる群から選択され、前記ＡＰＰマーカーが、全長ＡＰＰ、ＡＰＰα、ＡＰＰβ、ＦＬＡＰＰ＋ＡＰＰα、ＡＰＰの最後の１００アミノ酸、およびＡＰＰの最後の５７〜６０アミノ酸からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。２５．前記ＡＰＰマーカーがＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０からなる群から選択され、そして前記組織病理における変化が、プラークおよび神経突起組織に位置するＡＰＰマーカーの量の減少である、請求項１８に記載の方法。２６．前記哺乳動物が齧歯類である、請求項１８に記載の方法。２７．アミノ酸７１７をコードするコドンが、以下からなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異している、請求項１８に記載の方法：Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ。２８．アミノ酸７１７をコードするコドンが、Ｐｈｅをコードするように変異している、請求項２７に記載の方法。２９．アミノ酸６７０をコードするコドンが、ＡｓｎおよびＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異しているか、またはアミノ酸６７０をコードするコドンが欠失している、および／または、アミノ酸６７１をコードするコドンが、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、およびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異しているか、またはアミノ酸６７１をコードするコドンが欠失している、請求項１８に記載の方法。３０．アミノ酸６７０をコードするコドンが、Ａｓｎをコードするように変異している、および／または、アミノ酸６７１をコードするコドンが、ＬｅｕまたはＴｙｒをコードするように変異している、請求項２９に記載の方法。３１．前記構築物が、少なくとも１つの有効量のイントロンをさらに含み、ここで、該少なくとも１つの有効量のイントロンがＡβ−含有タンパク質をコードする構築物の領域内に位置する、請求項１８に記載の方法。３２．前記イントロンがＡＰＰ遺伝子イントロンである、請求項３１に記載の方法。３３．前記プロモーターが、前記構築物の発現を以下のように仲介する：２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも３０ナノグラムのレベルでＡβ_totが発現される、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも８．５ナノグラムのレベルでＡβ_1- ₄₂ が発現される、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも１５０ピコモルのレベルでＡＰＰおよびＡＰＰαの合計が発現される、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織１グラム当たり少なくとも４０ピコモルのレベルでＡＰＰβが発現される、および／または、２〜４月齢の前記哺乳動物の海馬または皮質の脳組織において前記トランスジェニック哺乳動物の内因性ＡＰＰをコードするｍＲＮＡの場合の少なくとも２倍のレベルでＡβ−含有タンパク質をコードするｍＲＮＡが発現される、請求項１８に記載の方法。３４．前記哺乳動物の脳組織に、Congo Redで染色され得るアミロイドプラークが存在する、請求項１８に記載の方法。