JP2000516087A - アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用 - Google Patents

アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用

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Abstract

(57)【要約】 ２つのヒトプレセニリン遺伝子ＰＳ−１およびＰＳ−２の同定、単離、配列決定および特徴付けを開示する。これらの変異は家族性アルツハイマー病を導く。マウス、C.elegansおよびD.melanogasterにおけるプレセニリン遺伝子ホモログもまた開示する。プレセニリンを含むかまたはこれに由来するタンパク質およびその核酸の、アルツハイマー病のスクリーニングおよび診断、アルツハイマー病の処置のための治療薬の同定および開発、アルツハイマー病のモデルとして有用な細胞株およびトランスジェニック動物の作製における使用。さらに、プレセニリンタンパク質、その機能的フラグメントもしくは改変体、またはそのムテインに結合するか、またはそれらの活性を調節する物質を同定するための方法、および、プレセニリン相互作用タンパク質と、プレセニリンタンパク質、その機能的フラグメントもしくは改変体、またはそのムテインとの相互作用に影響する物質を同定するための方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用発明の分野 本発明は、一般的にアルツハイマー病に関連する神経学的および生理学的機能 障害に関する。より詳細には、本発明はアルツハイマー病に関連する遺伝子の同 定、単離、およびクローニング、ならびにそれらの転写物、遺伝子産物、関連す る配列情報、および関連遺伝子に関する。本発明はまた、これらの遺伝子の正常 および変異の対立遺伝子の保因者を検出および診断する方法、アルツハイマー病 を検出および診断する方法、アルツハイマーの遺伝子およびタンパク質と関連ま たは相互作用する遺伝子およびタンパク質を同定する方法、アルツハイマー病の 潜在的治療法をスクリーニングする方法、アルツハイマー病の処置法、ならびに アルツハイマー病に潜在的に有用な治療法をスクリーニングおよび評価するため に有用な細胞株および動物モデル、に関する。発明の背景 本発明は、一般的にアルツハイマー病に関連する神経学的および生理学的機能 障害に関する。より詳細には、本発明はアルツハイマー病に関連する遺伝子の同 定、単離、およびクローニング、ならびにそれらの転写物、遺伝子産物、関連す る配列情報、および関連遺伝子に関する。本発明はまた、これらの遺伝子の正常 および変異の対立遺伝子の保因者を検出および診断する方法、アルツハイマー病 を検出および診断する方法、アルツハイマーの遺伝子およびタンパク質と関連ま たは相互作用する遺伝子およびタンパク質を同定する方法、アルツハイマー病の 潜在的治療法をスクリーニングする方法、アルツハイマー病の処置法、ならびに アルツハイマー病に潜在的に有用な治療法をスクリーニングおよび評価するため に有用な細胞株および動物モデル、に関する。 アルツハイマー病（AD）はヒトの中枢神経系の変性障害であり、中年から老年 期における進行性の記憶障害ならびに認識力および知能の低下によって特徴付け られる（Katzman(1986)N.Eng.J.Med. 314:964-973）。この病気は一群の神経病 理学的な特徴を伴い、その中で主要なものは、細胞外アミロイドまたは老人斑の 存在および神経細胞の神経原線維の変性である。この病気の病因は複雑であるが 、特定の家族においては常染色体優性の形質として遺伝するようにみえるものも ある。しかしながら、これらの遺伝型のADにおいても、少なくとも３種の異なる 遺伝子（この病気に遺伝感受性を与える）が存在する（St.George-Hyslopら(199 0)Nature 347:194-197）。アポリポタンパク質Ｅ（ApoE）遺伝子のε４(C112R) 対立遺伝子多型は、一生のうち遅い時期に発症する症例のうちのかなりの割合の 症例において、ADと関連した（Saundersら(1993)Neurology 43:1467-1472；Stri ttmatterら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci ．(USA)90:1977-1981）。同様に、65歳前 に発症する家族性の症例の非常にわずかな割合が、β-アミロイド前駆体タンパ ク質（APP）遺伝子における変異に関連した（Chartier-Harlinら(1991)Nature 3 53:844-846；Goateら(1991)Nature 349:704-706；Murrellら(1991)Science 254: 97-99；Karlinskyら(1992)Neurology 42:1445-1453；Mullanら(1992)Nature Gen etics 1:345-347）。早期発症ADの症例のより多くの割合と関連する三番目の遺 伝子座(AD3)が、最近、染色体14q24.3にマッピングされた（Schellenbergら(199 2)Science 258:668-670；St.George-Hyslopら(1992)Nature Genetics 2:330-334 ；Van Broeckhovenら(1992)Nature Genetics 2:335-339）。 染色体14q領域は、AD3と関連する変異部位の候補遺伝子と考えられ得るいくつ かの遺伝子（例えば、cFOS、α-1-抗キモトリプシン、およびカテプシンＧ）を 有するが、これらの候補遺伝子のほとんどが、AD3領域外のそれらの物理的位置 および/またはそれらのそれぞれのオープンリーディングフレーム中に変異が存 在しないことに基づいて除外された（Schellenbergら(1992)Science 258:668-67 0；Van Broeckhovenら(1992)Nature Genetics 2:335-339；Rogaevら(1993)Neuro logy 43:2275-2279；Wongら(1993)Neurosci.Lett. 152:96−98）。 アルツハイマー病の処置およびその診断に関して、いくつもの開発および商業 化の傾向または計画があった。公開された国際特許出願第WO 94 23049号には、 高分子量YAC DNAの、特定のマウス細胞へのトランスフェクションが記載されて いる。この方法は、大きな遺伝子複合体を解析するために用いられ得る。例えば 、 トランスジェニックマウスは、増大したAPP遺伝子量を有し得る。これは、ダウ ン症候群に蔓延するトリソミー状態を模擬し、そしてアルツハイマー病の個体に 蔓延するβ-アミロイド症に似た、β-アミロイド症の動物モデルを産生する。公 開された国際出願WO 94 00569には、大きなトランスジーン（例えばヒトAPP遺伝 子を含むトランスジーン）を有するトランスジェニック非ヒト動物が記載されて いる。そのような動物モデルは、アルツハイマー病のようなヒトの遺伝病の、有 用なモデルを提供し得る。 カナダ国特許出願第2096911号には、APP-切断プロテアーゼをコードする核酸 （アルツハイマー病およびダウン症候群に関連する）が記載されている。染色体 19から単離された遺伝子情報は、アルツハイマー病を診断するために使用され得 る。カナダ国特許出願第2071105号は、遺伝性または後天性のアルツハイマー病 の、YACヌクレオチド配列を用いた検出および処置について記載している。YACは 、番号23CB10、2BCA12、および26FF3で同定される。 米国特許第5,297,562号には、染色体21のトリソミーに関連するアルツハイマ ー病の検出が記載されている。処置は、染色体21トリソミーの増殖を減少させる 方法を包含する。カナダ国特許出願第2054302号には、モノクローナル抗体が記 載され、これは、染色体21にコードされるヒト脳細胞核タンパク質を認識し、そ してアルツハイマー病またはダウン症候群による発現の変化を検出するために用 いられる。そのモノクローナル抗体は、ヒト染色体21にコードされるタンパク質 に特異的であり、そしてヒト脳組織の大きな錐体細胞中に見出される。発明の要旨 本発明は、一部、２つの哺乳動物の遺伝子の、同定、単離、クローニングおよ び配列決定に基づいている。これらの遺伝子は、プレセニリン（presenilin）- １（PS1）およびプレセニリン-２（PS2）と命名されている。これら２つの遺伝 子、およびそれらの対応するタンパク質産物は、高度に保存された遺伝子（プレ セニリン）のファミリーのメンバーであり、それらは他の哺乳動物種（例えば、 マウス、ラット）にホモログまたはオーソログを、また無脊椎動物種（例えば、C ．elegans 、D ．melanogaster）にオーソログを有する。これらの遺伝子の変異 は、ヒトにおける家族性アルツハイマー病の形態の発生に関係し、そして同様の 他の障害（例えば、他の認識的、知能的、神経学的、または心理学的障害（例え ば、脳溢血、精神分裂症、鬱病、精神遅滞および癲癇など））の原因でもあり得 る。本開示は、ヒトPS1(hPS1)およびヒトPS2(hPS2)遺伝子、マウスPS1ホモログ （mPS1）、ならびにC ．elegans（sel-12、SPE-4）およびD ．melanogaster（DmPS ）由来の関連する遺伝子のゲノムおよびcDNAヌクレオチド配列を提供する。本開 示はまた、これらの遺伝子にコードされるプレセニリンタンパク質の予想アミノ 酸配列、およびプレセニリンの構造の特徴付け（推定の機能的ドメインおよび抗 原決定基を含む）を提供する。ヒトのアルツハイマー病（AD）の原因であるプレ セニリン中の変異の多くもまた開示され、そしてそのタンパク質の機能的ドメイ ンに関連づけられている。 従って、一連の実施様態において、本発明は、プレセニリン遺伝子を含むかま たはそれ由来のヌクレオチド配列を含む単離された核酸、および/またはプレセ ニリンタンパク質を含むかまたはそれ由来のポリペプチドをコードする単離され た核酸を提供する。本発明のプレセニリン配列は、特定の開示された配列、これ らの配列のスプライス変異体、これらの配列の対立遺伝子変異体、同義配列、お よびこれらの配列の相同またはオーソロガス変異体を包含する。従って、例えば 、本発明は、hPS1遺伝子、hPS2遺伝子、mPS1遺伝子およびDmPS遺伝子由来のゲノ ムおよびcDNA配列を提供する。本発明はまた、対立遺伝子変異体および相同また はオーソロガス配列を、このような変異体が通常得られ得る方法を提供すること によって、提供する。本発明はまた、プレセニリンの変異または病気誘因変異体 を、多くの特異的変異配列を開示することによって、そして、他のこのような変 異体を通常得ることができる方法を提供することによって、特に提供する。本発 明の核酸が、種々の診断、治療、および組み換えの適用に使用され得るので、プ レセニリン配列の種々のサブセットおよびプレセニリン配列の異種配列との組合 せもまた提供される。例えば、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションスクリ ーニングまたはPCR増幅技術における使用のためには、センス配列およびアンチ センス配列、正常配列および変異配列、ならびにイントロン配列、エキソン配列 および非翻訳配列を含む、プレセニリン配列のサブセットが提供される。このよ うな 配列は、本明細書中で開示されるか、さもなければ実施可能とされる配列由来の 少数の連続するヌクレオチドを含み得るが、好ましくは、プレセニリン配列由来 の少なくとも８〜10個の、より好ましくは９〜25個の連続するヌクレオチドを含 む。他の好ましいプレセニリン配列のサブセットは、プレセニリンタンパク質の 機能的ドメインまたは抗原決定基の１つ以上をコードする配列を含み、そして特 に、正常（野生型）配列または変異配列のいずれかを含み得る。本発明はまた、 完全またはサブセットのいずれかのプレセニリン配列が、外因性の配列と作動可 能に連結され、クローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、およびト ランスジェニック構築物などを形成する種々の核酸構築物を提供する。従って、 本発明の別の局面によれば、哺乳動物または無脊椎動物組織細胞を形質転換して 、正常または変異プレセニリン配列を細胞中で発現する組換えベクターが提供さ れる。 別の一連の実施形態において、本発明は、本発明の核酸の１つでトランスフェ クトされたか、または形質転換された宿主細胞を提供する。細胞は、単に本発明 の核酸構築物を増殖する目的のために形質転換され得るか、またはプレセニリン 配列を発現するために形質転換され得る。本発明の形質転換された細胞は、タン パク質および/または正常または変異プレセニリン発現に影響を与える、正常ま たは変異プレセニリンタンパク質と相互作用する、および/または正常または変 異タンパク質の機能または効果を調節する他の化合物を同定するアッセイにおい て使用され得る。あるいは、本発明の形質転換された細胞は、プレセニリンタン パク質、融合タンパク質、機能的ドメイン、抗原決定基、および/または抗体を 産生するアッセイにおいて使用され得る。形質転換された細胞はまた、ヒトを含 む宿主に、治療または他の理由で移植され得る。好ましい宿主細胞は、神経、線 維芽細胞、骨髄、脾臓、器官型のまたは混成の細胞培養物由来の哺乳動物細胞、 ならびに細菌、酵母、線虫、昆虫および他の無脊椎動物細胞を包含する。以下に 記載される使用のために、好ましい細胞はまた、胚幹細胞、接合、配偶子および 生殖系列細胞を包含する。 別の一連の実施様態において、本発明は、ADおよび、プレセニリン遺伝子の変 異に関連する他の病気または障害についての、トランスジェニック動物モデルを 提供する。動物は、本質的に、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサ ギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびヒトではない霊長類を含む任意の 哺乳動物であり得る。さらに、線虫および昆虫を含む無脊椎動物モデルは、特定 の適用に使用され得る。動物モデルは、マイクロインジェクション、トランスフ ェクションを含む標準的な遺伝子組換え法によって、または胚幹細胞、接合子、 配偶子、および生殖系列細胞と、ゲノムもしくはcDNAフラグメントを含むベクタ ー、ミニ遺伝子、相同組換えベクター、およびウイルス挿入ベクターなどとの他 の形態の形質転換によって産生される。適切なベクターは、ワクシニアウイルス 、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、リポソーム輸送体、 神経親和性ウイルス、および単純ヘルペスウイルスを含む。動物モデルは、正常 および変異の配列、イントロン、エキソン、および非翻訳の配列を含むプレセニ リンを含むか、またはそれ由来の遺伝子組換え配列、および機能的ドメインのよ うなプレセニリンのサブセットをコードする配列を含み得る。提供される動物モ デルの主要なタイプは、以下を包含する：（１）正常ヒトプレセニリン遺伝子が 、動物のゲノムに、外因性または内因性プロモーターエレメントいずれかの調節 下で、付加的な遺伝子として、およびミニ遺伝子または大きなゲノムフラグメン トのいずれかとして、組換え的に導入された動物；正常ヒトプレセニリン遺伝子 が、動物の相同プレセニリン遺伝子の１つまたは両方のコピーと、相同組換えま たは遺伝子標的化によって、組換え的に置換された動物；および/または動物の 相同プレセニリン遺伝子の１つの１つまたは両方のコピーが、相同組換えまたは 遺伝子標的化によりヒトホモログをコードする配列を部分的に置換することによ って、組換え的に「ヒト化」された動物。（２）変異ヒトプレセニリン遺伝子が 、動物のゲノムに、外因性または内因性プロモーターエレメントのいずれかの調 節下で、付加的な遺伝子として、およびミニ遺伝子または大きなゲノムフラグメ ントのいずれかとして、組換え的に導入された動物；変異ヒトプレセニリン遺伝 子が、動物の相同プレセニリン遺伝子の１つまたは両方のコピーと、相同組換え または遺伝子標的化によって、組換え的に置換された動物；および/または動物 の相同プレセニリン遺伝子の１つの１つまたは両方のコピーが、相同組換えまた は遺伝子標的化により変異ヒトホモログをコードする配列を部分的に置換するこ とによっ て、組換え的に「ヒト化」された動物。（３）その動物のプレセニリン遺伝子の １つの変異バージョンが、動物のゲノムに、外因性または内因性プロモーターエ レメントのいずれかの調節下で、付加的な遺伝子として、およびミニ遺伝子また は大きなゲノムフラグメントのいずれかとして、組換え的に導入された動物；お よび/または、その動物のプレセニリン遺伝子の１つの変異バージョンが、動物 の相同プレセニリン遺伝子の１つまたは両方のコピーと、相同組換えまたは遺伝 子標的化によって、組換え的に置換された動物。（４）動物のプレセニリン遺伝 子の１つの１つまたは両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子標的化によって 部分的にまたは完全に欠失した、または外因性の配列の相同組換えまたは遺伝子 標的化による挿入または置換によって不活化された「ノックアウト」動物。好ま しい実施様態において、ADのためのトランスジェニックマウスモデルは、正常ヒ トPS1またはPS2タンパク質、変異ヒトもしくはマウスPS1またはPS2タンパク質、 あるいは相同組換えまたは遺伝子標的化によって作製されたヒト化正常もしくは 変異マウスPS1またはPS2タンパク質をコードするトランスジーンを有する。 別の一連の実施様態において、本発明は、実質的に純粋なタンパク質の調製物 （プレセニリンタンパク質を含むか、またはそれ由来のポリペプチドを含む）を 提供する。本発明のプレセニリンタンパク質配列は、特定の開示された配列、オ ルタナティブmRNAスプライシングから得られるこれらの配列の変異体、これらの 配列の対立遺伝子変異体、これらの配列のムテイン、およびこれらの配列の相同 またはオーソロガス変異体を含む。従って、例えば、本発明は、hPS1タンパク質 、hPS2タンパク質、mPS1タンパク質、およびDmPSタンパク質由来のアミノ酸配列 を提供する。本発明はまた、対立遺伝子変異体および相同またはオーソロガスタ ンパク質を、このような変異体が通常得られ得る方法を提供することによって、 提供する。本発明はまた、プレセニリンの変異または病気誘因変異体を、多くの 特異的変異配列を開示することによって、そして他のこのような変異体を通常得 ることができる方法を提供することによって、特に提供する。本発明のタンパク 質は、種々の診断、治療および組換え適用に使用され得るので、プレセニリンタ ンパク質配列の種々のサブセットおよびプレセニリンタンパク質配列と異種配列 との組合せもまた提供される。例えば、免疫原としての使用または結合アッセイ に おいて、プレセニリンタンパク質配列のサブセットが、正常配列および変異配列 の両方を含めて、提供される。このようなタンパク質配列は、本明細書中で開示 されるか、さもなければ実施可能とされる配列由来の少数の連続するアミノ酸残 基を含み得るが、好ましくは、プレセニリン配列由来の少なくとも４〜８個、そ して好ましくは少なくとも９〜15個の連続するアミノ酸残基を含む。他の好まし いプレセニリンタンパク質配列のサブセットは、プレセニリンタンパク質の機能 的ドメインまたは抗原決定基の１つ以上に対応する配列を含み、そして特に、正 常（野生型）配列または変異配列のいずれかを含み得る。本発明はまた、完全か またはサブセットのいずれかのプレセニリン配列が、外因性配列と結合し、融合 タンパク質などを形成する種々のタンパク質構築物を提供する。これらの実施様 態に従って、本発明はまた、プレセニリンを含むかまたはそれ由来の上記すべて のタンパク質を産生する方法を提供する。 別の一連の実施様態において、本発明はポリクローナル抗体およびモノクロー ナル抗体の産生および使用を提供する。それらの抗体は、プレセニリンまたはプ レセニリンの特定の抗原決定基に選択的に結合する、Fabフラグメント、F(ab')2 、および単鎖抗体フラグメントを包含する抗体フラグメントを包含する。この抗 体はマウス、ウサギ、ヤギ、または他の適切な動物中で惹起され得るか、または ハイブリドーマ細胞株のような培養細胞中で組換え的に産生され得る。好ましく は、抗体は、プレセニリン配列由来の少なくとも４〜８個、そして好ましくは少 なくとも９〜15個の連続するアミノ酸残基を含むプレセニリン配列に対して惹起 される。本発明の抗体は、本明細書中に記載の、種々の診断、治療、および技術 適用に使用し得る。 別の一連の実施様態において、本発明は、プレセニリン遺伝子およびタンパク 質（例えば、PS1またはPS2）の発現を誘発または阻害し得るタンパク質、低分子 、または他の化合物をスクリーニングまたは同定する方法を提供する。アッセイ は、インビトロで、形質転換されたもしくは形質転換されていない細胞株、不死 化細胞株を用いて、またはインビボで、本明細書中の実施可能とされるトランス ジェニック動物モデルもしくはヒト被験体を用いて行い得る。特に、アッセイは PS1、PS2、または他のプレセニリン関連遺伝子もしくはタンパク質の増加または 減少 した発現の存在を、増加または減少したmRNA発現、増加または減少したプレセニ リン関連タンパク質産物レベル、または組換え構築物中のプレセニリン5'調節領 域に作動可能に連結したマーカー遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ、緑色 蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼまたはルシファラーゼ）の増加または 減少した発現レベルを基準に検出し得る。特定のプレセニリンを発現することが 知られた細胞、または特定のプレセニリンを発現するために形質転換された細胞 は、インキュベートされ、そして１つ以上の試験化合物が培地に添加される。化 合物がプレセニリンの発現を誘発または阻害するのに充分な時間（例えば、０〜 72時間）の経過後、確立したベースラインからの発現レベルの任意の変化が、上 述の任意の技術を用いて検出され得る。特に好ましい実施様態において、細胞は 、ヒト神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、またはハイブリドーマ細胞株のような不 死化された細胞株由来であるか、または本発明の形質転換細胞である。 別の一連の実施様態において、本発明は、プレセニリンに結合するか、さもな くば直接相互作用するタンパク質および他の化合物を同定する方法を提供する。 タンパク質および化合物は内因性の細胞成分を包含する。その細胞成分は、イン ビボでプレセニリンと相互作用し、従って、薬学的および治療的介入のための新 しい標的、ならびに組換え化合物、合成化合物およびさもなくば外因性の化合物 を提供する。それらの化合物は、プレセニリン結合能を有し得、従って、薬学的 調製物の候補となり得る。従って、一連の実施様態において、細胞溶解物または 組織ホモジネート（例えば、ヒト脳ホモジネート、リンパ球溶解物）は、正常ま たは変異プレセニリンの一つに結合するタンパク質または他の化合物についてス クリーニングされ得る。あるいは、任意の種々の外因性の化合物は、天然に存在 するおよび/または合成（例えば、小さな分子またはペプチドのライブラリー） の両方とも、プレセニリン結合能についてスクリーニングされ得る。これら各々 の実施様態において、アッセイが、「プレセニリン成分」といくつかの他の部分 との間の結合を検出するために行われる。これらのアッセイにおけるプレセニリ ン成分は、正常または変異プレセニリンタンパク質（プレセニリンのまたはプレ セニリン融合タンパク質機能的ドメインまたは抗原決定基を含む）を含むかまた はそれ由来の任意のポリペプチドであり得る。結合は、非特異的測定（例えば、 細胞内Ca2+、Na+、K+、もしくはGTP/GDP比の変化、アポトーシスもしくは微小管 結合タンパク質リン酸化の変化、Aβペプチド産生の変化、またはディファレン シャルディスプレイ、2Dゲル電気泳動、ディファレンシャルハイブリダイゼーシ ョン、またはSAGE法によってモニターされ得る他の下流遺伝子の発現の変化）に よって、あるいは免疫沈降、Biomolecular Interaction Assay(BIAcore)、もし くはタンパク質ゲル電気泳動の変化のような直接測定によって検出され得る。好 ましい方法は、以下の技術の改変を含む：（１）アフィニティークロマトグラフ ィーによる直接的抽出；（２）免疫沈降によるプレセニリン成分および結合タン パク質または他の化合物の同時単離；（３）BIAcore分析；および（４）酵母ツ ーハイブリッドシステム。 別の一連の実施様態において、本発明は、正常または変異プレセニリンの活性 を調節し得るタンパク質、低分子および他の化合物を同定する方法を提供する。 正常細胞または動物、本発明の形質転換細胞およびトランスジェニック動物モデ ル、または正常もしくは変異プレセニリン遺伝子を有する被験体から得られる細 胞を使用して、本発明は、プレセニリンの発現、プレセニリンの細胞内位置、細 胞内Ca2+、Na+、K+またはGTP/GDP比または他のイオンレベルまたは代謝量の変化 、アポトーシスまたは細胞死の頻度または割合、Aβペプチド産生のレベルまた はパターン、微小管結合タンパク質のリン酸化の有無またはレベル、または正常 および変異プレセニリン配列を有する細胞を区別する他の生化学的、組織学的、 または生理学的マーカーに影響を与えるそれら化合物の能力に基づき、このよう な化合物を同定する方法を提供する。本発明の動物モデルを用いて、このような 化合物を同定する方法がまた、プレセニリンの変異に関連する挙動的、生理学的 、組織学的表現型に影響を与えるこれらの化合物の能力に基づいて提供される。 別の一連の実施様態において、本発明は、ADに関連するプレセニリン対立遺伝 子の保因者をスクリーニングする方法、ADの羅患者を診断する方法、および関連 する初老期および老年期の痴呆、精神分裂病および鬱病のような精神医学病、な らびに脳卒中および脳溢血のような神経性の病気（これらはPS1またはPS2遺伝子 の変異に関連する）をスクリーニングおよび診断する方法を提供する。スクリー ニングおよび/または診断は、本明細書中で開示される、および実施可能な核酸 （ゲノム配列およびmRNA/cDNA配列を含む）、タンパク質、および/または抗体に 基づく方法によって達成され得る。その方法は、正常プレセニリン活性の減衰も しくは増大、および/または変異プレセニリンによって与えられる特定の新しい 活性の存在を検出するよう設計された機能的アッセイを含む。従って、プレセニ リンタンパク質に基づくスクリーニングおよび診断が提供され、それらは変異プ レセニリンと正常プレセニリンとの間の電気泳動移動度、タンパク質分解の切断 パターン、種々のアミノ酸残基のモル比、特異的な抗体を結合する能力の差異を 検出する。さらに、核酸（gDNA、cDNA、またはmRNA）に基づくスクリーニングお よび診断が提供され、それらは、直接的ヌクレオチド配列決定、対立遺伝子特異 的オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション、制限酵素消化および マッピング（例えば、RFLP、REF-SSCP）、電気泳動移動度（例えば、SSCP、DGGE ）、PCRマッピング、RNaseプロテクション、化学的ミスマッチ切断（chemical m ismatch cleavage）、リガーゼ媒介検出（ligase-mediated detection）、なら びに種々の他の方法によってヌクレオチド配列の差異を検出する。PS1、PS2、AP P、またはPS1、PS2、もしくはAPPと反応するタンパク質の異常なプロセシング（ 例えば、異常リン酸化、グリコシル化、グリケーション、アミド化、またはタン パク質分解切断）；プレセニリンの転写、翻訳、および翻訳後修飾における変化 ；プレセニリン遺伝子産物の細胞内および細胞外のトラフィッキングにおける変 化；またはプレセニリンの異常な細胞内局在を検出する他の方法もまた提供され る。これらの実施様態に従って、診断キットもまた提供され、それらは上記の診 断スクリーニングに必要な試薬を含む。 別の一連の実施様態において、本発明は、ADのようなプレセニリンに関連する 病気の処置における使用のための方法および薬学的調製物を提供する。これらの 方法および薬剤は以下に基づく：（１）正常PS1またはPS2タンパク質の投与、（ ２）変異遺伝子を補償または置換するための正常PS1またはPS2遺伝子による遺伝 子療法、（３）変異PS1またはPS2遺伝子に対するアンチセンス配列に基づくかま たは変異遺伝子を「ノックアウト」する遺伝子療法、（４）PS1またはPS2の変異 体の有害な効果を、ブロックするかまたは矯正するタンパク質をコードする配列 に基づく遺伝子療法、（５）正常および/または変異のPS1もしくはPS2タンパ ク質に対する抗体に基づく免疫療法、または（６）PS1もしくはPS2の発現を変化 させるか、PS1またはPS2の変異形態と他のタンパク質またはリガンドとの間の異 常相互作用をブロックする低分子（薬物）、または、そうでなければ変異PS1も しくはPS2タンパク質の異常な機能を、変異タンパク質の構造を変化させるか、 またはそれらの代謝クリアランスを増強するか、もしくはそれらの機能を阻害す ることによってブロックする低分子（薬物）。 本開示はまた、生理学的条件下でプレセニリンと相互作用する、26Sプロテア ソームのS5aサブユニット、GT24タンパク質およびRab11を含む、多くのヒト細胞 タンパク質を同定し、そして部分的に特徴付ける。これらプレセニリン相互作用 タンパク質は、アルツハイマー病の研究、診断および処置を指向するさらなる実 施態様の基礎を構成する。詳細には、本発明は、これらプレセニリン相互作用タ ンパク質、その機能的ドメイン、またはプローブもしくはプライマーとして有用 なサブ配列をコードする、単離された核酸を提供する。これら核酸は、融合タン パク質をコードするベクターおよび細胞株のトランスフェクションまたは形質転 換用および動物モデルの作製用のベクターを含む種々の組換えDNA構築物に組み 込まれ得る。したがって、本発明はまた、プレセニリン相互作用タンパク質の少 なくとも機能的ドメインをコードするこれら核酸を有する、形質転換された細胞 株およびトランスジェニック動物を提供する。本発明の細胞株および動物モデル を使用して、これらプレセニリン相互作用タンパク質、その機能的ドメイン、も しくは少なくともその抗原決定基に対応する、実質的に純粋なペプチドまたはタ ンパク質を産生することが可能になる。さらに、これら組換え産生されたタンパ ク質、または天然に産生されたが実質的に精製されたプレセニリン相互作用タン パク質を使用して、本明細書に記載されるアッセイにおいて有用性を有する、こ れらプレセニリン相互作用タンパク質に対する抗体を作製することが可能になる 。別の一連の実施態様において、本発明は、プレセニリンとプレセニリン相互作 用タンパク質との間の相互作用を調節する化合物のアッセイを提供する。好まし い実施態様において、これらアッセイは、酵母ツーハイブリッドシステムにおい て実施される。ここで、プレセニリンの相互作用ドメインおよびプレセニリン相 互作用タンパク質は、ハイブリッド融合タンパク質で発現され、そして候補化合 物 は、この相互作用を調節する能力について試験される。他の実施態様において、 化合物がこれら相互作用を調節する能力は、本発明の形質転換された細胞株およ びトランスジェニック動物を使用して、またはインビトロ手段（例えば、競合結 合アッセイ）によって試験され得る。これら相互作用を調節することが示された 候補化合物は、薬学的に有用な量で産生され得、本明細書中で提供されるアルツ ハイマー病の動物モデルにおいて試験され得、そして/または治療的利益を提供 する能力についてヒト臨床試験において試験され得る。別の一連の実施態様にお いて、アルツハイマー病または関連疾患の原因であり得る、プレセニリン相互作 用タンパク質の変異についての診断スクリーニングが提供される。さらに、薬学 組成物、ならびにアルツハイマー病および関連疾患を処置するためのその使用方 法が提供される。これら製薬は、本発明の方法によって同定された、プレセニリ ンとプレセニリン相互作用タンパク質との間の相互作用を調節する化合物を含む 。このような製薬はまた、プレセニリンおよびプレセニリン相互作用タンパク質 の両方の相互作用ドメインのペプチドフラグメント、ならびにこれらドメインの 低分子模倣物を含む。新たに開示されたプレセニリン相互作用タンパク質に関す るこれらおよび他の実施態様は、以下の開示から容易に明らかになる。 本発明の別の局面に従って、本発明のタンパク質は、リガンド、治療用薬物ま たは他のタイプの小化学分子を提供する合理的なドラッグデザインのための出発 点として使用され得る。あるいは、上記のスクリーニングアッセイによって同定 される低分子または他の化合物は、合理的なドラッグデザインにおける「リード 化合物(lead compounds)」として働き得る。 本発明で特に開示されたヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、配列番号１〜 41と番号付けされている。さらに、ブダペスト条約の約定に基づき、本明細書に おいて開示された特定の核酸の生物的寄託が、ATCC（Rockville，MD）でなされ た。これらの寄託物としては、受託番号97124（1995年４月28日寄託）、受託番 号97508（1995年４月28日寄託）、受託番号97214（1995年６月28日寄託）、およ び受託番号97428（1996年１月26日寄託）が挙げられる。図面の簡単な説明 図１：この図はhPS1ゲノムDNAの構造の構成を表す。非コードエキソンを網状 （solid shaded）の長方形で示す。コードエキソンを、白抜きの（open）長方形 で、またはオルタナティブスプライシングされた配列を斜線のついた（hatched ）長方形で示す。制限部位は：Ｂ=BamHI;Ｅ=EcoRI;Ｈ=HindIII；Ｎ=NotI;Ｐ=Pst I;Ｖ=PvuII;Ｘ=XbaIである。制限部位間の水平な線のとぎれは、未決定のゲノム 配列を表す。各エキソンを含むクローン化されたゲノムフラグメントを、水平な 両端矢印で示す。ゲノムのサブクローンの大きさおよび各ゲノム配列の受託番号 を提供する。 図２：この図は、推定のPS1タンパク質のハイドロパシープロットを表す。こ のプロットは、KyteおよびDoolittle（1982）J.Mol.Biol. 157:105の方法に従っ て計算された。 図３：この図は、PS1タンパク質の推定構造の模式図である。ローマ数字は膜 貫通ドメインを表す。推定のグリコシル化部位はアスタリスクで示され、そして リン酸化部位のほとんどは、同じ膜表面上に２つの酸性親水性ループとして局在 する。MAPキナーゼ部位は残基115に存在し、PKC部位は残基114に存在する。FAD 変異部位を水平な矢印で示す。 図４：この図はPS2タンパク質の推定構造の模式図である。ローマ数字は膜貫 通ドメインを表す。推定のグリコシル化部位はアスタリスクで示され、そしてリ ン酸化部位のほとんどは、同じ膜表面上に２つの酸性親水性ループとして局在す る。FAD変異部位を水平な矢印で示す。 図５：この図は、プレセニリン１変異（アラニン-246-グルタミン酸(A246E)； システイン-410-チロシン(C410Y)）、散発性AD(SAD)、または罹患していないコ ントロール(cnt1)由来の脳抽出物のウエスタンブロットを示す。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 本発明の種々の実施様態の説明、ならびに本発明を実行および使用する際に用 いられる種々の要素および成分の理解を容易にするために、本明細書の記載およ び添付の請求の範囲で用いられた特定の用語について以下に示す定義が提供され る：プレセニリン。 本明細書中でさらなる修飾がなされずに用いられる、用語「プ レセニリン」は、プレセニリン-１（PS1）および/またはプレセニリン-２（PS2 ）の遺伝子/タンパク質を意味する。特に、修飾されない用語「プレセニリン」 は、哺乳動物のPS1および/またはPS2の遺伝子/タンパク質、そして好ましくは、 ヒトPS1および/またはPS2の遺伝子/タンパク質を意味する。プレセニリン-１遺伝子。 本明細書中で用いられる、用語「プレセニリン-１遺 伝子」または「PS1遺伝子」は、米国特許出願第08/431,048号（1995年４月28日 出願）に最初に開示および記載され、そして後にSherringtonら（1995）Nature 375:754-760に記載された哺乳動物遺伝子（任意の対立遺伝子変異体および異種 特異的哺乳動物ホモログを含む）を意味する。一つのヒトプレセニリン-１（hPS 1）cDNA配列が、本明細書中で、配列番号１として開示される。hPS1 mRNAの転写 物のオルタナティブスプライシングから得られる別のヒトcDNA配列は、配列番号 ３として開示される。以下に記載されるように、33残基をコードする領域が、い くつかの転写産物においてスプライスアウト（spliced-out）され得るさらなる ヒトスプライス変異体もまた発見されている。マウスホモログ（mPS1）のcDNAは 、配列番号16として開示される。用語「プレセニリン-１遺伝子」または「PS1遺 伝子」は、主としてコード配列に関するが、いくつかまたは全ての隣接調節領域 および/またはイントロンもまた包含し得る。用語PS1遺伝子は、特に、スプライ ス変異体に基づく組換え遺伝子を含むcDNAまたはゲノムDNAから作製された人工 または組換え遺伝子を包含する。プレセニリン-１遺伝子はまた、S182遺伝子（ 例えば、Sherringtonら、1995）として、またはアルツハイマー関連膜タンパク 質（ARMP）遺伝子（例えば、米国特許出願第08/431,048号、1995年４月28日出願 ）として言及されている。プレセニリン-１タンパク質。 本明細書中で用いられる、用語「プレセニリン- １タンパク質」または「PS1タンパク質」は、PS1遺伝子（対立遺伝子変異体およ び異種特異的哺乳動物ホモログを含む）によってコードされるタンパク質を意味 する。１つのヒトプレセニリン-１（hPS1）タンパク質配列が、本明細書中で、 配列番号２として開示される。hPS1 mRNA転写物のオルタナティブスプライシン グから得られる別のヒトPS1タンパク質配列は、配列番号４として開示される。 以下に記載されるような、33残基を含む領域が変異体mRNAスプライシングにより 省略され得る、さらなるヒトスプライス変異体もまた発見されている。これらの 変異体はまた、本明細書中で用いられる、用語プレセニリン-１タンパク質によ り包含される。マウスホモログ（mPS1）のタンパク質配列は、配列番号17として 開示される。このタンパク質は、組換え細胞もしくは生物によって産生され得る か、天然の組織もしくは細胞株から実質的に単離され得るか、または化学的もし くは酵素的に合成され得る。従って、用語「プレセニリン-１タンパク質」また は「PS1タンパク質」は、グリコシル化された、部分的にグリコシル化された、 またはグリコシル化されていない形態、ならびにリン酸化された、部分的にリン 酸化された、リン酸化されていない、硫酸化された、部分的に硫酸化された、ま たは硫酸化されていない形態のタンパク質を包含することが意図される。この用 語はまた、PS1アミノ酸配列の対立遺伝子変異体および他の機能的等価物（生物 学的に活性なタンパク質分解フラグメントまたは他のフラグメント、ならびにPS 1の生理学的および病理学的タンパク質分解性切断産物を含む）を包含する。こ のタンパク質はまた、S182タンパク質（例えば、Sherringtonら、1995）または アルツハイマー関連膜タンパク質（ARMP）（例えば、米国特許出願第08/431,048 号、1995年４月28日出願）として言及されている。hPS1 の遺伝子および/またはタンパク質。 本明細書中で用いられる、略語「hPS 1」は、PS1の遺伝子および/またはタンパク質のヒトホモログおよびヒト対立遺 伝子変異体をいう。ヒトPS1遺伝子の２つのcDNA配列が、本明細書中で、配列番 号１および配列番号３として開示される。対応するhPS1タンパク質配列は、配列 番号２および配列番号４として、本明細書中で開示される。有害な変異体を含む 数多くの対立遺伝子変異体が、以下の記載を通して開示され、そして実施可能と される。mPS1 の遺伝子および/またはタンパク質。 本明細書中で用いられる、略語「mPS 1」は、PS1の遺伝子および/またはタンパク質のマウスホモログおよびマウス対 立遺伝子変異体をいう。１つのマウスPS1遺伝子のcDNA配列が、本明細書中で、 配列番号16として開示される。対応するmPS1タンパク質配列が、本明細書中で、 配列番号17として開示される。有害な変異体を含む対立遺伝子変異体が、以下の 記載において実施可能とされる。プレセニリン-２遺伝子。 本明細書中で用いられる、用語「プレセニリン-２遺 伝子」または「PS2遺伝子」は、米国特許出願第08/496,841号（1995年６月28日 出願）に最初に開示および記載され、そして後に、Rogaevら（1995）Nature 376 :775-778およびLevy-Lahadら（1995）Science 269:970-973に記載された哺乳動 物遺伝子（任意の対立遺伝子変異体および異種特異的哺乳動物ホモログを含む） を意味する。１つのヒトプレセニリン-２（hPS2）cDNA配列が、配列番号18とし て、本明細書中で開示される。以下に記載されるように、１つのコドンまたは33 残基をコードする領域がいくつかの転写物においてスプライスアウトされ得るさ らなるヒトスプライス変異体もまた、発見されている。用語「プレセニリン-２ 遺伝子」または「PS2遺伝子」は、主としてコード配列に関するが、いくつかま たは全ての隣接調節領域および/またはイントロンもまた包含し得る。用語PS2遺 伝子は、特に、スプライス変異体に基づく組換え遺伝子を含む、cDNAまたはゲノ ムDNAから作製された人工または組換え遺伝子を包含する。プレセニリン-２遺伝 子はまた、E5-1遺伝子（例えば、Rogaevら、1995；米国特許出願第08/496,841、 1995年６月28日出願）として、またはSTM2遺伝子（例えば、Levy-Lahadら、1995 ）として、言及されている。プレセニリン-２タンパク質。 本明細書中で用いられる、用語「プレセニリン- ２タンパク質」または「PS2タンパク質」は、PS2遺伝子（対立遺伝子変異体およ び異種特異的哺乳動物ホモログを含む）によってコードされるタンパク質を意味 する。１つのヒトプレセニリン-２（hPS2）タンパク質配列が、本明細書中で、 配列番号19として開示される。以下に示されるように、一つの残基または33残基 を含む領域が特定の転写物においてスプライスアウトされ得るさらなるヒトスプ ライス変異体もまた、発見されている。これらの変異体はまた、本明細書中で用 いられる、用語プレセニリン-２タンパク質により包含される。このタンパク質 は、組換え細胞または生物によって産生され得るか、または天然の組織または細 胞株から実質的に精製され得るか、または化学的にもしくは酵素的に合成され得 る。従って、用語「プレセニリン-２タンパク質」または「PS2タンパク質」は、 グリコシル化された、部分的にグリコシル化された、またはグリコシル化されて いない形態、ならびにリン酸化された、部分的にリン酸化された、リン酸化され ていない、硫酸化された、部分的に硫酸化された、または硫酸化されていない形 態のタンパク質を包含することが意図される。この用語はまた、PS2アミノ酸配 列の対立遺伝子変異体および他の機能的等価物（生物学的に活性なタンパク質分 解フラグメントまたは他のフラグメント、ならびにPS2の生理学的および病理学 的タンパク質分解性切断産物を含む）をも包含する。このタンパク質はまた、E5 -1タンパク質（例えば、Sherringtonら、1995；米国特許出願第08/496,841、199 5年６月28日出願）またはSTM2タンパク質（例えば、Levy-Lahadら、1995）とし て言及されている。hPS2 の遺伝子および/またはタンパク質。 本明細書中で用いられる、略語「hPS 2」は、PS2の遺伝子および/またはタンパク質のヒトホモログおよびヒト対立遺 伝子変異体をいう。ヒトPS2遺伝子の一つのcDNA配列が、本明細書中で、配列番 号18として開示される。対応するhPS2タンパク質配列は、配列番号19として、本 明細書中で開示される。有害な変異体を含む数多くの対立遺伝子変異体が、以下 の記載を通して開示され、そして実施可能とされる。DmPS の遺伝子および/またはタンパク質。 本明細書中で用いられる、略字「DmP S」は、PS1およびPS2の遺伝子/タンパク質のDrosophilaホモログおよび対立遺伝 子変異体をいう。この定義は、核酸およびアミノ酸配列多型のうち、遺伝子また はタンパク質配列中の置換、挿入、または欠失が、遺伝子産物の本質的機能に影 響を与えないものを包含すると理解される。DmPS遺伝子の１つのcDNAのヌクレオ チド配列が、本明細書中で、配列番号20として開示され、そして対応するアミノ 酸配列が、配列番号21として開示される。用語「DmPS遺伝子」は、主として、コ ード配列に関するが、いくつかまたは全ての隣接調節領域および/またはイント ロンもまた包含し得る。正常。 本明細書中で遺伝子に関して用いられる、用語「正常」は、正常タンパ ク質をコードする遺伝子をいう。本明細書中でタンパク質に関して用いられる、 用語「正常」は、通常のまたは正常な生理学的役割を演じ、かつ病理的な状況ま たは状態に関連しないかまたはその原因となることのないタンパク質を意味する 。従って、本明細書中で用いられる、用語「正常」は、本質的に、用語「野生型 」の通常の意味と同義である。任意の所与の遺伝子または対応するタンパク質に ついて、多数の正常対立遺伝子変異体が存在し得るが、そのうちのどれも病理的 な状況または状態の発展に関連しない。このような正常対立遺伝子変異体は、１ つ以上のヌクレオチド置換が、コードされるアミノ酸配列の変化をもたらさない 変異体を包含するが、それらに限定されない。変異。 本明細書中で遺伝子に関して用いられる、用語「変異」は、変異タンパ ク質をコードする遺伝子をいう。本明細書中でタンパク質に関して用いられる、 用語「変異」は、通常のまたは正常な生理学的役割を演じず、かつ病理的な状況 または状態に関連し、またはその原因となるタンパク質を意味する。従って、本 明細書中で用いられる、用語「変異」は、用語「機能障害の」、「病理的な」、 「病気誘因の」および「有害な」と、本質的に同義である。本発明のプレセニリ ン遺伝子およびタンパク質に関して、用語「変異」は、１つ以上のヌクレオチド /アミノ酸置換、挿入および/または欠失を有するプレセニリン遺伝子/タンパク 質をいい、それらは、ヒトにおいて発現されたとき、代表的には、アルツハイマ ー病および/または他の関連する遺伝的表現型（例えば、脳溢血、精神遅滞、精 神分裂病、精神病、および鬱病）の症状の発症をもたらす。この定義は、生来存 在する種々の変異を包含すると理解され、それらには本明細書中で開示された変 異、およびヒトの介入により産生された合成または組換え変異が包含されるが、 それらに限定されない。用語「変異」は、プレセニリン遺伝子に適用されるとき には、遺伝子コードの縮重によって、本明細書中で開示されるかまたはさもなく ば実施可能とされる正常配列と同一のタンパク質をコードする配列変異体を包含 すると意図されない。また、異なるタンパク質をコードするが、正常プレセニリ ンタンパク質と機能的に等価であるタンパク質をコードする配列変異体を包含す ることも意図されない。機能的等価。 遺伝子配列およびアミノ酸配列の記載において、本明細書中で用 いられる、用語「機能的等価」は、列挙された配列が、特に開示される配列番号 何番の配列と同一である必要はないが、開示される配列の等価物として、生物学 的および/または化学的に機能する配列を提供することだけが必要であることを 意味する。実質的に純粋。 タンパク質（抗体を含む）または他の調製物に関して本明細書 中で用いられる、用語「実質的に純粋」は、少なくとも60重量％（乾燥重量）が 目的の化合物である調製物を意味する。好ましくは、調製物は、少なくとも75重 量％、より好ましくは少なくとも90重量％、そして最も好ましくは少なくとも99 重量％が目的の化合物である。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロ マトグラフィー、ゲル電気泳動、またはHPLC分析によって、測定され得る。タン パク質（抗体を含む）に関して、調製物が２つ以上の異なる目的の化合物（例え ば、本発明の２つ以上の異なる抗体、免疫原、機能的ドメイン、または他のポリ ペプチド）を含有する場合、「実質的に純粋」な調製物は、全ての目的の化合物 の全重量（乾燥重量）が、全乾燥重量の少なくとも60％である調製物を意味する 。同様に、２つ以上の目的の化合物を含有する調製物については、目的の化合物 の全重量が、調製物の全乾燥質量の少なくとも75％、より好ましくは少なくとも 90％、そして最も好ましくは少なくとも99％であることが好ましい。最後に、目 的のタンパク質が、投与、安定化、貯蔵などのために、１またはそれ以上の他の タンパク質（例えば、血清アルブミン）または化合物（例えば、希釈剤、賦型剤 、塩、多糖、糖、脂質）と混合されている場合、このような他のタンパク質また は化合物は、調製物の純度の計算では無視され得る。単離された核酸。 本明細書中で用いられる、「単離された核酸」は、リボ核酸 、デオキシリボ核酸、またはその生物由来の天然に存在するゲノム中、直接隣接 （5'末端のものおよび3'末端のもの）する配列から単離または分離されたポリヌ クレオチド配列を含む核酸アナログである。この用語は従って、例えば、ベクタ ー、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真 核生物のゲノムDNAに組み込まれた；あるいは、分離した分子（例えば、PCRまた は制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されたcDNAまたはゲノムDNAフラグ メント）として、他の配列とは独立して存在する組み換え核酸を包含する。また 、さらなるポリペプチド配列をコードする、および/または外因性の調節エレメ ントを含むハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも包含される。実質的に同一の配列。 本明細書中で用いられる、「実質的に同一」なアミノ酸 配列は、保存的アミノ酸置換、例えば、１つのアミノ酸の別の同じクラスのアミ ノ酸での置換（例えば、バリンの代わりにグリシン、アルギニンの代わりにリジ ンなど）のみが異なるか、または（アッセイされた、例えば、本明細書中で記載 の）タンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置に局在する、１つ以上の 非保存的置換、欠失、挿入のみが異なるアミノ酸配列である。好ましくは、この ような配列は、少なくとも85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％が、 アミノ酸レベルで、比較されるタンパク質またはペプチドの配列と同一である。 核酸については、比較配列の長さは、一般的に少なくとも50ヌクレオチド、好ま しくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、 そして最も好ましくは110ヌクレオチドである。「実質的に同一」な核酸配列は 、上記のように定義される実質的に同一なアミノ酸配列をコードする。形質転換細胞。 本明細書中で用いられる、「形質転換細胞」は、その中へ（ま たは、その先代の中へ）組換えDNA技術を用いて、目的の核酸分子が導入された 細胞である。目的の核酸は、ペプチドまたはタンパク質を代表的にコードする。 形質転換細胞は、目的の配列を発現し得るか、またはその配列を増殖するためだ けに使用され得る。用語「形質転換された」は、本明細書中で、外因性の核酸を 導入する任意の方法（形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーショ ン、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介トランスフェクションなど を包含するが、これらに限定されない）を包含して用いられ得る。作動可能に連結された。 本明細書中で用いられるように、調節領域の影響また は制御下で、コード配列の発現または転写が生じるように、コード配列および調 節領域が共有結合的に結合される場合、それらは「作動可能に連結された」とい われる。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つ のDNA配列は、以下を満たせば、作動可能に結合されたといわれる：プロモータ ーの機能の誘発が、コード配列の転写をもたらす場合、および２つのDNA配列間 の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の誘導をもたらさない、（２）コー ド配列の転写を指向する調節領域の能力を妨害しない、または（３）対応するRN A転写物の、タンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合。従って、調節領域 は、調節領域がDNA配列の転写をなし得、得られた転写物が所望のタンパク質ま たはポリペプチドに翻訳され得た場合、作動可能にコード配列に結合される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件。 ストリンジェントなハイブ リダイゼーション条件は、当業者によって理解される当該分野の用語である。任 意の所与の核酸配列について、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件 は、核酸配列のその相補的な配列への（実質的に異なる配列へではない）ハイブ リダイセーションを可能にする温度、カオトロピック酸、緩衝液、およびイオン 強度を有する条件である。「ストリンジェントな」条件を構成する正確な条件は 、核酸配列の性質、配列の長さ、およびその配列のサブセットが他の非同一配列 中に存在する頻度に依存する。ハイブリダイゼーション条件を、非特異的ハイブ リダイゼーションが生じるストリンジェンシーのレベルから、特異的ハイブリダ イゼーションのみ観察されるレベルへ変化させることによって、当業者は、過度 の実験を伴わずに、所与の配列が相補的な配列とのみハイブリダイズし得る条件 を決定し得る。このようなストリンジェンシー条件の適切な範囲は、Krauseおよ びAaronson（1991）Methods in Enzymology，200:546-556に記載されている。配 列の長さおよび共通性に依存するハイブリダイゼーション条件は、20℃〜65℃の 温度および５×〜0.1×SSCのイオン強度を包含し得る。高度にストリンジェント なハイブリダイゼーション条件は、40℃〜42℃の低い温度（ホルムアミドのよう な変性剤が含まれる場合）、または0.1×SSCの低いイオン強度においては60℃〜 65℃までの温度を包含し得る。しかし、これらの範囲は、例示であるのみであっ て、標的配列の性質および可能な将来の技術的開発に依存して、必要であるより もストリンジェントであり得る。ストリンジェント条件未満の条件が、任意の所 与の配列と実質的に類似する、対立遺伝子的または相同な核酸配列を単離するた めに用いられる。選択的に結合する。 抗体に関して本明細書中で用いられるように、抗体が目的 の標的を認識および結合するが、サンプル（例えば、目的の標的を含む生物学的 サンプル）中の他の分子を、実質的に認識および結合しない場合、抗体は標的に 「選択的に結合する」といわれる。 II．プレセニリン 本発明は、部分的に、変異した場合、アルツハイマー病の進展に関連する、哺 乳動物遺伝子のファミリーの発見に基づいている。プレセニリン-１およびプレ セニリン-２と命名されたこれらの遺伝子の発見、ならびにこれらの遺伝子、そ のタンパク質産物、変異体、および可能な機能的役割の特徴付けを以下に記載す る。プレセニリンの無脊椎動物のホモログをまた、そのプレセニリンの機能を明 らかにし得るように、そして以下に記載の様々な実施態様において有用であり得 る程度に記載する。 １．ヒトプレセニリン-１遺伝子の単離 Ａ．AD3 領域の遺伝子マッピング PS1遺伝子の最初の単離および特徴付け（当時、AD3遺伝子またはS182遺伝子と いわれる）が、Sherringtonら(1995)中に記載された。アノニマスマイクロサテ ライトマーカーD14S43およびD14S53の近傍の、14q24.3へのAD3遺伝子座の最初の 領域マッピング(Schellenbergら、1992；St.Gcorge-Hyslopら、1992；Van Broec khovenら、1992)の後、21の家系が、ADを推定の常染色体の優性特性として分離 するのに使用され(St.George-Hyslopら、1992)、そして高密度遺伝的連鎖地図に 組み入れられた(Weissenbachら(1992)Nature 359:794-798；Gyapayら(1994)Natu re Genetics 7:246-339)、14q24.3領域由来の18個のさらなる遺伝マーカーの分 離を調べるために用いられた。先に刊行されたペアワイズ最尤度分析(pairwise maximum likelihood analyses)は、家族性アルツハイマー病(FAD)と全てのこれ らのマーカーとの間の連鎖に対する実質的な累積的証拠を確認した。しかし、こ れらのマーカーへの連鎖を支持する多くの遺伝的データは、６つの大きな初期発 症家系(FAD1(Neeら(1983)Arc.Neurol. 40:203-208)、FAD2(Frommeltら(1991)Alz heimer Dis.Assoc.Disorders 5:36-43)、FAD3(Goudsmitら(1981)J.Neurol.Sci. 49:79-87；Pollen(1993)Hannah's Heirs:The Quest for the Genetic Origins o f Alzheimer's Disease ，Oxford University Press，Oxford)、FAD4(Foncinら(1 985)Rev.Neurol. （Paris）141:194-202)、TOR1.1(Bergamini(1991)Acta Neurol. 13:534-538)、および603(Pericak-Vanceら(1988)Exp.Neurol. 102: 271-279)に由来し、これら各々は、14q24.3由来の少なくとも１つのアノニマス 遺伝マーカーを提供する(St.George-Hyslopら、1992)。 14q24.3由来の遺伝マーカーの既知の位置に対するAD3遺伝子の位置をより正確 に規定するために、組換えのランドマーク(recombinational landmark)を、染色 体14に明確な連鎖を示す６つの家系の遺伝子型決定された冒されたメンバー由来 の稀なハプロタイプの生のデータを、直接的な観察により探索した。この特定の 例におけるこの選択的なストラテジーは、減少した冒されたメンバーの再構築さ れた遺伝子型由来、ならびに古い無症候性の(elderly asymptomatic)大きな家系 のメンバー由来のデータをほぼ放棄し、および不確実な連鎖状態のより小さい家 系は考慮に入れない。しかし、このストラテジーは非常に確実である。それはま た、非父方から生じる減少した冒されたメンバーの再構築された遺伝子型中のエ ラーを通して、または連鎖していない家系の包含、サンプリングエラーのいずれ かを介して、潜在的に獲得された読み違えの遺伝子型データの獲得を避けるので 、このストラテジーは非常に確実な根拠がある。 冒された被験体に対するハプロタイプのデータの観察に基づいて、その遺伝子 型が直接決定された６つの大きな家系のメンバーは、D14S48およびD14S53、なら びにD14S258およびD14S63において必須の組換え体であることが明らかとなった 。D14S53における単一組換え体（FDA領域についてテロメリックな境界を描く） は、FAD1家系の同じADに冒された被験体中で生じた。このFAD1家系は、D14S48を 包む、D14S53にテロメリックに位置するいくつかの他のマーカーにおいて組み換 えられていることが既に見出されている(St.George-Hyslopら、1992)。逆に、D1 4S258における単一組換え体（FAD領域のセントロメリックな境界をマークする） はFAD3家系の冒されたメンバーにおいて生じる。このFAD3家系はまた、D14S63を 含む、D14S258に対してセントロメリックないくつかの他のマーカーにおいて組 み換えられた。両方の組換え被験体は、そのファミリーの他の冒されたメンバー 中の疾患についての標準的な臨床試験を通して確認されたアルツハイマー病の明 白な証拠を有し、そして両方の組換え被験体の遺伝子型は、有益な情報を与え、 そしてD14S53に対して中間でセントロメリックな、そしてD14S258に対してテロ メリックなものの中の複数の遺伝子座において共分離する。 ハプロタイプ分析を、６つの大きな家系の減少した冒されたメンバーの再構築 された遺伝子型ならびに0.95未満の連鎖に対する見込みを有する残りの15の家系 由来のデータを含むように拡大すると、いくつかのさらなる組換え体が、D14S53 とD14S258との中間の１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子座で検出された。こ のように、１つのさらなる組換え体が、３つのより大きなFAD家系(FAD1、FAD2お よび他の関連ファミリー)のそれぞれの減少した冒されたメンバーの再構築され た遺伝子型中に検出され、そして８つのさらなる組換え体が、５つのより小さな FAD家系の冒されたメンバー中に検出された。しかし、これらの組換え体のいく つかは、さらに規定された標的領域内にAD3遺伝子を正確に配置したが、最初に 議論した理由のためだけでなく、これらがD14S53-D14S258の間隔の間にAD3遺伝 子に対して相互に一致しない位置を提供するために、これらの潜在的に近似であ る「内部組換え体」を信頼できないとみなすことは必要であった。 Ｂ．AD3 領域にわたる物理的コンティグの構築 AD3遺伝子のクローニングに対する最初の工程として、酵母人工染色体ベクタ ー、ファージ人工染色体ベクター、およびコスミドベクター中へクローン化され た重複するゲノムDNAフラグメントのコンティグを構築した。YACクローン932c7 および964f5由来のコスミドを用いるFISHマッピング研究は、AD3遺伝子を最も保 有し得る間隔は、少なくとも５メガ塩基のサイズであることを示唆した。この大 きなサイズの最小共分離領域がポジショナルクローニングストラテジーを扱い難 いものにしているために、D14S53およびD14S258により隣接されるインターバル 内の１つまたはそれ以上のサブ領域に対するAD3遺伝子についての探索に焦点を 合わせるさらなる遺伝的ポインターが求められている。D14S53とD14S258との間 のマーカーでのハロタイプ分析は、この分析がFADの初期の発症形態を有する家 系に制限されるか、または全ての家系を含むように一般化されるかどうかに無関 係に、これらのマーカーのいずれかにおけるFAD形質と対立遺伝子との間の連鎖 不均衡および／または対立遺伝子関連についての統計学的に有意な証拠を検出で きない。この結果は、本発明者らの家系の多様な民族起源を考えれば意外ではな かった。しかし、同じ民族血統の家系を照合した場合、同じ民族起源の異なる家 系において分離する疾患を有する染色体上で観察されたハプロタイプの直接観察 は、マーカー遺伝子座の２つのクラスターを明らかにした。第１のこれらのクラ スターはD14S77にセントロメリックに位置しており(D14S786、D14S277およびD14 S268)、そしてYAC 78842においては含まれる0.95Mbの物理的インターバルにわた っている。第２のクラスターは、D14S77にテロメリックに位置しており(D14S43 、D14S273、およびD14S76)、そしてオーバーラップするYACクローン964c2、7416 3、797d11および854f5の一部の中に含まれる約１Mbの物理的インターバルにわた っている。同一の対立遺伝子が、同じ民族起源の少なくとも２つの家系中に観察 された。ストラテジーの一部として、物理的にクラスター化したマーカー遺伝子 座のこれらの１つの群において、共有する対立遺伝子の存在は、各種民族的集団 において元々見出された染色体上のPS1遺伝子を取り囲む小さな物理的領域の同 時遺伝を反映し得るということが解った。重要なことに、各共有された範囲のハ プロタイプは、正常な白色人種集団ではまれであり、そして共有する対立遺伝子 は、染色体14q24.3上の他の同様の遺伝的間隔にわたるマーカーの他の群におい ては観察されない。 Ｃ．転写マッピングおよび候補遺伝子の分析 両方の重大な中間内にコードされる発現された配列を単離するために、ヒト脳 mRNA由来の一次相補DNAプールから転写された配列を回収するために、ハイブリ ダイゼーション標的として、固定化され、クローン化されたヒトゲノムDNAを含 む直接選択ストラテジーを用いた(Rommensら(1993)Hum.Molec.Genet. 2:901-907 )。大きさが100〜600塩基対のおよそ900個の推定のcDNAフラグメントをこれらの 領域より回収した。これらのフラグメントを、ヒトおよび他の哺乳動物由来のオ ーバーラップするYACクローンおよびゲノムDNAクローンのそれぞれ由来のゲノム DNAを含有するサザンブロットに対してハイブリダイズした。これにより進化的 保存および／またはそれらがスプライスされたmRNA由来であることを示唆する複 合体構造の証拠を示す151個のクローンのサブセットを同定した。このサブセッ ト内のクローンを物理的地図位置、クロス−ハイブリダイゼーションおよびヌク レオチド配列に基づいて照合しそしてこれらを用いてより長いcDNAのために従 来のヒト脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。長さ１kbを超える少なくと も19個の独立したcDNAクローンを単離し、そして次にAD3領域の部分的転写地図 に並べる。これらの転写物の内３個のみが既知の特徴付けされた遺伝子に対応し た(cFOS、ジヒドロリポアミドスクイニルトランスフェラーゼ、および潜在的な 形質転換増殖因子結合タンパク質２)。 Ｄ．候補遺伝子の回収 候補遺伝子の各オープンリーディングフレーム部分を、正常コントロール被験 体の死後の脳組織から、および染色体14に明らかに連鎖する６つの家系の冒され たメンバーの死後の脳組織、または培養した線維芽細胞株由来の単離されたmRNA のいずれかからRT-PCRにより回収した。次いで、RT-PCR産物を、化学的切断およ び制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング一本鎖配列コンホメーショ ン的多型法(SaleebaおよびCotton(1993)Methods in Enzymology 217:286-295；L iuおよびSommer(1995)Biotechniques 18:470-477)により、および直接的ヌクレ オチド配列決定により、配列の相違についてスクリーニングした。１つの例外と 共に、試験した全ての遺伝子(目的の物であるが)、冒された被験体に独特なまた は疾患と共分離する配列内には改変を含まなかった。唯一の例外は、正常被験体 中には観察されなかった一連のヌクレオチド変化を含むクローンS182により示さ れる候補遺伝子であった。そしてこれは冒された被験体中のアミノ酸配列を改変 することが予測された。このクローンに対応する遺伝子をプレセニリン-１(PS1) と称する。２つのPS1 cDNA配列（以下に記載のオルタナティブスプライス変異体 を示す）は、配列番号１および配列番号３として本明細書中に開示される。対応 する予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２および配列番号４として開 示する。これらのcDNAクローンを有するBluescriptプラスミドは、ATCC,Rockvil le,Mdにおいて、ATCC受託番号97124および97508として、1995年４月28日に寄託 されている。配列番号１および配列番号２に対応する配列はまた、GenBankデー タベースに寄託されており、そして受託番号42110を通して検索され得る。 ２．マウスプレセニリン-１遺伝子の単離 ヒトPS1遺伝子のマウスホモログ(mPS1)を、hPS1遺伝子由来の標識化したヒトD NAプローブでマウスcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより回収した 。この様式で、２kb部分転写物（遺伝子の3'末端を表す）および5'末端を表すい くつかのRT-PCR産物を回収した。マウスホモログのコンセンサスcDNA転写物の配 列決定は、hPS1と実質的なアミノ酸同一性を明らかにした。重要なことに、以下 に詳細に示すように、FAD家系中の変異した全てのアミノ酸は、マウスホモログ と正常ヒト変異体との間に保存されていた。PS1遺伝子のこの保存は、マウス内 に存在するオーソロガス(orthologous)な遺伝子の存在を示し(mPS1)、そしてヒ トPS1プローブを用いるゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングするこ とにより他の哺乳動物のホモログまたはオートログをクローン化することを今や 可能にする。従って、同様のアプローチは、他の種内でのPS1遺伝子を同定およ び特徴付けすることを可能にする。mPS1クローンの核酸配列を、配列番号16とし て本明細書中に開示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号17として開示す る。両配列をGenBankデータベースに寄託し、そしてこれは受託番号42177を通し て検索可能である。 ３．ヒトプレセニリン-２遺伝子の単離 今日プレセニリン-２(PS2)と命名された、第２のヒト遺伝子を単離し、そして PS1遺伝子と実質的な核酸およびアミノ酸相同性を共有することを実証した。こ の遺伝子の最初の単離は、Rogaevら(1995)に詳細に記載されている。ほぼ同一の 方法によるヒトPS2遺伝子(「STM2」と言われる)の単離がまた、Levy-Lahadら(19 95)に報告されている。簡潔には、Altschulら(1990)J.Mol.Biol. 215:403-410の BLASTNパラダイムを用いる検索データベースに、PS1に対するcDNAのヌクレオチ ド配列を用いることにより、PS2遺伝子を同定した。受託番号T03796、R14600、 およびR05907により同定された、実質的な相同性(p＜1.0e-100、少なくとも100 の連続的な塩基対にわたる97％より大きい)のある、３つの発現された配列タグ 化部位(EST)を、位置付けた。 オリゴヌクレオチドプライマーを、これらの配列から作製し、そして逆転写酵 素PCR（RT-PCR）によりPCR産物を生成するために用いた。これらの短いRT-PCR産 物を部分的に配列決定してデータベース内の配列とのそれらの同一性を確認し、 そして次いでハイブリダイゼーションプローブとして用いて全長cDNAライブラリ ーをスクリーニングした。１kb〜2.3kbの大きさにわたるいくつかの異なるcDNA をガン細胞cDNAライブラリー(Caco2)およびヒト脳cDNAライブラリー(E5-1、G1-1 、cc54、cc32)から回収した。これらのクローンのヌクレオチド配列は、すべて が同じ転写物の誘導体であることを確認した。 転写物をコードする遺伝子である、PS2遺伝子は、物理的コンティグマップ（1 q41に対するFISHによりマップされたYACクローン750g7、921d12；および1p36.1- p35に対してマップされたYACクローン787g12）上に配置されたCEPH Mega YACク ローンの２つのクラスターに対するハイブリッドマッピングパネルを用いてヒト 染色体１にマップされた。hPS2クローンの核酸配列を配列番号18として本明細書 中に開示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号19として開示する。両配列 をGenBankデータベース中に寄託し、そしてこれらは受託番号L44577を通して検 索し得る。hPS2クローンのDNA配列はまた、ベクター中に組み込まれ、そしてATC C、Rockville、MD.,ATCC受託番号97214として1995年の６月28日に寄託されてい る。 ４．C.elegans およびD.melanogaster中のホモログの同定 Ａ．C.elegans のSPE-4 BLASTアライメントパラダイムを用いる利用可能なデータベースでのPS1の核酸 配列および予想されるアミノ酸配列の比較は、C.elegans精子内在性膜タンパク 質SPE-4と適度なアミノ酸類似性(p=1.5e-25、少なくとも50残基の３群にわたる2 4〜37％の同一性)、および哺乳動物クロモグラニンＡおよび哺乳動物電圧依存性 カルシウムチャンネルのαサブユニットを含むいくつかの他の膜貫通タンパク質 の部分とのより弱い類似性を明らかにした(Altschulら、1990)。推定の膜貫通ド メインを横切るアミノ酸配列類似性は、限られた数の疎水性アミノ酸から簡易に 生じるアライメントをときには生じ得るが、しかしいくつかの親水性ドメインに おいてPS1とSPE-4との間には伸長された配列アライメントが存在する。両方の推 定PS1タンパク質およびSPE-4は、同等の大きさ(それぞれ、467残基および465残 基)であることが予想され、以下により十分に記載するように、最後の予測され る膜貫通ドメインに先行する大きな酸性ドメインを有する少なくとも７つの膜貫 通ドメインを含むことが予測される。PS1タンパク質は、Ｎ末端により長い予測 された親水性領域を有する。 BLASTPアライメント分析はまたPS2とC.elegans SPE-4タンパク質との間の有意 な相同性（p=3.5e-26；同一性=少なくとも22残基における５つのドメインにわた って20-63％）、および脳ナトリウムチャンネル（αIIIサブユニット）ならびに 種々の種由来の電圧依存性カルシウムチャンネルのαサブユニットに対する弱い 相同性（p=0.02；少なくとも35残基の２以上のドメインにわたって20〜28％の同 一性を）検出した(Altschul、1990)。これらのアライメントはPS1遺伝子につい ての上記のアライメントに類似している。 Ｂ．C.elegans のSel-12 C.elegans由来の461残基のSel-12タンパク質およびS182(配列番号２)が、460 アミノ酸にわたり48％の配列同一性を共有することが見出された(Levitanおよび Greenwald(1995)Nature 377:351-354)。Sel-12タンパク質はまた複数の膜貫通ド メインを有すると考えられている。sel-12遺伝子(受託番号U35660)がin-12 gain -of-function変異の抑制についてのスクリーニングにより同定され、そして形質 転換レスキューによりクローン化された(LevitanおよびGreenwald、1995)。 Ｃ．D.melanogaster のDmPS プレセニリン／Sel 12タンパク質の高度に保存された領域をコードする縮重オ リゴヌクレオチドを調製し、そして成体および幼虫のD.melanogasterから関連し たmRNAを同定するために用いた。これらのmRNAは配列決定され、そしてヒトのプ レセニリンのアミノ酸配列に高度に相同的な推定のアミノ酸配列を有するオープ ンリーディングフレームを含むことが示された。DmPS cDNAを配列番号20として 同定する。 この配列は、ヒトのプレセニリンに対して約52％の同一性を有する541アミノ 酸(配列番号21)のポリペプチドをコードする。 D.melanogasterホモログの構造は、少なくとも７つの推定の膜貫通ドメインを 有するヒトのプレセニリンの構造に類似する（15のウィンドウおよび1.5のカッ トオフを用いるKyte-Doolittle疎水性分析）。少なくとも１つのオルタナティブ スプライス型の証拠が、541アミノ酸のORFを含むクローンpds13中に検出され(一 方クローンpds7、pds14、およびpds1は、ヌクレオチド1300-1341を欠いている) 。このオルタナティブスプライシングは、推定のTM6→7ループ内の残基384にお けるGlyからAlaへの改変、およびより長いORFのコドン399におけるGlu残基に対 するインフレーム融合の結果生じる。D.melanogasterとヒト遺伝子との間のアミ ノ酸配列の主要な相違は、Ｎ末端酸性親水性ドメイン内およびTM6→7ループの酸 性親水性部分内に存在する。TM6→7ループを取り囲む残基は特に保存されており （残基220〜313および451〜524）、これらが機能的に重要なドメインであること を示唆している。20残基中16残基がヒトPS1およびPS2中で変異されており、そし てヒトFADはD.melanogasterホモログ中で保存されていることが同定されている 。 DmPS遺伝子のDNA配列はクローンとしてBluescriptプラスミド中に組み込まれ ている。安定なベクターはATCC受託番号97428の下に、1996年１月26日に、ATCC, Rockville,MD.,に寄託された。 ５．ヒトプレセニリン遺伝子の特徴付け Ａ．hPS1 転写物および遺伝子構造 ノザンブロットへのPS1(S182)クローンのハイブリダイゼーションは、主要な 約2.8kbの転写物およびマイナーな約7.5kbの転写物としての、脳および末梢組織 の多くの領域において広く発現した転写物を同定した（例えば、Sherringtonら の図２、1995を参照のこと）。PS1は脳のほとんどの領域において、および転写 の低い肝臓を除くほとんどの末梢組織でわずかに一様に発現する。約7.5kbの転 写物の同一性は不明確であるにもかかわらず、２つの観察は、約2.8kbの転写物 がこの遺伝子の活性産物を示すことを示唆する。脳を含む、種々のマウス組織由 来のmRNAを含むノーザンブロットへのPS1クローンのハイブリダイゼーションは 、約2.8kbのヒト転写物に同一の大きさの単一の転写物のみを同定する。今日ま で に発見された、全てのより長いcDNAクローン(2.6〜2.8kb)(5'および3'UTRの両方 を含み、そしてノザンブロット上で約2.8kbのバンドを供給する)は、染色体14の 同じ物理的領域に占有的にマップされている。 これらの実験から、約7.5kbの転写物は、稀な選択的にスプライシングされる かまたは約2.8kb転写物のポリアデニル化されたイソ型のいずれかを表し得るか 、またはPS1に対する相同性を有する別の遺伝子を表し得る。PS1およびPS2両方 を高レベルで発現するCaco2細胞株由来のcDNAライブラリーを、長い転写物につ いてスクリーニングした。２つの異なるクローン(GL40およびB53)を得た。配列 決定により、両方のクローンが、類似の5'UTR、および脳内のより短い2.8kbの転 写物のORFと同一のORF含むことが明らかとなった。 両方のクローンは異常に長い3'UTRを含んでいた。この長い3'UTRは、さらに下 流約3kbの別のポリアデニル化部位の使用を表す。この長い3'UTRは、パリンドロ ームまたはステムループ構造を生じる多くのヌクレオチド配列モチーフを含む。 これらの構造は、mRNA安定性そしてまた翻訳効率に関係する。この観察の有用性 は、上流のポリアデニル化部位が除去された組換え発現構築物および／またはト ランスジーンを作製することを可能にし得、それにより下流のポリアデニル化部 位およびより長い3'UTRの使用を強化することである。ある例において、これは 標的化された細胞株において、またはさらに脳内のインビボで(生殖系列治療に より、または遺伝子療法の形態用に改変されたヘルペス単純ウイルスベクターの ようなウイルスベクターの使用のいすれかにより)、変異体対野生型転写物のバ ランスを変えることに利用され得る、優先的翻訳を用いて、選択されたmRNA種の 安定性を促進し得る。 hPS1遺伝子は、Roswell Park PACライブラリー由来の200kb PAC1クローンRPCI -1 54D12内の少なくとも60kbのゲノム間、およびLos Alamos Chromosome 14コス ミドライブラリー由来の３つの重複するコスミドクローン57-H10、1-G9、および 24-D5にわたる。PS1遺伝子の転写物は、PACおよびコスミドクローンのサブクロ ーン化された制限フラグメントへの、オリゴヌクレオチドおよび部分cDNAプロー ブの反復ハイブリダイゼーションにより、およびこれらのサブクローンの直接の ヌクレオチド配列決定により同定されたエクソン13由来のRNAを含む。5'UTRは、 その転写物の交互の5'末端を示すエクソン１および２と共に、エキソン１〜４内 に含まれる。そのORFは、エクソン４の一部またはエクソン９の全ての欠失をも たらすオールタネーティブスプライシング事象を用いて、エクソン４〜13内に含 まれる。 他に述べない限り、明瞭性および簡潔性のために、hPS1由来のヌクレオチド配 列中のヌクレオチド位置に関する全ての参考は、配列番号１（L42110）(エクソ ン１で始まるhPS1 cDNA配列)の塩基番号を用いる。このcDNAにおいて、エクソン １はエクソン３に直接スプライシングされ、これはエクソン４〜13にスプライシ ングされる。配列番号１において、エクソン１はヌクレオチド１〜113位にわた り、エクソン３は114〜195位にわたり、エクソン４は196〜335位にわたり、エク ソン５は336〜586位にわたり、エクソン６は587〜728位にわたり、エクソン７は 729〜796位にわたり、エクソン８は797〜1017位にわたり、エクソン９は1018〜1 116位にわたり、エクソン10は1117〜1203位にわたり、エクソン11は1204〜1377 位にわたり、エクソン12は1378〜1496位にわたり、エクソン13は1497〜2765位に わたる。同様に、他に述べない限り、hSP1由来のタンパク質配列中のアミノ酸残 基位に関する全ての参考は、配列番号１の翻訳産物である、配列番号２の残基数 字を用いる。 隣接するゲノム配列をエクソン１〜12について得、そしてそれらを配列番号５ 〜14中に示す(受託番号L76518〜L76527)。エクソン13の５’のゲノム配列もまた 決定し、そして配列番号15中に示す（受託番号L76528)。配列番号５〜14は完全 なエクソン配列も含む。しかし、配列番号15は、エクソン13の３’末端を含まな い。エクソン１および２に対応するゲノム配列は、2.6kbのBamHI-HindIIIフラグ メント（配列番号５）上で約240bp離れて位置する。エクソン３および４（ATG開 始コドンを含む）は、別の３kbのBamHIフラグメント上に位置する。エクソン２ の約850bp下流のBamHI部位と、エクソン３の約600bp上流のBamHI部位との間のイ ントロン２の完全な配列はまだ同定されておらず、そして隣接するBamHI部位由 来のプライマーを用いる拡張PCRにより即時に回収されておらず、このことは、 イントロン２が巨大であり得るという意味を含んでいる。 エクソン１および２（配列番号５）を取り囲むヌクレオチド配列の解析は、イ ントロン１中のNotI制限部位を含む多くのCpGジヌクレオチドを明らかにした。 アクチベータータンパク質-２(AP-2)の複数のクラスター、転写のシグナルトラ ンスデューサーおよびアクチベーター(STAT3)(SchindlerおよびDarnell(1995)An nu.Rev.Blochem. 64:621-651)、ガンマアクチベーター配列(GASまたはSTAT1)、 複数の開始部位エレメント下流(MED)(InceおよびScotto(1995)J.Biol.Chem. 270 :30249-30252)、およびGCエレメントを含むいくつかの推定の転写調節タンパク 質に対するコンセンサス配列は、イントロン１およびエクソン１の５’配列の両 方の中に存在していた（配列番号５を参照のこと）。２つの推定のTATAボックス が、エクソン１の上流（配列番号５のbp925〜933bpおよび978〜987bp）に存在し 、そしてこの後に２つの推定の転写開始(CAPまたはChambon-Trifonov)コンセン サス配列（配列番号５の1002〜1007bpおよび1038〜1043bp488）が続く。対照的 に、エクソン２のすぐ上流の配列はTATAボックスもCAP部位を欠くが、CpG島のク ラスターに富んでいる。 hPS1遺伝子の構造的な構成の概略地図を図１として示す。非コードエクソンを 黒四角で示す。コードエクソンを白四角またはオルタナティブスプライシングさ れた配列に対しては斜線四角で表す。制限部位を：Ｂ＝BamHI；Ｅ＝EcoRI；Ｈ＝ HindIII；Ｎ＝NotI；Ｐ＝PstI；Ｖ＝PvuII；Ｘ＝XbaIとして示す。制限部位の間 の水平線中の不連続部分は未決定のゲノム配列を表す。各エクソンを含むクロー ニングされたゲノムフラグメントを、両端が矢印の水平線で示す。ゲノムサブク ローンの大きさおよび各ゲノム配列に対する受託番号もまた提供する。 エクソン１の上流290bp内かつイントロン１内のヌクレオチド配列に基づく約D NA２次構造の予測は、16kcal/molより大きい安定性を有するいくつかのパリンド ームを明らかにする。これらの２次構造分析はまた、ヌクレオソーム(約76bp)を 取り囲むのに十分なループサイズを有する３つの安定なステムループモチーフ(b p1119〜1129/1214〜1224；bp1387〜1394/1462〜1469；およびbp1422〜1429/1508 〜1515；全て配列番号５中)の存在を予測する。このようなステムループ構造は 、TATA含有遺伝子の共通の特徴である（KollmarおよびFarnham(1993)Proc.Soc.E xpt.Biol.Med. 203:127-137)。 これらの５’領域中の特徴の要約を表１に提示する。塩基位に対するすべての 参照は、配列番号５に関する。 配列番号１中の最も長い予測されたオープンリーディングフレームは、467ア ミノ酸のタンパク質（配列番号２）をコードする。このオープンリーディングフ レームに対する開始コドンは、TGA停止コドンの下流に位置する最初の相内のATG である。最初の相内の２つのATGコドンの周囲には古典的なKozakコンセンサス配 列は存在しない(Sherringtonら、1995)。古典的な「強力な」開始コドンを欠く 他の遺伝子のように、ヒト転写物の推定の５’UTRはGCに富んでいる。 Ｂ．hSP1 ５’UTRのオルタナティブ転写およびスプライシング 最初の３つのエクソンおよび第４のエクソンの部分が非翻訳領域を含むが、ヒ ト海馬cDNAライブラリー(Stratagene,La Jolla CA)からおよび結腸腺癌細胞株(J .RommensからのCaco2)から単離された複数の全長cDNAクローンの分析が、多くの クローンにおいて開始配列がエクソン１に由来し、そしてエクソン１が直接エク ソン３にスプライシングされることを明らかにした(受託番号L42110、配列番号1 )。より頻繁でなく（９クローン中１クローン）、最初の転写された配列はエク ソン２由来であり、そしてエクソン３上にスプライシングされた（受託番号L765 17、配列番号３）。エクソン１中のプライマーを用いて単離した少なくとも40個 の独立したRT-PCR転写物の直接的ヌクレオチド配列決定は、エクソン１およびエ クソン２の両方を含むいかなるクローンを同定することにも失敗した。最終的に 、エクソン２の上流のゲノム配列の観察は、３’スプライス部位配列を明らかに はしなかった。これらの観察は、エクソン２が、エクソン１中で開始する転写物 のオルタナティブスプライス型またはcDNAクローニングの人工産物というよりは むしろ真の開始エクソンであることを主張する。さらに、エクソン２を含むクロ ーン(cc44)は、同じモノクローナルCaco2細胞株から得られたので、エクソン１ 含有転写物およびエクソン２含有転写物の両方が同じ細胞に存在するようである 。 エクソン１近接の５’上流領域のヌクレオチド配列に基づく転写開始部位につ いての予測を試験するために、本発明者らはエクソン１を含有する３つの独立し た「全長」cDNAクローン(cc33、cc58およびcc48)。およびエクソン３中に位置す るアンチセンスプライマーを用いてプライマー伸長することにより回収した３つ の配列の５’末端配列を調べた。最も遠位の５’伸長がcDNA G40L中に見られ、 これはエクソン１（配列番号５(L76518)）を含有するゲノム配列中の1214 bp位 に最も近位の転写開始部位をマップし、従ってこれは配列番号１の−10位に対応 する。２つのさらなるクローン(cDNA cc48および５’RACE産物＃５)は、ゲノム 配列（配列番号５）中の1259 bp位の共通開始部位を共有し、これは配列番号１ 中の34位に対応する。２つの残りのcDNA、ならびに残りの５’RACEクローンは、 エクソン１内のより遠位の位置で開始した。５’RACEクローン＃８は1224 bpで 開始し、これは配列番号１の１位に等しい。それゆえこれらのクローンは、いず れもエクソン１の上流の予想されたCAP部位まで伸長しなかった。エクソン２由 来の開始配列を含有する転写物の低普及率により、これらの開始部位の類似の研 究は行われていない。 Ｃ．hPS1 ORF のオルタナティブスプライシング 異なる開始配列を有する転写物に加えて、種々のライブラリーから回収された 複数のcDNAクローンの分析がまた、ORFに影響するPS1転写物中の２つの変異を明 らかにした。 これらの第１は、エクソン４の３’末端由来の12ヌクレオチドの比存在である （配列番号１のヌクレオチド324〜335）。これはヌクレオチド335の後の代わり にヌクレオチド323の後での、エクソン４のスプライシングの結果生じる。エク ソン４のこのオルタナティブスプライシングから生じる転写物は、配列番号２の アミノ酸残基Val26-Arg27-Ser28-Gln29をコードしない。エクソン４に対するこ れらの２つのオルタナティブスプライシング事象から生じる転写物は、調査され た全ての組織においてほぼ等しい頻度で検出された。マウスPS1転写物は、Ile26 -Arg27-Ser28-Gln29に対するcDNA配列のみを含有し、そしてVal-Arg-Ser-Glnモ チーフに対する配列は、Arg48-Ser49-Gln50としてヒトPS2中に部分的に保存され るのみであるということが現在までに調べられたクローンにおいて顕著である(R ogaevら、1995)。各々のこれらの観察は、これらの相違が適切なPS1機能には重 要でないということを示唆する。 ORFに影響する第２のスプライシング変異は、エクソン９（配列番号１内のヌ クレオチド1018〜1116）の非存在を生じる。種々の組織のmRNA由来のRT-PCR産物 の分析は、脳（ADにより代表的に影響される新皮質範囲を含む）およびいくつか の他の組織（筋肉、心臓、肺、結腸）がエクソン９を有する単一転写物を優先的 に発現するということを示した。他方、白血球（リンパ芽球ではない）はまた、 エクソン９を欠くより短い形態を発現した。エクソン９のオルタナティブスプラ イシングは、配列番号２中の257位のアスパラギン酸残基をアラニンに変化させ 、次の33残基を排除し、そしてその結果エクソン10中にコードされた291位のト レオニンで開始する残りのタンパク質に対してインフレーム融合を生じることが 予測される。 Ｄ．hPS2 転写物 ヒトPS2遺伝子を含むゲノムDNAは、まだ完全には特徴付けされていない。それ にもかかわらず、PS1遺伝子とPS2遺伝子との間の多くの類似性が明らかである。 しかし、両方の遺伝子のイントロン／エクソン境界は、TM6→7ループの領域内を 除いて非常に類似しているかまたは一致しているようである。 ノザンブロットに対するPS2 cDNAクローンのハイブリダイゼーションは、脳の 領域を含む多くの組織において約2.3kbのmRNAのバンド、ならびに筋肉、心筋お よび膵臓における約2.6kbのmRNAのバンドを検出した。PS2は、脳梁を除くほとん どの脳の領域において低レベルで発現し、脳梁では転写が高い。骨格筋、心筋お よび膵臓において、PS2遺伝子は、脳中におけるレベルよりも比較的高レベルで そして約2.3kbおよび約2.6kbの２つの異なる転写物として発現している。両方の 転写物の大きさは、2.7kbのPSI転写物の大きさと明らかに区別されるサイズを有 し、そして高ストリンジェントにおいて、PS1プローブとはクロスハイブリダイ ズしなかった。１つのhPS2対立遺伝子のcDNA配列は配列番号18(受託番号L44577) として同定される。 このPS2 cDNAコンセンサスヌクレオチド配列内の最も長いORFは、最初の相内 のATGコドンから数えて448アミノ酸（配列番号19）を含むポリペプチド（配列番 号18において366〜368位）を予測し、これはKozakコンセンサス配列により取り 囲まれた。停止コドンは、1710〜1712位である。 PS1についてと同様にいくつかの組織（脳および筋肉を含む）のRNA由来のPS2R T-PCR産物の分析は、その中で比較的大きなセグメントがスプライスアウトされ 得る２つのオルタナティブスプライス変異体を明らかにした。従って、比較的低 い頻度で、PS2転写物のヌクレオチド1152〜1250（配列番号18）（配列番号19の 残基263〜295をコードする）がオルタナティブでスプライスされる転写物が産生 される。以下で議論するように、このスプライシング事象は、PS1のエクソン９ のオルタナティブスプライシングに密接に対応する(Rogaevら、1995)。 配列番号18中のヌクレオチド1338〜1340位におけるGAAトリプレットを欠くPS2 cDNA配列のさらなるスプライス変異体がまた、調べた全ての組織において見出 された。このオルタナティブスプライシングは、アミノ酸325位におけるGlu残基 の削除を生じる。 ６．プレセニリンタンパク質の構造 Ａ．プレセニリンタンパク質ファミリー プレセニリンは、多くの無脊椎動物および脊椎動物細胞に存在する推定の構造 ドメインと関連する、共通の構造モチーフ、共通のオルタナティブスプライシン グパターン、および共通の変異領域ホットスポットを有する高度に保存された膜 内在性タンパク質の新規のファミリーとして開示される。HoppおよびWoodsアル ゴリズムを用いるヒトプレセニリン遺伝子の推定アミノ酸配列の分析は、このタ ンパク質が、多岐にわたる膜内在性タンパク質（例えば、レセプター、チャンネ ルタンパク質、または構造膜タンパク質）であることを示唆する。推定上のhPS1 タンパク質のKyte-Doolittleヒドロパシープロットを図２に示す。ヒドロパシー プロットおよび構造分析は、これらのタンパク質が、親水性「ループ」により分 離されるおよそ７つの疎水性膜貫通ドメイン(TM1〜TM7と称する)を有することを 示唆する。他のモデルは、予測アルゴリズムにおいて用いられるパラメーターに 依存して、５つ程度および10個程度の膜貫通ドメインを有すると予測され得る。 しかし、７つの膜貫通ドメインの存在は、G-結合レセプタータンパク質のいくつ かのクラスの特徴であるが、これはまた他のタンパク質（例えば、チャンネルタ ンパク質）で観察されている。認識可能なシグナルペプチドの非存在および少数 のグリコシル化部位は注目すべきである。 hPS1およびmPS1タンパク質のアミノ酸配列を表２において比較し、そしてhPS1 およびhPS2タンパク質の配列を表３で比較する。各図において、同一のアミノ酸 残基を垂直線により示す。７つの推定上の膜貫通ドメインを配列の上または下の 水平線により示す。 このファミリーのメンバー間の主要な差異は、Ｎ末端における親水性、酸性ル ープドメインおよびプレセニリンタンパク質の推定上のTM6およびTM7ドメインの 間（TM6→7ループ）のアミノ酸配列内にある。hPS1エクソン９（これはいくつか の非神経組織においてオルタナティブスプライシングされる）によりコードされ る残基のほとんどは、推定上のTM6→7ループの一部を形成する。さらに、hPS2に おいて同定された対応するオルタナティブスプライシング変異体はTM6→7ループ の一部をコードするようである。この親水性ループの可変スプライシング、およ びこのループのアミノ酸配列がこの遺伝子ファミリーのメンバー間で異なるとい う事実は、このループがタンパク質の重要な機能的ドメインであり、そして個々 のプレセニリンタンパク質の生理学的および病理学的相互作用に対するいくつか の特異性を付与し得ることを示唆する。Ｎ末端の親水性ドメインが、TM6→7親水 性酸ループと同じ酸性電荷を共有し、そして７つの膜貫通ドメインモデルにおい て膜に関して同じ方向を有するようであり、そしてプレセニリン間で変化し得る ので、これらの２つのドメインは、調和しているかまたは独立した様式のいずれ かで機能性（例えば、同一のまたは異なるリガンドあるいは機能的特性）を共有 するようである。従って、Ｎ末端はまた、このタンパク質の重要な機能的ドメイ ンであり、そして個々のプレセニリンタンパク質の生理学的および病理学的相互 作用に対していくつかの特異性を付与し得るようである。 以下に詳述されるように、PS1およびPS2クラスターにおける病理学的変異は、 TM1→2ループおよびTM6→7ループのまわりに存在し、これらのドメインがこれら のタンパク質の機能的ドメインであることをさらに示唆する。図５および図６は 、図面上に示された既知の変異部位とともに、それぞれ、PS1およびPS2遺伝子の 予測される構造の模式図を示す。図面に示されるように、TM1→2結合配列は、Ｎ 末 端およびTM6→7ループのそれに対して膜の反対側に存在することが推定され、そ して膜貫通連絡において重要であり得る。このことは、早発性(30〜40歳)の家族 性ADを有する家系において観察されたPSIY1 15H変異により、そしてループを不 安定化することが予測され得る、TM1/2らせんにおけるさらなる変異により支持 される。TM1→2ループは比較的短く（PS1：残基101〜132；PS2：残基107〜134） 、このことは、これらの配列に従来のペプチド合成をより受け入れ易くしている 。７つのPS1変異領域は、コドン82とコドン146との間の領域に存在し、この領域 はPS1における推定上の第１の膜貫通ドメイン(TM1)、TM1→2ループ、およびTM2 ドメインを含む。同様に、PS2のコドン141における変異もまたTM2ドメインに位 置する。これらの変異は、おそらく、TM1およびTM2におけるTM1→2ループドメイ ンおよびのその固着ポイントを不安定化する。少なくとも12個の異なるPS1変異 は、約コドン246とコドン410との間のアミノ酸の変化を生じ、これらの変異はTM 6、TM6→7ループ、およびTM7ドメインに含まれる。これらの変異は、TM6→7ルー プの構造または安定性を（直接的か、あるいはTM6またはTM7のコンフォメーショ ンを改変することによるかのいずれかで）改変し得る。 TM6→7ループに存在する重要な機能的役割に関するさらなる証拠は、プレセニ リンタンパク質ファミリーの異なるメンバー間のTM6→7ループの中央部分（おお よそアミノ酸300〜371）における配列相違である。同様に、プレセニリンタンパ ク質ファミリーのメンバーのＮ末端配列もまた互いに異なるので、わずかに異な る配列が各々の異なるプレセニリンタンパク質の機能に特異性を付与する役割を 果たし、一方、保存された配列が共通の生物学的活性を付与するようである。こ れらの領域はリガンド結合部位を表し得る。そうである場合には、TM6→7領域中 の変異は、リガンド結合活性を改変するようである。プレセニリンタンパク質フ ァミリーの異なるメンバー間で保存されているTM1→2ループは、おそらく、反対 の膜面上のエフェクタードメインを表す。エクソン10スプライシング変異を除い て、他の（ミスセンス）変異のほとんどは、推定上の膜貫通ヘリックスの同じ表 面上に整列する。このことは、それらがリガンド結合またはチャンネル機能に影 響し得ることを示唆する。従って、これらのドメイン（例えば、TM6→7ループお よびTM1→2ループ）は、変異の効果を阻害し、そして／またはアルツハイマー病 を有する被験体においてプレセニリンタンパク質の正常機能を回復させる特異的 結合因子を開発するための部位として用いられ得る。 C.elegansSPE-4遺伝子の推定上の産物とPS1遺伝子の推定上の産物との間の類 似性は、これらが類似した活性を有し得ることを暗示している。SPE-4タンパク 質は、精子発生の間の線維体-膜オルガネラ(FBMO)複合体の形成および安定化に 関与するようである。FBMOは特定化されたゴルジ由来オルガネラであり、平行し たタンパク質線維の複合体に接着し、そしてこれを部分的に取り囲む膜結合小胞 からなり、そして可溶性ポリペプチドおよび膜結合ポリペプチドの輸送および貯 蔵に関与し得る。SPE-4における変異はFBMO複合体を解離させ、そして精子発生 を停止させる。従って、SPE-4の病理学的機能は、膜内在出芽（budding）と融合 事象との間の相互作用を安定化するか、または精子発生の間のFBMO複合体の細胞 内輸送の間に膜タンパク質と線維性タンパク質との間の相互作用を安定化するか のいずれかであり得る。匹敵する機能が、プレセニリンについて予想され得る。 例えば、PS1は、βAPPのような他の膜結合タンパク質のドッキング、または（例 えば、ゴルジ器官またはエンドソーム−リソソーム系における）タンパク質輸送 の間の膜結合小胞の軸索輸送および融合出芽のいずれかに関与し得る。これらの 仮説が正しい場合、変異は、βAPPの異常な輸送およびプロセシングならびに／ または微小管会合タンパク質Tauのような細胞骨格タンパク質との異常な相互作 用を生じることが予測され得る。βAPPおよびTauの両方の細胞内および細胞外配 置における異常性は、実際、アルツハイマー病の神経病理学的特徴の必要不可欠 な部分である。推定上のタンパク質の保存されたドメイン内の高度に保存された 残基におけるPS1およびPS2変異の位置は、これらが病原性であることを示唆して いるが、これらの変異のうちの少なくとも３つはそれら自身保存的であり、この ことは成体生物における疾患の発症に対応する。発現または機能の完全な欠損を 生じることが期待される欠失またはナンセンス変異は今日まで観察されていない で、本発明者らは、これらの変異が優性な機能獲得効果（gain-of−function ef fect）を有し、従って、βAPPの異常なプロセシングまたは正常なβAPPプロセシ ングの停止を生じる優性な機能喪失効果（loss-of-function effect）を促進す るかどうかを予測し得ない。エクソン10スプライシング変異は、エクソン９から エクソン10へのインフレーム融合を引き起こし、そして細胞内標的化またはリガ ンド結合を改変し得るPS1タンパク質における構造的効果を有し得るか、そうで なければPS1機能に影響し得る。 別の可能性は、PS1遺伝子産物がレセプターまたはチャンネルタンパク質を表 し得るということである。このようなタンパク質の変異は、脊椎動物（例えば、 ヒトにおける悪性高熱、高カリウム血性周期性麻痺）および無脊椎動物細胞（C. elegans におけるdeg-l(d)変異）の両方におけるいくつかの他の神経学的疾患に 原因として関連する。これらの他の優性疾患の病理はアルツハイマー病の病理と は類似していないが、アルツハイマー病おいてイオンチャンネルの機能性異常に 関する証拠がある。例えば、テトラエチルアンモニウム感受性113pSカリウムチ ャンネルおよびカルシウムホメオスタシスにおける異常が報告されている。PS1 と電位依存性カルシウムチャンネルのα-IDサブユニットとの間の弱い相同性、 および培養細胞における細胞内カルシウムの増大がアルツハイマー病の生化学的 特徴のいくつか（例えば、Tau微小管結合タンパク質のリン酸化における改変お よびAβペプチドの増加した産生）を複製し得るという観察から、膜貫通カルシ ウムフラックスにおける混乱が特に関連し得る。 Ｂ．hPS1 構造 配列番号２に示すように、ヒトPS1タンパク質の最も大きい既知の形態は467ア ミノ酸を含有し、そして約51.37kDaの推定分子量を有する。上述のエクソン４の オルタナティブスプライシング（配列番号２の26〜29位に対応する残基が欠失さ れる）を有する変異体は、アミノ酸が４個少なく、そして約50.93kDaの分子量を 有する。同様に、上述のエクソン９のオルタナティブスプライシング（配列番号 ２の258〜290位に対応する残基が欠失される）を有する変異体は、アミノ酸が33 個少なく、そして約47.74kDaの分子量を有する。 推定上のドメインの位置を表４に示す。残基位置の番号付けは配列番号２に関 し、そしておおよそ（すなわち、±２残基）であることにさらに留意されたい。 推定上のPS1構造の模式図を図３に示す。Ｎ末端はいくつかの潜在的なリン酸 化ドメインを有する、高度に親水性の負に荷電したドメインであり、その後に順 番に、約19残基の疎水性膜貫通ドメイン(TM1)、約32残基の荷電した親水性ルー プ（TM1→2）、短い（1〜15残基）親水性ドメイン（TM2→3からTM5→6）が点在 する５つのさらなる疎水性膜貫通ドメイン（TM2からTM6）、さらなるより大きな 酸性親水性荷電ループ（TM6→7）、および少なくとも１つ（TM7）、おそらくは ２つの他の疎水性の潜在的膜貫通ドメインが続き、Ｃ末端の極性ドメインに達す る。 このタンパク質はまた、多数の潜在的なリン酸化部位を含有する。そのうちの １つはMAPキナーゼコンセンサス部位であり、この部位はまた、神経原線維濃縮 体への正常Tauの変換の間のTauのリン酸化過剰に関与する。このコンセンサス配 列は、アルツハイマー病の他の生化学的局面にこのタンパク質の活性と連結した 推定上のエレメントを提供し得、そして有望な治療的標的を表す。タンパク質構 造の検閲により、MAPキナーゼコンセンサス配列である5/T-Pモチーフを表すYTPF （残基115〜118、配列番号２）およびSTPE（残基353〜356、配列番号２）の２つ の配列が示される。いくつかの他のリン酸化部位は、プロテインキナーゼＣ(PKC )活性に対するコンセンサス配列とともに存在する。PKC活性がアルツハイマー病 に関連するAPPの代謝における差異と関連するので、PS1タンパク質およびそのホ モログ上のこれらの部位はまた、標的化療法のための部位である。予備的な証拠 により、少なくともトランスフェクトされた細胞において、PS1タンパク質は微 少な程度しかリン酸化されず、一方、PS2タンパク質は有意にリン酸化されるこ とが示されている。少なくともPS2については、このリン酸化は、PKCに関与しな い機構によりＮ末端ドメインのセリン残基上で起こるようである(Capellら、199 6)。 エクソン４の末端におけるオルタナティブスプライシングは、親水性Ｎ末端ド メインから４個のアミノ酸を除去し、そしてリン酸化コンセンサス配列を除去す ることが予期されることに留意されたい。さらに、エクソン９のオルタナティブ スプライシングは、短縮されたイソ型のPS1タンパク質を生じる。ここで、TM6の Ｃ末端の５つの疎水性残基、およびTM6に対して直ぐＣ末端の親水性の負に荷電 したTM6→7ループの一部は欠けている。このオルタナティブスプライシングされ たイソ型は、Ｎ末端から配列番号２の256位におけるチロシンまでそしてこのチ ロシンを含む配列の保存、257位のアスパラギン酸のアラニンへの変化、および このタンパク質のチロシン291から（そしてそれを含む）Ｃ末端への配列のスプ ライシングによって特徴付けられる。このようなスプライシングの差異は、しば しばタンパク質の重要な機能的ドメインに関連する。このことは、この親水性ル ープ（従って、類似のアミノ酸電荷を有するＮ末端親水性ループ）がPS1産物の 活性な機能的ドメインであり、従って治療的標的化のための部位であることを示 している。 Ｃ．hPS2 構造 ヒトPS1とPS2タンパク質は全アミノ酸にわたって63％の同一性を示し、そして いくつかのドメインは事実上完全に同一であることを示している。従って、期待 されるように、疎水性分析は、両方のタンパク質がまた同様の構造的機構を共有 することを示唆する。従って、両方のタンパク質は７つの疎水性の推定上の膜貫 通ドメインを有することが予測され、そして両方のタンパク質はＮ末端およびTM 6とTM7との間に大きな酸性の親水性ドメインを有する。さらなる類似性が、脳お よび筋肉RNA由来のRT-PCR産物の上記の分析から明らかであり、これはPS2転写物 のヌクレオチド1153〜1250がオルタナティブスプライシングされることを明らか にした。これらのヌクレオチドはアミノ酸263〜296をコードし、これらのアミノ 酸は、推定上のPS2タンパク質のTM6→7ループドメイン内に位置し、そしてPs1中 のオルタナティブスプライシングされたアミノ酸257〜290と94％の配列同一性を 共有する。 hPS2タンパク質の推定上の機能的ドメインの位置を表５に記載する。残基位置 は配列番号19の残基位置を参照し、そしてその位はおおよそである（すなわち、 ±２残基）であることに留意されたい。 推定のPS2構造の模式図を図４に示す。hPS1とhPS2との間の類似性は、PS1タン パク質のTM1とTM6との間およびTM7からＣ末端までの間隔に対応するタンパク質 のいくつかのドメインにおいて最も大きい。PS1とPS2との主要な差異は、負に荷 電した親水性TM6→7ループのサイズおよびアミノ酸配列、ならびにＮ末端の親水 性ドメインの配列にある。 ２つの予測されるアミノ酸配列間の最も顕著な差異は、TM6→7親水性ループ（ hPS1の残基304〜374；hPS2の残基310〜355）の中心部分のアミノ酸配列内、そし てＮ末端の親水性ドメイン内に現れる。類推により、このドメインはまた、マウ スPS1遺伝子とヒトPS1遺伝子との間で高度には保存されておらず（同一性＝47/6 0残基）、そしてSPE-4の相当する領域に対してなんら類似性を示さない。 ７．プレセニリン変異体 Ａ．PS1 変異体 PS1遺伝子内のいくつかの変異が同定されており、これらは重篤なタイプの家 族性アルツハイマー病を引き起こす。これらの変異の１つまたは組み合わせは、 この型のアルツハイマー病ならびにいくつかの他の神経学的疾患の原因であり得 る。これらの変異は、予想されるアミノ酸配列中の変異を導くか、あるいは異常 な転写物プロセシング、レベル、または安定性を導くヌクレオチド配列の置換、 挿入、または欠損の任意の形態であり得る。ヌクレオチドの形態における変異お よび／またはアミノ酸欠損あるいは置換を引き起こす特異的な疾患が以下に記載 されるが、さらなる変異が他のファミリーで見出されることが予測される。実際 、８つの異なる家系間の５つの異なるミスセンス変異の最初の発見（Sherringto nら、1995）の後、他の遺伝病（例えば、Ca2+スーパーオキシドジスムターゼ遺 伝子中の変異と関連する筋萎縮性外側硬化症）での実験から、さらなる変異が同 定されることが予測された。この予測は、プレセニリン中のさらなる変異の本発 明者らの引き続く発見（Rogaevら、1995）により、そして他者による同様の観察 （例えば、Crutsら(1995)Hum.Molec.Genet ．4:2363-2371；Campionら(1995)Hum. Molec.Genet ． 4:2373-2377）により実現されている。従って、PS1遺伝子および タンパク質に関して本明細書中で用いられるように、用語「変異体」はこれらの 特定の変異体に限定されるよりは、むしろ上記で規定されたように解釈されるべ きである。 第14染色体に連鎖した６つの大きな家系の発症したメンバーから単離された2. 8kbのS182転写物にわたるオーバーラップRT-PCR産物の直接的な配列決定は、最 初に、６つの家系の各々における５つのミスセンス変異の発見を導いた。これら の各変異は、それぞれの家系における疾患とともに同時分離され、そしてFAD家 系と同じ民族起源から抜き出された142人以上の無関係な神経学的に正常な被験 体（284個の無関係な染色体）には存在していなかった。AD3形質とともに分離す る物理的間隔内のこの遺伝子の位置、第14染色体に最終的に連鎖した６つの家系 における疾患形質とともに同時分離する８つの異なるミスセンス変異の存在、お よび284人の個体の正常な染色体におけるこれらの変異の非存在は、PS1遺伝子が AD3座位であるということを累積的に確認する。この仮説に対するさらなる生物 学的な支持は、FAD家系における変異した残基が進化において保存されている（ 例えば、hPS1 v.mPS1）という事実、それらの変異がまた、他の脊椎動物および 非脊椎動物ホモログにおいて高度に保存されているタンパク質のドメインに位置 するという事実、およびPS1遺伝子産物が脳のほとんどの領域（ADが最も重篤に 発症した領域を含む）において高レベルで発現しているという事実から生じる。 PS1遺伝子の最初の発見以来、ADの発生に関連した多くのさらなる変異がカタ ログに加えられている。表６は多数のこれらを特徴付ける。各々の観察されたヌ クレオチド欠損または置換は、PS1転写物の推定上のORF内に生じ、そして示され た位置でコードされたアミノ酸を変化させることが予想された。それらの変異は 、配列番号１中のそのヌクレオチド位置に関して、そして配列番号２中のそのア ミノ酸位置に関して列挙される。「NA」の記入は、データが入手可能でなかった ことを示す。次の節で議論されるように、多くのPS2変異がまた見出されている 。hPS1配列とhPS2配列との比較は、図４に示され、そしてこれらの病理学的変異 が、PS1タンパク質内に保存されているPS2タンパク質の領域内にあることを示す 。それ故、PS1タンパク質内の対応する変異はまた、病理学的であることが予測 され得、そして本明細書中で提供され、そして可能にされたPS1変異体中に含ま れる。さらに、プレセニリン遺伝子の任意の保存された領域において同定される 任意の病理学的変異は、その保存された領域を共有する他のプレセニリンの変異 体を表すことが想像され得る。 興味深いことに、変異A260V、C263R、P264L、P267S、E280A、E280G、A285V、L 286V、Δ291-319、G384A、L392V、およびC410Yはすべて、推定上の膜貫通ドメイ ンであるTM6とTM7との間の酸性親水性ループ中またはその近傍に生じる。これら の変異のうち８つ（A260V、C263R、P264L、P267S、E280A、E280G、A285V、L286V ）はまた、オルタナティブスプライシングドメイン（配列番号２の残基257〜290 ）中に位置する。 これらすべての変異は、成熟mRNA/cDNA配列またはゲノムDNAを提示するRT-PCR 産物を用いて、種々のストラテジー（直接的ヌクレオチド配列決定、対立遣伝子 特異的オリゴヌクレオチド、連結ポリメラーゼ連鎖反応、SSCP、RFLP、新規の「 DNAクリップ」技術など）によりアッセイされ得る。 Ｂ．PS2 変異体 PS1遺伝子産物とPS2遺伝子産物との間の強い類似性は、PS2遺伝子が、第14染 色体、第19染色体、および第21染色体を排除した遺伝的連鎖研究において、いく つかの週数の初期発病型のAD家系中における、疾患を引き起こす変異の部位であ り得る可能性を生じた。RT-PCRを用いて、βAPPおよびPS1遺伝子における変異が 直接配列決定研究によりすでに排除されている、初期発病型FADを有する８つの 家系の発症したメンバーの、リンパ芽球、線維芽細胞、または死後の脳組織由来 のPS2転写物に対応するcDNAが単離された。 これらのRT-PCR産物の調査により、初期発病型の、病理学的に確認されたFAD （50〜70歳で発病）を有するイタリア人起源(Flo10)の拡張した家系のすべての ４つの発症したメンバー中のヌクレオチド1080におけるヘテロ接合のA→G置換が 検出された。この変異はTM5中のコドン239におけるMet→Valミスセンス変異を引 き起こすことが予測される。 TM2中のコドン141におけるAsn→Ile置換を引き起こす第２の変異（ヌクレオチ ド787におけるA→T）が、Volga German祖先(細胞株AG09369、AG09907、AG09952 、およびAG09905、Coriell Institute、Camden NJで示される)の関連家系の群の 発症したメンバー中に見出された。意味ありげに、１つの被験体(AG09907)はこ の変異に対してホモ接合であった。観察はこれらの家系の近交系の性質と矛盾し ない。意味ありげに、この被験体はN141I変異体に対してヘテロ接合である被験 体の臨床像と顕著に異なる臨床像を有さなかった。いずれのPS2遺伝子変異も284 人の正常白色人種コントロールには見出されず、これらはADのAD3型を有する家 系 の発症したメンバー中にも存在しない。 これらのPS2変異の両方は、PS1/PS2遺伝子ファミリー内に高度に保存されてい る残基の置換を引き起こすことが予測される。 さらなるPS2変異は1624塩基対におけるT→C置換により引き起こされ、これは Ｃ末端のコドン420におけるIleからThrへの置換を引き起こす。この変異は初期 発病型(45歳)家族性ADのさらなるケースにおいて見出された。 これらのhPS2変異を、配列番号18中のそれらのヌクレオチド位置に関して、そ して配列番号19中のそれらのアミノ酸位置に関して、表５中に列挙する。表中の 「NA」の記述は、そのデータが入手不可能であったことを示す。前のセクション で議論したように、多くのPS1変異がまた見出されている。hPS1配列とhPS2配列 との比較を図４に示し、そしてこれらの病理学的変異はPS1タンパク質のPS2タン パク質中で大いに保存されている領域中に存在することを明らかにする。従って 、PS2タンパク質中の対応する変異もまた病理学的であることが予測され得、そ して本明細書中に提供され、かつ実施可能であるPS2変異体中に含まれ得る。さ らに、プレセニリン遺伝子の任意の保存された領域において同定された任意の病 理学的変異は、この保存された領域を共有する他のプレセニリンの変異体を表す ことが予測され得る。 その産物が、PS1遺伝子産物と実質的なアミノ酸類似性および構造類似性を共 有することが予測される遺伝子の発見は、これらのタンパク質が重複する機能に ついて無関係なタンパク質として機能的に関与し得るが、多量体のポリペプチド の物理的に会合したサブユニットとして、または同じ経路において連続的な機能 を行う無関係なタンパク質として、おそらくわずかに異なる特定の活性を有する ことを示唆する。 ADの家族型を有する被験体中のPS2タンパク質の保存されたドメインにおける ３つの異なるミスセンス変異の観察は、これらの変異が、PS1遺伝子中の変異と 同様にADの原因となることを示す。この結論は重要である。なぜなら、PS1遺伝 子中の変異に関連する疾患表現型（30〜50歳で発病、持続期間10年）がPS2遺伝 子中の変異に関連する疾患表現型（40〜70歳で発病、持続期間20年まで）と微妙 に異なるので、一般的な類似性は、この遺伝子ファミリーのメンバーにより包含 される生化学的経路が少なくとも初期発病型ADの発生の中心であることを明確に 主張する。疾患表現型における微妙な差異は、CNS中のPS2転写物の低レベルの発 現を反映し得るか、またはPS2遺伝子産物に対する異なる役割を反映し得る。 PS1変異の効果に対する類似により、変異した場合のPS2は、APP(アミロイド前 駆体タンパク質)からAβペプチドへの異常なプロセシング、Tau微小管結合タン パク質の高リン酸化、および細胞内カルシウムホメオスタシスの異常性を引き起 こし得る。これらの異常な相互作用の妨害は、ADにおける治療的介入を提供する 。 最終的に、少なくとも１つのヌクレオチド多型は、コードされたアミノ酸配列 中にいかなる変異も伴わないで、そのPS2 cDNAが配列番号18の626 bpでT→C変化 を有する、ある正常な個体において見出されている。 ８．プレセニリンプロセシングおよび相互作用 本明細書中に開示された抗体およびタンパク質結合アッセイを用いて、正常プ レセニリンおよび変異プレセニリンの両方のプロセシングおよびタンパク質−タ ンパク質相互作用を調べた。プレセニリンにおける変異が、細胞内プロセシング （例えば、タンパク質内分解切断、ユビキチン結合、およびクリアランス）、お よびヒト脳で発現された他のタンパク質との細胞内相互作用において劇的な変化 に至ることが見出された。以下に記載のように、プレセニリンプロセシングおよ び相互作用の知識、ならびに、特に、変異プレセニリンのプロセシングおよび相 互作用における変化の知識は、アルツハイマー病および関連疾患のための新たな 診断標的および治療標的を提供する。 ウエスタンブロット分析は、正常プレセニリンがタンパク質分解切断を受けて 、特徴的なＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントを生じることを示唆す る。上述のように、正常プレセニリンタンパク質は、mRNAスプライスの変化に一 部依存して、47〜51kDaの予期された分子量を有する。しかし、ウエスタンブロ ットの分析は、正常プレセニリンタンパク質がタンパク質分解切断を受けて、約 35kDaのＮ末端フラグメントおよび約18kDaのＣ末端フラグメントを生じることを 示唆する。特に、Ｎ末端のPS1特異的残基１〜25を認識する抗体（「14.2」）を 用いた、野生型ネイティブヒト線維芽細胞、コントロール被験体由来のヒト新皮 質脳 組織、ならびに非トランスジェニックマウスおよびPS1トランスジェニックマウ ス由来の新皮質脳組織からの溶解物を有するウエスタンブロットにより、約35kD aの強い免疫反応性バンド、およびより長く曝露すると約45kDaのより弱いバンド （おそらく完全長PS1タンパク質を表す）の存在が明らかになる。PS1のTM６→７ ループの尖部の残基304〜318に対する抗体（「520」）、およびPS1のＣ末端の残 基457〜467に対する抗体（「4627」）は共に、約18kDaの同じ強いバンドを認識 する。抗体520はまた、14.2により検出されたPS1バンドと一致する45kDaの弱い バンドも認識する。これらの所見は、タンパク質内分解切断事象が、PS1のエキ ソン９および10の接合部近傍で生じることを示唆する。PS1トランスフェクトヒ ト胎児腎臓細胞（HEK293）由来の主要Ｃ末端フラグメントの配列決定は、主要な タンパク質内分解切断が、TM６→７ループの基部においてM298の近傍で生じるこ とを示した。これらの細胞における完全長PS1は迅速に代謝回転される（ｔ1/2＜ 60分）。 プレセニリンタンパク質の変異がそれらのタンパク質分解切断の変化を生じる か否かを決定するために、正常被験体およびPS1変異を有する被験体由来の線維 芽細胞および新皮質脳ホモジネートの溶解物を含むウエスタンブロットを、比較 した。正常条件下では、プレセニリン（PS1、PS2）は、別個のＮ末端フラグメン トおよびＣ末端フラグメントの形成を生じるタンパク質内分解切断を受ける。プ レセニリン-1（PS1）はMet298の近傍で切断され、約33,350ダルトンのＮ末端フ ラグメントおよび19,000ダルトンのＣ末端フラグメントを生じる。 キャリアおよび正常間の劇的な差異が、PS1のA246EまたはC410Y変異（それぞ れ、TM6およびTM7に位置する）のいずれかのAD罹患ヘテロ接合型キャリア由来の 側頭部新皮質のホモジネートにおいて検出された。ヘテロ接合体において、完全 長PS1タンパク質に対応しない約40〜42kDaの強い免疫反応性ダブレットが検出さ れた。対照的に、線維芽細胞では、40〜42のダブレットは観察されず、そしてPS 1変異のヘテロ接合型キャリア由来の溶解物を正常ホモ接合体と比較した場合、 約30ダルトンの正常切断産物の相対的強度において明らかな差異はなかった。 PS1関連家族性ADのいくつかの症例および散発性AD症例からの脳抽出物の検査 により、図５に見られるように、正常分子量より高いさらなるＮ末端切断産物の 存在が明らかになった。これらのAD関連バンドは、40〜42kDaで生じるＮ末端反 応種である。これは、カスパーゼ(caspase)-3タンパク質分解の結果であり得る か、またはそれらは、従来のフラグメントの部分的なユビキチン結合、および失 敗したプロテアソーム分解から生じ得る。カスパーゼ切断部位は、Asp345または その近傍であると提唱されている。この部位は、AD症例において観察されたフラ グメントの見かけ分子量に密に相当する39,395ダルトンのＮ末端フラグメントを 生じ得る（正確な分子量からのわずかな変動は、おそらく、ゲル電気泳動による 分離がタンパク質サイズにもっぱら依存するわけではないという事実に起因する ）。コントロールおよびPS1変異を有する個体から採取した生検サンプルから増 殖した線維芽細胞培養物からの抽出物の検査は、正常切断産物のみを示した。こ のことは、別のフラグメントが脳特異的であり得ることを示す。この示唆は、こ れらのバンドの生成に至る生化学的プロセス（および／またはバンドそれ自体） が診断的に有用であり、そしてPS1の正常なプロセシングの欠損を示し得、従っ て、可能な治療標的を表し得るということである。 プレセニリンに結合するかそうでなければプレセニリンと相互作用するタンパ ク質を同定するために、以下（実施例１５）に記載のように、酵母ツーハイブリ ッド系を用いた。特に、TM６→７ループドメインにおける変異がADの原因である ことは知られているので、酵母ツーハイブリッド系を用いて、正常プレセニリン TM６→７ループドメインと相互作用する細胞タンパク質を同定した。簡単にいえ ば、TM６→７ループ（すなわち、PS1の残基266〜409）をコードするcDNA配列を 、pAS2−1酵母発現プラスミドベクター（Clontech）中のGAL４ DNA結合ドメイン にインフレームで連結した。次いで、このプラスミドを、GAL4活性化ドメインを 有するpACT2酵母発現ベクター（Clontech）に連結したヒト脳cDNAのライブラリ ーと共に、S ．cerevisiae Y190株に同時形質転換した。適切な選択後、正常プレ セニリンTM６→７ドメインと相互作用するペプチドをコードするヒト脳cDNAを有 する多数のクローンを回収し、そして配列決定した。プレセニリン相互作用がTM ６→７ループ内のAD関連変異により改変されるか否かを決定するために、酵母ツ ーハイブリッド系を再度、L286V、L392V、およびエキソン10スプライシング変異 体を含有するTM６→７ループペプチドと共に用いた。これらの変異構築物を「ベ イ ト（bait）」として使用して、脳cDNA：GAL4活性化ドメインライブラリーを再ス クリーニングしたとき、正常プレセニリンと相互作用する、脳cDNA配列の全てで はないがいくらかが回収された。さらに、変異体と相互作用するが正常プレセニ リンとは相互作用しない、いくつかの新しいクローンが同定された。最も高いプ レセニリン親和性を有するプレセニリン相互作用タンパク質に相当するクローン を、実施例１５および以下に記載する。 ２つの重複クローンが、抗分泌性因子（「ASF」）または26Sプロテアソームの 複ユビキチン鎖結合性S5aサブユニット（「S5a」）としてもまた知られるヒトタ ンパク質の一部を表すと同定されている。これらのクローン（合わせてS5aの残 基70〜377を含む）は、正常プレセニリンTM６→７ループドメインと相互作用す るが、試験した２つのTM６→７ループドメイン変異体（L286V、L392V）とわずか に弱く相互作用するだけであることが示された。PS1：S5a相互作用を免疫共沈降 研究により確認し、そして免疫細胞化学研究により、S5aおよびPS1は、連続した 細胞内ドメイン（例えば、ゴルジおよびER）で発現されることが示された。 PS1とプロテアソームとの間の相互作用は、いくつかの可能な機構を通じてア ルツハイマー病（AD）の病原に関連し得た。第１に、ほとんどの哺乳動物細胞は 、非常に低いレベルのPS1ホロタンパク質を維持するようである。これについて の著しい例外は、PS1 Δ290−319スプライシング変異を発現する細胞である。こ の変異は、タンパク質内分解切断されず、従って容易に検出可能な変異PS1ホロ タンパク質を生じる。少なくともΔ290−319スプライシング変異の場合、変異PS 1ホロタンパク質の蓄積、すなわち35kDa Ｎ末端フラグメントおよび18kDa Ｃ末 端フラグメントを生じないことが、ADを引き起こすに十分であるようである。従 って、変異PS1ホロタンパク質の代謝回転における非常にわずかな変化でさえも 、有意な病理学的影響を有する可能性がある。このように、プレセニリンまたは S５aのいずれかの変異（これは、哺乳動物CNSにおけるPS1：S5a相互作用を混乱 させる）が、プレセニリンホロタンパク質の異常なプロセシングを引き起こし得 、そしてADを引き起こし得る。従って、プレセニリンタンパク質分解経路の調整 は、変異ホロタンパク質の除去を増強するように治療的に適用され得る。 PSIと26SプロテアソームのS5aサブユニットとの間の可能性のあるインビボで の関係を評価するために、本発明者らは、PS1代謝に対するプロテアソームイン ヒビターの影響を調べた。新生児ラット海馬および結腸ガン（CaCo2）細胞（PS1 およびPS2の両方を高レベルで発現する）の短期器官培養物に、特異的可逆性プ ロテアソームインヒビターであるN-アセチル-ロイシニル-ロイシニル-ノルロイ シニル-H（LLnL）（Rockら（1994）Cell 78:761-771）、または特異的不可逆性 プロテアソームインヒビターであるラクタシスチン(lactacystin)（Fenteanyら 、1995）のいずれかを投与した。両薬剤とも、PS1ホロタンパク質の定常状態レ ベルの増大を引き起こした。また、両薬剤とも、約15分から約35分まで、海馬切 片におけるパルスチェイス実験において、PS1ホロタンパク質の半減期を延長し た。上述のように、PS1ホロタンパク質は、正常細胞において迅速に代謝回転さ れるようである。しかし、代謝標識の４時間後でさえ、両プロテアソームインヒ ビターはいずれも、35kDaのＮ末端PS1フラグメントのレベルに影響せず、そして 新規な種の出現も生じなかった。これらの研究は、PS1ホロタンパク質の大部分 が、いくつかの他の膜内タンパク質（例えば、Sec61およびCFTR）と同様な様式 で、迅速なプロテアソーム依存性経路を介して直接代謝されることを示唆する。 他方で、約35kDaおよび約18kDaの末端フラグメントはプロテアソームインヒビタ ーの存在下でなお生成されるので、PS1のこのタンパク質内分解切断は、おそら くプロテアソーム経路によって媒介されない。従って、少なくとも２つのタンパ ク質分解経路が、PS1ホロタンパク質に対して作用しているようである。 PS1とS5aとが哺乳動物細胞内で相互作用することは、c-mycエピトープでタグ 化された野生型ヒトPS1および／またはS5aで一過的にトランスフェクトされたHE K293細胞における免疫共沈研究により強く支持される。これらの実験は、myc-S5 aが、二重トランスフェクト細胞に由来するPS1のみと特異的に免疫共沈し得るこ とを確認する。この相互作用は、膜溶解性架橋剤DSPの使用により安定化された が、これは、その不在下でも弱くではあるが検出可能であり、そしていくつかの 独立した抗PS1抗体を用いて再現され得た。免疫細胞化学研究は、この相互作用 が生理的環境下で生じ得るという考えに、さらなる証拠を加える。このように、 PS1タンパク質およびS5aタンパク質は共に、マウス小脳、新皮質、および海馬の ニューロン内に提示される（Leeら（1996）J．Neurosci．16、7513-7525）。さ らに、これらのタンパク質は、ネイティブな線維芽細胞において連続した細胞内 区画で発現される。S5aは核周囲細胞質内に主に局在する（示さず）。ここでは 、S5aは、ゴルジマーカーp58と、そしてより弱い程度ではあるがERのマーカーと 重複する。PS1はまた、ER、ゴルジ、および原形質小胞において発現される（Wal terら(1996)Molec.Medicine 2，673-691）。まとめると、これらの研究は、PS1 とS5aとの間の生理学的相互作用の存在を強く支持する。 PS1260-409ループ内のFAD関連変異がこの相互作用を改変するか否かを決定す るために、本発明者らは、酵母ツーハイブリッド相互作用アッセイを使用して、 S5a（GAL4-DNA活性化ドメイン融合構築物として発現）と変異または野生型PS126 0-409 ループタンパク質（GAL4-DNA結合性ドメイン（GBD）融合構築物として発現 ）との間の親和性を比較した。S5aとLeu286ValおよびLeu392Val変異PS1260-409 ループとの相互作用は、野生型PS1260-409ループと比較して有意に減少した（ｐ ＜0.05）。これらの差異は、変異PS1260-409-GBD mRNAまたは融合タンパク質が 不安定であることに起因しなかった。なぜなら、等量の野生型または変異PS1260 -409 /GBD融合タンパク質が、形質転換酵母細胞に存在したからである。PS1260-4 09 ループにおける臨床的に関連した単一疎水性残基置換によるPS1：S5a相互作用 の破壊は、ユビキチンにおいて匹敵する変異（例えば、Leu8Ala、Il3rrAla、ま たはVal70Ala）により引き起こされるS5a：ユビキチン相互作用の破壊に類似し ている（Beal、Deveraux、Xia、RechsteinerおよびPickart(1966)Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 93，861-866）。本発明者らの研究は、他のドメインにおける変異がP S1：S5a相互作用に影響を与えるか否か、またはどのように影響を与え得るかを 述べていない。しかし、それらは、PS1のコンホメーションを変化させ得るか、 またはPS1：S5a相互作用の上流または下流の他の生化学的事象に影響を及ぼし得 ると考えられ得る。 PS1：S5a相互作用は、PS1ホロタンパク質の分解におけるプロテアソームの既 知の関与を単に反映し得る（Fraserら(1997)Neurobiol.Aging（印刷中））。し かし、２つの所見は、これが唯一の説明ではないようであることを示唆している 。第一に、ユビキチン結合PS1は、S5aもまた含む抗PS1免疫沈降物において検出 可能ではなかった（データは示さず）。この結果、相互作用は、プロテアソーム 分解について標的されたユビキチン結合PS1へのS5aの結合を単に反映するわけで は ないようである。第二に、他のプロテアソームサブユニットはいずれも、酵母ツ ーハイブリッドアッセイにおいて同定されなかった。PS1：S5a相互作用について の別の説明は、相互作用によりPS1がS5aの活性を改変させ得るということである 。S5aの活性の全てが知られているわけではない（Johansson、Lonnroth、Lange 、JonsonおよびJennishe(1995)J.Biol.Chem．270，20615-20620）。しかし、S.c erevisiae(Mcbl)およびArabiodopsis（Mbpl）におけるS5aおよびその進化ホモロ グが、調節されたタンパク質プロセシングに関与しているという強い証拠がある 。従って、Mcblの欠失変異体により、McblおよびS5aが、選択されたタンパク質 のプロテアソーム分解を調節することにおいてのみ役割を果たすことが明らかに なる（van Nockerら(1996)Molec.Cell Biol．16，6020-6028）。さらに、かなり の割合の細胞性S5a/Mbplが、プロテアソームのない状態で存在し、そして過剰な 遊離Mbplが、インビトロでプロテアソーム機能を阻害する（Deveraux、van Nock er、Mahaffey、VierstraおよびRechsteiner(1995)J.Biol.Chem．270，29660-296 63）。従って、いくつかのPS1変異により引き起こされたPS1：S5a相互作用の低 下は、プロテアソームの調節不全および選択されたプロテアソーム基質のミスプ ロセシングに至り得る。 ADにおける欠陥プロテアソーム媒介分解についての間接的な証拠は、以下から 明らかになる：１）AD脳におけるユビキチン結合タンパク質の広範な蓄積(Kudo 、Iqpal、Ravid、SwaabおよびGrundke-Iqpal（1994）Brain Reserach 639，1-7) (Morishima-KawashimaおよびIhara(Springer-Verlag，Berlin，1995)Alzheimer' s Diseases：lessons from cell biology（Kosik、Chrinsten,Y.およびSelkoe,D .J.編）；２）AD神経病因の免疫反応性成分としてのプロテアソームサブユニッ トの発見（Fergussonら（1996）Neurosci.Letts．219，167-170）；および３） プロテアソームがβAPPを部分的に分解し得るがAβを分解し得ないことを示唆す るインビトロ実験(Gregori、BhasinおよびGoldgaber（1994）Biochem.Biophys.R es.Comm．203，1731−1738)(GoldgaberおよびGregori(1996)Neurobiol.Aging 17 ，A763 pgS189)(Klafki、Abramowski、Swoboda、PaganettiおよびStafenbiel（1 996）Biol.Chem．271，28655-28659)(Marambaud、WilkおよびChecler（1996）J. Neurochem．67，2616-2619)。PSI：S5a相互作用とβAPPプロセシングとの間の可 能性 のある関連を調べるために、本発明者らは、野生型ヒトβAPP695で安定にトラン スフェクトしたHEK293細胞株におけるβAPPプロセシングに対するプロテアソー ムインヒビターの影響を検査した。これらの薬剤は、βAPP転写も細胞生存性も 変化させなかった（データは示さず）。しかし、βAPPプロセシングの有意な変 化が、LLnLまたはラクタシスチンのいずれかで処理した細胞において検出された （示さず）。このように、プロテアソームインヒビターは、細胞内の10kDa Ｃ末 端βAPPセクレターゼフラグメントおよびＮグリコシル化未成熟βAPPの有意な蓄 積を引き起こしたが、成熟Ｎ-／Ｏ-グリコシル化βAPPについては、よりずっと 小さな増加しか引き起こさなかった。LLnLおよびラクタシスチンは共にまた、分 泌された可溶性βAPP-a、Aβ、およびp3の有意な増加を引き起こした。Aβの種 分化およびPS1変異の影響の両方を探索するために、LLnLを、野生型ヒトAPP695 および野生型もしくはL392V変異のヒトPS1 cDNAで安定にトランスフェクトしたH EK293細胞に投与した。両細胞型は共に、Aβ40ではなく分泌されたAβ42を劇的 に増大することによりLLnLに応答した。しかし、変異PS1を有する細胞は、野生 型細胞（Aβx-42：基線の360±19.8％；Aβ1-42：基線の364±52.49％）に対し て、Aβ42の最小限度のより大きい増加を示した（Aβx-42：基線の421±13.01％ ；Aβ1-42：基線の413±11.5％）（ｐ＝n.s.）。 これらの実験は２つの結論に至る。第一に、いくつかのPS1変異は、PS1とプロ テアソームの調節サブユニットとの間の相互作用を調整し得る。第二に、プロテ アソームの阻害は、ERにおいて未成熟βAPPの蓄積を引き起こす。未成熟βAPPは 、続いて種々の経路を通じて代謝されて、Aβ42を非常に増大された量とする。 これは以下の最近の所見と一致する：PS1における変異がAβ42 6-9の産生の増大 と関連している；Aβ42は、神経細胞のER内腔に存在する（Harmannら、1997、投 稿中）；Aβ40産生およびAβ42産生について異なる細胞内位置がある(Tienariら (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4125-4130)；ブレフェルジンＡ(Brefeldin A)または熱ブロックでのERからゴルジへの輸送の遮断が、細胞内Aβ42産生の増 加を引き起こす(Harmannら(1997)Nature Med．投稿中)(Wildら(1997)J.Blol.Che m．印刷中）；および、Ｎグリコシル化未成熟(ER)形態のβAPPは、PS2およびお そらくはPS1とも免疫共沈され得る（Tienariら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.US A 94，4125-4130）。これらの結果の背景において、本発明者らのデータは、ER- ゴルジにおけるPS1：プロテアソーム相互作用が、βAPPを含む限定された数のタ ンパク質基質の校正／輸送機能を補助し得ることを示唆する。PS1における変異 この機能を変化させ得、βAPPの異常なER/ゴルジプロセシングおよびAβ42の過 剰産生を生じる。最後に、ユビキチン依存性プロテアソーム媒介タンパク質分解 の活性化は、長期増強（LTP）に必要である（Cookら(1997)Keystonia Symposia ）。従って、PS1とプロテアソームの調節サブユニットとの間の相互作用はまた 、正常PS1ではなく変異ヒトPS1を過剰発現するトランスジェニックマウスにおい て観察された、LTPにおける異常についての説明を提供し得る（Agopyanら、投稿 中）。 このように、プレセニリン−プロテアソーム相互作用は、いくつかの点におい て重要であるようである。第一に、正常プレセニリンTM６→７ループドメインは S5aタンパク質と相互作用するという事実、変異プレセニリンTM６→７ループド メインはS5aタンパク質と相互作用し得ない（または非常に弱く相互作用する） という事実、TM６→７ループドメインにおける変異を有するプレセニリンは異な って切断および複ユビキチン結合されるようであるという事実、プロテアソーム は種々のタンパク質（特に複ユビキチン結合タンパク質）の切断およびクリアラ ンスに関与することが知られているという事実、プロテアソーム活性の阻害がプ レセニリンホロタンパク質の切断を阻害するという事実、および、S5aプロセシ ングがAD脳において変化しているという事実は全て、（１）S5aサブユニットお よび26Sプロテアソームが、プレセニリンの正常なプロセシングに関与し、そし てこの正常な相互作用を破壊する変異が、TM６→７ループドメイン変異体におい て観察された異常なプロセシングの原因となり得ること、あるいは（２）プレセ ニリン−プロテアソーム相互作用は、プロテアソーム媒介プレセニリンプロセシ ングを関与させることなく、１つまたは両方のタンパク質の活性を調整し得るこ とのいずれかを示唆する。これらの仮説を支持して、過剰ユビキチン結合リン酸 化Tauおよび他の微小管結合タンパク質を取り除くことができないことが、アル ツハイマー病の目立った特徴であることに留意すべきである（KosikおよびGreen berg(1994)Alzheimer Disease．New York，Raven Press．335-344）。このこと は、TM６→７ループドメイン変異体、プレセニリン−プロテアソーム相互作用、 Tau-プロテアソーム相互作用、およびAD脳におけるTauタンパク質の神経原線維 濃縮体の間の可能な関連を示唆する。最後に、プロテアソームは、APPを分解し 得、そしてアルツハイマー病に関連するAβペプチドに結合し得ることが知られ ており、このことは、TM６→７ループドメイン変異体、プレセニリン−プロテア ソーム相互作用、APP−プロテアソーム相互作用、およびAD脳に特徴的なアミロ イド斑の間の可能な関連を示唆する。 従って、プレセニリンプロセシングおよびプレセニリン−プロテアソーム相互 作用は、ADにおける治療的介入と同様に診断についても明確な標的である。従っ て、以下に記載のように、プレセニリンのプロテアソーム媒介切断に影響するか 、変異プレセニリンの代替のタンパク質内分解切断およびユビキチン結合に影響 するか、あるいはそうでなければ、プレセニリンもしくはプロテアソームのS5a サブユニットのプロセシングおよび輸送に影響する薬物についてのアッセイが、 今や提供され得る。さらに、プレセニリンの正常なプロセシングを破壊する、26 Sプロテアソームにおける変異が、アルツハイマー病の原因であるようなので、 プロテアソームのS5aまたは他のサブユニットにおける変異を検出するためのさ らなる診断アッセイが、提供される。最後に、プロテアソームの少なくとも機能 的ドメインをコードする正常または変異配列の導入によって改変された、さらな る形質転換細胞株およびトランスジェニックモデルが、今や提供され得る。 別のプレセニリン相互作用タンパク質（GT24と称される）が、酵母ツーハイブ リッド系および成人脳cDNAライブラリーを用いて得られたいくつかの重複クロー ンから同定された。続いて、６つのより長いGT24クローン（サイズ約3.8kb）が 、従来のcDNAライブラリーのスクリーニングによって得られた。これまでに得ら れた最も長いGT24クローン（受託番号U81004）内のオープンリーディングフレー ムは、GT24が、独特のＮ末端、およびそのＣ末端でいくつかのアルマジロ（arm ）反復タンパク質とかなりの相同性を有する少なくとも1040アミノ酸のタンパク 質であることを示唆する。従って、例えば、GT24の残基440〜862（受託番号U810 04からの番号付け）は、マウスp120タンパク質（受託番号Z17804）の残基440〜8 54と32〜56％の同一性を有し（ｐ＝1.2e-133）、そしてGT24の残基367〜815は、D. melanogaster アルマジロセグメント極性タンパク質（受託番号P18824）の残基24 5〜465と26〜42％の同一性を有する（ｐ＝0.0017）。GT24遺伝子は、アノニマス マイクロサテライトマーカーD5S748およびネコ鳴き症候群遺伝子座の近傍の染色 体5p15にマップしている。 GT24の独特の5'配列のノーザンブロットへのハイブリダイゼーションにより、 GT24遺伝子が、いくつかのヒト脳領域およびいくつかの非神経学的組織（例えば 、心臓）において、サイズが約3.9〜5.0kbの間で変動する転写物として発現され ることが明らかになる。さらに、４ケ月齢マウス脳におけるGT24の5'末端由来の 289bpの単コピーフラグメントを用いるインサイチュハイブリダイゼーション研 究によって、PS1の転写に密接に関連するGT24転写が明らかになる。これは、歯 状回および海馬のニューロン、散在する新皮質ニューロン、および小脳プルキン エ細胞において強く発現されている。E13日目のマウス胚において、GT24は、低 レベルで広く発現されるが、体節および神経管では幾分か高いレベルで発現され る。GT24とPS1との間の生理学的インビボ相互作用は、野生型ヒトPS1cDNA、GT24 の残基484〜1040（Ｃ末端arm 反復を含む）をコードするc-mycタグ化cDNA、また は両cDNAで一過的にトランスフェクトしたHEK293細胞における免疫共沈研究によ り支持される。細胞溶解物を抗PS1抗体と免疫沈降させ、次いでmyc-GT24タンパ ク質の存在について免疫ブロッティングにより調べた。PS1/myc-GT24二重トラン スフェクト細胞では、免疫沈降物は、Mr約60kDaの強い抗myc反応性バンドを含ん でいた。このバンドは、myc-GT24コントロールと同時に移動した。myc-GT24のみ でトランスフェクトした細胞では、非常に弱いバンドが、長時間曝露後に検出さ れた。これは、おそらくmyc-GT24と低レベルの内因性PS1との相互作用を反映す る。myc反応性バンドは、PS1単独でトランスフェクトされた細胞でも、免疫前血 清で免疫沈降させたトランスフェクト細胞のいずれにおいても、検出されなかっ た。まとめると、これらの所見は、観察されたPS1：GT24相互作用が生理学的に 関連があることを強く示唆する。 PS1のTM６−TM７ループにおける変異がPS1：GT24相互作用に影響を及ぼすか否 かを探索するために、本発明者らは、定量液体β-ガラクトシダーゼアッセイを 使用して、GT24のＣ末端残基499〜1040と野生型および変異PS1266-409との酵母 ツ ーハイブリッド相互作用を直接比較した。これらの研究により、GT24499-1040の L286V変異PS1ドメインとの相互作用が、対応する野生型PS1ドメインとの相互作 用とは有意に異ならないことが明らかになった。対照的に、L392V変異PS1構築物 とのGT24499-1040相互作用には有意な減少があった。L286V変異の影響がなく、 そしてL392V変異では影響があることは、ある変異はPS1：GT24結合を達成し得る が、他はGT24結合へのPS1応答を調整し得ることを示唆し得る。 PS1：GT24相互作用はいくつかの機能を支持し得る。GT24のarm反復モチーフは 、多様な機能を有するいくつかのタンパク質（β-カテニンおよびその無脊椎動 物ホモログarmadillo、プラコグロビン、p120、腺腫結腸ポリポーシス（APC）遺 伝子、酵母におけるRNAポリメラーゼ１のサプレッサー（SRP1）、およびsmGDSを 含む）において検出されている。例えば、β-カテニン、p120およびプラコグロ ビンは、細胞間接着において本質的な役割を果たす。β-カテニン/armadilloは 、細胞運命特異化(cell fate specification)の間のwingless/Wntシグナルの変 換に関与し、そしてβカテニンおよびp120は、他のレセプター媒介シグナル変換 事象（栄養因子（例えば、PDGF、EGF、CSF-1およびNGF）に対する応答を含む） において役割を果たし得る。 PS1:GT24相互作用が、栄養性因子に関する細胞内シグナル伝達経路の一部であ るか、または細胞-細胞接着に関与する場合、この相互作用の崩壊は、PS関連FAD 脳における神経変性プロセス、およびアポトーシスに対するPS1またはPS2トラン スフェクト細胞の増加した感受性に関与し得る(Wolozinら(1996)Science 274:17 10-1713)。少なくとも１つのarmタンパク質smGDSが、細胞内Ｇタンパク質におい てGDP/GTP変換を刺激すること（Kikuchiら(1992)Oncogene 7:289-293；Borguski ら(1993)Nature 366:643-654）、そしてβAPPおよびPS2の両方の変異体形態が、 ヘテロ三量体GTP/GDPタンパク質を含む機構を通じてプログラムされた細胞死経 路を活性化すると考えられることが注目される(Wolozinら、1996；Okamotoら(19 95)J ．Biol．Chem.270:4205-4208；Yamatsujiら(1996)Science 272:1349-1352) 。 PS1とGT24との間の相互作用はまた、マウスにおけるホモ接合PS1ノックアウト に関連する発生表現型(例えば、尾側胚の体節不全、短い尾、およびE13.5日目あ たりでの致死性脳出血)のいくつかに関与し得る(Wongら(1996)Neuroscience 22: 728)。PAX1およびNotchにおける無発現変異に関連する表現型に対するこれら骨 格表現型の類似、およびC.elegansにおけるNotch/lin12媒介シグナル伝達に対す るsel12における変異の見かけのサプレッサー効果は、Notchシグナル伝達経路に おいてPSタンパク質が機能することを示唆する。さらに、Wnt-3a遺伝子のノック アウトについてホモ接合であるマウス(Takadaら(1994)Gene&Dev.8:174−189)、 およびWnt-3a遺伝子における自然変異「痕跡尾部」またはvtについてのマウスホ モ接合体(Grecoら(1996)Gene&Dev.10:313-324)は、不完全な尾側体節および尾芽 形成の骨格表現型を有する。Wnt-3aノックアウトは、12.5日までに胚致死性であ る。これらの表現型は、マウスPS1遺伝子のホモ接合型ノックアウトの表現型と 類似している(Wongら、1996)。GT24がPS1に結合し、胚体節で発現し、そしてWin gless/Wnt 経路の下流シグナル伝達で用いられる他のタンパク質のアルマジロ反 復モチーフを含むという知見は、PS1がGT24-Wingless/Wnt経路の下流要素である ことを示唆する。これは、GT24-PS1相互作用に直接影響するか、またはその相互 作用の上流もしくは下流要素に影響する薬剤についてのバイオアッセイを作成す るために利用され得、従ってプレセニリン変異の影響をモニターするために使用 され得る。例えば、正常または変異プレセニリンでトランスフェクトされた細胞 は、可溶性Wnt-3aタンパク質(またはWnt-１のような他のWntタンパク質)に曝さ れ得、そしてWingless/Wntシグナル伝達経路に特異的である変化について、また は細胞アッセイに関して本明細書中で記載される任意の他の変化(例えば、細胞 内イオンレベル、Aβプロセシング、アポトーシスなど)についてアッセイされ得 る。 さらに、本発明者らは、GT24はまたPS2と相互作用することを観察した。GT24 のトランスフェクションは、いくつかの異なる細胞タイプで顕著な形態学的変化 を引き起こす。細胞質の樹状分岐および細胞：細胞接触近傍でのGT24の見かけの 凝集を含むこれらの変化は、PS2/PS2:GT24相互作用が、両方の細胞骨格組織化、 細胞骨格への細胞膜の固着(anchoring)、および細胞間シグナル変換に関与し得 ることを示唆する。これらの複数の機能は、アルマジロタンパク質およびβカテ ニンの複数の機能に類似している。このことは分化における役割を示唆し、そし てβ-カテニンおよびAPCのような他のアルマジロタンパク質と同様に、GT24(な らびにPS1およびPS2とのその相互作用)が、傷害後の再生および修復、ならびに 発ガンにおける役割を果たし得ることを主張する。従って、PS1、PS2およびGT24 はまた、組織の再生および修復ならびにガンモデルに有用であり得る。 従って、GT24タンパク質はまた、ADにおける診断および治療的介入の新たな標 的を提供する。例えば、GT24タンパク質の変異はまた、アルツハイマー病の原因 であり得るので、さらなる診断アッセイがこれらの配列における変異を検出する ために提供される。同様に、GT24タンパク質の少なくとも機能性ドメイン、そし て特にプレセニリンと相互作用する機能性ドメイン(例えば、残基70〜377)をコ ードする正常または変異核酸を導入することによって改変されたさらなる形質転 換細胞株およびトランスジェニックモデルが提供され得る。このような形質転換 細胞およびトランスジェニックは、プレセニリン-GT24相互作用を調整する化合 物に関するアッセイにおいて有用性を有する。 野生型PS1266-409「ベイト」を用いた初期スクリーニングにおいて単離された 別の独立クローンはまた、C末端arm反復(クローンY2H25、受託番号U81005)を有 するペプチドをコードする。Y2H25クローンに対応するより長いcDNA配列は、Gen Bankにヒトタンパク質p0071(受託番号X81889)として寄託された。Y2H25/p0071 O RFの予測される配列とGT24の予測される配列との比較は、それらが47％の全体ア ミノ酸配列同一性、そしてGT24の残基346〜862とY2H25の残基509〜1022との間の 70％の同一性を有する関連タンパク質であることを確認する。このことは、PS1 が新規のクラスのarm反復含有タンパク質と相互作用することを示唆する。GT24 の独特の5'末端とのノーザンブロットで得られる広範な約4.5kbのハイブリダイ ゼーションシグナルは、GT24の代替のスプライシング/ポリアデニル化、または より可能性は低いが、GT24に対するY2H25より高度なＮ末端相同性を有する、こ のファミリーのさらなるメンバーの存在のいずれかを反映し得る。これらの配列 で形質転換された細胞、またはこれらの配列を含むトランスジェニック動物は、 ADの動物モデルとして、ならびに正常および変異プレセニリンの作用を調整する 化合物についてのスクリーニングでの使用のための、さらなる有用性を有する。 酵母ツーハイブリッド系はまた、26Sプロテアソームのヒトp40サブユニット(M ov34)に対する配列同一性を示すクローンを同定した。興味深いことに、このク ローンは、野生型TM6→7ドメインではなく、変異PS1 TM6→7ループドメインとの 相互作用によって同定された。26SプロテアソームのS5aサブユニットに関する上 記の全ての理由のために、プレセニリンとp40サブユニットとの間の相互作用は 、ADの診断および治療的介入の明確な標的である。従って、以下に記載するよう にプレセニリンのプロテアソーム媒介切断およびクリアランスに影響するか、変 異プレセニリンの代替タンパク質内分解切断およびユビキチン化に影響するか、 またはプレセニリンのプロセッシングおよび輸送に影響する薬物についてのアッ セイが提供される。さらに、プレセニリンの正常なプロセッシングを崩壊させる p40サブユニットにおける変異は、アルツハイマー病の原因であり得るので、プ ロテアソームのp40サブユニットにおける変異を検出するためのさらなる診断ア ッセイが提供される。最後に、このプロテアソームサブユニットの少なくとも機 能性ドメインをコードする正常または変異配列の導入によって改変された、さら なる形質転換細胞株およびトランスジェニックモデルが、今や提供され得る。 多くの他のプレセニリン相互作用タンパク質は、本発明の方法に従って同定さ れた。これらは実施例15に記載されている。これらのタンパク質のそれぞれ、そ して特に正常または変異プレセニリンのいずれかと選択的に相互作用するタンパ ク質は、有用な薬剤の同定のための新たな標的、危険にある個体の同定における 診断ツールの新たな標的、形質転換細胞株およびトランスジェニック動物モデル の産生のための新たな配列、ならびにアルツハイマー病における治療的介入ため の新たなベースを提供する。 従って、ADの発症は、変異プレセニリンタンパク質とタンパク質（例えば、本 明細書中で記載される方法を用いて同定されたタンパク質）との異常な相互作用 に関連し得る。しかし、類似の異常な相互作用は、プレセニリンと正常には相互 作用しない変異形態のタンパク質への正常プレセニリンの結合から生じ得る。正 常なプレセニリンタンパク質を含む異常な相互作用は、変異がプレセニリン遺伝 子に見出されない多くのAD症例に関連し得る。変異相互作用タンパク質は、当該 分野で公知の方法を用いて単離され、そして同定され得る。例えば、タンパク質 抽出物は、プレセニリン遺伝子に変異のないアルツハイマー患者に由来する組織 サンプルから作成される。次いで、これらのタンパク質抽出物は、マトリックス に結合した正常プレセニリンタンパク質に曝され、そして相互作用タンパク質が 特異的にマトリックスに保持される。次いで、これらのタンパク質は単離され、 そして特徴づけられる。次いで、これらのタンパク質をコードする遺伝子はクロ ーン化され得、そして異常な相互作用の原因である特定の変異が同定され得る。 これらのタンパク質のいくつかは、変異プレセニリンと特異的に相互作用するこ とを見出された変異形熊の野生型タンパク質であることが予期される。正常プレ セニリンと相互作用するこれらの変異タンパク質はまた、遺伝学的アプローチ( 例えば、実施例15に記載される酵母ツーハイブリッド系)を用いて同定され得る 。これらの結果は、本明細書中に記載される治療および診断方法を開発するため に用いられ得る。 III．好ましい実施態様 本明細書中に開示および記載される発見に部分的に基づいて、本発明の以下の 好ましい実施態様を提供する。 １．単離された核酸 ある一連の実施態様において、本発明は、本明細書中に開示されるプレセニリ ンの核酸配列に対応または関連する、単離された核酸を提供する。以下でより十 分に記載されるように、これらの配列としては、ヒトおよび他の哺乳動物種由来 の正常PS1および正常PS2の配列、ヒトおよび他の哺乳動物種由来の変異PS1およ び変異PS2の配列、DrosophilaおよびC.elegansのような非哺乳動物種由来の相同 配列、プローブおよびPCRプライマーとして有用なこれらの配列のサブセット、 プレセニリンタンパク質のフラグメントをコードするかまたは特定の構造ドメイ ンもしくは多型領域に対応するこれらの配列のサブセット、プレセニリン遺伝子 のフラグメントに対応する相補配列またはアンチセンス配列、プレセニリンコー ド領域が外因性調節領域に作動可能に結合されている配列、および発現のマーカ ーとして、精製のための「タグ」として、またはプレセニリンと相互作用するタ ンパク質についてのスクリーニングおよびアッセイにおいて有用な、他のタンパ ク質に融合したプレセニリンタンパク質の一部の融合タンパク質をコードする配 列が挙げられる。 従って、第１の一連の実施態様において、正常バージョンまたは変異バージョ ンのPS1タンパク質およびPS2タンパク質をコードする、単離された核酸配列を提 供する。このような核酸配列の例を、本明細書中に開示する。これらの核酸配列 は、ゲノム配列(例えば、配列番号５〜15)であり得るか、またはcDNA配列(例え ば、配列番号１、３、16、および18)であり得る。さらに、核酸は、組換え遺伝 子または「ミニ遺伝子」であり得、ここで全てまたはいくつかのイントロンが除 去されたものであり得、または、ここでイントロンの種々の組合せ、ならびにエ キソンおよび局所的なシス作用性調節エレメントが、増殖または発現の構築物ま たはベクターにおいて操作されたものであり得る。従って、例えば、本発明は、 本明細書中に記載されるオルタナティブスプライス変異体がDNAレベルで取り込 まれており、従って、これらの配列を含む細胞が、各スプライシング部分で唯一 のオルタナティブスプライス変異体を発現することを可能にする、核酸配列を提 供する。一例として、PS1遺伝子のエキソン１の３’末端(配列番号５の1337bp) がエキソン３の５’末端(配列番号６の588bp)に直接連結され、その結果、優勢 な転写物に対応する転写物のみが産生される、組換え遺伝子を産生し得る。明ら かに、エキソン２およびエキソン３のオルタナティブスプライシングを「強制す る」組換え遺伝子をまた作製し得る。同様に、PS1のエキソン４またはエキソン ９のスプライス変異体(またはPS2の対応するTM6→7スプライス変異体)の１つがD NAに組み込まれた組換え遺伝子を作製し得、その結果、この組換え遺伝子を含む 細胞は、これらの変異体のうちの１つのみを発現し得る。組換えプレセニリン遺 伝子のサイズを減少させるために、cDNA遺伝子を使用し得るか、またはイントロ ンおよび非翻訳エキソンの種々の組合せをDNA構築物から除去し得る。最終的に 、5'UTRが変化して、その結果、転写が２つの転写開始部位の一方または他方か ら必ず進行する、組換え遺伝子を作製し得る。このような構築物は、以下に記載 するように、プレセニリンの発現を誘導または抑制し得る化合物の同定において 特に有用であり得る。これらの実施態様の多くの改変はここで、本明細書中に提 供されるプレセニリン遺伝子の詳細な説明によって可能になる。 開示されるプレセニリン配列に加えて、当業者は、現在、開示される配列の対 立遺伝子であるプレセニリン遺伝子もしくはcDNA、または異種特異的ホモログで あるプレセニリン遺伝子もしくはcDNAを表す核酸を同定しそして単離することが 可能であする。従って、本発明は、これらの対立遺伝子およびホモログ、ならび にこれらの配列由来の種々の上記の組換え構築物に対応する単離された核酸を、 当該分野で周知の手段によって提供する。簡潔に記載すると、当業者は、現在、 ゲノムまたはcDNAの調製物(個々の生物(例えば、ヒトのAD患者またはそれらの家 族の一員)ならびに細菌、ウイルス、酵母、または他のゲノムもしくはcDNAのラ イブラリーから調製したサンプルを含む)を、対立遺伝子配列または相同配列を 同定するためのプローブまたはPCRプライマーを使用してスクリーニングし得る 。ADまたは他の疾患の発達に寄与し得るさらなるプレセニリン遺伝子変異を同定 することが望ましく、病原性でないさらなるプレセニリン多型を同定することが 望ましく、そして、ADの研究および潜在的な治療のためスクリーニングに使用し 得る種々の動物モデルの作製もまた望ましいので、さらなるプレセニリン配列が 、ヒト核酸の他の調製物またはライブラリー、および動物(ラット、マウス、ハ ムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよび非ヒト 霊長類を含む)由来の調製物またはライブラリーから単離されることが、特に意 図される。さらに、酵母または無脊椎動物種(C ．elegansおよび他の線虫、なら びにDrosophilaおよび他の昆虫を含む)由来のプレセニリンホモログは、薬物の スクリーニングに特に有用性を有し得る。例えば、迅速に生じてそして容易に評 点される表現型(例えば、数日後の異常な外陰または眼の発達)を生じる変異プレ セニリンホモログ(または哺乳動物のプレセニリントランスジーン)を有する無脊 椎動物を、変異遺伝子の効果をブロックする薬物のふるいとして使用し得る。こ のような無脊椎動物は、より大きな脊椎動物よりも大量のスクリーニングのため にはるかに迅速かつ有効であることを立証し得る。一旦、リード化合物が、この ようなスクリーニングを通して見出されたら、これらは高等動物において試験さ れ得る。 標準的なハイブリダイゼーションスクリーニングまたはPCR技術を、比較的短 いプレセニリン遺伝子配列を使用して(例えば、mPS1遺伝子の同定において使用 されたように)、このような対立遺伝子配列および相同配列を同定および／また は単離するために使用し得る。配列は、標的配列の性質、使用する方法、および 必要とされる特異性に依存する、８個以下のヌクレオチドを含み得る。将来の技 術発展により、より短い配列の有利な使用ですら可能になるかもしれない。現在 の技術では、９〜50ヌクレオチド、および好ましくは約18〜24の配列が好ましい 。これらの配列は、本明細書中で開示された配列から選択され得るか、または本 明細書中で可能になった他の対立遺伝子ホモログまたは異種特異的ホモログ由来 であり得る。mRNAをプローブするかまたはcDNAライブラリーをスクリーニングす る場合、コード配列(イントロンよりはむしろ)由来のプローブおよびプライマー を好ましくは使用し、そしてオルタナティブスプライシング変異体において削除 される配列は、代表的には、これらの変異体を同定することが特に所望されない 限り、避ける。プレセニリン遺伝子の対立遺伝子変異体は、本明細書中で規定さ れるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、開示された 配列とハイブリダイズすると予想され得るが、一方で、より低いストリンジェン トを使用して異種特異的ホモログを同定し得る。 別の一連の実施態様において、本発明は、プレセニリン配列またはそれらの相 補物のサブセットを含む単離された核酸を提供する。上記で注意したように、こ のような配列は、プレセニリン遺伝子の対立遺伝子変異体および相同変異体の同 定および単離におけるプローブおよびPCRプライマーとしての有用性を有する。 上記のように、プレセニリンの多型領域に対応するサブ配列はまた、以下のよう に、診断目的のための個体のスクリーニングおよび／または遺伝子型決定におけ る特別な有用性を有する。さらに、また以下に記載するように、このようなサブ セットは、(１)融合タンパク質に含まれるプレセニリンタンパク質のフラグメン ト、(２)結合研究に使用するためのプレセニリンタンパク質の機能的ドメインを 含むフラグメント、(３)プレセニリンタンパク質に対する抗体を生じるための免 疫原として使用され得るプレセニリンタンパク質のフラグメント、および(４)競 合的インヒビターとして、またはプレセニリン模倣物として作用して、プレセニ リンの生理学的機能を阻害または模倣し得るプレセニリンのフラグメント、をコ ードするために有用性を有する。最終的に、このようなサブセットは、プレセニ リン遺伝子またはプレセニリンmRNA転写物に対して、これらの配列の転写または 翻訳を阻害する生理学的条件下でハイブリダイズし得る相補的配列またはアンチ センス配列をコードまたは示し得る。それゆえ、意図される使用に依存して、本 発明は、8〜10ヌクレオチド(例えば、PCRプライマーとしての使用のため)から、 プレセニリンのゲノムDNAまたはcDNAのほぼ全長のサイズまで変化する長さを有 し得るプレセニリン遺伝子の核酸配列を提供する。従って、本発明は、本明細書 中で開示されたかさもなければ可能にしたように、プレセニリン遺伝子の少なく とも8〜10個、好ましくは15個、そしてより好ましくは少なくとも20個の連続す るヌクレオチドまたはその相補物に対応する配列を含む、単離された核酸を提供 する。しかし、上記で注意したように、異なる技術ではより短い配列が有用であ り得る。 別の一連の実施態様において、本発明は、イントロンを有するかもしくは有さ ない、または上記のように組換えにより操作されたプレセニリンのコード配列が 、内因性または外因性の５'および／または３'調節領域に作動可能に連結されて いる核酸を提供する。hPS1遺伝子の内因性調節領域は、本明細書中に詳細に記載 および開示される。本明細書の開示および標準的な遺伝的技術(例えば、PCR伸長 、標的遺伝子ウォーキング)を使用して、当業者はまた、現在、対応するhPS2の5 'および／または3'内因性調節領域をクローン化することを可能にする。同様に 、hPS1およびhPS2の内因性調節領域の対立遺伝子変異体、ならびに他の哺乳動物 のホモログ由来の外因性調節領域は、同様に過度の実験を行うことなく可能にな る。あるいは、外因性調節領域(すなわち、異なる同種遺伝子または異種特異的 調節領域由来の調節領域)は、発現を駆動するためにプレセニリンのコード配列 に作動可能に連結され得る。適切な5'調節領域としてはプロモーターエレメント が挙げられ、そしてまたはオペレーター配列またはエンハンサー配列、リボソー ム結合配列、RNAキャップ形成配列などのようなさらなるエレメントも挙げ得る 。調節領域は、原核生物細胞または真核生物細胞、それらのウイルス、およびそ れらの組合せの遺伝子の発現を制御する配列から選択され得る。このような調節 領域として、lac系、trp系、tac系、およびtrc系；λファージの主要なオペレー ター領域およびプロモーター領域；fdコートタンパク質の制御領域；SV40の初期 または後期プロモーター；ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキ ュ ロウイルス、およびシミアンウイルス由来のプロモーター；3-ホスホグリセレー トキナーゼプロモーター；酵母の酸性ホスファターゼプロモーター；酵母のα- 交配因子；ニューロンまたは他の細胞型において発現する他の真核生物遺伝子の プロモーターエレメント；およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定 されない。特に、これらの核酸で形質転換された細胞内でプレセニリン遺伝子の 制御された、および／または操作可能な発現を可能にする誘導可能または抑制可 能(例えば、β-ガラクトシダーゼプロモーター)である調節エレメントを選択し 得る。あるいは、プレセニリンのコード領域を、多細胞生物における組織特異的 発現を提供する調節エレメントに作動可能に連結し得る。このような構築物は、 適切な組織内でのみプレセニリン遺伝子の発現を生じるトランスジェニック生物 の作製に特に有用である。適切な調節領域の選択は、当業者の能力および裁量の 範囲内であり、そして多くのこのような調節領域の組換え体の使用は、現在当該 分野で確立されている。 別の一連の実施態様において、本発明は、融合タンパク質の形態でプレセニリ ンタンパク質の全部または一部をコードする単離された核酸を提供する。これら の実施態様において、核酸調節領域(内因性または外因性)は、第２のコード領域 にインフレームで共有結合的に連結されている第１のコード領域に作動可能に連 結される。第２のコード領域は随意に、一つ以上のさらなるコード領域に共有結 合的に連結され得、そして、最後のコード領域は、終止コドン、および随意に、 適切な3'調節領域(例えば、ポリアデニル化シグナル)に連結される。 融合タンパク質のプレセニリン配列は、第１、第２、または任意のさらなるコ ード領域を示し得る。プレセニリン配列は、保存的ドメインまたは非保存的ドメ インであり得、そして融合物の任意のコード領域に配置され得る。融合物の非プ レセニリン配列を、実施者の要求および裁量に従って選択し得るが、本発明によ っては制限されない。しかし、有用な非プレセニリン配列としては、得られる融 合タンパク質の同定または精製を補助するために使用し得る抗原決定基またはポ リHisタグのような短い配列の「タグ」が挙げられる。あるいは、非プレセニリ ンコード領域は、タンパク質の同定および精製を補助し得るか、または以下に記 載のようなアッセイにおいて有用であり得る、酵素または結合タンパク質のよう な大きなタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードし得る。特に意図さ れるプレセニリン融合タンパク質としては、プレセニリンの単離および精製に有 用であるポリHisおよびGST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)の融合物、およ び以下に記載の、プレセニリンと結合または相互作用する他のタンパク質を同定 するためのアッセイにおいて有用である酵母のツーハイブリッド融合物が挙げら れる。 別の一連の実施態様において、本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺 伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ)が、プレセニリン遺伝子 の５’調節領域に作動可能に連結され、その結果、マーカー遺伝子の発現が、プ レセニリン調節配列の制御下にある、組換えDNA構築物の形態の単離された核酸 を提供する。本明細書中で開示されるかさもなければ可能にされるプレセニリン 調節領域(ヒトおよび他の哺乳動物種から得たPS1遺伝子およびPS2遺伝子由来の 調節領域を含む)を使用して、当業者は、現在、このような構築物を作成するこ とが可能である。以下でより十分に議論するように、このような単離された核酸 は、直接的または間接的に、差別的にプレセニリン発現に影響を与え得る化合物 の同定に有用である、細胞、細胞株、またはトランスジェニック動物の作製に使 用され得る。 本明細書において開示されそして実施可能にされるプレセニリン配列に加えて 、本発明はまた、インビボでプレセニリンと相互作用するペプチドまたはタンパ ク質をコードする核酸配列を提供する。従って、プレセニリンのプロセッシング および相互作用について上述したように、そして下記実施例１５において詳述さ れるように、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための酵母ツー ハイブリッドシステムを用いて、プレセニリンと相互作用する多数の脳タンパク 質が同定された。以下に開示されるそして当該分野で公知である、プレセニリン と相互作用するすなわち「ＰＳ相互作用」タンパク質を同定する他の方法を用い て、または他の組織または種からのｃＤＮＡライブラリーを用いて、ＰＳ相互作 用タンパク質をコードする種々の核酸を同定しそして単離することが今や可能で ある。一度同定されれば、これらの配列を用いて、より大きなｃＤＮＡまたはゲ ノムフラグメント（ＰＳ相互作用の機能的ドメインを含む全遺伝子を含む）をク ローン し得るか、または、ＰＳ相互作用活性を維持するより小さな、最小の活性フラグ メントを（例えば、ＰＳ相互作用ペプチドの末端から残基を繰り返し削除しそし て活性の維持について試験することにより）同定し得る。さらに、以下に示され るように、同定され得るＰＳ相互作用ペプチドまたはタンパク質として、プレセ ニリンの特定の機能的ドメインと相互作用するもの（例えば、ＴＭ６→７ループ ドメイン、ＴＭ１→２ループドメイン、Ｎ−末端、Ｃ−末端）、特定のプレセニ リンと相互作用するもの（例えば、ｈＰＳ１、ｈＰＳ２、ｍＰＳ１、ＤｍＰＳ） 、または変異型または正常型と特異的に相互作用するもの（例えば、Ｃ４１０Ｙ 変異体、Ｍ１４６Ｌ変異体）がある。 本発明のＰＳ相互作用ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸は、本質的 に、プレセニリンについて上述された全ての実施態様において用い得る。従って 、提供されるＰＳ相互作用ペプチドをコードする核酸は以下のものを含む：ゲノ ムまたはｃＤＮＡ配列；いくつかのまたは全てのイントロンが除去されたミニ遺 伝子；次のものをコードすることについて有用なサブ配列（１）融合タンパク質 に含ませるための、ＰＳ相互作用タンパク質のフラグメント、（２）結合研究に 使用するための、ＰＳ相互作用タンパク質の機能的ドメインを含むフラグメント 、（３）ＰＳ相互作用タンパク質に対する抗体を産生させる免疫原として使用さ れ得る、ＰＳ相互作用タンパク質のフラグメント、および（４）競合的阻害剤と して、またはプレセニリンとの生理的相互作用の類似物（mimetics）として作用 し得る、ＰＳ相互作用タンパク質のフラグメント；内因性または外因性の調節エ レメントに作動可能に連結された配列；他のコード配列とインフレームで連結さ れて融合タンパク質をコードする配列（例えば、酵母ツーハイブリッドシステム におけるように）；その他。 最終的に、本発明の単離された核酸は、ベクターに含まれる場合、上記の任意 の配列を含む。適切なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド 、エピソームなどを含む全ての型のクローニングベクターおよび発現ベクターな らびに組込みベクターが挙げられる。ベクターはまた、それらで首尾よく形質転 換された細胞の同定に有用である、種々のマーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐 性遺伝子または感受性遺伝子)を含み得る。さらに、ベクターは、本発明の核酸 が 作動可能に連結されている調節配列を含み得、そして／またはベクター中で適切 に連結される場合、本発明の核酸が融合タンパク質として発現されるようなコー ド領域もまた含み得る。このようなベクターはまた、酵母「ツーハイブリッド」 、バキュロウイルス、およびファージディスプレー系における使用のためのベク ターを含み得る。ベクターは、特定の用途のために必要とされるかまたは所望さ れるような、原核生物、真核生物、またはウイルスの発現のために有用であるよ うに選択され得る。例えば、SV40プロモーターを有するワクシニアウイルスベク ターもしくはシミアンウイルスベクター(例えば、pSV2)、または単純ヘルペスウ イルスまたはアデノ関連ウイルスは、培養中またはインビボでのニューロンを含 む哺乳動物細胞のトランスフェクションに有用であり得る。そして、バキュロウ イルスベクターは、昆虫細胞(例えば、チョウの細胞)のトランスフェクションに 使用され得る。非常に多様な異なるベクターは、現在市販されており、そうでな ければ当該分野で公知であり、そして適切なベクターの選択は、当業者の能力お よび裁量の範囲内である。 ２．実質的に純粋なタンパク質 本発明は、プレセニリンタンパク質、プレセニリンタンパク質のフラグメント 、およびプレセニリンまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質の実質的に 純粋な調製物を提供する。タンパク質、フラグメント、および融合物は、本明細 書中に記載されるように、正常プレセニリンおよび変異プレセニリンに対する抗 体の生成、プレセニリン結合タンパク質の同定、ならびに診断方法および治療方 法において有用性を有する。それゆえ、意図される用途に依存して、本発明は、 完全なプレセニリンタンパク質のサブ配列であり、そして完全なプレセニリンタ ンパク質に対して、４〜10アミノ酸(例えば、免疫原としての使用のため)または 10〜100アミノ酸(例えば、結合アッセイにおける使用のため)で変化する長さを 有し得るアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なタンパク質またはペプチドを提供 する。従って、本発明は、本明細書中に記載するかそうでなければ可能とされる ように、プレセニリンタンパク質の少なくとも４〜５、好ましくは６〜10、そし てより好ましくは少なくとも50または100の連続するアミノ酸に対応する配列を 含 む、実質的に純粋なタンパク質またはペプチドを提供する。 本発明のタンパク質またはペプチドは、そのタンパク質配列によって明らかに される特性に基づいて選択される、任意の種々の方法によって単離および精製さ れ得る。プレセニリンは、細胞膜内タンパク質または膜貫通タンパク質の特性を 有するので、プレセニリンが通常高度に発現される細胞(例えば、ニューロン、 オリゴデンドログリア、筋肉、膵臓)の膜画分が単離され得、そしてタンパク質 が、例えば、界面活性剤可溶化によって抽出され得る。あるいは、プレセニリン タンパク質、融合タンパク質、またはそれらのフラグメントは、以下の発現ベク ターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた細胞から精製され得る：例 えば、pPbacおよびpMbacベクター(Stratagene，La Jolla，CA)のようなバキュロ ウイルス系；pYESHIS Xpressベクター(Invitrogen，San Diego，CA)のような酵 母発現系；一定の構成的発現を有するpcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)また は誘導可能であるLacSwitch(Stratagene，La Jolla，CA)のような真核生物発現 系；またはpKK233-3(Clontech，Palo Alto，CA)のような原核生物発現ベクター 。タンパク質またはフラグメントが、組換え細胞(例えば、不死化ヒト細胞株ま たは他の真核生物細胞)の小胞体または原形質膜内に組み込まれる場合、タンパ ク質を膜画分から精製し得る。あるいは、タンパク質が組換え細胞(例えば、原 核生物細胞)内の封入体において、適切に局在化しないか、または凝集する場合 、タンパク質を、溶解細胞全体または可溶化された封入体から精製し得る。 精製を、標準的なタンパク質精製手順を使用して達成し得る。タンパク質精製 手順としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC、イオン交換HPLC、サイズ排除HPLC)、高 性能クロマトフォーカシングクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ フィー、免疫沈降、または免疫親和性精製が挙げられるが、これらに限定されな い。ゲル電気泳動(例えば、PAGE、SDS-PAGE)を使用して、タンパク質またはペプ チドの分子量、電荷特性、および疎水性に基づいてタンパク質またはペプチドを また単離し得る。 プレセニリンタンパク質またはそのフラグメントはまた、例えば、抗原決定基 またはポリHisタグ(例えば、QIAexpressベクター、QIAGEN Corp.，Chatsworth， CA)、またはより大きなタンパク質(例えば、pGEX-27ベクター(Amrad，USA)を使 用するGST)またはGreen Lanternベクター(GIBCO/BRL．Gaithersburg，MD)を使用 する緑色蛍光タンパク質)の別のペプチドに融合した所望のプレセニリン配列を 含む融合タンパク質を作製することによって、好都合に精製され得る。融合タン パク質は、原核生物細胞または真核生物細胞から発現および回収され得、そして 融合ベクター配列に基づく任意の標準的な方法によって精製され得る。例えば、 融合タンパク質を、融合物の非プレセニリン部分に対する抗体を用いて免疫親和 性または免疫沈降によって、またはポリHisタグの場合は、ニッケルカラムに対 する親和性結合によって精製し得る。次いで、所望のプレセニリンタンパク質ま たはフラグメントを、融合タンパク質の酵素的切断によって融合タンパク質から さらに精製し得る。タンパク質の精製のためのこのような融合構築物の調製方法 および使用方法は当該分野で周知であり、そしていくつかのキットが、現在、こ の目的のために市販されている。本発明の開示に照らせば、現在では、プレセニ リンにこのような融合構築物を使用することが可能である。 ３．プレセニリンに対する抗体 本発明はまた、プレセニリンタンパク質またはそのフラグメントに選択的に結 合する抗体および抗体の作製方法を提供する。特に重要なことは、プレセニリン の機能的ドメインおよびADに関連する多型領域を同定することによって、本発明 は、プレセニリンタンパク質の正常形態および変異(すなわち、病原性)形態に選 択的に結合し、それゆえこれらを同定および／または識別する抗体およびそのよ うな抗体の作製方法を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、プレセニリンの免 疫親和性精製、プレセニリンを発現する細胞または組織を同定するためのウェス タンブロッティング、およびこのタンパク質の細胞以下の位置(subceller locat ion)を確証するための免疫化学的技術または免疫蛍光技術のための研究室用試薬 としての有用性を有する。さらに、下記のように、本発明の抗体は、ADに関連す るプレセニリン対立遺伝子の保有者を同定するための診断手段として、またはイ ンビボでプレセニリンタンパク質の病原性形態に選択的に結合して、これを阻害 するための治療手段として使用され得る。 本発明の抗体は、本発明のプレセニリンタンパク質の全体を使用して、または このタンパク質の特徴であり、そしてこのタンパク質と他の宿主タンパク質とを 実質的に区別する任意のプレセニリンエピトープを使用して作製され得る。この ようなエピトープは、例えば、プレセニリン配列由来の４〜10アミノ酸残基の配 列と、関連する宿主由来のタンパク質配列のコンピューターデータベースとを比 較することによって同定され得る。好ましくは、エピトープは、Ｎ末端もしくは Ｃ末端、またはこのタンパク質の膜貫通ドメインを連結するするループドメイン から選択される。特に、多型Ｎ末端領域、TM1→2ループ、またはTM6→7ループに 対する抗体は、診断的および治療的の両方に最大の有用性を有すると期待される 。一方で、高度に保存されたドメインに対する抗体は、プレセニリンの精製また は同定に最大の有用性を有すると期待される。 IBI Pustellプログラムを使用して、アミノ酸残基の位置を、hPS1タンパク質 における潜在的な抗原性部位として同定した。そして、これは、本発明の抗体の 生成において有用であり得る。配列番号２における位置と対応するこれらの位置 を表６に列記する。 抗原決定基を選択する他の方法はもちろん、当該分野で公知であり、そして使 用される。さらに、これらのエピトープのいくつかを含む、より大きなフラグメ ント(例えば、８〜20残基、または好ましくは９〜15残基)もまた使用し得る。例 えば、109-112エピトープを含むフラグメントは、残基107-114、または105-116 を含み得る。例えば機能的ドメイン全体または多数の機能的ドメイン(例えば、T M1、TM1→2、およびTM2またはTM6、TM6→7、ならびにTM7)を含むさらに大きなフ ラグメントでさえまた好ましいかもしれない。他のプレセニリンタンパク質(例 えば、mPS1もしくは他の非ヒトホモログ、またはPS2)については、相同部位が選 択され得る。 同じIBI Pustellプログラムを使用して、アミノ酸残基の位置を、hPS2タンパ ク質における潜在的な抗原性部位として同定した。そしてこれは、本発明の抗体 の生成において有用であり得る。配列番号19における位置に対応するこれらの位 置を表７に列記する。 PS1についてのように、抗原決定基を選択する方法はもちろん、当該分野で公 知であり、そして使用される。さらに、これらのエピトープのいくつかを含む、 より大きなフラグメント(例えば、８〜20残基、または好ましくは９〜15残基)も また使用され得る。例えば、310-314エピトープを含むフラグメントは、残基308 -316または307-317を含み得る。例えば機能的ドメイン全体または多数の機能的 ドメイン(例えば、TM1、TM1→2、およびTM2またはTM6、TM6→7、ならびにTM7)を 含むさらに大きなフラグメントでさえまた好ましいかもしれない。他のプレセニ リンタンパク質(例えば、mPS2もしくは他の非ヒトホモログ、またはPS1)につい ては、相同部位が選択され得る。 プレセニリン免疫原調製物を、粗製抽出物(例えば、このタンパク質を高発現 する細胞の膜画分)から、天然もしくは組換え的にそれらを発現する細胞から実 質的に精製されたタンパク質もしくはペプチドから、または短い免疫原について は、化学的ペプチド合成によって生成し得る。プレセニリン免疫原はまた、非プ レセニリン領域がそのアジュバント特性について選択される、融合タンパク質の 形態であり得る。本明細書で使用される、プレセニリン免疫原は、本明細書中で 開示されるかさもなければ可能にされるように、プレセニリンタンパク質の少な くとも４〜８個、そして好ましくは少なくとも９〜15個の連続するアミノ酸残基 を含むペプチドを含有する調製物として定義されるべきである。もちろん、より 少ない残基の配列もまた、意図される用途および将来の技術的発展に依存する有 用性を有する。それゆえ、プレセニリンに対する抗体を生成するために使用され るプレセニリン由来の任意の配列は、プレセニリン免疫原と見なされるべきであ る。 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得、 またはFabフラグメント、F(ab')2、および単鎖抗体フラグメントを含む、抗体の フラグメントであり得る。さらに、本発明の方法によって有用な抗体を同定した 後、上記で列記した任意の抗体フラグメント、ならびにプレセニリンタンパク質 に対する非ヒト抗体に基づくヒト化抗体を含む、組換え抗体を生成し得る。プレ セニリンタンパク質および本明細書中で可能になった他のプレセニリンの特徴付 けの本開示に照らして、当業者は、当該分野で周知の任意の種々の標準的な手段 によって上記の抗体を生成し得る。抗体技術の概観については、Antibody Eng ineering:A Practical Guide ，Borrebaek編、W．H．Freeman ＆ Company，NY(19 92)，またはAntibody Engineering，第２版、Borrebaek編、Oxford University Press，Oxford(1995)を参照のこと。 一般的な事として、適切なキャリア中のプレセニリン免疫原で、マウス、ウサ ギ、ヤギ、または他の適切な動物を最初に免疫することによって、ポリクローナ ル抗体を生成し得る。調製物の免疫原性を増加させるために、免疫原をキャリア タンパク質にカップリングさせ得るか、またはアジュバント(例えば、Freundア ジュバント)と混合し得る。必要ではないが、ブースター注射が、推奨される。 体液性応答を発達させるに適切な期間の後(好ましくは数週間後)、動物から採血 し、そして血清を精製してイムノグロブリン成分を単離し得る。 同様に、一般的な事として、適切なキャリア中のプレセニリン免疫原で、マウ ス、ウサギ、ヤギ、または他の適切な動物を最初に注射することによってモノク ローナル抗プレセニリン抗体を生成し得る。上記のように、キャリアタンパク質 またはアジュバントを利用し得、そしてブースター注射(例えば、８〜10週間に わたって２または３週間おきに)が推奨される。体液性応答を発達させた後、動 物を屠殺し、そして脾臓を取り出し、そして例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(P BS)中に再懸濁する。脾細胞を、リンパ球の供給源として供する。このリンパ球 のいくつかは適切な特異性の抗体を産生する。次いでこれらの細胞を、不死化細 胞株(例えば、ミエローマ)と融合し、そして融合産物を、HATのような選択的薬 剤の存在下で多数の組織培養ウェルに播種する。ウェルを連続的にスクリーニン グし、そして有用な抗体を産生する細胞を選抜したそれぞれの時点で再播種する 。代表的には、いくつかのスクリーニング手順および再播種手順を、90％を越え るウェルが、抗体産生について陽性である単一のクローンを含むまで実施する。 このようなクローンによって産生されるモノクローナル抗体を、プロテインＡセ ファロースを使用するアフィニティークロマトグラフィーのような標準的な方法 、イオン交換クロマトグラフィー、またはこれらの技術の改変または組合せによ って精製し得る。 本発明の抗体を、診断的使用および／または治療的使用のために、他の化合物 または材料で標識またはコンジュゲート化し得る。例えば、本発明の抗体を、画 像化もしくは治療のために放射性核種、蛍光化合物、もしくは酵素と、または特 定の組織位置にリポソーム中に含まれる化合物を標的化するためのリポソームと 、カップリングし得る。 ４．形質転換細胞株 本発明はまた、原核生物および真核生物の両方の細胞または細胞株を提供する 。これらの細胞は、本発明の核酸で形質転換またはトランスフェクトされており 、その結果、これらの核酸のクローン増殖および／またはそれらにコードされる タンパク質またはペプチドの発現を引き起こす。このような細胞または細胞株は 、本発明の核酸およびタンパク質の増殖および生成の両方において有用性を有す るだけでなく、本明細書中でさらに記載されるように、診断アッセイおよび治療 アッセイのためのモデル系としても有用性を有する。本明細書で使用される用語 「形質転換細胞」は、形質転換、トランスフェクション、感染、または他の手段 のいずれかによって、本発明の任意の核酸が導入された、任意の細胞または任意 の細胞の子孫を含むこと意図する。適切なベクターを作製する方法、それらのベ クターで細胞を形質転換する方法、および形質転換体を同定する方法は、当該分 野で周知であり、そして本明細書で簡潔にのみ概説される(例えば、Sambrookら 、(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbo r Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkを参照のこと)。 本発明の形質転換細胞の作製に有用な原核生物細胞としては、Escherichia（ 例えば、E ．coli）、Pseudomonas（例えば、P ．aeruginosa）、およびBacillus( 例えば、B ．subtillus、B ．stearothermophilus)の細菌属の一員、ならびに当該 分野で周知であり、そしてしばしば使用されている他の多くものが挙げられる。 原核生物細胞は、本発明のタンパク質またはペプチド(例えば、正常プレセニリ ンまたは変異プレセニリン、プレセニリンのフラグメント、プレセニリンの融合 タンパク質)の大量生産に特に有用である。細菌細胞(例えば、E ．coli)を、例え ば、T7 RNAポリメラーゼ/プロモーター系、λバクテリオファージ調節配列、ま たはM13ファージmGPI-2を有するプラスミドを含む、種々の発現ベクター系と共 に使用し得る。細菌宿主はまた、例えば、lacZ、trpE、マルトース結合タンパ ク質、ポリHisタグ、またはグルタチオン-S−トランスフェラーゼ融合タンパク 質を生じる融合タンパク質ベクターで形質転換され得る。これらの全て、および 多くの他の原核生物発現系は、当該分野で周知であり、そして、広範に市販され ている(例えば、GST融合物については、pGEX-27(Amrad，USA))。 本発明の形質転換細胞の作製に有用な真核生物の細胞および細胞株としては、 哺乳動物の細胞および細胞株(例えば、PC12、COS、CHO、線維芽細胞、ミエロー マ、神経芽細胞肺、ハイブリドーマ、ヒト胚腎293、卵母細胞、胚幹細胞)、昆虫 細胞株(例えば、pPbacまたはpMbac(Strategene，La Jolla，CA)のようなバキュ ロウイルスベクターを使用する)、酵母(例えば、pYESHIS(Invitrogen，CA)のよ うな酵母発現ベクターを使用する)、および真菌が挙げられる。真核生物細胞は 、プレセニリンタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは変異体（vari ants）、またはその変異タンパク質が機能を果たすこと、および／または正常タ ンパク質または変異タンパク質のいずれかに関連する細胞内相互作用を受けるこ とが必要である実施態様に特に有用である。従って、例えば、形質転換真核生物 細胞は、プレセニリンの機能または相互作用のモデルとしての使用のために好ま しく、そして候補の治療剤のスクリーニングのためのアッセイは、好ましくは、 形質転換真核生物細胞を使用する。 真核生物細胞内での発現を達成するために、人工的なプロモーターエレメント の調節下で、プレセニリンヌクレオチド配列の誘導可能な(例えば、LacSwitch発 現ベクター、Stratagene，La Jolla，CA)、または同じ性質の(例えば、pcDNA3ベ クター、Invitrogen，Chatsworth，CA)発現を可能にする、広範な種類のベクタ ーが開発されており、そして市販されている。このようなプロモーターエレメン トは、しばしばCMVまたはSV40ウイルス遺伝子由来であるが、真核生物細胞内で 活性な他の強いプロモーターエレメントもまた、プレセニリンヌクレオチド配列 の転写を誘導するために使用し得る。代表的には、これらのベクターはまた、ま た外因性ウイルス遺伝子配列由来であり得るかまたは他の真核生物遺伝子由来で あり得る、人工的なポリアデニル化配列および3'UTRを含む。さらに、いくつか の構築物において、人工的で、非コードの、スプライス可能なイントロンおよび エキソンがベクター中に含まれて、目的のヌクレオチド配列(この場合プレセニ リン配列)の発現を増強する。これらの発現系は、通常、市販であり、そしてpcD NA3およびpZeoSV(Invitrogen，San Diego，CA)のようなベクターによって代表さ れる。後者のベクターの両方を首尾よく使用して、トランスフェクトされたCOS 、CHO、およびPC12細胞(Levesqueら、1996)内でプレセニリンタンパク質の発現 を生じる。無数の市販の発現ベクターおよび注文設計された発現ベクターは、市 販であり、構成的にまたは特定の外因性刺激(例えば、テトラサイクリンの使用 中止またはIPTGへの曝露)への曝露後のいずれかで、多かれ少なかれ任意の所望 の細胞型における任意の所望のプレセニリン転写物の発現を可能にする。 ベクターを、以下の当該分野で周知の種々の方法によって、レシピエントまた は「宿主」細胞に導入し得るが、これらに限定されない：リン酸カルシウムトラ ンスフェクション、リン酸ストロンチウムトランスフェクション、DEAEデキスト ラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション(例え ば、Dosperリポソームトランスフェクション試薬、Boehringer Mannheim，Germa ny)、マイクロインジェクション、マイクロビーズでの弾道挿入(ballistic inse rtion)、プロトプラスト融合、またはウイルスベクターまたはファージベクター については、組換えウイルスもしくはファージでの感染による。 ５．トランスジェニック動物モデル 本発明はまた、変異型もしくは野生型のプレセニリン配列が発現されるか、ま たはプレセニリン遺伝子が不活化されている(例えば、「ノックアウト」欠失)、 アルツハイマー病の研究のため、候補の薬学的化合物のスクリーニングのため、 外植した哺乳動物CNS細胞培養物(例えば、ニューロン、グリア、器官型、または 混合した細胞の培養物)の作製のため、および潜在的な治療的介入の評価のため の、トランスジェニック非ヒト動物モデルの作製を提供する。さらに、本発明は 、プレセニリンと相互作用するタンパク質（例えば、Ｓ５ａ）をコードする変異 型もしくは野生型の配列が発現されるか、またはこれらの遺伝子が不活化されて いる(例えば、「ノックアウト」欠失)、動物モデルを提供する。本発明より前に 、アルツハイマー病についての部分的な動物モデルが、血小板由来増殖因子βレ セプタープロモーターエレメントの調節下で、ミニ遺伝子としてヒトアミロイド 前 駆体タンパク質遺伝子の変異型を挿入し、そして過剰発現させることによって存 在した(Gamesら、1995 Nature 373:523-527)。この変異体(βAPP717Val→Ile)は 、高いコピー数でこのトランスジーンをを有するトランスジェニック動物の脳に おいて、シナプス病理学およびアミロイドβペプチドの沈着の出現を引き起こす 。トランスジェニック動物の脳におけるこれらの変化は、ヒトADに見られる変化 と非常に類似している(Gamesら、1995)。しかし、このような動物が痴呆になる かどうかはまだ明らかでないが、現在はマウスにおいてADの少なくともいくつか の局面を再現することは可能であるという一般的な総意が存在する。 本発明の動物モデルにおける使用に適切な動物種として、ラット、マウス、ハ ムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒ ト霊長類(例えばアカゲザル、チンパンジー)が挙げられるが、これらに限定され ない。最初の研究のためには、トランスジェニック齧歯類(例えばマウス)が、維 持が比較的容易であるため、および短い寿命のために好ましい。実際、上記で留 意したように、トランスジェニック酵母または無脊椎動物(例えば線虫、昆虫)は 、これらがさらにより迅速かつ安価なスクリーニングを可能とするために、いく つかの研究のために好ましいかもしれない。しかし、トランスジェニック非ヒト 霊長類は、それらのヒトに対するより顕著な類似性のため、およびそれらの高い 認知能力のために、さらに長期間の研究に好ましいかもしれない。 本明細書中に開示されるかさもなければ可能とされる核酸を使用すれば、現在 、アルツハイマー病のためのトランスジェニック動物モデルの作製のためのいく つかの利用可能なアプローチが存在する。従って、可能になった動物モデルとし ては、以下が挙げられる。(１)外因性もしくは内因性のプロモーターエレメント のいずれかの調節下でのさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子もしくは大き なゲノムフラグメントのいずれかとして、正常なヒトプレセニリン遺伝子の少な くとも機能的ドメインをコードする配列が動物のゲノム中に組換えにより導入さ れている動物；相同組換えもしくは遺伝子標的化によって、正常ヒトプレセニリ ン遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が動物の相同なプレセニ リン遺伝子の１コピーもしくは両方のコピーと組換えにより置換されている動物 ；および／または動物の相同なプレセニリン遺伝子の１コピーもしくは両方のコ ピ ーが、相同組換えもしくは遺伝子標的化による、ヒトホモログをコードする配列 の部分的置換によって、組換えにより「ヒト化」されている動物。これらの動物 は、トランスジェニック手順の効果、およびヒトプレセニリン遺伝子またはヒト 化プレセニリン遺伝子の導入または置換の結果を評価するために有用である。（ ２）外因性もしくは内因性プロモーターエレメントのいずれかの調節下でのさら なる遺伝子として、およびミニ遺伝子もしくは大きなゲノムフラグメントのいず れかとして、変異(すなわち病原性)ヒトプレセニリン遺伝子の少なくとも機能的 ドメインをコードする配列が動物のゲノム中に組換えにより導入されている動物 ；変異ヒトプレセニリン遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が 、相同組換えもしくは遺伝子標的化によって動物の相同なプレセニリン遺伝子の １コピーもしくは両方のコピーと組換えにより置換されている動物；および／ま たは動物の相同なプレセニリン遺伝子の１コピーまたは両方のコピーが、相同組 換えもしくは遺伝子標的化による変異ヒトホモログをコードする配列の部分的な 置換によって、組換えにより「ヒト化」されている動物。これらの動物は、生化 学的、生理学的、および／または挙動的レベルのいずれかで、アルツハイマー病 またはプレセニリン遺伝子の変異に関連する他の疾患の病原である、１つ以上の 対立遺伝子を有するいくつかまたは全てのヒトの特徴を示すモデルとして有用で ある。（３）外因性または内因性のプロモーターエレメントのいずれかの調節下 でのさらなる遺伝子として、およびミニ遺伝子または大きなゲノムフラグメント のいずれかとして、その動物のプレセニリン遺伝子の１つの変異バージョン(例 えば、ヒトプレセニリンの病原性変異の１つに対応するかもしくは類似する特異 的変異を有する)の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が、動物のゲノ ム中に組換えにより導入されている動物；および／もしくは相同組換えもしくは 遺伝子標的化によって、その動物のプレセニリン遺伝子の１つの変異バージョン (例えば、ヒトプレセニリンの病原性変異の１つに対応するかもしくは類似する 特異的変異を有する)の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が、動物の 相同なプレセニリン遺伝子の１コピーもしくは両方のコピーと、組換えにより置 換されている動物。これらの動物はまた、生化学的、生理学的、および／または 挙動的レベルのいずれかで、アルツハイマー病の病原である１つ以上の対立 遺伝子を有するいくつかまたは全てのヒトの特徴を示すモデルとして有用である 。(４)この動物のプレセニリン遺伝子の１コピーもしくは両方のコピーが、相同 組換えもしくは遺伝子標的化によって部分的または完全に欠失しているか、また は外因性配列の(例えば、停止コドン、lox p部位)相同組換えもしくは遺伝子標 的化による挿入または置換によって不活化されている、「ノックアウト」動物。 このような動物は、プレセニリン遺伝子発現の損失が有し得る影響を研究するた め、機能の損失が変異型の連続的な発現に好ましいかどうかを評価するため、お よびADまたは他の疾患の処置として、変異プレセニリンを置換する(例えば、PS1 をPS2で置換する)ため、またはADを引き起こす他の遺伝子(例えば、APPまたはAp oE)の影響に介入するため他の遺伝子が補充され得るかどうかを試験するための モデルとして有用である。例えば、正常プレセニリン遺伝子は、実際にADとして 発現されるために変異APP遺伝子の作用に必要であり得、それゆえ、トランスジ ェニックプレセニリン動物モデルは、このような複遺伝子性相互作用の解明に有 用であり得る。 １つ以上のプレセニリンの発現が変化したトランスジェニック動物モデルに加 えて、本発明はまた、プレセニリンと相互作用するタンパク質の１つ以上の発現 が変化したトランスジェニック動物モデルの産生を提供する。従って、以下に詳 述するように、本発明は、正常型および／または変異型プレセニリンと相互作用 するタンパク質を同定する種々の方法（例えば、アフィニティークロマトグラフ ィー、免疫共沈、生体分子相互作用アッセイ(biomolecular interaction assay) 、酵母ツーハイブリッドシステム）を提供する。これらの「PS相互作用タンパク 質」またはそれらのタンパク質の相互作用ドメインをコードする核酸は、次いで 単離され得、そして、任意の対応する内因性配列に加えて、またはその代わりに 、それらのタンパク質の正常または変異体配列を有するトランスジェニック体が 産生され得る。実際、動物モデルは、それらのプレセニリン配列においてのみな らず、それらのPS相互作用タンパク質の配列においてもヒトと異なり得るので、 プレセニリンに加えて少なくとも１つのPS相互作用タンパク質のための正常また は変異体ヒト配列を有するトランスジェニック体が産生され得ることが特に意図 される。このような同時形質転換された動物モデルは、ヒト分子生物学のより多 い エレメントを有し、従って、ヒト疾患のより良好なモデルであると期待される。 従って、本発明に従って、１つ以上のPS相互作用タンパク質、またはこれらのタ ンパク質の相互作用ドメインについての正常もしくは変異体配列を有するトラン スジェニック動物モデルが最初に産生され得る。これらの動物は、それらが種々 の正常もしくは変異体プレセニリン配列を有する動物と交配されて、同時形質転 換された動物モデルを産生し得るという点での有用性を有する。さらに、以下に 詳述のように、PS相互作用遺伝子における変異は、プレセニリンそれ自身におけ る変異のように、アルツハイマー病および/または他の障害(例えば、他の認識障 害、知能障害、神経学的障害、心理学的障害(例えば、脳出血、精神分裂病、鬱 病、精神遅滞、およびてんかん))を引き起こし得ることが予想される。従って、 任意のプレセニリン配列での形質転換なしに、PS相互作用タンパク質に対応する 正常または変異体配列を有するトランスジェニック動物モデルは、このような障 害の研究におけるそれら自身の有用性を有する。 以下に詳述するように、PS相互作用タンパク質またはPS相互作用タンパク質の ドメインで形質転換されたトランスジェニック動物モデルのための好ましい選択 には、実施例15で同定および記載され、そして配列番号26〜41で開示されたクロ ーンに対応する正常または変異体配列で形質転換されたものが挙げられる。正常 または変異体PS1 TM6→7ループドメインと相互作用するこれらのクローンは、酵 母ツーハイブリッドシステムを用いる本発明の方法に従って同定された。これら のクローン、これらのクローンを含む長い核酸配列、ならびに本発明の本方法お よび他の方法によって同定された他のクローン(例えば、プレセニリンの他のド メインと相互作用するタンパク質、ＰＳ１またはＰＳ２と特異的に相互作用する タンパク質、または正常または変異型のプレセニリンと特異的に相互作用するタ ンパク質をコードするクローン)は全て、本発明に従って使用されて、プレセニ リン配列との同時形質転換体を有するか有さない動物モデルを作製し、それは、 アルツハイマー病および/または他の認識障害、知能障害、神経学的障害、もし くは心理学的障害の研究における有用性を有する。 従って、本明細書中で開示されたか、そうでなければ可能とされる核酸を使用 して、ここで、当業者は、変化したPS相互作用タンパク質発現を有する以下の任 意の型のトランスジェニック動物モデルを作製し得る：(１)外因性または内因性 プロモーターエレメントのいずれかの調節下のさらなる遺伝子として、およびミ ニ遺伝子または巨大ゲノムフラグメントとして、正常ヒトPS相互作用タンパク質 遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が動物のゲノムに組換え導 入されている動物；正常ヒトPS相互作用タンパク質遺伝子の少なくとも機能的ド メインをコードする配列が、相同組換えまたは遺伝子標的化によって動物の相同 的PS相互作用タンパク質遺伝子の１つまたは両方を組換え置換されている動物； および/または動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝子の１つの１コピーまた は両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子標的化によってヒトホモログをコー ドする配列の部分的置換によって組換え的に「ヒト化」されている動物。これらの 動物は、ヒトPS相互作用タンパク質ならびにヒトプレセニリンタンパク質を発現 する、より良いトランスジェニックモデルを提供するのに有用である。それらは また、トランスジェニック手順の効率およびヒトまたはヒト化PS相互作用タンパ ク質遺伝子の導入または置換の効果を評価するのに有用である。(２)外因性また は内因性プロモーターエレメントの調節下のさらなる遺伝子として、およびミニ 遺伝子または巨大ゲノムフラグメントとして、変異体(すなわち、病原性)ヒトPS 相互作用タンパク質遺伝子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が、動 物のゲノムに組換え導入されている動物；変異体ヒトPS相互作用タンパク質遺伝 子の少なくとも機能的ドメインをコードする配列が、相同組換えまたは遺伝子標 的化によって動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝子の１コピーまたは両方の コピーを組換え置換されている動物；および/または動物の相同的PS相互作用タ ンパク質遺伝子の１つの１コピーまたは両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝 子標的化によって変異体ヒトホモログをコードする配列の部分的置換によって組 換え的に「ヒト化」されている動物。これらの動物は、アルツハイマー病またはPS 相互作用遺伝子における変異に関連する他の疾患に病原性である１つ以上の対立 遺伝子を保有するヒトのいくつかまたは全ての特徴を、生化学的、生理学的およ び/または挙動レベルのいずれかで表示するモデルとして有用である。(３)外因 性または内因性プロモーターエレメントの調節下のさらなる遺伝子として、およ びミニ遺伝子または巨大ゲノムフラグメントとして、１つのこの動物のPS相互作 用タンパク質遺伝子の変異体バージョンの少なくとも機能的ドメインをコードす る配列(例えば、ヒトPS相互作用タンパク質の病原性変異の１つに対応するか類 似する特異的変異を有する)が、動物のゲノムに組換え導入されている動物；お よび/または相同組換えまたは遺伝子標的化によって、１つのこの動物のPS相互 作用タンパク質遺伝子の変異体バージョンの少なくとも機能的ドメインをコード する配列(例えば、ヒトPS相互作用タンパク質の病原性変異の１つに対応するか 類似する特異的変異を有する)が、動物の相同的PS相互作用タンパク質遺伝子の １コピーまたは両方のコピーを組換え置換されている動物。これらの動物はまた 、アルツハイマー病に病原性である１つ以上の対立遺伝子を保有するヒトのいく つかまたは全ての特徴を、生化学的、生理学的および/または挙動レベルのいず れかで表示するモデルとして有用である。(４)この動物のPS相互作用タンパク質 遺伝子の１つの１コピーまたは両方のコピーが、相同組換えまたは遺伝子標的化 によって部分的にまたは完全に欠失されているか、または外因性配列(例えば、 停止コドン、lox p部位)の相同組換えまたは遺伝子標的化による挿入または置換 によって不活化されている「ノックアウト」動物。このような動物は、PS相互作用 タンパク質遺伝子発現の損失が有し得る効果を研究するため、機能の損失が連続 的な発現に好ましいかどうかを評価するため、およびADまたは他の障害のための 処置として他の遺伝子が変異PS相互作用タンパク質を置換するかまたはADを引き 起こす他の遺伝子(例えば、APPまたはApoE)の効果に介入するように補充され得 るかどうかを試験するための、有用なモデルである。例えば、正常PS相互作用タ ンパク質は、変異体PS1、PS2、またはAPP遺伝子の作用が実際にADとして発現さ れるのに必要であり得、従って、トランスジェニックPS相互作用タンパク質動物 モデルは、このような複遺伝子性相互作用を解明するのに有用であり得る。 動物モデル(例えば、トランスジェニックマウス)を作製するために、正常また は変異プレセニリン遺伝子(例えば、正常または変異のhPS1、mPS1、hPS2、mPS2 など)、プレセニリンの少なくとも１つの機能的ドメインをコードする正常また は変異バージョン組換え核酸(例えば、ヒト変異配列に対応するヌクレオチド配 列が置換されているmPS1配列を含む組換え構築物)、正常または変異PS相互作用 タンパク質遺伝子（例えば、26SプロテアソームS5aまたはp40サブユニット、Rab 11）、またはPS相互作用タンパク質の少なくとも機能的ドメインをコードする正 常または変異バージョン組換え核酸（例えば、酵母ツーハイブリッドクローンY2 H24、Y2H29、Y2H31、Y2HEx10-6）を、卵母細胞マイクロインジェクションの標準 的な技術、または胚幹細胞へのトランスフェクションもしくはマイクロインジェ クションを使用して、生殖系列または幹細胞に挿入し得る。これらまたは同様の 手順によって作製された動物を、トランスジェニックという。同様に、内因性プ レセニリン遺伝子またはPS相互作用タンパク質遺伝子を不活化または置換するこ とが所望される場合、胚幹細胞を使用する相同組換えが用いられ得る。これらま たは同様の手順によって作製された動物を、「ノックアウト」(不活化)または「 ノックイン」(置換)モデルという。 卵母細胞注入のために、本発明の組換えDNA構築物の１つ以上のコピーを、受 精直後の卵母細胞の前核に挿入し得る。次いで、この卵母細胞を、偽妊娠した養 母に再移植する。この生産動物を、挿入された組換えトランスジーン配列の存在 について、DNA(例えば、子孫マウスの尾静脈由来)分析を使用して成分をスクリ ーニングする。トランスジーンは、YAC、BAC、PAC、もしくは他の染色体DNAフラ グメントとして注入された完全なゲノム配列、天然プロモーターまたは異種プロ モーターのいずれかを有するcDNA、または全コード領域および最適な発現に必要 であることが見出されている他のエレメントを含むミニ遺伝子のいずれかであり 得る。 初期胚のレトロウイルス感染もまた、本発明の組換えDNA構築物を挿入するた めに行われ得る。この方法において、トランスジーン(例えば、正常または変異 のhPS1またはPS2配列)を、キメラ(そのいくつかは、生殖系列への伝達を導く)を 作製するために発達の初期段階の間に、直接、胚(例えば、マウスまたは非ヒト 霊長類の胚)を感染させるために使用されるレトロウイルスベクター中に挿入す る。 幹細胞を使用する相同組換えは、希少な相同組換え事象を同定するための遺伝 子移入細胞のスクリーニングを可能にする。一旦同定されると、胚盤胞の注入に よってキメラを作製するためにこれらを使用し得、そして得られる動物の割合は 、組換え系列からの生殖系列伝達を示す。この方法論は、プレセニリン遺伝子の 不 活化が所望される場合に特に有用である。例えば、マウスにおけるmPS1遺伝子の 不活化は、選択的マーカーに隣接するmPS1エキソン由来の配列を含むDNAフラグ メントを設計することによって達成され得る。相同組換えは、エキソンの中央の マーカー配列の挿入を導き、mPS1遺伝子の不活化および／または内部配列の欠失 を引き起こす。次いで、個々のクローンのDNA分析を使用して、相同組換え事象 を認識し得る。 トランスジェニック動物の作製技術、および相同組換えまたは遺伝子標的化の 技術は、現在、広範に受け入れられそして実施される。例えば、マウス胚の操作 の実験マニュアルは、入手可能であり、トランスジェニックマウスの作製のため の標準的な実験技術を詳細に記載している(Hoganら、（1986）Manipulating the Mouse Embryo ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， New York)。トランスジーンを作製するために、目的の標的配列(例えば、正常ま たは変異体のプレセニリン配列、正常または変異体のPS相互作用タンパク質配列 )を、代表的には、当該配列からのRNAの発現を調節するいくつかのプロモーター エレメントの下流に位置するクローン化部位に連結する。コード配列の下流には 、代表的には人工的なポリアデニル化配列が存在する。遺伝性のヒト神経変性性 疾患の局面を模倣する動物を首尾よく作製するために使用されてきたトランスジ ェニックモデルにおいて、最もうまくいったプロモーターエレメントは、血小板 由来増殖因子レセプターβ遺伝子サブユニットプロモーターおよびハムスタープ リオンタンパク質遺伝子プロモーターであるが、中枢神経系細胞における発現を 導く他のプロモーターエレメントもまた有用である。トランスジーンを作製する ための別のアプローチは、トランスジーンの発現を駆動するための内因性のプレ セニリンまたはPS相互作用タンパク質遺伝子プロモーターおよび調節配列の使用 である。最終的に、所望の遺伝子全体およびその適切な調節配列を含むYACのよ うな大きなゲノムDNAフラグメントを使用して、トランスジーンを作製すること が可能である。このような構築物は、トランスジェニックマウスにおけるヒトAP P発現を駆動するために首尾よく使用されてきた(Lambら、（1993）Nature Genet ics 5:22-29)。 動物モデルをまた、内因性配列を変化させるために、内因性プレセニリンまた はPS相互作用タンパク質遺伝子を相同組換えによって標的化することにより作製 し得る。これらの標的化事象は、内因性配列を除去(ノックアウト)する効果、ま たは内因性配列を変化させて、ヒトの疾患に関連するアミノ酸の変化または他の 異常配列(例えば、元の動物の配列よりもヒトの配列に似ている配列)を生じると いう効果を有し得る(ノックイン動物モデル)。多数のベクターが、これを達成す るために利用可能であり、そして標的化されるべきマウスおよび他の動物のゲノ ムについてのゲノムDNAの適切な供給源は、GenomeSystems Inc.(St．Louls，Mis souri，USA)のような会社から市販されている。これらの標的化ベクター構築物 の代表的な特徴は、２〜４kbのゲノムDNAが、選択マーカー(例えば、「ネオマイ シンカセット」と呼ばれるネオマイシン耐性遺伝子自身のプロモーターエレメン ト下の細菌性ネオマイシン耐性遺伝子)の５’側に連結されていることである。 次いで、目的の遺伝子由来の第２のDNAフラグメントを、ネオマイシンカセット の下流だが第２の選択マーカー(例えば、チミジンキナーゼ)の上流に連結する。 ベクターに含まれる配列のいずれか１つによる内因性配列の相同置換によって、 変異配列が標的化される動物の生殖系列に導入され得るように、このDNAフラグ メントを選択する。あるいは、ネオマイシンカセットを取り囲むベクターの右の アームと左のアームの間に通常存在する配列の欠失を引き起こすために、配列を 選択し得る。前者はノックインとして知られ、後者はノックアウトとして知られ る。さらに、特に、神経変性性疾患に関連する遺伝子を含む遺伝子の標的化され たノックアウトのために、無数のモデル系が作製された(例えば、Zhengら、（19 95）Cell 81:525-531によるマウスAPP遺伝子の標的化された欠失；Buelerら、（ 1996）Nature 356:577-582による成人発症性ヒトCNS変性に関連するマウスプリ オン遺伝子の標的化された欠失)。 最終的に、トランスジェニック動物(変異または不活化したプレセニリン遺伝 子、または変異または不活化したPS相互作用タンパク質遺伝子を有する動物を含 む)の等価物を、接合子の化学的変異誘発またはｘ線変異誘発とその後の受精を 使用して作製し得る。本明細書中に開示されるかまたは可能とされる単離された 核酸を使用して、当業者は、得られた子孫を、例えば、変異体を検出するための 直接的配列決定RFLP、PCR、もしくはハイブリダイゼーション分析、または量に より１つの対立遺伝子の欠失を実証するためのサザンブロッティングによって、 より迅速にスクリーニングし得る。 ６．プレセニリン発現に影響を与える薬物についてのアッセイ 別の一連の実施態様において、本発明は、プレセニリン遺伝子およびタンパク 質(例えば、PS1またはPS2)の発現を誘導または阻害し得る低分子または他の化合 物を同定するためのアッセイを提供する。このアッセイを、非形質転換細胞、不 死化細胞株、もしくは組換え細胞株を使用してインビトロで実施し得るか、また は本明細書中で可能になったトランスジェニック動物モデルを使用してインビボ で実施し得る。 特に、このアッセイは、mRNA発現の増大または減少に基づく、PS1、PS2、もし くは他のプレセニリン関連遺伝子またはタンパク質の発現の増大または減少(例 えば、本明細書中で開示されるかまたは可能になった核酸プローブを使用して) 、PS1、PS2、もしくは他のプレセニリン関連タンパク質産物のレベルの増大もし くは減少(例えば、本明細書中で開示されるかまたは可能になった抗プレセニリ ン抗体を使用して)、または組換え構築物においてプレセニリンの５’調節領域 に作動可能に連結されたマーカー遺伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼまたはル シフェラーゼ)の発現レベルの増大もしくは減少の存在を検出し得る。 従って、例えば、特定のプレセニリンを発現することが知られる細胞を培養し 得、そして１つ以上の試験化合物の培養培地に添加し得る。化合物がプレセニリ ン発現を誘導または阻害するに十分な時間(例えば、０〜72時間)を経た後、発現 レベルにおける確立されたベースラインからのいかなる変化も、上記および当該 分野で周知の任意の技術を使用して検出し得る。特に好ましい実施態様において 、細胞は、ヒト神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、またはハイブリドーマ細胞株の ような不死化細胞株由来である。本明細書中で開示されそして可能になった核酸 プローブおよび／または抗体を使用して、プレセニリンの発現における変化の検 出、従って、プレセニリン発現のインデューサーまたはリプレッサーとしての化 合物の同定は、日常的な実験しか必要としない。 特に好ましい実施態様において、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質 、 アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子がプ レセニリン遺伝子の５’調節領域に作動可能に連結される、組換えアッセイを使 用する。好ましいベクターとしては、Green Lantern 1ベクター(GIBCO/BRL，Gai thersburg，MD)、およびGreat EScAPe pSEAPベクター(Clontech，Palo Alto)が 挙げられる。本明細書中で開示されるhPS1調節領域または他のプレセニリン調節 領域は、これらの遺伝子のコード領域についての本明細書の開示に照らして、当 業者によって容易に単離およびクローン化され得る。レポーター遺伝子および調 節領域は、レポーター遺伝子の転写および翻訳が、プレセニリン調節エレメント の制御下で進行し得るようにインフレームで(または３つの可能なリーディング フレームの各々において)連結される。次いで、組換え構築物を任意の適切な細 胞型(哺乳動物細胞が好ましく、そしてヒト細胞が最も好ましいが)中に導入し得 る。形質転換細胞を培養して増殖し得、そしてレポーター遺伝子の発現レベルの ベースラインを確立した後に、試験化合物を培地に添加し得る。レポーター遺伝 子の発現の検出が容易であるため、プレセニリン遺伝子のインデューサーおよび リプレッサーの同定のための迅速で高処理量のアッセイが提供される。 この方法により同定された化合物は、PS1、PS2、または他のプレセニリン関連 遺伝子の発現をインビボで改変するのに潜在的な有用性を有する。これらの化合 物を、本明細書中で開示されそして可能になった動物モデルにおいてさらに試験 し、最も強力なインビボでの効果を有する化合物を同定し得る。さらに、プレセ ニリン結合活性を有する低分子に関して本明細書中で記載したように、これらの 分子は、例えば、連続的改変、分子のモデル化、および合理的なドラッグデザイ ンにおいて使用される他の日常的な手順にこの化合物を供することによって、医 薬品のさらなる開発のための「リード化合物」として役立ち得る。 ７．プレセニリン結合性能力を有する化合物の同定 本開示に照らして、当業者は、プレセニリンに結合する、そうでなければ直接 的に相互反応するタンパク質または他の化合物の同定に有用である新たなスクリ ーニング方法を実施し得る。タンパク質および化合物は、インビボでプレセニリ ンと相互作用し、従って、薬学的および治療的介入、ならびにプレセニリン結合 能力を有し得、従って、薬学的薬剤についての候補であり得る、組換え、合成、 およびそうでなければ内因性の化合物についての新たな標的を提供する内因性細 胞成分を含む。従って、一連の実施態様において、細胞溶解物または組織ホモジ ネート（例えば、ヒト脳ホモジネート、リンパ球溶解物）を、正常または変異プ レセニリンの１つに結合するタンパク質または他の化合物についてスクリーニン グし得る。あるいは、任意の種々の内因性化合物（天然に生じるおよび／または 合成の両方（例えば、低分子またはペプチドのライブラリー））は、プレセニリ ン結合能力についてスクリーニングされ得る。低分子はこの意味で特に好ましい 。なぜなら、それらは経口投与後により容易に吸収され、より少ない潜在的抗原 決定基を有し、そして／あるいは核酸またはタンパク質のようなより大きい分子 よりも、血液脳関門をより横断しそうであるからである。本発明の方法は、それ らを用いて、（正常形態よりはむしろ）プレセニリンタンパク質の変異形態に選 択的または優先的に結合する、従って、この優性常染色体疾患のヘテロ接合性の 犠牲者の処置において特定の有用性を有し得る分子を同定し得る点で特に有用で ある。 PS1およびPS2の正常な生理学的役割はなお未知であるので、これらのプレセニ リンの正常、変異または両方の形態に結合する化合物は、処置および診断に対し て有用性を有し得る。正常プレセニリンにのみ結合する化合物は、例えば、その 正常活性のエンハンサーとして作用し得、それにより、アルツハイマー病の犠牲 者におけるプレセニリンの変異形態の失われたまたは異常な活性を少なくとも部 分的に補い得る。プレセニリンの正常および変異の両方の形態に結合する化合物 は、正常機能からの全体の逸脱を軽減するように、それらが２つの形態の活性に ディファレンシャルに影響する場合、有用性を有し得る。あるいは、PS1またはP S2いずれかの正常および変異形態の両方の活性のブロックは、疾患の通常の進行 よりも重篤でない生理学的および臨床的結果を有し得、従って、プレセニリンの 正常および変異の両方の形態に結合し、そしてその活性を阻害する化合物は、治 療的に有用であり得る。しかし、好ましくは、正常プレセニリンよりも変異プレ セニリンに対して高い結合親和性を有し（例えば、少なくとも２〜10倍は高いKa ）、そして変異形態の活性を選択的または優先的に阻害する化合物が同定され る。このような化合物は、本明細書中に記載の任意の技術を用い、次いで、PS1 またはPS2の正常および変異形態に対して候補化合物（単数または複数）の結合 親和性を比較することによって、同定され得る。 プレセニリン（正常または変異形態）に結合する薬剤の効果は、装置（例えば 、BIAcore，LKB Pharmacia，Sweden）を用いてこの結合を直接モニターして、 この結合を、例えば、可溶性相または基質−結合相のいずれかにおいて、結合薬 剤またはプレセニリン成分のいずれかの蛍光、分子量、または濃度の変化によっ て検出することによって、モニターされ得る。 一旦上記の方法によって同定されると、次いで、候補化合物は薬学的投与また は試験のために十分な量で（例えば、μｇまたはmgまたはより大きい量）で生産 され得、そして薬学的に受容可能なキャリア(例えば、Remington's Pharmaceuti cal Sciences ，Gennaro，A.編，Mack Pub.，1990を参照のこと)中に処方さ得る 。次いで、これらの候補化合物は、本発明の形質転換細胞、本発明のトランスジ ェニック動物モデル、動物モデルまたはヒト患者由来の細胞株、またはアルツハ イマー患者に投与され得る。本明細書中に記載されそして実施可能にされた動物 モデルは、それらの治療効力について正常または変異プレセニリンに結合する候 補化合物をさらに試験するのに特に有用である。 さらに、一旦上記の方法によって同定されると、候補化合物は、新たな医薬の 設計および開発において「リード化合物」としても作用し得る。例えば、当該分 野で周知であるように、低分子の連続的な修飾（例えば、ペプチドについてのア ミノ酸残基置換；ペプチドまたは非ペプチド化合物についての官能基置換）は、 新たな医薬の開発のための、医薬産業における標準的なアプローチである。一般 に、このような開発は、所望の医薬の活性（例えば、PS1結合またはブロック活 性）のうちの少なくともいくつかを有することが示されている「リード化合物」 から進行する。特に、目的の少なくともいくつかの活性（例えば、プレセニリン 活性の調節）を有する１以上の化合物が同定されると、分子の構造的比較は、保 存されているはずであるリード化合物の部分、および新たな候補化合物の設計に おいて変化され得る部分を示唆することによって、当業者に大いに情報を与え得 る。従って、本発明は、順次に修飾され得、アルツハイマー病の処置における使 用のための新たな候補化合物を生成するリード化合物を同定する手段も提供する 。次いで、これらの新たな化合物は、プレセニリン−結合またはブロックについ て（例えば、上記の結合アッセイにおいて）、および治療効力について（例えば 、本明細書に記載の動物モデルにおいて）の両方で試験され得る。この手順は、 所望の治療活性および／または効力を有する化合物が同定されるまで、反復され 得る。 本発明の一連の各々の実施態様において、アッセイを行って、「プレセニリン 成分」といくつかの他の部位との間の結合を検出する。特に有用なのは、連続的 なアッセイであり、ここで、化合物は、結合アッセイにおいて変異および正常プ レセニリン成分を用いて、プレセニリンの機能的ドメインの正常形態のみまたは 変異形態のみに結合する能力について試験される。このような化合物は、以下に より詳細に記載するように、最大の治療的有用性を有すると予測される。これら のアッセイにおける「プレセニリン成分」は、プレセニリンタンパク質の完全に 正常な形態または変異形態（例えば、hPS1またはhPS2変異体）であり得るが、そ うである必要はない。むしろ、上記のように、プレセニリンの特定の機能的ドメ インは、別々の分子としてまたは融合タンパク質の一部としてのいずれかで用い られ得る。例えば、これらの機能的ドメインと相互作用するタンパク質または化 合物を単離するために、融合構築物および／またはこれらの領域に対応する合成 ペプチドを用いてスクリーニングを行い得る。従って、PS2については、アミノ 酸１〜87（Ｎ末端）、または269〜387（TM6→7ループ）に、あるいは目的の任意 の他の保存ドメインにほぼ対応する配列を含めて、GST−融合ペプチドを作製し 得る。より短い機能的ドメインについては、例えば、アミノ酸107〜134（TM1→2 ループ）にほぼ対応する合成ペプチドを生産し得る。同様に、PS1については、 アミノ酸1〜81（Ｎ末端）または266〜410（TM6→7ループ）にほぼ対応する配列 を含めて、GTS−または他の融合タンパク質を生産し得る。あるいは、アミノ酸1 01〜131（TM1→2ループ）にほぼ対応する合成ペプチドが生産され得る。明らか に、融合タンパク質およびプレセニリン機能的ドメインの種々の組合せが可能で あって、そしてこれらは例に過ぎない。さらに、機能的ドメインを変化させて、 例えば、ドメインを基材上に固定化する（例えば、スルフヒドリル反応を用い て）ことを容易にする、反応性基またはアミノ酸残基（例えば、システイン）を 、機能的ドメインに導入することによって、アッセイを補助し得る。従って、例 えば、さらなるＣ末端システイン残基を含有する、PS1TM1→2ループフラグメン ト（31マー）が合成された。このペプチドは、アフィニティークロマトグラフィ ー(Sulfo−link，Pierce)のためのアフィニティー基材を作製して、マイクロ配 列決定のための結合タンパク質を単離するために使用される。同様に、修飾され た残基を用いて、他の機能的ドメインまたは抗原性フラグメントを作製し得る（ 例えば、実施例10を参照のこと）。 これらの方法によって同定されるタンパク質または他の化合物は、当該分野で 公知の任意の標準的方法によって、精製および特徴付けされ得る。タンパク質は 、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、2D PAGE）またはクロマトグラフィー （例えば、HPLC）技術を用いて精製および分離され得、次いで、マイクロ配列決 定され得る。ブロックされたＮ末端を有するタンパク質については、特定の結合 タンパク質の切断（例えば、CNBrおよび／またはトリプシンによる）を用いて、 ペプチドフラグメントを放出させ得る。HPLCによるさらなる精製および／または 特徴付け、ならびに従来法によるミクロ配列決定および／または質量分析は、こ のようなブロックされたタンパク質の内部配列データを提供する。非タンパク質 化合物については、標準的有機化学分析技術（例えば、IR、NMRおよび質量分析 ；官能基分析；Ｘ線結晶解析）を用いて、それらの構造および正体（identity） を決定し得る。 細胞溶解物、組織ホモジネート、または低分子ライブラリーを、候補プレセニ リン−結合分子についてスクリーニングする方法は、当該分野で周知であり、そ して本開示に照らして、今や、それを用いて、正常または変異プレセニリン化合 物に結合する、あるいは非特異的尺度（例えば、細胞内Ca2+、GTP／GDP比の変化 ）によって、または特異的尺度（例えば、Aβペプチド産生の変化またはディフ ァレンシアルディスプレイ、2Dゲル電気泳動、ディファレンシアルハイブリダイ ゼーション、またはSAGE方法によってモニターされ得る、他の下流遺伝子の発現 の変化）によって定義される、プレセニリン活性を調節する化合物を同定し得る 。好ましい方法は、以下の技術の変形を含む：（１）アフィニティークロマト グラフィーによる直接的抽出；（２）免疫沈降によるプレセニリン成分および結 合タンパク質または他の化合物の同時単離；（３）Biomolecular Interaction A ssay(BIAcore)；ならびに（４）酵母ツーハイブリッドシステム。これらおよび 他のものを、以下に別々に議論する。 Ａ．アフィニティークロマトグラフィー 本開示に照らして、当該分野で周知の種々のアフィニティー結合技術を用いて 、本明細書において開示されたまたは実施可能にされたプレセニリンに結合する タンパク質または他の化合物を単離し得る。一般に、プレセニリン成分は、基材 （例えば、カラムまたはフィルター）上に固定化され得、そして試験化合物（単 数または複数）を含む溶液を、結合に許容性の条件下でプレセニリンタンパク質 、融合体またはフラグメントと接触させる。次いで、基材を溶液で洗浄して、非 結合のまたは弱く結合した分子を除去する。次いで、第２の洗浄により、固定化 された正常または変異プレセニリン成分に強力に結合するこれらの化合物を溶出 させ得る。あるいは、試験化合物を固定化し得、そして１つ以上のプレセニリン 成分を含有する溶液を、カラム、フィルターまたは他の基材と接触させ得る。プ レセニリン成分が試験化合物に結合する能力は、上記のように測定され得るか、 またはプレセニリン成分の標識形態（例えば、放射性標識されたまたは化学ルミ ネセンス性の機能的ドメイン）を用いて、基材−固定化化合物への結合をより迅 速に評価し得る。さらに、PS1およびPS2の両方は膜会合タンパク質であると考え られているので、プレセニリンタンパク質、融合体またはフラグメントを脂質二 重層例えば、リポソーム）に組み込んで、これらの適切な折り畳みを促進するこ とが好ましくあり得る。これは特に、少なくと別の膜貫通ドメインを含むプレセ ニリン成分を使用する場合に真である。このようなプレセニリン−リポソームは 、基材に固定化され得（直接的またはリポソーム膜中の別のエレメントによる） 、固定化された試験化合物で基材を通過されせ得るか、あるいは膜タンパク質の ための任意の他の周知の種々の結合アッセイにおいて使用され得る。あるいは、 プレセニリン成分は、成分を産生する細胞由来の膜画分中に単離され得、そして この膜画分は結合アッセイにおいて使用され得る。 Ｂ．免疫共沈 プレセニリン成分およびそれらの関連タンパク質または他の化合物の単離のた めの、別の十分に特徴付けられた技術は、抗体を用いる直接的免疫沈降である。 この手順は、例えば、多くのシナプス小胞関連タンパク質を単離するために首尾 よく用いられた(PhizickyおよびFields，(1994)Microbiol ．Reviews 59:94-123) 。従って、正常または変異、遊離または膜結合のいずれかのプレセニリン成分を 、結合に許容性の条件下で候補化合物（単数または複数）と溶液中で混合し得、 そしてプレセニリン成分を、免疫沈降させ得る。次いで、プレセニリン成分と免 疫共沈するタンパク質または他の化合物を、上記の標準的な技術によって同定し 得る。免疫沈降のための一般的技術は、例えば、HarlowおよびLane(1988)，Anti bodies:A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor ，NYに見出され得る。 このアッセイにおいて使用される抗体は、本明細書において記載されそして実 施可能にされたように、ポリクーナルまたはモノクローナルであり得、そして種 々の抗体フラグメント（例えば、Fab、F(ab')2）および単鎖抗体などを含む。 Ｃ．Biomolecular Interaction Assay 結合タンパク質の検出および単離のための別の有用な方法は、Pharmacia Bios ensorによって開発され、そして製造者のプロトコルに記載されている（LKB Ph armacia,スウェーデン）Biomolecular Interaction Assayまたは「BIAcore」シス テムである。本開示に照らして、当業者は、今や、このシステム、または実質的 な等価物を使用して、プレセニリン結合能力を有するタンパク質または他の化合 物を同定し得る。BIAcoreシステムは、アフィニティー精製抗GST抗体を用いて、 GST融合タンパク質をセンサーチップ上に固定化させる。明らかに、他の融合タ ンパク質および対応する抗体は、置換され得る。センサーは、屈折率の変化を検 出する光学的現象である表面プラズモン共鳴を利用する。目的の組織のホモジネ ートを固定化融合タンパク質に通し、そしてタンパク質−タンパク質相互作用を 屈折率の変化として記録する。このシステムを用いて、結合の反応速度を測定し 得、そして全ての観察された結合が生理学的関連であるか否かを評価し得る。 Ｄ．酵母ツーハイブリッドシステム 酵母「ツーハイブリッド」システムは、２つの物理的に分離可能な、機能的ド メインからなる転写因子を利用する(PhizickyおよびField，1994)。最も一般に 使用されるのは、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインよりなる酵母GAL4 転写アクチベーターである。２つの異なるクローニングベクターを用いて、潜在 的な結合タンパク質をコードする遺伝子に対するGAL4ドメインの別々の融合体を 生じさせる。融合タンパク質を同時発現させ、核に標的化し、そしてもし相互作 用が起これば、レポーター遺伝子（例えば、lacZ）の活性化により検出可能な表 現型を生じる。例えば、Clontech Matchmaker System-2を、プレセニリン−GAL4 結合性ドメイン融合クローンを用いて、Clontech脳cDNA GAL4活性化ドメイン融 合ライブセリーとともに用い得る(Clontech，Palo Alto，CA)。本明細書におけ る開示に照らして、当業者は、今や、プレセニリンタンパク質の正常または変異 機能的ドメインのいずれかを含む融合を含む、種々のプレセニリン融合体を生産 し、そしてプレセニリン結合タンパク質を同定するためにこのような融合ライブ セリーをスクリーニングすることが実施可能である。 Ｅ．他の方法 これらの核酸の変異形熊および正常形態の両方、ならびにそれらの対応するタ ンパク質を含むヌクレオチド配列およびタンパク質産物を、前記技術とともに用 いて、他の相互作用性タンパク質を単離し、そしてその発現が正常プレセニリン 配列の過剰発現によつて、正常プレセニリン配列の過小発現によって、または変 異プレセニリン配列の発現によって変化される他の遺伝子を同定し得る。これら の相互作用性タンパク質の同定、および（例えば）その発現レベルが変異プレセ ニリン配列に直面して変化される他の遺伝子の同定により、その臨床的または病 理学的形態においてこの疾患の病状に対して直接的関連を有する他の遺伝子標的 が同定される。詳細には、それ自体がアルツハイマー病を引き起こす他の変異の 部位であり得る、あるいはこの疾患のための潜在的処置としてそれ自体が治療的 に標的化され得る（例えば、それらの発現レベルを正常まで低下させるため、ま たはそれらの過剰発現の影響を薬理学的にブロックするために）、他の遺伝子が 同定される。詳細には、これらの技術は、PCRに基づくおよび／またはハイブリ ダイゼーションに基づく方法に依存して、２つの条件（変異プレセニリン配列を 発現する同一細胞型と比較しての、正常プレセニリンを発現する細胞株）の間で ディファレンシャルに発現される遺伝子を同定する。これらの技術は、ディファ レンシャルディスプレイ、遺伝子発現の連続的分析（SAGE）、およびタンパク質 2D−ゲルの質量分析、およびサブトラクティブハイブリダイゼーションを含む(N owak，（1995）Science 270:368-371およびKahn，（1995）Science 270:369-370 に概説される)。 当業者に明白なように、正常または変異プレセニリン成分に結合する分子を同 定するための、個々のタンパク質または他の化合物、あるいはタンパク質または 他の化合物の大きなライブラリー（例えば、Stratagene，La Jolla,カリフォル ニアからのファージディスプレイライブラリーおよびクローニングシステム）を スクリーニングする多数の他の方法が存在する。これらの方法の全ては、正常ま たは変異のプレセニリンタンパク質、融合体、またはフラグメントを試験化合物 と混合し、結合させ（もしあれば）、そして結合複合体についてアッセイする工 程を包含する。全てのこのような方法が、今や、実質的に純粋なプレセニリン、 実質的に純粋なプレセニリン機能的ドメインフラグメント、プレセニリン融合タ ンパク質、プレセニリン抗体、およびそれらを作製しそして使用する方法の本開 示によって、実施可能にされる。 ８．プレセニリン相互作用の崩壊 プレセニリンの、他のタンパク質との特定の相互作用を崩壊させる能力は、潜 在的に大きな治療的価値があり、そしてADの病因学の理解および治療のためのさ らなる標的の同定において重要である。プレセニリン相互作用を崩壊させる化合 物を同定するために使用する方法は、正常または変異体プレセニリンのいずれか および正常または変異体相互作用タンパク質のいずれかが関与する相互作用にも 同じように適用され得る。 プレセニリン相互作用を崩壊させ得る化合物についてのアッセイは、当該分野 に周知の任意の種々の方法により実施され得る。本質的には、このようなアッセ イは、プレセニリン相互作用タンパク質および化合物の同定のためのこれらのア ッセイと平行する。従って、一旦プレセニリン相互作用タンパク質が任意の方法 により同定されると、相互作用を崩壊させる化合物を同定するための候補化合物 の存在下で、その方法または等価な方法が実施され得る。従って、例えば、アッ セイは、(1)アフィニティクロマトグラフィー；(2)免疫沈降；(3)Biomolecular Interaction Assay(BIAcore)；または(4)酵母ツーハイブリッドシステムを含む 方法を用い得る。このようなアッセイは、精製された正常または変異体プレセニ リンタンパク質のいずれか、および/または正常もしくは変異体の精製されたプ レセニリン相互作用タンパク質のいずれかを用いて開発され得る。 アフィニティ方法については、プレセニリンまたはプレセニリン相互作用タン パク質のいずれかがマトリックス(例えば、カラム中)に固定され得、次いで対応 物タンパク質(プレセニリンがマトリックスに固定される場合は相互作用タンパ ク質；もしくは相互作用タンパク質がマトリックスに固定される場合はプレセニ リンタンパク質)は候補化合物(単数または複数)の添加前または後のいずれかに 、固定されたタンパク質に曝される。候補化合物の崩壊効果の非存在下では、プ レセニリンとプレセニリン相互作用タンパク質との間の相互作用は、対応物タン パク質が固定したタンパク質に結合することを生じる。相互作用を崩壊させる任 意の化合物は、マトリックスからの対応物タンパク質の放出を生じる。マトリッ クスからの対応物タンパク質の放出は、当該分野に公知の方法を用いて測定され 得る。 酵母ツーハイブリッドシステムにより検出され得るプレセニリン相互作用につ いて、これらのアッセイはまた、相互作用を崩壊させる化合物を同定するために 用いられ得る。簡潔には、プレセニリンおよびプレセニリン相互作用タンパク質 (または各々の適切な構造ドメイン)は、そのシステムの融合タンパク質に用いら れ、そして細胞はレポーター遺伝子の発現における候補化合物の効果を決定する ために候補化合物に曝露され得る。レポーター遺伝子の適切な選択により、この ような系は、化合物の巨大ライブラリーの高スループットスクリーニング(例え ば、培地中に存在する抗生物質に耐性を与えるレポーター遺伝子を用いること、 または最少培地中で増殖する栄養要求株をレスキューするレポーター遺伝子を用 いることによる)のために容易に適用され得る。 これらのアッセイは、多数の異なるタイプの化合物を、プレセニリンの相互作 用におけるそれらの崩壊効果についてスクリーニングするために使用され得る。 例えば、化合物は合成分子のライブラリーに属し得るか、または相互作用を崩壊 させるように特異的に設計され得る。化合物はまた、いずれかのタンパク質の相 互作用ドメインに対応するペプチドであり得る。このタイプのアッセイは、ある プレセニリン改変体と所定の相互作用タンパク質との間の特異的な相互作用を崩 壊させる化合物を同定するために使用され得る。さらに、プレセニリンのすべて の相互作用を崩壊させる化合物が同定され得る。例えば、プレセニリンタンパク 質の折り畳みを特異的に崩壊させる化合物は、プレセニリンと他のタンパク質と の間の全ての相互作用を崩壊させることが予想される。あるいは、このタイプの 崩壊アッセイは、異なるプレセニリン相互作用のある範囲のみを崩壊させる、ま たはプレセニリン相互作用の１つのみを崩壊させる化合物を同定するために使用 され得る。 ９．プレセニリン活性を調節する化合物を同定する方法 別の一連の実施態様において、本発明は、正常および変異のプレセニリンの活 性を調節する能力を有する化合物を同定する方法を提供する。この一連の実施態 様に関して用いられる、用語「活性」は、遺伝子およびタンパク質発現、プレセ ニリンタンパク質翻訳後プロセシング、トラフィッキングおよび局在化、ならび に任意の機能的活性（例えば、酵素、レセプター−エフェクター、結合、チャン ネルの）、ならびに任意のこれらの下流影響を広く含む。プレセニリンは、通常 は小胞体および／またはゴルジ装置と会合した内在性膜タンパク質であるようで あり、そしてAPPの輸送またはトラフィッキングおよび／または細胞内カルシウ ムレベルの調節に関与する機能を有し得る。さらに、プレセニリン変異は、Aβ ペプチドの生産の増大、アミロイド斑および神経細線維もつれの出現、認識機能 の低下、およびアポトーシス細胞死に関連することが知られている。従って、本 発明の形質転換細胞およびトランスジェニック動物モデル、変異プレセニリン遺 伝子を有する被験体または天然に生じるプレセニリン変異を有する動物もしくは ヒトの被験体から得られた細胞を用いて、今や、正常または変異のプレセニリン 発現の１つ以上のこれらの機能的特徴または表現型発現の変化を検出することに よって、候補医薬および処置を、それらの治療的効果についてスクリーニングし 得る。 従って、本発明は、細胞をインビボまたはインビトロで候補化合物と接触させ 、そして正常または変異のプレセニリン活性に関連したマーカーの変化について アッセイすることによって、プレセニリン活性を調節するタンパク質、低分子、 または他の化合物をスクリーニングまたはアッセイする方法を提供する。プレセ ニリン活性に関連したマーカーは、プレセニリン発現に関連する、任意の測定可 能な生物学的、生理学的、組織学的、および／または挙動的特徴であり得る。特 に、有用なマーカーは、それらの正常なカウンターパートから、少なくとも１つ の変異プレセニリン遺伝子を有する細胞、組織、動物、または個体を区別する、 任意の測定可能な生物学的、生理学的、組織学的、および／または挙動的特徴を 含む。さらに、マーカーは、任意のプレセニリン活性の特異的または非特異的尺 度であり得る。プレセニリン特異的尺度は、本発明の核酸プローブまたは抗体を 使用し得る、プレセニリン発現の尺度（例えば、プレセニリンmRNAまたはタンパ ク質レベル）を含む。非特異的尺度は、cytosensor microphysiometer(Molecula r Devices Inc.,United States)のようなデバイスでモニターされ得る、pH、細 胞内カルシウム、サイクリックAMPレベル、GTP/GDP比、ホスファチジルイノシト ール活性、タンパク質リン酸化などのような細胞生理学の変化を含む。その変異 形態または正常形態におけるプレセニリン活性の活性化または阻害はまた、アル ツハイマー病に至るプレセニリン経路に特異的な他の遺伝子の発現の変化を検討 することによってモニターされ得る。これらは、ディファレンシャルディスプレ イ、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、およびSAGE（遺伝子発現の連 続的分析）のような技術によって、ならびに細胞溶解物の二次元ゲル電気泳動に よって、アッセイされ得る。各場合において、ディファレンシャルに発現される 遺伝子は、候補化合物の適用の前後の同一の研究の点検によって確認され得る。 さらに、他所で記載するように、その発現が候補化合物の投与によって調節され る特定の遺伝子は、クローニング、ヌクレオチド配列決定、アミノ酸配列決定、 または質量分析によって確認され得る(Nowak，1995に概説される)。 一般に、細胞を候補化合物と接触させ、そして適切な期間の後（例えば、培養 細胞のほとんどの生化学的尺度については０〜72時間）、プレセニリン活性のマ ーカーをアッセイし、そしてベースライン測定値と比較し得る。ベースライン測 定値は、細胞と候補化合物との接触の前になされ得、または他の実験によって確 立されたもしくは当該分野で公知の外部ベースラインであり得る。細胞は、本発 明の形質転換細胞であり得、または動物もしくは個体由来の外植片であり得る。 特に、細胞は、プレセニリン変異の保因者（例えば、アルツハイマー病を有する ヒト被験体）または本発明の動物モデル（例えば、変異プレセニリン遺伝子を有 するトランスジェニック線虫またはマウス）由来の外植片であり得る。Aβ経路 に対するプレセニリン変異の効果を増大させるためには、増加したAβ産生を有 するトランスジェニック細胞または動物が使用され得る。好ましい細胞は、ニュ ーロン細胞、神経膠細胞または混合細胞の培養物のような神経組織；および培養 線維芽細胞、肝臓、腎臓、脾臓、または骨髄由来の細胞を含む。細胞は、インビ トロにおいて培養物中の候補化合物と接触され得るか、またはインビボにおいて 生存動物もしくはヒト被験体に投与され得る。生存動物またはヒト被験体につい ては、試験化合物を経口または化合物に適切な任意の非経口経路によって投与し 得る。ヒト被験体の臨床試験については、測定は数ヶ月または数年の間定期的に （例えば、毎日、毎週、または毎月）行い得る。 プレセニリン変異の保因者のほとんどはヘテロ接合型であるので（すなわち、 １つの正常および１つの変異プレセニリン対立遺伝子を有する）、化合物を正常 およびプレセニリン活性を調節するそれらの能力について試験し得る。従って、 例えば、正常プレセニリンの機能を増強する化合物は、アルツハイマー病のよう なプレセニリン関連障害の処置において有用性を有し得る。あるいは、ヘテロ接 合型個体における正常および変異プレセニリンの両方の活性の抑制は、関連疾患 の進行よりも低い重篤度の臨床的結果を有し得るので、全ての形態のプレセニリ ンを不活化または抑制する化合物を同定することが所望され得る。しかし、好ま しくは、正常プレセニリンの遺伝子またはタンパク質の機能を破壊することなく 、変異プレセニリンの活性を選択的または特異的に不活化または抑制する化合物 が同定される。 本発明のプレセニリンの遺伝子およびタンパク質の本明細書中における同定、 特徴付け、および開示、プレセニリンの核酸プローブおよび抗体、ならびにプレ セニリン形質転換細胞およびトランスジェニック動物に照らして、当業者は、今 や、候補化合物によるプレセニリン活性の調節を検出する非常に多様なアッセイ を行うことが実施可能にされる。特に好ましいそして意図される実施態様は、以 下にいくぶん詳しく議論される。 Ａ．プレセニリン発現 一連の実施態様において、プレセニリン発現の特異的尺度が、プレセニリン活 性に影響するそれらの能力について候補化合物をスクリーニングするために使用 される。従って、本明細書において開示された、そして実施可能にされたプレセ ニリンの核酸および抗体を用いて、mRNAレベルまたはタンパク質レベルを、プレ セニリン活性を調節する候補化合物の能力のためのマーカーとして使用し得る。 このようなプローブおよび抗体の、遺伝子およびタンパク質発現を測定するため の使用は当該分野で周知であり、そして本明細書中の他所で議論される。特に目 的とするのは、プレセニリンの異なるスプライス変異体の相対的レベルを変化さ せ得る化合物の同定であり得る。例えば、アルツハイマー病に関連したプレセニ リン変異の多くは、いくつかの末梢組織（例えば、白血球）におけるオルタナテ ィブスプライシングに供される推定TM6→7ループの領域に位置する。従って、こ のスプライシング事象の相対的頻度を増加させ得る化合物は、この領域における 変異の発現を妨げるのに有効であり得る。 Ｂ．細胞内局在化 別の一連の実施態様において、プレセニリンのトラフィッキングおよび細胞内 局在化に対するこれらの効果に基づいて、プレセニリンの活性を調節するそれら の能力について、化合物をスクリーニングし得る。プレセニリンは免疫細胞化学 的に、小胞体およびゴルジ装置と会合する膜構造に局在化されると見られ、そし て１つのプレセニリン変異体（H163R）（他は違う）は未知の機能の小さい細胞 質小胞中で可視化された。従って、変異および正常プレセニリンの局在化の差異 は、プレセニリン関連疾患の病因に寄与し得る。従って、プレセニリンの局在化 に影響し得る化合物は、潜在的治療剤として同定され得る。当該分野で公知の標 準的技術を用いて、プレセニリンの局在化を検出し得る。一般に、これらの技術 は、本発明の抗体、特に１つ以上の変異プレセニリンに選択的に結合するが、正 常プレセニリンには選択的に結合しない抗体を使用する。当該分野で周知のよう に、このような抗体は、プレセニリンの細胞内位置を可視化することを補助する ために、任意の種々の技術（例えば、蛍光または放射性タグ、標識二次抗体、ア ビジン−ビオチンなど）によって標識され得る。当該分野で公知のように、プレ セニリンは、これらの構造のマーカーに対する抗体（例えば、ゴルジに対するTG N38、ゴルジ後輸送小胞に対するトランスフェリンレセプター、リソソームに対 するLAMP2）を用いて、特定の構造に共局在化（co−localize）され得る。異な る細胞内膜結合オルガネラ（例えば、リソソーム、シナプトソーム、ゴルジ）に ついての富化された細胞溶解物由来の精製画分のウェスタンブロットもまた使用 され得る。さらに、細胞ドメインを横切るプレセニリンの異なるドメインの相対 的方向は、例えば、電子顕微鏡およびそれらのドメインに対して惹起された抗体 を用いてアッセイされ得る。 Ｃ．イオン調節／代謝 別の一連の実施態様において、化合物を、細胞内Ca2+、Na+またはK+レベル、 あるいは代謝における尺度に基づいて、プレセニリンの活性を調節するそれらの 能力についてスクリーニングし得る。上記のように、プレセニリンはイオンレセ プターまたはイオンチャンネルとして作用し得る、あるいはそれと相互作用し得 る膜会合タンパク質である。従って、化合物を、インビボまたはインビトロのい ずれかでプレセニリン関連のカルシウムまたは他のイオン代謝を調節するそれら の能力について、パッチクランプ、電圧クランプおよび細胞内カルシウムまたは 膜貫通電圧に感受性の蛍光色素を用いて、イオンチャンネルフラックスおよび／ または膜貫通電圧または電流フラックスの測定によって、スクリーニングし得る 。イオンチャンネルまたはレセプター機能はまた、サイクリックAMP、cGMPチロ シンキナーゼ、リン酸、細胞内Ca2+レベルの増加などのようなセカンドメッセン ジャーの活性化の測定によってアッセイされ得る。また、組換えにより作製され たタンパク質を人工膜系中に再構築して、イオンチャンネルコンダクタンスを研 究し得、そして従って、このようなアッセイで使用される「細胞」は人工膜また は細胞を含み得る。イオン調節または代謝の変化についてのアッセイは、内因性 正 常または変異プレセニリンを発現する培養細胞に対して行われ得る。このような 研究は、正常形態または変異形態の、プレセニリンの１つを、またはプレセニリ ンの１つの機能的ドメインを発現し得るベクターでトランスフェクトされた細胞 に対して行い得る。さらに、このようなアッセイにおいて測定されたシグナルを 増強させるために、細胞をイオンチャンネルタンパク質をコードする遺伝子で同 時トランスフェクトし得る。例えば、Xenopus卵母細胞またはラット腎臓（HEK29 3）細胞を、正常または変異プレセニリン配列およびラット脳Na+β１サブユニッ ト、ウサギ骨格筋Ca2+β１サブユニット、またはラット心臓K+β１サブユニット をコードする配列で同時トランスフェクトし得る。プレセニリン関連またはプレ セニリン媒介性イオンチャンネル活性の変化は、卵母細胞における２-ミクロ電 極電圧クランプ記録によって、またはHEK293細胞における全細胞パッチクランプ 記録によって測定され得る。 Ｄ．アポトーシスまたは細胞死 別の一連の実施態様において、化合物を、プレセニリン関連またはプレセニリ ン媒介性アポトーシスまたは細胞死に対するそれらの効果に基づき、プレセニリ ンの活性を調節するそれらの能力についてスクリーニングし得る。従って、例え ば、アポトーシスまたは細胞死のベースライン率を、培養物中の細胞について確 立し得るか、または特定の年齢におけるニューロン損失のベースライン度を、動 物モデルまたはヒト被験体について、死後に確立し得、そしてアポトーシスまた は細胞死を抑制するまたは阻害する候補化合物の能力を測定し得る。細胞死は標 準的な顕微鏡技術（例えば、光学顕微鏡）によって測定され得、あるいはアポト ーシスは、ヌクレオソームラダーを生じる特徴的な核形態またはDNAフラグメン ト化パターンによって、より特異的に測定され得る(例えば、Gavievliら，（199 2）J.Cell Biol．119:493-501;Jacobsonら，（1993）Nature 361:365;Vitoら， （1996）Science 271:521-525を参照のこと)。TUNELも、脳における細胞死を評 価するために用いられ得る(例えば、Lassmannら，1995を参照のこと)。好ましい 実施態様において、化合物を、本発明のトランスジェニック動物モデルにおける ニューロン損失を抑制または阻害するそれらの能力について、スクリーニングし 得る。例えば、変異ヒト、変異マウス、またはヒト化変異プレセニリン遺伝子を 有するトランスジェニックマウスを使用して、アルツハイマー病に関連する神経 変性を遅延または停止し得る化合物を同定または評価し得る。変異APP遺伝子を 有する同様のトランスジェニックマウスモデルが、Gamesら(1995)によって最近 報告されている。 Ｅ．A βペプチド産生 別の一連の実施態様において、化合物を、APPプロセシングのプレセニリン関 連またはプレセニリン媒介性変化を調節するそれらの能力について、スクリーニ ングし得る。APPプロセシングにおける差違から生じたいくつかのイソ型で、Aβ ペプチドを産生する。Aβペプチドは、散在性および老人性斑において、およびA Dを有する被験体の血管において、進行性に沈積するβAPPの39〜43アミノ酸の誘 導体である。ヒト脳において、AβペプチドはＮおよびＣ末端の両方において不 均質である。しかし、いくつかの観察は、全長形態および、残基42または43で終 結する長テールAβペプチドのＮ末端短縮型(すなわち、Aβ1-42/43およびAβx-4 2/43)の両方が、残基40で終結するペプチドよりも、ADにおいてより重要な役割 を有することを示唆する。従って、Aβ-42/43およびAβx-42/43は、老人性斑お よび散在性斑の両方の初期かつ突出した特徴であるが、残基40で終結するペプチ ド（すなわち、Aβ1-40およびAβx-40）は、成熟斑のサブセットおよびアミロイ ド性血管に優勢に関連する(例えば、Iwatsuboら，（1995）Ann ．Neurol. 37:294 -299;Gravinaら，（1995）J ．Biol．Chem. 270:7013-7016；Tamaokaら，（1995 ）Brain Res. 679:151-156;Podlisnyら，（1995）J ．Biol．Chem. 270:9564-957 0を参照のこと)。さらに、長テールイソ型は、原線維形成に対してより大きい傾 向を有し、そしてAβ1-40ペプチドよりも神経毒性であると考えられる(Pikeら， 1993;Hilbichら，（1991）J ．Mol．Blol. 218:149-163)。最後に、初期発症FAD に関連するβAPP遺伝子のコドン717におけるミスセンス変異は、冒された変異体 保因者の脳において、冒されそして前症候性の両方の保因者の末梢細胞および血 漿において、ならびにβAPP717変異cDNAでトランスフェクトされた細胞株におい て、長テールAβの過剰産生を生じる(Tamaokaら，（1994）J ．Blol．Chem. 269: 32721-32724;Suzukiら，（1994）Science 264:1336-1340)。下記の実施例18に記 載のように、本発明者らは、今や、Aβペプチドの長形態の産生の増大もまた、 プレセニリン遺伝子における変異に関連することを開示する。 従って、一連の実施態様において、本発明は、候補化合物を、変異プレセニリ ン遺伝子を発現する細胞またはトランスジェニック動物における、Aβペプチド の長イソ型の産生の増大をブロックまたは阻害するそれらの能力について、スク リーニングする方法を提供する。特に、本発明は、脳細胞または線維芽細胞のよ うな培養哺乳動物細胞が、本明細書に開示された方法に従って形質転換された、 あるいは齧歯類または非ヒト霊長類のようなトランスジェニック動物が、本明細 書に開示される方法によって生産されて、比較的高レベルの変異プレセニリンを 発現する、このような方法を提供する。任意に、このような細胞またはトランス ジェニック動物はまた、βAPPタンパク質の正常形態を比較的高レベルで発現さ せるように形質転換され得る。 この一連の実施態様において、候補化合物を細胞株またはトランスジェニック 動物に投与し得（例えば、培養物中の細胞の培地に添加することによって；ある いは動物に経口または非経口投与することによって）、そして適切な期間の後（ 例えば、培養物中の細胞については0〜72時間、動物モデルについては数日また は数カ月）、生物学的サンプルを収集し（例えば、培養物中の細胞由来の細胞培 養上清または細胞溶解物；動物由来の組織ホモジネートまたは血漿）、そしてA βペプチドの長イソ型のレベルについて試験する。絶対的な意味において（例え ば、nMol/ml)または相対的意味において（例えば、短Aβイソ型に対する長イソ 型の比）、ペプチドのレベルを決定し得る。Aβイソ型は、当該分野で公知の任 意の手段によって（例えば、電気泳動分離および配列決定）検出され得るが、好 ましくは、長イソ型に対して特異的な抗体を使用して、Aβ1-42/43またはAβx-4 2/43ペプチドの絶対的または相対的レベルを測定する。これらの長Aβイソ型の 絶対的または相対的レベルを低下させる（特に、本発明のトランスジェニック動 物モデルにおいて）候補医薬または治療は、アルツハイマー病、あるいはプレセ ニリン変異またはAPP代謝における異常によって引き起こされる他の障害の処置 において治療的有用性を有するようである。 Ｆ．微小管関連タンパク質のリン酸化 別の一連の実施態様において、候補化合物を、Tauのような微小管関連タンパ ク質（MAP）のリン酸化レベルに対する化合物の効果を評価することによって、 プレセニリン活性を調節するそれらの能力についてスクリーニングし得る。アル ツハイマー病の犠牲者の脳におけるTauおよび他のMAPの異常リン酸化は、当該分 野において周知である。従って、ＭＡＰの異常リン酸化を防止するまたは阻害す る化合物は、ADのようなプレセニリン関連疾患を治療することにおいて有用性を 有し得る。上記のように、正常または変異動物または被験体、あるいは本発明の 形質転換細胞株および動物モデルを使用し得る。好ましいアッセイは、変異ヒト またはヒト化変異プレセニリン遺伝子で形質転換された細胞株または動物モデル を使用する。これらの細胞におけるMAPのベースラインリン酸化状態を確立し得 、次いで、候補化合物を変異体に関連する過剰リン酸化を防止、阻害または中和 するそれらの能力について試験し得る。MAPのリン酸化状態は、当該分野で公知 の任意の標準的方法によって測定され得るが、好ましくは、リン酸化されたまた はリン酸化されていないエピトープに選択的に結合する抗体が使用される。Tau タンパク質のリン酸化エピトープに対するこのような抗体は、当該分野において 公知である（例えば、ALZ50）。１０．アルツハイマー病についてのスクリーニングおよび診断 Ａ．一般的診断方法 本明細書中で開示されまたは実施可能なプレセニリン遺伝子および遺伝子産物 、ならびにプレセニリン由来のプローブ、プライマーおよび抗体は、アルツハイ マー病に関連する対立遺伝子の保因者のスクリーニング、アルツハイマー病の罹 患者の診断、ならびに関連する早老性および老人性の痴呆症、精神分裂病および 鬱病のような精神医学的疾患、ならびに脳卒中および脳溢血のような神経学的疾 患（これらの全ては、PS1またはPS2の遺伝子またはAPP遺伝子における変異を有 する症候的ヒト被験体において多かれ少なかれ見られる）のスクリーニングおよ び診断において有用である。アルツハイマー病の危険がある個体（例えば、家系 に存在するADを有する個体）、あるいは危険があることが従前には知られていな い個体を、種々の技術によって変異プレセニリン遺伝子またはタンパク質の存在 を検出するためのプローブを用いて日常的にスクリーニングすることができる。 こ れらの病気の遺伝の症例の診断は、正常なプレセニリン活性の欠損または増加、 および／または変異プレセニリンによって付与された新しい特定の活性の存在を 検出するように設計された機能的アッセイを含む、本明細書中で開示されまたは 実施可能な（ゲノム配列およびmRNA／cDNA配列を含む）核酸、タンパク質、およ び／または抗体に基づく方法によって達成することができる。好ましくは、本明 細書中で開示されまたは実施可能であるように、本方法および産物は、ヒトのPS 1またはPS2の核酸、タンパク質、または抗体に基づく。しかしながら、当業者に 明らかなように、ヒト、マウス、C ．elegans、およびDrosophilaのような広い種 においてさえ、PS1およびPS2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の大きな割 合の有意の進化的保存は、当業者に、ヒトまたは他の動物被験体に向けられた適 用についてさえ、このような非ヒトプレセニリンホモログの核酸、タンパク質、 および抗体を利用することを可能とする。従って、本発明の範囲を限定すること なく説明を簡単にするために、以下の記載は、PS1およびPS2のヒトホモログの使 用に焦点を当てる。しかしながら、本明細書に開示するものを含む他の種からの 相同配列は、多くの目的のためには同等であることが理解される。 当業者によって認識されるように、本発明の診断方法の選択は、テストすべき 利用可能な生物学的サンプルの性質および必要とされる情報の性質によって影響 される。例えば、PS1は、脳組織で高度に発現される。しかし、脳バイオプシー は、特に日常的なスクリーニングでは、侵襲的であって費用のかかる手順である 。しかしながら、有意なレベルでPS1を発現する他の組織（例えば、リンパ球） は、オルタナティブスプライシングを示し得る。従って、このような細胞からの PS1のmRNAまたはタンパク質は、あまり有益ではあり得ない。従って、被験体の ゲノムPS1 DNAに基づくアッセイが好ましいかもしれない。なぜなら、どの情報 も、オルタナティブスプライシングに依存せず、そして本質的に、任意の有核細 胞は使用可能なサンプルを供し得るからである。他のプレセニリン（例えば、hP S2、mPS1）に基づく診断は、同様の考慮：組織の利用性、種々の組織における発 現のレベル、およびオルタナティブスプライシングにより得られる別のmRNAおよ びタンパク質産物を対象とする。 Ｂ．タンパク質に基づくスクリーニングおよび診断 診断アッセイがプレセニリンタンパク質に基づくべき場合、種々のアプローチ が可能である。例えば、診断は、正常タンパク質と変異タンパク質との電気泳動 移動度における差異をモニターすることによって達成できる。このようなアプロ ーチは、荷電置換が存在する変異体、あるいは挿入、欠失、または置換の結果得 られたタンパク質の電気泳動移動が有意に変化した変異体を同定するにおいて特 に有用である。あるいは、診断は、正常タンパク質と変異タンパク質とのタンパ ク質分解切断パターンの差異、種々のアミノ酸残基のモル比の差異に基づくもの であり得、あるいは遺伝子産物の変化した機能を示す機能的アッセイによるもの であり得る。 好ましい実施態様において、タンパク質に基づく診断は、正常および変異プレ セニリンタンパク質（特に、hPS1またはhPS2)に結合する抗体の能力の差異を使 用する。このような診断テストは、正常タンパク質に結合するが変異タンパク質 には結合しない、あるいはその逆である抗体を使用できる。特に、複数のモノク ローナル抗体（各々が、変異エピトープに結合できる）を使用できるアッセイ。 テスト被験体から得られるサンプルにおける抗変異体抗体の結合のレベル（例え ば、放射性標識、ELISA、または化学ルミネセンスにより可視化される）が、コ ントロールサンプルへの結合のレベルと比較され得る。あるいは、正常プレセニ リンには結合するが変異プレセニリンには結合しない抗体を使用することができ 、そして抗体結合のレベルの減少を用いて、ホモ接合の正常個体を、変異したヘ テロ接合体またはホモ接合体から区別することができる。このような抗体診断は 、神経線維の絡みおよびアミロイド斑などのこれらの病気に関連する神経病理学 的構造体を含む、生前または死後に得られるCNS組織のバイオプシーサンプルを 用いるインサイチュ免疫組織化学のために使用し得るか、あるいは脳脊髄液のよ うな液体サンプル、あるいは白血球のような末梢組織を用いて使用し得る。 Ｃ．核酸に基づくスクリーニングおよび診断 診断アッセイがサンプルからの核酸に基づく場合、アッセイは、mRNA、cDNA、 またはゲノムDNAに基づくことができる。サンプルからのmRNAを使用する場合、 多くの同じ考慮が、供給源組織およびオルタナティブスプライシングの可能性に 関してなされる。すなわち、適切な組織供給源が選択されず、またはそれが入手 可能でなければ、転写物の発現はほとんどまたは全くなく、そしてオルタナティ ブスプライシングの結果、いくつかの情報が失われるか、あるいは解釈が困難と なる。しかしながら、本発明者らは、5'UTR、3'UTR、オープンリーディングフレ ーム、ならびにPS1およびPS2の双方のスプライス部位における変異は、白血球お よび／または皮膚線維芽細胞から単離されたmRNA／cDNAで信頼性よく同定できる ことを既に示した(Sherringtonら，1995；Rogaev，1995)。mRNA、cDNA、または ゲノムDNAをアッセイするか否かにかかわらず、当該分野で周知の標準的な方法 を用いて、インサイチュまたはインビトロのいずれかで特定の配列の存在を検出 することができる(例えば、Sambrookら，（1989）Molecular Cloning:A Laborat ory Manual ，第２版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NYを参 照のこと)。しかしながら、一般的には、有核細胞を持つ任意の組織を調べるこ とができる。 診断のために用いられるゲノムDNAは、血液、組織バイオプシー、手術検体、 またはオートプシー材料に存在するもののような身体細胞から得ることができる 。DNAを単離し、そして特異的配列の検出に直接使用するか、あるいは分析に先 立って、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅することができる。同様に 、RNAまたはcDNAはまた、PCR増幅と共にまたはそれなしで用いることができる。 特異的な核酸配列を検出するに、直接的ヌクレオチド配列決定、特異的オリゴヌ クレオチドを用いるハイブリダイゼーション、制限酵素消化およびマッピング、 PCRマッピング、RNaseプロテクション、化学的ミスマッチ切断、リガーゼ媒介検 出、および種々の他の方法が使用できる。特定の配列に対して特異的なオリゴヌ クレオチドを化学的に合成し、放射性または非放射性標識（例えば、ビオチンタ グ、エチジウムブロミド）し、そして（例えば、ドットブロットまたは電気泳動 後にゲルからの転写により）膜または他の固体支持体に固定化された、あるいは 溶液中の個々のサンプルにハイブリダイズさせることができる。次いで、標的配 列の存在または不存在を、オートラジオグラフィー、フルオロメトリー、または 比色法のような方法を用いて可視化することができる。これらの手順は、高密度 でシ リコンチップに固定化された既知配列の縮重した短いオリゴヌクレオチドを用い て自動化できる。 （１）適切なプローブおよびプライマー ハイブリダイゼーション、RNaseプロテクション、リガーゼ媒介検出、PCR増幅 、または本明細書中に記載されそして当該分野で周知の任意の他の標準的な方法 のいずれにせよ、本明細書中で開示されまたは実施可能なプレセニリン配列の種 々のサブ配列は、プローブおよび／またはプライマーとして有用である。これら の配列またはサブ配列は、正常なプレセニリン配列および有害な変異配列の両方 を含む。一般に、有用な配列は、プレセニリンのイントロン、エキソン、または イントロン／エキソン境界からの、少なくとも８〜９、より好ましくは１０〜５ ０、そして最も好ましくは１８〜２４の連続するヌクレオチドを含む。標的配列 、必要な特異性、および将来の技術開発に応じて、より短い配列もまた有用性を 有し得る。従って、プレセニリン配列を単離し、クローン化し、増幅し、同定し 、または操作するのに使用される任意のプレセニリン由来の配列は、適切なプロ ーブまたはプライマーとみなすことができる。有用と特に考えられるのは、疾患 原因の変異が存在することが知られているプレセニリン遺伝子のヌクレオチド位 置を含む配列、あるいはこれらの位置に隣接する配列である。 （ａ）PS1 のプローブおよびプライマー 前記で考察したように、今や、種々の疾患原因の変異が、ヒトPS1遺伝子で同 定された。これらおよび他のPS1変異の検出は、今や、正常または変異のPS1遺伝 子に由来する単離された核酸プローブまたはプライマーを用いて可能である。有 用と特に考えられるのは、Ｎ末端、TM1−TM2領域、およびTM6−TM7領域をコード する配列に由来するプローブまたはプライマーである。しかしながら、前記に開 示するように、PS1タンパク質の他の領域に影響する変異は既に検出されており 、本明細書中で開示する方法を用いて、さらに疑いもなく検出される。従って、 本発明は、アルツハイマー病の発症に関連することを示し得る、イントロンなら びに5'および3'UTRを含むPS1遺伝子のいずれかの部分からの正常配列および変異 配列に対応する単離された核酸プローブおよびプライマーを提供する。 単に例として、かつ本発明を限定することなく、丁度C410Yの変異付近のhPS1 DNAセグメントに由来するプローブおよびプライマーを、スクリーニングおよび 診断方法で使用することができる。この変異は、少なくとも特定の個体において 、配列番号１の1477位におけるＧからＡへの置換から生じる。従って、この潜在 的な変異部位を含むオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、個 体の末梢血液サンプルから獲得されたゲノムDNA、mRNA、またはcDNAをスクリー ニングできる。この変異用のハイブリダイゼーションプローブには、変異部位を またぐ、８〜５０、より好ましくは１８〜２４塩基のプローブ（例えば、配列番 号１のbp1467〜1487）が使用できる。もしプローブがmRNAとともに使用されるな らば、それは、勿論、mRNAに相補的であるべきである（従って、PS1遺伝子の非 コード鎖に対応する）。ゲノムDNAまたはcDNAとともに使用すべきプローブは、 プローブは、いずれかの鎖に相補的であり得る。PCR方法によるこの変異を含む 配列を検出するために適切なプライマーは、いずれかの側の変異に隣接する領域 に由来する、８〜50、好ましくは18〜24の長さのヌクレオチドの配列を含む。そ れは、変異部位から除去された、1〜1000bp、好ましくは1〜200bpの任意の位置 に対応する。（コード鎖上の）変異の5'側にあるPCRプライマーは、配列におい て、PS1遺伝子のコード鎖に対応すべきであり、他方、（コード鎖上の）変異部 位の3'側にあるPCRプライマーは、非コード鎖もしくはアンセンス鎖に対応すべ きである（例えば、配列番号１のbp1451〜1468に対応する5'プライマー、および 配列番号１４の719〜699の相補物に対応する3'プライマー）。 同様のプライマーを、他のPS1変異、または一般に変異の「ホットスポット」 について選択することができる。例えば、M146L変異（bp684におけるＡ→Ｃ）に ついての5'PCRプライマーは、配列番号１のほぼbp601〜620に対応する配列を含 むことができ、そして3'プライマーは、配列番号８のほぼbp1328〜1309の相補物 に対応し得る。この例は、イントロン配列およびエキソン配列の双方からのプラ イマーを使用することに注意されたい。別の例として、A246E変異（bp985におけ るＣ→Ａ）についての適切な5'プライマーは、配列番号１のほぼbp907〜925に対 応する配列、または配列番号１のほぼbp1010〜990の相補物に対応す る3'プライマーを含み得る。別の例として、配列番号９のほぼbp581〜559の相補 物に対応する3'プライマーと共に、配列番号９のほぼbp354〜375に対応する配列 を含むH163R変異（配列番号１のbp736または配列番号９のbp419におけるＡ→Ｇ ）についての5'プライマー。同様に、イントロン配列またはエキソン配列を使用 して、例えば、配列番号１１のほぼbp249〜268または配列番号１のbp1020〜1039 に対応する配列を含むL286V変異（配列番号１のbp1104または配列番号１１のbp3 98におけるＣ→Ｇ）についての5'プライマーおよび配列番号１１のほぼbp510〜4 91の相補物に対応する3'プライマーを生成させることができる。 プローブおよびプライマーが特異的変異ヌクレオチドを含み得ることに注意す べきである。従って、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたは5'プライ マーは、正常な対立遺伝子をスクリーニングもしくはそれを増幅するために、配 列番号１のほぼbp1468〜1486に対応する配列、あるいは変異した対立遺伝子をス クリーニングするかもしくはそれを増幅するために、同一であるが変異したbp14 77（Ｇ→Ｔ）に対応するbpを有する配列に対応する配列を含むC410Y変異のため に作製することができる。 （ｂ）PS2 のプローブおよびプライマー PSIについてのプローブおよびプライマーに関する前記の同じ一般的考慮は、P S2についてのプローブおよびプライマーに同等に適用される。特に、プローブま たはプライマーは、イントロン、エキソン、またはイントロン／エキソン境界配 列に対応してもよく、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖からの配列に 対応してもよく、そして正常または変異配列に対応してもよい。 単に例として、PS1 N141I変異（bp787におけるＡ→Ｔ）を、配列番号１８のほ ぼbp733〜751に対応する5'プライマーおよび配列番号１８のほぼbp846〜829の相 補物に対応する3'プライマーを用い、周囲のDNA断片のPCR増幅によってスクリー ニングすることができる。同様に、M239V変異（bp1080におけるＡ→Ｇ）につい ての5'プライマーは、ほぼbp1009〜1026に対応する配列を含むことができ、そし て3'プライマーは配列番号１８のほぼbp1118〜1101の相補物に対応し得る。別の 例として、I420T変異（bp1624におけるＴ→Ｃ）の周囲の領域をコードする 配列を、配列番号１８のほぼbp1576〜1593に対応する5'プライマーおよび配列番 号１８のほぼbp1721〜1701の相補物に対応する3'プライマーを用いて、ゲノムDN AのPCR増幅によってスクリーニングして、146塩基対の産物を生成させることが できる。次いで、この産物を、例えば、野生型（例えば、配列番号１８のbp1616 〜1632）および／または変異体（例えば、bp1624におけるＴ→Ｃを有する配列番 号１８のbp1616〜1632）の配列について対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドで プローブすることができる。 （２）ハイブリダイゼーションスクリーニング 正常または変異のPS1、PS2、または他のプレセニリン関連核酸配列のインサイ チュ検出には、標準的な技術によって組織のサンプルを調製することができ、次 いで、１つ以上の前記のプローブ、好ましくは検出を容易とするために標識され たプローブと接触させ、そして核酸ハイブリダイゼーションのためのアッセイを 、プローブと高度にまたは完全に相補的な配列との間でのみハイブリダイゼーシ ョンを可能とするストリンジェントな条件下で行う。現在までに検出されたPS1 およびPS2の変異のほとんどは、１つのヌクレオチド置換よりなるので、高いス トリンジェンシィーのハイブリダイゼーション条件が、多くの変異配列から正常 配列を区別するのに必要である。被験体の親のプレセニリン遺伝子型が知られて いる場合、それに従ってプローブを選択することができる。あるいは、種々の変 異体に対するプローブを、連続的または組み合わせて使用することができる。プ レセニリン変異体を有する個体の多くははヘテロ接合性であるので、正常配列に 対するプローブも使用することができ、そしてホモ接合の正常個体を、（例えば 、放射能シグナルの強度により）結合の量によって変異したヘテロ接合体から区 別することができる。別の変形において、競合結合アッセイを使用することがで きる。この場合、正常および変異の両方のプローブを使用するが、１つのみを標 識する。 （３）制限マッピング 配列の変化をまた用いて、適切な酵素消化、続いてのゲル−ブロットハイブリ ダイゼーションの使用によって明らかにされる偶発的な制限酵素認識部位が生成 または破壊され得る。部位（正常または変異）を有するDNA断片は、サイズおけ るその増加または減少によって、あるいは対応する制限断片数の増加または減少 によって検出される。このような制限断片長多型分析（RELP）、または制限マッ ピングは、ゲノムDNA、mRNAまたはcDNAを用いて使用することができる。プレセ ニリン配列は、制限に先立って前記のプライマーを用いるPCRによって増幅する ことができ、この場合、PCR産物の長さは、特定の制限部位の存在または非存在 を示すことができ、および／または増幅後に制限に供し得る。プレセニリン断片 は、任意の便宜な手段によって可視化することができる（例えば、エチジウムブ ロミドの存在下におけるUV光下）。 単に例として、PS1のM146L変異（配列番号１のbp684におけるＡ→Ｃ）はPsphI 部位を破壊し；H163R変異（bp 736におけるＡ→Ｇ）はNlaIII部位を破壊し；A24 6E変異（bp985におけるＣ→Ａ）はDdeI部位を生じ；およびL286V変異（bp1104に おけるＣ→Ｇ）はPvuIII部位を生じることに注意される。当業者は、多くの市販 の制限酵素から容易に選択し、本明細書中で開示されそしてそうでなければ実施 可能となる正常および変異配列に基づいて、いずれかのプレセニリン変異を実際 に検出する制限マッピング分析を行うことができる。 （４）PCR マッピング 別の一連の実施態様において、一塩基置換変異を、異なるPCR産物の長さまた はPCRにおける産生に基づいて検出することができる。従って、変異部位にまた がる、あるいは好ましくは変異部位に3'末端を有するプライマーを使用して、被 験体からのゲノムDNA、mRNA、またはcDNAのサンプルを増幅することができる。 変異部位におけるミスマッチは、ポリメラーゼ反応を促進し、それにより、正常 な被験体と、ヘテロ接合および／またはホモ接合のプレセニリン変異体との間で 異なる産物プロフィールが得られる、正常プライマーまたは変異プライマーの能 力を変更することが予測できる。正常遺伝子および変異遺伝子のPCR産物は、異 なって分離され、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動、および標 識プローブ、エチジウムブロミド等を用いた可視化のような標準的な技術によっ て検出できる。変異部位の可能な非特異的プライミングまたは読み通しのため、 ならびに変異対立遺伝子の保因者のほとんどがヘテロ接合であるとの事実のため 、この技術の効果は低いかもしれない。 （５）電気泳動移動度 DNA配列差異に基づく遺伝子テストはまた、ゲルにおけるDNA、mRNA、またはcD NAの断片の電気泳動移動度の変化の検出によって達成することができる。例えば 、小さな配列の欠失および挿入は、一本鎖または二本鎖のDNAの高分解能ゲル電 気泳動によって、あるいは非変性ゲル電気泳動におけるDNAヘテロ二重鎖の移動 パターンの変化として可視化することができる。プレセニリン変異体または多型 はまた、mRNAまたは一本鎖DNAの二次構造に関連した一本鎖コンフォメーション 多型（SSCP）による移動度シフトを利用する方法によって検出することができる 。 （６）ミスマッチの化学的切断 プレセニリンの変異はまた、ミスマッチの化学的切断（CCM）方法を使用する ことによって検出できる(例えば、SaleebaおよびCotton，1993,およびその中で の引用文献を参照のこと)。この技術では、プローブ（約1kbまで）は、被験体か ら得たゲノムDNA、cDNA、またはmRNAのサンプルと混合され得る。サンプルおよ びプローブを混合し、そして（もしあれば）ヘテロ二重鎖の形成を可能とする条 件に付す。好ましくは、プローブおよびサンプル核酸は共に二本鎖であるか、あ るいはプローブおよびサンプルを一緒にPCR増幅して、全ての可能なミスマッチ ヘテロ二重鎖の生成を確実にし得る。ミスマッチＴ残基は四酸化オスミウムに対 して反応性であり、ミスマッチＣ残基はヒドロキシルアミンに対して反応性であ る。各ミスマッチＡにはミスマッチＴが伴い、そして各ミスマッチＧにはミスマ ッチＣが伴うので、プローブとサンプルとの間の任意のヌクレオチド差異（小さ い挿入または欠失を含む）は、少なくとも１つの反応性ヘテロ二重鎖の形成に至 る。いずれかのミスマッチ部位を修飾するための四酸化オスミウムおよび／また はヒドロキシルアミンでの処理の後、混合物を、例えば、ピペリジンとの反応に よっていずれかの修飾されたミスマッチ部位での化学的切断に付す。次いで、 混合物をゲル電気泳動のような標準的な技術によって分析して、プローブとサン プルとの間のミスマッチを示す切断産物を検出し得る。 （７）他の方法 本明細書中で開示され、そしてそうでなければ実施可能なプレセニリン配列に 基づいて、プレセニリン変異を検出する種々の他の方法は、当業者に明らかであ る。これらのいずれも本発明に従って使用され得る。これらは、限定されるもの ではないが、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（S1またはリガーゼ媒介）、 連結PCR、変性グラジエントゲル電気泳動(DGGE；例えば、FischerおよびLerman( 1983)Proc.Natl.Acad.Scl.(USA)80:1579-1583を参照のこと）、SSCPと組み合わ せた制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF-SSCP；例えば、Liu およびSommer，1995を参照のこと）等を含む。 Ｄ．他のスクリーニングおよび診断剤 遺伝の場合には、一次事象として、および非遺伝の場合には病気状態による二 次事象として、PS1、PS2、APP、またはPS1、PS2、もしくはAPPと反応するタンパ ク質の異常プロセシングが起こる。これは、身体組織または体液（例えば、CSF または血液）における異常なリン酸化、グリコシル化、グリケーション、アミド 化またはタンパク質分解の切断産物として検出され得る。 診断はまた、プレセニリン転写、翻訳、および翻訳後修飾およびプロセシング の変化、ならびに脳および末梢細胞におけるプレセニリン遺伝子産物の細胞内お よび細胞外のトラフィッキングにおける変化の観察によって行うことができる。 このような変化は、プレセニリンのメッセンジャーRNAおよび／またはタンパク 質の量の変化、リン酸化状態の変化、異常な細胞内位置／分布、異常な細胞外分 布等を含む。このようなアッセイは、（プレセニリン特異的および非特異的ヌク レオチドプローブを用いる）ノーザンブロット、（グリコシル化およびリン酸化 のイソ形態を含む種々の翻訳後修飾状態を含む、プレセニリンまたはプレセニリ ンの機能的ドメインに対して特異的に惹起した抗体を用いる）ウェスタンブロッ トおよび酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）を含む。これらのアッセ イは、末梢組織（例えば、血液細胞、血漿、培養または他の線維芽細胞組織等） 、ならびに生前または死後に得られたCNS組織のバイオプシー、および脳脊髄液 で行うことができる。このようなアッセイはまた、（メッセンジャーRNAおよび タンパク質を、特定の細胞より小さい（subcellular）区画および／または神経 線維の絡みおよびアミロイド斑などのこれらの疾患に関連した神経病理学構造体 内で局在化するための）インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化 学を含む。 Ｅ．スクリーニングおよび診断キット 本発明によれば、前記の診断スクリーニングに必要な試薬を含む診断キットも また提供される。例えば、１つ以上の変異エピトープに対して特異的な抗体また は抗体の組を含むキットが提供され得る。これらの抗体は、特に、結合の可視化 を容易にするいずれかの標準的な手段によって標識できる。あるいは、前記のよ うに、オリゴヌクレオチドプローブまたはPCRプライマーが、変異のPS1、PS2ま たは他のプレセニリン関連ヌクレオチド配列の検出および／または増幅のために 存在するキットが提供され得る。さらに、このようなプローブは、特異的なハイ ブリダイゼーションの、より容易な検出のために標識することができる。前記の 種々の診断の実施態様に最適なものとして、このようなキットにおけるオリゴヌ クレオチドプローブまたは抗体は基材に固定化され、そして適切なコントロール を提供し得る。 １１．治療の方法 本発明は、今や、プレセニリンの変異によって引き起こされるか、あるいは引 き起こされ得る疾患における治療的介入のための基礎を提供する。前記にて詳細 に記載したように、hPS1およびhPS2遺伝子における変異は、初期発症型のアルツ ハイマー病の発症と関連付けられてきた。従って、本発明は、特に、アルツハイ マー病と診断されたか、あるいはその発症の危険がある被験体の処置に指向する 。しかしながら、種々の組織におけるPS1およびPS2遺伝子の発現を考慮すると、 これらの遺伝子座における変異の効果は、脳には限定されず、従って、アルツハ イ マー病に加えて、障害の原因となり得るようである。従って、本発明はまた、プ レセニリン遺伝子および遺伝子産物における変異、誤った発現、誤った代謝ある いは他の遺伝的または後天的な変化から生じ得る、他の組織における疾患発現に 指向する。加えて、アルツハイマー病は神経学的障害として発現するが、この発 現はプレセニリンにおける変異によって引き起こされ得るのであり、これはまず 他の器官組織（例えば、肝臓）に影響し、次いで、脳の活性に影響する因子を放 出し、最後にはアルツハイマー病を引き起こす。よって、後記の種々の治療を考 慮して、このような治療は、PS1および／またはPS2はまた、発現される、心臓、 胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓などの脳以外の組織で標的化され得る ことが理解される。 本発明のいずれかの特定の理論に拘束されることなく、プレセニリンにおける アルツハイマー病関連の変異の影響は、新規機能の獲得、または正常機能の加速 であるようであり、これは、脳におけるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の Ａβペプチドへの異常なプロセシング、異常なリン酸化ホメオスタシス、および ／または異常なアポトーシスを直接的または間接的に引き起こす。このような機 能の獲得または機能的モデルの加速は、徴候の成人発症およびアルツハイマー病 の優性遺伝と一致する。それにもかかわらず、プレセニリンにおける変異が、こ れらの結果を引き起こし得るメカニズムは依然不明である。 APPは、２つの経路のいずれかを介して代謝され得ることが知られている。第 １に、APPは、ゴルジネットワークの通過により、次いで、クラスリン被覆小胞 を介する分泌経路に代謝される。次いで、成熟APPは原形質膜まで通過し、そこ で、α−セクレターゼによって切断されて、可溶性画分(プロテアーゼNexin II) ＋非アミロイド原性Ｃ末端ペプチドを生じる(Selkoeら(1995);Gandyら(1993))。 あるいは、成熟APPをエンドソーム−リソソーム経路に向けることができ、そこ では、β−およびγ−セクレターゼの切断を受けて、Ａβペプチドを生成する。 APPのＡβペプチド誘導体は神経毒性である(Selkoeら(1994))。細胞のリン酸化 状態は、α−セクレターゼ（非アミロイド原性）またはＡβ経路（アミロイド原 性経路）の間の相対的バランスを決定し(Gandyら，1993)、ホルボールエステル 、ムスカリン様アゴニストおよび他の薬剤によって薬理学的に改変され得る。 細胞のリン酸化状態は、ゴルジネットワークにおける１つ以上の細胞膜内膜タン パク質に作用するサイトゾル因子（特に、プロテインキナーゼＣ）によって媒介 されるようである。 本発明のいずれかの特定の理論に拘束されることなく、プレセニリン、特に（ プロテインキナーゼＣのいくつかのリン酸化コンセンサス配列を有する）hPS1ま たはhPS2は、そのリン酸化状態がα−セクレターゼとＡβ経路との間の相対的な バランスを決定する細胞膜内膜タンパク質で有り得る。従って、PS1またはPS2遺 伝子における変異は、それらの産物の構造および機能の改変を引き起こし、これ は調節エレメント（例えば、プロテインキナーゼＣ）またはAPPとの欠陥相互作 用に至り、これにより、APPがアミロイド原性のエンドソーム−リソソーム経路 に向けられるのを促進し得る。環境因子（例えば、ウイルス、トキシン、または 老化）もまた、PS1またはPS2に対して同様の効果を有し得る。 さらに、本発明のいずれかの特定の理論に拘束されることなく、PS1およびPS2 タンパク質は共に、ヒトイオンチャンネルタンパク質およびレセプターに対して 実質的なアミノ酸配列相同性を有することにも注意されたい。例えば、Altschul ら(1990)のBLASTP例を用いて、PS2タンパク質はヒトナトリウムチャンネルα− サブユニットに対する実質的な相同性（Ｅ＝0.18、Ｐ＝0.16、同一性＝２２−２ ７％（少なくとも３５アミノ酸残基の２つの領域にわたる））を示す。他の疾患 （例えば、ヒトにおける悪性高体温および高カリウム血性周期性麻痺、ならびにC ．elegans における機械的感知ニューロンの変性）は、イオンチャンネルまたは レセプタータンパク質における変異を通じて生じる。従って、PS1またはPS2遺伝 子の変異は、同様な機能に影響し得、そしてアルツハイマー病および／または他 の精神医学的および神経学的疾患に至る。 ADなどのプレセニリン関連疾患を処置するための治療は、以下に基づくことが できる：（１）正常なPS1またはPS2のタンパク質の投与、（２）変異遺伝子を補 うかまたはそれを置換するための正常なPS1またはPS2の遺伝子での遺伝子療法、 （３）変異遺伝子を「ノックアウトする」、変異したPS1またはPS2の遺伝子に対 するアンチセンス配列に基づく遺伝子療法、（４）PS1またはPS2の変異の有害効 果をブロックまたは矯正するタンパク質をコードする配列に基づく遺伝子療法、 （５）正常および／または変異なPS1またはPS2のタンパク質に対する抗体に基づ く免疫療法、あるいは（６）PS1またはPS2の発現を変更させ、変形形態のPS1ま たはPS2と他のタンパク質またはリガンドとの間の異常な相互作用をブロックす るか、あるいはそうでなければ変異タンパク質の構造を変化させること、それら の代謝クリアランスを増強すること、あるいはそれらの機能を阻害することによ って変異PS1またはPS2タンパク質の異常な機能をブロックする低分子（薬物）。 Ａ．タンパク質療法 プレセニリン関連のアルツハイマー病、またはプレセニリン変異に起因する他 の障害の処置は、変異タンパク質を正常なタンパク質で置き換えること、変異タ ンパク質の機能を調節すること、あるいは過剰の正常タンパク質を提供して変異 タンパク質のいずれかの異常な機能の効果を低下させることによって行うことが できる。 これを達成するために、本明細書に記載されそして実施可能なように、このタ ンパク質を発現し得る培養細胞系からの大量の実質的に純粋なPSIタンパク質ま たはPS2タンパク質を得ることが必要である。次いで、タンパク質の患部脳領域 または他の組織への送達は、例えば、標的細胞へのリポソーム媒介タンパク質送 達を含む適切なパッケージングまたは投与系を用いて達成することができる。 Ｂ．遺伝子療法 １連の実施熊様において、PS1遺伝子またはPS2遺伝子の正常コピーを患者に導 入して、１つ以上の異なる患部細胞型において正常なタンパク質を首尾よくコー ドする遺伝子療法が使用できる。遺伝子は、それが取り込まれ、効果的な機能を 提供するのに、十分なタンパク質をコードし得る形態でそのような細胞に送達さ れなければならない。従って、組換え遺伝子は、強力なプロモーターに作動可能 に連結され、その結果、変異タンパク質を補うかまたはそれ以上に競合する高レ ベル発現を提供するのが好ましい。前記のように、組換え構築物は、内因性また は外因性の調節エレメント、誘導性または抑制性の調節エレメント、あるいは組 織特異的な調節エレメントを含有し得る。 別の１連の実施態様において、遺伝子療法を用いて、組換え構築物による相同 組換えにより変異遺伝子を置換することができる。組換え構築物は、標的化プレ セニリン遺伝子の正常コピーを含有することができ、この場合、欠陥はインサイ チュで矯正されるか、あるいは変異遺伝子の機能をなくす停止コドン、ミスセン ス変異、または欠失を導入する「ノックアウト」構築物を含有することができる 。この点に関して、このような構築物は、ヘテロ接合個体における標的化プレセ ニリンの正常および変異コピーの両方をノックアウトすることができるが、プレ セニリン遺伝子機能の全喪失は、疾患状態の継続した進行よりも個体に対して有 害性が低いであろうことに注意すべきである。 別の１連の実施態様において、アンチセンス遺伝子療法を使用することができ る。アンチセンス療法は、遺伝子発現の配列特異的抑制がmRNAまたはDNAと相補 的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションによって達成できると いう事実に基づく。次いで、ハイブリッド二重鎖の形成は、遺伝子の転写および ／または標的プレセニリンmRNAのプロセシング、輸送、翻訳および／または安定 性を妨害し得る。アンチセンスストラテジーは、アンチセンスオリゴヌクレオチ ドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエー ト骨格を持つアナログ）の投与、およびアンチセンスRNA発現ベクターでのトラ ンスフェクションを含む種々のアプローチが使用できる。さらに、このようなベ クターは、外因性または内因性の調節エレメント、誘導性または抑制性の調節エ レメント、あるいは組織特異的調節エレメントを含むことができる。 別の１連の実施態様において、遺伝子療法を用いて、変異プレセニリン遺伝子 によって引き起こされる異常な機能を阻止するか、またはそうでなければ矯正す るタンパク質またはペプチドをコードする組換え構築物を導入することができる 。１つの実施態様において、組換え遺伝子は、別の細胞タンパク質または他の細 胞リガンドと異常に相互作用することが判明しているプレセニリンの変異ドメイ ンに対応するペプチドをコードし得る。従って、例えば、もし変異TM6→7ドメイ ンが特定の細胞タンパク質と相互作用するが、対応する正常TM6→7ドメインがこ の相互作用を受けないことが見出されているならば、遺伝子療法を用いて、変異 タンパク質と競合でき、そして異常な相互作用を阻害または阻止できる過剰の変 異 TM6→7ドメインを提供することができる。あるいは、変異プレセニリンと相互作 用するが、正常プレセニリンとは相互作用しないタンパク質の部分をコードし、 組換え構築物により発現させて、異常な相互作用と競合させ、それにより、それ を阻害または阻止することができる。最後に、別の実施態様において、同一の効 果が、変異トランスジーンの挿入によってC ．elegansにおける「Deg 1(d)」および「 Mec 4(d)」の変異の修正と同様のアプローチにおける遺伝子療法によって第２の 変異タンパク質を挿入することにより獲得され得る。 特に感染ならびに安定な組込みおよび発現の高効率のために、レトロウイルス ベクターが、体細胞の遺伝子療法で使用することができる。しかしながら、標的 化細胞を分け得なければならず、そしてこの疾患は優性のものであるので、正常 タンパク質の発現レベルを高くすべきである。全長のPS1またはPS2遺伝子、プレ セニリンの機能的ドメインをコードするサブ配列、または前記の他の治療ペプチ ドのいずれかをレトロウイルスベクターにクローン化し、そして内因性プロモー ター、レトロウイルスの長末端反復、または目的の標的細胞型（例えば、ニュー ロン）に特異的なプロモーターから駆動することができる。使用することができ る他のウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ウシ乳 頭腫ウイルス、またはエプスタインバールウイルスなどのヘルペスウイルスを含 む。 Ｃ．免疫療法 免疫療法はまた、アルツハイマー病に可能である。抗体を変異PS1またはPS2タ ンパク質（またはその部分）に対して惹起させ、そして患者に投与して、変異タ ンパク質に結合するか、またはそれを阻止して、その有害効果を妨げる。同時に 、正常なタンパク質産物の発現を刺激することができる。あるいは、変異または 野生型のPS1またはPS2とそれらの相互作用パートナーとの間の特異的複合体に対 して抗体を惹起させる。 さらなるアプローチは、所望の抗原に対する内因性の抗体産生を刺激すること である。投与は、１回の免疫原性調製物またはワクチン免疫化の形態であり得る 。免疫原性組成物は、注射剤、液状溶液またはエマルジョンとして調製され得る 。 PS1またはPS2タンパク質あるいは他の抗原を、タンパク質に適合する薬学的に受 容可能な賦形剤と混合することができる。このような賦形剤は、水、生理食塩水 、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含み得る 。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに、乳化剤またはアジュバントなどの 補助物質を含有し、有効性を増強させることができる。免疫原性組成物およびワ クチンは、皮下注射または筋肉内注射によって、非経口的に投与することができ る。 免疫原性調製物およびワクチンは、治療的に有効で、保護的でかつ免疫原性と なるような量で投与される。用量は、投与経路に依存し、そして宿主のサイズに 応じて変化する。 Ｄ．低分子治療薬 本明細書中で記載されそして実施可能となるように、本発明は、アルツハイマ ー病、またはプレセニリンにおける変異によって引き起こされた他の障害の処置 で有用であり得る低分子または他の化合物を同定する多数の方法を提供する。従 って、例えば、本発明は、プレセニリン結合性タンパク質を同定する方法、特に 、変異プレセニリンに結合するか、またはそうでなければそれと相互作用するが 、正常なプレセニリンとはそうはならないタンパク質または他の細胞成分を同定 する方法を提供する。本発明はまた、変異プレセニリンとこのようなタンパク質 または他の細胞成分との間の異常な相互作用を破壊するのに使用できる低分子を 同定する方法を提供する。 正常なプレセニリンではなく変異プレセニリンを関するこのような相互作用は 、プレセニリンの変異によって乱され、そしてアルツハイマー病の原因となる生 化学経路を理解するのに有用な情報を提供するのみならず、疾患の病因学におけ る介入のための中間的な治療標的を提供する。これらのタンパク質を同定し、そ してこれらの相互作用を分析することによって、相互作用に逆作用するか、また はそれを妨げる化合物についてスクリーニングして、それを設計することが可能 であり、従って、異常な相互作用のための可能な処置を提供する。これらの処置 は、これらのパートナーによるプレセニリンの相互作用を変化させるか、相互作 用するタンパク質の機能を変化させるか、相互作用パートナーの量または組織分 布あ るいは発現を変化させるか、またはプレセニリン自体の同様の特性を変化させる 。 療法は、これらの相互作用を調節し、従って、アルツハイマー病ならびにPS1 遺伝子またはPS2遺伝子あるいはそれらの遺伝子産物の後天的または遺伝的な異 常性に関連する他の状態を調節するように設計することができる。これらの療法 の潜在的な効率は、PS1遺伝子、PS2遺伝子または他のプレセニリンホモログの機 能的ドメインに対応する合成ペプチドまたは組換えタンパク質を用い、親和性（ ＫdおよびＶmax等）の標準的な薬物動態学測定によって、治療剤への暴露後のこ れらの相互作用の親和性および機能を分析することによってテストできる。親水 性ループなどの機能的ドメインを含む任意の相互作用の効果をアッセイする別の 方法は、治療剤の存在下および非存在下におけるインサイチュハイブリダイゼー ション、免疫組織化学、ウェスタンブロッティングおよび代謝パルス−チェイス 標識実験によって、関連遺伝子の細胞内移動および翻訳後修飾の変化をモニター することである。さらなる方法は、（ｉ）APPおよびその産物の細胞内代謝、移 動および標的化の変化；(ii)セカンドメッセンジャー事象、例えば、cAMP細胞内 Ca2+、プロテインキナーゼ活性等の変化を含む「下流」事象の効果をモニターす ることである。 前記のように、プレセニリンは、APP代謝に関与し得、そしてプレセニリンの リン酸化状態は、α−セクレターゼとAPPプロセシングのＡβ経路との間のバラ ンスに対して重要であり得る。本発明の形質転換細胞および動物モデルを用いる と、これらの経路およびプレセニリン変異で起こる異常事象をよく理解できる。 この知識を用いて、次いで、プレセニリン変異の有害効果に逆作用する治療スト ラテジーを設計することができる。 アルツハイマー病を処置するためには、例えば、PS1および／またはPS2のリン 酸化状態を、プロテインキナーゼＣおよび他のプロテインキナーゼの活性を変化 させるか、またはプロテインホスファターゼの活性を変化させるか、あるいは翻 訳後に修飾されるPS1の利用性を改変する化学剤および生化学剤（例えば、薬物 、ペプチドおよび他の化合物）によって変化させることができる。キナーゼおよ びホスファターゼとプレセニリンタンパク質との相互作用、およびプレセニリン タンパク質とゴルジネットワーク内のAPPのトラフィッキングに関与する他のタ ン パク質との相互作用を調節して、ゴルジ小胞のエンドソーム−リソソーム経路へ のトラフィッキングを低下させ、それにより、Ａβペプチド産生を阻害すること ができる。このような化合物は、APP、PS1、PS2のペプチドアナログおよび他の プレセニリンホモログ、ならびに他の相互作用するタンパク質、脂質、糖、およ びPS1、PS2および／またはそれらのホモログの異なるグリコシル化を促進する薬 剤；プレセニリンmRNAまたはタンパク質の生物学的半減期を変化させる薬剤（抗 体およびアントセンスオリゴヌクレオチドを含む）；ならびにPS1および／また はPS2の転写に作用する薬剤を含む。 これらの薬剤の細胞株および動物全体における効果は、PS1および／またはPS2 の転写、翻訳および翻訳後修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）、なら びに種々の細胞内および細胞より小さい区画を介するPS1および／またはPS2の細 胞内移動をモニターすることによってモニターできる。これらの実験のための方 法は、ウェスタンおよびノーザンブロット、放射性メチオニンおよびATPでの代 謝標識（パルス−チェイス）後の免疫沈降、および免疫組織化学を含む。これら の薬剤の効果はまた、プロテインキナーゼＣ、APP、PS1、PS2、または他のプレ セニリンホモログに対する抗体を用いる標準的な結合親和性アッセイまたは共沈 殿およびウェスタンブロットのいずれかを用いて、プロテインキナーゼＣおよび ／またはAPPとの相互作用に関与するPS1および／またはPS2タンパク質の相対的 結合親和性および相対量を調べる実験を用いてモニターすることができる。これ らの薬剤の効果はまた、予想される治療剤への暴露の前後に、ELISAによってＡ βペプチドの生産を評価することによってモニターすることができる(例えば、H uangら，1993を参照のこと)。この効果はまた、アルツハイマー病において神経 毒性であると考えられているアルミニウム塩および／またはＡβペプチドへの暴 露の後に細胞株の生存率を評価することによってモニターすることができる。最 後に、これらの薬剤の効果は、APPおよび／またはそれらのプレセニリンホモロ グにおいて正常な遺伝子型を有するか、（変異を含むまたは含まない）ヒトAPP トランスジーンを有するか、（変異を含むまたは含まない）ヒトプレセニリント ランスジーンを有するか、またはこれらのいずれかの組合せを有する動物の認識 機能を評価することによってモニターすることができる。 同様に、前記のように、プレセニリンは、レセプターまたはイオンチャンネル としてCa2+の調節に関与し得る。プレセニリンのこの役割はまた、本発明の形質 転換細胞株および動物モデルを用いて調べることができる。これらの結果に基づ いて、アルツハイマー病についてテストを行い、プレセニリン遺伝子およびそれ らの産物、または相同遺伝子およびそれらの産物において後天的または遺伝的な 異常性に関連する異常なレセプターまたは異常なイオンチャンネル機能を検出す ることができる。このテストは、細胞内カルシウムまたは膜貫通電位に感受性の パッチクランプ、電位クランプおよび蛍光色素を用いて、イオンチャンネルフラ ックスおよび／または膜貫通電位または電流フラックスを測定することによって 、インビボまたはインビトロのいずれかで達成することができる。欠陥イオンチ ャンネルまたはレセプター機能はまた、環状AMP、cGMPチロシンキナーゼ、ホス ファターゼなどのセカンドメッセンジャーの活性化、細胞内Ca2+レベルの増加等 の測定によって評価することができる。また、組換えにより作成されたタンパク 質はまた、人工膜系において再構成され、イオンチャンネルコンダクタンスを調 べることができる。（PS1遺伝子またはPS2遺伝子における後天的／遺伝的欠陥の ため；APPにおける変異などのこの疾患に至る他の経路における欠陥のため；お よび環境薬剤のために）アルツハイマー病に影響する療法を、プレセニリン遺伝 子における変異によって誘導された異常なイオンチャンネルまたはレセプター機 能を修飾するそれらの能力の分析によってテストすることができる。療法はまた 、プレセニリンタンパク質のイオンチャンネルまたはレセプターの能力の正常な 機能を改変するそれらの能力によってテストすることができる。このようなアッ セイは、内因性の正常または変異PS1遺伝子／遺伝子産物あるいはPS2遺伝子／遺 伝子産物を発現する培養細胞で行うことができる。このような研究はまた、正常 または変異形態の、プレセニリンの１つ、またはプレセニリンの１つの機能的な ドメインを発現し得るベクターでトランスフェクトした細胞で行うことができる 。アルツハイマー病に対する療法は、PS1遺伝子またはPS2遺伝子の異常なイオン チャンネルまたはレセプター機能を改変するように工夫し得る。このような療法 は、通常の薬物、ペプチド、糖、または脂質、ならびに抗体、あるいはPS1また はPS2の遺伝子産物の特性に影響する他のリガンドであり得る。このような療法 はまた、 遺伝子療法によって、PS1遺伝子および／またはPS2遺伝子の直接的な置換によっ て実施され得る。イオンチャンネルの場合、遺伝子療法は、プレセニリン遺伝子 の一部またはすべてのゲノムDNA配列を有する、ミニ遺伝子（cDNA＋プロモータ ー）またはゲノム構造物のいずれかを用いて行うことができる。また、C.elegan s においてMec4およびDeg1の置換について最近行われたように（HuangおよびChal fie(1994)）、変異プレセニリンまたはホモログの遺伝子配列はまた、プレセニ リン遺伝子の遺伝的または後天的な異常性の結果に対抗するために用いることが できる。この療法はまた、PS2遺伝子などの１つのホモログのレセプターまたは イオンチャンネルの機能を増大させるのに指向し、その結果、別のホモログの変 異形態（例えば、後天的または遺伝的な欠陥により欠陥とされたPS1遺伝子）の 機能を潜在的に受け継ぐようにできる。正常なPS1またはPS2遺伝子を用いる遺伝 子置換を施した、変異PS1遺伝子または変異PS2遺伝子の発現を阻止するためのア ンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる療法はまた、遺伝子療法またはタンパク 質置換療法のいずれかの標準的な技術を用いて適用することができる。 実施例 実施例１ 最小共分離領域の遺伝的、物理的「コンティグ」および転写マップの 開発 遺伝連鎖研究ならびに付加的マーカーで使用される12 SSRマーカー遺伝子座の 各々についてのオリゴヌクレオチドプローブを用いて、CEPH MegaYACおよびRPCI PACヒト全ゲノムDNAライブラリーを、染色体14q24.3のAD3領域からのゲノムDNA フラグメントを含有するクローンについてサーチした(Albertsenら(1990)Proc.N atl.Acad.Sci(USA)87:4256-4260；Chumakovら(1992)Nature 359:380-387；Ioann uら(1994)Nature Genetics 6:84-89)。各マーカー間の遺伝子マップ距離をコン ティグ上方に描き、そしてそれは公表されたデータ(NIH/CEPH Collaborative Ma pping Group(1992)Science 258:67-86；Wang(1992)Genomics 13:532-536;Weisse nbachらｍｌ992；Gyapayら、1994)から得られる。４つの独立した方法を用い、 最初のマーカー遺伝子座の各々について回収されたクローンを、部分的にオーバ ーラップするクローン（「コンティグ」）の順序立てたシリーズに並べた。 最初に、逆PCR(Rlieyら(1990)Nucl.Acid Res．18:2887-2890)によってYACインサ ートの末端を表す配列を単離し、そしてオーバーラップする配列を有する他のYA Cクローンを同定するために、最初の遺伝子座の全てについて回収されたYACクロ ーンの全て由来のDNAの制限消化物を含有するサザンブロットパネルにハイブリ ダイズした。２番目に、Alu間PCRを各YACにおいて行い、そしてオーバーラップ する配列を有する他のクローンを同定するために、得られたバンドパターンを、 回収されたYACクローンのプールを交差して比較した(Bellamne-Chartelotら(199 2)Cell 70:1059-1068；Chumakovら、1992)。３番目に、Alu-PCRフィンガープリ ンティングの特異性を改善するために、YAC DNAをHaeIIIまたはRsaIで制限酵素 処理し、制限産物をAluおよびLlHの両コンセンサスプライマーで増幅し、そして この産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回収した。最後に、さらな るSTSが、転写された配列についてのサーチの間に生じたので、これらのSTSをま た用いてオーバーラップを同定した。得られたコンティグは、D14S53を有するYA C932C7と、D14S61を有するYAC746B4との間の単一の不連続性を除いて完全であっ た。コンティグ内のSTSの物理的マップ順序は、この領域についての遺伝連鎖マ ップと大いに一致していた(NIH/CEPH Collaborative Mapping Group，1992;Wang およびWeber，1992;Weissenbachら，1992;Gyapayら，1994)。しかし、遺伝子マ ップに関してのように、D14S43/D14S71クラスターおよびD14S76/D14S273クラス ター内の遺伝子座の相対的順序を明確に決定するのは不可能であった。PAClクロ ーンは、D14S277がD14S268に対してテロメリック（telomeric）であることを示 唆し、他方、遺伝子マップは逆の順序を示唆した。さらに、最も貧弱なコンセン サス物理的マップに基づき、かつ遺伝子マップから、STSを含有することが予測 される少なくとも１つのYACクローンにおいて、数個のSTSプローブは、ハイブリ ダイゼーションパターンを検出することができなかった。例えば、D14S268(AFM2 65)およびRSCAT7 STSはYAC788H12には存在しなかった。これらの結果は再現性が あり、かついくつかの異なるSTSマーカーで起こったので、これらの結果は、お そらく、YACクローンの１つの内の小さな隙間の欠失の存在を反映する。実施例２ 染色体14q24.3マーカーについての累積２点ロッドスコア 各マイクロサテライト遺伝子座(Weissenbachら、1992；Gyapayら、1994)につ いて特異的なプライマー配列を用い、以前に記載されたように(St.George-Hyslo pら、1992)、全ての利用可能な罹患したまたは罹患していない家系メンバーの10 0ngのゲノムDNAから、PCRによって、各多型マイクロサテライトマーカー遺伝子 座での遺伝子型を決定した。同一人種集団からの配偶者および他の神経学的に正 常な被験体を用い、各対立遺伝子の正常集団頻度を決定したが、混成の白色人種 集団について確立されたものと有意に異ならなかった(Weissenbachら、1992；Gy apayら、1994)。最大尤度計算により、発症年齢の修正（an age of onset corre ction）、混成の白色人種被験体の公表されたシリーズから得られたマーカー対 立遺伝子頻度、および以前に記載されたような(St.George-Hyslopら、1992)、1: 1000のAD3変異についての見積もられた対立遺伝子頻度が推定された。同等なマ ーカー対立遺伝子頻度、および以前に記載された罹患した家系メンバーのみから の表現型情報を用い、分析を反復して、最大尤度計算で使用した見積もられたパ メーターにおける不正確さが、分析を誤まらせないことを確実とした(St.George -Hyslopら、1992)。これらの補足的分析は、連鎖を支持する証拠または組換え事 象の発見のいずれかを有意に変更しなかった。実施例３ FADにおいてAD3を有する隣接マーカー分離体間のハプロタイプ １４の早期発症FAD家系(家系NIH2、MGH1、Tor1.1、FAD4、FAD1、MEX1、および FAD2)において、AD3とともに分離する第１４染色体の親コピー上のセントロメア 隣接マーカーとテロメア隣接マーカーとの間の拡張されたハプロタイプは、家系 特異的ロッドスコア＞+3.00を示し、D14S258およびD14S53の間に少なくとも１つ のマーカーを有する。同様の人種集団起源のいくつかの家系において分離する染 色体を有する疾患の２つの領域で、同一の部分的ハプロタイプが観察された。領 域Ａにおいて、共有される対立遺伝子が、D14S268（「Ｂ」；対立遺伝子サイズ ＝126bp、正常白色人種における対立遺伝子頻度＝0.04；「Ｃ」；サイズ＝124bp 、頻度＝0.38）；D14S277（「Ｂ」：サイズ＝156bp、頻度＝0.19、「Ｃ」：サイ ズ＝154bp、頻度＝0.33）；およびRSCAT6（「Ｄ」；サイズ＝111bp、頻度0.2 5；「Ｅ」：サイズ＝109bp、頻度＝0.20；「Ｆ」：サイズ＝107bp、頻度＝0.47 ）で観察される。領域Ｂにおいては、同一サイズの対立遺伝子が、D14S43（「Ａ 」：サイズ＝193bp、頻度＝0.01；「Ｄ」：サイズ＝187bp、頻度＝0.12；「Ｅ」 ：サイズ＝185bp、頻度＝0.26；「Ｉ」：サイズ＝160bp、頻度＝0.38）；D14S27 3（「３」：サイズ＝193bp、頻度＝0.38；「４」サイズ＝191bp、頻度＝0.16； 「５」：サイズ＝189bp、頻度＝0.34；「６」：サイズ＝187bp、頻度＝0.02）お よびD14S76（「１」：サイズ＝bp、頻度＝0.01；「５」：サイズ=bp、頻度＝0.3 8；「６」：サイズ＝bp、頻度＝0.07；「９」：サイズ＝bp、頻度＝0.38）で観 察される。詳細については、Sherringtonら(1995)を参照。実施例４ AD3インターバルからの転写配列の回収 直接的ハイブリダイゼーション方法を用い、AD3インターバルにコードされた 推定転写配列を回収した。ここでは、ヒト脳mRNAから生じた短いcDNAフラグメン トを、固定化したクローン化ゲノムDNAフラグメントにハイブリダイズさせた(Ro mmensら、1993)。得られた短い推定転写配列をプローブとして用いて、ヒト脳ｃ DNAライブラリーから、より長い転写物を回収した(Stratagene、La Jolla)。元 の短いクローンの物理的位置、および引き続いて獲得されたより長いcDNAクロー ンの物理的位置を、コンティグ内の個々のYACクローンから単離したEcoRI消化し た全DNAサンプルのパネルを含有するサザンブロットにプローブをハイブリダイ ズさせることによって生じたハイブリダイゼーションパターンの分析によって確 立した。自動サイクル配列決定(Applied Biosystems Inc.、CA)によって、より 長いcDNAクローンの各々のヌクレオチド配列を決定し、そしてブラスト（blast ）アルゴリズム(Altschulら、1990)を用いて、ヌクレオチドおよびタンパク質デ ータベースにおける他の配列と比較した。転写された配列についての受託番号は ：L40391、L40392、L40393、L40394、L40395、L40396、L40397、L40398、L40399 、L40400、L40401、L40402、およびL40403である。実施例５ 制限酵素を用いるPS1遺伝子における変異の位置決定 95℃×20秒、60℃×20秒、72℃×5秒の30サイクルにて、100ngのゲノムDNA鋳 型、2mM MgCl2、10ピコモルの各プライマー、0.5UのTaqポリメラーゼ、250μＭ dNTPを用いて、84bpのゲノムエクソンフラグメントを増幅するために、配列番号 １のbp907〜925に本質的に対応する末端標識プライマー、および配列番号１のbp 1010〜990の相補物に対応する非標識プライマーを用いるPCRによって、DdeI制限 部位を生じるA246E変異の存在を、ゲノムDNAにおいてアッセイした。製造業者の プロトコルに従って、産物を過剰のDdeIと共に２時間インキュベートし、そして 得られた制限フラグメントを６％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、そし てオートラジオグラフィーで可視化した。DdeI制限部位の存在による84bpフラグ メントの切断から、変異の存在が推定された。FADI家系の全ての罹患したメンバ ー、および数人の危険な状態のメンバーは、DdeI部位を保有していた。真性逸脱 者（疾患にかかっていない個体、年齢＞70歳）のいずれも、そして正常コントロ ールのいずれも、DdeI変異を保有していなかった。実施例６ 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いるPSI遺伝子における変 異の位置決定 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用い、C410Y変異の存在をアッセイし た。2.5mM MgCl2を除く上記反応条件、および94℃×20秒、58℃×20秒、および7 2℃10秒のサイクル条件を用い、配列番号１のbp1451〜1468に対応するエクソン 配列プライマー、および配列番号14のbp7l9〜699と相補的な反対のイントロン配 列プライマーを用いて、100ngのゲノムDNAを増幅した。得られた216bpゲノムフ ラグメントを、0.4M NaOH、25mM EDTA中の10倍希釈によって変性し、そして二連 のナイロン膜に真空スロット−ブロットした。（配列番号１のbp1468〜1486に対 応する）末端標識「野生型」プライマー、および（1477位におけるＧ→Ａ置換を 有する以外は同一配列に対応する）末端標識「変異」プライマーを、48℃にて、 ５×SSC、５×デンハルト、0.5％SDS中にて、スロット−ブロットフィルターの 別々のコピーに１時間ハイブリダイズさせ、次いで、23℃にて２×SSC中で、そ して50℃にて２×SSC、0.1％SDS中で連続的に洗浄し、次いで、Ｘ−線フィルム に感光させた。AD3およびNIH2家系の全てのテスト可能な罹患したメンバーなら びに数人の危険な状態のメンバーは、C410Y変異を保有していた。SSCPによりC41 0Y変異を検出しようとする試みにより、共通のイントロン配列多型が同−SSCPパ ターンで移動することが明らかにされた。実施例７ 種々の組織におけるPS1タンパク質mRNAの発現を示すノーザンハイブ リダイゼーション CsCl精製のような標準的な手法を用い、外科的病理学から得られた種々の組織 サンプル（心臓、脳、および胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および脾臓の異な る領域を含む）から、全細胞質RNAを単離した。次いで、RNAをホルムアルデヒド ゲルにおいて電気泳動して、サイズ分画を行った。ニトロセルロース膜を調製し 、次いで、RNAを膜に移した。32P-標識cDNAプローブを調製し、そしてプローブ とRNAとの間のハイブリダイゼーションが起こるように膜に添加した。洗浄した 後、膜をプラスチックフィルム中に包み、そしてＸ−線フィルムを含有するイメ ージングカセットに入れた。次いで、オートラジオグラフィーを行って、１〜数 日間現像した。標準的なRNAマーカーとの比較によって、サイズ分類を確立した 。オートラジオグラフィーの解析により、3.0kbのサイズにおいて顕著なバンド が明らかになった（Sherringtonら、1995の図２を参照）。これらのノーザンブ ロットは、PS1遺伝子が調べた組織の全てで発現されることを示した。実施例８ 真核生物および原核生物発現ベクター系 真核生物および原核生物発現系で使用するのに適した構築物を、PS1ヌクレオ チドcDNA配列インサートの３つの異なるクラスを用いて作製した。第１のクラス （全長構築物という）においては、全PS1 cDNA配列を、正しい方向で発現プラス ミドに挿入し、これは、天然の5'UTRおよび3'UTRの両配列ならびに全オープンリ ーディングフレームを含んだ。このオープンリーディングフレームはヌクレオチ ド配列カセットを有し、このヌクレオチド配列カセットは、野生型オープンリー ディングフレームが発現系に含まれることを可能とするか、あるいは、単一また は二重変異の組合せをオープンリーディングフレームに挿入することができる。 これは、酵素NarIおよびPflmIを用いて野生型オープンリーディングフレームか ら制限フラグメントを除去し、そして逆転写酵素PCRによって生じた類似のフラ グメントでそれを置き換え、そしてM146L変異またはH163R変異のいずれかをコー ドするヌクレオチド配列を保有させることによって達成された。酵素PflmIおよ びNcoIでの切断によって、オープンリーディングフレームについての野生型正常 ヌクレオチド配列から第２の制限フラグメントを除去し、そしてA246E変異、A26 0V変異、A285V変異、L286V変異、L392V変異、またはC410Y変異をコードするヌク レオチド配列を有する制限フラグメントで置き換えた。タンデムに、M146Lまた はH163R変異のいずれかと、残りの変異のうちの１つとの組合せを有する第３の 変異体を、前者の変異の１つを有するNarI-PflmIフラグメント、および後者の変 異の１つを有するPflmI-NcoIフラグメントを連結することによって作製した。 全長野生型または変異cDNA配列から5'UTR、および3'UTR配列の一部を除去する ことによって、第２のクラス（短縮型構築物という）のcDNAインサートを構築し た。5'UTR配列を、KpnI制限部位（GGTAC/C）および小配列（GCCACC）を含有する 合成オリゴヌクレオチドで置き換えて、PSIORFの始まり（配列番号１のbp249〜2 67）のATG付近にKozak開始部位を作製した。3'UTRを、5'末端に人工EcoRI部位を 有する配列番号１のbp2568〜2586の相補物に対応するオリゴヌクレオチドで置き 換えた。次いで、上記の変異配列を、上記のNarI-PflmIおよびPslmI-NcoI部位に 挿入することによって、この構築物の変異体を作製した。 第３のクラスの構築物は、クローンcc44由来の配列を含み、これは、エクソン ４のオルタナティブスプライスの結果、Ｎ末端の４残基の削除が起こったもので あった（配列番号３）。 真核生物発現については、制限消化によってSV60プロモーターカセットを除去 し、そしてpcDNA3のCMVプロモーターエレメント(Invitrogen)で置き換えた発現 ベクターpZeoSV中に、上記の野生型および変異配列を有するこれらの種々のcDNA 構築物をクローン化した。原核生物発現については、グルタチオンＳ−トランス フェラーゼ（GST）融合ベクターpGEX-kgを用いて、構築物が作製されている。GS T融合ヌクレオチド配列に付着させたインサートは、正常のオープンリーディン グフレームヌクレオチド配列を有するか、または上記の単一および二重変異の組 合せを有する上記の同一ヌクレオチド配列である。これらのGST融合構築物は、 変異または野生型GST融合タンパク質として原核細胞系における部分的または全 長のタンパク質の発現を可能とし、従って、全長タンパク質の精製、続くトロン ビン消化によるGST融合産物の除去を可能とする。GST融合ベクターを用いて、さ らなるcDNA構築物を作製して、野生型ヌクレオチド配列として、またはA285V変 異、L286V変異、もしくはL392V変異のいずれかを有する変異配列として、全長タ ンパク質のTM6とTM7との間の親水性酸性ループドメインに対応するアミノ酸配列 の産生を可能とする。これは、5'BamHI制限部位（G/GATCC）を有する配列番号１ のbp1044〜1061に対応する5'オリゴヌクレオチドプライマー、および5'EcoRI制 限部位（G/AATTC）を有する配列番号１のbp1476〜1458の相補物に対応する3'プ ライマーを用い、適切なRNAの供給源から野生型または変異配列を回復させるこ とによって達成された。これは、pGEX-KGベクター内のBamHIおよびEcoRI部位に おける親水性酸性ループドメインに対応する適切な変異または野生型ヌクレオチ ド配列のクローニングを可能とした。実施例９ PS1遺伝子におけるさらなる変異の位置決定 PS1遺伝子における変異は、成熟mRNA／cDNA配列またはゲノムDNAを表すRT-PCR 産物を用い、種々のストラテジー（直接的ヌクレオチド配列決定、対立遺伝子特 異的オリゴ、連結ポリメラーゼ連鎖反応、SSCP、RFLP）によってアッセイされ得 る。A260VおよびA285V変異については、このエクソンを有するゲノムDNAを、L28 6V変異と同一のPCRプライマーおよび方法を用いて増幅し得る。 次いで、PCR産物を変性し、そしてC410Y変異について記載したスロットブロッ トプロトコルを用い、二連のナイロン膜にスロットブロットした。 48℃におけるハイブリダイゼーション、続く0.1％SDSを含有する３×SSC緩衝 液中での52℃における洗浄によって、野生型配列（配列番号１のbp1017〜1036） または変異配列（bp1027にＣ→Ｔを有するbp1017〜1036）に対応する末端標識対 立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを用いて、A260 V変異をこれらのブロットにおいて得点付けた。代わりに、48℃において野生型 配列（配列番号１のbp1093〜1111）または変異プライマー（bp1102にＣ→Ｔを有 する配列番号１のbp1093〜1111）に対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド を用いる以外は上記のように、続いて、洗浄溶液が２×SSCである以外は上記の ように52℃で洗浄することにより、A285V変異を、これらのスロットブロットに おいて得点付けた。 マグネシウム濃度が2mMであり、かつサイクル条件が94℃×10秒、56℃×20秒 、および72℃×10秒である以外は標準的なPCR緩衝液条件を用い、プライマー（ 配列番号14のbp439〜456に対応する5'、および配列番号14の719〜699に相補的な 3'）を用い、ゲノムDNAからのエクソンの増幅によって、L392V変異を得点付けた 。C410Y変異について記載したように、得られた200塩基対ゲノムフラグメントを 変性し、そして二連でナイロン膜にスロット−ブロットした。次いで、変異の存 在または非存在を、45℃におけるハイブリダイゼーション、次いで23℃における ２×SSCおよび次いでの68℃における２×SSC中での連続的な洗浄によって、野生 型末端標識オリゴヌクレオチド（配列番号１のbp1413〜1431）または末端標識変 異プライマー（bp1422にＣ→Ｇを有する配列番号１のbp1413〜1431）のいずれか への差別的なハイブリダイゼーションによって得点付けた。実施例10 抗体産生 PS1タンパク質の一部に対応するペプチド抗原を固相技術によって合成し、そ して逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。プレセニリンフラグメ ントのペプチドＣ末端におけるシステイン残基の添加によって可能になったジス ルフィド結合を介して、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH） に共有結合させた。このさらなる残基は、タンパク質配列が正常ではないと思わ れ、そしてKLH分子への結合を容易にするために含まれたにすぎない。抗体が惹 起された特異的プレセニリン配列は以下の通りである： ポリクローナル抗体＃ hPS1抗原（配列番号２） 1142 30〜44 519 109〜123 520 304〜318 1143 346〜360 これらの配列は、PS1タンパク質の特異的ドメイン内に含まれる。例えば、残 基30〜44はＮ末端内にあり、残基109〜123はTM1→２ループ内にあり、そして残 基304〜318および346〜360は大きなTM6→7ループ内にある。これらのドメインの 各々は、水性媒体に暴露され、そして疾患表現型の発生に重要な他のタンパク質 への結合に関与し得る。ペプチドの選択は、IBI PustelI抗原性予測アルゴリズ ムを用いるタンパク質配列の分析に基づくものであった。 合計３匹のニュージランド白ウサギを、フロイントのアジュバントと組み合わ せて各ペプチド抗原についてのペプチド-KLH複合体で免疫化し、続いて、７日間 隔でブースター注射した。抗血清を各ペプチドについて収集し、そしてプールし 、そして硫酸アンモニウムを用いてIgGを沈殿させた。次いで、抗体を、適切な ペプチドにカップリングさせたスルホー連結アガロース(Pierce)でアフィニティ ー精製した。この最終精製は、免疫前または免疫後のいずれかの血清中に存在す る他の抗体の非特異的相互作用を除去するのに必要である。 各抗体の特異性を、３つのテストで確認した。第１に、各々は、脳ホモゲネー トのウェスタンブロットにおいてプレセニリン−１について予測されたおよその サイズの単一の支配的バンドを検出した。第２に、各々は、適切な配列を有する 組換え融合タンパク質と交差反応した。第３に、各々は、組換えPS1または免疫 化ペプチドでの予備吸着によって特異的にブロックされ得た。 さらに、２つの異なるPS1ペプチドグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST ）融合タンパク質を用いて、PS1抗体を作製した。最初の融合タンパク質は、GST に融合したPS1のアミノ酸1〜81（Ｎ末端）を含んでいた。第２の融合タンパク質 は、GSTに融合したPS1のアミノ酸266〜410（TM6→7ループドメイン）を含んでい た。これらの融合タンパク質をコードする構築物を、pGEX-2T発現プラスミド(Am rad)中に適切なヌクレオチド配列を挿入することによって作製した。得られた構 築物は、GSTをコードする配列、ならびにGSTとPS1ペプチドとの間のトロンビン 感受性切断のための部位を含んでいた。発現構築物を、DH5a E ．coliにトランス フェクトし、そして融合タンパク質の発現を、IPTGを用いて誘導した。細菌ペレ ットを溶解させ、そしてグルタチオンセファロースビーズ(Boehringer-Mannheim 、Montreal)における単一工程アフィニティークロマトグラフィーによって、可 溶性GST−融合タンパク質を精製した。標準的な手順を用い、このGST−融合タン パク質を用いて、マウスを免疫化して、モノクローナル抗体を作製した。 これらのマウスから得られたクローンを、精製されたプレセニリンフラグメント を用いてスクリーニングした。 さらに、GST−融合タンパク質をトロンビンで切断して、PS1ペプチドを遊離さ せた。遊離されたペプチドをサイズ排除ＨＰＬＣによって精製し、そしてこれを 用いて、ポリクローナル抗血清の作製のためにウサギを免疫化した。 同様の方法によって、プレセニリン−２のアミノ酸1〜87（Ｎ末端）、または2 72〜390（TM6→TM7ループ）のためのヌクレオチド配列を含む構築物を用い、GST 融合タンパク質を作製し、そしてこれを使用してこのタンパク質に対するモノク ローナル抗体を作製した。PS2−GST融合タンパク質もまたトロンビンで切断し、 そしてこの遊離され、精製されたペプチドを用いて、ウサギを免疫化して、ポリ クローナル抗血清を調製した。実施例11 PS2遺伝子における変異の同定 888bp産物については、配列番号18のbp478〜496に対応する5'プライマー、お よび配列番号18のbp1366〜1348と相補的な3'プライマーを有する第１のオリゴヌ クレオチドプライマー対、そして826bp産物については、配列番号18のbp1083〜1 102に対応する5'プライマーおよび配列番号18のbp1909〜1892と相補的な3'プラ イマーを有する第２のプライマー対を用い、PS2 ORFに対応するRT-PCR産物を、 リンパ芽球または凍結した死後脳組織のRNAから生成した。250mMolのdNTP、2.5m M MgCl2、10pMolのオリゴヌクレオチドを用いて、10ml中で、94℃×20秒、58℃ ×20秒、72℃×45秒の40サイクルでサイクルさせるPCRを行った。自動サイクル 配列決定(ABI、Foster City、CA)によってPCR産物を配列決定し、蛍光クロマト グラムを、直接的観察によって、およびFactura(バージョン1.2.0)およびSequen ce Navigator(バージョン1.0.1bl5)ソフトウェアパッケージによって、ヘテロ接 合ヌクレオチド置換についてスキャンした（データは示さず）。 N141I変異の検出：ヌクレオチド787におけるＡ→Ｔ置換は、BclI制限部位を生 じさせる。この変異を有するエクソンを、配列番号18のbp733〜751（末端標識） に対応するオリゴヌクレオチド、および配列番号18のbp846〜829の相補物の各10 pMol、ならびにM239V変異について下記するものと同様のPCR反応条件を用い、10 0ngのゲノムDNAから増幅した。製造業者のプロトコルに従い、BclI(NEBL、Bever ly、MA)を用いて2mlのPCR産物を10mlの反応容量中で制限酵素処理し、そしてこ の産物を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。野生型配列 を有する被験体においては、114bpのPCR産物を、68bpおよび46bpのフラグメント に切断する。変異配列は、産物を、53bp、46bp、および15bpに切断させる。 M239V変異の検出：ヌクレオチド1080におけるＡ→Ｇ置換は、NlaIII制限部位 を欠失させ、配列番号18のbp1009〜1026に対応するオリゴヌクレオチド、および 配列番号18のbp1118〜1101の相補物の各10pMolを用いる100ngのゲノムDNAからの 増幅によって、M239V変異の存在の検出を可能にする。PCR条件は：0.5U Taqポリ メラーゼ、250mM dNTP、1mCi α32P-dCTP、1.5mM MgCl2、10ml容量；94℃×30秒 、58℃×20秒、72℃×20秒の30サイクルであり、110bp産物を生成した。2mlのPC R反応物を10mlに希釈し、そして3UのNlaIII(NEBL、Beverly、MA)で３時間制限酵 素処理した。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって制限産物を分離し 、そしてオートラジオグラフィーにより可視化させた。正常被験体は、55、35、 15、および6bpの切断産物を示し、他方、変異配列は、55、50、および6bpのフラ グメントを与える。 I420T変異の検出：上記の手順と同様に、配列番号18のbp1576〜1593に対応す るプライマー、および配列番号18のbp1721〜1701の相補物を用いるゲノムDNAのP CR増幅によって、I420T変異をスクリーニングして、146塩基対産物を生成し得る 。次いで、この産物を、野生型配列（例えば、配列番号18のbp1616〜1632)、お よび変異配列（例えば、bp1624においてＴ→Ｃ置換を有する配列番号18のbp1616 〜1632）について、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドでプローブし得る。実施例12 トランスジェニックマウス トランスジェニックマウスの調製において用いるために、一連の野生型および 変異PS1およびPS2遺伝子を構築した。PS1およびPS2の変異バージョンを、標準的 な技術を用いて、クローン化cDNA cc33（PS1）およびcc32（PS2）の部位特異的 変異誘発によって作製した。 cDNA cc33およびcc32、ならびにそれらの変異バージョンを用いて、実施例８ に記載のように、変異および野生型PS1およびPS2c DNAの２つのクラスを調製し た。第１のクラス（「全長」cDNAという）を、EcoRI（PS1）またはPvuII（PS2） での消化によって、ポリＡ部位の直前の３’非翻訳領域のほぼ200bpを除去する ことによって調製した。第２のクラス（「短縮型」cDNAという）を、ATG開始コ ドンの5'側に隣接して配置したリボソーム結合部位（Kozakコンセンサス配列） で5'非翻訳領域を置き換えることによって調製した。 上記のように調製した種々の全長および短縮型の野生型および変異PS1およびP S2 cDNAを、以下の１つ以上のベクターに導入し、そして得られた構築物を、ト ランスジェニックマウスの作製のための遺伝子の供給源として使用した。 cos.TET 発現ベクター：このベクターは、SyrianハムスターPrP遺伝子を含有す るコスミドクローンに由来した。これは、Scottら(1992)Protein Sci．1:986-99 7およびHsiaoら(1995)Neuron.（印刷中）によって詳細に記載されている。PS1お よびPS2 cDNA（全長または短縮型）を、このベクターにSalI部位で挿入した。最 終構築物は、挿入されたcDNAに隣接する20kbの5'配列を含む。この5'隣接配列は 、PrP遺伝子プロモーター、50bpのPrP遺伝子5'非翻訳領域エクソン、スプライス ドナー部位、1kbイントロン、およびSalI部位（この中にPS1またはPS2 cDNAが挿 入された）に丁度隣接して位置するスプライスアクセプター部位を含む。挿入さ れたcDNAに隣接する3'配列は、ポリアデニル化シグナルを含むPrP3'非翻訳領域 のほぼ８kbセグメントを含む。NotI（PS1）またはFseI（PS2）でのこの構築物の 消化は、PrPプロモーターの制御下にある変異または野生型PS遺伝子を含有する フラグメントを遊離した。遊離されたフラグメントをゲル精製し、そしてHsiao ら(1995)の方法を用い、受精したマウス卵の生殖核に注入した。 血小板由来成長因子レセプターβ−サブユニット構築物：ヒト血小板由来成長 因子レセプターβ−サブユニットプロモーターの3'末端において、SalI（全長PS 1 cDNA）またはHindIII（短縮型PS1 cDNA、全長PS2 cDNA、および短縮型PS2 cDN A）の間にPS cDNAをまた挿入し、そしてSV40ポリＡ配列の5'末端におけるEcoRI 部位および全カセットを、pZeoSVベクター(Invitrogen，San Diego，CA)にクロ ーン化した。ScaI/BamHI消化によって遊離されたフラグメントをゲル精製し、そ してHsiaoら（1995）の方法を用い、受精したマウス卵の生殖核に注入した。ヒトβ−アクチン構築物：PS1およびPS2 cDNAを、pBAcGHのSalI部位に挿入し た。この挿入によって生じた構築物は、3.4kbのヒトβアクチン5'隣接配列（ヒ トβアクチンプロモーター、スプライシングされた78bpのヒトβアクチン5'非翻 訳エクソンおよびイントロン）、およびPS1またはPS2インサート、続いて、いく つかのイントロンおよびエクソンを含有する2.2kbのヒト成長ホルモンゲノム配 列、ならびにポリアデニル化シグナルを含む。SfiIを用いて、PS-含有フラグメ ントを遊離させ、これをゲル精製し、そしてHsiaoら(1995)の方法を用い、受精 したマウス卵の生殖核に注入した。 ホスホグリセレートキナーゼ構築物：PS1およびPS2 cDNAをpkJ90ベクターに導 入した。このcDNAを、ヒトホスホグリセレートキナーゼプロモーターの下流のKp nI部位と、ヒトホスホグリセレートキナーゼ遺伝子の3'非翻訳領域の上流のXbaI 部位との間に挿入した。PvuII/HindIII（PS1 cDNA）またはPvuII（PS2 cDNA）消 化を用いて、PS−含有フラグメントを遊離させ、次いでこれをゲル精製し、そし て上記のように受精したマウス卵の生殖核に注入した。 トランスジェニックマウスの海馬におけるＡβの分析：マウスにおける変異ヒ トPS1トランスジーンの影響を分析するために、早期発症PS1連鎖アルツハイマー 病の特に重症の形態と組み合わせて観察されたPS1変異、すなわち、M146Lミスセ ンス変異(Sherringtonら、1995)を用いた。混合FVB-C57BL/6株バックグラウンド でPS1変異トランスジーンについてヘテロ接合である動物を、Hsiaoら(1995)によ り最近記載された動物に類似の、同じSyrianハムスターPrPプロモーター下にヒ ト野生型βAPP695CDNAを保有する類似のマウスと交配させた。ヒトＡβは、マウ スＡβペプチドより凝集体を形成し易いと考えられるので、これらの交配を実施 した。 次いで、これらPS1M146L×βAPPWT交配の子孫の遺伝子型を調べ、ヒト野生型 βＡPP695トランスジーンおよび変異ヒトPS1M146Lトランスジーンの両方を含む 動物を同定した。これらマウスを、２〜３ケ月齢まで成熟させ、次いで屠殺し、 海馬および新皮質を脳から迅速に切り出し、そして凍結した。野生型ヒトβAPP6 95 トランスジーンのみを含む、これらマウスの同腹子もまた屠殺し、そして海馬 および新皮質を同様に切り出し、そして凍結した。 総Ａβペプチド(Ａβx-40およびＡβx-42(43))と、残基42または43で終わるＡ βペプチド(長テイルＡβ42ペプチド)のサブセットとの両方の濃度を、先に記載 されたように(Tamaokaら、1994；Suzukiら、1994)、ツーサンドイッチELISAを用 いて測定した。これらの結果は、野生型ヒトβAPP695コントロールと比較して、 野生型ヒトβAPP695および変異ヒトPS1M146Lトランスジーンを保有する二重トラ ンスジェニック動物における総Ａβペプチドのわずかな増加を説得力をもって示 した。さらに印象的には、これらの測定はまた、残基42または43で終わる長テイ ルＡβペプチド(Ａβ42)の量の増加が存在することを示した。対照的に、野生型 ヒトβAPP695トランスジーンのみを保有する同腹子は、定量限界を下回る(「BLQ 」)Ａβ42長テイルペプチド値を有していた。結果を以下に示す：PS1 遺伝子型および海馬のＡβペプチド含量 遺伝子型 動物ＩＤ Ａβ42 Ａβ 野生型 ４ BLQ 36.21 野生型 ５ BLQ 34.31 野生型 ６ BLQ 41.29 野生型 ８ BLQ 39.07 野生型 10 BLQ 44.66 野生型 13 BLQ 44.31 野生型 14 BLQ 37.47 野生型 16 BLQ 36.74 M146LPS1 １ 8.14 52.17 M146LPS1 ２ 6.39 60.01 M146LPS1 ３ 8.94 65.82 M146LPS1 ７ 6.81 56.51 M146LPS1 ９ 5.71 51.32 M146LPS1 11 6.87 53.37 M146LPS1 12 5.34 52.18 M146LPS1 15 7.11 55.99 従って、これらの観察は、トランスジェニック動物の構築が、ヒトアルツハイ マー病のいくつかの生化学的特徴(すなわち、Ａβペプチドの過剰産生、および 、特に、Ａβペプチドの長テイルイソ型の過剰産生)を反復し得ることを確認し た。従って、これらの観察は、トランスジェニックモデルが、アルツハイマー病 の処置および予防に関係する治療標的を調査することにおいて実際有用であるこ とを証明する。 PS1 トランスジェニックマウスにおける海馬依存性記憶機能の分析 2.5〜３月齢の、PrPプロモーター下にヒトPS1M146V変異トランスジーンを保有 する14匹のトランスジェニックC57BL/6×FVBマウス(上記)および12匹の野生型同 腹子（両群とも年齢、体重、および性別を釣り合わせた）を、変異トランスジー ンに帰し得る挙動の差異について調査した。また、ホームケージにおけるマウス の挙動の定性的観察は、動物サンプルにおいて挙動の双峰分布を示さなかった。 実験１。調査した挙動(例えば、歩行、後肢立ちによる周囲の観察、お よび不慣れな環境の調査パターン)の微妙な差異を試験するために、PS1M146Vお よび野生型同腹子の両方を、オープンフィールドで試験した(Janusら(1995)、Ne urobiology of Learning and Memory、64:58-67)。試験の結果は、マウス歩行挙 動(歩行、立ち止まり、壁学習(wall learning)、後肢立ち、グルーミング)によ り測定される新環境の調査行動に、トランスジェニックとコントロールの間で、 有意差はないことを明らかにした(F(1,24)=0.98、NS)。従って、Morrisの水迷路 テストにおける挙動の差異(以下を参照)は、歩行能力などの差異に帰することが できない。 実験２。オープンフィールドテストの１週間後、PS1M146V変異トランク スジェニックマウスおよびそれらの同腹子を、Morrisの水迷路中で訓練した。こ のテストでは、マウスは、水面下の逃避プラットホームを見つけるために、プー ル中を泳がなければならない。マウスは、利用可能な迷路外の空間的手がかりを 用いてプラットホームの位置を学習することによりこのテストを解決する(Morri s(1990)Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology、55：161−173 )。このテストは、海馬体がこの形態の学習に関与するという強い証拠が存在す るこ とから選択された。海馬はまた、ヒトにおけるAD神経病変の主要部位であり、そ して空間学習の欠陥(地理的失見当識、目的を見失うこと、遊走など)は、ヒトAD の顕著な初期の特徴である。Morrisテストは３相で実施される。第１相(学習獲 得相)では、マウスはプラットホームの空間的位置を学習しなければならない。 第２相(探索試行)では、プラットホームはプールから取り出され、そしてマウス のプラットホームサーチが記録される。最終相(学習移行相)では、プラットホー ムがプール中の新たな位置に配置され、そしてマウスはそのプラットホームの新 たな空間的位置を学習しなければならない。 トランスジェニックマウスおよび野生型マウスは、学習獲得の間にプラットホ ームを見出す潜時に違いはなく(F(1,24)=0.81、NS)、そして両群とも、試行を通 じて迅速な学習を示した(F(10,15)=11.57、p<0.0001)。探索試行相の間、両群の マウスは、当初プラットホームを含んでいたプールの四分円を、プラットをホー ムを含んでいなかった他の領域よりかなり長くサーチした(F(3,22)=28.9、p<0.0 01)。しかし、野生型コントールは、プラットホームの以前の正確な位置を横切 る数の増加について統計的に有意でない傾向(t(24)=1.21、p=0.24)を示した。学 習移行試験では、両群は、試行の初期ブロックにおいて、プラットホームの新た な位置を見つける潜時は同じであった(t(24)=1.11、NS)。新たな空間的位置を見 つけるためのこのような長い潜時は、マウスが、そのほとんどの時間を、古い空 間的位置にあるプラットホームのサーチに費やすために予期されることである。 しかし、学習移行相における後の試行では、野生型マウスは、PS1M146V変異トラ ンスジェニック動物に比べて、プラットホームの新たな位置に泳ぎ着く潜時がよ り短かった(F(1,24)2.36、p=0.14)。この結果は、PS1M146V変異トランスジェニ ックマウスが、学習した情報を新たな状況に移行することにおいてより柔軟でな く、そして古い位置にあるプラットホームのサーチに保存される傾向にあったこ とを示す。 結論として、野生型マウスとPS1M146V変異トランスジェニックマウスとの間に 、新環境の自発的調査および新たな空間的情報の獲得において差異は見出されな かった。しかし、PS1M146V変異トランスジェニックマウスは、この知識をその後 の状況に切り換えそして/または適合させることを損傷していた。変異トランスジェニックマウスの海馬における電気生理学的記録 ：上記と同じC5 7BL/6×FVB系統のバックグラウンドを持つ、５〜６月齢の同腹子コントロールお よびヒトPS1M146V変異トランスジェニックマウスを用いて、海馬における学習お よび記憶の電気生理学的相関物としての長期増強(LTP)を調べた。記録は、従来 技術に従って、400μｍ厚の海馬切片で行った。簡単に述べれば、マウスをハロ タン麻酔下で断頭した後１分以内に、脳を取り出し、そして海馬を含む横断切片 を得た。記録の前に１時間、切片を、酸素を添加した人工脳脊髄液中に室温にて 維持した。一度に１つの切片を記録チャンバーに移し、そこで切片を酸素添加人 工脳脊髄液と湿潤空気との間の界面に32℃にて維持した。次いで切片を、さらに １時間、記録チャンバー中で平衡化した。 細胞外電場記録を、海馬CA1領域においてSchaeffer側副枝錐体細胞シナプスで 実施した。シナプス応答を、0.03Hzの周波数で最大応答の30〜50％の強度にてSc haeffer側副枝を刺激することにより誘導した。長期増強を誘起するためのテタ ヌス刺激は、10秒の列間間隔の、200ミリ秒間続く100Hz刺激の５列からなった。 電場電位を、Axopatch 200B増幅器(Axon Instrument)を用いて記録した。ガラス ピペットを、1.5mmの外径を有するホウケイ酸ガラスから製造し、そして２段階N arishige pullerを用いて引いた。データを、PCLAMP6ソフトウェア(Axon Instru ment)を用いる486-IBM互換コンピューターにより得た。 シナプス前機能における異常について試験するために、本発明者らは、シナプ ス効率の使用依存性増加の例であり、そして起源がシナプス前であると考えられ ている、対パルス促通における差異を調査した。海馬では、２つの刺激が、急速 に連続してSchaeffer側副枝に送達されるとき、対パルス促通は、刺激間隔がよ り短くなるにつれて、第２の刺激に対して増大した樹状突起応答として現れる。 野生型/トランスジェニックマウスの３つのペアにおいて、本発明者らは、20ミ リ秒〜１秒の範囲の刺激間隔にわたって対パルス促通における差異を観察しなか った。これらのデータは、PS1M146V変異トランスジェニックマウスでは、Schaef fer側副枝線維の興奮性および神経伝達物質の放出は正常であるようであること を示唆する。 テタヌス刺激は、コントロール(n=3)およびPS1M146V変異トランスジェニック マ ウス(n=2)の両方で、シナプス強度の長期持続増加を誘導した。PS1M146V変異ト ランスジェニックマウスから得られた切片では、シナプス強度の長期持続増加は 、コントロールマウスから得られた切片より30％より多かった。実施例１３ 真核生物細胞における組換えPS1およびPS2の発現 pcDNA3ベクター(Invitrogen，San Diego，CA)を用い、組換えPS1およびPS2を 、種々の細胞型（例えば、PC12、神経芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣、お よびヒト胚性腎臓293細胞）で発現させた。このベクターに挿入されたPS1および PS2 cDNAは、実施例８で記載されたものと同一の全長および短縮型cDNAであった 。 これらのcDNAを、CMVプロモーターと、pcDNA3のウシ成長ホルモンポリアデニ ル化部位との間に挿入した。トランスジーンは高レベルで発現された。 さらに、PS1およびPS2を、pCMXベクターを用いてCOS細胞で発現した。プレセ ニリンタンパク質の細胞内位置決定のタギングおよび追跡を容易にするために、 ヒトc-myc抗原（例えば、Evanら(1985)Mol.Cell Biol ．5:3610-3616を参照）に 由来する11アミノ酸の配列をコードし、かつモノクロメーナル抗-myc抗体MYC 1- 9E10.2(Product CRL 1729，ATCC，Rockville，Md.)によって認識されるオリゴヌ クレオチドを、PS1およびPS2 cDNAのオープンリーディングフレームの直前また は直後のいずれかにインフレームで連結した。タグ化していないｐCMX構築物も また調製した。また、c-myc-タグ化構築物もまた、CHO細胞へのトランスフェク ションのためにpcDNA3に導入した。 製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine(Gibco/BRL)を用い、これらの構 築物の一過性でかつ安定なトランスフェクションを達成している。48時間後、一 過性発現について培養物をアッセイした。安定にトランスフェクトされた株を、 0.5mg/mlゲネチシン（Geneticin）(Gibco/BRL)を用いて選択した。 上記の抗プレセニリン抗体1142、519、および520を用いるウェスタンブロット によって、トランスフェクトしたPSタンパク質の発現をアッセイした。略言すれ ば、培養したトランスフェクト細胞を可溶化し（2％SDS、5mM EDTA、1mg/mlロイ ペプチンおよびアプロチニン）、そしてタンパク質濃度をLowryによって測定し た。タンパク質をSDS-PAGEグラジエントゲル(４〜20％Novex)で分離し、そして 一定のボルト数（50V）にて２時間で、PVDF(10mM CAPS)に移した。非特異的結合 をスキムミルク（５％）を用いて、１時間でブロッキングした。次いで、タンパ ク質を、２つのウサギポリクローナル抗体（TBS、pH7.4中で約1mg/ml）を用いて 12時間プローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（st repavadin）、第三級４−クロローナフトール（napthol）、および過酸化水素を 用いて可視化したビオチン化ヤギ−抗ウサギ二次抗体を用い、プレセニリン交差 反応種を同定した。上記の両方の抗プレセニリン抗体を用い、c-myc-タグ化プレ セニリンペプチドをウェスタンブロットによってアッセイし（プレセニリンペプ チド抗原を検出するため）、そしてハイブリドーマMYC 1-9E10.2からの培養上清 を、ウェスタンブロットに関して1:10、および免疫細胞化学に関して1:3に希釈 した（myc−エピトープを検出するため）。50〜60kDaの免疫反応性の主要バンド を、種々のプレセニリン抗体の各々によって、およびmyc-エピトープ抗体によっ て（myc-含有プラスミドでトランスフェクトした細胞株について）同定した。約 10〜19kDaおよび約70kDaにおけるマイナーなバンドを、いくつかのプレセニリン 抗体によって検出した。 免疫細胞化学では、トランスフェクトした細胞を、Tris緩衝化生理食塩水（TB S）中の４％ホルムアルデヒドで固定し、TBS+0.1％Tritonで十分に洗浄し、そし て非特異的結合を3％BSAでブロッキングした。固定した細胞を、プレセニリン抗 体（例えば、上記の抗体520および1142；代表的には5〜10mg/ml）でプローブし 、洗浄し、そしてFITC-またはローダミン−結合ヤギ−抗ウサギ二次抗体で可視 化した。c-myc-タグ化プレセニリン構築物について、１：３に希釈したハイブリ ドーマMYC 1-9E10.2上清を抗マウス２次抗体とともに用いた。スライドを、0.1 ％フェニレンジアミン（ICN）を含む90％グリセロール中に封入し、蛍光を維持 した。抗BIP（または、抗カルネキシン(calnexin)）(StressGen，Victoria，B.C ．)および小麦胚芽凝集素(EY Labs,San Mateo，CA)を、それぞれ、小胞体および ゴルジのマーカーとして使用した。二重−免疫標識をまた、ニューロン株NSC34 において抗アクチン(Sigma，St．Louis，Mo.)、抗アミロイド前駆体タンパク質( 22C11，Boehringer Mannheim)、および抗ニューロフィラメント(NF-M特異的、Si gma)を用いて行った。これらの免疫蛍光研究は、トランスフェクション産 物が、小胞体およびゴルジ装置を示唆する特に強い核周辺局在化（これは、トラ ンスフェクトしていない細胞で観察されるものと同様であるが、より強く、時々 核膜に溢れ出る）とともに、細胞内に広く分布することを証明する。myc-タグ化 プレセニリン構築物で一過的にトランスフェクトしたCHOおよびCOS細胞で、c-my cおよびPSエピトープの同時免疫局所化が観察された。 従って、トランスフェクトした細胞におけるトランスフェクトしたプレセニリ ン遺伝子の強力な発現が、免疫細胞化学、ノーザンブロット、ウェスタンブロッ ト（上記のプレセニリンに対する抗体を用い、そして3'または5'c-mycタグを含 有する構築物におけるmycタグに対するモノクローナル抗体MYC1-9E10.2を用いる ）によって判明した。実施例14 アフィニティークロマトグラフィーによるプレセニリン結合タンパク 質の単離 プレセニリンの生化学的機能に関与し得るタンパク質を同定するために、PS1 −結合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した。実 施例８に記載したように調製したPS1TM6→７ループを含有するGST−融合タンパ ク質を用いて、生理食塩水中で、ポリトロンにより脳組織をホモゲナイズするこ とによって調製したヒト脳抽出物をプローブした。グルタチオン−セファロース ビーズとのインキュベーションにより内因性GST−結合成分の脳ホモゲネートを 予め清澄化することによって、非特異的結合を排除した。次いで、これらのGST を含まないホモゲネートを、GST-PS融合タンパク質と共にインキュベートして、 機能的結合タンパク質との所望の複合体を作製した。次いで、これらの複合体を 、アフィニティーグルタチオン−セファロースビーズを用いて回収した。リン酸 緩衝化生理食塩水で十分に洗浄した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （SDS-PAGE；Tris−tricinグラジエントゲル４〜20％）によって、単離したタン パク質の収集物を分離した。50〜60kDの範囲のいくつかの弱いバンドに加えて、 ２つの主要なバンドが、約14kDおよび20kDで観察された。 これらのタンパク質とTM６→７ループとの間の相互作用の薬理学的改変は、ア ルツハイマー病の処置において使用され得る。さらに、おそらくプレセニリン生 化学経路内で作用するこれらのタンパク質は、アルツハイマー病を引き起こす新 規の変異部位であり得る。実施例15 ツーハイブリッド酵母系によるプレセニリン相互作用タンパク質の単 離 プレセニリンタンパク質と相互作用するタンパク質を同定するため、市販の酵 母ツーハイブリッドキット（Clontech，Palo Alto，CAの"Matchmaker System 2" ）を用いて、プレセニリンの機能ドメインと相互作用するクローンを得るため脳 cDNAライブラリーをスクリーニングした。プレセニリンのTM6→７ループドメイ ンが重要な機能ドメインである可能性を考慮して、正常のPS1タンパク質の残基2 66〜409または正常のPS2タンパク質の残基272〜390のいずれかをコードする部分 的cDNA配列を、インフレームで、pAS2-1融合タンパク質発現ベクター（Clontech ）のEcoRIおよびBamHI部位に連結した。得られた融合タンパク質は、PS1タンパ ク質のTM6→７ループまたはPS2タンパク質のTM6→７ループのいずれかにインフ レームで結合されたGAL4 DNA結合ドメインを含んでいる。これらの発現プラスミ ドを、GAL4活性化ドメインを持つpACT2酵母融合タンパク質発現ベクター（Clont ech）に連結されたヒト脳cDNAのライブラリーと共に、「Matchmaker System 2」 酵母ツーハイブリッドキット（Clontech，Palo Alto，CA）の酢酸リチウムプロ トコルを変形して用いて、S.cerevisiae菌株Y190に同時形質変換させた。TM6→ ７ループドメインと相互作用するヒト脳ｃDNAを有する酵母クローンを、ヒスチ ジンを含まないSD最小培地で培養してHis-耐性によって選択し、色選択をしてβ gal+活性によって選択した。そして、His+βgal+クローンから、10μｇ/mlのシ クロヘキサミドで培養して構築したpAS2-1「ベイト」を取り除き、PS相互作用タ ンパク質をコードするヒト脳ｃDNAの未知の「トラップされた」挿入物を、PCRに よって単離し配列決定した。最初の600万の形質転換株の中で、陽性コロニーの 選択に関する製造者のプロトコルに従って行われた、His-選択の後、200の陽性 クローンを得、βgal+色選択の後、42の陽性クローンを得た。これら42のクロー ンの中には、同一の遺伝子を表す独立したクローンがいくつかあった。 プレセニリンの変異体が、変異タンパク質と１つまたはそれ以上の他の細胞タ ンパク質との間の新規な相互作用によって媒介される、新規な毒性の機能を得る こと（つまり、機能変異を優勢に得ること）によってADを引き起こす可能性につ いて検討するために、pACT2発現ベクター（Clontech）にクローニングされたヒ ト脳ｃDNAライブラリーを、上記のような変異体TM6→７ループドメイン配列を製 造者のプロトコルに従って用いて、再スクリーニングした。特に、変異体L286V 、L392VおよびΔ290-319を有する、PS1 TM6→７ループドメインの残基260-409に 相当する変異体プレセニリン配列を、インフレームで、pAS2-1ベクター（Clonte ch）のGAL4 DNA結合ドメインに連結し、pACTベクター（Clontech）のヒト脳cDNA :GAL4活性化ドメインをスクリーニングするのに用いた。酵母を同時形質転換し 、陽性のコロニーを選択し、「トラップされた」配列を回収して、上記のように 配列決定した。正常のTM6→７ループドメインを用いて回収した同一の配列の一 部に加えて、いくつかの新しい配列が得られたが、これらは、変異体プレセニリ ンの正常な細胞タンパク質との異常な相互作用を反映するものである。 これらのPS相互作用タンパク質に相当する、回収され配列決定されたクローン を、NCB1電子メールサーバを介して、BL:ASTNアルゴリズムを用いた公開された 配列データベースと比較した。これらのクローンの一部について以下に説明する ： 坑分泌性因子／プロテアソームS5aサブユニット 二つの重複するクローン（Y 2H29およびY2H31）が同定されたが、これらは、坑分泌性因子（ASF）または26S プロテアソームの多ユビキチン鎖結合S5aサブユニット（S5a）のいずれかと同定 されるタンパク質のＣ末端フラグメントに相当する（Johanssonら（1995）J.Bio l.Chem. 270:20615-20620；Ferrellら（1996）FEBS Lett. 381:143-148）。S5a サブユニットの完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アクセス番号U51007 で公開されたデータベースから入手可能であり、本明細書中においては、配列番 号26および配列番号27として再生する。Y2H29およびY2H31クローンのヌクレオチ ド配列は、配列番号26のヌクレオチド351-1330および配列番号27のアミノ酸残基 70-377を含む。このように、完全なS5aサブユニットの残基70-377は、このタン パク質のPS相互作用ドメインを含む。S5aの残基206-377は、タンパク質−タンパ ク質相互作用にとって重要な特定のモチーフを含んでいる（Ferrelら、1996）。 PS1-S5aサブユニットの相互作用を、野生型および変異PS1 TM6→７ループ（残 基260〜409）の両方に関して、Y187酵母細胞を、インフレームでpACT2のGAL4-DN A結合ドメインに連結した、適切な野生型または変異体（L286V、L392VまたはΔ2 90-319）cDNAで形質転換することによって、直接に再検査した。Δ290-319変異 体融合構築物は、いかなるS5a「ターゲット配列」もない状態で、自立的なβgal 活性を示し、そしてそれ故それ以上分析することはできなかった。それに対して 、L286VおよびL392V変異体構築物はともに、特にS5a構築物と特異的に相互作用 した。しかし、定量アッセイによると、これらの相互作用は、野生型PS1260-409 配列によるものに比べて弱く、相互作用の程度はFADの開始時期にほぼ相関して いることがわかった。形質転換された酵母の溶菌液のウェスタンブロットにより 、同量の変異体または野生型融合タンパク質が見られたため、βgal活性の差は 、変異体PS1260-409構築物mRNAまたは融合タンパク質の不安定さに起因するもの ではなかった。 S5aの想定される機能の一つが、多ユビキチン化タンパク質を結合することで あるため、S.cerevisiaeに見られるPS1:S5a相互作用は、PS1260-409構築物の酵 母依存ユビキチン化によって、または直接相互作用によって起こるものであり得 る。前者は、分解経路、PS1とS5aとの間の機能的なおそらく相互の作用、または その両方をもたらし得る。PS1:S5a相互作用は、L286VおよびL392V変異体の存在 によって、増加するよりも却って減少するという事実により、そして、これらの 変異体のうちいずれもがPS1260-409ループのユビキチン結合部位（つまり、K265 、K311、K314またはK395）に影響を与えることがないという事実により、直接相 互作用は望ましいものである。この可能性をさらに検討するため、本発明者らは 、S5aおよびPS1260-409ループの全長に相当する、His標識された組換え融合タン パク質の直接相互作用を調べた。部分的に精製されたHis標識組換えPS1260-409 ループおよびHis標識S5aタンパク質および適切なコントロールを、リン酸緩衝化 生理食塩水内に混合した。この混合物をサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、 溶出液をSDS-PAGEおよび坑His標識モノクローナル抗体（Quiagen）を用いたウェ スタンブロットによって調べた。粗製のPS1260-409ループ調製物だけにおいて、 PS1260-409ループが、35分の広いピークとしてサイズ排除カラムから溶出した。 粗製のS5a調製 物だけにおいて、S5aが25分で溶出した。しかし、粗製のPS1260-409ループとS5a 調製物を混合すると、PS1260-409の溶出は、より分子量の大きな複合体の方へと 有意にシフトした。同一の分画においてS5aおよびPS1260-409が同時に溶出され ることが、坑His標識抗体を用いた画分のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットに よって確認された。これらの結果は、ユビキチン非依存性の、従って、機能的で ある可能性の高い相互作用と合致する。 Rab11 遺伝子 本明細書中で配列番号28として開示されるこのクローン（Y2H9 ）は、正常なPS1 TM6→７ループドメインと相互作用するものと同定され、アク セス番号X56740およびX53143で入手可能な、公知の遺伝子であるRab11に相当す ると思われる。Rab11は、ER/Golgiにおけるタンパク質／小胞輸送に関係してい ると考えられている。βAPPおよびNotchなどの膜タンパク質の処理と、その結果 過剰生成される毒性Ａβペプチド（特に神経毒性Ａβ1-42(43)アイソフォーム） の関係に注意されたい（Scheunerら（1995）Soc.Neurosci.Abstr. 21:1500）。 レチノイドＸレセプター−β遺伝子 本明細書において配列番号29として開示 されるこのクローン（Y2H23b）は、正常のPS1 TM6→７ループドメインと相互作 用するものと同定されたが、これは、レチノイドＸレセプターβ、核レセプター コレギュレーター、またはMHCクラスＩ調節要素として様々に知られている、ア クセス番号M84820、X63522およびM481766で入手可能な、公知の遺伝子に相当す ると思われる。この遺伝子は、細胞間シグナル伝達に関与しており、C.elegans sel12およびNotch/lin-12（転写アクチベーター）によって媒介される、細胞間 シグナル伝達機能と関連があり得ることを示唆していると考えられている。 未知の遺伝子（Y2H35） 本明細書中において配列番号30として開示される、 この遺伝子（Y2H35）は、正常なPSi TM6→７ループドメインと相互作用するもの と同定されたが、これは、アクセス番号R12984で入手可能な、酵母において保存 性を示す、未知の機能を有する既知の遺伝子に相当すると思われる。 細胞質シャペロニン遺伝子 本明細書中において配列番号31として開示される 、この遺伝子（Y2H27）は、正常なPS1 TM6→７ループドメインと相互作用するも のと同定されたが、これは、アクセス番号U17104およびX74801で入手可能な、細 胞質シャペロニン含有TCP-1という既知の遺伝子に相当すると思われる。未知の遺伝子（Y2H171） 本明細書中において配列番号32として開示される、 この遺伝子（Y2H171）は、正常なPS1 TM6→7ループドメインと相互作用するもの と同定されたが、これは、アクセス番号D55326で入手可能な、既知の発現された 反復配列に相当すると思われる。 p120/ プラコグロビンファミリーに相同のGT24およびその関連遺伝子 ５つの重複するクローン（Y2H6、Y2H10b、Y2H17h2、Y2H24およびY2H25）が得 られたが、これらは正常なPS1 TM6→7ループドメインと相互作用し、少なくとも １つの新規な遺伝子を表すと思われる。Y2H24クローンはまた、変異PS1 TM6→7 ループドメインとも相互作用することがわかった。この遺伝子ファミリーの１つ 以上のメンバーが単離されたが、これは異なるプレセニリンと様々に相互作用す る遺伝子ファミリーであることを示唆していると思われることに注意されたい。 これらのクローンに相当する最も完全な入手可能なcDNAは、GT24と呼ばれ、本明 細書中で配列番号33として開示され、アクセス番号U81004でGenBankに寄託され た。オープンリーディングフレームによって、GT24が特有のＮ末端を有し、C末 端においていくつかのアルマジロ（arm）反復タンパク質に相当の相同性を持つ 、少なくとも1040のアミノ酸からなるタンパク質であることが示唆される。従っ て、たとえば、（アクセス番号U81004から数字を付された）GT24の残基440-862 は、ネズミp120タンパク質（アクセス番号Z17804）の残基440-854に32-56％の同 一性（p=1.2e-133）を有しており、GT24の残基367-815は、D.melanogasterアル マジロセグメント極性タンパク質（アクセス番号P18824）の残基245-465と26-42 ％の同一性（p=0.0017）を有している。GT24遺伝子は、アノニマスマイクロサテ ライトマーカーD5S748およびネコ鳴き症候群遺伝子座の近くの染色体5p15にマッ プされる。この配列は、また、未知の機能を有する二つのヒトEST（つまり、ア クセス番号F08730のヌクレオチド2701-3018およびアクセス番号T18858のヌクレ オチド2974-3348）の一部ともほぼ同一である。これらのクローンもまた、他の 部分的cDNAおよびgDNA配列（たとえば、H17245、T06654、T77214、H24294、M620 15、T87427およびG04019）との相同性の程度は低い。 野生型PS1266-409「ベイト」での最初のスクリーニングで単離された、さらな るHis-、βgal+クローンは、GT24（ターゲットクローンY2H25；アクセス番号U81 0 類似のヌクレオチド配列を有していたが、これもまた、C末端arm反復を有するペ プチドをコードすると予想される。Y2H25クローンにほぼ相当する、より長いcDN A配列が、ヒトタンパク質p0071（アクセス番号X81889）としてGenBankに寄託さ れた。Y2H25/p0071 ORFの予想された配列を、GT24のものと比較すると、それら が全アミノ酸配列のうち47％の同一性を有し、GT24の残基346-862とY2H25/p0071 の残基509-1022（Y2H25 cDNAによってコードされる残基を含む）の間では70％の 同一性を有する関連タンパク質であることがわかる。後者の結果によって、PS1 が、arm反復含有タンパク質の新規なクラスと相互作用することが強く示唆され る。GT24の特有の5'末端でのノーザンブロットで得られた、広い〜4kbのハイブ リッドシグナルは、GT24のスプライシング／ポリアデニル化、または、Y2H25/p0 071よりもGT24にN末端相同の程度が高い、このファミリーのさらなるメンバーの 存在のいずれかを反映したものであり得る。 未知の遺伝子（Y2H41） PS1およびPS2の双方のTM6→7ループドメインばかり かPS1の変異ループドメインとも強く反応する、このクローン（Y2H41）が同定さ れた。配列番号34として開示されるこの配列は、未知の機能を有するEST（アク セス番号T64843）に強い相同性を示す。 未知の遺伝子（Y2H3-1） 正常および変異双方のPS1 TM6→7ループドメインに 反応するこのクローン（Y2H3-1）が同定された。この配列は、本明細書中におい て配列番号35として開示される。 プロテアソームp40サブユニット（Mov34） このクローン（Y2HEx10-6）は、 野生型TM6→7ドメインではなく、変異PS1 TM6→7ループドメインとの相互作用に よって同定された。このクローンは、26Sプロテアソームのヒトp40サブユニット （Mov34）と配列同一性を示す。このサブユニットの全配列は、アクセス番号D50 063で入手可能である。クローンY2HEx10-6の配列は、配列番号36として開示する 。 未知の遺伝子（Y2HEx10-17-1） このクローン（Y2HEx10-17-1）は、野生型TM 6→7ドメインではなく、変異PS1 TM6→7ループドメインとの相互作用によって同 定された。このクローンは、いかなる既知の配列とも強い相同性を示さない。こ のクローンの配列は、配列番号37として開示される。これは、3'末端からの逆配 列であることに留意されたい。未知の遺伝子（Ex10/17-1） このクローン（Ex10/17-1）は、野生型TM6→7ド メインではなく、変異PS1 TM6→7ループドメインとの相互作用によって同定され た。このクローンは、いかなる既知の配列とも強い相同性を示さない。このクロ ーンの配列は、配列番号38として開示される。 未知の遺伝子（Ex10/24-1） このクローン（Ex10/24-1）は、野生型TM6→7ド メインではなく、変異PS1 TM6→7ループドメインとの相互作用によって同定され た。このクローンは、いかなる既知の配列とも強い相同性を示さない。このクロ ーンの配列は、配列番号39として開示される。開示される配列は3'末端である。 ヒトチューブリンと相同性を有する未知の遺伝子 このクローン（Ex10/1-2） は、野生型TM6→7ドメインではなく、変異PS1 TM6→7ループドメインとの相互作 用によって同定された。このクローンは、ヒトチューブリンα鎖と強い相同性お よび同一性を有している。このクローンのこの配列は、配列番号40として開示さ れる。 未知の遺伝子（mutTM1-TM2） 本明細書中で配列番号41として開示されるこの クローン（mutTM1-TM2）は、変異PS1 TM1→TM2ループドメインと相互作用するも のと同定されたが、これは、既知の熱ショックセリンプロテアーゼ遺伝子に相当 すると思われる。実施例16 トランスジェニックC．elegans トランスジェニックC ．elegansを、卵母細胞のマイクロインジェクションによ って得た。ベクターpPD49.3 hsp16-41およびpPD49.78 hsp16-2をこの目的のため に選択した。これらのベクターのうち最初のものを用い、正常hPS1遺伝子または 変異体（L392V）を導入したトランスジェニックC ．elegansを作製した。上記の ヒトcDNAプローブcc32および抗体519、520、および1142を用い、ノーザンブロッ トまたはウェスタンブロットにおいてヒトcDNAの発現をアッセイすることによっ て、形質転換動物を検出した。シス二重変異hPS1遺伝子（M146LおよびL392V）、 正常hPS2遺伝子、および変異（N141I）hPS2遺伝子を有するベクターをまた調製 し、そして／または注入した。実施例17 DrosophilaプレセニリンホモログであるDmPSのクローニング Trpで終わり／始まる（例えば、PS1における残基Trp247およびTrp404にて；PS 2におけるTrp253およびTrp385にて）プレセニリン／sel-12タンパク質の高度に 保存された領域の公表されたヌクレオチド配列データから、重複するオリゴヌク レオチド5'ctn ccn gar tgg acn gyc tgg（配列番号22）、および5'rca ngc(agt )at ngt ngt rtt cca（配列番号23）を設計した。これらのプライマーを、成体 および胚のD ．melanogaster由来のmRNAから、RT-PCR（50ml容量、2mM MgCl2、94 ℃×30秒、57℃×20秒、72℃×20秒の30サイクル）のために用いた。次いで、94 ℃×1分、59℃×0.5分、および72℃×1分のサイクル条件および内部の保存され た重複プライマー5'ttt ttt ctc gag acn gcn car gar aga aay ga（配列番号24 ）、および5'ttt ttt gga tcc tar aa(agt)atr aar tcn cc（配列番号25）を用 いて、生成物を再増幅した。約600bpの生成物を、pBSのBamHIおよびXhoI部位に クローン化した。これらの生成物を配列決定し、そしてこれは、ヒトプレセニリ ンのアミノ酸配列に高度に相同な推定アミノ酸配列を有するオープンリーディン グフレームを含有することが示された。次いで、このフラグメントを用いて、従 来のD ．melanogaster cDNA/Zapライブラリー(Stratagene，CA)をスクリーニング して、サイズ約２〜2.5kbの６つの独立したcDNAクローン（クローンpds8、pds13 、pds1、pds3、pds7、およびpds14）を回収し、これを配列決定した。最長のORF は、ヒトプレセニリンと52％の同一性を有する541アミノ酸のポリペプチドをコ ードする。実施例18 Ａβペプチドの長いイソ型についてのアッセイ PS1またはβAPP717変異を有するFAD；この病気の家族歴が知られていない散発 性AD；他の成人発症神経変性性障害（HD=ハンチントン病；ALS＝筋萎縮性側索硬 化症）；ダウン症候群（DS）；および神経学的徴候のないコントロール被験体の 組織病理学的に確認された症例の凍結した大脳皮質から、Ａβペプチドを９９％ ギ酸で60分間（20℃）抽出した。200,000×gで20分間遠心分離した後、上清をペ レットから分離し、希釈し、中和し、そしてELISAによって調べた。Ａβの異な る種を定量するために、４つのモノクローナル抗体を使用した。抗体BNT-77 （これは、Ａβの中央由来のエピトープを検出する）、および抗体BAN-50（これ は、Ｎ末端残基を検出する）を最初に用いて、Ｎ末端短縮型を有するかまたは有 さない（BNT-77）、あるいはＮ末端短縮型のみを有さない（BAN-50）異種形態を 含むＡβの全てのタイプに結合させた。次いで、残基40で終わる短いテールのＡ β（抗体BA-27）または残基42/43で終わる長いテールのＡβ（抗体BC-05）のい ずれかを特異的に検出する２つのさらなるモノクローナル抗体を用いて、Ａβの 異なるＣ末端形態を区別した。以前に記載されているように(Tamaokaら，1994;S uzukiら，1994)、２部位ELISAを行った。略言すると、脳組織由来の100μｇの標 準ペプチドまたは上清を、BNT-77抗体でコーティングしたマイクロプレートに適 用し、４℃で24時間インキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、次い で、HRP-標識BA-27およびBC-05抗体と共に４℃で24時間インキュベートした。以 前に記載されたように、TNBマイクロウェルペルオキシダーゼ系を用い、発色に よってHRP活性をアッセイした。皮質Ａβレベルを、対（paired）Student t-検 定を用いて診断群間を比較した。平均検定のStudent-Newman-Keuls多重比較を用 いる、全てのＡβイソ型データの連合評価により、βAPP717および散発性AD被験 体からのＡβ1-42レベルがPS1変異症例についてのものとは区別されるが、コン トロールとは類似することが明らになった。対照的に、Ａβx-42レベルを考慮し た場合、３つの群が区別可能であった：高（PS1およびβAPP717AD）、中（散発 性AD）および低（コントロール）。 詳細には、人生の40代および50代で発症する他の神経変性性疾患を有する５人 の被験体を含む、14のコントロール被験体の大脳皮質における種々のＡβイソ型 の濃度の測定は、短いテールのＡβ（Ａβ1-40;0.06±0.02nMol/グラム湿潤組織 ±SEM;Af3x-40:0.17±0.40）、および長いテールのＡβ（Ａβ1-42/43:0.35±0. 17;Aβx-42/43:1.17±0.80）の両方の低濃度のみを明らかにした。対照的に、長 いテールのＡβペプチドは、PS1変異を有する全ての４人の被験体の大脳皮質で 有意に上昇していた（Ａβ1-42/43:6.54±2.0、p=0.05;Aβx-42/43:23.91±4.00 、p<0.01）。長いテールのＡβペプチドの濃度における同様の増加が、βAPP717 変異を有する被験体（Aβ1-42/43:2.03±1.04;Aβx-42/43;25.15±5.74）、およ び散発性ADを有する被験体（Aβ1-42/43:1.21±0.40、P=0.008;Aβx-42/43:14.4 5 ±2.81．P=0.001）の両方の皮質で検出された。PS1またはβAPP717変異を有する 被験体においては、Ａβの長いテールのイソ型におけるこの増加は、短いテール のＡβイソ型における小さいが有意でない増加を伴った（例えば、PS1変異体に おけるＡβx-40:3.08±1.31;βAPP717変異体における1.56±0.07）。従って、短 いイソ型に対する長いイソ型の比率も有意に増加した。しかし、散発性AD症例に おいて、代表的には、長いテールのＡβにおいて観察された増加は短いテールの Ａβイソ型におけるかなり大きな増加を伴った（Ａβ1-40:3.92±1.42;Aβx-40: 16.60±5.88）。短いテールのＡβにおけるこの増加は、コントロールと比較し た場合に統計的に有意であった（Ａβ1-40およびＡβx-40の両方についてp<0.03 ）が、PS1およびβAPP717症例と比較した場合は、ボーダーラインで統計的に有 意であった（ｐ<0.05）。ダウン症候群を有する成人被験体由来の皮質サンプル の分析は、散発性ADにおいて観察されたものと同様のパターンを示した。実施例19 PS1切断 プレセニリン-1変異[アラニン-246-グルタミン酸塩（A246E）；システイン-41 0-チロシン（C410Y）]を有する個体、散発性AD（SAD）および罹患していないコ ントロール（cntl）の場合。 脳抽出物から得たタンパク質約50μｇを、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳 動[トリス−グリシン４-20％勾配；Novex]によって分離し、N末端PS-1特異的抗 血清でプローブした。コントロールの場合は、32-34kDで、正常な切断生成物が 得られた。家族性および散発性ADの場合は、40-42kDにおいてさらなるダブレッ トのバンドを含んでいたが、これは、別のタンパク質内分解切断が起こっている 可能性に合致する。コントロールおよびPS-1家族性個体の両方からの線維芽細胞 培養液から得た抽出物では、正常な32-34kD（フラグメント）だけが得られた。 これらの結果を図５に示す。 本発明の好ましい実施態様を本明細書中に詳細に記載してきたが、本発明の精 神または添付の請求の範囲の範囲を逸脱することなく、本発明に対して改変をな し得ることは当業者に理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／０２９，８９５ (32)優先日 平成８年11月８日(1996．11．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０３４，５９０ (32)優先日 平成９年１月２日(1997．1．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 セント ジョージ―ヒスロプ，ペーター エイチ. カナダ国 エム５ピー ３ジー３ オンタ リオ，トロント，リッチビュウ アベニュ ー 210 (72)発明者 フレイザー，ポール イー. カナダ国 エム６エス ３エル９ オンタ リオ，トロント，ワインダーメール アベ ニュー 611 (72)発明者 ロメンス，ジョハンナ エム. カナダ国 エム５ティー ２エックス４ オンタリオ，トロント，マッカール スト リート 105

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．変異体プレセニリン１タンパク質またはその機能的フラグメントをコードす るヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が以下の配列からなる群より選 択される、単離された核酸： （１）配列番号２のヒトプレセニリン１アミノ酸配列を含むタンパク質であっ て、Ｆ１７７ＳおよびＩ４３９Ｖからなる群より選択されるアミノ酸置換もまた 有するタンパク質をコードする配列； （２）配列番号４のヒトプレセニリン１アミノ酸配列を含むタンパク質であっ て、Ｆ１７７ＳおよびＩ４３９Ｖからなる群より選択される配列番号２の変異に 位置的に対応するアミノ酸置換もまた有するタンパク質をコードする配列； （３）配列番号１７のマウスプレセニリン１アミノ酸配列を含むタンパク質で あって、Ｆ１７７ＳおよびＩ４３９Ｖからなる群より選択される配列番号２の変 異に位置的に対応するアミノ酸置換もまた有するタンパク質をコードする配列； （４）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、残基２５７がア ラニンに置換され、残基２５８〜２９０が省略されており、そしてＦ１７７Ｓお よびＩ４３９Ｖからなる群より選択されるアミノ酸置換もまた有するタンパク質 をコードする配列； （５）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、残基２５３がア ラニンに置換され、残基２５４〜２８６が省略されており、そしてＦ１７７Ｓお よびＩ４３９Ｖからなる群より選択される配列番号２の変異に位置的に対応する アミノ酸置換もまた有するタンパク質をコードする配列；および （６）正常なプレセニリン１タンパク質をコードし、そしてストリンジェント なハイブリダイゼーション条件下で（１）〜（５）のいずれかの配列に相補的な 配列にハイブリダイズする配列。 ２．（１）異種特異的変異体プレセニリン遺伝子の少なくとも機能的ドメインを コードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、または（２）異種特異的変異体 プレセニリン遺伝子の同種ホモログの少なくとも機能的ドメインをコードする少 なくとも１つのヌクレオチド配列を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒ ト動物であって、該変異体プレセニリン遺伝子が、Ｆ１７７ＳおよびＩ４３９Ｖ からなる群より選択される配列番号２の変異に位置的に対応する少なくとも１つ の変異をコードする、トランスジェニック非ヒト動物。 ３．変異体プレセニリン１タンパク質の実質的に純粋な調製物であって、該タン パク質は （１）配列番号２のアミノ酸配列； （２）配列番号４のアミノ酸配列； （３）配列番号１７のアミノ酸配列； （４）配列番号２のアミノ酸配列であって、残基２５７がアラニンで置換され、 そして残基２５８〜２９０が省略されている、アミノ酸配列；および （５）配列番号４のアミノ酸配列であって、残基２５３がアラニンで置換され、 そして残基２５４〜２８６が省略されている、アミノ酸配列 からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する変異体プレセニリン１タンパク 質を含み、該アミノ酸配列は、Ｆ１７７ＳおよびＩ４３９Ｖからなる群より選択 される配列番号２の変異に位置的に対応する少なくとも１つの変異もまた有する 、調製物。 ４．Ｙ２Ｈ３−１（配列番号３５）、Ｙ２ＨＥｘ１０−６（配列番号３６）、Ｙ ２ＨＥｘ１０−１７−１（配列番号３７）、Ｅｘ１０/１７−１（配列番号３８ ）、Ｅｘ１０/２４−１（配列番号３９）、Ｅｘ１０/１−２（配列番号４０）、 およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ２（配列番号４１）からなる群より選択されるプレセ ニリン相互作用タンパク質の少なくともプレセニリン相互作用ドメインをコード する、単離された核酸。 ５．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１０ /１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ ２タンパク質からなる群より選択されるプレセニリン相互作用タンパク質の抗原 決定基をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。 ６．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１０ /１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ ２タンパク質からなる群より選択されるヒトプレセニリン相互作用タンパク質を コードする遺伝子の対立遺伝子改変体または異種特異的ホモログを同定するため の方法であって、 （ａ）該ヒトプレセニリン相互作用タンパク質と選択的に結合する抗体を選択 する工程； （ｂ）該抗体と、該タンパク質を含み得るタンパク質サンプルとを混合する工 程；および （ｃ）該抗体が該タンパク質と結合したかどうかを検出し、その結果、該対立 遺伝子改変体または異種特異的ホモログが同定され得る工程 を包含する、方法。 ７．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１０ /１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ ２タンパク質からなる群より選択されるヒトプレセニリン相互作用タンパク質遺 伝子の対立遺伝子改変体または異種特異的ホモログをコードする、単離された核 酸。 ８．（１）異種特異的正常プレセニリン相互作用タンパク質の少なくとも機能的 ドメインをコードするヌクレオチド配列、（２）異種特異的変異体プレセニリン 相互作用タンパク質の少なくとも機能的ドメインをコードするヌクレオチド配列 、（３）異種特異的変異体プレセニリン相互作用タンパク質の同種ホモログの少 なくとも機能的ドメインをコードするヌクレオチド配列、および/または（４） 不活化された内在性プレセニリン相互作用タンパク質遺伝子を含むゲノムを有す るトランスジェニック非ヒト動物であって、該プレセニリン相互作用タンパク質 が、Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１０ /１ ７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ２タ ンパク質からなる群より選択される、動物。 ９．前記ゲノムが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８ 、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１に記載されるヌクレオチド 配列を含む、請求項８に記載の動物。 １０．前記ヌクレオチド配列が、Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥ ｘ１０−１７−１、Ｅｘ１０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２ 、およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ２タンパク質からなる群より選択される変異体ヒト プレセニリン相互作用タンパク質の少なくとも機能的ドメインをコードする、請 求項８に記載の動物。 １１．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１ ０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−Ｔ Ｍ２タンパク質からなる群より選択されるタンパク質の実質的に純粋な調製物。 １２．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１ ０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−Ｔ Ｍ２タンパク質からなる群より選択されるプレセニリン相互作用タンパク質の少 なくともプレセニリン相互作用ドメインを含むポリペプチドの実質的に純粋な調 製物。 １３．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１ ０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−Ｔ Ｍ２タンパク質からなる群より選択されるプレセニリン相互作用タンパク質の少 なくとも抗原決定基を含むポリペプチドの実質的に純粋な調製物。 １４．プレセニリン相互作用タンパク質と選択的に結合する抗体を産生する方法 であって、 （ａ）Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ １０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１− ＴＭ２タンパク質からなる群より選択される、免疫学的有効量のプレセニリン相 互作用タンパク質を、動物に投与する工程；および （ｂ）該動物から、または該動物に由来する細胞培養物から、該プレセニリン 相互作用タンパク質と選択的に結合する抗体を得る工程 を包含する、方法。 １５．Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１ ０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−Ｔ Ｍ２タンパク質からなる群より選択されるプレセニリン相互作用タンパク質と選 択的に結合する抗体の実質的に純粋な調製物。 １６．前記抗体が、変異体プレセニリン相互作用タンパク質と選択的に結合し、 そして正常プレセニリン相互作用タンパク質と結合できない、請求項１５に記載 の抗体調製物。 １７．プレセニリン相互作用タンパク質と、プレセニリンタンパク質、またはそ の機能的フラグメント、改変体もしくはムテインとの間の相互作用に影響する物 質を同定するための方法であって、 （ａ）該プレセニリンタンパク質を含む調製物、Ｙ２Ｈ３−１、Ｙ２ＨＥｘ１ ０−６、Ｙ２ＨＥｘ１０−１７−１、Ｅｘ１０/１７−１、Ｅｘ１０/２４−１、 Ｅｘ１０/１−２、およびｍｕｔＴＭ１−ＴＭ２タンパク質からなる群より選択 されるプレセニリン相互作用タンパク質、ならびに候補物質を含むサンプルを提 供する工程；および （ｂ）該物質が、該プレセニリン相互作用タンパク質と該プレセニリンタンパ ク質との間の相互作用に影響するかどうかを検出する工程 を包含する、方法。 １８．前記調製物が、配列番号２に示される配列を有するタンパク質であって、 Ｉ１４３Ｔ、Ｍ１４６Ｌ、Ｌ１７１Ｐ、Ｆ１７７Ｓ、Ａ２６０Ｖ、Ｃ２６３Ｒ、 Ｐ２６４Ｌ、Ｐ２６７Ｓ、Ｅ２８０Ａ、Ｅ２８０Ｇ、Ａ２８５Ｖ、Ｌ２８６Ｖ、 Ｌ３２２Ｖ、Ｌ３９２Ｖ、Ｃ４１０ＹおよびＩ４３９Ｖからなる群より選択され るアミノ酸置換もまた有するタンパク質を含むプレセニリン１ムテインを含む、 請求項１７に記載の方法。 １９．前記調製物が、配列番号１９に示される配列を有するタンパク質であって 、Ｎ１４１Ｉ、Ｍ２３９Ｖ、およびＩ４２０Ｔからなる群より選択されるアミノ 酸置換もまた有するタンパク質を含むプレセニリン２ムテインを含む、請求項１ ７に記載の方法。
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